Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Очистка и иммобилизация некоторых липолитических ферментов (фосфолипаза С, щелочная липаза)

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Очистка и иммобилизация некоторых липолитических ферментов (фосфолипаза С, щелочная липаза)"

ЧБ 01\

1 п г.П? Ю

1 а Ш? г'

• " АХА^ЕХШ НАУК ГШШЛШ УЗБЕКИСТАН

ИНСТИТЛ' и:;КР0Б1ЮЛ0Г1И

Ш 57?. 13.004.14:577.152.3.1

СОФЬИНА Елена Яковлевна

ОЧИСТКА И ИММОБИЛИЗАЦИЯ НЕКОТОРЫХ ЛЙПОЛКТИЧЕСККХ ССГ;.£К103 СФОСФОЛШЗА С, дЗЛСЧНАЯ ЛИПАЗА)

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диесертац'лл на соискание учекоП сгспони ■ нандидага'биологических наук

Таи.танг - 1235

,ота выполнена на кафедре биотехнологии Ташкентского государственного университета

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Рахимов М.М.

доктор биологических наук профессор Алкатов К.Т.;

кандидат биологических на стариий научный сотрудник Ахмедова

Бедусая организация: Институт физиологии и бкофкзкки АК РУз

Защита состоится " /3 " u'sS/JC-SJj* IS95 г. s-ij часов на заседании Специализированного Совета Д 015.02.21 по защите"диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте микробиологии АН РУз по сдгесу: 700128, г. Ташкент, ул. А.Кадирий, 7б. '

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН РУз.

Автореферат разослан " г, ISS5 г.

Учений секретарь Специализированного Совета CA§r'I?30B S

; биологических наук, ,

:сотессор

}

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми. Инженерная знзимология, наряду с такими разделами биотехнология как генная инженерия, иммуннобиотехноло-гия и др., является одним из наиболее перспективных направлений современной биологии. В основе этого направления лежит проблема создания технологичных биокатализаторов (модификация их с приданием определённых свойств к достижением многократности использования путём иммобилизации, стабилизации и т.д.). Для многих фер~ ментол ата проблема успешно решена. В.последние годы..особый интерес обращен к фермента.-', действующим в гетерогенной среде, когда ввиду нерастворимости субстрат?, известные подходи иногда оказывается неприемлем-.;:'.1.!. К таким ферментам «уносятся и липолитичесхие. которые, обладая рядом уникальных снах*г, имеют широхие перспективы использования в различных областях народного хозяйства и не-диинны. Они представляют интерес как с исследовательской точки зрения, так и с практической технологичной стороны - в бытовой химии, кожевенной и меховой промышленности, в масло-жировой подотрасли и т.д. Введение ферментативной стадии во многий процессы позволяет значительно увеличить выход продукции, повысить её ка-•гот!!о, сэкономить дорогостоящее сырье, а также у совершенствовать гйлН0.*.0г;:1 . К лиу.кгзруюкт факторам расширения использования ли-гелитвчост относятся де|кцат ассортимента к объёма

гак !>ксскосчл;*!шнх, имегсах больвус ценность в аналитическом п.-.ньс, так и Ексокоактнь-ных стабильных, в тон числе и им-

чс( ,!.-.::ьсра1 ферментных препаратов для практического использования .

3 «астоявее время в направлении разработок простых схем мае--¿.таОируомого получения высокоочисгенных, а также технологически э£фоктиэнкг препарате» липодитичоских ферментов ведутся интенсив-;:ьг зссдодогзкия. Несколько успеснах разработок проведено в нашей лоратории с нейтральной и кислой липазами, фосфолипазой ^ различного происхождения, фосфолипазой Д. й'Кастоящей работе эти исследования продолжены в отношении фосфолипаэы С и щелочной липазы. Рэзработ?Гны„дост> пные методы очистки этих ферментоЕ, а также получены из них стабилизированные и активные иммобилизованные формы.

Цель и задачи работы. Цельс диссертационной работы было составление простых схем^ очистки микробных липолитических ферментов - фосфолипазы С и щелочной липазы - с использованием на основных

~ 4 -

I

этапах дешевых отечественных материалов, позволяющих проводить масштабирование процессов и получать при разной степени затрат ферменты с определённой степенью чистоты в зависимости от предъявляемых требований; разработка технологически эффективных стабилизированных и иммобилизованных форм ферментов и путей их практического использования.

В связи с отим предстояло реиить следующие задачи:

1. Подобрать эффективные способы очистки фосфолилазы С и мелочной липазы на основе дешевых материалов отечественного производства.

