Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетика биолюминесцентной реакции в нетрадиционных средах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Кинетика биолюминесцентной реакции в нетрадиционных средах"

российская академия наук

сибирское отделение институт биофизики

На правах рукописи

РГ5 ОД

Суковатая Ирина Егоровна и ^ ¡^р

кинетика биолюминесцентнои реакции в нетрадиционных средах

03,00.02-Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск - 2000

Работа выполнена в отделе биотехнологии Института биофизики СО РАН

Научный руководитель:

к. б. н., с.н.с. Наталья Анатольевна Тюлькова

Официальные оппоненты: д.б.н., профессор Р.И. Кузьмина

д.ф.-м.н., профессор П.И. Белобров

Ведущая организация - Красноярский Государственный Университет

Защита диссертации состоится «_»_2000 г.

в_часов на заседании специализированного Совета Д 003.45.01 по

защитам диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036 г. Красноярск-36, Академгородок, Институт биофизики СО РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики г. Красноярск, Академгородок.

Автореферат разослан «_»_2000 г.

Ученый секретарь специализированного Совета,

к.ф-м.н.

Л.Г. Косолапова

Е&У1 {)

Актуальность проблемы. Структурно-динамическая организация белков, представляющая собой фундаментальную проблему современной биохимии, включает баланс межмолекулярных взаимодействий как внутри белка, так и в его микроокружении. Для направленного изменения свойств белков наряду с генной инженерией и белковым дизайном одним из перспективных подходов считается "дизайн среды", который предполагает многообразие методов в использовании неводных реакционных сред: мицелл, микроэмульсий, индивидуальных органических растворителей и их смесей, или водно-органических растворов. Моделирование физико-химических свойств среды для ферментативного катализа путем введением органических растворителей в последнее время получило широкое распространение, поскольку помимо практического применения в биотехнологии и медицине, позволяет моделировать многие биохимические процессы и получить информацию о ферментах зачастую недоступную в рамках традиционной энзимологии.

Люциферазы из разных видов светящихся бактерий катализируют реакцию окисления длинноцепочечного алифатического альдегида до соответствующей жирной кислоты с излучением квантов света. Способность люцифераз трансформировать энергию химических связей в световую позволяет считать этот фермент уникальным объектом научных исследований. Сравнительное изучение кинетических параметров реакций люцифераз из двух видов светящихся бактерий P.leiognathi и V.harveyi в водно-органических средах позволяет оценить роль воды и объемных характеристик среды (гидрофобности, диэлектрической проницаемости, способности образовывать водородные связи) в поддержании каталитически активной структуры ферментов и выяснить природу формирования фермент-субстратного комплекса.

Цель работы. Целью данной работы является сравнительное изучение кинетики реакции люцифераз из двух видов светящихся бактерий при направленном изменении реакционной среды с использованием органических растворителей.

Основные задачи исследования:

1. Исследовать динамику кинетических параметров люцифераз из двух видов светящихся бактерий Photobacterium ¡eiognathi и Vibrio harveyi при введении органических растворителей в реакционную среду.

2. Проверить применимость термодинамической модели влияния органических растворителей на белки для прогноза денатурирующего действия растворителей на люциферазы.

3. Сопоставить кинетические параметры реакции, характеризующие различные стадии биолюминесценции, со следующими параметрами органических растворителей: параметром гидрофобности (-logP), способностью образовывать водородные связи, донорно-акцепторными свойствами растворителей и диэлектрической проницаемостью.

4. Определить типы взаимодействия органических растворителей с лю-циферазами по отношению к альдегидам разной длины цепи.

Научная новизна. Выявлены особенности влияния органических растворителей на кинетику реакции двух бактериальных люцифераз из двух видов светящихся бактерий Р.ШодкИЫ и \\harveyi при использовании альдегидов с разной длиной цепи. Показана значительная активация интенсивности свечецня люцифераз при введении небольших концентраций органических растворителей. Методами кинетического анализа определены типы взаимодействия (активации -и ингибирования) органических растворителей с люциферазами и установлено, за счет каких взаимодействий (гидрофобных или электростатических) происходит образование фермент-субстратных комплексов люцифераз с альдегидными субстратами.

Практическая значимость. Введение органических растворителей в реакционные смеси позволяет оптимизировать условия реакции, в частности, увеличивать скорость реакции. Показана возможность применения параметров гидрофобности и денатурирующей силы растворителя для качественной оценки их инактивирующего действия на люциферазу.

