Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние гелевого окружения на ферменты бактериальной биолюминесценции

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние гелевого окружения на ферменты бактериальной биолюминесценции"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ

Р Г Б ОД ■1 1 МАР

На правах рукописи

Абакумова Виктория Викторовна

ВЛИЯНИЕ ГЕЛЕВОГО ОКРУЖЕНИЯ НА ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИАЛЬНОЙ БИОЛШИНЕСЦЕНЦИИ

03. СО. 02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск - 1995

Работа выполнена в Институте биофизики СО РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук.

старший научный сотрудник а А. Крат ас ш

Официальные оппоненты: доктор биологических наук.

профессор Волова Т. Г. кандидат фиэ. -мат. наук, ст. н. с. Барцев С. И.

Ведущая организация': Красноярский государственный

университет

Защита состоится "¿0" б г. в час. на

васедании Специализированного совета Д. 003.46.01 по ващите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биофизики СО РАН (660036, Красноярск, Академгородок). С диссертацией можно ознакомиться в библиотека Института биофизики РАН.

Автореферат разослан " Ж " 19абг.

Ученый секретарь ,• Специализированного Совете> доктор технических наук

'ЯлГл

П. ЛЬвырногов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Исследование механизмов генерации и переноса энергии при работе различных ферментативных систем является одной из актуальных задач биохимии. При проведении такого рода исследований весьма привлекательны и перспективны ферменты и ферментные системы, катализируквдие биолюминесцентные реакции. В ходе зтих реакций с высокой квантовой эффективностью происходит преобразование химической энергии субстратов люциферазы в свет. За последние три десятилетия накоплен значительный опыт по расшифровке биохимических реакций, ведущих к высвечиванию. Однако, остается ряд невыясненных вопросов и спорных моментов. Непонятна, например, роль свечения в общем метаболизме клетки, неизвестен механизм формирования электронно- возбужденного состояния люциферазы и т.д. Это связано с тем, что изучение механизмов высвечивания проводят либо in vitro на модельной смеси люцифераз и их субстратов, либо с использованием целых бактериальных клеток. Использование интакт-ных организмов корректнее, но проведение экспериментов затруднено, так как работает сложная цепь метаболических процессов, а клеточная оболочка препятствует прямому манипулированию с клеточным содержимым. Вязкость среды и микроокружение люциферазы в клетке значительно отличаются от условий функционирования in vitro.

Иммобилизованная в гель люцифераза, аналогично ферменту внутри интактной клетки, встроена в матричную структуру. Иммобилизация позволяет создавать определенное микроокружение ферментов биолюминесценции , связанных с нерастворимым носителем (микро-pH» диэлектрическая проницаемость, отличие гидрофоб-но-гидрофильных свойств примыкающих к ферменту групп от свойств воды и т.д.) (БерезинИЕ, 1990 г.). По-видимому, изучение иммобилизованных ферментов может приблизить нас к пониманию процессов биолюминесценции, происходящих in vivo.

Впервые люцифераза была иммобилизована в 1970 году (Erlanger В. F. et al. 1970) . В настоящее время предложено более десятка способов и носителей для иммобилизации люциферазы и сопряженных с ней ферментов (Blum L. j., Coulet P. R, 1993). Это методы иммобилизации бактериальной люциферазы на сефарозе, агарозе, нейлоне, коллагеновых пленках, ариламинироЕанных

стеклянных бусах, полиакриловой кислоте, гелях из альбумина, сшитых глутаровым альдегидом и т. д. Большинство методов иммобилизации люцифераз было создано и успешно используется для аналитических целей. Исключение составляет лишь иммобилизованная в биогелъ люцифераза, с помощью которой изучали механизмы реакции бактериальной Стлкшнесценции, в частности взаимодействие с альдегидами, оборот фермента, свойства долгоживуще-го интермедиата люцифераэы (Erlanger Б. F. et al. 1970). Однако, связывание люцкферазы с биогелем происходит с участием активных групп фермента, важных для катализа Это приводит к существенной инактивации фермента и мешает правильной количественной интерпретации результатов. Вместе с тем, существует возможность иммобилизации люциферазы, при которой не происходит ковалентного взаимодействия с активными группами фермента и полностью сохраняется его активность. Это методы иммобилизации в нейтральные гели, такие как гель крахмала

Изучение свойств иммобилизованной в крахмальный гель люцифераэы и сравнение ее каталитических характеристик с растворимой позволит приблизиться к пониманию процессов, происходящих в нативной клетке.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель настоящей работы - изучение влияния гелевого окружения на биферментную систему бактерий: NADH: РШ-оксидоредуктаза-люцифераза Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить зависимости характеристик иммобилизованной би-ферментной системы от условий иммобилизации в крахмальный гель для получения препаратов иммобилизованных ферментов с заданными свойствами.

