Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, очистка и применение растворимых и иммобилизованных фосфолипаз

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение, очистка и применение растворимых и иммобилизованных фосфолипаз"

МИНИСТЕРСТВО НАРОДНОГО ОБРАЗОВАНИЯ КАЗАХСКОЙ ССР

КАЗАХСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. С. М. КИРОВА

На правах рукописи

ЯКУБОВ ИСКАНДАР ТАХИРОВИЧ

УДК 577. 112.083:577. 3. 311: 57.083. 185

ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ПРИМЕНЕНИЕ РАСТВОРИМЫХ И ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФОСФОЛИПАЗ

03.00.04 — биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

АЛМА-АТА — 1991

Работа выполнена на кафедре биофизики и биотехнологии ТашГУ имени В. И. Ленина.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Рахимов М. М.

доктор биологических наук, Утешев А. Б.

доктор биологических наук, Арипов Т. Ф.

Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, кафедра химической энзимологии.

Защита состоится 2$ 1991 г. в 3 часов

на заседании специализированного совета К 058.01,18 по присуждению ученой степени кандидата наук, при биологическом факультете Казахского государственного университета, по адресу: Алма-Ата, 480121, ул. Тимирязева, 46.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан ¿¿¿сГ1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук л¡1 А. ТАКЕНОВ

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.'

Актуальность теми. Интерес к изучению ^.политических фер-зтов, особенно фосфолипаз, объясняется рядом причин. Во-пер-I, фосфолипазы, представляют большую группу ферментов, кото-з участвуют в каталитических превращениях фосфолипидов. Вслед-вие этого они играют важную роль в метаболизме фосфолипадов, также осуществляют контроль биосинтеза простаглавдинов. Во-эрых, фосфолипазы катализируют превращения своих субстратов границе раздела фаз и могут служить хорошей.моделью для изу-

закономерностей гетерогенных.ферментативных процессов, третьих, фосфолипазы могут изменять свою каталитическую актив-:ть, а иногда и специфичность действия в зависимости от фази--химического состояния поверхности субстратной фазы. Это имеет шов значение, ввиду того, что в качестве субстратов этих эментов в клетке могут выступать фосфолипиды биологических лбран. Ферментативная модификация фосфолипидов мембран приво-г к изменению их состояния, и, как следствие,- функций мембран, ¿астности, таким образом они регулируют Каталитическую актив-:ть многих мембранных ферментов. По этой причине, фосфолипазы, деленные из различных природных источников могут использовать-в качестве своеобразных "инструментов" для выяснения взаимо-1зи структура-функция при исследовании функций" мембран/мемб-ших липидзависимых ферментов-и полиферментных .систем. Нако-д, фосфолипазы могут служить в качестве реагентов при решении гктических задач: стереоселективный синтез фосфолипидов, их !фолиз с получением ценных Ееществ, .например, арахидоновой злоты и др. Как впервые показано в настоящей работе, они зют большие преимущества при использовании их в качестве фер-1тно;1 метки при разработке высокочувствятельных методов им-1оформентного анализа. Перевод фосфолипаз в иммобилизованное зтояние позволяет решать не только практические задачи, но и зт сведения о первых стадиях ферментативного процесса ввиду растворимости субстрата. Это важно для выяснения отдельных здий механизг/л действия фосфолипаз и позволяет лучше понять шципы функционирования а'ерментов на границе раздела фаз.

Вышеизложенные показывает несомненную актуальность иосле-вания фосфолипаз различного происхождения, изучение их свой-

ств, в свободном и иммобилизованном состояния и выявление но. сфер практического применения этих ферментов.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилось въ деление и изучение каталитических свойств фосфолипаз из разли ных источников, получение иммобилизованных форм этих ферменте и сравнительное изучение свойств растворимых и иммобилизованных форм фосфолипаз. В связи с этим предстояло решить еледуги задачи:

1. Синтез биоспедафических адсорбентов для очистки фосфс липаз - полиамид-кефалан и полиамид-лиз окефалин.

2. Выделение фосфолчпазы и лизофосфолипазы в внеокоочшде ном состоянии.

3. Изучение каталитических свойств фосфолипаз.

4. Получение иммобилизованных форм фосфолипаз на полиаш них носителях и коныогатов фосфолипазы с биологически активш веществами.

5. Сравнительное исследования свойств растворимых и имм< лизованных фосфолиааз.