2. Получить стабилизированные и иммобилизованные формы ферментов, сохраняюаие высокую активность при многократном использовании.

3. Исследовать возможность использования полученных препаратов в процессах переработки масел и жиров.

4. Разработать технологические схемы для процессов с участием липолитических ферментных препаратов.

Научная новизна работы. Впервые показана возможность эффективного использования группового биоспецифического сорбента по-дианид-кефалина (поликефамида) для аффинного извлечения фос4олж паз С. В результате этой стадии основной изофермент I фосфолипа-зн с из С1. рвгГг1яавп» очищен в 64800 раза при выходе 50%, что сопоставимо с результатами очистки этого фермента на сорбентах о полисахаридной основой.

Разработана схема очистки липазы из аеги^поаа , позволяющая посредством несложной операции кислотного осаждения фермента избавиться от основной части балластных веществ и, в том числе от полисахаридов, без значительной потери активности. В противоположность этому, известные способы разделения липопо-лнсахарид-липазного комплекса, используемые при очистке этого фермента, представляют собой трудоёмкий процесс.

Осуществлена стабилизация термолабильной фосфолипазы С из «. регГг5пбвп* . путём конъюгирования с ингибитором протеиказ, в результате чего ахтивность полученной термостабильной фракции не падала в течение часа при 50°С. Для практического осуществления кснъвгяроваккя разработан направленный метод с использованием фиксация фермента на поликефамидс.

Впервые получены и охарактеризованы иммобилизованные на различных носителях формы липазы ИЗ Ре. авп^вдаа . сохранявшие эффективность при многократном использовании.

Показана возможность практического приложения полученных липолитических препаратов в процессах обогащения определёнными жирными кислотами растительных масел, фосфолипазы С - для усовершенствования рафинации с увеличением выхода фосфатидов.

Практическая ценность. В результате проведённых исследований разработаны схемы очистки фосфолипазы С и щелочной липазы, позволявшие на основе доступных дешевых материалов получать частично очищенные препараты с возможной дочисткой дополнительными стадиями в зависимости от требуемой степени чистоты.

Полученные технологически эффективные иммобилизованные формы иелочной липазы могут быть использованы в различных процессах с применением липолитических ферментов. В частности, в данной работе исследована возможность применения щелочной липазы для обогащения жиров и масел полиненасыденными жирными кислотами посредством гидролиза и переэтерификации, фосфолипазы С - для увеличения выхода фосфатидов из растительных масел в процессе рафинации.

Часть результатов диссертационной работы вошла в программу йольаого практикума для студентов биолого-почвенного факультета Ташкентского госуниверситета, специализирующихся по кафедре биотехнологии.

Апробация работы, Материалы диссертационной работы были доложены на 1У Конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Ашхабад, 1986), на Всесоюзно!5 конференции с участием ~чрми я»*.-*' " "%делвние, анализ, очистка и свойства бися« - чесг'- 8г"к."ных -¡оедииений" (Сухуми, 1987), на 1У Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Тан-кент, 1968), на УН Всесоюзном симпозиуме "Инженерная знзимочо-гия" (Москва, 1991).

.'?>бдикаиии. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования и изложения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы. Диссерта-

ционная работа изложена на 148 страницах машинописного текста, содержит Ю таблиц и 25 рисунков. Список литературы включает 176 источников, опубликованных з отечественных и зарубежных изданиях.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

I. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В работе использованы частично очищенная осаждениями солями аммония фракция изофермента I фосфолипазы С из oi. pertrin-gsпв птамма 3P6Kjf28 типа А, полученная из Московского научно-исследовательского института вакцин и сывороток МЗ СССР, лиофи-лизироватшй препарат фосфолипазы С из в. cereue (Олайне) и аммонийный препарат щелочной лкпазы ПОх из Pa. aeruginosa ИН25а, полученный из НПО "Биотехнология".

