Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Воздействие растворов америция-241 малой и средней активности на биолюминесцентные системы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Воздействие растворов америция-241 малой и средней активности на биолюминесцентные системы"

На правах рукописи

uuj^^aaIB

и

Рожко Татьяна Владимировна

ВОЗДЕЙСТВИЕ РАСТВОРОВ АМЕРИЦИЯ-241 МАЛОЙ И СРЕДНЕЙ АКТИВНОСТИ НА БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск - 2008

003448916

Работа выполнена в Институте биофизики Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор

Кудряшева Надежда Степановна

Официальные оппоненты, доктор биологических наук,

профессор

Назина Тамара Николаевна

кандидат биологических наук Межевикин Владислав Валентинович

Ведущая организация. Московский государственный университет

Имени М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «//» 2008 года в /¡Р час, на заседании

диссертационного Совета Д 003 007.01 в Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036. Красноярск, Академгородок. Факс 8-3912-433400. тел.8-3912-431579.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН.

Автореферат реферат разослан с^Ь 2008 1

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических на\ к

Франк Л. А.

Аюуальность проблемы.

В настоящее время в радиоэкологических исследованиях наблюдается смена концептуального подхода- на смену антропоцентрическому приходит экоцентрический подход. Созрело понимание необходимости изучения влияния радиоактивности на всю биоту в целом и на человека как составную часть этой бноты, интегрированную в биосферу множеством функциональных связей. Микроорганизмы являются прост ейшей и основополагающей частью биосферы, и их состояние может служить индикатором состояния системы в целом В связи с этим исследования воздействия радиоактивности на микроорганизмы приобретают все большую актуальность

Фундаментальной задачей в рамках указанной проблемы является разработка научных основ использования микроорганизмов для мониторинга радиационной токсичности Удобными обьектами являются морские люминесцентные бактерии, которые уже более сорока лет применяются для мониторинга химической токсичности различных сред [1,2]. Для количественной оценки состояния этих микроорганизмов в различных условиях окружающей срсды используется интенсивность их люминесценции Имеется возможность аналитического использования как бактериальных клеток, так и выделенных ферментов, что дает возможность сравнивать результаты воздействия радиации на микробиологическом и биохимическом уровнях.

К настоящему времени известны исследования [3]. в которых биолюминесценция бактериального рекомбинантного штамма Е coli применялась для определения токсичности среды, задаваемой гамма-излучением Биолюминесцентные системы до сих пор не использовались дня изучения воздействия следовых количеств изотопов с преимущественно альфа-излучением.

В последние годы исследователи все чаще обращаются к проблеме «малых доз». Обсуждаются неаддитивность и гетерогенность откликов организмов на низкодозовое воздействие. Наиболее важным достижением в данном вопросе является выявление нелинейности зависимости доза-эффект и понимание того, что воздействия излучений в малых дозах нельзя оценивать путем простой экстраполяции экспериментальных данных, полученных при использовании больших повреждающих доз облучения [4]. Известно, что в определенном диапазоне доз наблюдается стимуляция, а не угнетение клеточных процессов (так называемый эффект «гормезиса»).

Одним из наиболее опасных, с точки зрения влияния на живые организмы, является воздействие радионуклидов, характеризующихся преимущественно альфа-распадом. Типичным альфа-излучающим радионуклидом является Ат-241. Время его полураспада - 432,7 лег. Этот радиоизотоп имеет техногенное происхождение, является одним из побочных продуктов ядерного производства и в последние годы все чаще регистрируется в окружающей среде

Цель исследования - изучение воздействия растворов Ат-241 малой и средней активности на биолюминесцентные системы - люминесцентные бактерии и выделенные ферменты. В работе поставлены следующие задачи.

1 Адаптировать биолюминесцентные методики для мониторинга радиотоксичности растворов чалой и средней активности.

2. Сравнить воздействие на бактериальную биолюминесценцию Аш-241. радионуклидов низкой удельной активности (на примере урана) и

стабильных тяжелых металлов На основе этого сравнения оценить вклады химической и радиационной составляющих в воздействии Ат-241 и урана на биолюминеснентные системы.

3. Сравнить воздействие Ат-241 па биолюминесценцию бактерий и выделенных ферментативных систем.

4. Оценить распределение Аш-241 в бактериальной культуре.

5. Исследовать влияние гумшювых веществ на люминесценцию бактерий в растворах Аш-241. поврежденность клеток и содержание Аш-241 в клеточной фракции.

Научная новизна. На примере Аш-241 впервые исследовано воздействие растворов альфа-излучаюшего изотопа малой и средней активиости на биолюминесцентные системы - интактные и лиофилизированные бактерии, водорастворимую и иммобилизованную в крахмальный гель ферментативные системы. Получены зависимости интенсивности биолюминесценции от времени воздействия радионуклида и его концентрации/удельной активности Показано, что воздействие Ат-241 проявляется при низких концентрациях/удельных активностях радионуклида, характеризуется начальным периодом активации и последующим периодом ингибирования биолюминесценции.

На основе сравнения со стабильными элементами показано, что воздействие Ат-241 на биолюминесцентные системы определяется радиационными, а эффекты урана - химическими свойствами

Обнаружено накопление Ат-241 бактериальными клетками, визуализированы изменения бактериальных клеток на различных этапах радиационного воздействия.

Биолюминесцентные системы впервые использованы для мониторинга процессов детоксикации растворов Am-241 гуминовыми веществами.

Практическая значимость. Предлагаемые исследования являются основой для разработки биолюминесцентных методик мониторинга радиотоксичности радиоизотопов, характеризующихся альфа-распадом, в растворах низкой и средней активности Биолюминесцентные системы могут быть использованы в качестве сенсоров в экологии и медицине для мониторинга воздействия растворов радионуклидов на микробиологические и биохимические процессы, для выявления эффектов при различных дозах облучения. Положения, выносимые на защиту

1. Нелинейность зависимости эффекта от времени хронического воздействия Ат-241 на биолюминесцентные системы в растворах низкой и средней активности: активация на начальной и ингибирование на конечной стадиях воздействия

2. Радиационная природа токсичности Ат-241 и химическая природа токсичности урана в растворах низкой и средней активности.

3 Уменьшение эффектов Am-241 на люминесцентные бактерии в присутствии гуминовых веществ. Апробация работы. Основные положения работы представлены на VII Международной школе-семинаре молодых ученых "Актуальные проблемы физики, технологий и инновационного развития" (Томск. 2005). VIII Международном

симпозиуме «Сложные системы в экстремальных условиях» (Красноярск. 2006). Российской школе-конференции молодых ученых «Экоюксикология современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Москва. 2006), конференции «Социально-экологические проблемы природопользования в Центральной Сибири» (Красноярск, 2006). XII Международном симпозиуме по люминесцентной спектроскопии (Испания. Луго. 2006), 2 Всероссийской конференции по аналитической химии (Краснодар, 2007), Международной конференции по радиоактивности окружающей среды (CN-145, Вена. Австрия, 2007). 15 Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (Шанхай, Китай, 2008), 1 Российской конференции «Радиоэкология: итоги, современное состояние и перспективы» (Москва, 2008).

Работа выполнена при финансовой поддержке, гранта Министерства Образования РФ REC-002 KR-006: ФСП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-¡ехнологического комплекса России на 2007-2012 годы» по теме' «Биолюмииесцеигнмй анализ' биосенсоры и биокаталитические технологии», программы РАН «Молекулярная и клеточная биология», гранта молодежной инновационной программы Сибирского Федерального Университета «Биолюминесцентный метод мониторинга радиотоксичности». 2007.

Личный вклад соискателя состоял в адаптации бколюминесцентных методик для мониторинга радиотоксичности растворов, проведении всех экспериментов, обработке и обсуждении экспериментальных данных. Радиометрический анализ радиоактивных растворов осущсс шлялся в Лаборатории радиоэкологии ИБФ СО РАН. приготовление препаратов интактных и лиофилизированных бактерий - в Лаборатории бактериальной биолюминесценции ИБФ СО РАН, иммобилизованных ферментативных препаратов - в лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН. Основная часть результатов была получена в сотрудничестве с Болсуновским А Я . Бондаревой Л.Г., Есимбековой Е Н . Кратасюк В А . Кузнецовым A.M., Выдряковой Г.А., Могильной О А.. Александровой М.А. Вклад соавторов отрахсен в публикациях. Автор приносит благодарность всем коллег ам за участие в совместных работах и обсуждении результатов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей, 7 тезисов конференций. 1 патент Российской Федерации.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, трех глав с изложением результатов работы, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 113 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 7 таблицами и 21 рисунком. Библиография включает 150 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

В первой главе диссертации рассмотрены предпосылки использования люминесцентных бактерий для изучения закономерностей воздействия на микроорганизмы растворов радионуклидов. характеризуюшихся альфа-распадом. Обсуждается проблема «малых доз», представлен обзор существующих методов определения радионуклидов в окружающей среде, анатизируется применимость и распространение радиобиологических методов Приводится обзор литературы по

структуре и свойствам бактериальных люминесцентных систем, механизмам воздействия на них токсичных соединений и методам биотестирования химической токсичности сред. Приведены примеры использования бактериальных биолюминесцентных биотестов и биотестов на основе ферментативных реакций светящихся бактерий Уделено внимание использованию гуминовых веществ для детоксикации различных сред. Обоснованы преимущества использования биолюминесцентных бактериальных систем различной сложности для мониторинга токсичности радионуклидов, характеризующихся альфа-распадом, в растворах низкой и средней активности

Вторая глава диссертации посвящена описанию материалов и методов исследования. В работе использовали четыре биолюминесцентных системы: интактные бактерии - клеточная суспензия 16-часовой культуры бактерий Рк. рпохркогеит 1883 1ВЯО из коллекции Института биофизики СО РАН: препарат микробиотест 677Р, изготовленный на основе лиофилизировамных светящихся бактерий РИ рИозрИогеит 1883 1В80, комплект реактивов аналитической биолюминесценции, который включает лиофилизированные препараты бактериальной люциферазы и НАД(Р)Н:ФМН-оксидоредуктазы, иммобилизованный в крахмальный гель препарат ферментов НАД(Р)Н:ФМН-оксидорсдуктазы и люшферазы.

В качестве источников радиоактивного излучения использовали растворы 241Ат(]М0з)з и иО:(МО;)2- Хроническое воздействие растворов солей радионуклидов сравнивали с воздействием солей стабильных металлов -Еи(К0з)з и РеС13.

