Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Алифатические альдегиды и амины в реакции бактериальной люциферазы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Алифатические альдегиды и амины в реакции бактериальной люциферазы"

й (3 о * за

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.152.199.2:577.151.45

СОБОЛЕВ АЛЕКСАНДР ЮРЬЕВИЧ

АЛИФАТИЧЕСКИЕ АЛЬДЕГИДЫ И АМИНЫ В РЕАКЦИИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЛКВДФЕРАЗЫ

(03.00.04 - биохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1992

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета им.М.В.Ломоносова.

Научный руководитель - доктор биологических наук

В.С.Данилов.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор Н.К.Наградова

доктор биологических наук Ф. И. Атауллаханов

Ведущее учреждение - Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН.

Защита состоится

30

1992 г. в 15— на

заседании Специализированного Совета Д.053.05.32 при Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу: П9899 Москва, Ленинские Горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

(Ю.Н.Лейкш

• • ;• - I -

"J . | ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

' :.'.-;':!.'.'.'Лк1у1льность проблемы. Расшифровка механизма бактериальной биолюминесценции представляет большой научный интерес как в связи с необычайной эффективностью трансформации люциферазой химической энергии п световую, так и в связи с тем, что фермент представляет собой идеальную модель для исследования свойств монооксигеназ.

В настоящее время отсутствует единай точка зрения на механизм катализируемой бактериальной люциферазой реакции (Данилов, Егоров, 1990; Ohisla et al., 1987; Hastings et al., 1985Г Lee et ai., 1990). Связано это с нерешенностью целого ряда узловых моментов, в частности, вопроса о механизма взаимодействия фермента с алифатическими лигвндами - субстратами и ингибиторами.

В основе многих концепций функционирования люциферазы лежит предположение о том, что в условиях инициированной ишн2 реакции фермент способен совершать только один оборот. При этом кинетика биолюминесценции может быть описана простой экспоненциальной зависимостью (Hastings, Gibson, 1963). Обоснованность подобных выводов, однако, вызывает серьезные сомнения.

Большинство исследователей либо вообще не рассматривает механизм связывания альдегидного субстрата в активном центре фермента, либо, вслед за Гастингсом и соавторами (Hastings et al., 1985), полагает, что связывание альдегида происходит путем образования 4а-пероксиполуацеталя с находящимся в комплексе с люциферазой 4а-гидропероксифлавином. В рамках последней модели объяснить конкурентный до отношению к альдегиду характер ингибирования люцифоразной реакции целым рядом гидрофобных соединений (Измайлов и др., 1981; Adey et al., 1976; Holzman, Baldwin, 1981; Yoehida, Nakamura, 1974) H8 представляется возможным. Таким образом, получение достоверных сведений о механизме взаимодействия люциферазы с различными алифатическими

лигандами является несомненно актуальным.

В настоящее время биолшинесцентные мотода находят широкое применение в анализе различных биологически активных соединений, ферментов и метаболитов, что обусловлено их высокой чувствительностью, експрессностыо, простотой. В этой связи актуальной представляется задача расширения возможностей биолшинесцонтного метода в анализе различных ферментов, особенно имемцих клинико-диагностическое значение, как, например, моноаминооксидаза (МАО).

Цели и задачи исследования. Цель» настоящей работы явилось получение новых данных о механизме взаимодействия бактериальной люциферазы с алифатическими лигандами - субстратами (альдегидами) и ингибиторами (аминами), а'также разработка биолшинесцент-ного метода определения активности МАО, способной катализировать окисление длинноцепочечных аминов в соответствующие альдегиды. В процессе работы в наши задачи входило:

1). исследование кинетики биолюминесценции в инициированной фотовосстановленным флавином реакции бактериальной люциферазы о различными алифатическими альдегидами;

2). проведение ингибиторного анализа люциферазной реакции с использованием алифатических длинноцепочечных первичных аминов;

3). анализ функциональных параметров сопряженной системы МАО - люцифораза;

4). создание на основе бактериальной люциферазы высокочувствительной аналитической системы для определения активности МАО в различных биологических образцах.

Научная новизна роботы. Впервые показано, что в стандартных условиях с различными альдегидами в качестве субстрата кинетика биолюминесценции в реакции с фотовосстановлешшм' флавином не описывается простой вкспонентой. Сделан вывод о том, что в

условиях инициированной ппга2 биолюминесцентной реакции фермент способен совершать каталитический цикл многократно, утилизируя в качестве субстрата различные формы флавина.

Обнаружен новый класс высокоэффективных ингибиторов явд!феразы (алифатические первичные аминн) с конкурентным по отношению к альдегиду и неконкурентным по отношении к флавину механизмом действия. Приведены доказательства в пользу возможного участия гидрофобных и электростатических взаимодействия в образовании нековэлентного кошлекса фермента с алифатическими лигандачи.