Определение активности липслитических препаратов проводили методом потенциомбтрического титрования при постоянном значении рН среды ( Dennie, 1975 ) • Субстратом для фосфолипазы С служили либо суммарные фосфолипиды, выделенные из яичных желтков, либо индивидуальный лецитин ( Singleton et al., 1965 ), для липазы в серийных экспериментах - трибутирин. Продукты реакции анализировали методом микротонкослойной хроматографии (Кейтс, 1975). Содержание углеводов в препаратах определяли с использованием антронового реагента (Туркина и др., 1971). Белок определяли по методу Лоури ( Lowy et »г., 1957 ), фосфор - по методу Васькойского ( Veekovaicy et eJL,, 1975 )•

Аффинные сорбенты на основе полиамида и с.иликагель-полиа-мида синтезировали путём ковалентного присоединения лигандов через глутаровый диальдегид (Ахмеджанов, 1981) или карбодкикид-ЬУМ способом С Hornby et »1., 1970 )»

Адсорбционную иммобилизацию липазы осуществляли из 0,1 М фосфатного буфера, рН 9,0, содержащего препарат стдиализованио-го фермента с концентрацией,! мг/мл. Нагрузка фермента - 10 мг на I г сорбента. Ковалентное связывание с нерастворимым носителем проводили по аминогруппам белка и подложки через глутаровый диальдегид. Модификации фермента водорастворимым полимером -нинилпиррол идо н аллилглицериловым эфиром (ВП-АГЗ) проводили по опоксигрулпач носителя к аминогруппам белка при щелочных значениях рН среды (Таджиев, 1982).

Определение хириокислотного состава продуктов ферментатив"

ного превращения липидов проводили после предварительного гидролиза ооразцоз. и получения метиловых эфиров жирных кислот С canedu at ai., хуб7 ). Анализ метиловых зфиров осуществляли с помощью газо-жидкостной хроматографии в НИИХРВ РУз.

2. ОЧИСТКА ФОСФОЛЙПАЗЫ С. Первый этап исследований был направлен ка разработку эффективных и доступных способов очистки липолитических ферментов

Для очистки основного изофермента I фосфолйпазы С из oi. porfrtngene использовали аффинную хроматографии, на поликефа-миде. Варьирование факторов среды при изучении условий сорбции и десорбции показало сложный характер образующегося фермент-ли-гандного комплекса и позволило выбрать определённые условия проведения хроматографии. Сорбцию фермента проводили из 0,1 М универсального буфера, рН 5,6, содержащего I мМ z„oi2 , элвиро-вание осуществляли градиентной подачей раствора деэохеихолата натрия в концентрациях от 0 до \%. Результаты очистки приведены в таблице I.

Таблица I.

Результаты очистки изофермента I фосфолйпазы С из

Cl. perfrin^eno.

Стадии очистки

)

■Белок!

Активность

(удельная(общая MI j ед/мг i ед

I

•Степень Выход .'очистки раз

ч/

Первичный концентрат

Препарат изофермента I

Аффинная хроматография (поликефамид)

Гель-фильтрация (ультрагель АсА 54)

0,005

24 17 100 3400

0,64 324 -207 50 64800

0,30 372 112 27(41)* 74400

* Значение в скобках соответствует выходу активного

* фермента с учётом потерь при концентрировании (удаление агрегированного неактивного белка центрифугированием) - расчётная величина.

После аффинной хроматографии была достигнута высокая степень очистки фермента.по сравнению с первичная концентратом из культуральной жидкости. Однако препарат, полученный на этой стадии, по данным диск-электрофореза в ПААГ, содержал некоторое

Т 12 16

объём фракций, мл

чгд

30 90, .150

обгем фракций,*мл

1278

0 I >

Рис.1. Очистка изофермента I фосфолипаэы С из и. РегтпЁепв в - аффинная фроматография на поликефамидв; б - гель-фильтрация через ультрагель АсА I - активность, 2 белок, 3 - градиент концентрации дезоксихолата натрия. Стрелкой обозначено начало элюирования. В поле рисунков - данные гель-электрофореза.

количество балластных белков (рис.1,а); Для получения электро-форетически однородного препарата дополнительно проводили гель-фильтрацию через ультрагель АсА 54 (рис.1,6).

Разработанный метод аффинной хроматографии на поликефами-де фос<| олипазы С из 01. рогт^ва» оказался приемлемым для очистки фосфолипаз С из других источников. В частности, на по-ликефамиде продемонстрирована очистка фосфолипазы С из а. евг«-

ио.

3. ОЧИСТКА ЩЕЛОЧНОЙ ЛИПАЗЫ ИЗ р». шншоза. Разработана схема очистки щелочной липазы из Ра. »вги^пова, ьклсчэвщая первой основной стадией кислотное осаждение фермента из кк,с1 -кн^сн буфера снижением рН среды до 4,0. В результате удавалось сразу же избавиться от значительной части балластных веиеств (97$ полисахаридов и 82$ белка оставалось в супернатан-те после осаждения 84# активного фермента) (табл.2).