Источником гуминовых веществ служил препарат «Гумат-80» (ООО «Гумат», г. Иркутск, Россия) Концентрации гуминовых веществ в рабочих растворах составляли 0.25-1,00г/л.

Растворы радионуклидов добавляли в суспензии бактерий или растворы ферментов. Рабочие (с радионуклидом) и контрольные (без радионуклида) образцы инкубировали при низких температурах (-3-10°С) Затем через 0,5. 1. 1,5; 2: 2,5, 3: 4; 6; 8; 16; 24 и т.д. часов отбирали пробы, готовили рабочий и контрольный растворы, которые использовали для измерения интенсивности биолюминесценции при комнатной температуре. Измерения интенсивности биолюминесценции продолжали до падения интенсивности биолюминесценции контрольного раствора на 80%.

На Рис. 1 в качестве примера представлена зависимость ингенсивиости люминесценции интактных бактерий от времени их иикубирования в радиоактивном и контрольном образцах.

Изменение интенсивности биолюминесценции в присутствии радионуклидов (или их стабильных аналогов) оценивали относительной интенсивное! ью биолюминесценции

^ ге1 _ I гскЛ I сотг

где /Л|(/ - среднее значение интенсивности биолюминесценции в присутствии радион\ктида (ити стабильного металла в случае сравнительных экспериментов). /„,», - среднее значение интенсивности биолюминесценции в отсутствии радионуклида (или стабильною металла) Вычисляли среднее значение /"' и

погрешность для этой величины Ошибка определения /*' не превышала 15%. Далее строили зависимости У"7 от времени инкубирования биолюминеснентной системы в растворе радионуклида (или стабильного металла)

Для количест венной характеристики активации и ингибирования биолюминесценции использовали величины ^ и . которые фиксировались

соответственно в момент максимальной интенсивности биолюминесценции и в момент падения интенсивности свечения контрольного образца на 80%

I.mV

время инкубирования, ч

Рис 1. Зависимость интенсивности биолюминесценции интактных бактерий (I) от времени инкубирования: 1 - в растворе Am-241 (А ~ 6000 Бк/л, С = 2-10"'°М), 2-в контрольном растворе.

Активность растворов (Л) измеряли методами гамма-спектрометрии и жидкостно-шинтилляционной спектрометрии на жидкостносцингилляционном счетчике "TriCarb" фирмы "Canberra Paccard" (США) с использованием в последнем программного обеспечения "RadSpectraDec". Для расчета доз обл>чения использован метод, описанный в [5]

Клетки разделяли на фракции (клеточную и межклеточную) с помощью ультразвукового воздействия и последующего центрифугирования Затем, измеряя активность каждой фракции, определяли в них процентное содержание Аш-241

Третья глава посвящена анализу влияния растворов Аш-241 на биолюминесцентные системы Получены зависимости интенсивности биолюминесценции четырех биолюминесцентных систем от времени воздействия Am-241 в растворах различной удельной активности/концентрации. При этом в большинстве случаев на начальном этапе инкубирования наблюдали активацию, затем - ингибирование биолю-минесценции Задержка эффекта (индукционный период) состав тя та 0.5-4 часа

На Рис.2 в качестве примера приведена зависимость интенсивности биолюминесценции цитатных бактерий от времени воздействия Ат-241. Из рисунка видны периоды активации (/"'>}) (до 50 часов) и ингибирования биолюминесценции (/"' <1) (более 50 часов). В данном эксперименте (в растворе Аш-241 с удельной активностью 6000 Бк/л) при инкубировании в течение 50 часов бактерии получили дозу менее 2 Гр Эта величина близка к условной границе между «большими» и «средними» дозами для млекопитающих ~ 1-2,5 Гр [4]

О 20 40 60 80

время инкубирования, ч

Рис. 2 Относительная интенсивность биолюминесценции (/"') интактных бактерий при хроническом воздействии радиоизотопа 24,Ашн (Л = 6000 Бк/л, С=2-Ю"10М.) (1) и стабильного изотопа Ей3" (С = 2- Ю"10М) (2).

Рис. 3 суммирует результаты воздействия Аш-241 на все четыре биолюминесцентные системы Из рисунка видно, что отклонения от контроля тГе1

(1 = 1) растут с увеличением удельной активности/концентрации раствора, как

для случаев активации, так и ингибирования. Максимальная активация наблюдается т"'

для интактных бактерий (1 п,ях = 4). Лиофилизированные бактерии и ферментативная

-тс! .гс-1

водорастворимая система характеризуются меньшей активацией (I жп - 1,6 и I ти =

1.3. соответственно). Активация не наблюдалась в иммобилизованной ферментативной системе

Таким образом, зафиксировано воздействие Ат-241 не только на бактериальные клетки, но и на ферментативные системы. Эффекты для этих систем подобны (активация на начальном этапе воздействия и ингибирование на конечном), однако, для ферментов активация менее выражена. Меньшая активация лиофилизироваиных бактерий по сравнению с интактными связана, вероятно, с поврежденностью бактериальных клеток при лиофилизации. Низкая чувствительность иммобилизованного препарата ферментов может объясняться ограниченной диффузией атомов Агп-241 в крахмальном геле.

Из Рис. 3 видно, что при хроническом воздействии Ат-241 на биолюминесцентные системы эффекты проявляются при содержании радионуклида в растворах >100 Бк/л, (>10"12М), Эффективность воздействия Ат-241 зависит от уровня организации системы (бактериальные клетки или выделенные ферментативные системы), поврежденное™ клеток, и концентрации радионуклида.

Рис. 3. Величины и т™' при воздействии растворов Ат-241 на

I та* 1 т1П

биолюминесцентные системы: I - интактные бактерии: 2 - лиофилизированные бактерии: 3 - растворимая ферментативная система. 4 - иммобилизованная ферментативная система.

Активация биолюминесценции - проявление радиационного гормезиса для биолюминесцентных систем. Механизм этого явления на сегодня остается дискуссионным. В настоящее время предполагается, что все эффекты ионизирующего излучения, в том числе и радиационный гормезис. являются

следствием инициирования в среде радикальных процессов [4]. Существует концепция мембранного механизма воздействия малых доз Л.Х. Эйдуса, лучевого токсического эффекта - «bystander effect» и др.

Эффективная активация штгактных бактерий может быть связана с увеличением активности ферментов, а также рядом других процессов, определяющихся воздействием ионизирующего излучения на бактериальную культуру, например, изменением концентрации субстратов ферментативных реакций, накоплением перекисных соединений, активирующих биолюминесценцию, изменение осмотического давления или активацией более сложных протекторных функций бактериальных клеток на генетическом или биохимическом уровнях.

На Рис. 4 представлено распределение Am-241 в бактериальной культуре на трех стадиях инкубирования: на стадии задержки эффекта, активации и ингибировании биолюминесценции. Содержание Am-241 в клеточной фракции, показанное на оси ординат, включает внешнюю (за счет адсорбции па мембране) и внутриклеточную составляющие. За 100% принято суммарное содержание америция в бактериальной культуре.

о4

СО

к 8ч

О

100 75 -50 -25 -0

Индукционный период

I

Стадия активации

Стадия ингибирования

Л

0 10 - межклеточная фракция

20 30

время инкубирования, ч

• клеточная фракция

Рис. 4. Распределение Am-241 между клетками и внеклеточной жидкостью на трех стадиях инкубирования. А = 3000 Бк/л, С-10"!ОМ.

Из рисунка видно, что в течение 20 часов наблюдается увеличение содержания Ат-241 в клеточной фракции. Известно, что имеют место факты концентрирования Ат-241 и других радионуклидов на поверхности клеток [6]. Вероятно, Ат-241 также способен поступать внутрь клетки, аналогично железу или

плутонию [7]. Кроме того, возможен транспорт тяжелых металлов через клеточную мембрану с участием специфичных клеточных белков - силерофоров |8-9].

На последнем этапе инкубирования (20-32 часа) наблюдалось значительное (на 48%) уменьшение содержания Апт-241 в клеточной фракции (Рис. 4). Вероятно, у части клеток на этой стадии происходит полное разрушение клеточной стенки, и внутриклеточное содержимое смешивается с межклеточной средой.

На Рис. 5 представлены результаты электронно-микроскопических исследований бактериальных клеток, отобранных на стадиях активации (Рис. 56) и ингибирования (Рис. 5в) биолюминесценции.

Из Рис. 5а видно, что бактериальные клетки контрольного образца имеют овальную или округлую форму с достаточно гладкими краями. Показанные белые пузырьковые включения, вероятно, являются включениями полиоксибутирата -вещества, которое запасает здоровая клетка для расходования в неблагоприятных условиях. Форма клеток в контрольном образце со временем практически не меняется.

Контрольный образец Клетки в растворе Ат-241

Рис. 5. Ультраструктура бактерий РИ. ркозркогеит: контрольный образец (а) и клетки в растворе Ат-241 на стадиях активации (б) и ингибирования (в) биолюминесценции. А ~ 3000 Бк/л, С =Ю"10М.

Из сопоставления клеток контрольного (Рис. 5а) и опытных образцов (Рис. 5б.в) видно, что в результате хронического воздействия Ат-241 происходит заметное изменение клеток как на стадии ингибирования, так и активации биолюминесценции. Наблюдается наличие большого числа плеоморфных клеток: их края неровные, имеются шелевидные расщепления. Кроме того, обнаружено нарушение деления и существенное уменьшение содержания полиоксибутирата. На стадии активации (Рис. 56) мембраны повреждены, однако обнаруживаются и неповрежденные клетки. На стадии ингибирования (Рис. 5в) неповрежденные клетки полностью отсутствуют. Все перечисленное указывает на нарушение клеточных функций при хроническом воздействии Ат-241.

Таким образом, в растворах Ат-24! наблюдаются накопление Ат-24] в клеточной фракции и повреждения клеточных структур.

(а)

(б)

(в)

В главе 4 проведено сравнение эффектов нитрата америция и солсй других металлов.

Предварительно нами показано, что природа анионов используемых солей (нитратов, сульфатов или хлоридов) не влияет на интенсивность биолюминесценции. Эффекты определялись только природой катионов. Рассмотрено действие на биолюминесцентные системы катионов 23-х-металов, принадлежащих различным группам Периодической системы (Табл. 1).

Эффекты оценивались на начальной стадии инкубирования с биолюминесцентными системами - лиофилизированными бактериями, водорастворимой и иммобилизованной ферментативными системами.