Проведен кинетический анализ сопряяэнной системы МАО -люцифераза при отличном от стандартного соотношении активностей анализ!груемого п вспомогательного ферментов, и показана принципиальная возможность использования одного из параметров люминесцентной реакции (начальная скорость нарастания биолюминесценции) для определения активности анализируемого ^рмонта в условиях, когда активность вспомогательного фермента является скоростьлимитирупцим фактором.

Практическое значение работы. Практяческуа значимость голеют сфордулированные в работе новые принципы' организации биос8нсоров на основе лвцифераз как бактериального, так и иного происхождения. ' Использование бйолкминесцентных систем в количествах, лимитирующих скорость цепочки сопряяенных реакций, позволяет значительно снизить стоимость анализа. Результаты проведенного анализа сопряженной системы на основе бактериальной ляциферазы свидетельствуют о необходимости учета особенностей фермента как мснооксигеназы.

Большое практическое значение ииеет разработанный на основе ЛЕЦифервзы V.hsrveyl способ определения активности МАО, превосходящий по чувствительности наиболее эффективные

радиохимические методы и выгодно отличающийся от них экологической безопасностью, простотой и экспрессностью.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены на 18 научной конференции молодых ученых биологического факультета МГУ "Проблемы современной биологии" (Москва, 1987), v Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1987), Iii Всесоюзной научной конференции "Проблемы экологии Прибайкалья" (Иркутск, 1988), IV Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988), V Международном симпозиума по биолюминесценции и хемилюминесценции (Флоренция, Италия, 1988), Всесоюзной конференции "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, 1990), VII Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Москва, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано, 13 работ, включая I авторское,свидетельство.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, еыводов и списка литераторы, содержащего наименования. Работа изложена на 7e?Q страницах машинописного текста, иллюстрирована

м

рисунками и у) таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Культивирование люминесцентных бактерий. Люминесцентные бактерии Vibrio harveyl, штамм N392.выращивали в жидкой среде в соответствии с описанной ранее методикой (Баранова и др,, 1980).

Получение очищенного препарата люциферазы. Очистку формент-еого препарата проводили по методу (Шумихин и др., 1980) с некоторыми модификациями. Процедура очистки , вклклала получение Сесклеточного экстракта, фракционирование сульфатом аммония.

ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-Toyopearl 650М (Toyo Soda, Япония) и гель-фильтрацию на uitrogei аоа-44 (lkb,* Швеция). Полученный препарат фермента высаливали сульфатом аммония.

В качестве критерия гомогенности препарата (Hastings et al., 1978) использовали наличие полос, по молекулярной массе соответствующих аир субъединицам люциферазы (приблизительно 40 и 37 кДа соответственно), при электрофорезе в присутствии додзцилсульфата натрия (Laenrali, 1970). Оцененная таким образом чистота препарата составляла не менее 95%.

В некоторых экспериментах использовали препарат люциферазы, дополнительно пропущенный через колонку с АН-агарозой, что позволяло значительно снизить собственное свечение люциферазы в присутствии эндогенного альдегидного фактора.

Аппаратура для регистрации биолюминесценции. Измерение биолюминесценции проводили на автоматическом люминомэтре (1251, LKB-Wailao, Финляндия) или на люминометрической установке, состоящей из стандартных блоков.

Регистрация и анализ кинетики биолюминесценции в реакции с фотовосстановленным флавином. Кинетику- затухания биолюминесценции измеряли при 22°С в реакции с фотовосстановленным флавином (Hastings et al., 1978). Среда измерения (0,5 мл) содержала 0,1 М калий-фосфатный буфер, рН 7,1, люциферазу V.harveyl (25 мкг/мл), 20 мкл спиртового раствора альдегида. Реакцию инициировали добавкой 1,25 мл 50 мкМ раствора фотовосстановлэпного флавина в 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 7,1, содераавшеи 3,3 мМ ЭДГА.

Для кавдой. концентрации альдегида проводили компьютерную обработку одновременно минимум трех кривых после их предварительного нормирования относительно максимальной интенсивности биолшинесценции iQ, которую принимали за 100%.

Проведение ингибиторного анализа с алифатическими аминами. Кинетический анализ действия алифатических аминов на люциферазу V.harveyl проводили в NADH-зависимой системе (Hastings et al., 1978). Среда измерения (конечный объем 1,0 мл) содержала 0,1 М калий-фосфатный буфер, pH 7,4, I мМ НАШ, 7,5 мкг/мл ферментного препарата и насыщающие концентрации одного из субстратов люциферазы (альдегида или флавина).

