Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез глицеридов, катализируемый иммобилизованной липазой из Penicillium Sp.

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Синтез глицеридов, катализируемый иммобилизованной липазой из Penicillium Sp."

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

УДК 577.153.2

ХАЛАМЕЙЗЕР Влада Вениаминовна

СИНТЕЗ ГЛИЦЕРИДОВ, КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ЛИПАЗОЙ

ИЗ PENICILLIUM SP.

03.00.23 — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент — 1996

Работа выполнена в лаборатории ферментов микроорганизмов Института микробиологии АН РУз.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор К. Д. ДАВРАНОВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ш. К. КАСЫМОВ кандидат биологических наук И. Т. ЯКУБОВ

Ведущая организция:

Институт биохимии АН РУз.

Защита состоится « час

на заседании Специализированного совета Д. 015.02.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте микробиологии АН РУз по адресу (700128, г. Ташкент, ул. А. Кадырий, 7 Б).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН РУз.

Автореферат разослан «2/»

КО<Я$Р>Я. 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор биологических наук - У С. М. ХОДЖИБАЕВА

основными прС'Д>.'.•,£(-¿-акиаи оказываются котчл?йн дис."о?н. к.-, на более пэз/.'-ых с.;.реакции в среде сбц: ?у «телись сл'.-а.^«.' количестна трупеиьа.

Наивыса'.П -гч'Цент ¡-.ечверсии олеинсгоП кисл'л.» б:-л достигнут через 8 ч (40-спустя 21 ч в данной реак^икно^ с^^лч триг-лицершш не -.'ручлв&лис^ говее. Продукте. б''-;' предс-

тавлены ди- ¡4 чог'ящерлА.АМЛ. 0г.ерат1:ы:гч с ¡лег-зна«. а''/:',;.3, носгь липаз» ¡з К'Лгориз гШсгосрэгиз составляла 7Г.-?0>* 1.-т >и-мальвой. В р./-.'Л!!-! синтеза глицеридов в вздвои 'ср?л<з эчса <*'?-

мент ПРОЯВЛ!.« 4 СПсЧО'ЭДЧГОСТЬ к 1-!! з- ОЛ.Т.г-ООфПрН'.Г! с еЯ1'5.М. По-вмдимсму, с^разсвэнио триолеина явилось рте'.^.ыатом сплггэл-ной миграции гшодздс групп.

Липаза из ЯчисШ1ш> ер. проявила себя как крспвдр&лчякЗ г<з откожешш к по. дциг.м эфирных связей фермект. поскольку огювныч продуктом реакции синтеза Сыл триолеин. Через 16 ч степень конверсии не прееусала 20%, а через 24- ч триглицериды в среде вообще не обнаруживались , что свидетельствовало только п ленни скорости синтеза, но и обращении реаэдии г. сторону гидролиза. Оперативная скнтетазная актиадооть составила рсэг- гс-гхл от начальной, тогда как оперативная глдролкг.прская акт юность колебалась в гр-.делах 70-803. Этими фактора: и го-кно объяснить смешение реакция в сторону гидролиза.

Низкий шк-эн продукта реакция, катали^" .чгшчзоВ ' ■

Реп1сШ1ит вр. по сравнению с липазой из ЕД-оги.- т'лгоягег •. связан с ингнбпрующги эффектом олеинозоП, кислстч Последа»* зывала необратимое шгпбироззнве липазы из РепШШш зр., е«;* з среду ке были добавлены некоторые агенты (буФеу) с соответстз---кнцим рН или 1%-Я раствор казеина) {табл. 1). .

Липаза КЫгсщз т1сго5^огиэ подобному кигибироватте олеиновой кислотой не подвергалась,

■ Зависимость между-концентрацией фермента и выходом продукта-была линейной для обеих липаз.

Изучение влияния различных компонентов,' внесенных в реакционную среду, на скорость реакции этерификацин Л выход продуктов показало, что многие агента, актнвирувкие личолпическне ферменты в реакции гагроляза. не'влияют или сншивт сютетазнуо. активность (табл. 1).

Таблица 1

Зависимость синтетазкой активности некоторых микробных липаз от состава реакционной среды

IJ ! 1'еакшюнная срела 1 — ...... 1 конверсия олеиновой

1 I 1 кислоты.%.......

1 1 1 1 1 |Иг. microsporusl Pénicillium, sp i i

t 1 1 0.25 М ацетатный буфер, рН 6.5 1 36.6 ±0.05 I 20.2 i0,04

2 1 0.1 М боратнш". буфер, рН 9.0 1 13. 5 ±0. 10 1 5.2 ±0.25

ri 1 1 *- %-ныЛ раствор казеина 1 42.7 tO. 10 1 18.6 ±0,25

4 1 1%-ний раствор казеина 1 13.6 ±0.17 1 20,8 ±0,10

с 1 0. 5%-ньгЛ раствор казеина 1 22.7 ±0,25 1 14,2 ±0,15 ■

е I 2Ж-иыЧ рьстзор казенна I 17.8 ±0,35 1 11.5 ±0.04

•т I 1 0.5"-чый раствор ИБС I 1 3,5 ±0. 10 » 1 2.8 ±0.20 1 .....

