Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение липаз, продуцируемых различными вариантами гриба Rhizopus microsporus

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение липаз, продуцируемых различными вариантами гриба Rhizopus microsporus"



АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

КУЙЛИБАЕВ ИМОМАЛИ ТУЛАГАНОВИЧ

На правах рукописи

УДК 577.133.2

ИЗУЧЕНИЕ ЛИПАЗ, ПРОДУЦИРУЕМЫХ РАЗЛИЧНЫМИ ВАРИАНТАМИ

ГРИБА РШ/ОРШ М1СК05Р0Р118

03.00.23 — биотехнология 03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Ташкент-1995 г.

Работа выполнена в лаборатории ферментов микроорганизмов Института микробиологии АН РУз-

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор ДАВРАНОВ К.Д.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор БАБАЕВ К Д Кандидат биологических наук ХАСАНОВ Х.Т.

Ведущая организация — Институт Биоорганической химии

им. А.С.Садыкова АН РУз.

Защита диссертации состоится «^ »_о^^^'Я__1995 г.

и ^ чягпп на заседании Специализированного совета Д 015.02.21. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора паук в Институте микробиологии АН РУз по адресу: 700128, Ташкент-128. ул- А. Кадири, 7 Б. Факс: (3712) 417129

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН РУз.

Автореферат разослан -- 1995 г.

Ученый секретарь Специализированнного совета, доктор биологических наук.,^

профессор V '"'Л . Ж. Сафиязов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность■проблемы. Липазы (Триацил глицерол гидролазы, 3.1.1.3)-ферменты,гидролизируюшие -сложноэфирние связи-в молекулах природных липидов и синтетических триглицеомдов с образованием свободных жирных кислот,моно-диглицеридоз и глицерина. Они стали предметом широкого применение в'различных отраслях промышленности г в пищевой,- легкой, химической я также В' медицине. Новей областью, применения липазы является производство новых форм лекарственных веществ .пригодных для восполнения дефицита фермента з пищеварительном тракте.

В настоящее время препараты липаз. высокой^ степени чистоты используются для стереоспецифического анализа, структуры природных липидов.установления-состава и строения биологи-, ческих ' мембран,иммуноферментного анализа.создания биологических микроустройстз с ферментативным .усилением, препаративного синтеза липидов с определенной структурой,а комплексные препараты липаз в процессах гидролиза жиров и масел для получения жировых оспов.для производства маргаринов и майонезов. Они входят в состав.• синтетических моющих средств и в составе ферментной-композиции широко ■ используются для осветления натуральных соков, обработки шкурок,отходов шелкомотального производство и т.д.

В этой связи различные отрасли современной биотехнологии и. медицины, все-больше нуждаются в высокоочищенных препаратах липаз с определенными Физико-химическими и каталитическими свойствами. ' . ■ '

В большинстве, .случаев производство многих ферментных препаратов ,в том числе и ли'паз.основано'на использований-в качестве продуцентов -микромицетов,среди которых ■ широко рас-трсстрянено явление естественной изменчивости, е'результате чего однородная популяция активных •продуцентов ферментов в ходе свсего развития обратимо диссоциирует на зар^анты,отличающиеся по морфологии- колоний..

Этому явлению свойственна большая скорость процессов изменения популяций, а. тэкже постоянный характер этих, изменений. Как было . показанб в лаборатории- ферментов микроорга--

нйзмов Института микробиологии АН РУз изменчивости подвержен и продуцент липомикроспорина - микромицет НМаорш пИсгозро-гйа, УзЛТ-1. Установлена »что'этот.'штамм; в-процессе хранения, многократных пересевов, и культивирования'.расщепляется' ¡и -.варианты, раз дичащиеся между собой по ряду признаков, в тем числе и по способности синтезировать внеклеточные липазы.-

До-сих пор остается не выясненным вопрос о влиянии процесса естественной - изменчивости ', микроорганизмов ' на . физико-химические- и каталитические - свойства синтезируемых, ими липа:-.

■ В то же время в. результате' естественной изменчивости и за счет образования различных вариантов, частично или' полностью утративших способность синтезировать' целевой продукт ■ (липазу ), ферментная промьше.нность можеть понести большой' экономический урон. По. этой же причине' глубокие исследования физико-химических и' каталитических . свойств -липаз-, синтезируемых'различными вариантами, .позволят более углубленно по-' нять процесс"естественной изменчивости, что поможет выявить продуценты (..^а'уровне вариантов ■) липаз, более пригодные -для.решения конкретных задач биотехнологии, чем ферменты исходного варианта .'•.- •...'' • •.; ' ..' . .'■• • '.

; Настоящая работа является -частью исследований проводимых в-лаборатории.- ферритов микроорганизмов Института-микробиологии АН РУг^по- плановой теме!;"Выяснение' природы и'.'функции множественности' молекулярных, -форм ферментов .в клетках микро-оргэнизмов.Г('-». Госрегистрации 'шифр. К01930001472 )'. '• -. -

. Цель и задача, исследований-. Целью настоящего - исследования является сравнительное изучение' липазообр'азуюших способностей двух вариантов ■( "белый'/ и "серый'.' ) штамма Ийг'ориз' ш1сгозрогиз. . ■'••-.. • -'-'". .;

" Для достижения-поставленной- дели следовало .-решать 'следу г юшле .задачи:. ;'. • ' - - '

¡..сравнительное исследование, изменений активности и спектра, липаз в процессе:'. роста. различных вариантов гриба ЯМгориз Шсгозрогоз. ' . •

2. разработать вясокоэффективнкй .и/лелсоБоспрфИзводимый метод'Выделения и. очистки липаз из "белых" и "серых" вариантов-

гш*ба' Rhlzopus mlcrosporus, штамм Ж-1 fA.C.N= ¿6 79

3. сравнительно исследовать физико-химические к каталитические свойства липаз-из указанных выще вариантов гриба EMlo-pus mlcrosporus,,

4. разработка биотехнологического регламента получения комплексного препарата липомикроспорин Б из гриба Hhisopus reic-rosporus, (вариант' "оелый" ). .