Определение активности МАО по накоплению аммиака. Содержание аммиака в депротошшзировашшх пробах после его изотермической отгонки (Киркель и др., 1983) определяли с фенол-гитохлоритным реактивом (Jaenioke, 1974)

Другие методы. Содержание белка з препаратах люминесцентной системы определяли методом Брэдфорд (Bradford, 1976), а в прочих биологических препаратах - с биуретовым реактивом (Qornall et olw, 1949). Митохондрии из печени крысы выделяли методом дифференциального центрифугирования (Johnson, Lardy, 1967). Гомогенат мозга крысы (10Ж), получали в 0,32 М сахарозе, содержавшей 0,1Ж Твин-40.

Результаты и обсуждение Кинетика биолюминесценции в реакции бактериальной люциферазы с различными алифатическими альдегидами. Детальный анализ кинетики биолюминесценции в реакции с фотовосстановленным флавином, проведенный в широком диапазоне концентраций различных альдегидов, в частности тетрадеканаля (рис. I), показал, что она не описывается простым экспоненциальным законом.

Проведенная компьютерная статистическая обработка результатов позволила с высоким коэффициентом корреляции аппроксимировать кинетику затухания биолюминесцекции' в реакции с тетрадеканалем биэкспоненциалыюй ■ зависимостью:

Ю01

?(t). %

10 15

Время, сек

Рис. I. Кинетика 38-тухания биолюминесценции в реакции бактериальной лю-циферази с фотовосстанов-ленным флавином при различных концентрациях тет-радеканаля (в М): О (I), 5,4-Ю"9 (2), 2,7-1СГ8

(3),

2,7-10"

6,4'Ю"

(4).

(5), 5,4-10"

(6), 5,4-10"° (7).

Рис. 2. Зависимость констант скорости затухания биолюминесценции для начальной (I) и конечной (2) фаз и вкладов начальной (3) и конечной (4) фаз в максимальную интенсив-05 нссть биолюминесценции от концентрации тетрадекана-ля.

____h« I I III1UI I ....... f > muJ

-10 -9 -8 -7 -6 "5

10 10 10 ю 10

[Тотродексналь], М

IС *) = ц .ехр(-)е1г) + 12.ехр(-й2г), .где 1и) - текущее значение интенсивности биолюминесценции, выраженное в % от 10; ^ и 12 - вклады соответственно начальной и коночной экспонент в максимальную интенсивность свечения, также выраженные в %; и й2 - константы скорости первого порядка соответственно для начальной и конечной фаз.

Еще одним принципиальным отличием от кинетики первого порядка является наличие зависимости параметров процесса от концентрации альдегида (рис. 2). Увеличение концентрации тетрадека-

ТП

наля от Б "10 до б "10 М сопровождается значительным возрастанием величин констант скорости затухания биолюминесценции для обеих фаз, а также вклада начальной фазы в общую светосумму реакции (от 2,3 до 76,6%).

При использовании в качестве субстрата ЛЕЦифэразы тридока-наля бифазность проявляется столь же ярко, однако по сравнению с реакцией с тетрадеканалем имеется существенное отличие: на заключительных этапах затухание свечения протекает с константой скорости, не зависящей от концентрации альдегида. Остальные параметры биолюминесцентной реакции при увеличении концентрации тридеканаля от 1,5'10_а М до 1,5 'Ю-5 М меняются весьма значительно: возрастает вклад начальной фазы в максимальную интенсивность (от 11,8 до 63%) и соответствующая ей константа скорости (от 0,175 до 0,343 сек-*), уменьшается (от 89,4 до 38,5%) вклад конечной экспоненты в величину 10- Вклад начальной фазы в общую светосумму хотя и возрастает, однако, в отличие от реакции с тетрадеканалем, остается небольшим (менее .12%).

Кинетика затухания биолюминесценции в реакции с прочими исследованными альдегидами (деканалем и нснаналем) также следует биэкспоненциальному закону, причем зависимость параметров от концентрации носит для каждого альдегида специфический характер.

Бифазность процесса, однако, выражена не столь отчетливо, как в реакции с тетрадеканалем или тридеканалем.

Бифазный характер кинетики затухания биолюминесценции не меняется при варьировании в широком диапазоне концентрации лпцифвразн, причем все параметры процесса при этом остаются практически неизменными (табл. I). Это согласуется с результатами работы (Mathenon, Lee, 1983), представленными авторами только для заключительной фазы биолвминебцентного процесса.

Таблица I.

Зависимость параметров кинетики затухания биолюминесценции от концентрации люциферазы.

Концентрация люциферазы, мкг/мл 10. усл.ед. % ч- % сек-1 * сек"*

2,72-Ю"3 7,1 101,9 3,7 1,19 не опр.