2. Г-закция гилролипа в системе обращенных млцеял.

Эксперименты (¡рпгзл'^ли с липазой из Penlc.illton sp. в системе обрашенн.-ос мкцелл ДОТ п 'бензоле. Л v ряда Формантов, заключенных в обращенные чицеллц (ОМ) ПАВ з органическом растворителе. наЗлвдэегпл изменение многих характеристик, установленных в вс/чок среде, в четности. изменяется эффект ионов двухваленгн&х М'".7-и!.1гя». Как и ь водной среде, добавление Са?* в водную Фазу обрашсьмцх миаелл приводило к повышению активности, но при значителен O'.j.ec ииг.кой ' концентрации. Дальнейшее повышение кон-центрацчи Caz' в системе ОМ вызывало даже снижение активности ниже значения, зарегистрированного в отсутствии ионов.

При заключении в .полость ОМ часто изменяется рН-зависимость липаз. Это подтвердилось и. для липазы из Pénicillium s р. Как' было установлено, в водной среде.эта липаза имеет довольно широкий диапазон рН (6.5-9.0) (рис. 1 (кривая 1)).. В системе обращенных мицелл АОТ в бензоле диапазон рН более узкий и несколько смещен в щелочную область (рис.: (кригая 2)). рН оптимум липазы в ОМ стал равным 8,7. хотя известно, что рН-оптимум этого фермьнта в водной среде 7.5. Это. вероятно, связано с'эффектом микрораспре-деле!кя вог.ы в мнкроокруж;.нш; молекул Фермента.

Рис.1. рН-зависимость гидролитической активности липлзн из Penicillîur, r,p.: 1 - в водной среде (А»»*« 230 ¡толь Х'К/нин/мг); 2 - в системе ОМ (Amа* = 435 ииоль КК/кин/иг)

Увеличение концентрации воды в системе приводило к уреличе-нию гидролитической активности липазы только до значения степени гидратации W„, равного 20, повышение степени гилратаиип выше 22.5 не только не увеличивало скорость гпдролуза. но. наоборот, сникало его теины.

Заключение лшазн в полость обрашеншдс иицелл позволило . избежать (или, по крайней мере, ослабить) эффект снижения скорости реакции при высоких концентрациях фермента. Подобное снижение начальной скорости реакции происходит и в водной средз. и системе ОМ, но при разных концентрациях: в годной среде сит-стя"»«'»..'' активность падает при концентрации липаза выше 0,22 нг/ил , а ;; системе ОН при 0,8 мг/нл в, т.е. при в:3,6 раза более высокой концентрации липази .

Значительные различия .для двух систем выявились в зависимости активности липазы от концентрации субстрат®. Так, если в водной среде оптимальное значение концентрации субстрата составляло 5%, то для обращенных мицелл это значение сказывалось равным всего 0,8%. И в -ом, и в другом случае выше этих концентраций субстратов наблюдалось ингибирсвание липазной активности субстратом. Кинетические пзргметры для липазы из Pénicillium sp. в водной среде а з системе СИ АОТ ¡з бензоле существенно различались. •

3. Реакция Ьтррко&ацкя таду пжцеркно.ч н глглой кислотой в

cy.cirяе СП ЙОТ в бзн;ся*з. , Нами ксслс^оизяо ьяшшш концентрации. агентов, -пред&лявганх структуру сС;-у ••;:!'-'!ix (воды, глицерине и MТ) на пр»\«шле~

шш С!шт«азной активности. Липаза из Рзташит вр. проявляла еиктйтазну'й активность даже в отсутствии окзогенно добавленной воды. Однако е данном сл/чао нельзя говорить о полностью обезвоженной си.;теие. поскольку существует эндогенная вода, входящая в' состав каддогс компонента реакции.

Варьирование объема экзогенно добазленкой в систему ..воды от О до 0.2Х (что соответствует степени гидратации №о=0-1.2) приводило к возрастании синтетаэноЯ активности от 0.48 до 0,58 мг ТАГ/мг белка/ч. а при увеличении концентрации воды выше 0,5% (%>3) активность падала до исходного значения, далее оставаясь на том ;ке уровне (рлс.2).

Степень гидратации (Ю0) - отношение Ш20)/[а0Т] (в нолях) -прямо пропорционально радиусу образовавшихся мицелл. Поэтому логичном било Оу предположить, что снижение активности липази из, 1;еп1сгШ1И! зр, при увеличении значения \'!а выаэ 3 связано с увеличением радиуса мицелл выше оптимального. Однако, это может быть связано и со смещением реакции в сторону пиролиза при избыт»', г вод-ч.

Ь случае участия в реакции глиис-Ала мо;-.ае убедиться в ис-тиннгм влиянии разизра пицелл на активность Л/?пазы. поскольку в стсутствии зкзогенно добавленной веды именно отношение концент-здп;-глицерина к конценграцл.ч АОТ определяет размер мицелл. '

Ауд.

о.е -

А

А

»

N.

—I" -,—т—Т—|

б

г. о

Зй?!Г'.и:сг,П' гиятагяоВ емгБмоста из Репи*и-

И'Уп ¿7р. с су.атеяе ОН от степени гкдратаеяк (Но).