2. Изучить влияния гелевого окружения на кинетические характеристики и стабильность биферментной системы: NADH: FMN-ok-сидоредуктаза-люцифераза

3. Осуществить совместною иммобилизацию ферментов и субстратов бактериальной биолюминесценции. Разработать многокомпонентный иммобилизованный реагент для биолюминесцентного анализа

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Получены зависимости характеристик иммо-билизоваиной биферментной системы от условий иммобилизации.

являвшиеся основой для разработки алгоритма получения иммобилизованных препаратов с заданными свойствами. Показано, что в геле увеличивается термостабильность биферментной системы и константы Михаэлиса по субстратам; уменьшаются константы инактивации под влиянием ионов водорода и высоких концентраций солей.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Получены результаты, позволяющие разработать алгоритм создания иммобилизованного препарата с заданными свойствами: состав, выход активности, кратность использования, устойчивость к химическим факторам среды (рН, ионная сила растворов). Получен высокоактивный препарат, включающий все компоненты биферментной системы in vitro (MADH: FMN-оксидоредуктаза, люцифераза, FMN, NADH, DTT, тетра-деканаль). Показана возможность использования полученного семейства реагентов сложного состава для тестирования ксенобиотиков и анализа субстратов биолшинесцентной реакции.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИШЕ НА ЗАЩИТУ:-

1. Зависимости характеристик иммобилизованной биферментной системы от условий иммобилизации. Алгоритм получения иммобилизованного препарата с заданными свойствами: состав, выход активности, кратность использования, устойчивость к химическим факторам средь (рН, ионная ста растворов).

2. Показано, что в гелевом окружении сохраняется каталитическая активность биферментной системы, увеличивается термостабильность ферментов и константы Михаэлиса по субстратам, уменьшается инактивации ферментов в кислой и щелочной среде и при высоких концентрациях солей.

3. Получен многокомпонентный иммобилизованный люциферазный реагент для биолюминесцентяого анализа.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы докладывались на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущи-но, 1990), на IV Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение" (Москва, 1992), на 11 Международном биофизическом конгрессе (Будапешт, Венгрия, 1993), на Международном биолюминесцентном симпозиуме (Гаваи, 1993), на Международной конференции по клини-

ческой хемилюминесценции (Берлин, Германия, 1994), Международная конференция "Environmental Pollution and Neuroimmuno Interactions and Environment" (Россия, С-Петербург, 1995).

ПУБЛИКАЦИИ, to материалам диссертации опубликованы 2 статьи, б тезисов.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, трех глав с изложением результатов работы, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (156 источников, в т. ч. - 96 на английском языке). Диссертация иллюстрирована 29 рисунками, содержит 11 таблиц.

ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ. F№) - флавинмононуклеотид, FMNH2 -восстановленный флавинмононуклеотид, ДТТ - дитиотреитол, NADH

- восстановленный никот инамидаде ниндикукле от и д, ЭДТА - зтилен-диаминтетрауксусная кислота, I - интенсивность свечения, Imax

- максимальная интенсивность свечения, mY - милливольты, Km -константа Михаэлиса, Ks - константа спада, Kin - константа инактивации.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Исследования выполнены на препаратах ферментов разной степени чистоты, подученных из светящихся бактерий в секторе биотехнологии Института биофизики СО РЖ Иммобилизацию лщиферазы и NADH: FMN-оксидоредуктазы проводили по модифицированному методу иммобилизации ферментов в крахмальный гель (Кратасюк и др., 1986). При многокомпонентной иммобилизации вместе с ферментами, в гель вводили растворы субстратов: тетрадеканаль, FMN, NADH.

Измерения проводили на биолюминометре БЛМ 8801 (СКТБ "Наука" КФ СО РАН г.Красноярска).'1 Биолюминесцентный сигнал регистрировали на самописце 2210 ("LKB", Швеция). Актиеность люцифе-разы определяли по максимальной интенсивности свечения - Imax, выраженной в относительных единицах или милливольтах.