2,72'Ю"2 76,8 102,3 2,5 1,-16 0,133

2,72'Ю-1 887 102,2 3,1 1,15 0,132

2,72 I08I0 92,6 ' 1,8 1,03 0,133

27,2 II6625 92,8 1.6 1,12 0,119

Мы полагаем, что объяснить зависимость параметров наблюдаемой сложной многофазной кинетики затухания биолюминесценции от концентрации альдегида можно лишь исходя из предположения о том, что лвцифераза не просто выступает в роли стехиометрического .реактанта, но совершает каталитические обороты многократно. Данное предположение требует решения вопроса, какие яе формы фдавина лячдферазо использует в качества субстрата на различных этапах реакции. По наиему мнении, начальная фаза безусловно связано с утилизацией полностью

восстановленного флавина.

Конечная фаза затухания биолюминесценции протекает на фоне исчезаще низких концентраций FMNH2. В связи с этим необходимо постулировать возможность утилизации люциферазой в качестве субстрата каких-либо форм флавина, отличных от полностью восстановленной. В пользу данного предположения говорит способность люциферазы катализировать люминесцентную реакцию с участием нейтрального семихинона флавина (Kurfuret et al., 1982, 1983) или продуктов неферментативного окисления FMNH2 - FUN и HgOg (Haetlnga et al., 1979; Watanabe, HastInga, 1987; Watanabe, Nakamura, 1976).

Взаимодействие бактериальной люциферазы с алифатическими аминами. Изучение механизма действия алифатических аминов на

бактериальную люциферазу проводили в полной люминесцентной системе, содержащей МБ(р)н:рми-оксидоредуктазу и собственно люциферазу. Дециламин при концентрациях вплоть до 600 мкМ практически не влияет на активйость МАШ:РМ1Ыжсидоредуктазы.

В плане оптимизации условий анализа активности МАО интерес представлял выбор длины цепи амина, в связи с чем наряду с дециламином были также исследованы И другие, в частности додециламин. Ингибиторный анализ проводили -в парах децилвмин-деканаль и додециламин-додеканаль, т.к. подобный подход позволяет более адекватно моделировать реальную ситуацию в сопряженной системе МАО - люцифераза.

Установлено, что по отношению к альдегиду ингибирование люциферазной реакции и дециламином (рис. 3), и додециламином является конкурентным с к(=0,Б.и 0,2 мкМ соответственно. По отношению к флавину ингибирование биолюминесценции етыш аминами носит неконкурентный характер, к{=1,8 и 0,3 мкМ соответственно. Значения констант ингибирования свидетельствуют о более высоком

1/1. усл. od.

80 (100 1/[Двканаль], мМ

120

Рис. 3. График Лайну-ивера-Барка для ингиОиро-вания ИАБН-зависимой биолюминесценции дециламином по отношению к деканалю. Концентрация дециламина (в мкМ): О (I), 0,5 (2), I (3). 1,6 (4). 2 (Б).

dl/dt, усл. ed./мин(1)

3000

2600

2000

1600

1000

500

dI/dt,

УСА. вЭ./мин(2) 160

100

01 2345678 АктиВмость МАО б пробе, мкЕ

Рис. 4. Зависимость начальной скорости нарастания биолшинесценции от активности МАО в пробе при различных концентрациях люциферазы: 240 »кг/мл (I) и 7,2 мкг/мл (2).

сродстве фермента к более гидрофобному додециламину. Это согласуется с опубликованными ранео данными об увеличении сродства фермента к субстратам - альдегидам (Spudloh, 1963) и ингибиторам - жирным кислотам (Nakamura, 1982; Yoehida, Nakamura, 1974) с ростом длины углеродной цепи. Таким образом, логично предположить, что' начальные этапы взаимодействия фермента с алифатическими лигандами протекают с участием гидрофобных сил. Схемой функционирования бактериальной люциферазы Гастингса и его коллег это не учитывается.

Конкурентный по отношению к альдегиду и неконкурентный по отношению к флавину характер ингибирования -люциферазы алифатическими аминами подтверждает вывод о неупорядоченном механизме взаимодействия субстратов с люциферазой и позволяет о определенностью утверждать, что связывание альдегида происходит в сайте, отличном от сайта связывания флавина.

Сравнение значений констант Михавлиса или ингибирования для

— A _7

ряда декан - деканаль - децющмин (3,7'Ю , 3*10 и 5*10 М соответственно) позволяет предположить, что' увеличение сродства фермента к лиганду в ряду обусловлено появлением в составе молекулы сначала несущего частичный положительный заряд карбонильного атома углерода, в затем и положительно заряженного при физиологических значениях рН атома азота. Таким образом, электростатические взаимодействия наряду с гидрофобными также, вероятно, вовлечены в связывание алифатических лигандов в альдегидсвязывающем центре люциферазы. В качестве наиболее вероятного участнике можно предположить SH-группу остатка а106-Суо люциферазы, по-видимому, играющего определенную роль в связывании альдегида (Baldwin et al., 19S9).