Воздействие солей металлов на биолюминесценцию описано уравнением:

1/1 0 = ехр(-КС), (1)

где /- интенсивность биолюминесценции при концентрации соли С (М); 10 - интенсивность биолюминесценции при О О, К (М"') - коэффициент ингибирования, который определяли по начальному участку зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации соли. Положительные величины К соответствуют ингибироваиию биолюминесценции, а отрицательные - ее активации. В Табл. 1 перечислены исследуемые соли, указана природа внешних электронных орбиталей. приведены величины К для трех биолюминесцентных систем. Здесь же приведены действующие концентрации солей металлов для бактериальной системы (С20) т.е. концентрации соли, изменяющие интенсивность биолюминесценции на 20 %.

Данные Табл. 1 показывают, что соли щелочных металлов при заданных концентрациях и условиях эксперимента не действуют на биолюминесцентные системы. Наиболее чувствительной к солям ¿/-металлов оказалась иммобилизованная система, а к тяжелым ¿»-металлам - бактерии (коэффициенты ингибирования максимальны)- Кроме того, оказалось, что соли щелочноземельных металлов активируют водорастворимую и в небольшой степени иммобилизованную ферментативные системы. Соли ¿-металлов с незаполненными (/-орбиталями активируют только водорастворимую систему

Таким образом, воздействие солей металлов на бактериальные биолюминесцентные системы связано с электронной структурой катиона - природой его внешних орбиталей. Для групп катионов со сходным строением внешней электронной оболочки наблюдаются аналогичные изменения воздействий на биолюминесценцию.

Из Табл. 1 видно, для всех катионов величины С2о не превышают 10"7М за исключением радиоактивного Ат-241. для которого С;оравна 10*"М.

Исследовано хроническое воздействие Ки(К03)5, ГеС13 и и02(К0;)2, на четыре биолюминесцентные системы - интактные бактерии, диофилизированные бактерии, водорастворимую ферментативную систему, иммобилизованную ферментативную систему. Условия инкубирования выбирались аналогично условиям, использованным для Ат(М0э)з Получены зависимости интенсивности биолюминесценции от времени инкубирования с этими солями.

Таблица 1.

Коэффициенты ингибирования водорастворимой {Кр). иммобилизованной {!<„) ферментативных систем и лиофилизированных бактерий (К6). С 20 ~ действующая концентрация соли.

Соли Природа внешних Кр, Кп К*

металлов орбиталей катиона (м-1) (М"1) (М-1) <М)

/. Соли щелочных металлов

1лС1 28° 0 0 0

№С1 ЗБ0 -40 0 0 4,6-10"3

КС1 48° 0 0 0

2 Соли щелочноземельных металлов

М8С12 35° -7-102 -70 2 2,6 10"4

СаС12 45° -6-Ю2 -10 6 3,0-10^

ВаС12 6Б° -5-Ю3 -10 0 3.6-10-5

3 Соли (¡-металлов

КСг(%04)2 Зс1345° 2 103 2-103 8-103 1,1-Ю-4

МпС12 3<1548° -3-Ю2 2-104 8 102 6. МО"4

Ре804 Зс1б48° 6-102 8-103 2-103 3,7-10^

СоЭ04 за748° -5-102 4-103 З-Ю3 3,6-10'4

N¡804 Зс1848° -7-102 6 103 з-ю3 2,6-10'4

СиБ04 ЗёЧБ0 Ю4 2-104 3-Ю4 2,2-10'5

гп304 Зс11045° 2 103 4 104 103 1,1-Ю-4

AgNOз 4(11055° 104 102 2 103 2.2-10'5

Сс1С12 4с)'°55° 3-104 103 3-Ю2 7.4-10'6

Нё(М03)2 5с11065° 5-Ю3 8-Ю3 3 102 4.5-10'5

4. Соли р-металлов

А1С13 ЗБ0 8-103 30 7 102 2,8-10'5

$пС12 552р° 4-103 2 Ю2 103 5,6-10'5

РЬС12 682р° 104 2-Ю3 4-105 2.2-10'5

В.-(Ы03)3 682р° 2 103 МО3 4104 1.1-КГ4

5 Соли Г-металлов

Еи(М03)3 4Г76Э2 3-Ю4 3-Ю10 4-104 5 10'6 ... 7

(ио2)то3)2 5Г6с1'782 3-104 4-104 2 105 10 7

Ат(МО?); -2 10ю -2 109 -2 10ю 10"12

На Рис. 6 приведены зависимости интенсивности люминесценции интактных бактерий от времени инкубирования в растворах Еи(ЭД03)3 и СО-^О;;);;

Уран является радионуклидом низкой удельной активности Проведено сравнение его воздействия с европием (Рис. 6) в качестве стабильного аналога. Из сравнения Рис. б.а и Рис. 6.6 видно, что эффекты европия и урана аналогичны.

время инкубирования, ч время инкубирования, ч

Рис. 6. Относительная интенсивность биолюминесценции Г"' интактных бактерий в присутствии: (а) Еи(Ш3)3, (б) и02(К03)2 Концентрации солей: 1 - 10"3 М, 2 - 10"4 М, 3 - 10'5 М. 4 — 10'7 М. 5 - 10"" М. Соответствующая удельная активность растворов Ш2(Ш3)- 1 - 3000 Бк/л, 2 - 300 Бк/л, 3-30 Бк/л, 4 - 0,3 Бк/л, 5-3-10'5Бк/л.

Спад биолюминесценции во времени аппроксимирован логарифмической зависимостью'

Г" = - а 1п I + 1 (2)

Рассчитаннь[е угловые коэффициенты С1 представлены в Табл. 2. Из Табл. 2 видно, что угловые коэффициенты й близки для нитратов уранила и европия одной концентрации. Аналогичные результаты получены и для хлорида железа Следовательно, эффекты урана и стабильных металлов могут считаться аналогичными, что свидетельствует о доминировании химической составляющей в воздействии урана на биолюминесценцию

Проведено сравнение хронического воздействия Ат(М03)3. рассмотренного в главе 3, с воздействием Еи^О^ и и02(М03)2.

Европий - это элемент, который считается стабильным химическим аналогом америция благодаря схожести природы внешних электронных орбиталей; оба элемента характеризуются одинаковым частичным заполнением /подуровней и двумя электронами на внешней ¿■-орбитали. Так как воздействие европия на биолюминесцентные системы включает только химическую составляющую, сравнение эффектов Аш-241 и европия дает возможность определить химическую и радиационную составляющие в воздействии Аш-241. Из Рис. 2 видно, чю при низких концентрациях (С = 2-10'10 М) эффект европия отсутствует, а Аш-241 активирует биолюминесценцию т начальном этапе и затем ингибирует ее на конечном этане инкубирования. Следовательно, весь эффект Ат-241 можно приписать его радиационным свойствам.

Таблица 2.

Угловой коэффициент а линейной зависимости (2) для интактиых бактерий в растворах Еи(Ш3)3 и и02(К03)2

Концентрация, М Еи(Ш3)3 ио2(Ш3)2

а а

10"3М 0,17 0.13

Ю^М 0,13 0,10

10'5М 0,09 0,05

10'7М 0,04 0,04

Ю'ПМ 0,002 0,002

Представляет интерес сравнение воздействия растворов радионуклидов низкой и высокой удельной активности на примере урана и америция. Выявлены следующие отличия:

1) Эффект Аш-241 проявляется при низких концентрациях (до 10"12 М, Рис. 3). а урана при более высоких (выше 10'7 М, Рис. 66).

2) При воздействии Аш-241 наблюдается активация биолюминесценции (до 400%) на начальном этапе инкубирования; воздействие урана характеризуется отсутствием активации люминесценции.

3) Эффект Ат-241 определяется его радиационными свойствами, а урана ~ химическими.

Таким образом, можно выделить особенности отклика биолюминесцентных систем на радиационную токсичность: радиационная токсичность (1) проявляется только в присутствии радионуклидов высокой удельной активности, (й) проявляется при значительно меньших концентрациях элементов, чем химическая, (ш) характеризуется начальным этапом активации свечения.

В главе 5 изложены результаты влияния гумииовых веществ на люминесцентные бактерии в растворах Ат(К03)3. На Рис. 7а приведена зависимость относительной интенсивности биолюминесценции от времени инкубирования

интактных бактерий в растворе нитрата америция в отсутствии и в присутствии гуминовых веществ

Из Рис. 7а видно, что присутствие гуминовых веществ уменьшает отклонения интенсивности биолюминесценции от контроля. Величина /mai в

г"'

присутствии гуминовых веществ уменьшилась на 40%, а /„,,„ увеличилось на 35%

Следовательно, присутствие гуминовых веществ создает маскирующий эффект, нейтрализуя токсическое воздействие Аш-241 на люминесцентные бактерии Маскирующий эффект связан со способностью гуминовых веществ образовывать комплексы с Аш-241 [10] и экранированием клеток бактерий от альфа-излучения.

время инкубирования, ч

Рис. 7. Влияние гуминовых веществ на интактные бактерии в растворах Ат(Х03)3: а) относительная интенсивность биолюминесценции (/""') на различных стадиях инкубирования, б) содержание Аш-241 в клеточной фракции на различных стадиях инкубирования 1 - отсутствие гуминовых веществ. 2 - присутствие гуминовых веществ А =3000 Бк/.1 Г=Ю"10М Концентрация (уминовых веществ-0.25г/л.

Изучено влияние гуминовых веществ на распределение Аш-241 между бактериальными клетками и межклеточной средой. Показано, что Ат-241 накапливается в клеточной фракции и в отсутствии, и в присутствии гуминовых веществ (Рис. 76). Однако, сравнивая кривые 1 и 2 на Рис. 76. видим, что присутствие гуминовых веществ уменьшает накопление радионуклида клетками на интервале 7-24 часа. Этот интервал близок интервалу активации биолюминесценции (см. Рис. 7а). Вероятно, уменьшение активации биолюминесценции гуминовыми веществами связано с уменьшением накопления Ат-241 клетками на этом этапе воздействия. На стадии ингибирования (32 часа) в присутствии гуминовых веществ (Рис. 76. кривая 2) не зафиксировано достоверного уменьшения (по сравнению со стадией активации) содержания Ат-241 в клеточной фракции. Вероятно, в присутствии гуминовых веществ полному разрушению на этой стадии подвержено меньшее число клеток.

Электронно-микроскопические исследования позволили визуализировать процессы, происходящие с клеточной культурой вследствие радиационного воздействия Ат-241 в присутствии гуминовых веществ. На Рис. 86 и 8в представлены изображения бактериальных клеток, инкубированных в растворе Ат-241 в присутствии гуминовых веществ, отобранных на стадии активации и стадии ингибирования биолюминесценции, соответственно.