Положения, выносимые на защиту.

- Изменение кинетических параметров биолюминесцентной реакции, катализируемой люциферазами из двух видов светящихся бактерий РАею^шЫ и I \liarveyi, в водно-органических средах определяется балансом гидрофобных и электростатических взаимодействий, и вытеснением воды из гидратной оболочки белка. За счет этого, вероятно, происходят конформационные изменения люцифераз. Стабилизация долгоживущего интермедиата определяется донорно-акцепторными свойствами растворителей.

- Структурные особенности двух видов люцифераз проявляется в том, что люцифераза 1 \harvcyi более устойчива к действию органических растворителей и величина активирующих и ингибирующих эффектов растворителей на биолюминесценцию определяются: для люциферазы РАею^паОи - длиной цепи используемого альдегида, для люциферазы У.Иатеуч - природой растворителя.

- Введение органических растворителей характеризуется различными типом взаимодействий люцифераз с эффекторами и зависит от их концентрации и используемого субстрата. Взаимодействие люциферазы УИап/еу! с Си и Сю имеет преимущественно гидрофобную природу, и люциферазы А/е/о^иа/А/ с Си -гидрофобную, а с С:1 и С|0 - электростатическую.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на Международной конференции "Вюса1а!уз15-95"(Суздаль, 1995), на 9-ом (Массачусетс, США, 1996) и 10-ом (Бологна, Италия, 1998) Международных симпозиумах по биолюминесценции и хемилюминесценции, на XIII Международном биофизическом конгрессе (Нью Дели, Индия, 1999), на I Всесибирском конгрессе женщин-математиков (Красноярск, 2000).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения и трех глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 126 страницах маши-

нописного текста, проиллюстрирована 7 таблицами и 28 рисунками. Список литературы включает 93 отечественных и иностранных источника.

Содержание работы.

Во введении дано обоснование темы диссертации, ее научная новизна, практическая значимость, сформулированы цели и задачи исследования.

Обзор литературы состоит из нескольких разделов. В первом разделе рассматриваются структура и каталитические свойства бактериальных люцифе-раз из двух видов светящихся бактерий P.leiognathi и V.harveyi. Во втором разделе данной главы даны классификации растворителей в соответствии с их химическим строением, с их физическими, кислотно-основными свойствами и по специфическому взаимодействию с растворенным веществом. Проведен анализ влияния различных факторов среды на каталитические свойства ферментов и конформацию различных белков. Особое внимание уделено роли воды и различных (гидрофобных и электростатических) взаимодействий как в поддержании нативной структуры белка, так и в процессе образования фермент-субстратных комплексов биокатализаторов. Приведены параметры органических растворителей (гидрофобность, денатурирующая сила, индекс полярности, емкость денатурации), которые используются для характеристики влияния этих эффекторов на белковые макромолекулы. В третьем разделе на основании анализа литературы дано обоснование необходимости изучения роли белка и его микроокружения в биолюминесценции.

Объектами исследования служили люциферазы из Phoíobacterium Iciognathi (штамм 208), Vibrio harveyi (штамм 1212) и рекомбинантного штамма H.coli, высокоочищенные методами ионообменной хроматографии и гель-фильтрации (Tyulkova, 1989; Илларионов, Тюлькова, 1997). Ферменты были получены в секторе биотехнологии ИБФ СО РАН. Субстраты реакции: деканаль (Сю) (Sigma, США), додеканаль (Ci2)(Merck, ФРГ), тетрадеканаль (См)(Мегск, ФРГ) и фотовосстановленный флавинмононуклуотид (FMNH?) (Sigma, США).

Методы исследования. Биолюминесцентная реакция при инициировании ее фотовосстановленным FMNH2 представляет собой короткую вспышку света с ярко выраженным максимумом и быстрым спадом биолюминесценции. Максимум интенсивности свечения (1о) характеризует начальную скорость реакции и концентрацию фермент-субстратного комплекса, образуемого в ходе реакции. Затухание биолюминесцентной реакции во времени происходит по экспоненте и определяет скорость распада фермент-субстратного комплекса. Константа спада светоизлучения (кс„) вычисляется по спаду свечения от 80% до 20 % от максимальной интенсивности: kcn=(InIgo-lnl2o)/t. Общее число квантов Q=I„/kcn пропорционально общему числу молекул фермент-субстратного комплекса, распавшихся с излучением. Измерения проводили на биолюминометре, сконструированном в Институте биофизики СО РАН. Конструкция биолюминометра позволяет стабилизировать температуру реакционной смеси. Ферментативную реакцию проводили при температуре 25°С. Параметры реакции регистрировали на самописце 2210 (LKB-Wallac, Финляндия). Реакцию для измерения контроля