Таблица 2,

Результаты очистки липазы из рз. в&гиг1пова.

I

Выход¡Степень

% |ОЧИСТКИ

| раз

Исходный препарат 769 1258,2 5,8 216,9 121,1 100 I

¡Сислотное осаждение 50 1051,А 27,2 38,7 3,4 83,6 4,7

Хроматография I С гидроксиапатит) 165,5 10,7 458,2 92^3 15,5 13,2 1,8 Зб|4 15*9 49,6

Хроматография 2 [.биогель Р-ЮО) 41,1 39,6 32*8 142^8 1,0л- о;г 3,3 6,8 2*6 24*6

5,9

В результате адсорбционной хроматографии, проведенной на :ледувдем этапе, при элюции градиентным увеличением концентра-дни буферного раствора (0,01-0,50М) фермент выходил двумя пикам с разной удельной активностью (10,7 и 92,3 ед/мг) (рис.2,а). 1ополнительная хроматография индивидуально обоих пиков на биоге-:е Р-ЮО демонстрировала синхронное элвирование активных фрак-

Стадии очистки

! I ;

Сухие! Активность !Белок

в~ва!общая!удель--! мг ! ед ! ная, ! ! ! ел/мг!

Углеводы, мг

АО - ч

Рис.2. Очистка щелочной липазы ИЗ* Ра. aemginoaa

а - хроматография на гвдрохсиапатите; б - гель-фильтрация через биогель P-I00 объединённой фракции I; в -гель-фильтрация через биогель Р-ЮО объединённой фракции II: I ~ активность, 2 » оптическое поглощение при А* 260 нм, 3 - белок, определённый по методу Лоури.

ций в обоих вариантах при разном объёме балластных веществ... (рис.2,6 и в). После хроматографии на. биогеле достигалась высокая степень очистки фермента, однако низким был на этой стадии выход фермента, что указывало на целесообразность, если допускают требования к препарату, останавливаться на предшествующем этапе, либо вводить дополнительные стабилизирующие факторы.

СТАБИЛИЗАЦИЯ ФОСФОЛИПАЗЫ С.

Для повышения стабильности термолабильной фосфолипазы С из С1. рогтпаепв • осуществляли конъюгацию фермента с белковым ингибитором протеиназ. Конъюгирование проводили посредством ковалентного связывания молекул фермента и ингибитора через глутаровый дяальдегид по аминогруппам белков. С целью исключения неспецифического хаотичного связнвани1„ а .также избежания инактивации фермента вследствие случайного блокирования активного центра, конъюгирование осуществляли разработанным направленным путём непосредственно на аффинном со]Йенте - поликефами-де - после предварительной адсорбции фосфолипазы С» Схема процесса представлена на рис.3.

Рис. 3. Принципиальная схема проведения процесса направленного кокъсгирования фосфолипазы С о ингибитором протеиназ -о предварительной адсорбцией фермента на поликефамиде. Условные обозначения:

<1лС„~ фосфолипаза С; ИТ - ингибитор трипсина; ГА - глутаровый диальдегид; ДОХ - дезоксихолат натрия; §ЭА -лиганд - фосфатидилэтаноламин.

Конъюгат снимали с сорбента обычной олсцией в условиях, подобранных для аффинной хроматографии фосфолипазы на поликефамиде. При элюировании конъсгата в колоночном режиме получали основную термостабильную и "хвостовую", перегруженную ингибитором, термолабильную фракции (рис.^.а). Конъюгированный фермент из термостабильной фракции сохранял активность в течение часа при 50°С с некоторой активацией в первые 15 минут (рис.б).

ИТ, %тт

50.

Рис.2». Стабилизация фосфолипазы С путём кснъюгирования с ингибитором г.ротеиназ:

а - профиль олюции конъюгата фосфолипазы С с Й1 с поли~ кефамида: I - активность фосфолипазы, 2 - трипсин-ииги-бирующая активность, 3 - белок;

б ~ термостабильность фосфолипазы С из ох. рогГПпеепв при 50 С: I - нативный фермент, 2 - фермент, конъюгированный с ИТ, фракция X, 3 - фермент, конъюгированный с ИТ,- фракция II.

5. ИММОБИЛИЗАЦИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ЛИПАШ ИЗ гз. АЕнилкозл.

НА РАЗЛИЧНЫХ НОСИТЕЛЯХ.

В сравнительном аспекте была 'исследована эффективность иммобилизации липазы ИЗ ?в. аегиг1поаа на различных носителях.