Результаты проведенного ингибиторного анализа позволили однозначно решить в пользу дециламина вопрос о выборе субстрата

МАО при определении ее активности биолюминэсцентным методом.

Особенности сопряженной ферментативной системы МАО - люци-фэраза. Анализ функциональных параметров сопряженной системы на основе КАБН-зависим'ой электронтранспортной цепи (люцифераза + НАШгРШН-оксидоредуктаза) проводили при различных соотношениях активностей (п) вспомогательного (люцифераза) и анализируемого (МАО) ферментов. Особый интерес представляло исследование возможности использования тех или иных параметров биолюминесценции для оценки активности МАО в отличных от стандартных условиях, когда скорость моноаминооксидазной реакции выше скорости люциферазной (п<1). Еще одна особенность подобной сопряженной системы заключается в том, что используемый в качестве субстрата МАО дециламин одновременно является ингибитором люциферазы.

Рассмотрим сопряжеш!ую систему:

МАО Лиц Ш12ИН2-► ЛСНО -► ШЗООН + Ьу + ...

При проведении анализа кинетики сопряженной системы МАО -НАШ-зависимая люминесцентная електронтранспортная цепь были сделаны следующие допущения:

1). Скорость моноаминооксидазной реакции постоянна, что достигается добавлением большого избытка субстратов.

2). Все реакции протекают необратимо.

3). Все субстраты люциферазы, кроме альдегида, имеются также в большом избытке.

4). Концентрация дециламина существенно превышает величину К( для люциферазной реакции. Измене!шем его концентрации мокно пренебречь. Вместо истинного значения Км по альдегиду для люциферазы с учетом конкурентного ингибирования дециламшгом

используется кажущееся значение.

Б). Скорость лнциферазной реакции подчиняется уравнению Михаэли-са-Ментен. Поскольку квантовый выход люциферазной реакции ч по альдегиду отличен от 1, уравнение Михаэлиса относительно продукта - кванта света можно записать следующим образом:

1

'тах-1*0Н°1 К*0Ж + [ИСНО] (I).

<ШУ

где I- =ч.У - интенсивность биолшинесценции, 1та1=Ч-'тах -максимальная интенсивность Снолюмине сценции.

Изменение концентрации альдегида во времени описывается уравнением (2):

й[КСЯО)

V, - V, (2).

« 1 2

Подставляя уравнение Мяхоэлиса-Ментен (I) с учетом квантового выхода ч в уравнение (2), получаем дифференциальное уравнение (3):

ЙЦйсно) 1 1пшз:Л1'СН0)

(3).

<П 1 + !ИСНО]

Полагая пределы интегрирования для * и [ЛОНО] от 0 до

текущего значения, находим общее решение (4) дифференциального уравнения:

1 гкаж

С^Н-их «V ^•1шахМНСН01+У1 •"5"

Е™ -ы -ч-ш« • ч

t=---Лп-:- (4)

112 ках

~ ~Лтах ч,1пах) У1,КМ

Выразив в уравнении Михаалиса-Ментен (I).[нсно] через I и подставив ■ его в уравнение (4). получаем уравнение' (5), связывающее кинетические параметры компонентов сопряженной системы со временем г:

•--«Г'«,-я/а-

Анализ функциональных параметров сопряженной системы (при п<1) выявил существенные расхождения в их экспериментальных и теоретических значениях. Это может быть обусловлено особенностями люциферазы как моноокскгеназы, а также наличием белок-белковых взаимодействий между компонентами сопряженной системы. Вместе с тем, в качественном отношении поведение в зависимости от активности МАО в пробе такого функционального параметра системы, как скорость нарастания биолюминесценции, предсказанное на основании использованной модели, нашло впоследствии экспериментальное подтверждение.

Продифференцировав уравнение (б) по времени и перегруппировав члены, получаем уравнение (6):

111 1та*>2-<У1

(6).

<1 t I___.К£'

т-каж

таг

Рассмотрим случай, когда активность люциферазы в пробе по сравнению с активностью МАО мала. Для времен, когда стационарная концентрация альдегида остается существенно ниже К^вж для люциферазы, справедливо соотношение (7):

5Л « 5Лшах < <7>-

Тогда уравнение (6) может быть упрощено до следующего (0):

(II *тах у ^д ^

<й ~ ф* '

Таким образом, скорость нарастания биолюминесценции при фиксированной активности люциферазы в пробе при п<1 будет прямо

пропорционально зависеть от скорости моноеминооксидазной реакции.