Научная новизна работа. В диссертационной работе вперв! синтезирован новый биоспецифический сорбент - полиамвд-лизок< лин для выделения лизофосфолипазы и других липолитических фе] ментов. Получены высокоочищенные препараты фосфолипазы А2 и . зофосфолипазы из яда большого шершня. Исследованы некоторые ] талитические свойства атих ферментов. Впервые получены высок активные иммобилизованные препараты фосфолипаз на полиамвдны носителях.

Биоспецпфическая иммобилизация высокоочищенной фосфолип С—-- на полаащд-кефалине позволило охарактеризовать особенности , тишого центра этого фермента. Получены каталитически актиш коныогатн фосфолипазы с некоторыми антигенами, которые такке сохранили иммунологическую активность. Разработан принцициал новый метод проведения имцуноферментного анализа, основанной принципе экранирования.

Практическая ценность работы.■ Результаты исследований но использовать для изучения закономерностей гетерогенных фе ментативных процессов. Иммобилизованные формы фосфолипаз мог

> использованы для анализа а синтеза фосфолшщдов, лизофос-швдов, а также для модификации мембранных ляпядов. Конъюга-хэсфолипаз с другими биологически активными веществами поз-дат разработать высокочувствительные тест-системы иммунофвр-"ного анализа.

Часть материалов диссертации нашли отражение в учебном про а, как составная часть спецкурса "Основы биологической спе-чности" читаемый студентам биологического факультета Таш-ского государственного университета. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на ' и У1-Всесоизных симпозиумах по Инженерной энзимологаи (Киев, г., Вильнюс, 1938 г), на Всесоюзной конференция по приме-

0 ферментов в биохимических анализах (Паланга, 1964), на эюзной университетской конференции молодых ученых по биоло-метки (Тбилиси, I9d5), на 1-ом региональном совещании по тскш реактивам республик Средней Азии и Казахстана (Душан-¡986), на Всесоюзном симпозиума "Выделение, очистка и ха-Фистика биологически активных соединений" (Сухуми, 1987). Публикации. Но материалам диссертации опубликовано 16 ра-

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит >едения, обзора литературы, экспериментальной части, резуль-

1 и их обсуждения, выводов и списка использованной литера-

МетоДяческая часть. Чистый яд большого шершня Yespa orien-} получали от рабочих особей методом электростимуляции и лиофилизировали. Дд среднеазиатской кобры Naja naja naja ала из Института зоологии и паразитологии АН УзССР. Свежую лудочную железу свиньи получаля из мясокомбината. Оуммар-эсфолипиды из яичного яелтка и хроматографически чистый щцнлхолин получали из желтка куриных яиц по методу Сингл-i сотр (1965) с дополнительной рехроматографией на колонке цсагелем и хранили при - 12°С в хлороформе. Лизофосфолипи-шого желтка получали расщеплением суммарных фракцай фос-1дов желтка фосфолипазой из яда среднеазиатской кобры. В ?ве поверхностно-активных веществ были использованы три-

тон Х-100, дезоксихолат натрия, додецилсульфат натрия, иетил-триметилашоний бромид.

Синтез полишли-ф>оеЗатндилэтаноламина и полиамид-лизофос-фатодллэтаноламина осуществляли путем ковалентного присоединения лигавдов к полиамидным гранулам через глутаровый диальдеп Количество лигандов, связанных с носителями, определяли по со-дераашш фосфора. Определение активностей фосфолипазы и лизо-фосфолипазы проводили методом потенциометрического титрования выделившихся лирных молот при постоянном значении рН. Продук' реакции ферментативного гидролиза обнаруживала с помощью шкр< тонкослойной хроматографии. Удельные активности лидолигически; ферментов вырагали в мкмолях свободных жирных кислот, выделив шихся за I ьш в расчете на I мг белка. Кинетические данные анализировались графически в двойных обратных графиках Лайнуи-вера-Барка. Белок определяла спектрофотометрцчески при 2о0 нм и по методу Лоури (1951).

Для «.мобилизации фосфолапаз пользовались методами ковалентного и адсорбционного связывания. В качестве носителя для ковалентноИ иммобилизация ферментов использовали полиамидный Порошок, а для адсорбционной - полпшзд-фосфатидилатаноламин. Удельные активности иммобилизованных фосфолипаз выраяали в ыкмолях свободных кирных кислот, выделившийся за I млн на I г сухого адсорбента.

РКзУЛьТА'Ш И ИХ 0БСУШНИ2.