/

Оказалось, что скнтетазная активность липазы из РепЮПШап зр. граг.тичгсчи на меняется при поылеяки концентрации глицери-

на. А'это означает, что размер мицелл в дакнем глучар не спре;^-ляет проявление ?еризнтешной активности. 3 гг.язн с вкаескя&пн-ным мы предпэ; r.v«?M. что б отоа реакции Еода кесСходнма для поддержания акт;«-гг; кспформчции липазц. а последующее с.-пасениз активности внзваьл тем, что вода способствует реакции г;:гролиза.

Концентрат-:> обращенных мицелл в реакцнок'-среде при постоянном -значен!¡,*9 определяет концентрация ПАВ. 3 связи с этим было изучено Блияшге концентрации АОТ на активность липязк. :<п-тимальной дпй реакции этериФикации между глицерином и сжаю^ой кислотой оказалась концентрация АОТ. равная ЮС кМ. Было отмечено значительной снижение синтетазкой активности липазы при увеличении концентрации АОТ вине 150 v.M. Это. вероятно, селззно с тем, что липаза взаимодействует с мембраной мицеллы, а не просто растворяется в матриксе как водорастворимые белки. В зточ случае выявляется зависимость между концентрацией ПАВ к активностью фермента.

Чтобы выяснить как влияют на активность фермента ПАВ, имеющие саряд, в ореду вносили неионные ПАВ, снижающие силу гидростатических взаимодействуй. Добавление 5раг,-?0 л Tween-20 увеличивало выход тппглицерида по сравнению с исходным на 9-18;-:. тог. да как добавление Ерап-35 и Tween-85 способствовало лишь незна-' чительному увеличению степени конверсии на 4-6-';. Это действие можно объяснить тем, что липаза гидролизует зширине связи э-ли соединений и через 5-6 часов в среде обнаруживайся сбоСодк_я зкирнке кислоты. Активный центр фермента оказывается защипанным от адсорбции молекул АОТ,- но частичный гидролиз ПАВ не позволяет сильно увеличиться выходу синтетазной реакции.

Добавление Triton Х-10С незначительно снижало сшггетазную активнссть липазы, выход продуктов в этом случае падал до 85% по сравнению с исходным.

Синтетазная актигчость липазы из РегЛсШЛия sp. в системе ОМ значительнз не изменялась при изменении значений pH, хотя гидролитическая активность существенно зависила от значения pH. Поведение литзи из- Pentoi Ilium sp. существенно отличается от • других липаз, заключенных в полость ОМ, для которых отмечено определенное рпиянИе значения pH среды на синтэтазную .активность. =•

.Кинетика с^'разоэагля .продуктов синтетазной реакции отражена' на рис.3. Кинетическая кривая линейна на участке 'м^ 4-х часов

инкубации, а через 4 ч образовывалось максимальное количество трипшийрндоз. продолжение инкубации приводило к снижению с!ко-расти о?р. 13ова]П{я продукта. Липаза из РепЮаНит эр. существенна отличается от ранее изученных липаз, для которых характерно проведении подобных реакций в течение длительного периода врёме-

¡¡.I.

Наши акспернменты показали, что оптимальное соотношение субстратов - глицерин : олеиновая кислота, равно 1:3, т.е. сте-хцомэгричеокому соотношению, однако, при его значительном повы-1«нии до 11:1 и 22:1 конверсия олеиновой кислоты в продукты, ре-,икции этерификации значительно не меняется. Известно, что при избытке одного из субстратов двухсубстрзтнои реакции последнюю можно рассматривать ка.ч односубстратную к изучать влияние кон-!'нитрации второго субстрата. В этом случае кинетика реакции подчиняется законам Михаэлиса-Ментен. что дает возможность вычислить кинетические параметры. Таким образом, при изучении влияния олеиновой кислоты нами установлено, что степень конверсии субстрата в продукч сначала увеличивается по мере роста концентрации олеиновой кислоты со 1,6 мМ (этому зна-якна «»ответствует степень конверсии 46%), а дальнейшее яовьсхекие концентрации олеино-• ьой хислоты приводит к спишшю степени ее конверсии.

ТАГ,

мг

тгг г 111 м I: . п П О' 10 20 ПО

Ррекя, ч

Гис.З. Образование триглицерилсв в реакции этнри$акации. ¡:а-талг-лфуекпй липазой из РепПИИт вр. в систеис ОМ.

4. Синтез глнциридн», катэ лизнруеюЛ липазой из Реп1сНИия пр., иммобилизованной на модифицированной ДЭАЭ-целлюлозе.

Липаза из Репин Шт яр. была иммобилизована на биосиецифи-ческом носителе, полученном на основе ДЭАЭ-целлюлозы. модифици--

ровакноЯ остс!::а;г.! гпга-митпнсвой кислота. 1'Г:в-отио. что использование субстратов, продуктов реакции или их аналогов в качестр« лигандов обесг.ечлвает наибольшее биологическое сродство.