К тому же вираканта (8) можно прийти и в том случае, когда активность люциферазы выше вктивности МАО в пробе (п>1), как в нормальной сопряженной системе, однако верным оно будет только для начальной скорости нарастания биолюминесценции. Исходя из совсем иных допущений, к подобому г® выводу пришли и авторы работы (ВгоИп вt аХ., 1989).

Действительно, в модельной системе, содержащей очищенную МАО из печени свиньи п препарат люциферазы V.Тюгьеу1 с низким эндогенным свечением, при двух различных концентрациях люциферазы, соответствующих условиям п>1 и п<1, начальная скорость нарастания биолюминесценции была прямо пропорциональна вктивности МАО (рис. 4).

Биолпминесцентный метод определения активности МАО. Принцип биолююгаесцентвого метода измерения активности МАО представлен на схеме. (ОР - }Ш>(Р)Н:ЛШ-оксидоредуктазв, Люц - бактериальная диолфэрааа).

МАО

Лщ

RCHgNHg -► RCHO

°2

hv

NAD(P)H--' PMNNa2S204

Особенности способов измерения активности люциферазы предполагают различные возможности в конструировании аналитической системы. Генерация таш2 может осуществляться как химическим способом с помощью дитионита натрия, так и с помощью NAD(Р)К:FKH-оксидоредуктазы.

Предварительная инкубация в течение 10 мин митохондрия мозга Сыка в качестве источника МАО с дециламином приводит к тему, что при последукадем внесении компонентов полной NAlH-зависимсй люминесцентной системы свечение во времени начинает нарастать и спустя 16-20 мин выходит на стационарный уровень. Интенсивность стационарного свечения линейно зависит от концентрации белка митохондрий мозга быка в диапазоне от I до 26 мкг/мл (рис. 6) и ыояет быть использована для оценки активности МАО в пробе. В случае тромбоцитов крови человека линейная зависимость интенсивности стационарного свечения от концентрации белка сохраняется в диапазоне от 10 до 260 мкг/мл, в случае более грубого препарата (гомогената печени крысы) - от 10 до 70 мкг/мл.

Результаты анализа кинетики сопряженной системы МАО -NADH-зависимая люминесцентная электронтранспортная цепь легли в основу биолюминесцонтного способа измерения активности МАО в непрерывном рояиме с использованием скоростьлимитирующих количеств лщиферазы. В системе, содержащей в качестве источника МАО различные биологические препараты, скорость нарастания биолюминесценции в широком диапазоне линейно связана с количеством препарата в пробе. Так, для гомогената мозга крысы этот диапазон составляет 20-120 мкг белка на мл, для митохондрий мозга быка - от 5 до 100 мкг белка на мл. Скорость нарастания биолюминесценции спустя 1-2 мин после начала, реакции выходит на постоянный уровень и остается на нем в течение продолжительного времени - 10-15 мин. Начальный латентный период моиет быть обусловлен наличием в составе препарата люциферазы эндогенного альдегидного фактора, определяющего пороговую чувствительность формепта к екзогегаюму альдегиду.

Плазма крови человека является одним из рутинных объектов

ISO

I, усл. ей.

Рис. Б. Зависимость интенсивности стационарного ИАШ-зависимого свечения от концентрации белка митохондрий мозга быка.

& 1о 16 го 2б зо [Бедок], мкг/мл

2600

2000 ■

1600

1000

600

усл. ed.

5 10 15

Плазма В пробо, мкл

Рис. 6. Зависимость интенсивности пшн2-зави-симой биолюминесценции от концентрации плазмы в пробе до и после инкубации в присутствии и отсутствии дециламина. Концентрация дециламина О (I) и 100 мкМ '(2,3). Время прединкубации О (2) и G0 мин (1,3).

при проведении различных клинико-диагностических исследований. Активность МАО в плазме низка, в связи с чем при определении активности был использован биолюминесцентный метод о химически восстановленным флавином, зарекомендовавший себя при анализе микроколичеств длинноцепочечных алифатических альдегидов (Сахаров, I98G; Maighen et al., 1982).