I. Синтез сорбента для биоспешшической хроматографии.

Высокую эффективность при разделении л очистке липолити-ческих ферментов проявляют биоспецифаческие сорбенты с ковале! но присоединенными лигаццами, представляющие собоД субстраты или их модифицированные формы. Высокую эффективность при разд лении и очистке липолитических ферментов проявил сорбент, синтезированный в Нашей лаборатории, путем ковалентного присоеда нения кефалина к полиамидным гранула!,и Были получены хорошие результаты при работе с ядами различных змей (кобра, гадюки, гюрза и др), поджелудочной железой, микробншли источниками фе; ментов (Ахмедаанов, 1981). При попытке использовать этот сорб>

для разделения и очистки липолитичэских ферментов яда 'Уоора

мы наблюдали хорошую сорбцию фосфолипаз и лизо-сфолипаз при пропускании раствора яда в 0,05 М буфере, рН 7,5. нако, десорбция ферментов с носителя оказалась чрезвычайно удной. Определенная часть фосфолипазноа'активности элшрова-гь с сорбента при элюции градиентом концентрации тритона [00. Что касается лизофосфолилазной активности, то её нв уда- ' }ь осуществить даже при элюция в весьма жестких условиях. Таз поведение лизофосфолипазы, по-видимому, связано с природой ;ледуемого носителя и особой прочностью связи данного белка с габилизованным на полиамиде кефалином. В связи с вышеизложен-1, мы решили синтезировать другой биоспецафический сорбент [ очистки лизофосфолипазы, который отличался бы от известного [, что вместо кефалина в качестве лиганда выступал бы лизофос-эдилэтаноламш, являющийся субстратом лизофосфолипазы.

Для ковалентного присоединения к полиамидным гранулам лида использовали фракцию лизофосфолияидов, полученных аз сутаной фракции яичных фосфолипядов после ферментативного гвдро-а фосфолипазой из ада кобры. При этом лйзофосфатидялэтанол-я, содержание которого в смеси лнзофосфолипвдов составляло , связался с модифицированными гранулами полиамида. Непрореа-звавшие лизофосфолшщды удалялась многократкой промывкой. Зодные альдегидные группы блокировали шноэтаноламином. При и, в зависимости от количества взятых лиэофосфолипидоз, мож-Зило присоединить от 2 до 10 мкмоль лиганда. Как показали .нейшие эксперименты, при присоединения нет необходимости наибольшого связывания. Наиболее удобным для биоспецифичес-хроматографии оказался сорбент, содержащий 2 мкмоль лиганда г полиамидных гранул (по содержанию фосфора). Такой сор-1 может связать 5-6 мг белка на I г сорбента. Одной из отли-льных особенностей синтеза этого сорбента является легкость строга осуществления всех операций.

2. ОЧИСТКА. Ф0СФ0ЛИПАЗ И ЛИЗОФОСФОЛИПАЗ.

Нами получены высокоочищенйые препараты фосфолипазы подо« лудочной железы и яда шершня с использованием Оиоспецифическо! адсорбционной хроматографии. В качестве сорбента использовали поликефамид (кефалин ковалентно иммобилизованный на полиамвде а.с. СССР № 762917. Результаты использования поликефамида для аффинной хроматографии фосфолишз в табл.1.

Таблица I.

Очистка фосфолидаз А аз раз,тачных источников с использованием биоспецифической хроматографии.

Стадияя очистка

! ! Активность ! Выхо,

!Белок, !-1-!по ак-

! ! Общая» !Удеш>ная, !тивно<

! кХГ' ! ед. I ед/мг. I %

I. Поджелудочная железа свиньи.

Исходный гомогенаг

Тепловая обработка, рН 4, диализ

Биоспецифическая . хроматгарафия

1280 3340

92 2940

5,8 2349

32

405

100

76

61

2. Сырой яд большого шершня

Биоспецифическая хроматография

18,0 29520 1640 100

2,1 18900 9000 64

Из приведенных в таблице данных видно, что подбирая уело вая сорбции и десорбции фермента, можно осуществить очистку фосфолипаз. При этом естественно, что для различных объектов различна и степень очистки фермента. Так, в случае панкреатической фосфолипазы А полученный фермент достаточно гомогецен:

АуД, ед/мл

о.1. Очистка лизофосфолииазы А из яда большого шершня

на полилизокефамиде. Д^ - оптическая плотность при 280 нм. Ауд - удельная активность, ед/мл; I - белок, 2 - активность. Стрелкой указано начало эякщди раствором 0,05 М трис-НС1, доведенного аммиаком до рН II,

ояруется одним пиком при гель-хроматографии через сефадекс а дает одну полосу при диск-электрофорезе в 15^-ном ПААГ. гае яда большого шершня, наряду с основной фракцией, цри-вовали и минорные компоненты. Для дальнейшей очистки фоо-13ы из этого объекта была использована хроматография на тлюлозе.