• Научная ноеттота результатов. Показано, что гриб Rhisopu" mlcrosporus штамм "УзЛГ-1, в процессе хранения,- многократных пересевов и- культивирования расщепляется на варианты, различающиеся между собой по-'ряду признаков, в том-числе и по способности синтезировать внеклеточные липазы.Разработана -•схема очистки, до гомогенного состояния : липаз, из фильтрата -■ культуральной.жидкости трёх вариантов'материнский штамм (М),. .белый (Б).,'серый (С) -гриба Rhiaopps micrpsporus:y3JTr-t. При .этом на.первом этапе очистки использован новый подход - ые-'тод отделения сопутствующих ферментов .( амилаз- и-протезз' ), обработкой культуральной -жидкости растворимым крахмгкм и' -разработаны условия' их сорбции.Впервые прове-л-енс, сравнительное изучение физико-химических и каталитических свойств липаз, синтезируемых и секретируемых различными вариантами. -Показано, чти- при расщеплении Однородной популяции продуцента, образовавшиеся варианты синтезирует различные борцы липа» ,• отличающиеся по уровни специфической 'активности, s также по физико-химическим и 'каталитическим свойствам. Варианты . различаются также' по взаимному содержанию форм липг.г,гъза*-йс-тан регламент получения препарата -дипььи-липошкг'сог.орпка Е

Практическая'ценность работа. Схему очистки' позволяющую получит гомогенные по данным дискэлектро^оргза m .'ПААГ- г.ре-П&ра'ты вне клеточных 'липаз -разных рягаантов 'ггтмхэ 'Г. 77-' -гриба Eiisopus Edcrosporus. может .-.¡.¡ть вчедг-ена ь »¡р^п г-м-стзо.асокоочищбннье препараты . кзед/т применение в медицине, а также' в лабораторной практике для -структуры различных пьиррдныч ли-пилов и биологически.; мен-' о'рак. ' - . - -

-Апробация работы. Основные • положения диссертационной работа доложены на 7 ''Всероссийской конференции ./"Биосинтез ферментов . микроорганизмами "Л Москва, '1993 ), 2 конференции биохимиков Узбекистана( Чашеит, 1993 ) и на конференции молодых ученых Института микробиологии АН РУз.

Публикации.' По-, полученным данным опубликовано 5 работ.

Содержание й объем.работы. Диссертация- изложена, на 131 страницах машинописного текста,, содержит 12 таблиц и 19 рисунков.. Список, литературы включает 161 наименований.

' ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ; • ' ' .овьгкш И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментальной': работе . использовали ¡птамм УзЛТ .: 1 гриба- PhlsópM mlcrosporus (A.C. ,N=. 46.?9 32) и варианты ( белый и серый .)-.образованные в -результате многократных пере-'севов и -хранения. ■• Культуры поддерживали косьяках с..пло'таой .'сусло-агаровой средой.. \ •••• . •-. -. '. ' . -•'

Для получения-инокулша клетки, -выращиваемые- в течение суток -на косьяках при 38°С, переносили-в -жидкую,питательную среду; содержащею (г/л): кукурузный-.экстракт -20;- хлопковое масло-! О : СаС03~1,0. - Перед автоклавироеанием реакцию среды доводили до рН-5,0 внесением IM NaOH. Культуры выращивали . при -38^-4-0°в' колбах Эрленмейэра объемом 250 мл с . 50 мл питательной - среды- ка круговой; -.' (200-250 ' об/мин ') . или обратно-поступательной качалках,, а также 30 литровых: ферментерах. По окончании культивирования биомассу отделяли--фильтрованием. При необходимости длительного хранения филь-■трат, культуральной ж1Дкоста. лйофильно шсушивали и.получен-' ный сухой препарат использовали *в, качестве исходного материала для. .звделения липазы.

. Дипазнув активность.'определяли :титрометрическим. методом С Ota.., Yamada ,1967) субстратом служила. -40%-най эмульсия оливкового, масла-.в..20$-ном растворе .поливинилового спирта. Зе единицу липазкэй.' активности' приникали такое количество

¡ермента, которое ' отщепляет ■ 1 мкм . олеиновой кислоты от ■0%-ной эмульсии оливкового масла в растворе полинилозого :пирта за один час в подобранных условия*'.

Протеолитическую" активность определяли модифицированным (етодом (Каверзнева,1971). . ;'. ■ •

■ Белок-определяли по Лоури и др. (1951)'. Электрофорез в 1ААГ проводили по Лемм'ли (1970). ..... . ,.

. Молекулярную массу-очищенных форм липаз определяли двумя ¡етодами: электрофорезом в.ПААГ б присутствии додзцил' су ль-' аш натрия (flS-íia) .и гель фильтрацией на сефадексе (G -100, юпользуя в-' качестве метчиков белки с известной молекулярной ассой' фирмы - Serva. (Германия).

Для определения изоэлектрической точки- липаз- проводили гаоэлектрофокусирование в- 1% - ном ПААГ с амфолином РН 3-5 [а приборе GE-4 фирмы. Pharmacia согласно методическому ру-:ободетву фирмы. ' '...■''..■■-..■'

. Аминокислотный состав различных форы липаз - определяли юсле 24 и 48 часового гидролиза з 6Н HCl . при 110°С.

Аминокислотный анализ проводили на приборе Aniinoacichria-.yzer ААА-300 (Чехословакия ).

Для определения углеводов в составе липаз использовали ;истеиновый метод (Денисова.. Поляковский,- 19ТТ). Полученные «спериментальные данные минимум трех, повторностей, обрабо-■аны методом математической статистики (Урбах, 1975 .).