Инкубация плазмы в присутствии дециламина приводит к увеличению по сравнению с контролем интенсивности Ршга2~зависимого свечения при последующем инициировании биолюминесцентной реакции. В качестве контроля может быть использован уровень биолюминесценции в присутствии дециламина, наблюдаемый при инициировании реакции без предварительной инкубации, который во всем диапазоне концентраций плазмы в пробе (2-20 мкл) остается практически неизменным. Интенсивность Р1ШН2-зависимой биолюминесценции после 60-минутноЯ инкубации линейно зависит от количества плазмы в пробе (рис. 6). Увеличение времени инкубации от 10 до 60 мин сопровождается линейным возрастанием интенсивности Ушга2-зависимой биолюминесценции. Таким образом, в присутствии дециламина для широкого интервала времен инкубации плазмы (от 10 до 60 мин) и диапазона концентраций плазмы в пробе (от 2 до 20 мкл) интенсивность РШН2-завискмой биолюминесценции адекватно отражает накопление альдегида в ходе моноаминооксидазной реакции.

Разработанный биолюминесцентный метод был использован нами в ряде физиологических экспериментов для определения активности МАО в различных органах крыс. При изучении влияния хронической алкоголизации, а также иммунизации гетерологичнсй элкогольдегидрогеназой на активность МАО мозга измерения проводили тремя независимыми способам!: по накоплению аммиака, а также биолшинесцентным методом в NADH-зависимой системе в

непрерывном режиме (по dl/dt) и в пшн2-зввисимой системе. Сравнение в соответствии с критерием Стыодекта средних значений активности МАО в различных группах животных, измеренной независимо каждым из трех способов, показало, что ни в одном из случаев различия не являются статистически достоверными (сМЭ.05). Таким образом, исследованные экспериментальные состояния не сопровождаются изменениями активности МАО • мозга крыо в отношении окисления децилакина. Результаты, получедшые с помощью двух модификаций биолюминесцентного и стандартного методов определения активности МАО, полностью совпадают.

При исследовании влияния депренила (10 мг/кг) In vivo на активность МАО. мозга и печени крыс измерения проводили в NADH-зависимой сопряженной системе непрерывным методом и в иган2-зввисимой системе после предварительной инкубации. Результаты измерений показали, что после введения в хвостовую вену депренила остаточная активность МАО о дециламином в качестве субстрата как в митохондриях печени, так и в гомогенате мозга крысы составляет 25-30% от исходной. Полученные результаты можно объяснить с учетом того, что депронил является специфическим необратимым ингибитором Б-формы фермента. Поскольку обе формы фермента (А и Б) в мозге и печени представлены приблизительно поровну (GquireB, 1972), можно сделать вывод, что' МАО-Б при окислении децяламша обладает в 2-3 раза большей активностью, чем ЫАО-А.

i Каждая из разработанных модификаций биолюминесцентного метода анализа активности МАО шеет свое достоинства и недостатки. В. целом, биолкмшесцентннй метод отличается высокой чувствительностью, позволяет проводить определение активности в разнообразных биологических препаратах (плазме крови, тромбоцитах, гомогенатах и митохондриях мозга и печени), прост,

технологичен, быстр, безопасен в экологическом отношении. В физиологических экспериментах показана высокая вффэктивность использования биолюминесцентного метода анализа активности МАО ,.ч полная корреляция результатов, получаемых этим и стандартным методами.

ВЫВОДЫ 1

1. Исследование кинетики биолюминесценции в реакции лгядефе-разы V.harveyi с различными алифатическими альдегидами выявило, что затухание свечения нэ описывается простой экспоненциальной зависимостью, но с высоким коэффициентом корреляции может - быть аппроксимировано суммой двух экспонент.

2. Обнаружено, что параметры биэкспоненциального биолши-несцентного процесса зависят от концентрации альдегида, что свидетельствует о способности люциферазы многократно совершать каталитические обороты в условиях инициированной FE3ffl2 лгс.мнесцентной реакции. Обосновано предположение о способности фермента на различных стадиях реакции утилизировать в качестве субстрата формы флавина, отличные от полностью восстановленной.

3. Алифатические длинноцепочечные первичные амины являются эффективными ингибиторами люминесценции как In vivo, так и in vitro. Установлено, что связывание субстрата - альдегида и ингибитора - амина происходит в одном и том кв активном центре люциферазы. Высказано предположение об участии наряду с гидрофобными и электростатических сил в связывании алифатических лигандов в вльдвгвдсвязыввхэдем центре фермента.

4. Проведен кинетический анализ сопряженной системы МАО -люциферсза при различных соотношениях активностей анализируемого п вспомогательного ферментов. Разработан новый принцип организации биосенсоров на основе лвцифераз различного происхождения.

заключающийся в определении активности анализируемого фермента по начальной скорости нарастания биолюминесценции при использовании лпдаюсцентной системы в скоростьлимитирусцк количествах.