Контрольный образец ■

Клетки в растворе Ат-241 в присутствии гуминовых веществ

Стадия активации

Рис. 8. Ультраструктура бактерий Рк ркоярНогеит: контрольный образец (а) и клетки в растворе Ат-241 на стадиях активации (б) и ингибирования (в) биолюминесценции в присутствии гуминовых веществ. А = 3000 Бк/л, (С= Ю"10М). Концентрация гуминовых веществ 0,25 г/л

Из этих рисунков видно, что в присутствии гуминовых веществ наблюдаются нарушения клеточных структур, схожие с нарушениями без гуматов. рассмотренными ранее (Рис. 56. 5в). Однако на стадии активации в присутствии гуминовых веществ обнаружено меньшее число поврежденных клеток (сравни Рис.56 и Рис. 86). На стадии ингибирования зафиксированы целые клетки (сравни Рис. 5в и Рис. 8в). Меньшее разрушение бактериальных клеток в присутствии гу матов. объясняется снижением накопления Ат-241 в клеточной фракции Рис. 76.

'1аким образом, показано, что гуминовые вещества нейтрализуют воздействие Агп-241 на люминесцентные бактерии: уменьшают отклонения биолюминесценции от контроля, поврежденность клеток и изменяют накопление Аш-241 в клеточной фракции.

ВЫВОДЫ;

1 Установлена нелинейность зависимости эффекта от времени хронического воздействия Аш-241 на биолюминесцентные системы в растворах малой и средней активности: продемонстрирована активация биолюминесценции на начальной стадии и ингибирование биолюминесценции на конечной стадии воздействия. Указанные эффекты зависят от уровня организации системы (бактериальные клетки или ферментативные системы), поврежденное™ клеток и концентрации радионуклида Эффект проявляется при низком содержании Am-241 в растворах (А=100 Бк/л. С= 10"ПМ). 2. На основе сравнения хронического воздействия на люминесцентные бактерии америция, урана и стабильных элементов (европия, железа) показано, что эффект Агп-241 в растворах малой и средней активности определяется его радиационными свойствами, а урана - химическими 3 Продемонстрировано накопление Аш-241 в клеточной фракции. 4. Установлено, что гуминовые вещества в растворах Агп-241 уменьшают его влияние на люминесценцию бактерий, уменьшают поврежденность бактериальных клегок и изменяют накопление Аш-241 в клеточной фракции. 5 На примере Аш-241 показана принципиальная возможность использования люминесцентных бактерий для мониторинга радиотоксичности растворов радионуклидов. характеризующихся альфа-распадом. в различном микроокружении

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах: Статьи:

1. Кудряшева Н.С. Действие солей металлов на бактериальные биолюминесцетные системы различной сложности / Н.С Кудряшева, JI.B. Зюзикова, Т.В. Гутник (Рожко). A.B. Кузнецов II Биофизика. 1996. - Т.41. № 6. -С Л 264-1269.

2. Кудряшева Н С. Механизм действия солей металлов на бактериальную биолюминесцентную систему in vitro / Н.С Кудряшева. Е В Зюзикова, Т.В. Гутник (Рожко) // Биофизика. 1999 - Т 44, №2. - С 244-250

3 Рожко Т.В Влияние радиации малой активности на биолюминесцентные тестовые системы различной сложности. / Т В Рожко. Н.С. Кудряшева. А М. Кузнецов. Г.А Выдрякова. Л.Г. Бондарева. А Я. Болсуновский // Изв. By зов. Физика. 2006 - Т.49. №3. - С 166-167. 4. Roihko T.V. Effect of low-level a-radiation on biolummescent assay systems of \arious complexity / TV Rozhko. MS. Ki)dryashe\a. A.Vf Kuznetsov. G.A. Vydryakova. LG Bondareva. A.Ya. Bolsunovsky // Photochem Photobiol Sei. 2007 - V 6. - P.67-70.

5. Rozhko T.V. Comparison of Effects of Uranium and Americium on Bioluminescent Bacteria / T.V. Rozhko. N S. Kudryasheva, M.A. Aieksandrova. L.G Bondareva. A A Bolsunovsky. G.V. Vydryakova // Journal of Siberian Federal University: Biology. 2008 - V.I. №1 -P.60-64.

6. Патент РФ № 2006133756. Биолюминесцетный способ мониторинга радиогоксичпости растворов. Приоритет от 21.09 2006

Тезисы конференций:

7. Kudryasheva N. Bioluminescent monitoring of detoxification process / N. Kudryasheva. E. Fedorova. T. Rozhko, О Tchaykovskaya, I. Sokolova, V Svetlichniy // Abstr of Xll-th Int. Symposium on Luminescence Spectrometry, 2006. -Spain. 2006. - P. 38.

8 Рожко T.B. Влияние растворов радионуклидов низкой активности на биолюминесцентные тестовые системы различной сложности / Т.В Рожко, Н С.Кудряшева. A.M. Кузнецов, Г.А. Выдрякова, Л.Г. Бондарева, А.Я Болсуновский // Тезисы Российской школы-конференции молодых ученых «Экотоксикология: современные биланалитические системы, методы и технологии», 2006. - Пущино, 2006. - С.125-126. 9. Кудряшева Н.С. Использование биолюминесценции для анализа радиотоксичности растворов. / Н.С. Кудряшева, Т.В. Рожко, Л Г. Бондарева, А.Я. Болсуновский И Тезисы 2-ой Всероссийской конференции по аналитической химии, 2007. Краснодар, 2007. - С.151-153 10 Kudryasheva N.S. Effect of low-level a-radiation on bioluminescent bacteria / N S.Kudryasheva. T.V. Rozhko. M.A. Aieksandrova. L.G Bondareva, A.Ya. Bolsunovsky G V.. Vydryakova // International Conference on Environmental Radioactivity: From Measurements and Assessments to Regulation (CN-145). 2007. -Austria, 2007. - P 67-70. 11. Рожко Т.В Влияние растворов радионуклидов малой активности на биолюминесцентные тестовые системы различной сложности / Т.В. Рожко, Н.С. Кудряшева. Л.Г. Бондарева А М., Кузнецов. Г.А Выдрякова. А.Я. Болсуновский Тезисы 4-ой молодежной научно-практической конференции «Ядерно-промышленный комплекс Урала: проблемы и перспективы». 2007. - Озерск,

2007. -С.122-122.

12 Kudtyasheva N S Bioluminescenct monitoring of radiotoxicity in solutions of alpha-radionuclides / N S. Kudryasheva. T.V. Rozhko. L.G. Bondareva. A A. Bolsunovsky, G.V. Vydryakova // Luminescence. 2008. - V.23, N2. - P.78-78 13. Rozhko T.V Bioluminescence monitoring; detoxification of alpha-radioactive solutions by humic substances / T.V. Rozhko. M.A. Aieksandrova // Luminescence.

2008. - V.23, N2, P.90-90.

Цитируемая литература

1. Гительзон И.И Экологическая биофизика. /И.И. Гительзон. В.А Кратасюк. В Н. Лопатин, А.А. Тихомиров, Л.А. Щур. B.C. Филимонов// В Зт Учебное пособие. М .Логос. 2002,- 127с

2. Girotti S Monitoring of environmental pollutants by bioluminescent bacteria / S Girotti. E N Ferri. M G Fumo. E. Maiolini П Anal.Chim Acta. 2008. - V. 608. N 1. -P 2-29

3. Min J. Gamma-radiation dose-rate effects on DNA damage and toxicity in bacterial cells / J Mm, C. W. Lee, M B. Gu // Radiation and Environmental Biophysics 2003.

- V. 42. N3 -P. 189-192.

4 Кудряшов IO Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения) / Ю.Б.

Кудряшов // М.: Физчатлит. 2004. 446 с

5. Несмеянов А Н. Радиохимия. / А.Н. Несмеянов // М.: Химия. 1978. 560с

6 Sigel A Iron Transport and Storage in Microorganisms / A.Sigel, H.Sigel // Plants, and. Animals - New York. 1998. - V 1 35. - P. 824.

7. Clemens S Toxic metai accumulation, responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants / S.Clemens // Biochimie., 2006 - V.88. № 11. - P. 1707-1719.

8. Liu N. Biosorption of 241 Am by Saccharomyces cerevisiae- Preliminary investigation on mechanism / N. Liu. J.Liao, Y.Yang, S.Luo. Q.Luo, Y.Duan. M.Liu, P. Zhao 4 Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 2008. - V. 275, №1. - P 173-180.

9 Braun V. Avoidance of iron toxicity through regulation of bacterial iron transport / V Braun // Biol Chem, 1997. - V.378, №8. - P 779-786.

10 Choppin G R Comparison of two models for metal-humic interactions / G R. Choppin, N Labonne-Wall //Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 1997. -V. 221, №1,- P. 67- 80.

Подписано в печать 08.09.2008 Формат 60 х 84/16 Бумага типографская. Псча1Ь офсетная Объем 1.8 пл. Тираж 100 экз. Заказ № 19

Типография Института физики СО РАН 6600366 г Красноярск. Академгородок 50. строение 38.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рожко, Татьяна Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ПРЕДПОСЫЛКИ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ ТЕСТОВЫХ СИСТЕМ ДЛЯ МОНИТОРИНГА РАДИОТОКСИЧНОСТИ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)

1.1. Биолюминесценция: природа и свойства

1.2. Использование биолюминесценции для мониторинга химической токсичности

1.2.1. Использование люминесцентных бактерий для мониторинга химической токсичности

1.2.2. Использование биолюминесцентных ферментативных реакций для мониторинга химической токсичности

1.3. Способы оценки радиационного состояния окружающей среды

1.3.1. Методы детектирования радионуклидов в различных объектах

1.3.2. Метод гамма-спектрометрии

1.3.3. Метод альфа-спектрометрии

1.3.4. Метод бета-спектрометрии

1.3.5. Масс-спектрометрия

1.3.6. Жидкостно-сцинтилляционная спектрометрия

1.3.7. Определение отдельных радионуклидов. 27 1 -4. Воздействие ионизирующих излучений

1.4.1. Характеристика излучений

1.4.2. Биологические процессы под действием ионизирующего излучения. Радиобиологические методы.