Измерения биолюминесценции в моно- и биферментной реакции, для растворимых и иммобилизованных ферментов, а также изучение зависимости интенсивности свечения и констант инактивации от

б

рН, температуры и ионной силы проводили известными методами. Выход активности иммобилизованных ферментов рассчитывали-из отношения активности иммобилизованной биферментной системы к активности растворимой биферментной системы, измеренной по Imax.

В работе использовали гидролизованный крахмал, NADH, FMN и дитиотреитол фирмы "Serva", тетрадеканадь,.додеканаль и дека-наль фирмы "Merck". Остальные реактивы были квалификации ч. д. а.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучалось влияние условий иммобилизации на характеристики иммобилизованного продукта Показано, что стабильность, выход активности и сохранение активности при многоразовом использовании иммобилизованной люциферазы и NADH: РШ-оксидоредуктазы зависят от условий иммобилизации следующим образом;

1) при увеличении концентрации крахмального геля от 2% до 107. уменьшается выход активности иммобилизованных ферментов, но увеличивается остаточная активность ферментов после 5-кратного использования (табл. 1);

2) свойства материала, используемого в качестве подложки при высушивании иммобилизованных реагентов, влияют на стабильность дисков при многоразовом использовании, лучшей подложкой является лавсановая пленка (табл. 2);

3) оптимальное время высушивания иммобилизованных препаратов 3 часа при 20-2513, при увеличении времени высушивания уменьшается выход активности ферментов и прочность препаратов;

4) выход активности" иммобилизованного реагента увеличивается при увеличении концентрации ферментов и при увеличении степени очистки ферментов (табл. 3);

5) введение ДТТ в крахмальный гель в процессе иммобилизации в концентрации 10 мМ позволяет получить более стабильный реагент и увеличить выход активности ферментов на 13-50 %.

' Найдены условия иммобилизации, при которых не происходит инактивации люциферазы и биферментной системы - НАДН: ФМН-окси-доредуктаза-люцифераза, что свидетельствует в пользу сохранения активности функционально важных групп ферментов. Модифицированная процедура иммобилизации биферментной системы

ИАОН: РКИ-оксидоредуктаза-люцифераза в крахмальный гель заключалась в следующем: 5 мл 8% крахмального геля кипятили до прозрачности, остужали до 30 °С, в гель вводили 0,5 мл раствора биферментной системы, содержащего 10 мМ ДТТ'и 100 мкг люцифе-разы. Полученную смесь дозировали микропипегкой по 50 мкл на лавсановую подложку и высушивали в течении 5-8 часов при температуре 20-25 °С.

Таблица 1.

Влияние концентрации геля на активность реагента при многоразовом использовании

Концентра- 1т, Выход Активность после Константа ция геля, активности, 5 измерений, спада,

X тУ 7. 7, мин

2 66.8 305 10 -

4 ' 27,1 124 30 0.088

6 11.1 51 80 0.051

8 11.5 53 90 0.035

10 1.75 8 90

Таблица 2.

Зависимость активности иммобилизованной биферментной системы от материала подложки при многократном использовании

Вид подложки Количество измерений 1 диска до его активности на 25% . ; 50% падения 757.

лавсановая пленка • 10 25 50

полиэтилен 10 ^ 14 21

орг. стекло 9 14 20

целлофан 4 7 8

целлюлоид 2 3 4

парафилм - 7 8

покровное стекло . 1 2 3

Таблица 3.

Выход активности иммобилизованной люцифераэы в зависимости от количества и чистоты используемого фермента

Препарат люцифераэы Количество белка Выход активности (X)

Гель является системой проницаемой для ферментов и субстратов бактериального свечения. При увеличении концентрации крахмального геля вымывание иммобилизованных ферментов из ге-левой фазы уменьшается. На рисунке 1 показано свечение препаратов иммобилизованной биферментной системы в 47. и 87. геле через 15 минут с момента запуска реакции раствором NADH. Суммарное свечение кюветы, содержащей иммобилизованные в 87. гель ферменты, на 73 % определяется свечением ферментов в диске. Для 4 7. геля суммарное свечение в равной степени опредляется свечением Ферментов как в геле, так и продиффундировавших в ракционную смесь.

Суммарное количество квантов, образованных в ходе реакции растворимых ферментов и иммобилизованных в гель одинаково, но изменяется величина максимальной интенсивности свечения и время высвечивания. Основным измерявши параметром при сравнении характеристик иммобилизованных и растворимых ферментов была максимальная интенсивность свечения - I max.