Б. На основе NADH-зависимой люминесцентной системы V.har-veyt разработан высокочувствительный, быстрый, простой, экологически безопасный биолшинесцентный метод определения моноамшооксидазкой активности, при создании которого использованы результаты проведенного анализа сопряженной системы МАО - люцифераза. Метод позволяет работать как в непрерывном, так и в дискретном режимах. Показана возмокность использования разработанного метода для анализа активности МАО в широком спектре биологических препаратов: плазме крови и тромбоцитах, гомогенатах и митохондриях печени п мозга.

G. Для определения активности МАО в представляющем наибольший клинико-диагностический интерес биологическом препарате -плазме крови рекомендовано использовать бколшпнесцентшй метод измерения с химичоски восстановленным флавииом. По чувствительности разработанный биолшинесцентный метод превосходит радиохимические и позволяет определять активность 0,2-0,5 мкЕ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. А.Ю.Соболев. Альдегидзависимая кинетика распада бактериальной биолшинесценции//Проблемы современной биологии: Тр. 18 науч конф. мол. ученых бкол. фак. МГУ, Москва, 133?.-К., 1Э87.-Ч.2, С.82-86.-Деп. в ВИНИТИ 14.09.87, KS653-B87.

2. A.D.Соболев. Особенности кинетики распада бактериальной биолюминесценции с различными альдегкдами//Биология клетки: Тр. V Всесоюз. межуниверситетской конф., Тбилиси, 1907 .-Тбилиси,

1987.-Ч.2.-С.€32-684,

3. А.Ю.Соболев, M. M. Маку ль. Использование бактериальной люциферазы для определения монсамшюоксидазной активности в биологических препаратах//Биосш;тез ферментов микроорганизмами: Тез. докл. IV Всессюз. конф., Ташкент, 1988.-Ташкент, 1988.-С. 137-138.

4. А.Ю.Соболев. Бактериальная люцифараза как детектор алифатических длишоцепочечных аминов/ЛТроблемы экологии •Прибайкалья: Тез. докл. III Всесоюз. науч. конф., Иркутск,

1988.-Иркутск, I988.-4.I.-С.100.

Б. А.Ю.Соболев, В.С.Данилов. Влияние дециламина на реакцию бактериальной люцкферазы//Биохимия.-1988.-Т.БЗ, N6.-С.912-917.

6. A.D.Ismailov, A.Yu.Bobolev, V.S.Danilov. Complex biolumineeoenoe deoay kinetioa in the in vitro reaotion of baoterial luoiferaae with different aliphatio aldéhydes : Abat. V Int. Syirp. on Bioluminesoenoe and Chemiluminesoenoe, Plorenoe, Italy, 19Ö8.//J.Biolumin.Ch0milumin.-1988.-V.2, И4.-Р.216.

7. А.Ю.Соболев, А.Д.Исмаилов, В.С.Данилов. Отклонение от кинетики первого порядка при затухании биолкминесценции в реакции бактериальной люциферазы с тетрадеканалем//Докл. АН СССР.-I989.-Т.305, N5.-С.12Б8-1261.

8. А.Ю.Соболев, А.Д.Исмаилов, В.С.Данилов. Кинетика биолюминесценции в реакции бактериальной люциферазы с различными алифатическими альдегидами/ЛЗиохимия.-1989.-Т.54,N12.-С.206k- 2066.

9. А.Ю.Соболев, В.З.Горкин, В.С.Данилов, М.М.Маиуль, Ю.А.Малков, Т.А.Москвитина, Л.Н.Овчинникова. Способ определения активности моноаташооксидазы: Авт.свид. Н1Б21761//0ткрытия, изобретения,- 1989.-N42.

10. А.Ю.Соболев, М.М.Мажуль, Ю.А.Малков, В.С.Данилов, В.З.Горкин. Т.А.Москвитина, Л.Н.Овчинникова. Использование

бактериальной' лвциферазы■ для определения моноаминооксидазной активности//Прикл. биохим. михробиол.-1990.-Т.26, N5.-С.700-705.

11. A'.D. Соболев, В:0.Дйнилов. Микрометод определения аткивности' моноаминооксидазы с помощьо бактериальной люциферазы//М9тоды получения;, анализа и применения ферментов: Тез, докл. Всесоюз. конф'.: Юрмала, 1990.-Рига, 1990.-С.216.

12. A.D.Iemail07,.A.Yu.Sobolev, V.S.Danilov. В1о1ищ1певсеп-ое dsoay kinetioB inthe reaction of baoterial luoiferaoe with1 different' aIdehydeB//J.Biolumin.Chemilumin.-1990.-V.5, N3--Р.21Э- 217.

13. А.Д.Исмаилов, A'.D.Соболев, В.С.Данилов. Альдегидзави-симые биолхминесцентные системы микроанализа/УИшсенерная энзимология: Тез. докл. vii Всесоюз. симп., Москва, 19911 -ММ 9911 -С. 24-25.