t I

проводили в смеси следующего состава: 10 мкл люциферазы, растворенной в 0,02М фосфатном буфере, 50 мкл водного раствора альдегида, 440 мкл 20мМ фосфатного буфера, pH 7. Реакция инициировалась добавлением 0,5 мл раствора фотовосстановленного FMNH2 с ЮмМ ЭДТА. Фотовосстановление FMNH2 проводили в термостатаруемой рубашке. Концентрации люциферазы P.leiognathi в реакционной смеси составляли (0,1 - 1,5)-10"7 М, люциферазы V.harveyi - (0,007 - 0,013)" 10"7,М. Концентрации субстратов в реакционной смеси составляли: СЫ=47-10'6М, 0,2=5,4-10^, Сю=12,8-10"3М, FMN=7,6-10" 3М. Для измерения активности люцифераз в водно-органических растворах фосфатный буфер заменяли на буферно-органическую смесь, содержащую необходимую концентрацию органического растворителя, которую получали из исходных концентрированных растворов органических растворителей путем разведения. В работе использовали следующие органические растворители: ацетонитрил (АЦТР), ацетон (АЦ), этанол (ЭТ), метанол (MET) (Sigma,США), формамид (ФА) (Serva,CHIA), диметилсульфоксид (ДМСО) (Serva,CLLIA), глицерин (ГЛ), этиленгликоль (ЭТГЛ). Все, используемые реактивы, кроме отмеченных в тексте, были отечественного производства квалификации ОХЧ. Этанол дополнительно очищали перегонкой при 76°С, ацетон обезвоживали добавлением aquacide III (Hoechst,США). Концентрации растворителей выражали в объемных процентах. Для исследования обратимости действия органических растворителей на люциферазы в смесь, которая содержит люциферазу и органический растворитель, добавляли фосфатный буфер и измеряли восстановление активности. Измерения по определению времени автоокисления FMNH2 в водно-органических средах проводили спектрофотометрически на спектрофотометре Shimadzu (Япония). Фотовосстановленный FMNHj впрыскивали непосредственно в кювету спектрофотометра и регистрировали уменьшение оптической плотности на 445нм Для определения типов взаимодействия (активации и ингибирования) концентрации субстратов варьировали в следующих пределах: С|4=(0,47-47)-10"7,М; С,2=(0,5 - 5,4)-10^,М; Сю=(1,3-12,8)-10"3,М; и FMN=(3-7,6)-10"5,М. Кинетические данные обрабатывались с помощью трансформации зависимости Михаэлиса-Ментен в координатах Иди-Хофсти, Хейнса, Лайнуи-вера-Берка и Диксона (Келети, 1990). В случае смеси двух растворителей использовали усредненную величину постоянной диэлектрической проницаемости <£>, определяемую соотношением <£>= (Ci8i+C2£2)/100, где С; - относительная концентрация i-компоненты (С, + С2=Ю0%), а е , - ее диэлектрическая проницаемость (Эме, 1967). Статистическая обработка полученных экспериментальных результатов проводилась методом наименьших квадратов с использованием пакета программ Excel for Windous-98.

Результаты исследований н их обсуждение. В первом разделе Влияние органических растворителей на кинетические параметры реакции, катализируемой люциферазами из P.leiosnathi и V.harveyi изложен экспериментальный материал по влиянию органических растворителей на кинетику бактериальных люцифе-

раз. Все исследуемые органические растворители в конечном итоге ингибируют каталитическую активность люцифераз. Зависимость интенсивности свечения люцифераз от концентрации органических растворителей имеет вид колоколо-образной кривой (рис.1) и характеризуется следующими параметрами: С3 -концентрация растворителей, при которой наблюдается максимальная активация интенсивности свечения; С,ф - диапазон концентраций растворителя, в которых происходит увеличение начальной скорости реакции; С50 - пороговая концентрация, при которой происходит потеря половины ферментативной активности (табл.1).