Типичная картина биоспецифической хроматографии яда боль-иершня на полиамид-лизофосфатидилэтаноламине представлена 3.1. Видно, что основная часть белковых веществ, не обла-

Аи. -

дающих ферментативной активность», проходит через колонку, не связываясь с адсорбентом. При промывании колонки раствором аммиака, рН II элюаруется около 16/5 от общей активности исходного яда шараня. На этой стации удельная активность фермента возрастала в 5 раз. Анализ белкового состава элаированной с адсорбента Фракции методом электрофореза обнаружил, что на электрофоре-граммо активной фракции проявляются две полосы, соответствующие компонентам с молекулярный! массами 32 и 44 кДа, соответственно Поэтому, учитывая различия в молекулярных массах, мы подвергала полученную фракцию гзль-фильтрации на колонке с сефздексом 6-75 Эта операция позволила нам отделить лизофосфолипазу от сопутствующего компонента.

3. Изучение свойств ¿осФолкпаз. •

Еысокоочлщенная фосфолипаза из яда Усарь ог!егИ;а11о обладала значительно более высокой ферментативной активностью по сравнению с фосфолапазами из .других источников. Она гораздо лучше расщепляет субстраты, находящиеся в состава смешанных мицелл с тритоном Х-100. При этом удельная активность фермента составляла 15000-20000 ед/мг для разных партий яда,

Оосфолипазы Л2 проявляют специфичность в отношении алкиль-ного остатка в полярной часта молекул фосфолшщдов и ацильной части, фосфолипаза А^ из яда большого шершня с наибольшей скоростью расщепляла 1,2-дилауроилфосфатвдилхол1Ш, природный /яичный/ фосфатидилхолин, а также 1,2-дипалыштоил- и 1,2-диолеил-фосфатидялхолины. Весьма низкие скорости гидролиза наблюдались для фосфатидилсерина и фосфатидилинозита, а I,2-дипальмитоил-фосфатидилэтанолашн практически не гидролизуется.

Характер кинетических кривых гидролиза фосфатидилхолина ферментом зависит от концентрации детергента в реакционной среде. С увеличением концентрации тритона Х-100 и дезоксихолат натрия, увеличивается скорость образования свободных жирных кислот и максимальная скорость реакции наблюдается при соотношении концентрации фосфатидилхолина и тритона Х-100 и ДОХ-Ыа I 2 и I : I, соответственно. Присутствие ДЦС-На и Ц1МАБ в реаупонной среде не способствуют проявлению каталитической ак-

ивности фосфолипазы.

Ферментативный гидролиз лизофосфатидилхолина лизофосфоли-азой из яда большого шершня протекает при рН 7,5 и в отсутст-ш ионов Са^+. Присутствие ионов Са2+ в реакционной среде придало к увеличению начальной скорости реакции гидролиза. Одна-з, необычным является появление излома на начальном участке эивой в присутствии ионов Са2+. Наличие этого излома не было зязано только с присутствием ионов кальция, но и зависело и г рН среды. Характер кривой и величины лаг-периодов зависел цоке от количества фермента в реакционной среде. При низкой >нцентрации излом на кривой проявлялся более четко. При высо-' IX температурах (50°С) наблюдалось исчезновение излома на кине-гаесяой кривой, а цри её снижении (25°С) наоборот, лаг-период юявлялся более четко. При этом величина лаг-периода оставалось ютоянной. Изменение концентрации субстрата в реакционной сре-напротив, не влияло на лаг-период. Эти данные сввдетельст-ют о том, что происхождение лаг-периодов связано, прежде все-с взаимодействием яонов кальция и фермента, но не субстра-.. Кривая зависимости начальной скорости реакция от концентра-и субстрата имела обычный гиперболический ввд и описывалась авнением Иихаэлиса-Мвнтен. Кажущаяся константа Михаэлиса (Ку) максимальная скорость реакции ( ?вах ) * вычисленные из графи-Лайнуивера-Бергл были равны 0,27 ЫА а 5500 мкмоль/мин-ыг, ответственно. Лизофосфолипеза из яда большого шершня прояв-ла достаточно высокую ферментативную активность а без добав-!шя экзогенных ионов. Добавление Са2+ и Мп2+ лриводало к уверению скорости реакции, причем присутствие обоих металлов в ицентрации 10 мМ в реакционной среда примерно к двухкратно-увеличению количества образующихся свободных жирных кислот время проведения реакции. Ионы н^и Эг'практически не оказн-ш заметного влияния, а ионы Си2+инг2бяровали ферментативную гивность. Также ингибирующий эффект на активность лизофосфо-тазы оказывали различные детаргонты. Сильным ингйбирующим £ектом обладал анионный детергент додецилоульфат натрия. При-гствие 1-2 Ш детергента в реакционной среде вызывало 50^-ноз гибирование, а 100^-ное ингибирование наблюдалось при концен-