1.5. Проблема «малых доз»

1.6. Использование гуминовых веществ для детоксикации растворов

1.7. Перспективность использования бактериальной люминесценции для мониторинга радиотоксичности 49 растворов

ГЛАВА 2. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

2.1. Реактивы и приборы

2.2. Методы измерения

2.2.1. Регистрация кинетики биолюминесценции

2.2.2. Приготовление образцов для измерения интенсивности биолюминесценции

2.2.2.1. Основные этапы

2.2.2.2. Приготовления проб и растворов (рабочих и контрольных) с использованием интактных и лиофильно высушенных 56 бактерий

2.2.2.3. Приготовления проб и растворов (рабочих и контрольных) с использованием водорастворимой и иммобилизованной 57 ферментативных систем

2.2.2.4. Измерение интенсивности биолюминесценции интактных бактерий в присутствии гуминовых веществ

2.3. Обработка данных биолюминесцентного анализа

2.4. Измерение активности растворов Ат

2.5. Анализ ультраструктуры бактериальных клеток.

2.6. Анализ распределения Ат-241 в клеточной культуре

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ РАСТВОРОВ Ат-241 НА

БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ

3.1. Влияние растворов Ат-241 на биолюминесцентные системы

3.1.1 Бактериальные системы

3.1.1.1. Интактные бактерии

3.1.1.2. Лиофилизированные бактерии

3.1.2. Ферментативные системы

3.1.2.1 Водорастворимая биферментная система

3.1.2.2 Иммобилизованная в крахмальный гель ферментативная система

3.2. Сравнение влияния Аш-241 на биолюминесцентные системы

3.3. Распределение Ат-241 в бактериальной культуре

3.4. Результаты электронно-микроскопических исследований ^ бактериальной культуры в растворе Am

ГЛАВА 4. СРАВНЕНИЕ ВЛИЯНИЯ СОЛЕЙ МЕТАЛЛОВ НА БАКТЕРИАЛЬНУЮ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЮ

4.1. Классификация эффектов металлов различных групп на биолюминесцентные системы (начальная стадия 76 и нкубирования)

4.2. Исследование эффектов тяжелых металлов при различных временах инкубирования

4.2.1. Хроническое воздействие Европия

4.2.2. Хроническое воздействие Урана

4.3. Сравнение воздействия на биолюминесценцию металлов различной удельной радиоактивности 4.3.1. Сравнение эффектов европия и америция

4-3-2 Сравнение эффектов европия и урана

4.3.3. Сравнение эффектов урана и америция

4.4. Итоги главы

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ НА ТОКСИЧНОСТЬ РАСТВОРОВ Ат

5.1. Влияние гуминовых веществ на интенсивность биолюминесценции бактерий в растворах нитрата америция 5.2 Распределение радионуклидов между бактериальными клетками и средой в присутствии и отсутствии гуминовых веществ

5.3. Результаты электронно-микроскопических исследований воздействия гуминовых веществ на бактериальную культуру в растворе Am

Введение Диссертация по биологии, на тему "Воздействие растворов америция-241 малой и средней активности на биолюминесцентные системы"

В настоящее время в радиоэкологических исследованиях наблюдается смена концептуального подхода: на смену антропоцентрическому приходит экоцентрический подход. Созрело понимание необходимости изучения влияния радиоактивности на всю биоту в целом и на человека как составную часть этой биоты, интегрированную в биосферу множеством функциональных связей. Микроорганизмы являются простейшей и основополагающей частью биосферы, и их состояние может служить индикатором состояния системы в целом. В связи с этим исследования воздействия радиоактивности на микроорганизмы приобретают все большую актуальность.

Фундаментальной задачей в рамках указанной проблемы является разработка научных основ использования микроорганизмов для мониторинга радиационной токсичности. Удобными объектами являются морские люминесцентные бактерии, которые уже более сорока лет применяются для мониторинга химической токсичности различных сред (Гительзон и др., 1984; Кратасюк, 1994; Girotti, 2008). Для количественной оценки состояния этих микроорганизмов в различных условиях окружающей среды используется интенсивность их люминесценции. Имеется возможность аналитического использования как бактериальных клеток, так и выделенных ферментов, что дает возможность сравнивать результаты воздействия радиации на микробиологическом и биохимическом уровнях.

К настоящему времени известны исследования (Min, 2003), в которых биолюминесценция бактериального рекомбинантного штамма E.coli применялась для определения токсичности среды, задаваемой гамма-излучением. Биолюминесцентные системы до сих пор не использовались для изучения воздействия следовых количеств изотопов с преимущественно альфа-излучением.

В последние годы исследователи все чаще обращаются к проблеме «малых доз». Обсуждаются неаддитивность и гетерогенность откликов организмов на низкодозовое воздействие. Наиболее важным достижением в данной проблеме является выявление нелинейности зависимости доза-эффект и понимание того, что воздействия излучений в малых дозах нельзя оценивать путем простой экстраполяции экспериментальных данных, полученных при использовании больших повреждающих доз облучения (Кудряшов, 2004). Известно, что в определенном диапазоне доз наблюдается стимуляция, а не угнетение клеточных процессов (так называемый эффект «гормезиса»).

Вместе с тем, несмотря большой интерес к проблеме «малых доз», вопрос о механизмах формирования вызываемых ими эффектов остается на уровне гипотез и предположений (Kim et al., 2007).

Одним из наиболее опасных, с точки зрения влияния на живые организмы, является воздействие радионуклидов, характеризующихся преимущественно альфа-распадом. Типичным альфа-излу чающим радионуклидом является Am-241. Время его полураспада - 432,7 лет. Этот радиоизотоп имеет техногенное происхождение, является одним из побочных продуктов ядерного производства и в последние годы все чаще регистрируется в окружающей среде.

Цель исследования - изучение воздействия растворов Am-241 малой и средней активности на биолюминесцентные системы - люминесцентные бактерии и выделенные ферменты.

В работе поставлены следующие задачи:

1. Адаптировать биолюминесцентные методики для мониторинга радиотоксичности растворов малой и средней активности.

2. Сравнить воздействие на бактериальную биолюминесценцию Am-241, радионуклидов низкой удельной активности (на примере урана) и стабильных тяжелых металлов. На основе этого сравнения оценить вклады химической и радиационной составляющих в воздействии Am-241 и урана на биолюминесцентные системы.

3. Сравнить воздействие Am-241 на биолюминесценцию бактерий и выделенных ферментативных систем.

4. Оценить распределение Am-241 в бактериальной культуре.

5. Исследовать влияние гуминовых веществ на люминесценцию бактерий в растворах Am-241, поврежденность клеток и содержание Am-241 в клеточной фракции.

Научная новизна. На примере Am-241 впервые исследовано воздействие растворов альфа-излучающего изотопа малой и средней активности на биолюминесцентные системы - интактные и лиофилизированные бактерии, водорастворимую и иммобилизованную в крахмальный гель ферментативные системы. Получены зависимости интенсивности биолюминесценции от времени воздействия радионуклида и его концентрации/удельной активности. Показано, что воздействие Am-241 проявляется при низких концентрациях/удельных активностях радионуклида, характеризуется начальным периодом активации и последующим периодом ингибирования биолюминесценции.

На основе сравнения со стабильными элементами показано, что эффекты Am-241 на биолюминесцентные системы определяется радиационными, а эффекты урана — химическими свойствами.

Обнаружено накопление Am-241 бактериальными клетками, визуализированы изменения бактериальных клеток на различных этапах радиационного воздействия.

Биолюминесцентные системы впервые использованы для мониторинга процессов детоксикации растворов Am-241 гуминовыми веществами.

Практическая значимость. Предлагаемые исследования являются основой для разработки биолюминесцентных методик мониторинга радиотоксичности радиоизотопов, характеризующихся альфа-распадом, в растворах низкой и средней активности. Биолюминесцентные системы могут быть использованы в экологии и медицине для мониторинга воздействия растворов радионуклидов на микробиологические и биохимические процессы, для выявления эффектов при различных дозах облучения.

Положения, выносимые на защиту:

1 Нелинейность зависимости эффекта от времени хронического воздействия Агп-241 на биолюминесцентные системы в растворах низкой и средней активности: активация на начальной и ингибирование на конечной стадиях воздействия.

2 Радиационная природа токсичности Ат-241 и химическая природа токсичности урана в растворах низкой и средней активности.

3 Уменьшение эффектов Агп-241 на люминесцентные бактерии в присутствии гуминовых веществ.

Апробация работы. Основные положения работы представлены на

VII-ой Международной школе-семинаре молодых ученых "Актуальные проблемы физики, технологий и инновационного развития" (Томск, 2005),

VIII-ом Международный симпозиум «Сложные системы в экстремальных условиях» (Красноярск, 2006), Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Москва, 2006), конференции «Социально-экологические проблемы природопользования в Центральной Сибири» (Красноярск, 2006), ХН-ом Международном симпозиуме по люминесцентной спектроскопии (Испания, Луго, 2006), 2-ой Всероссийской конференции по аналитической химии (Краснодар, 2007), Международной конференции по радиоактивности окружающей среды (CN-145, Вена, Австрия, 2007), 12-ом Международном симпозиуме по биолюминесценции (Шанхай, Китай, 2008), 1-ой Российской конференции «Радиоэкология: итоги, современное состояние и перспективы» (Москва, 2008).

Работа выполнена при финансовой поддержке следующих грантов: Грант Министерства Образования 1>Ф REC-002 KR-006; ФСП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2007-2012 годы» по теме: «Биолюминесцентный анализ: биосенсоры и биокаталитические технологии»; Программа РАН «Молекулярная и клеточная биология»; грант молодежной инновационной программы Сибирского Федерального Университета «Биолюминесцентный метод мониторинга радиотоксичности», 2007.

Личный вклад соискателя состоял в адаптации биолюминесцептных методик для мониторинга радиотоксичности растворов, проведении всех экспериментов, обработке и обсуждении экспериментальных данных. Радиометрический анализ радиоактивных растворов осуществлялся в Лаборатории радиоэкологии ИБФ СО РАН, приготовление препаратов интактных и лиофилизированных бактерий - в Лаборатории бактериальной биолюминесценции ИБФ СО РАН, иммобилизованных ферментативных препаратов — в лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН. Основная часть результатов была получена в сотрудничестве с Болсуновским А.Я., Бондаревой Л.Г., Есимбековой Е.Н., Кратасюк В.А., Кузнецовым A.M., Выдряковой Г.А., Могильной О.А., Александровой М.А. Вклад соавторов отражен в публикациях. Автор приносит благодарность всем коллегам за участие в совместных работах и обсуждении результатов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей, 7 тезисов конференций, 1 патент Российской Федерации.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, трех глав с изложением результатов работы, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 8 таблицами и 22 рисунками. Библиография включает 150 источников.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Рожко, Татьяна Владимировна

ВЫВОДЫ

1 Установлена нелинейность зависимости эффекта от времени хронического воздействия Ат-241 на биолюминесцентные системы в растворах малой и средней активности: продемонстрирована активация биолюминесценции на начальной стадии и ингибирование биолюминесценции на конечной стадии воздействия. Указанные эффекты зависят от уровня организации системы (бактериальные клетки или ферментативные системы), поврежденности клеток и концентрации радионуклида. Эффект проявляется при низком содержании Ат-241 в растворах (10"ПМ, 100 Бк/л).