РЕЗУЛЬТАТЫ.И-ИХ ОБСНДЕШЕ. ■ •

- 1..Сравнительное исследование липаз синтезируемых'

различными вариантами гриба Ehisopus' microspbrus .• -

Грибы рода Riilzopua-хорошо- известны .'как активкьк' -прбдуг ,ента' липаз. Отличия гриба Bhlzöpua я1с'гозрогиз -Уз.ТГ-1 как ¡родуцента липазы от других микроорганизмов'-этого рода- окажись весьма существенными. < A.C. Н= 46 7 9 32) по той же -гричине , что. so-первых, липазы из этого* объекта окапались -ермоустсйчивыми, во-вторых, если другие-штаммы этого рода •акие как Rhiaopua аггМгиэ.Шгориз-'oryzae;' Rhizopus ¡filemar, Rhi¿opu3 hanchow,'. Rhlaopus fQnnasaenflia,. • RMzopus. ihlnensls. и' Hftlzopua sp. не" отличается^ большим. числом изо-

ферментов липаз, то BMzopua mlcrosporua (УзЛГ-1 ) содержит ■ целый набор этих ферментов. .Кроме этого, душ данного- штамма характерна высокая., активность вне клеточной- липазы. В ходе многократных пересевов и длительного хранения этой культуры-замечено, что она расщепляется на два варианта ("белый" и -"серый" ). .

В. диссертационной работе дана мсрфолого кудьтуральная характеристика двух вариантов'гриса по сравнений с исходной культурой. Сопоставление- -уровней- липазной активности у. "белого"0 и "серого" оаригштов, показало -на более высокую -способность "белого" варианта к синтезу липаз. Была замечена зависимость между уровнями активности липаз и стадиями роста микроорганизмов. У. обоих вариантов дипазная активность, обнаруживается, в начале логарифмической фазы роста, затем она возрастает и достигает максимума :в начале стационарной фазы роста (рис.1). .

■ На кривых изменения активностей липаз имеется второй подъем, приходящийся на конец стационарной фазы роста микроорганизмов, чуо Гга-видимому, "связано с биосинтезом различных • форм липаз." . - ■

Действительно, наличие .'нескольких форм липаз было подтверждено с .помощь» энзишграмм. вне и внутриклеточных, ферментов , полученных методом электрофореза' ё_' ПААП с последующей идентификаций липазной- активности методом Abe et.al. '(■1964). , .;' '-"-. -

Таким образом, сравнительный анализ полученных данных .-' показал, -что. различный уровень липазной активности у вариантов гриба RMzopus microsporus связан с функционированием -• множественных -молекулярных 'форм липаз и изменением соотношения между ними. .

Для сравнительного анализа молекулярных форм, синтезируемых различными вариантами гриоа Ríüzopus mlcrosporua наш выбран метод инообменной хроматографии. комплексных препаратов липаз. Первоначально из фильтрата, культуральной жидкости различных вариантов гриоа липазу осаждали четырьмя'объемами изспропанода.Подученный осадок растворяли в Gx103M фосфатном буфере РН Т,4- и подвергали, иносбменчнй [хроматографии' на -ДЗАЭ<;ефадексе в идентичных условиях (рис.2). . При этом

А,ед/мл Биомасса, г/л А,ед/мл Биомассо, г/.'

Рис.1. Изменение липазной эктиености и накопление оиомассы в динамике роста .различных вариантов гриба НМгорив вЛсгоэрогиз УзХТ-1.

а) 1-липазная.актаЕнрсть материнского штамма, .... 2-ооразование биомёсси штеркнским .итаммом.

б) З'-лйпаэкая активность белого варианта. 4-оиомэс-са оелого варианта.

в) 5-липазная активность серого варианта,-6-сиомасса серого.варианта.-

зу

10 20 30 ' 40 50 60. 70- 80 90 , Номера фракции ;. -.

Рис.2. Ионообменная хроматография комклекеных препаратов йн клеточных'липаз, различных., вариантов гриба. Rhlsopus пйслэзрс

ros .-; . •-'..' . '-,-. • .• ..а)6ариант-.М,.б>-вариант Б, в) вариант С

замечены, некоторые различия в ■эдвпионнси диаграмме белкев, секретируемих расличннми вариантами гриоа..0се тЬи1варианта (исходные -штаммы (М)' "белый (Б) "серый (С) варианты) гриоа секоетировали липазы с Ш соответственно 0,77:0,52. н-0-,43'._В культуральной жидкости варианта доминировала форма дчпз-»ы с НГ 0,77, содертакие которой достигало солее 4£?» от со-¡ззй активности фермента.. Среди внеклеточных'"липаз:, варианта "В" доминировала липаза: с И 0,52, тогда как. содержание ут^й. <1юр'те у парата - 'С" гриба было незня'иитеяьнш (табл.-, ).

, /Таблица' Ь

• Процентное содержание • различных форм'внеклеточных лилаз.. у различных вариантов гриба НМгораз и1сгозрагга ■''

Шрианты! Соотношение внеклеточных форм.г Обшая активность;: еяЛ.,Ог. .'препарата

. " ... кг о.т7 ^нг0,52 м 0,45 •• ;/

. "'. . М ] - ■ 42 ■ 33' ^ 25 2 1 36 и 20 . -! 32 гз" АС ■ ■ , 2,0 х 10'. . 2,7 х 10?-0,7 >: 10 .

По удельной активности формы -внеклеточных липаз располагаются следующим'- оовазом: ЕТ 0.52 '- Р.1 0,77 > В! 0,45.

Ча основании полученных данных- высказано предложений о том, .что различия .между- вариантами гриба ЯМ-гориз пйегозро-гиз нг связаны с биосинтезом новьж' форм^яипаз,. а.обусловлен. урс-кнем удельной ■ активности сйнтезйрованвдх •. молекулярных ■ • -форм.^рмента. ■' - -''".'