При многокомпонентной иммобилизации, когда в гель включали биферментую систему и субстраты, все иммобилизованные препараты обладали высокой активностью (табл.4). Выход активности ферментов в препарате, содержащем все компоненты люминесцентной системы in vitro, составлял 5 %. Путем подбора концентраций иммобилизованных субстратов этот показатель был увеличен до 30%.

В препаратах, включающих NADH; FMN-оксидоредуктазу, люцифе-разу и NADH, насыщение по NADH не было достигнуто в исследуемом диапазоне концентраций (до 350 мкг/диск). При совместной

Очищенный Очищенный Грубый Грубый

40 мкг 24 мкг 2. 9 мг 86 мкг

326.9 146.9 28.7 72

I, тУ

120 100 80 60 40 20 0

12 3. 123

Рис. 1. Интенсивность свечения биферментой системы через 15 минут с момента инициирования реакции раствором ЫАОН в. 4% и 8% крахмальном геле: 1 - суммарное свечение препарата иммобилизованных ферментов в растворе субстратов, 2 - свечение ферментов в диске, 3 - свечение ферментов, продиффундировавших ив гелевой фазы в реакционную смесь.

Таблица 4.

Зависимость выхода активности иммобилизованных ферментов от состава реагента при совместной иммобилизации люциферазы, ИАОН: РШ-оксидоредуктазы и их субстратов

Добавки Выход активности, 7.

- 22

ДТТ 33

дат. тетрадеканаль 185

дат. ГШ 10 •

дтт. тетрадеканаль, ГШ ^ 35

дтт, ЫАОН 7

дтт. тетрадеканаль, ГШ. МАБН 5

иммобилизации биферментной системы й тетрадеканаля скорость реакции увеличивается почти в 5 раз по сравнению с раствором. Введение в гель флавинмононуклеотида, дополнительно к биферментной системе, снижает Imax реагента, поэтому выход активности иммобилизованного многокомпонентного реагента, измеренный по Imax, не превышал 30 Z. Оказалось, что при включении в крахмальный гель сохраняется стехиометрическое соотношение между компонентами люциферазвой реакции, присутствующее в системе in vitro. Однако, для получения максимального выхода активности люциферазы при совместной иммобилизации ферментов с субстратами требуется на порядок уменьшить концентрации последних по сравнению с раствором.

На основании полученных данных предложен алгоритм создания препаратов иммобилизованных ферментов с заданными свойствами. Алгоритм включает в себя набор фиксированных параметров, задающих процедуру иммобилизации, и изменяемые параметры - выход активности й стабильность.

Изучение свойств ферментов в геле проводили путем сравнения каталитической активности растворимой и иммобилизованной биферментной системы в зависимости от условий реакции.

ВЛИЯНИЕ ГЕЛЕВ0Г0 ОКРУЖЕНИЯ НА СТАБИЛЬНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ. Зависимости активности биферментной системы от температуры практически совпадают для растворимых и иммобилизованных ферментов (рис.2). При этом температурный оптимум активности лежит в интервале от 20 до 30 С. Для растворов ферментов термоинактивация начинается с 30 °С. В таблице 5 приведены константы термоинактивации растворимой биферментной системы, которые увеличиваются с увеличением температуры инкубирования в'интервале от 30 до 40 С, а также, с увеличением концентрации белка. В тех же условиях термоинактивации иммобилизованной биферментной системы не происходило даже после 70 минут инкубации при 30 С. Инкубирование приводило к увеличению интенсивности свечения ферментов в геле (рис.3). Возможно это объясняется тем, что при инкубации в интервале температур от 20 до 40^3 в геле происходят структурные изменения, приводящие к увеличению Imax. Вероятнее всего, инактивации люциферазы не происходит, так как включение фермента в матричную структуру геля препятствует распаду на мономеры и образованию конгломератов белка (Петуш-

Imax, Sfi

1Z0 100 ВО ВО 40 20 О

5 10 t5 20 25 30 35 40 45 Т С

Рис. 2. Зависимость Imax от температуры для иммобилизованной (1) и растворимой (2) биферментной системы: NADH-FMN: ок-сидоредуктаза - люцифераза

I, %

160 140 120 100 80 60 40

О 10 20 30 40 50 60 70 ВО i, МИН.

Рис.3; Влияние температуры на активность иммобилизованной (1) и растворимой (2) биферментной системы в заивисмости от времени при 30 °С. Содержание белка в реакционной скеси и в крахмальном диске: люциферазй - 1 мкг, NADH: FMN-оксидоредук-таза - 0.4 милиед. акт.

Таблица 5.