трации детергента равной 8 Ш. Скорость реакции снижалась е при действии детергентов неионной и катионной природы. Есда проводить предварительную инкубацию фермента в растворах де гентов при комнатной температуре, то в этом случае, тритон Х-100, ДС2Х-Ыа и ЦТМАБ не подавляли активность фермента, ет даже активировали его. Только ДДС-На вызывал ингибирование мой лизофосфолипазы. В этом отношении нельзя говорить о нез чивости фермента в растворах содержащих детергенты. По-вщу детергенты препятствуют взаимодействию фермента с субстрат} фазой..

4. Цолучениэ и характеристика иммобилизованных Форм фосфолипаз.

Нами исследованы иммобилизация фосфолипаз из яда болы шершня путем биоспецифической адсорбционной и химической к( лантной' иммобилизацией на модифицированном полиамиде, а та] сравнительную характеристику некоторых свойств этих ферме» в растворимом и иммобилизованном состояниях.

Из данных приведенных в таблице 2 видно, что при биоа ционной иммобилизации с носителем связываются в основном б обладающие ферментативной активностью. При этом происходит своеобразная частичная очистка фосфолипаз, что затем сказы ся при проявления более высокой каталитической активности го вида иммобилизованных ферментов по сравнению с ковалеьг форкой.

Баоспецифическая иммобилизация высокоочшценной фссфол зы А на гидрофобном адсорбенте также возможно и она привод к получению иммобилизованного препарата фермента, обладают ферментативной активностью. Результирующая активность ферм после иммобилизации составляет 48$ от активности растворим формы. При этом важно отметить, что фермент не расщепляет во втором положении в молекуле лиганда /фосфатидилэтанолаы ковалентно присоединенного к носителю, несмотря на то, что фолипаза яда большого шершня специфична именно этой связи лекулах фосфолипидов. Это свидетельствует.о том, что для р ции весьма важно наличие свободной алкильной группы в поля

Таблица 2.

Оценка различных методов иммобилизации фосфолилаз ада большого шершня на полиамидных носителях.

{Добавлено к I г ¡Присоединено !Удель-1 1 носителя !к 1г носителя! нал IВыход,

Иммобилизация 1-1--! актив-!

I ! ! ! мг ! ность! %.

ед !мг белка! ед }б0лка » од/ш.{

!

1. Растворимая фор.'.'Л

2. Ковалэнтная

3. Биоспецифическая

1. Растворимая ферма

2. Ковалентная

3. Биоспецифическая

йоссЬолидазд.

115545 15,9

1640

П&521 М 597 9Э,9$ 81,6$

6,7

112639 15,5 112639 1.86 11722 19,4 100$ 12%

Дизофосфолипаза»

1800

3600

10

1622 9455

42,4$

180 ■ 35,1

ЭД

20 3542 ¿г£§ 30 13,3 98,4$ 25,9$

част молекул фосфолипндов. В том случае, когда эта часть молекулы используется для образования козатангной связи, фериэпт теряет свою способность гядролизовать ту связь, на которую обычно направлено его действие. Из этого мояно сделать предположение, что в этом случав отсутствует компл§ментарность медцу участком узнавания фермента и полярной частью молекулы. В пользу этого свидетельствует тот факт, что биоспецифическая иммоби-

лизованная фосфолипаза А цродолжает оставаться активной по отнс шэнию к экзогенным субстратам. Во-вторых, природа сил, приводящие к иммобилизации, скорее всего, является гидрофобными. В noj зу этого сввдетельствуют следующие экспериментальные данные: а} увеличение термостабильности фермента; б) смещение температурного оптимума на Ю°С; в) из полученных данных можно сделай предположение о природе участков активнрго центра фосфолипазы t дда большого шершня. Участок узнавания скорее всего имеет заряженные группы, обладающие повышенным сродством к полярной части молекул фосфолипидов. Влесте с тем, она не взаимодействует с ковалентно связанным лигандом посредством этого участка и cm зывается фосфолипаза А с гццрофобными ацильными 1руппами лиган-да биоспецифического носителя. Эта связь достаточна црочна и устойчива даже в тех случаях, когда адсорбированный фермент взаимодействует с введенным извне в реакционную среду субстратом.