Иммобилизацию осуществляли ковалентно через глутаровый ди-алъдегид на полиамиде (ПА) и магнетите, покрытом полиамидом (Ре^О^-ПА), через эпоксигруппы на водорастворимом полимере -внкилпирролидок аллилглицериловом эфире (ВП-АГЗ) и адсорбцион-но на коиооменных сорбентах - ДЗАЗ-целлюлозз и ДЭАЗ-сфероне и биоспецифических - поликефамиде (ПА-ФЗА), силикагель-полпкефа-

Таблица 3.

Показателя ;:ичоб;:л.'5ауии липазы из Ра. аегизхпоаа на различных носителях.

Вид косптеля Количество '¡ДСОГ-бИВО-2аиного Количество связанного активного Активность иммобилизованной липазы % остаточной активности после

М17 г фермента, ед/г ед/мг адсор-! бированного ! белка ! ед/г сорбента иммобилизации

ПА 6,6 102 3,0 16,0 15,7

ПА-гЗА 3,2 т 2ч,г 77,4 53,6

СЛ-ПА-5ЭА 2,7 54 4,0 10,8 20,0

СЛ—ПА—Гц{ 2,9 цц 4,1 11,6 26,0

116 М. 10,2 8,8

Т £ II? 12,2 19,8 16,9

ДЗАЭ-цел.-; с л о з а 2,5 37 11,4 28,5 76,0

ДЭАЭ-сферон т г, 38 21,1 31,7 82,6

-й -

мидв (СЛ-ПА~§ЭА), магнетит-поликефамиде (Реу^-ПА-ФЗА) и сили-кагель-полиамид-пальмитиновой кислоте (СЛ-ПА-ПК). Наибольшей ёмкостью по количеству адсорбированного фермента обладали сорбенты на полиамидной основе и на основе магнетита, покрытого полиамидом (табл.3). Как видно из таблицы, более высокая активность была сохранена после иммобилизации путём биоспецифической и ионной адсорбции. Исследования показали достаточную прочность связывания фермента даже при адсорбционной иммобили-» зации (табл.'»). Высокая активность сохранялась после многократного использования полученных препаратов (табл.5). Липаза» иммобилизованная на ДЭАЭ-сфероне, кроме того, в течение первых пяти циклов демонстрировала даже значительную активацию фермента (до 200$ от исходного значения).

Таблица 4.

Десорбция щелочной липазы с носителей.

Элоирувщий | % элюированной активности

ПА-$ЭА ¡ДЭАЭ-сферон ¡ДЭАЗ -целлюлоза

Универсальный буфер ОДМ, рН 5 т 7,4 2.5

- » - рН 7 ■ 0 0 0

- " - рН10 11.3 0 0

0,5Я ПВС м 0,9 -

2 М Ка01 • 1 6,4 0 0

1% тритон Х-100 ** - . 1,6 0

Таблица 5.

Кратность использования иммобилизованной щелочной липазы.

; Сохраненная активность, % от начальной

{ ПА-ФЭА | ДЭАЭ-сферон ¡ДЗАЭ-целлюлоза

'I. 100 100 100

2. 87,6 225,2 64,1

3. 75,7 184,0 57,2

4. 67,9 173,0 54,3

5. 65,4 114,8 33,8

тзкизратура рН

Рис.5. Свойства иммобилизованной липазм:

а - остаточная активность фермента поело инкубации в течение часа при 60°С; б - субстратная зависимость расцепления трибутирина в координатах ЛаЯнуивера-Берка; » - зависимость активности от температуры; г - рН-зевискмость. I - нативный фермент; 2 - ДЭАЭ-сферон-липаза; 3 - ДЭАЭ-целлюлоза-липаза; 4 - ШНгЭА-липаза; 5 - ПА-липаза; 6 -ВП-АГЭ-липаза.

Изучение свойств иммобилизованных форм липазы (рис.5) показало в раде вариантов снижение стабильности в сравнении с исходным препаратом. Стабилизация с активацией липазы в кислой и нейтральной областях наблюдалась при иммобилизации на ДЭАЭ-сферон^ и стабилизация в нейтральной области происходила при иммобилизации на ВП-АГЭ. Температурный оптимум для большинстве иммобилизованных форм не изменялся. Происходило незначительное смещение рН-оптимума фермента в щелочную область после иммобилизации на нерастворимых носителях и более значительный сдвиг (до рН 9,5) при иммобилизации на ВП-АГЗ. Иммобилизация липазы на ДЭАЭ-сфероне, поликефамиде и полиамиде не изменяла сродстга этого фермента к трибутириьу. Значение Км увеличивалось после иммобилизации липазы на ДЗАЭ-целлслозе, Максимальная скорость реакции достигала большей величины после иммобилизации липазы на биоспецифических и ионообменных сорбентах и была ниже после ковалентного связывания фермента,

6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ Ф0СФ0ЛИПАЗЫ С И ЩЕЛОЧНОЙ ЛИПАЗЫ В ПРОЦЕССАХ ПЕРЕРАБОТКИ МАСЕЛ И КИРОВ.