2 На основе сравнения хронического воздействия на люминесцентные бактерии америция, урана и стабильных элементов (европия, железа) показано, что эффект Ат-241 в растворах малой и средней активности определяется его радиационными свойствами, а урана - химическими.

3 Продемонстрировано накопление Ат-241 в клеточной фракции.

4 Установлено, что гуминовые вещества в растворах Ат-241 уменьшают его влияние на люминесценцию бактерий, уменьшают поврежденность бактериальных клеток и изменяют накопление Ат-241 в клеточной фракции.

5 На примере Ат-241 показана принципиальная возможность использования люминесцентных бактерий для мониторинга радиотоксичности растворов радионуклидов, характеризующихся альфа-распадом, в различном микроокружении.

98

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предлагаемая работа имеет перспективы продолжения, как в фундаментальном, так и прикладном аспектах. Среди перспективных направлений можно отметить следующие: а) выявление клеточных процессов и структур, наиболее чувствительных к воздействию альфа-излучения низкой и средней активности -мутагенность, редокс-состояние низкомолекулярных соединений, активность ферментов. Потенциальные заказчики — медицинские и радиобиологические организации в России и за рубежом. б) выявления закономерностей воздействия хронического альфа-облучения низкой и средней активности на жизнедеятельность организмов; связь длительности и дозы облучения с восстановительными свойствами живых систем. Потенциальные заказчики — медицинские и радиобиологические организации в России и за рубежом. в) изучение детоксикации растворов альфа-радионуклидов природными комплексообрателями - гуминовыми веществами. с) расширение количества анализируемых радионуклидов. В частности, имеется острая необходимость контроля радиотоксичности трития в связи с развитием ядерной промышленности и интенсивным распространением этого радиоизотопа в окружающей среде. Потенциальными заказчиками являются контролирующие организации Казахстана (Семипалатинский полигон), Красноярского региона (бассейн реки Енисей) и др.

97

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рожко, Татьяна Владимировна, Красноярск

1. Алесина М.Ю. Формирование радиобиологических эффектов при хроническом внутреннем и внешнем облучении экспериментальных животных в малых дозах / М.Ю. Алесина // Международный журнал радиационной медицины, 1999, №2.- С.92-99

2. Ахапкин Ю. К. Биотехника новое направление компьютеризации / Ю.К. Ахапкин, С.И. Барцев, Н.Н. Всеволодов, В.А. Кратасюк // М.: Наука, 1990.- С.82-87.

3. Болсуновский А .Я. Новые данные по содержанию трития в одном из притоков реки Енисей / А.Я. Болсуновский, Л.Г. Бондарева // Доклады Академии наук, 2002. Т.385,№5.- С.714-717.

4. Вакуловский С.М Накопление 32Р в рыбе р. Енисей и реконструкция дозы облучения населения / Вакуловский С.М., Крышев А. И., Тертышник Э. Г., Чумичев В. Б., Шишлов А. Е // Атомная энергия, 2004. Т. 94. Вып. 1.-С. 61-67.

5. Гиль Т.А. Гашение люминесценции светящихся бактерий как тест для оценки токсичности фенольных компонентов стоков / Т.А. Гиль, А.Э. Балаян, Д.И. Стом //Микробиология, 1983.- Т.52,№6.- С. 1014-1016.

6. Гительзон И.И. Экологическая биофизика. /И.И. Гительзон, В.А. Кратасюк, В.Н. Лопатин, А.А. Тихомиров, Л.А. Щур, B.C. Филимонов // В Зт Учебное пособие; М.: Логос, 2002. 127с.

7. Гительзон И.И. Светящиеся бактерии / И.И. Гительзон, Э.К. Родичева, С.Е. Медведева, Г.А.Примакова, С.И. Барцев, В.Н. Петушков, В.В.

8. Межевикин, Е.С. Высоцкий, В.В. Заворуев, В.А. Кратасюк // Новосибирск: Наука, 1984. 278с.

9. Гродзенский Д.Э. Радиобиология: Биол. действие ионизирующих излучений / Д.Э. Гродзенский // М., Госатомиздат, 1963. 199 с.

10. Гудков Д.И. Тритий в воде Днепра и его водохранилищ / Д.И. Гудков // Гидробиологический журнал, 1995. Т.31, №3. - С. 95-102.

11. Гуркова В.И. Физика атомного ядра и частиц / В.И. Гуркова // Лабораторный практикум. Красноярск, 2000. 205с.

12. Джунковская И.П. Действие продукта окисления керогена на рост и люминесценцию Photobacterium fischeri / И.П. Джунковская, В.И. Сухаревич, В.Е. Шкинке, Л.А. Виестуре // Микробиология, 1985. Т.54, №1. - С. 89-92.

13. Есимбекова Е.Н. Исследование чувствительности трехферментных систем с бактериальной люциферазой при биотестировании водных экосистем: Автореф. дис. канд. биолог, наук / Е.Н. Есимбекова. Красноярск, 2000.-С. 17.

14. Жмур Н.С. Государственный и производственный контроль токсичности вод методами биотестироания в России. / Н.С. Жмур // М: Междун.дом сотрудничества, 1997. 148с.

15. Журавлев А.И. Спонтанная биохемилюминесценция животных тканей / А.И. Журавлев // В кн. Биохемилюминесценция. Наука, Москва, 1983.-С.10.

16. Карнаухов В.Н. Люминесцентный спектральный анализ клетки / В.Н. Карнаухов //М: Наука, 1978. 204с.

17. Кратасюк В.А. Гелевая модель функцонирования люциферазы в клетке/ В.А. Кратасюк, В.В. Абакумова, Н.И. Ким // Биохимия, 1994 Т.59, №7-С.761-765.

18. Кратасюк В.А. Каталитические свойства люциферазных биосенсоров / В.А. Кратасюк, Н.Б. Ким // В кн. Биотехника новое направление компьютеризации /Ахапкин Ю.К., Барцев С.И., Всеволодов Н.Н., Кратасюк В.А. и др.//М.: Наука. 1990 - С.82-87.

19. Кратасюк В.А. Люциферазное биотестирование: биофизические основы, методы и применение: Дис. док. биолог, наук / В.А. Кратасюк — Красноярск, 1994. М. 377 с.

20. Кратасюк В.А. Использование светящихся бактерий в биолюминесцентном анализе / В.А. Кратасюк, И.И. Гительзон // Успехи микробиологии, 1987-№21 С. 3-30.

21. Коган P.M. Основы гамма спектрометрии природных сред / P.M. Коган, И.М. Назаров, Ш.Д. Фридман // М.:Атомиздат, 1969. 468 с.

22. Коггл Д. Биологические эффекты радиации. / Коггл Д. // Пер с англ. М. Энергоатомиздат, 1986. 184 с.

23. Кудряшов Ю.Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения) / Ю.Б. Кудряшов // М.: Физматлит, 2004. 446 с.

24. Кудряшева Н.С. Закономерности ингибирования бактериальной биолюминесценции in vitro хинонами и фенолами компонентами сточных вод / Н.С. Кудряшева, Е.В. Шалаева, Е.Н. Задорожная, В.А. Кратасюк // Биофизика, 1994.- Т.39. №3.- С. 455-464.

25. Кудряшева Н.С. Использование биолюминесцентных биотестов для мониторинга вод озера Шира / Н.С. Кудряшева, Е.В.Шилова, Е.В., Хендогина В.А., Кратасюк // Сб. Медико-биологические и экологические проблемы комплекса "Озеро Шира". Томск, 1997. С. 100-105.

26. Кудряшева Н.С. Физико-химические основы биолюминесцентного анализа / Н.С. Кудряшева, В.А. Кратасюк, Е.Н. Есимбекова // Краснояр. гос. ун-т. Красноярск, 2002. 154 с.

27. Кудряшева Н.С. Основы физической химии / Н.С. Кудряшева // ГОУ ВПО «Гос.ун-т цвет, металлов и золота». Красноярск, 2006. 120 с.

28. Кузьмин М. Химия / М. Кузьмин // Учеб. пособие, М.: 1982. 284 с.

29. Кузин A.M. О различии ведущих молекулярных механизмов при действии g-радиации на организм в больших и малых дозах / A.M. Кузин // Изв. АН СССР. Сер. Биол., 1980. № 6. С. 883-890.

30. Кузин A.M. Возможные механизмы участия природного радиационного фона (ПРФ) в стимуляции деления клеток / A.M. Кузин // Радиац. биол. Радиоэкол., 1994. Т. 34. Вып. 2. - С. 398-400.

31. Кузин A.M. Идеи радиационного гормезиса в атомном веке. / A.M. Кузин // М.: Наука, 1995. 158с.

32. Кузин A.M. Роль природного радиоактивного фона и вторичного биогенного излучения в явлении жизни / A.M. Кузин //. М.: Наука, 2002. 80с.

33. Кузнецов A.M. Изучение характеристик реагентов для биолюминесцентных биотестов / A.M. Кузнецов, Н.А. Тюлькова, В.А. Кратасюк, В.В. Абакумова, Э.К. Родичева. //Сибирский экологический журнал, 1997. №5.- С.459-465.

34. Кузнецов A.M. Биотест, основанный на лиофилизованных бактериях / A.M. Кузнецов, Э.К. Родичева, Е.В. Шилова // Биотехнология, 1996 Т.9.- С.57-61.1 Ч 7

35. Кузнецов В.К. Накопление Cs в продукции растениеводства в зависимости от видовых и сортовых особенностей сельскохозяйственных культур / В.К. Кузнецов, Н.И. Санжарова, К.Г. Калашников, P.M. Алексахин // Сельскохозяйственная биология, 2000. №1. С.64-69.

36. Кузнецов Ю.В. К оценке вклада реки Енисей в общую радиоактивную загрязнённость Карского моря / Ю.В Кузнецов, Ю. А. Ревенко, В.К. Легин // Радиохимия, 1994. Т 36, №6 - С.546-559.

37. Кириллова И.П. Биолюминесцентный анализ и его возможности. / И.П. Кириллова, J1.A. Зайцева, JI.B. Дмитриева // Общие вопросы микробиологической промышленности, 1983. — С. 44.