Что касается каталитического участка, некая группа -ХН pat воримой фосфолипазы А находящаяся в активном центре фермента и способная непосредственно участвовать в каталитическом акте, м< жет осуществлять атаку слокноэфирной связи в молекуле субстрат* лишь посла того, как субстрат гидрофобно взаимодействует со си зываэдим участком /сы. схему/. В случае иммобилизованного ферме! та группы связывающего участка является занятыми и осуществляю: связь с лигандом. В этом случае появляется реальная возмоллосп осуществлять гидролиз фосфолипидов группой - XII непосредствен» на липидной фазы. О правильности этого представления свидетельствуют и результаты эксперимента: каталитическая константа гидролиза ( к ) в результате иммобилизации не меняется, а кажущаяся константа Махаэлиса ( K^j), которая суммарно отражает способность взаимодействия ; субстрата с участком узназания и связывающим участком растет в результате того, что группа связывающего участка уже не принимает участия в каталитическом акте. В результате сокращения числа промежуточных стадий повышается энергия активации реакции, а следовательно снижается и результирующая каталитическая активность.

Таким образом, результаты проведенных исследований позвол

Схематическое представление взаимодействие активного ¡тра растворимой /а/ и иммобилизованной /б/ формы фосфоли-ы А2 из яда большого шершня с субстратом.

ли не только получить нерастворимые иммобилизованные препараты фосфолипазы А яда большого шершня, но охарактеризовать особенности активного цонтра этого интересного фермента.

5. йммунрсЬерментны!* анализ с помощью йоссЬолипазной реакции.

Существующие методы иммуноферментного анализа (ИФА), как правило, основываются на трех принципах: титрометрическом, конкуренции и "сэндвича", каадый из которых может быть использован при создании методов ИФА для гомогенных и гетерогенных условий.

В иммуноформентных методах анализа, как правило, используют ферменты, которые действуют на низкомолекулярные субстраты, хорошо растворимые в воде. Это позволяет избежать различных диффузионных или межфазных осложнений, которые имеют место при использовании крупных или малорастворимых субстратов. Лииолити-ческие ферменты, в частности фосфолипазы, напротив, действуют на "суперсубстраты" (мицеллы, ламеллы, липосомы, монослои, би-слойные фосфолипидные мембраны и др), зачастую превышающие по своим размерам вирусные частицы. Кроме того, физико-химическое состояние поверхности субстратной фазы имеет рещающее значение для цротеканая ферментативной реакции. В связи с этим необходимо было получать ответ на два вопроса: I) способна ли фосфолипа-за, как один из видов ферментной метки, сохранять каталитические свойства и характер фермент-субстратных взаимодействий при образовании конъюгатов фермента с вирусами; 2) будут ли проявлять серологическую активность эти конъюгаты. Нами получены конъюга-ты фосфолипазы А с вирусом табачной мозаики (ВШ) с помощью функциональных агентов, обладающие каталитической активностью в сохраняющий серологическую активность. На следующем этапе предстояло выяснить, действительно ферментная метка может экранироваться антителами при взаимодействии с субстратом. Введение антител в среду снижало скорость гидролиза лецитина. Это может указывать на то, что затрудняется взаимодействие с субстратом фермента, связанного с вирусом, так как смещенные мицеллы с тритоном Х-100 лецитина представляют собой-довольно 1фушше частицы. При этом полнота "экранирования" зависела от условий получение конъюгатов. Конъюгаты с фосфолипазной активностью, доста-

+ о . о о

Омлоллотся жяршо киглотн из-за гидролиза ющам

а. Рваюшя коиъюгптов о мицеллами "суперсубстрпт*

Реакция не идет

б.Полное экранирование аититоллми '¡юрментчюй мотки от пзлимгдпПсттт о фосфсяытдтшп кшоллами

О

^ й + V V —- С{]> +

V а ?

В.ВзаямодеПствке пптитсл с

опредаллемим вирусом /1 этап/

6

Честь аптлтол реагирует о вирусом, п их кзвиток оота-птпл соободнии

НзЗнток аптптел реагирует с коныпгптам* и зк|сяируот част» •[юртвптноЦ метки

г, Добавление моченого вируса /2 этап/

Иоэкрипироваипая •!юрмвпт-1кщ мотка пинхитзуот "оупероуОстрат".