Показано, что включение фосфолипазы С в процесс рафинации хлопкового масла на стадии гидратации позволяет увеличить выход фосфатидов, являвшихся одновременно'ценным самостоятельным продуктом и нежелательной примесью в составе масла (табл.6). Сущность предложенного способа заключается в том, что фосфоли-паза С, расцепляя -офирнус связь между диглицеридом и замеаен-ной фосфорной кислотой в растительных маслах, увеличивает коли< чество гидратируемвх фосфатидов аа счёт перехода в водную фазу фосфорсодержащих продуктов.

Таблица 6.

Гидратация чёрного хлопкового масла традиционным и ферментативным способами.

Операции Контроль

Гидратация традиционная Гидратация с фд-зой С, ЗОмин Гидратация с фл-зой С, бОмин

! Содержание Р,мг! Выход

1на 100 г масла! фосфатидов,£

102,2 100

51,1 50

24,5 76

15,3 85

Исследована возможность использования щелочной липазы в биоконверсии растительных масел и животных жиров. Проведен ферментативный гидролиз рыбьего жира из сельди иваси. Сравнительный анализ жирнокислотного состава исходного жира и Фракции свободных жирных кислот (СЖК), полученной после проведения ферментативного процесса, показал значительное уменьшение относительного количества суммарных полиненасыщенных жирных кислот (табл.7), что свидетельствовало о их увеличении в смеси три- и диглицеридов в продукте. Таким образом, возможно использование щелочной липазы для обогащения рыбьего жира диетологически ценными полиненасыщенными жирными кислотами.

Таблица 7.

Содержание полиненаскщенных жирных кислот в ихтиеновом масле

сельди иваси и в продуктах его ферментативного гидролиза.

Кислота 1 Содержание жирных кислот, %

¡ИхтиеноБое масло ! Фракция СКК '.после гидролиза

20:5 13,5 9,9

22:6 11,7 8,7

20:5 + 22:6 25,1 17,6

Проводили также изучение возможности применения щелочной липазы для переэтерификации подсолнечного и оливкового масел с полиненасыщенной жирной кислотой, а именно эйкозопентаено-вой, не входящей в жирнокислотный состав исходных масел.

Целью исследования было показать включение этой кислоты в состав масел. После проведения процесса в составе триглице-ридов были обнаружены следы эйкозопентаеновой кислоты, что свидетельствовало прошедшей в некоторой степени переэтерификации между триглицеридами и донорной жирной кислотой, т.е. показана принципиальная возможность использования щелочной липазы и в этом процессе.

Для практического осуществления ферментативных процессов с участием иммобилизованной липаза предложена технологическая схема, основной позицией которой является реактор с мешалкой, на лопастях которой непосредственно локализован фермент. Суспензия иммобилизованного фермента помещается тонким слоем в зазоре между сетками, натянутыми на каркас (рис.6).

Рис.6. Технологическая схема ферментативной переработки жировых композиций:

а - схема основных позиций: I - приёмник; 2 - теплообменник; 3 - насос; 4 - реактор; 5 - смеситель; 6 - ёмкость для целочя; 7 - ёмкость для воды; 8 - центрифуга; 9 - вакуум-сушильный аппарат;

<5 - лопастная мешалка реактора с локализованным ферментом: I - металлический каркас; 2 - капроновая ячеестая сеть;,. 3 - суспензия иммобилизованной липазы.

~ 19 -

БУВОДН

1. Разработан простой способ очистки основного изоформен-та I фосфолипазы С из С1. регШг^епв , включающей в качестве основной стадии аффиннув хроматографию на полиамид-кефалиие

(лоликефамиде), после которой достигнута степень очистки фермента в £ЛВ00 раза с выходом 50% по активности. Показана возможность использования аффинного сорбента для очистки фосфоли-паз С из других источников.

Очищена в 25 раз щелочная липаза из Ро. аегизтоеа , Предложено кислотное осаждение фермента для отделения от полисахаридов и балластных белков, в результате которого удавалось отделить более 96$ полисахаридов при сохранении активного фермента.