Кммобил;;;-е. ;'ш проводили при рН 7.0-7.5 н 36°С в точекио 30-60 мин. Ссрбцпонная емкость модифицированной ДЖЭ-цзллюлозы составила 47.В чг/г сорбента, по активности - 800 Е'кг. Гидролитическая акт;-! :тость иммобилизованной липазы сохранялась на исходном уровне 12С ;.ней при 7-10°С. Для сравнения в подобных условиях проводили адсорбцию той ке липазы на ДЭЛЗ-целлюлогп, не подвергшейся модификации остатками пальмитиновой кислоты I ионообменную иммобилизацию). Сорбциокная .емкость в этом случае составила всего £0. 5 нг/г сорбента и 650 Е/мг - по активности..

рН-оптимук полученного иммобилизованного препарата по сравнению со свободным ферментом практически не изменился, а диапазон оптимальных температур сместился в область более высоких значений. Иммобилизованный фермент оставался стабильным и при 50°С. Были подобраны условия десорбции липазы с носителя.

Кммобилизованную липазу использовали в реакции этериФикации между глицерином и олеииозой кислотой (рис.4).

Ре-.ИсИИит яр., от исходного содержания.

Реакция проходила в трехфазной системе, содержащей .только гидрофильную л?зу глицерина, гидрофобную фазу олеиновой кислоты"' и твердую фаг-у -эерг-еита. На рис.4 представлены результаты кон-' версии олеиновой кислоты в продукты реакции отери:: сации. Макси-

мальный выход продуктов через ?3 ч инкубации составил 62%. В ходе реакции образовывались moho-, дн- :: триолеины. причем последние сбрезошЕгались б количестве, сравнимом с первыми двумя.

Изучали влияние содержания воды в системе на выход продукта. Максимальная степень конверсии была отмечена при 0,43% воды в среде иь.суСацин. ОптикальныЛ выход глицеридов наблюдался при концентрации воды з системе з пределах от 0.309% до 0.12%. При содержании воды в реакционной среде ниже 0.3% и выше 0.73% уро-зекь активности (и как следствие, процент конверсии) падал, а пои добавлении 50 мг воды в среду (3.01%) он практически равен нулю. Невозможно определить то количество воды в системе, при котором гидролиз триглицеридов был бы полностью остановлен при сохранении синтетазной активности фермента, поскольку для проявления последней липазе необходимо присутствие некоторого количества воды в системе.'

Влияние концентраций обоих субстратов на процесс этерифика-ции между глицерином и олеиновой кислотой имело следующий характер. Глицерин ингибирующего действия на липазу из Pénicillium sp. не оказывал, наоборот, повышение его концентрации с 2 мМ до 4,5 мМ увеличивало выход триолеина на 8-10%. Увеличение концент-эации глццррнна от 4.5 До 7.5 мМ практически не влияло на кок-зерсию ок. которая оставалась на одном и том же уровне. Однако концентрация :1эиновой кислоты существенно влиялз на активность Фермента и на процент конверсии. Рост концентрации олеиновой кислоты от 4 мм до 6,5 мМ не оказывал существенного влияния на конечный выход триолеина, дальнейшее ■ увеличение концентрации жирной кислоты до 9 мМ приводило к падению процента конверсии до 33%. Было установлено, что ингибиторный эффект олеиновая кислота начитает оказывать-при концентрации >7,5 мМ.

Исследования позволили установить, что липаза из Pénicillium sp. катализирует этерификацию жирных кислот первичными спиртами. В частности, в петролейном эфире шла реакция между n-бутанолом и олеиновой кислотой. Влияние увеличивающейся концентрации олеиновой кислоты в этом случае не характеризовалось эффектом насыщения субстратом. Это можно объяснить тем, • что рост концентрации субстрата в петролейном эфире всегда заключает в себе присутствие в системе "чистого" субстрата. Этерификация между п-бутано-лом и олеиновой кислотой может быть описана кинетикой Михаэли-са-Ментен. Максимальная скорость реакции достаточно высока й

составляет 0,625 мг глицеридов/час/мг фермента. Однако значение К,„ в этих условиях для олеиновой кислоты равно 7,4г0,05 мМГ т.е. в среде органического растворителя сродство липази к субстрату достаточно низкое.

5.Сравнительный анализ каталитических свойств липазы из Pénicillium sp. а различных модельных системах.

Позиционная специфичность липаз в рвакгт этерификации Анализ продуктов реакции этерификации з трех модельных системах показал отсутствие позиционной 'специфичности липазы из Pénicillium sp. Это представляет определенный научный интерес, поскольку в реакции гидролиза и в реакции синтеза липазы из других штаммов гриба Pénicillium sp. проявили себя как < 1.3-специ-фичные липазы. Изменение специфичности липазы может быть вызвано несколькими причинами. Во-первых, имеет место изменение физического состояния субстрата. Во-вторых,.специфичность липазы в реакции синтеза может отличаться от таковой в реакции гидролиза. Отсутствие специфичности может быть обусловлено синергизмом действия разных молекулярных форм липаз, составляющих комплексный препарат фермента. На специфичность липазы, вероятно, определенным образом влияет микроокружение и процесс иммобилизации, о чек свидетельствуют многочисленные данные литературы (Bill V, et al., 1989. Ryu К.. Dorcilck J. S., 1Э89).