Температурная зависимость констант инактивации для разных количеств растворимой биферментной системы: НАДЕ- ШЬоксидоредуктаза-люцифераза

Кол-во ферментов в кювете Константа инактиваг'и )

люцифераза, оксидоредуктаза, при температуре инкубации мкг милиед. акт. 30 °С 35 °С 40 °С

1 0.4 0.08 1.5 11.6

2.5 1 0.56 1.67 13.1

5 2 1.09 2.7 . 20.8

Таблица 6.

Зависимость констант инактивации растворимой и иммобилизованной биферментной системы от рН и величины ионной силы

ь Константа инактивации (с"') нмм. раств.

0.02 0.02 0.11 5.0 , 0.16 ' 0.29

0.06 0.05 0.21 5.3 0.21- 0.27

0.08 0.14 0.23 5.6 0.30 0.39

0.2 0.18 0.25 6.0 0.41 0.47

0.4 ' 0.15 0.18 6.2 0.42 —

0.6 0.11 0.12 6.4 0.41 0.53

0.8 0.05 0.09- ' 6.6 0.40 0.78

6.8 0.38 0.43

7.0 0.28 0.40

7.8 0.19 0.38

Нолчсноаь ?лнстачта ьН

инактивации Г

^ имм. раств.

ков и др., 1982; Тюлькова и др., 1995).

Инактивация растворенной 'биферментной системы в 0.02 М фосфатном буфере с различными рН происходит в большей степени, по 'сравнению с иммобилизованной (табл. 6). Аналогичный результат получен при инактивации растворенной и иммобилизованной биферментной системы в фосфатном буфере разной молярности при рН 6.8: константы инактивации показывают, что гелевое окружение позволяет уменьшить инактивацию иммобилизованной биферментной системы по сравнению с' раствором в среде с неоптимальными рН (табл. 6).

ВЛИЯНИЕ ГЕЛЕВОГО ОКРУЖЕНИЯ НА КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ. На рисунке 4 показана зависимость интенсивности свечения растворимых и иммобилизованных ферментов от рН реакционной смеси. Дяя растворимых ферментов кривая имеет выраженный максимум в точке, соответствующей рН 6.7. Используемый для иммобилизации крахмальный гель приготавливали в 0,02 М фосфатном буфере с рН 6.8. Поэтому, интенсивность свечений иммобилизованных ферментов практически не зависит от концентрации ионов водорода в реакционной смеси и монотонно меняется в интервале рН от 5.3 до 8. Этим же объясняются различия в зависимостях интенсивности свечения от молярности фосфатного буфера для растворимых и иммобилизованных ферментов: для раствора наблюдается четкий максимум при 0,08 М, для иммобилизованной биферментной системы максимум сдвинут в область низких концентраций солей (рис. 5).

Гелевое окружение не оказывает значительного влияния на высокую специфичность люциферазы к алифатическим альдегидам: константы Михаэлиеа по додеканала и тетрадеканаюо для растворимой и иммобилизованной люцифераз различаются в 3 раза, по деканалю - отличие незначительное (табл. 7). Подобное различие констант Михаэлиеа, возможно, объясняется наличием диффузионных препятствий, создаваемых гелем на пути проникновения субстратов к ферменту.

МНОГОКОШОНЕНГНШ РЕАГЕНТ ДЛЯ БИОЛаДШЕСЦЕОТНОГО АНАЛИЗА. Шдучено семейство многокомпонентных иммобилизованных реагентов для биолюминесцентного анализа Состав реагента задавался в зависимости от типа анализа. Так, для люциферазных биотестов токсичности использовался препарат, содержащий бифер-ментную систему: 1ШН: ГШ-оксидоредуктаза-люцифераза; а , нап-

1тах, X

Рис. 4. Зависимость интенсивности свечения иммобилизованной (1) и растворимой (2) биферментвой системы: МА0Н;РШ-ок-сидоредуктаза-люцифераза от рН.

1тох, %

-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

Молярное та Ьугрера, N

Рис. 5. Зависимость интенсивности свечения иммобилизованной (1) и растворимой (2) биферментной системы: НАОН: П«И-ок-сидоредуктаза-лщифераза от величины ионной силы.

Таблица 7.