38. Ландау-Тылкина С. П. Радиация и жизнь / С.П. Ландау-Тылкина // М. Атомиздат, 1974. 168с.

39. Лабас Ю.А. Неразгаданная Дарвиным биолюминесценция / Ю.А. Лабас, А.В. Гордеева. // Природа, 2003. №.2 С.25-31.

40. Левинский Б.В. Все о гуматах / Б.В. Левинский // 4-е изд. Корф-Полиграф. Иркутск, 2000. 75с.

41. Ленинджер А. Основы биохимии / А. Ленинджер // в 3-х томах. М.: Мир, 1985.367,368,320с.

42. Лютых В.П. Клинические аспекты действия «малых» доз ионизирующего излучения на человека (общесоматические заболевания) / В .П. Лютых, А.П. Долгих // Мед. радиол, и радиац. безопасность, 1998. -Т.43, №2. С.28-34.

43. Мажаров В.Ф. Радиационная обстановка в Красноярском крае и уровни канцерогенных рисков для населения / В.Ф. Мажаров, Л.Г. Климацкая, С.В. Куркатов // Бюллетень СО РАМН, 2006. №3. С. 64-67

44. Мажуль Л.М. Возрастные особенности влияния сочетанного радиационного воздействия на перекисное окисление липидов в крови крыс / Л.М. Мажуль, В.Е. Волыхина, Г.Г. Гацко // Вестник АН Беларусии, 2000. №1. С.68-69.

45. Мазурик В.К. Проблемы радиобиологии и белок р53 / В.К. Мазурик, Б.Б. Мороз // Радиационная биология. Радиоэкология, 2001. Т.41, № 5 -С.548-572.

46. Маслова И.В. Действие этанола на активность холинорецепторов и мембраносвязанных ферментов мозга крыс при длительном поступлении в организм радионуклидов / И.В Маслова // Здравоохранение, 1999. №7. -С.15-17

47. Матвеев А.Н. Атомная Физика / А.Н. Матвеев // М.: Высшая Школа, 1989. 439с.

48. Меликов Ю.В. Экспериментальные методы в ядерной физике / Ю.В. Меликов // Курс лекций. М.: Моск. ун-т, 1996. 120с.

49. Мильничук В.К. Радиационная химия / В.К. Мильничук //Соросовский образовательный журнал, 2000. Т.6, № 4 - С.24-29.

50. Молофей В.П. Адаптивный ответ на фоне радиопротекторного действия меланина в половых и соматических клетках мышей / В.П. Молофей, И.Б. Моссэ, С.И. Плотникова, JI.H. Кострова // Вестник АН Беларусии, 1999. №1.- С.35-36.

51. Несмеянов А.Н. Радиохимия. / А.Н. Несмеянов // М.: Химия, 1978.560с.

52. Никольский А.В. Радиоадаптивный ответ клеток млекопитающих / А.В.Никольский, А.Н. Котеров // Мед. радиол, и радиац. Безопасность, 1999. Т. 44, №6.- С. 5-18.

53. Носов А.В. Радиоактивное загрязнение р. Енисей, обусловленное сбросами Красноярского Горнохимического комбината / А.В. Носов // Атомная энергия, 1993. Т. 74. - С.144-150.

54. Носов А.В. Анализ радиационной обстановки на р. Енисее после снятия с эксплуатации прямоточных реакторов Красноярского ГХК / А.В. Носов, A.M. Мартынова // Атомная энергия, 1996. Т.81. - С.226-231.

55. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации / Д.С. Орлов // Москва: МГУ.1990. 325с.

56. Перцов JT.A. Ионизирующее излучение биосферы / JI.A. Перцов // М: Атомиздат, 1973. 228 с.

57. Пелевина И.П. Выживаемость облученных клеток млекопитающих и репарация ДНК / И.П. Пелевина, А.С. Саенко, В.Я. Готлиб, Б.И. Сынзыныс //М.: Энергоатомиздат, 1985. 120с.

58. Пелевина И.И. Радиационно-индуцированный адаптивный ответ у детей и эффект внешних и внутренних факторов/ И.И. Пелевина, Г.Г. Афанасьев, А.В. Алещенко // Радиац. биол. Радиоэкол, 1999. Т.39. Вып. 1. -С. 106-112.

59. Радиационная обстановка на территории Российской Федерации в 2000 году // Бюллетень по атомной энергии, 2002. №1- С.49-52.

60. Сапожников Ю.А. Радиоактивность окружающей среды / Ю.А.Сапожников, Р.А.Алиев, С.Н.Калмыков //М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2006. 287 с.

61. Сивухин. Д.В. Общий курс физики. Атомная и ядерная физика / Д.В. Сивухин // М.: ФИЗМАТЛИТ, 2006. Т 5. 784с.

62. Спитковский Д.М. Теоретические и экспериментальные подходы к проблеме индуцируемых адаптирующими дозами ионизирующей радиации изменений функциональных возможностей клеток / Д.М. Спитковский, И.В.

63. Кузьмина //Радиационная биология. Радиоэкология, 2001. Т. 41, № 5. - С. 599-609.

64. Урванцева Г.А. Применение методов биотестирования в оценке загрязнения вод тяжелыми металлами. / Г.А. Урванцева// 10 объед. пленум сов. и респ. ком. по прогр. Юнеско Человек и биосф. Тез. докл. Всес. конф. -Алма-Ата, 1988. С. 68 - 68.

65. Федорова Е.С. Детоксикация органических окислителей гуминовыми веществами / Е.С.Федорова, Н.С. Кудряшева //. Изв. Вузов. Физика, 2006. Т.49, №3. С. 172-174.

66. Худсон Д. Статистика для физиков: Лекции по теории вероятностей и элементарной статистике / Д. Худсон // Перев. с англ. М.: Мир, 1967. 242 с.

67. Шигорин Д.Н. Электронновозбужденные состояния многоатомных молекул / Д.Н. Шигорин, Г.А. Валькова, Е.А. Гастилович // Наука, Москва, 1993.496с.

68. Эйдус Л.Х. Проблемы механизма радиационного и химического гормезиса / Л.Х. Эйдус, В.Л. Эйдус//Радиационная биология. Радиоэкология, 2001.-Т. 41, №5.- С. 627-630.

69. Эйдус Л.Х. Мембранный механизм биологического действия малых доз. Новый взгляд на проблему / Л.Х. Эйдус // М.: ООО «Типография ФНПР», 2001. 82с.

70. Ansoborlo E. Development of a database: DACTARI for a radiotoxic element ranking methodology / E. Ansoborlo, C. Santucci, J.P. Grouiller// Radiation Protection Dosimetry, 2007. V. 127. N 1-4. - P. 526-530.

71. Barah M. The use of luminous bacteria for determination of phagdcytoses / M. Barah, S. Ulitzur, D. Merzbach// Immunol. Meth, 1983. V.64. -P. 353-363.

72. Barros M.P. Bioluminescence as a possible auxiliary oxygen detoxifying mechanism in elaterid larvae / M.P. Barros, E.J. Bechara // Free Radical in Biol. Med. 1998. V. 24, N 5. - P. 767-777.

73. Boothman D.A. Molecular analyses of adaptive survival responses (ASRs): role of ASRs in radiotherapy / D.A. Boothman, E. Odegaard, C.R. Yang // Hum. Exp. Toxicol., 1998. V. 17, N 8. - P. 448-453.

74. Bolsunovsky A. Artificail radionuclides in aquatic plants of the Yenisei River in the area affected by effluents of a Russian plutonium complex / A. Bolsunovsky // Aquatic Ecology., 2004. V.38. - P.57-62.

75. Bulich A.A Use of the luminescent bacterial system for the rapid assessment of aquatic toxicity / A.A. Bulich, D.Z. Isenberg // Instrum. Soc. Am. Tranc., 1981.-V.20,N1.-P. 29-33.

76. Calabrese E.J. Hormesis: A highly generalizable and reproducible phenomenon with important implications for risk assessment / E.J. Calabrese, L.A. Baldwin, C.D. Holland // Risk Anal., 1999. V. 19, N 2. P. 261-281.

77. Cali J.J. Bioluminescent assays for ADMET / J.J. Cali, A. Niles, M.P. Valley, M.A. O'Brien, T.L. Riss, J. Shultz // Expert Opinion On Drug Metabolism & Toxicology., 2008. V. 4, N 1.- P. 103-120.

78. Choppin G. R. Comparison of two models for metal-humic interactions / G. R. Choppin, N. Labonne-Wall //Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, 1997. V. 221, N 1. - P. 67-80.

79. Clemens S. Toxic metal accumulation, responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants / S.Clemens // Biochimie, 2006. V.88, N11.-P.1707-1719.

80. Esimbekova E.N. Bioluminescent method non-specific endotoxicosis in therapy / E.N. Esimbekova, V.A. Kratasyuk, V.V. Abakumova // Luminescence, 1999.-N 14.-P. 197-198.

81. Esimbekova E.N. Disk-shaped immobilized multicomponent reagent for bioluminescent analyses: Correlation between activity and composition / E.N. Esimbekova, V.A. Kratasyuk, I.G. Torgashina // Enzyme And Microbial Technology, 2007- V. 40, N 2. P. 343-346.

82. Feinendegen L.E. Cellular signal adaptation with damage control at low doses versus the predominance of DNA damage at high doses / L.E. Feinendegen, V.P. Bond, C.A. Sondhaus // R. Acad. Sci. Ill, 1999. V. 322, N 2-3. - P. 245251.

83. McCapra F. Chemical generation of excited states: The basis of chemiluminescence and bioluminescence / F. McCapra // Bioluminescence And Chemiluminescence, 2000. V. 305. - P. 3-47.

84. Hastings J.W. Bioluminescence / J.W. Hastings // In Cell Physiology. 3rd Edition. Academic Press, New York., 2001. P. 1115-1131

85. Holmberg K. Chromosomal instability in human lymphocytes after low dose rate irradiation and delayed mutagen stimulation / K.Holmberg, A. E. Mejer, M. Harms-Rindahl // Int. J. Radiat. Biol., 1998. -V. 73, N 1. P. 21-34.

86. Girotti S. Monitoring of environmental pollutants by bioluminescent bacteria / S. Girotti, E. N. Ferri, M. G. Fumo, E. Maiolini // Anal.Chim.Acta, 2008. V. 608, N 1.-P. 2-29.

87. Gil G. A biosensor for the detection of gas toxicity using a recombinant bioluminescent bacterium / G.C. Gil, R.J. Mitchell, S.T. Chang, M.B. Gu // Biosens. Bioelectron, 2000. N 15. - P. 23-30.