Кинетика образования продуктов В водной среде и в трехфазной системе действие липазы характеризовалось лаг-периодом (рис.5). При проведении реакции в системе обращенных мицелл АОТ в бензоле лаг-периода мы не наблюдали. Это можно объяснить более высоким сродством фермента к субстрату в системе ОМ по сравнению с двумя другими,, но, вероятно, существуют и другие причины.

На графике (см. рис.5) образования продуктов в водной среде отсутствует плато, наблюдаемое на соответствующих графиках для реакции, этерификации в системе ОМ и в трехфазной системе, что свидетельствует об постоянном смещении равновесия в сторону гидролиза образовавшихся глицеридов. В трехфазной системе даже через 38 ч инкубации не наблюдалось заметного снижения количества образованных глицеридов, как это было отмечено в системе ОМ через 16 ч инкубации.

(i /J

60-1

Время, ч

Рис.5. Сравнение синтетазной акгивностк липазы из РеШсНИит эр. в трех модельных системах: 1-в водной среде: 2-в трехфазной системе с иммобилизованным Ферментом; 3-в ОМ.

Основным Фактором, ответственным за обращение реакции в сторону гидролиза является вода, присутствующая в реакционной системе или образующаяся в ходе этерификации. Этим объясняется отсутствие состояния равновесия обратимой реакции при проведении з герификации в водной среде..

Максимальная синтетазная активность липазы из Pénicillium i;p. в системе ОМ ЛОТ в бензоле наблюдалась при Vl0 = 1.2. а максимальная гидролитическая активность - при W0 = 20. что подтверждает данные многих авторов о том, что W0 в большей степени определяется субстратами реакции. Следовательно, можно сделать, вывод, что в реакции этерификации, катализируемой липазой из Pénicillium sp.. вода оказывает влияние на активность не как ми-целлообразукмций Фактор.

В трехфазной системе с иммобилизованной липазой значение оптимального количества воды, необходимого для проявления синтетазной активности составило о,43 %. тогда как в системе обращенных мицелл ЛОТ в бензоле ото значение равно 0,2 Я. ' Такое различие связано с тем, что в системе обращенных мицелл АОТ в бензоле поверхностно-активное вещество 'обладает высокой способностью ад-, сорбировать воду и вся вода в системе гидратирует липазу. В системе о иммобилизованной липазой вода распределяется между фазой иммобилизованной липазы и фазой глицерина, то есть только часть

- 16 -

воды идет собственно на гидратацию фермента.

Влияние различных концентраций Фермента Изучение зависимости гидролитическом и сннтетазной активностей от концентрации Фермента в водкой среде и з системе ОМ позволяет сделать вывод о том, что помещение липазы в полость мицелл уменьшает эффект агрегации молекул белка. Этим можно объяснить тот факт, что гидролитическая активность в всдной среде на' чинает снижаться при гораздо более низкой концентрации липазы, чем в системе ОМ. В реакции этерификашш как в водной среде, гак и в . системе ОМ, подобное снижение активности при высоких концентрациях фермента.не имело место, активность продолжала расти, но при достижении определенной концентрации липазы зависимость уже не носила линейный характер. Подобную картину мы наблюдали и в случае этериФикации. катализируемой иммобилизованной липазой из Pentctllturn sp.

Этот эффект во всех модельных системах, очевидно, связан с насыщением адсорбированным ферментом поверхности раздела Фаз.

Влияние субстратов и сравнение кинетических параметров Кинетические параметры для липазы из PentсШturn sp. в волной среде и в системе ОН АОТ в бензоле существенно различались.

Сродство к оливковому маслу ь реакции гидролиза в системе ОМ меньше, чем в всдной среде. (Кт для оливкового масла в водной среде =4.3 мМ ± 0,07, К„ для оливкового масла в системе ОМ = 9,5 мМ ± 0.07), хотя максимальная скорость была на порядок выше. Отсдда можно предположить, что в этом случае играет роль тот факт, что субстрат - масло - оказывается как бы Физически отделенным от фермента при заключении последнего в полость обращенных мицелл, но фермент в системе ОМ преобретает более активную конформацию, чек в воде.

По мере поьышения концентрации субстрата синтетазная активность увеличивалась, ингибирования высокими концентрациями субстрата. как в случае гидролиза, не наблюдалось. Этот результат является примечательным, поскольку для большинства липолитичес-ких ферментов в реакциях гидролиза наблюдается ингибирование высокими концентрациями субстрата.

В системе обращенных мицелл сродство липазы к субстрату сннтетазной реакции - олеиновой кислоте (К,=3,28 мМ) выше, чем таковое к субстрату реакции гидролиза (И^ для оливкового масла=9,5

ММ ■.

Значение константы Михаэлиса для олеиновой кислоты в реакции, катализируемой иммобилизованной липазой, выше такового в системе обращенных мицелл ЛОТ в бензеле. Возможно, в обращенных мицеллах более высокая степень субстратного связывания по сравнен,!» с системой с органическим растворителем объясняется изменением в мпкроокружешш активного центра, вызванным взаимодействии с ПАВ. Имеете с тем. привлекательной кажется гипотеза, к.сказанная Иуи (1989), о том, что гидрсфобность растворителя ьиздаьет распределение субстратов между самим растворителем и активным центром фермента, что и сказывается на повышении константы Михаэлиса. А в системе обращенных мицелл поверхностно-ак-' тинное вещество вызывает расположение субстратов на межфазной поверхности, что делает его более доступным для активного центра липазы.