2. Предложен новый подход для стабилизации фосфолипазы С путём конъюгирования с ингибитором протеиназ. В результате полученная термоетабильная фракция сохраняла фосфолипазную активность на исходном уровне в течеги.-; о<*. при 50°С при некоторой активации в начальные 15 минут. Разработан направленный метод кон'Ьйгирования с использованием полпкефамида.

Получены и охарактеризованы иммобилизованные на различных носителях формы щелочной липазы ИЗ Ра. аеги£1гшяй , сохранявшие высокую активность при пяти-десятикратном цикле работы. Показаны преимущества препарата ДЭЛЭ-сферон-липазы в сравнении с другими вариантами (активация фермента после иммобилизации к при повторном использовании, а также стабилизация и актива-.V-.я в кислых и нейтральных областях рП среды при 50°С).

3. Показана принципиальная возможность использования препаратов щелочной липазы в процессе обогащения рыбьего жира, подсолнечного и оливкового масел полиненасыщенными жирными кислотами и фосфолипазы С в процессе рафинации хлопкового масла для увеличения выхода ценных биологически активных веществ - фосфатидов - с 50 до 85$.

4. Разработана технологическая схема для ферментативной обработки масел и киров препаратами иммобилизованной липазы. Предложена локализация иммобилизованного фермента непосредственно на лопастях мешалки реактора.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Софьина E.H., Сагатова i.A., Ахмеджанов P.A., Рахимов М.М, Очистка изофермента I фосфолипазы С из oioetridiim j>»r-fringen» //Хим. природн. соед. - 1988. - №6. - С.888-890.

2. Рахимов М.М., Ахмеджанов P.A., Софьина E.ß., Сагатова Ф.А., Шеманова Г,$. Очистка изофермента I фосфолипазы С из cioetridiun perfringen» и некоторые его свойства //Биохимия.

- 1989. - Т.», вып.8. - C.I3I5-I324.

3. Софьина Е.Я. Биоспецифическая и ковалентная иммобилизация щелочной липазы ИЗ Peeudcoonae aeruginosa //Актуальные вопросы физиологии, биохимии и биотехнологии. - Таикент, 1990. - С.21-26.

А. Софьина Е.Я., Рахимов М.М., Етейн И.В., Аренде Й.М.; Дорохов В,В. Адсорбционная иммобилизация «елочной липазы // Прикл. биохим.и микробиол. - 1991. - Т.27,вып.- С.523-528.

5. Ахмеджанов P.A., Вахабов А.Х., Салихова З.Т., Софьина Е.Я. Биоспецифические материалы на основе полиамидов для биотехнологических целей //1У Конф. биохимиков республик Средней Азии и Казахстана. - Тез.докл. - Ашхабад, 1986. - С.10.

6. Рахимов М.М., Ахмеджанов P.A., Салихова З.Т., Якубов И.Т., Софьина Е.Я. Очистка фосфолипаэ методом биоспецифической адсорбционной хроматографии //Всес. конф. с участием фирмы " » "Выделение, анализ, очистка и свойства биологически активных соединений". - Тез.докл. - Сухуми,1987, - C.1I -12.

7. Софьина Е.Я., Сагатова Ф.А. Изоферыент I фосфолипазы С из oi-oetri<liua рвг^ч*" : очистка, свойства, иммобилизация //1У Всес.конф. "Биосинтез ферментов микроорганизмами".

- Тез.докл. - Ташкент,1988. - С.Ш.

8. Софьина Е.Е., Мухитдинова JUH«, Рахимов М.М, Очистка и получение препаратов иммобилизованной липазы из р»«иа<мог.м asruginooa //УН Всес.симп. "Инженерная энзимология". -Тез.докл. - Москва,1991. - C.I6I-I62.

9. 3of'ine fi.í«., Kukhttdinov«. Ь.К., RakMaov Н.М. Purification

and preparation of immobilized lipase fron: Paeudoaooa« aeruginosa // oiochex. oiotcch. Elect. Expresa Cata. Rueeiao Bloches, ¡c. Biotech. - 19? -V.I, n.2/5.

Purification and inrobilization cf seme lipolitic enzyrs-s ( phospholipase C, alcaiine lipase)

A procedure for the purification, ir-obiligation and sts-Dili-ation o£ izGenzyme 1 of phosphoUpsse C from Clostridia

perfrir.ges and alcaiine lipase from Pseudomas aeruginosa v:ere develcpc-d.