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 5 10 15 20 25 30 35

[расгворитель],об.% [растворитель], об.%

Рис.1. Зависимость интенсивности свечения реакции люцифераз ¡\leiogtiathi и У.Иапг'у/ с См от концентрации органических растворителей, выраженной в объемных процентах.

Пик колоколообразной зависимости интенсивности светоизлучения лю-циферазы У.Иап-еуч от концентрации ацетона, метанола и этанола имеет тенденцию сдвигаться в сторону больших концентраций органических добавок при переходе от безальдегидного свечения к свечению с использованием экзогенных альдегидов с разной длиной цепи. Для люциферазы Р.1ею%паМ максимум интенсивности свечения в водно-метанольной смеси с увеличением длины цепи алифатического альдегида сдвигается в сторону меньших концентраций Са, а в водно-ацетонных и водно-этанольных смесях С3 приблизительно равны во всех случаях (табл.1)

Концентрации растворителей, которые как активируют, так и ингибируют интенсивность свечения люциферазы У.Иагуеу!, больше (иногда в несколько раз) соответствующих концентраций для люциферазы Р.1е10^па1/и (табл. 1,2). Т.е. люцифераза У.Иапеуг более стабильна к действию органических растворителей. Если концентрация для всех исследуемых нами органических раствори-

телей не превышает пороговой, то ингибирование ими люцифераз обратимо, и активность ферментов восстанавливается при уменьшении концентрации растворителя в среде.

Таблица 1.

Параметры (об.%), характеризующие активирующее и ингибирующее действие органических растворителей на интенсивность свечения люцифераз

Растворитель Параметры РИо!оЬас1егшт ¡еюдъсчМ Г/Л г/о Иагхву!

безА Сю С,2 С14 безА Сщ С,2 С„

ацетон Са 2 2 нет 1,5 1,5 3 2,5 5

Скр 3,5 3 нет 2,5 2,5 4,5 4 7

С50 5 4 8,5 6,5 7,2 6 6,6 9,5

этанол са 2,5 2 нет 2 2,5 6 6,5 5

С|ф 3,5 4,5 нет 6 3,5 12 12 11

С50 7 9,5 6 10,3 9 13,2 13 14,3

метанол Са 9 1,5 нет 2 7,5 8 8,5 10

Скр 15 4,5 нет 7,5 17,5 13 15 18

С50 16 11,5 8,5 11,8 19 15 17 19,5

Пороговые концентрации органических растворителей (Сз0) (табл.2) коррелируют с низкими коэффициентами линейной корреляции (50-80%) с параметром гидрофобности органических растворителей (1одР) (рис.2) и параметром ^Х, рассчитанным на основании значений шкалы денатурирующей силы (ДС), предложенной в термодинамической модели денатурирующего действия органических растворителей на белки (Белова, Можаев, 1991) (рис.3,А, кривые 1,2). Для обеих люцифераз экспериментальные значения пороговых концентраций органических растворителей значительно ниже теоретически определенных с помощью шкалы ДС пороговых концентраций растворителей (рис.3,А, кривые Г, 2'). Защитное действие ашфатических альдегидов на обе люциферазы к денатурации органическими добавками уменьшается в следующем порядке: Сю > экзогенный альдегидный фактор > Си > Сц. Высокая корреляция С50 с к^Р наблюдается для одного класса растворителей (спиртов): коэффициент корреляции с См равен для Р.Ыо^шШ 99%, У.Иатеу/' - 90% (рис.3,Б).

Существенное увеличение начальной скорости биолюминесцентной реакции, катализируемой обеими люциферазами, происходило при относительно низких концентрациях спиртов и ацетона: до 10об.% - для люциферазы Р.¡екщпшЫ и до 15об.% метанола - У.Иап>еу1. Наибольшая активация как при безальдегидном свечении люцифераз, так и при использовании альдегидов с разной длиной цепи, происходит в метаноле. Максимальное увеличение интенсивности свечения в 10 и 5 раз наблюдали в метаноле при безальдегидном свечении для люцифераз Р.1ею&ш1Ы и У.Иап>еу1 соответственно. Выраженный в

процентах диапазон увеличения интенсивности свечения для всех водно-органических систем с экзогенными альдегидами для V. капеуч от 110 до 370% в несколько раз превышает этот диапазон для Р. 1е1о£па!}и - 110-170% (табл.3).