Однако, максимальная скорость реакции этерификанпи в системе с иммобилизованной липазой выше (Уиах=0,625 мг глицеридов/ч/мг фермента), чем в системе ОМ (У.„а1(=0,49 мг глицеридов/ч/мг фермента) .

Сравнение синтетазиой активности липазы из РегПсИИит ' зр.. а такке других микробных липаз в модельных системах различной степени сложности дает возможность выбрать систему, которую можно использовать для практических целей (Табл.2). Проведение эте-рифнкации в трехфазной системе с иммобилизованным ферментом позволяет' получать наивысший процент конверсии, освобождает от использования органического растворителя, кроме того продукты син-тетазноН реакции в данной системе не нуждаются в специальной • дальнейшей очистке, а'лишь в хроматографнческом разделении.

5. Разработка биореакторов с использованием иммобилизованных липаз.

На основе использования иммобилизованного препарата липазы ' из РешЫшит зр. нами рекомендован Сиореактор ■ для получения' диглицёридов и триглицеридов в неэмульсионной системе (рис.6)

На рисунке представлены основные детали мзмбранного реактора.. , Микропористые мембраны выполнены из гидрофобного полипропилена. Процесс происходит при 50°С в течение 20-22 ч. содержание воды в системе - 0,4-1,3%, соотношение субстратов 1:1 (по мо-

Таблица 2

Сравнение синтетазной активности некоторых микробных липаз в различных модельных системах

Продуценты липаз f Модельная система | 1 ....... ■ ■ " ■■ ...... Конверсия жирной кислоты (%) Источник

Mucor miechei 1 иммоб. фермент в i системе ЗСС0г | 28-30% Lartle et al.. 1992

Mucor miechei иммоб. фермент в 1 системе с ацетоном 1 45-50% Dudal et al., 1992

Chronobacteriuir, viscosm ! ОМ АОТ в изооктане I j 38-44% Claon et al., 1994

Rhizopus dslemr ОМ АОТ в изооктане 1 1 60-70» Hayes et al., 1989

Peniniilium sp . 1 водная среда 1 1 18-223? Собствен-

PenicUUun sp . 1 ОМ АОТ в бензоле' I 1 46-50% нн'ые дан-

Penicilllum sp . • — 1 икмсб. фермент а | трехфазной системе I 60-62% ..... ...........- L ные

.я-чн). конверсия составляет 78-81%. Анализ образованных продуктов доводят нзтоаом Ш/ Период полувыведения фермента из реакцион-Л среды, вычисленный по экстраполяции кривой образования 'пробегов, равен 25 ч. Пролонгированная высокая активность липазы., ь; р'лггно, связана с иммобилизацией ее на твердом носителе и за-ягпчам эффектом многоатомного спирта - глицерина. Разработанная установка имеет ряд преимуществ: 1.Не требуется приготовления эмульсий, что сиинаот необходимость перекашивания и дальнейшего разделения.

г.Мош'о избежать окисления олеиновой кислоты, поскольку ограничен доступ кислорода.

3.Масляный продукт не смешивается с глицерином, т.е. его но*.ю получить в чистом вице.

Рис.6. Схема мембреиного биореактора для синтеза глицеридов: 1- микропористые мембраны, 2- непроницаемые пластины, 3-дер-жатели; 4- каркас.

Лабораторные эксперименты позволили установить, что липазы из РепШШит вр. и Шгориэ Ыстоврогиз катализируют транеэте-1рификацйа яевду жирными кислотами и триглицеридами.' Эту реакцию можно было'бы использовать для модификации хлопкового масла раз-л-длшми жирными кислотами. Для получения модифицированного хлопкового масла возможно использовать многоколоночиый реактор, -заполненный .'неспецифичной иммобилизованной липазой из Реп\с1Шт гр. и 1,3-специФичноЯ липазой из ИМгор1Ш тигоэрогиз (рис.7). Смзсь исходного масла и олеиновой кислота (1:3.по массе) подает-

ся из специального резервуара при 45-503С на колонки с и-липопе-нилом (из РепМШит зр.) , и далее смесь частично измененного масла со стеариновой и пальмитиновой кислотами при СО" С - на лонки с и-липомикроспорином (из Шгорив т1сгозрогив). Время реакции 10-12 ч, содержание воды в реакционной системе - 0.73%, выход продуктов - до 80%.

На первом этапе триглицериды масла обогащаются олеиновой кислотой по всем трем сложноэфирным связям триглицеридов. На второй - пальмитиновой и стеариновой кислотами только по первой и третьей позициям.

Рис.7. Схема лабораторного многоколоночного биореактора для обогащения хлопкового масла свободными жирными кислотами: 1-смесь хлопкового масла и олеиновой кислоты. 2- перемешивающие устройства. 3- нагревающие устройства. 4- перистальтический насос. 5- колонки с и-липоггенилом, 6- смесь частично модифицированного масла с пальмитиновой и стеариновой кислотами. 7- колонки с и-липомикроспорином. 8- конечный продукт.