Для хаояхтооистаки ьсей суммы белков, оекоетируемых. иа-. тактными- клетками двух вариантов. №1гориз-'ш1огозрогиз -', был применен нами диск-электрофорез, в -ПААГ.Было-замечено сущеот-.Ьенное различие в наборе' внеклеточных' белков "белого."--.и "серого" вариантов №1йошэ гп1сгоярсги5-.Чем может быть объяснено изменение1' олектрсфоретических свойств сразу ' целсгр. ряда белков, выделяемых различными. вариантами-- гриба? Очег.идн-о, что' вероятность возникновения одк.оввеменных мутаций по структурным генам ряда внеклеточных.белков и.мутаций,- .приводя-' дей колониально-морфологических' мутант&в, .практически, исключена. Скорее всего к. подобным-изменениям приводят различия.в

поверхностных структурах клеток мутантов.и связанных с,ними ферментов, которые участвуют б посттрансляционной, модификации целого' набора внеклеточных белков. Для проверки .этого предположения нами было предпринято Солее детальное исотдо-' вание■молекулярных форм липаз, продуцируемых различными риактами гриба НМгориз п&сгоэрогиз.

.2. Получение высокоочищенных препаратов лилаа .из . •различных вариантов НМгориз'Пйсгозрогиз

^ . ■ • ■ В ходе выполнения • настоящей работы нами оыло замечено

изменение удельной активности внеклеточных липаз при хранении их вводном растворе. Одной'из. причин быстрой инактивации синтезированных ферментов является присутствии проте-аэ среди метаболитов продуцента^ .Действительно,анализ сопутствующих к липазе ферментов показал 'наличие в фильтрате ■ куль'тураль ной жидкости грибах - амилазы и протеазы.

Для освобождения от этих ферментов нами был.-использован . крахмал.. Подбирая условия, образования фермент - субстратного . комплекса мы'^тановили, что лучшая еороция амилазы.на растворимом, крахмале происходят при соотношении 10-12 мг крахма--, . да на 1000 ед амилазы. Крахмал, свешивали с фильтратом куль' туральной жидкости, содержащим' 202 изопропан'ола и- 20 мг СаСГ^ и смесь. БыдержиБ&яи, в /течении 30-мин при .40°С '■. ,. ■

После э-йОго .комплекс крахмала с. а- амилазой и'-содержания также протеазы - (протеаза,-осаждалась вместе с:, а-амилазой) отделяли центрифугированием 30 мин при' 18000*«.При этом остаточная .активность липазы в надссадочной жидкости составляла около 92.-94% от первоначальной.' В надосадочной'.жидкости присутствовало также около 23-25% от первоначального.количества протеазной активности,; от которых необходимо сто освободиться.Известно,что гриб НМгориз т.1сгозрогин'секрета--рует термостаоильные липазы,которые' различаются по птам -свойствам от протеаз, 'синтезируемых .этим же грибом.Именно эти'свойства, липаз- былы приняты со' внимание • при Дальнейси'х исследованиях.

' Определение • остаточной активности липаз и протеаз. после инкубации фильтрата- культуральной.яижости. при 50°С е тече-

-we .30 мин показало,' что липагная активность сохранялась до 90%, тогда как протеазная активность инактивкрс-еалагь на . 90S. Поэтому термообработка -в указанны): внше условиях oms включена как один из эффективных подходов для очистки лип-чо исследуемого гриба.Для дальнейшей очистки и пазделения фогу липаз наш был гэзра'отан трехстадийный процесс, г.аключак»-дийся ß последовательной иокоо*мс-нн.-.й хроматбграфих на колон пах с Д5АЭ - целлюлозой к гельфидьтрацией ка колонке с сефэ-де-ксом в -too с последувягй рехроматогпнФи®й т Л?АС- .целлюлозе. После TeDvociOpr-бгтки декатурироваинне оелки отделяли центрифугированием (18000 x»g.l5 мин.) и детализовали в течении 24 ч. против I 'мМ фосфатного буфера pH 7,4. Диализат наносили -на колонку с ДЗАЭ- целлюлозой уравновешенной этим хе буфером с градиентом, концентрации КаСХ.от G-до 0,3 М. При этом удельная-активность возрастала- 5. раз по .сравнению с "предыдущим этапом. На -следующем • этапе r-ыл применен, метод гельфильтрацйи на сефвдексе G-i по, который .поибодйл к рвя»»-леняв бел ко? с липаз кой активность» той фраки".:/. От.-; -"■гакции,- коток у- были осс-зикчо;:^ рлми. кг-"" rt-~"~ib"".:.*.,;: г С). Следует ст"чо"^тъ..' что взаимное еооп-пшоЛне о~;х о-оок о меняется в зависимости от возраста гультурц и условий ьул;---•п-щировзкил продуцента.

Яавершакадим этапом очиотчи служкла г<охоо»--зтогтоооя о.;-;-'.-;;бных фракций на ДОАР - се^-чдскбв А-50. ( т&',-. 2 )

Б гя=-:.ульта~е cj ;.r:i-i гух-уч^ы яяекттч ^«ткчески гомогенна; i-ормы липаз с удельно Л жт/х-псстью 51С00.ед-/«г- (форма" А); 49000' ед/мг (форма Б ) к. 33000 .ед/ыт . ( ßr-бт' С" \ - гг-стветстрекно содеэтокио отмх у —.:.т;го" изо^зкга

ттиЗл состаьляе-т Q,S-j; : Л' -и С-,';?LZ от общего количества белка. Степень чистота полученных фракцийпроверяли методами диск~эле)гГройорс»а; "ультрацентрифугйроБанил, а также огреде-лгнием 'If-концевюс ашкскислот.

Результата очистки ргйштя о- -рм .килзз представлены в

т&йя.г.