The isoenzyme of phospholipase C was purified using the affinity chromatography on polyanide-phospl^tidyl ethar.Glamine (polyanide) and gel filtration through Ultrcgel AcA-54 with enzyme yield 41X and degree of purification 74400 times.

The alcaiine lipase was purified by acid precipitation and chromatography on hydroxylapatit with the degree of purification 16 times and enzyme yield 50%. When it was using a supplementary stage for the purification by is the chromatography on the Bio Gel P-100, the degree cf purification was 'achieved 25 tiroes ith snzyr.e yl^ld 6X

The irrobilizaticn cf phosphoiipase c was unsuccessful, so we found anothe^r v/ay for it s stabilization. It was conducted the covalent conjugation of phaspholip^se C with protein inhibitor of proteinase using the preliminary phospholipase absorption on the poiycephsnide affinity support. The received fraction of conjugate kept the activity on initial degree at 50° for one hour.

The immobilization of alcaiine lipase was conducted cova-lently through glutaral dialdegide on polyamide, Fe304-polya-nide and uncavalently using the affinity absorption of enzyme on polycephamide, silica geel-pcTycepha^ide, Fe304-polycepha-mide, silica gel-palmitic acid and. using the ion absorption of enzyme on DEAE-cellulose and DEAE-spheron.'«An even more successful iapabilization of lipase was achieved on DEAE-spheron, '.«here it was happened the lipase activation after the repeating use and treatment of enzyme at 60°C in acid ■ end neutral-fields.

The obtained enzyme preparates were reco.mented . for using in the processes of fats and oils, production, and the technological scheme with the immobilized lipase localized on the fan blades of• reactor mixer W3S.proposed.

Баьэи липолитик ферментларни тозалаш ва иммобилизация цил;:а (фосфолипаза С, и теорий липаза)

Оли б борилган илмий такрибалпр натижасида Cl. perri-ingens фосфолипаза С дан изофермент I ни ва'1>„. aeruabiosa дон оса ищорий липаза ферментини тозалаш, иммобилизация цилиш ва бар-царорлаш усули иилаб чицилди.

Фосфслипаза С изофсрменги полиамид-фос^атидилэтаноламин (поликефамид) адсорбенти ёрдамида аффин хрокатографияси Я.ули билан ва АсА-54 ультрагели орцали гель-фильтрация кили ни б, 74 400 маратабагача тозаланди ва бунда унинг чициш мицдори эса

таысил цилди.

Историй липаза ферменти кислотели музеитда чуктирилиб ва гидроксиапатитида хроматография усули билан 16 маротаба тоэа-ланди ва бунда унинг чш\ип мнцдори 50¡I та с/кил цилди. Агарда, цермоитни тозалашда Р-100 биогели ёрдамида цуилнча хроматография цуллпиилса, бунда ферментнинг чиции кицдори 25 марта, то-залик даражар;! 6 у, га о шиши аницланди.

Фосфолнпава С ферментини иммобилизация цилии нпткхасиз булганлит саСйбли, унинг барцарорлигини окирииишг Сочца усули то пи дли . Фсофолипаза дастлаб, йюопецифик сорбент лолакефа-нидига адсорбция цилиниб, сунгра оцоил таСнатига ora булган протеиназа ферменти иигибиторига колалонт бор ар^пли уланди. Олинган барцарср кокьюгат I соат дакокида SO°G да уз активлн-га ни сацлаб ь;олди.

Иц$орий липазани иммобилизациясинн глутар дпвльдогиди ёр~' дамида ковалент боглап усули билан цуйидаги адоорСоитлерга Си-рпктарилди: полиамидга, FegOjj-полиамидига; ковалент Сулмаган бпэепецифик адсорбция усули билан зса цуйидаги адсорбектларга уланди: поликефамндга, силикагель-поликефамидга, FegOjj-noíHKe-фамидига, силикагель-лолиамид- пальмитин кислотасига; Д2АЗ-целлюлоза ва ДЗАЗ-сферонга ион богланиш усули билан адсорбция Чили иди. Ьунда ДЗАЭ-с.реронга иммобилизация цилинган липаза кислотели ва нейтрал му^итларда 60°С да ушганганда ва цайта ии-латилганда фермент активлигининг оеиши аниуланди.

Олинган фермент препаратлари eF ва мойларни ^айта игалашга иклатии учуи тавсия эТилди ва имнобилизацияланган липазани ре-.акторнпнг айлантиргачига жойлактирилган технологик схемаси таклиф цилди.