д.Прове^епяо (^ерярчтативпоП реохцг.п

Ряс. .Схема проведения ИФА по припишу экршшропаиия.

точной для достоверного определения вируса (около 300-600 ед. при титрометрическом определении активности), были получены из разбавленных растворов вируса и фосфолипазы А. В дальнейшем эй конъюгаты использовали для разработки диагностических подходов оцределения исследуемого вируса. Согласно нашим данным, фосфо-липаза после связывания о вирусными частицами не теряет способности адсорбироваться на поверхности фосфолшщцных мицелл и гад ролизует субстратные молекулы, ¿то означает, что конъюгаты могут вступать во взаимодействие с мицеллами фосфолипадов. Антите ла связываются с конъюгатами почти так же, как исходный вирусоь По-видимому, при конъюпровании вируса с ферментами антигенные детерминанты остаются доступными для молекул антител. Такое взаимодействие о конъюгатами, как показывают эксперименты по из морению фосфолипазной активности, препятствует образованию фермент-субстратных комплексов, В присутствии достаточного количества антител ферментативная реакция практически прекращается. Наш очищен коншгат от нецрореагироаавших компонентов методом афрнной хроматографии. Для этой цели использованы два сорбента один из которых проявляет иродство к ТШ-ВШ, другой - к фосфо-липазе А: сорбент полиамид, представляющий собой иммобилизованный на полиамиде кефалин, и полиамид с иммобилизованными антителами к ТШ-ВТМ» который также шел высокое сродство к этому вирусу, В отличие от ранее проведенных исследований лигандн связывали не с полиамидными частицами, а с силикате левыми гранулами, которые "покрывали" полиамидом. Это позволило существен но улучшить условия проведения зфоматографического разделения. Продедура очистки конызгата позволила значительно повысить чувствительность метода. В результате проведенных исследований удается наделено определить от I до 12 нг вируса в исходном образце Таким образом, результаты налих исследований позволили разработать высокочувствительные эффективные методы диагностики антигенов о помощью иммуноферментного анализа, основанного на принципе экранирования. В настоящее время диагностика стафило-токсиновых антигена освоена в Среднеазиатском педиатрическом институте, а диагностика томатного штамма вируса .табачной мозаики - в Институте микробиологии АН УзССР.

ВЫВОДЫ

. Получены в высокоочшценном виде препараты фосфолипаз и лизофосфолипазы А. При атом для очистки использован специально синтезированный новый биоспецифический адсорбент - полиамид-лизофосфатидилэтаноламин - для выделения и очистки лизофос-фолипаз и других липолитических ферментов. Содержание лиганда в I г адсорбента составляло от 2 до 10 мкмолей. Эффективность сорбции была 2-3 раз выше известных биоспецифических сорбентов, описанных в литературе.

, Изучены каталитические свойства-фосфолипаз яда большого шершня. Значение константы Михаэлиса лизофосфолипазы (1,61 мМ) в 6 раз выше, чем константа Михаэлиса фосфолипазы А, в то же время максимальные удельные активности фосфолипазы и лизофосфолипазы составляют 29000 и 5500 ед/мг, соответственно. Иссле довано действие различных эффекторов (ионы двухвалентных металлов, субстраты и детергенты) на ферментативную активность фосфолипаз.

Подучены и охарактеризованы ковалентно иммобилизованные форш фосфолипаз на полиамидных носителях. При этом показано, что ^/мобилизация сохраняет активность ферментов, хотя она . существенно снижается. При этом получены шсокостабильныв форглы фосфолипаз, позволяющие юс использовать многократно и в непрерывных процессах.

Впервые получены и изучены свойства фосфолипаз 'иммобилизованные на ковалентно пришитых к носителю субстратах фосфолипаз (биоспецифическая иммобилизация). При этом одна молекула фосфолипазы играет роль своеобразного "якоря", а вторая функционирует подобно свободному ферменту о сравнимой активностью. Это создает более благоприятные условия для проявления каталитической активности фосфолипаз по сравнению'с ковалентной иммобилизацией.

Сравнительные исследования растворимой и биоспецифически иммобилизованной фосфолипазы и лизофосфолипазы позволили охарактеризовать особенности принципов функционирования актив-

ли -

ного центра фосфолипаз, также предложить гипотетическую модель.