. .Таблица 2 . г Резульчати. очистки .внеклеточных липаз из ■ белого варианта гриба ЕМгорис яйсговропш

1'....-■.'■ |этвлы очисти. ! ! белок ^МГ' г------— . липазная .активность ! - ' ■ выходД степень очи-стаи

* - .*..-" удельн. ед/мг. общая, ед Юг по . бел)су по актив ности

Фильтрат культу рал ь- •'8450 610 - 5154,5

ной жидкости 100 1.00 ■ 1

Обработка крахмалом. 71.. 4 6710 .- 4793 - 0.84 93 .11

Термообработка при 50 с за мин •. 38,4 12200 4690 ■ 0,45 91 .20

ИЬнообменная хромато-

графия на ДЗАЭ-целлю- ■ -

лоза ■-■■ -;'.

-1 -пик . 9,29': 12206.7 1134 0,11 22. .20

. • 2-пик - 4 - -. .17,74 12204,1 2165 0,21 42 . 20

3-пик 10,98 12677..-6 1392 о.,1з: 27 г '21

Очистка 1-го пика 33550 ■

на сефвдексе'-С-1СЮ . 3,4.' 1133,9 0,04 " 21,9 55-

на 'ДЭАЭ-еефадекс-А-50 2,36 '45750 • 1075'. 0,028 20,6 . ' .' 75

Очистка 2-го пика ЗЬбОО' ■

.' на сефадексе-С--! 00. 5.8" 2130' 0,07 41 ' -60

на ДЭАЭ-сефадекс-А-50 4,0 51850 2085' . 0,05 40,5 . 85

Очистка 3.-го пика 1310'

на сефадексе-О-ЮО 3,9 33550 0,0.46 25,4'. ГС

на ДЭАЭгсефадекс-А-50 .2.8 45750 1275-.- 0;03 24,7 •75

3. ■ Сравнительное, изучение физико-химических '.' и'.каталитических свойств'липаз из раялич-■ шх • вариантов' Юйязриз пйсгозрогиз

С целью, выяснения связи .-между- морфологической 'изменчивостью и биосинтезом-внеклеточных -липаз различных, вариантов ЕМгориг Шсгозрегиз нами .были -изучены фгаико-химичеекие -и каталитические• свойства гомогенных препаратов фермента, выделенного из исходного .штамма (М), :а также вариантов. "Б" .и

. Выполненные исследования .показали - что,- обе. варианта гри-=-. ба также, как и. его материнский штамм'секретируэт -три Формы ЛКПОЗЫ. . ■ ...' '. •' '- ' ■ :. ' .' ■;.' .. .'.

.Молекулярную массу липаз из'.рэзгеда вариантов:определяли

нетодаж' диск-эл«ггрсф^реза б Плат? г- поисутсто»:и Б гельфальттшией на колонке с со$<шксом G-1C3 и педу-а;. величины равные соответственно 690С0; -«ЗССО; j&T-O '

Л (Б). 1'£.к следует иг полученных.результатов по в«.тачин? -молекулярных масс формы липаз иг различных вариантов сувсст етшо не ргодячйгтгя.

Изозлектрические точки 'гомогенных ферм липаз, выделенных иг пазных- вари?"тсЕ,. спре^Слгкьие м<-к>яом йокуеирования,' гязж-сктся и равняются соответственно 4,2; ■4,4 и 4^8 (М); 5,1; 4,4 и 3,6 (5); 4,3; 4,5 и 5,0 (С) и -близки значениям pj установленным да многих липаз г-нделен-ных из других лтаммос ■ гриоа рода fifcisorus. Определенные различия изоэлектрических точек,липаз из-разных вариантов достаточно^-значительны,если учесть тот факт, что разрешающая -способность. метода равна/приблизительна .0,05 рН. Это может оьпъ -результатом различий в степени' амидировакия. сгоооднл:' карбоксильных групп, образования'неодинаковых южияжи ""мгюкектвми системы ам£ояинс-Р чаких-т' ичык иекк.-: .-кка структуре лила?. - - - . '

• Изучение аминсчислотлого сосно+иых &орм лгпло -;?.f=0,S2) из разных вариантов- показало, что ьсе пти липмгн имеет-практически одинаковый. аминокислотный состав и спи -r-полне соответствуют данным, проводимый б литературе д.* л д«'~ п:й из других втаымоБ гриоа Khlaopus. Причем, сравнение дан-к.,:Х, полученных- г-я^ом а'.'тсрев позволяет отметить зкачитель-кУе Колебания-' в "аминокислотном. составе' липаз из' зтзмм-г-п -грибов рода КЫгсиж. ьйгд;* г&ннье. сви£с'лл1.ртгукт идентичности анйкоклелотного состава л^паз Ки мс-р^логичес-ких Еэриантов'и, служат определенный' аргументом в польку того, что биосинтез липазы во всех морфологических'вариантах кодируется .одним и-'тем же стру-ктурнш геном. Кслкч^отге:-;'"--соотношение основных к киелге остатков аисдажи.^ст г- с.гляг--лилаз из различных вариантов не даьп'снлет раол.::-:;-;/; изоэлектрических точек исследуемых солсог- Лтосл .2')

далее нами оыпа 'огхедзлена К- --•■ кон^еьря л. c.v-xjh.-;-:готь липгды выделенной из "Би -варианта гриба-:. Mz"Ctep- Нле-Асп- Гли- Иле- Apr- Ала- Ала- TPs- Сер- Тру- .Иле- Лег.-,. Глу-

Лей- Тре- Тир- Трп- Тре......

■ Ранее была • показано - гликопротеидная природа липазы из варианта "М" гриба. Анализ углеводных компонентов липазы вы-

■ деленной из варианта "Б", показал наличие глюкозы - ксилозы .г галактозы -'.сиаловой кислоты в. молярном соотношении -

4:2:1:1. Таким образом, полученные.экспериментальные данные подтверждают, что липазы 'из исследуемого нами объекта являются гликогф'отеидами,''хотя остается неясным значение угле-

■ водного компонента в ферментативном гидролизе липидов. .