Таблица 2

Пороговые концентрации органических растворителей (об.%) и их параметр гидрофобности (-1о§Р) при. использовании альдегидов разной длиной цепи и без альдегида

растворитель -1одР РАе^пшМ У./гаггеуч

безА Сю С,2 С,4 безА С,О С,2 Сы

метанол 0,74 16 11,5 8,3 11,8 19 15 17 19,5

этанол 0,32 7 9,5 6 10,3 9 13,2 13 14,3

ацетон 0,24 5 4 8,5 6,5 7,2 6 6,6 9,5

этиленгликоль 1,93 12 30 10 33

глицерин 2,5 20

ДМСО 1,35 29 15 27 11,5

формамид 0,65 11 11 8,3 13,5

35 Ся,с&%

30-

25-

20-

15- а

10-

5-

0 —1—I—■—Г-

Р./еюдпа07 1 'А

35^ 30 25 20 15 10 5 0

УЬэп/еуг

СИ

д г-

1 1 1 1 > ) I { 1 Ь—г-г-гг*

0 1 » 2 3 0 0,5 1 1,5 2

-1осР

Рис.2. Корреляции пороговых концентраций органических растворителей (об.%) с их гидрофобностью (-1о§Р) для люцифераз Р.1е10^па11и и У.Иапеуч без альдегида (1), при использовании Сш (2), Си (3) и См (4).

-1оеХ -!о§Р

Рис.3. Корреляции пороговых концентраций растворителей (С50) с параметром (-^Х) (А) и Сл, спиртов с параметром их гидрофобности (-1оцР) (Б) для лю-цифераз Р. 1е10^па1Ь1 и I'. Иапеу/ с тетрадеканалем.

Таблица 3

Максимальное увеличение интенсивности свечения люцифераз в среде с активирующими начальную скорость реакции концентрациями органических растворителей (Са) относительно интенсивности свечения, наблюдаемой в буферном растворе, выраженное в процентах

растворитель P.leiognathi V.harveyi

безА С]ц С12 Си безА Сщ С12 С,4

метанол 1000 130 нет 120 500 180 210 370

этанол 230 170 нет 150 130 250 150 200

ацетон 250 150 нет 120 140 150 110 160

Константа спада светоизлучения (ксП) для обеих люцифераз не изменяется в диапазоне концентраций органических растворителей, увеличивающих начальную скорость реакции, и не претерпевает резких изменений при введении пороговых концентраций растворителей (рис.4,5) (за исключением фермент-субстратного комплекса люциферазы V.harveyi с деканалем (рис.4,Б)).

Для обеих люцифераз наименьшие значения ken светоизлучения наблюдали в ацетоне. Изменения константы спада светоизлучения люциферазы V.harveyi в большей мере зависит от природы используемого растворителя: в ацетоне к^, светоизлучения уменьшается, в спиртах - не изменяется или растет (рис.4 стрелками вверх показаны активирующие концентрации растворителей

С„ которые вызывают максимальное увеличение интенсивности свечения, стрелками вниз - пороговые концентрации растворителей С50). Изменения константы спада биолюминесценции люциферазы P.Ieiognathi в большей мере определяется длиной цепи используемого альдегида: с См и при безальдегидном свечении к^, светоизлучения уменьшается, с С12 - почти не изменяется, с Сю -растет (рис.5).

Изменение квантового выхода биолюминесценции люциферазы P.Ieiognathi в органических растворителях определяется главным образом изменением начальной скорости реакции и слабо зависит от константы спада реакции, и как следствие, характеризуется теми же самыми численными значениями параметров Са, С,ф и С50, что и интенсивность свечения. Изменение квантового выхода биолюминесценции люциферазы V.harveyi зависит как от начальной скорости реакции, так и от константы спада, и характеризуется другими параметрами Са, Сгр и С50, по сравнению с интенсивностью свечения, например, в водно-ацетонной смеси с С)0 и С|2 не наблюдается увеличение числа квантов, не смотря на активацию интенсивности свечения.

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

ч-1-г

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

т—i—г*

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 [растворитель],об.%

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 [растворитель],об.%

Рис.4. Зависимость константы спада светоизлучения реакции люциферазы КАяттеу/ от концентрации ацетона (1), метанола (2) и этанола (3) при безальдегидном свечении (А), с деканалем (Б), додеканалем (В) и тетрадеканалем (Г).