Полученное мнсло имеет измененный количественный и качествен ный жирнокислотный состав. Используя подобный принцип возможно, выбирая начальную пару реагентов и липазы с определенной специфичностью. заранее прогнозировать продукт, обладающий теми или иными свойствами в зависимости от времени нахождения в реакторе.

ВЫВОДЫ

1... Показано, что микробная липаза из Pénicillium sp. обладает способностью катализировать как реакцию гидролиза сложных эфиров глицерина, так и реакцию этерификации с достаточно высо-

:.tMii &)сомлмшк значениями проявления каталитических вьтивкос-

■:с:1. ' ' -

Изуч'.-ш услоьия проведения реакции этерификации катадизЯруе-липазой из PcnlctUlum sp. в системе обращенных мицелл АОТ в '..спзолс- и подобраны ее оптимальные условия: соотношение глнце-ргл::щрмлн кислота•> Р. [ДОТ] - 100 мМ. IE] » 0,8 мг/мл, время -л часа. ВОЙ. -О, ?.% (Wc-1.2), температура - 37° С, перемеиг.заниэ --''.о иб/кн!1.. В этих условиях процент конверсии олеиновой кислоты г тригжиаицы составляет 45-48%, Vnex«0,49±0.08 кг глицери-д^в/ч/иг i'epi'it-нта.

2. Пл",сС;>ану условия получения препарата липазы из Р;nicitllnm sp. в иммобилизованном состоянии с использованием »нюоСженного носителя (ДЭАЭ-целлвлозы) и гидрофобного сорбента г^АЭ-цвл.тпозк. кодифицированной остажаш пальниппобой к,jc.no-vi'). Ссрбционная емкость модифицированной ЛЭАЭ-целлвлози составляет 4.7,8 кг/г сорбента, гидролитическая активность ¡шмобилизо-раннон липазы - 800 ЕУмг. Сорбционная емкость немодифициротнноЯ ДПЛЭ-цемгалози составляет всего 20,7 мг/г сорбента ( активность - 650 Е/нг). "¡шаза. иммобилизованная на гидрофобном носителе (!!-лш1опь.;ил). отличается высокой активностью и температурной стабильностью (активна при 50°С). •

3. Изучены условия . проведения реакции ятерифлкацни между ¡7 нцкрииеи й олеиновой кислотой, катализируемой и--липопенилом. Оптимальными условиям,! реакции являются : соотношение субстратов -1:1, СЕЗ = 5% по массе, вода - 0,43% по массе, температура -50°С. время 35-33 часов, перемешивание - 400 об/мин. В этих условиях процент конверсии субстратов в продукты составляет €0-65%, Vtl(u = 0,625±0,04 чг глицеридов/ч/мг фермента.

4. Показано, что при заключении липазы в полость обращенных мицелл и ее . иммобилизации на твердом носителе меняется ряд свойств, • характерных для этого фермента в свободном состоянии. И в системе ОМ, и в трехфазной-системе Не наблюдается снижения синтетаэной активности при высоких концентрациях фермента, что Характерно для этой липазы в водной среде... В ом оптимальные, значения рН среды для'проявления гидролитической активности смещаются в щелочную область по сравнению с таковой для свободной липазы, s то же Еремя в этой же системе проявление слнтетазной активности не зависит от значения pli. Кроме того, изменяется влияние ионов металлов, зависимость активности от концентрации субс-

- 22 -

тратсв, специфичность, кинетические параметры.

5. Разработаны и определены конкретные биотехнологичес?и? процессы с участием иммобилизованных липаз из Pénicillium sp. (и-липопенила) и из Rhizopus microsporus (и-липомикроспсрши): разработан способ получения диглицеридов и триглицеридов в мембранном реакторе. Предложена лабораторная установка, представляющая многоколоточный реактор для обогащения растительных масел свободными жирными кислотами путем трансзтерификации.

Список райот, опубликованных по теме диссертационной работы

1. Давранов К.Д.. Гулямова К.А., Розмухамедова Б. X.. Халамейзер В.Б.. Махсумханов А., Рахимов Ш. Изучение множественных.молекулярных форм липаз, синтезируемых мицелиальными грибами. Конф;"Физиология и биохимия мииелиальных грибов в связи с проблемами биотехнологии". //Москва, 1994. С.53.

2. Davranov 1С.. Gulomova К. А., Khalameyzer V. Synthesls of glycerldes by llpases frora fimgus Pénicillium зр.// Flith Internationa! Mycologlal Co^gress, 1994, August 14-2i, N.47. P.78. vancover. Brltlsh Columbla Canada

3.Cavranov K., ' Khalameyzer V.B. Transesterlflcatlon between K-3 poiyunsaturateci fatty acld3 and cotton oll triglycéride?. Karadenlz Journal nr Médical Sciences. 1995, V.8. iï.4, P.226.

4.Давранов К.Д.. Халамейзер В.Б.. Ферментативный синтез триглице-ридов, катализируемый липазой из Pénicillium sp.// Химия природных соединений, 1995, N. 1. С. 122-126.

5.Давранов К.Д., Халамейзер В.Б., Розмухамедова Б.X. Специфичность липаз некоторых мицелиальных грибов к типу слож-ноэФирных связей.. // Прикл. биохимия и микробиология, 1996, Т. 32, N. 3, С. 294-297.