■•Далее в последующих опытах' нами были изучены некоторые 'каталитические свойства основных-.компонентов :(ИГ=0,Б2) липаз, из трех вариантов ИМгориз гШсгозрогив на примере гидролиза . триолеина. .'•'■• - •

При изучении влияния рН-на-активность гомогенных форм' 'липаз' выяснилось,- что -'максимальную, активность они проявлякгг при значениях рН-в-пределах от -7,4 до 8,2 и по •■этим парамет-.' рам различаются дат от. друга -(рис.З).- Гомогенные ■ формы ли-,-паз различаются и по- температурным оптимума),;(рис.4).- Так, . - если оптимальное-действие липазы вариант"М7'(субстрат триоле-'. ин .или- оливковое .масло).равно-.37°С, то. для лиггазы" полученной из "Б"' варианта гриба этот-параметр равен. 38°С . тогда ка1? липаза из варианта "С" максимально активны при,40°С..". • ... .'.'• Время полу инактивации, всех трех, липаз при 50° практический одинакова. (рис.5.) •

■ При изучении влияния ионов металлов «а активность липаз отмечено, что-2п+2-, ?е+2 ¡Ре1'3 ';. Си+г ингиби'руют лилззную ; активностьв-то время как.Са*Е , Ме+г и повышают .актив-'• ность липазы, причем степень активации- возрастает по, мере увеличения концентрации солей указанных металлов. В. поисут-: ствии хлористых солей и. Са'+г (. 1'0-1М.) наблюдается не. большой -активирующий эффект - .увеличение- активности, состав. ляет 23 и: 2755,' соответственно. .;

' Механизм действие ионов, металлов-на' липазы-сложен и пол-костью не установлен. В этом' плане. существуют различные .-предположения.Так, например по мнению-японских авторов (1»а1 ег.а1.{ 1970.) ингибирование липазы солями окиснэго -к закис' ного .желеса происходит, за счет связывания этих ионов с бел-

. - V* 1,0-,' "О

РИС;3. Зависимость активности липаз от оН-(здесь и далее липа-га с В.1 0'; 52) !- вэоиант Б: 2- взсиант С

липазная активность %'

ЮОт

Температура С

Рис.4. Зависимость активности липазы от температуры (суострат олиековоё масло, фосфатно- цитратный буфер, рН 7,4)

1- вариант М:'2- вариант Б 3- вариант С

-.1

го

40

50

т

60

.Температура. С

Рис.5. Термойнактивация липазы' ■ ■"'■•

Условия: концентрация фермента 0,01%: 0,1 М ¡£сс$атно-цитратный буфер оН 7,4: субстрат. оливковое масло .

Таблица 3

Аминокислотный состав-липазы (НГ=0,52) из различных вариантов ИМаоргиз тЮгозрошз.

Аминокислота Варианты

' ' Ы Б С

Аспарагиновая кислота 32 -'30 28

Треонин 21 • 2-3' ' 24

Серин ' 32 . ' : 30 . ' 32

Глутами^овая кислота ■ 24-- 25 26 ■

Пролин . Глицин 18 . -'18 ' 20

. . 21 23 24 '■

Алании . 18 22 . - 23 • '

Цистеин. •6 б 6

Валин - '24 - '.- 25 - 24

Метионин ' 3 4- 3

Изолейцин 15' ■ . 16 - 17- '

Лейцин -18- -16 .18 '

Тирозин 12 .15 15

Фенилаланин 12 14 13

Лизин 16 17. ■-■15

Гистидин . 6 • . 6 . 6 .- '

Аргинин ' б. 6 6

Триптофан ■.-•: ' 6 6 ' 6 ' .

Сумма аминокйвяотных

остатков,М 290 . 302 , - 305

Молекулярная масса по - . - - .-

сумме ашнокислот . ' - 36619 38150- 38409

Данные получены из числа-. . ■ ' 5-

анализов ' 5 • • -

■ . Таблица ч

Некоторые свойства липаз из' различных-вариантов гриба йМаория- пйсгоарогиз ■ ■

Варианты рН оптамум Температурный оптамум, ' °С. Время1 полу инактивации при 50 С, мин. . Интервал рН стабильности

м 7,4 37 •- '120- . 5,5 - 8,0-

. -Б 7,8 38 120 ■ . '5,5 - 8,2

С 8,2 . •40 120. 5,5 -.8,5, •

ковой частью фермента, что приводит к изменению конфсрмации молекулы. Ионы .металлов могут катализировать реакцию окисления не насыщенных жирных кислот, а образовавшиеся перекисни-; соединения приводят к . ингиоированию липаз. Действие Са+''. связано не с активацией липазы, а скорее, с предотвращением икгкоирующего эффекта продуктов.липолиза.

. Изучение влияния некоторых продуктов липолиза оливкового масла'( глицерин-, олеиновая кислота ) на активность' г.г.асы показало, что все исследуемые вещества с разной степенью подавляют' лигтазную активность, Почти полное её подавление отмечено в присутствии олеата натрия, в то время как олеиновая кислота в этой же концентрации вызывает падение ли-пазной активности на 45%. Ингибирование липазной активности наблюдалось также и в-присутствии твинов 20,40,60,80 (0,1%).

Совокупность полученных данных подтвервдаеТ высказанные выше предположения о том,- что .различия -между разнымими вариантами гриба не'связаны с синтезом ими новых-форм липаз . Незначительные различия в физико-химических свойствах липаз различных вариантов можно объяснит изменением структуры Ферментного ' белка в ходе его секреции" или -дейс: лием метаболитов гр'иоа как -модифицирующих, факторов. - - .