Константы Ыихаэлиса по альдегидам для растворимой и иммобилизованной люциферазы

Альдегид

Константа Михаэлиса, мкМ

растворимая люцифераза

иммобилизованная люцифераза

Деканаль

Додеканаль

Тетрадеканаяь

4.4 1.0 0.9

4.7 3.2 2.7

ркыер, для анализа FMN - все компоненты люциферазной реакции in vitro, кроме FMN. Использование таких реагентов в люцифе-разных биотестах токсичности С методы определения степени фу-за|)иозкого поражения зерна и степени неспецкфичесгеэго эндоток-сизсоза) показало, что количество анализируемой в биотестах смеси должно быть увеличено для иммобилизованных ферментов по сравнению с растворимыми. Так, одинаковый ответ получали при добавлении 125 мкл сыворотки крови пациента с панкреонекрозом к иммобилизованному реагенту и 20 мкл - к раствору ферментов > (рис.6).

Показана возможность использования иммобилизованной бифер-ментяой системы для анализа субстратов биолюминесцентной реакции: FMM и алифатических альдегидов. Пределы детекции альдегида одинаковы для растворимого и иммобилизованного ферментов и составляют в шнофермэнтной реакции 0,01 нМ, в биферментной -

1 Midi

Многокомпонентный иммобилизованный реагент дозирован, удобен в работе, так как представляет собой диски" с одинаковым содержанием компонентов биферментной биолюминесцентной системы. Реагент хранится в течение нескольких лет без потери активности и многократно используется в биолюминесцентных измерениях.

1тах, %

100

80

60

40

20

0

О

50 100 150 200

СыНюроткп кро$и, нсп.

Рис.6. Влияния сыворотки крови пациента (панкреонекроз) на биолюминесценцию иммобилизованной (1) и растворимой (2) бифер-ментной системы.

1. Показало, что характеристики иммобилизованной бифер-ментной системы НАШ: РШ-оксидоредуктаза-люцифзраза. зависят от условий иммобилизации. Предлоявн алгоритм получения иммобилизованного препарата с заданными свойствами: состав, выход активности, кратность использования, устойчивость к характеристикам внешней среды (рН, ионная сила растворов).

2. Показано ,что при сохранении общего количества квантов света изменяется динамика свечения. В геле сохраняется оптимум температур, увеличиваются термостабильность ферментов и Км по субстратам, уменьшается инактивация в зависимости от рН и концентрации солей.

ВЫВОДЫ

3. Показана возможность совместной иммобилизации люциферазы, NADH: FKI-í-оксидоредуктазы И их субстратов: NADH. FMN, тет-радеканаль. Подучено семейство многокомпонентных иммобилизо-. ванных реагентов для анализа субстратов биолюшнесцентной реакции и люциферааных биотестов токсичности: метода определения степени фузариозного поражения зерна, метода определения степени неспецифического эндотоксикоза

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

1, Кратасюк а А., Абакумова Е Е , Ни« Н Е Создание гелевой модели функционирования люциферазы в клетке. //Биохимия - 1994. - Т. 59, N 7. - С. 1020-1027.

2. Kudryashova N.S.. Belobrov P. I., Abakumova V. V., Egorova О. I. .Kratasyuk V. A. Nanodlancnd action on bacterial bioluminescence In vitro.//Herald of Russian Acad. Tech.Sci.-1994. - V.l, N. 7. - p.201-207.

а Кратасвк E A., Ким E E, Абакумова E E Люциферазные альдегидные биодатчики.//Тез. докл. Всес. Конф. "Новые направления биотехнологии", Пущино. - 1990. - С. 85.

4. Кратасюк Е А., Абакумова Е В., Ким К Е Применение растворимой и иммобилизованной люциферазы для анализов альдегидов. // Tea. IV Всес. совей, "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение", Москва - 1992. - С. 71.

5. Kratasyuk V. А., Abakumova V. V. The Interaction of soluble and InsRoblllzed lucíferas© with aliphatic aldehydes.- Abstr. of 11 International Biophysics Congress, Budapest, Hungary. - 1993. - P. 76.

6. Kratasyuk V. A.. Abakumova V. V I mobilized luc if erase as a model of bioluminescence in vivo.- Abstr. of International Bloluminescence Slmposlum, Havail. - 1993. - P.68.

7. Kratasyuk V. A.. Abaku/nova V. V The immobilized lucIferase and oxidoreductase with substrate as analytical tool. - Abstr. of International Conf. on Clinical Chemiluminescence, Germany, Berlin. - 1994. - P-B8.

8. Egorova 0. , Abakumova V., Kratasyuk V. Luciferase .oxicity testing in ecology. - Abstr. of Tha 1995 International Co-Conference on Environmental Pollution and Neuroinrmjno Interactions and Environment, St. Petersburg, Russia - 1995. - P. 9.