88. Joiner M.C. Adaptive response and induced resistance / M.C. Joiner, P. Lambin, B. Marples // C. R. Acad. Sci. Ill, 1999. V. 322, N 2-3. - P. 167-175.

89. Kim C.S. Low-dose radiation stimulates the proliferation of normal human lung fibroblasts via a transient activation of Raf and Akt / C.S. Kim, J.K. Kim, S.Y. Nam // Molecules And Cells, 2007. V. 24, N 3. - P. 424-430.

90. Kratasyuk V.A. Principle of luciferase biotesting. / V.A. Kratasyuk // In: Proceeding of the First International School "Biological Luminescence". -Singapore, 1990. World Scientific Publishing Co., 1990. - P. 550-558.

91. Kudryasheva N.S. Development of the bioluminescent bioindicators for analysis of environmental pollution / N.S. Kudryasheva, V.A, Kratasyuk E.N. Esimbekova, E.V. Vetrova// Field Analytical Chemistry and Technology, 1998. -N 2. P. 277-280.

92. N. S. Kudryasheva, Bioluminescence and exogenous compounds.Physico-chemical basis for bioluminescent assay (Review) / N. S. Kudryasheva // J. Photochem.Photobiol., 2006. V. 83, N 1. - P.77-86.

93. Kudryasheva N. S. Nonspecific effects of exogenous compounds onbacterial bioluminescent enzymes: Fluorescence study (Review) /N. S. Kudryasheva // Curr.Enzyme. Inhibition., 2006. V. 4, N 1. - P.363-372

94. Marples В., Lambin P., Skov K.A. et al. Low dose hyper radiosensitivity and increased radioresistance in mammalian cells // Int. J. Radiat. Biol., 1997. V. 71, N6.-P. 721-735.

95. Min J. Gamma-radiation dose-rate effects on DNA damage and toxicity in bacterial cells / J. Min', C. W. Lee, M. B. Gu // Radiation and Environmental Biophysics, 2003.- V.42,N3.-P. 189-192.

96. Mossman K.L., Ledesma L.M. Radiation exposure and adaptive processes // BELLE Newsletter, 1999. V. 7, N 3. - P. 16-19.

97. Morgan W.F., Corcoran J., Hartmann A. et al. DNA double-strand breaks, chromosomal rearrangements, and genomic instability // Mutat. Res, 1998. V. 404, N 1-2.-P. 125-128.

98. Nagasawa H., Little J.B. Unexpected sensitivity to the induction of mutations by very low doses of alpha-particle radiation: evidence for a bystander effect // Radiat. Res., 1999. V. 152, N5. - P. 552-557.

99. Naveh M. A new rapid and sensitive bioluminescence assay for antibiotics that inhibit protein synthesis / M. Naveh, S. Ulitzur// J. Appl.Bacterid., 1984. V.56, N3. - P. 457-463.

100. Parsons P.A. Hormesis: an adaptive expectation with emphasis on ionizing radiation / P.A. Parsons // J. Appl. Toxicol., 2000. V. 20, N 2. - P. 103112.

101. Persaud R. Demonstration of a radiation-induced bystander effect for low dose low LET beta-particles IR. Persaud, H. Zhou, T. Hei // Radiation and Environmental Biophysics, 2007. V. 46, N4. - P. 395-400.

102. Pohl-Ruling J. Effect of low dose acute X-irradiation on the frequencies of chromosomal aberrations in peripheral lymphocytes in vitro / J. Pohl-Ruling, P. Fischer, O. Haas //Mutat Res, 1983. V. 100, N2. - P. 71-82.

103. Price A. The repair of ionising radiation-induced damage to DNA / A. Price // Semin. Cancer. Biol., 1993. V. 4, N2. - P. 61-71.

104. Puget К. Studies in bioluminescence. Bacterial NADH: FMN -oxidoreductase / K. Puget, A.M. Michelson, S. Adrameas // Anal. Biochem., 1987. V.79. - P. 447-456.

105. Ryan L.A. Radiation-induced adaptive response in fish cell lines / L.A.Ryan, C.B.Seymour, A. O'Neill-Mehlenbacher // Journal of Environmental Radioactivity, 2008. V. 99, N4. - P. 739-747.

106. Reis J.L.R. Toxicity evaluation of the process effluent streams of a petrochemical industry / J.L.R. Reis, M. Dezotti, G.L. Sant'Anna // Env.Tech., 2007. V. 28, N2. - P. 147-155.

107. Rees J.F. The origins of marine bioluminescence: Turning oxygen defence mechanisms into deep-sea communication tools / J.F. Rees, B. De Wergifosse, O. Noiset, M. Dubuisson, B. Janssens, E.M. Thompson. //J. Exp. Biol., 1998.-V. 201, N8. P. 1211-1221.

108. Roda A. Biotechnological application of bioluminescence and chemiluminescence / A. Roda P. Pasini, M. Mirasoni, E. Michchelini, M. Guardigli // Trends Biotechnol., 2004. V. 22, N4. - P. 295-303.

109. Richardson M. Ecotoxicity monitoring use of Vibrio Fischeri / M. Richardson // Arh.Hig.Rada.Toksikol., 1996. V.47, N4. - P. 389-396.

110. Ruiz M.J. Toxicity assessment of pesticides using the microtox test: application to environmental samples / M.J. Ruiz, L. Lopez-Jaramillo, M.J. Redonto, G. Font // Bull.Environ.Contam.Toxicol, 1997. V.59, N4. - P. 619-625.

111. Serat W.F. Evaluation of biological effects of air pollutants by use of luminescent bacteria / W.F. Serat, F.E. Budenger // J. Bacterid., 1965. V.90, N3. -P. 832-833.

112. Serat W.F. Toxicity evaluation of air pollutants by use of luminescent bacteria / W.F. Serat, F.E. Budenger // Atmospher. Environ., 1967. V.l. - P. 2132.

113. Sigel A Iron Transport and Storage in Microorganisms / A.Sigel, H.Sigel (Eds.) // Plants, and. Animals. New York, 1998. -VI. 35. P. 824

114. Stom D.I. Bioluminescent method in studying the complecs effect of sewage components / D.I. Stom, T.A. Gill, A.E. Balayn, O.I. Shahova // Arch.Environ.Toxicol., 1992. V.22. - P. 202-203.

115. Tchan J.T. A new rapid specific bioassay method for photosynthesis inhibiting herbicides / J.T. Tchan, I.E. Roseby, G.R. Funnel // Soil Biol. Biochem., 1975. V.7. - P. 39-44.

116. Yordan A.Z. Toxicant detector / A.Z. Yordan, E.R. Schnauss, E.H. Sie, A. Thanos // Pat. USA, 1968 -N 3370175.

117. Ulitzur S. H-NS Protein Represses Transcription of the lux Systems of Vibrio fischeri and Other Luminous Bacteria Cloned into Escherichia coli / S. Ulitzur, A. Matin, C. Fraley, E. Meighen // Curr. Microbiol., 1997. V. 35. - P. 336-342.

118. Ulitzur S. A new sensitive and simple bioluminescence test for mutagenic compounds / S. Ulitzur, I. Weiser, S. Yannai // Mutant Res., 1980. -V.74, N2. P. 113-124.

119. Ulitzur S. Factors affecting the cellular expression of bacterial luciferase/ S. Ulitzur, A. Reinhertz, J.W. Hastings // Arch. Microbiol., 1981. V. 129. - P.67-71.

120. Ulitzur S. Determination of antibiotic activities with the aid of luminous bacteria / S. Ulitzur // Methods Enzymol., 1986.- V. 133. P. 275-284.

121. Vlasova I.I. Determination of antibiotics using luminescent Escherichia coli and blood serum / I.I. Vlasova, T.V. Asrieli, E.M. Gavrilova, V.S. Danilov // Appl. Biochem.&Microbiol., 2007. V.43. - P.422-428.

122. Vetrova E. A bioluminescent signal system: detection of chemical toxicants in water / E. Vetrova, E. Esimbekova, N. Remmel, S. Kotova, N. Beloskov, V. Kratasyuk, I. Gitelson // Luminescence, 2007. V.22. - 206-214.

123. Wu L.J. Targeted cytoplasmic irradiation with alpha particles induces mutations in mammalian cells / L.J. Wu, G. Randers-Person, A. Xu // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1999. V. 96, N9. - P. 4959-4962.

124. Wolf S. The adaptive response in radiobiology: evolving insights and implications // Environ. Health. Perspect., 1998. V. 106, N1. - P. 277-283.

125. Wright E.G. Radiation-induced genomic instability in haemopoietic cells / E.G Wright // Int. J. Radiat. Biol., 1998. V.74, N 6. - P. 681-687.

126. Weinstein J. Humic acids reduce the bioaccumulation and photoinduced toxicity of fluoranthene to fish/ J. Weinstein // Oris Environ. Toxic. Chem., 1999. -N18.-P. 2087-2094.

127. Zvara I. determination of very-low levels of radioactivity (technical report) /1. Zvara, P. Povinec, I. Sykora // Pure and applied chemistry, 1994. -V.66,N12 - P.2537-2586.1. Электронные источники:

128. Высокопроизводительный скрининг образцов, содержащих альфа и бета -излучающие радионуклиды: обзор методов. Packard Ind.,CPR-000047 Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.canberra.ru/html/literature/alphabeta.pdf

129. Государственное унитарное предприятие объединенный эколого-технологический и научно-исследовательский центр по обезвреживанию

130. РАО и охране окружающей средю-(ГУП МосНПО «Радон»). Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.radon.ru/cipt/radiochemistry/default.htm

131. Российский сайт ядерного нераспространения. Электронный ресурс. Режим доступа: www.NuclearNo.ru

132. Сцинтилляционные счетчики. Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.oval.ru/enc/69897.html

133. Сцинтилляционный метод (Характеристики сцинтилляционного детектора и его использование в качестве гамма спектрометра). Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.npi.msu.ru/structinc/lib/books/sovrmet/Labl .pdf

134. Сцинтилляционный счётчик Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.booksite.rU/fulltext/l/001/008/108/076.htm

135. Счетчики на основе жидких сцинтилляторов модельного ряда 'Tri-Carb' компании PerkinElmer(CLUA). Электронный ресурс. Режим доступа: http://spt.by/content/view/63/39/

136. Методы регистрации ядерных излучений. Визуальный метод сцинтилляций. Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.sduto.ni/87/l 04/2399/index 1.1 .html#Toc52005022