Биотехнологические аспекты получения компексногэ препарата липазы из гриба ШИгопиБ пйсгоэрогиз

Гриб БМгориз пйсговрогиз в. силу своей изменчивости в результате многократных пересевов и хранения теряет продуктивность к ооразбванию липаз-. Появляется-быстрорастущие, но .низкопродуктавные (С) V? медленнорастущий, новысокоактивные ■ (Б), варианты этой, куль турьи По-этсМу, для производство .комплексного препэспта липаз е> поомыелгкных или в псзд;;г.сши>:к-ных условиях нк рглэмендугм'следукйую схем:,-, стли-жеи---?.;: •-•: ранее,описанной с схема А): ....

В работе описаны условия - хранения кул--туры р. бкглык,» состоянии, а также регламент получения техии'-^сксго препарата липазы липомикроспорин Б- '. ..

В'качестве примеоа-можно:привести результатов, представ-

ленных в;та0л.,-5 »-тде-.продемонстрирдзаны изменения .продук-, тизнорш культуры при пересевах.. ' •

. . ..-•-..■'. ' -. Таблица 5.

; йзменекие'некоторых параметров оелого. варианта . , гриба РМаориз ш1сгосрогиз при пересевах

. Частота Количество Липазная активность, в мл

пересевов .. биомассы -0,05 н кон на 1 ш к.х.

в г/л -

через 1 месяцев - \ ¿о 14

через 3-месяцев ■ . . . ■ " - 28

через 6. месяцев 20 .46

через 1 год . 13 . • • .' 36

Применение: Условия 'культивирования, количество посевного , . материала к состав питательной среды не отяича-; .. ' ■ ■ лись. от описанных. в экспериментальной части ра-

■ • '•■•. ■ .. бота.. .• - - ...••'

■ , . .■* Приведены среднарифметические данные из . гагги. экспериментов -

; Если, снижение .продуктивности культуры Г1ри частш.'пересевах объясняется образованием новых , бистрорастуких париян-тов гриба,то низкая эффективность тггаыма-при пересевах Через один год мокеть быть' объяснена потреблением из среды питательных веществ и накоплением продуктов обмена,. отрицатель но влияилих на продуктивность тгтаыма. ' ; ■ '

* Технологическая схема. получения технического препарата липазы.- липомикроспооина Б представлена на рис. 6."

■^НА-УПДКОЙЛУ

Рис. б. Технологическая схема получения липомикроспорина Б.(Ладыжинский завод ферментных препаратов, -Украина).

1,5- воздушный фильтр; 2,6- сателлит для

пенсгасителя; 3- инокулятор; 4- ферментатор; 7- сборник культу ральной жидкости; 3- сепаратор; 9- сборник для биомассы; 10- сборник фильтрата;" 11- бактофуга; 12- сборник вторичного фильтрата; 13- установка ультрафильтрации; 14- сборник ультраконцентрата; 15- вакуум-выпарной аппарат:

16- сборник вакуум- концентрата;

17- распылительная сущилка; 18- циклоны

СХЕМА- ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОМИКРОСПОРИНА Б "' ' Схема- А

культура ВМгориз: тЮгозрогиз, вариант Б

. Отбор белого варианта путем ■ пересевов на твердой среде - -■Чапека содержащей. 1-2% говя-

кего -жира'

Ф Е Р М Е Н Т А Ц И Я г°-36-38°С

питательная среда следующего состава: '-' кукурузный ■ экстракт - 2% хлопковое ■ . масло . - 0,7й глюкоза - 0,1% СаС03 - 0,154

М^ЗО. - 0,05%

РНИс=Г5'2-5'6 аэрация .время .культивирования 20-24 ч. '

СТЕРИЛЬНАЯ ФИЛЬТРАЦИЯ

♦ХРАНЕНИЕ КУЛЬТУРЫ.

-На агарйзованной среде Чапека со дерущей 0,1% говяжего жира при 4-6 С до е-. . месяцев (контроль .продуктивности -культуры)

фильтрат культу-ральной жидкости

К О Н;Ц

жидкостная •.. стандартизация уль- ■ трафильтрата

УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИЯ'. Р.на входе=4,0±0,2 -бар Р на-.выхбде=2,0±0,1 бар.

Й Т Р А Т-....' "'.

!Е ЛАКТОЗОЙ-

НАС

(8-12%). (корреляция-КаОН,рН .6-1) .-

СЖА КСЩЕНТРАТА НА . РАСПЫЛИТЕЛЬНОЙ СУШИЖЕ

' к°вх=140-145°С • |1°в.ых= 70-75 С ""

фасовка' упаковка .ЛИПОШ^СРОСПОРИН Б

ВЫВОДЫ*

• 1. Разработаны доступные,легковоспроизводимые методы получения высокоочикенных форм внеклеточных липаз из различны/ вариантов гриоа НМзориз пЛсгоБрогиз. При этом для очистки использован. новый'подход - осаждение сопутствующих, липазе амилаз по принципу фермент- субстратного комплекса ямилярд крахмал. Для полного удаления протеаз подобраны условия термообработки фермента. Из фильтрата культуральной жидкости различных вариантов гриба ШЦнориз т1сговрогиз выделены три формы липазы.

?.. В. сравнительном, аспекте изучены некоторые физико- хими-. ческие и каталитические свойства .очищенных форм липаз из трех вариантов'гриба ВМаориз т1'сгозрогиз.'Установлено, что Варианты "М", "Б", и "С" .гриба секретируют'липазы, практичен-'

ки идентичные по молекулярной массе и аминокислотному составу, не различающиеся по игоэлектркческим течкам, ::Н, температурному-. оптимуму и термостабильности.