6 •Получены каталитически активные конъюгаты фосфолипазы со стафилотоксином и вирусом табачной мозаики, которые были использованы для разработки метода иммуноферментного анализа на принципе экранирования. Очистка конъюгата фосфолипазы с вирусом табачной мозаики с помощью двойной аффинной хромато-храфиа позволила в 20 - 25 раз повысить чувствительность метода.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах.

1. ТУйчибаев М.У., Якубов И.Т., Рахимов Ы.М., Ташмухамедов Б.А/ Свойства фосфолипазы А2 из яда большого шершня Vespa oriental^ .//Биохимия. -I9Ö4. -Т. 49; -J6.9. -C.I546-I555.

2. Khole V., Ahmodjanov R., Jakubov I.Г., Rakhiaov U.U., Tash-muhamedov В.А./ Purification of pancreas phospholipase

by affinity chromatography.// Indian. J. Biochom. Biophye. - 1954. -V-2I, «N.2. -P.I46-I47.

3. Султанов X.K., Якубов И.Т., Муксимов Ф.А., Туйчибаев М.У., Рахимов U.M./ Получение нерастворимых конъюгатов фосфолипазы А2 н стафилотоксана./Дзб.биол.журн. -I9Ö4. -»«3. -С.3-5.

4« Якубов И.Т., Ахмеджанов Р., Туйчибаев М.У./Биоспецифическая и ковалентная иммобилизация фосфолипаз яда большого шершня.// Узб.бйол.журн. -1985. -#.П. -С.7-9.

5. Рахимов М.М., Ахмеджанов Р., Якубов И.Т., Ташмухамедов Б.А./ Биоспецифическая адсорбционная хроматография фосфолипазы

из различных источников.// Прикл.биохим и микробиол. -1934. -ТЛХ1. -Ä.2. -С.190-198.

6. Якубов И.Т./ Влияние различных детергентов на каталитическую активность фосфолипазы А из яда большого шершня.// Тезиоы докладов Всесоюзной конференции молодых ученых по биологии клеткл. г.Тбилиси. -1985. -С.801-803.

К Якубов И.Т., Рахимов М.М./ Синт?з новых сорбентов для биоспецифической хроматографии липолитических ферментов./ Тезисы 1-го регионального совещания по химическим реактивам республик Средней Азии и Казахстана.Душанбе. -I98S. -С.133.

3. Вахабов А.Х., Якубов И.Т., Туйчибаев М.У. Рахимов ü.M./ Получение конъюгатов фосфолипазы А и BIT.!.// Узб.биол.аурн.

. -1986. -Л.2. -С.64-66.

Султанов Х.К., Якубов И.Т., Ахмедаанов Р., Туйчибаев М.У./ Рахимов М.М., Наямитдинов А./ Разработка способа выявления стафилококкового токсина иммуноферментным анализом.// Лабоу. дело. -1987. -.'6.3. -C.I67-I7I.

). Якубов И.Т., Туйчибаев М.У., Рахимов М.М./ Очистка и свойства лизофосфолипазы из яда большого шершня vespa orientalis .// Биохимия. -1988. -Т.53. -Гз.7. -C.I093-II02.

:. Якубов И.Т., Ахмедданов Р., Туйчибаев М.У., Рахимов М.М./ Еиоспецифическая хроматогоафия лизс-фосфолипазы из яда большого шершня.// Хим.природн.соед. -1987. -.4.2. -G.I87-I8Ü.

Î. Якубов И.Т., Ахмедаанов Р., Туйчибаев М.У., Рахимов U.U./ Способ получения сорбента для биоспецифической хроматографии.// Авт.са. Je I450I70 от 08.09.88 V. Заяв. -К. 4I97II9I от 25.12.86 г.

Î. Туйчибаев М.У., Якубов И,Т., и др./ Характеристика токсинов ИЗ яда Yespa orientalis .// Хим.природн.соед. -1988. -й.4. -С.616-617.

I. Вахабов А.Х., Якубов И.Т., Заитова А.З., Рахимов U.U./ Им-муноферментный аНаляз с помощью фосфолипазной реакции.//' Узб.биол.яури. -1988. -JÊ.4. -С. 5-7.

>. Вахабов А.Х., Якубов И.Т., Заитоза А.З., Рахимов М.М./ Получение конъюгатов фосфолипазы с вирусом табачной мозаика и их свойства.// Биологические науки. -198Э. -И.2. -С.22-26.

>. Вахабов А.Х., Заитова А.З., Якубов И.Т.,„Рахимов М.М./ Имму-ноферментный анализ BU.1 основанный на принципе "экранирования".// Биологические науки. -1990. -JS.I0. -С.27-34.