6.Давранов К.Д., Халамейзер В.Б., Вагина О.Н. Синтетазная активность липазы из Pénicillium sp. в водной среде и в системе обращенных мицелл. // Прикл. биохимия и микробиология.1996.Т.32. N. 4, С. 386-388.

7.Вагина О.Н.. Халамейзер В.Б.. Давранов К.Д. Синтетазная активность липазы из Pénicillium sp. в системе обращенных мицелл АОТ в бензоле. // Биохимия, 1995, Т. 60. II. 2. С. 263-269.

- 23 -УЗБЕКИСТАН ФАНЛАР АКАДЕНИЯСН

микробиология институти

ХШПЕЙ35? ВЛАДА БЕНИАШНОША , Биология фанларк номзоди илмий даражаспни олг.ш учун ^имоя •уюта таесия этилган "Реп1с1Шш ер. аамбуругодан олинган ли-««зашшг дояэбшшзацкя килинган препаратларн 1;рдакида глицерид-лг р синтез»" каЕзуидаги днссертацияшшг хулосалари.

Таз:?* тсконга крпатплган АОТ (сульосянтар кислс-.а диоктил ■■иирннниг катрпйлик тузи.» мицелласинкнг бензслдаги тизимида ва ¡¡¡■мобилизация килинга;: хрлатдаги уч бос^ичлик тизимда ропШШит $р. замбуругкдан олинган липааа ферменти глицерин ва ■я' кислетларинкнг эфиру,осл.т цилиш реакцияларини жадаллаитиркга. •.'¡'"батда юно-, ди- Еа триглицеридлар у,осил г,ила олнши биринчи г.".ротаба тажрнбада амалга ошрилган.

Захбуруглардан олинган липаза ферментшпшг эфир х,осил ¡;и-реакппяснни кадаллаэтирипшш. Урганиш насадила биринчи маро-таба лот кицеллаларининг Сензолдаги тигимидак файдал&нилган.Ли-л;:зглар тглк;л томонга угирилган мицеллалар бушлигига жойладти-рилгаида. улар узларшшкг айрим ^ус.усиятдаршш. ^усусан. рН-оп-тнмушши. тургунлнгтш ва надаллаштирилган улчамларяни 'узгартир-пшлиги кузатилган.

Ионалкаауэ ^усуоиятига эга булган сорбент асосида РеШсИПит гр. дан олинган липазашшг иммобилизация ^лингаи формасп "и-лштошшил" препарата олинган ва унинг баъзи хусуснят-л-рини батафсил урганилган. Бу препарат бирламчк спирт (бутанол) хг.мда пзтрслсйи зфирида эритилган олеин кислотаси ораскдаги ва учламчн спирт (глицерин) ^амда ёг кислоталари уртасида кечздиган зфирлап;'.;л реакцияларини кадаллаштирини к,эпд цилинган. Бу жараен уч модель тизимида (шски субстрат ва фермент) кетига анш;ланган.

И-лкяспенил иштирокида кадал утадиган синтез ва эфир хосил Я/1ЛИШ реакцияларшганг кинетик паракетрлари анш^ланган.

Диссертацияда "¡1-липопенил'г лрепаратини озик-ов^ат ва мик-робиолигия саноатида :^амда илмий таэди^отларда. з^усуоан, монодива триглицсридлар синтезида ишлатилиш мумкинлиги илмий асослаб берилган. Пахта егини стеарин ва пальмитин 6г кислоталари билан бойитилган йг олинган ва шу жараённи кадал утказа оладиган лаборатория ускуналари йигилгаи. Бу ускуна РепШШш! ■ вр. ва ГМгориз т'-сгоэрогиз замбуругларидаы олинган ва иммобилизация килинган липазалар асосида тузилган.

- 24 -

INSTITUTE OF MICROBIOLOGY UZBEK ACADEMY SCIENCES Thesis of dissertation "Clycerides.synthesis, catalysed f.f Immobilized lirase irons Penicillim sp." for obtaining candidate of biological sciences degree.

For the first time it was established that lipase from Penicillim sp. can catalyse the reaction of esterlficatlon between glycerol and fatty acids with forming of monoglycerides, triglycerides and triglycerides in aqueous media. In reverse micelles ,of AOT in benzene, in threephasea system with Immobilized enzyme.

System of reversed micelles of AOT in benzene was used for the study synthesis properties of fungi lipases. It was established that the incorporation of lipase into reversed micelles changes of soma Its' properties, such as pH-optlmum. catalytical parameters and others. •

For the first time lipase preparation immobilized on hydrophobic carrier was obtained. It catalysed the reaction of esterlflc&tion between primary alcohol (butanol) and oleic acid In petroleum ether and between glycerol and fatty acids In thrCephases system.

Kinetic values for the . reactions of Hydrolysis and esteriflcstlon in three model systems were calculated.

Immobilized lipase preparation can be used In scientific investigations, in food and microbial industries, for example, for dlglycerldes and triglycerides synthesis. Modified cotton oil, enriched with stearic and palmitic acids »as obtained using laboratory apparatus.