3. Установлено, что различия между различными вариантами гриба КМгориз га1сгоБрогиз связаны-с синтезом новых форм липаз. Незначительные различия в. физико-химмических свойствах молекулярных форм липаз, синтезируемых различными вариантами, по-видимому, связаны с изменением структуры белка в ходе секреции или же -под действием модифицирую!®« факторов - метаболитов, гриба'. . - •'

4. На основе белого варианта гриоа Г^зориэ .ш1сгоброгцз разработан регламент получения комплексного препарата липазы •липомикроспорина Б, превышающего ло-уровню активности ранее описанный препарат в 1,3-1,5 разя. ■

...-'-СПИСОК'РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ГЮ ■ . "'. // МАТЕРИМОМ .ДИССЕРТАЦИИ '

■ 1) Давраков К.Д., Куйлиооев И.Т./ Характеристика■ молекулярных'.форм "липазы, синтезируемых грибом Шигориз тЮгозрогиз. -к.Химия прир. соединений, 1993,..N=6,-0.884-888.'

2) .Давраков К.'Д., ГулямоваК.,Розмухамедова Б.,Шамшиева М.., Куйлиооев Й.Т., .Махеум^онов А./, Биосинтез внеклеточных липаз

• грибом 'Реп1с1111цш вр. и их 'характеристика.. -Тез.. докл.' £ конф. . Биосинтез 'ферментов микроорганизмов.,- .-Москва, .1993.-с:Ю-12. ' : - .' ■/ /.'

3)Куйлибоев •. ,й .Т., - Давранов К. Д."/ Липазы морфологических :вариантов триба 'КШасриэ Мсгоэрогиз УаЛТ-1. .-. Докл. Академии Наук Республики Узбекистан, 1.994, N¿2,- с.43-45.'

.4) Куйлибсюв И.Т.,'Давранов Е.Д./ Сравнительное исследование лйпаз,' Синтезируемых морфологическими .вариантами гриба- НМ-- горизга1сгозрогиз ..УзЛТ-1.;.-Узбек-биол.журнал,' -1994, К=4, -с.21г23. ';./.,. ' . '-. ''.. '.' ' •' '.' ■ .'■ '."'■ /■:■ 5)' Куйлиооев И .Т. ,-.-рйвранов' К. Д./-' Очистка внеклеточной, лгипа--зы "Б"'; варианта гриба: ЧЩагбрш". пйсгощюгив..йЛТ-1-;- -Дрклад

• Академии, Республики Узбекистан,- (995, И=2.-с.

Узбекистон Респубдикаси Фанлйр Академия« I . Минробилогия института'-

Куйлибоев ймомали Тулаганович- ■ ; '

ВШгориз Мсгсзрстз замбуруги-хдр хил • вариантларйнинг. липаза вдсил. вдлиш' хосеаларкш зргзниа.

Биология фанлари / номзбди илмий дарахасики олишга К?йилган диссертация авторефератининг хулосапари

ЯЫгорип пйсгоэрогиз замбуруги куп йиллик. цайта экишлар, са^лащ. ва. устириш натажасида ■ • бир-биридан бир.' канча курсаткичларга, жумладан. хужайрадан тавдарига'.чщздиган ли-' лаза х,осил тфшш хусусиятлари билан фарц «илувчи вариантлар-га булиниши кузатилган. :

Шу замбуругнинг уч хил вариантлари бирламчи штамм (М), 1гр; (Б) ва кулранг (С) вариантларнинг озука сушдакларидан липаза ферментини- тоза хрлда ажратаб олишнинг янги усули иш-лаб чикллган. Бунда, тозалаининг биринчи- боедачидз липазага Зулдош 'булган фермент (амилаза ва протеаза маони ажратидда .. знгича бндашув, яъни.сувда зрувчан крахмалдан фойдаланиш ■¿умкинлиги исботланган. Биринчи маротаба щорида зикр эталон :>й.чбуру'гнинг ■ ¡сэр , хил вариантлари томонидан . фалд • ^линувчи липаэаларнйнг физик-кимбвий ва:каталитак хусусият- : пари' тавдослаб урганилган. •■'••*

курсатилганидек,- оьрламчи вариант и(скиг& оулинганда .' фсия' булгян вариантлар- специфик' зктивлйк даразгаси,' Бйзик-кимевий-ва каталитик хусусиятлари-билан: бир-<5иридан •;• &арк килувчи липазанинг хав-яил молекуляр- формаларинй■дссйл-далиши кузатилган. ■■ ■ ■ . ■

Пипомикроспорин В ( ¡топаза ферментининг - комплекс х*7,1Щ куп микдорда олив усуллари (• завод шароитида } ?а

амалга ощириливи оарур Ьулгак йуоикяомалар г тэзсикгап : ишэб чикилган.

Institute of.' microbiology, " Uzbekistan - Academy - of Sciences, Tashkent

KuillbaeV imomali- Tulaganovich.

Study of lipase produced by various variants of -fungus Rhizopus microsporus. -

Thesis of. dissertation for obtaining of '• candidate of biological sciences degree ■

.It have been shown■ that fungus,'RMzopus microsporus"sp-. lits morphological, variants during, storage and vepeated cultivation. These variants are different on some properties,, among therathe apillty.to synthesise.the extracellular lipases. The shcem'e of purflcation of the lipases from the cultural filtrate -.of three morphological variants . ( maternal strain (M), #jy.te strain (W), grey strain (G).o.f fungus Rhizopus microsporus) to homogeneity'.prepartions have been devised. ,•..'.. . : . * "

We used thé new method of separation the .ballast- proteins .(amilasé arid protease) by starch'treat meat.

,.' . Candi tlëns of'the sobtiqn.of .these ensumes. have, bee devised too. Forthe first time we carried out the comprative Investigation of physicalchemlcal and catalytic properties of the lipases. -Syn-thesised and secreted by morphological variants.'

■ It have been, shownthot on splitting of homogeneous-producer; formed morphological variants synthesise lipase forms which are differ on specific activity physical-chemical and catalytical properties.- Technigus of production of complex lipase preparation, 'Lipomicrospcrine B, have been devised.