0 2 4 6

1—I—1—I ч

10 12 14 16 18

0,6 0,4 0,2 0

2 о-А Б <«= 3

! —1— ,—,—,— 1 1

0 2 4 6 8 10 12 14

[растворитель],об.%

8 Ю 12 0 2 4 6 8 10 12 14 16 [раствор и те ль], о б.%

Рис.5.Зависимость константы спада светоизлучения реакции люциферазы }'.1с1о%паип от концентрации ацетона (1), метанола (2) и этанола (3) при безальдегидном свечении (А), с деканалем (Б), додеканалем (В) и тетрадеканалем (Г).

Во втором разделе главы Результатов исследований приведены результаты кинетического анализа взаимодействия люцифераз с субстратами в водно-органических средах и исследования взаимосвязи диэлектрической проницаемости среды с эффектом органических растворителей на биолюминесцентную реакцию. Для анализа последовательности связывания лигандов с люцифера-зой, а также роли гидрофобных и электростатических взаимодействий, участвующих в образовании фермент-субстратных комплексов, проведен подробный кинетический анализ с использованием как традиционной анаморфозы Лайнуи-вера-Берка, так и более точных графиков Иди-Хофсти, Хейнса и Диксона. Последний из этих методов позволяет оценить число молекул ингибитора, связывающихся с ферментом.

Эффект введения органических растворителей эквивалентен различным типам взаимодействий люцифераз с эффектором и зависит от его концентрации. Для люциферазы ¡\lciognalhi с Си органические растворители, концентрации которых увеличивают интенсивность свечения, являются неконкурентными активаторами по отношению к этому альдегиду, тогда как в ингибирующих реакцию концентрациях - это конкурентные ингибиторы. С С!2 метанол и ацетон

являются бесконкурентными ингибиторами, а этанол - неконкурентным, а с Сю метанол, концентрации которого увеличивают интенсивность свечения, является неконкурентным активаторами, а ацетон и этанол - бесконкурентными активаторами, тогда как в ингибирующих реакцию концентрациях эти растворители - конкурентные ингибиторы. Для люциферазы У.Иагтеу/ с Си тип взаимодействия конкурентный как при активирующих, так и ингибирующих интенсивность свечения концентрациях растворителей. С Сю все исследуемые растворители проявляют смешанный тип ингибирования, этанол активирует по смешанному типу, тогда как метанол и ацетон, - неконкурентные активаторы. Ацетон, этанол, метанол и ДМСО проявляют неконкурентный тип активации и ингибирования по отношению к ИМИ.

Изменение константы Михаэлиса (Км) по альдегиду для обеих люцифераз в водно-органических средах зависит главным образом от длины цепи альдегида. Исходя из известных представлений о влиянии органических растворителей на Км по субстрату, можно заключить, что с Си реализуются преимущественно гидрофобные, а с С^ и Сю - электростатические взаимодействия между люци-феразой и альдегидными субстратами (рис.6). Для люциферазы У.Иап>еу1 Км по Си и Сю увеличивается с увеличением концентраций органического растворителя, это значит, что при связывании этих альдегидов с люциферазами преобладающими являются гидрофобные взаимодействия (рис.7).

[растасригель],оСР/<> [рзлваритеь|,о6%

Рис.6. Зависимость константы Михаэлиса по тетрадеканалю (Си), додеканалю (С|2) и деканалю (Сю) от концентрации ацетона(1), метанола(2) и этанола(З) для люциферазы /'.¡е/о^пшИ/.

С целью исследования взаимосвязи диэлектрической проницаемости среды с эффектом органических растворителей на биолюминесцентную реакцию были исследованы три типа растворителей: 1) ацетон, этанол, метанол, этиленг-ликоль - растворители, уменьшающие диэлектрическую константу среды (е); 2) ДМСО - растворитель, не изменяющий значительно £ в пределах исследуемых

концентраций; 3) формамнд - растворитель, существенно увеличивающий е. Растворители разных классов, изменяющие диэлектрическую проницаемость (спирты, ацетон и формамнд), вызывают увеличение интенсивности свечения люцифераз и индуцируют одинаковую (колоколообразную) зависимость начальной скорости реакции от диэлектрической проницаемости среды, как при ее увеличении, так и при уменьшении относительно буферного раствора. ДМСО, слабо изменяя диэлектрическую проницаемость, вызывает быстрое (почти линейное) уменьшение начальной скорости реакции (рис.1).

[ралвсритель],о9'/с [росгесригель],сб.%

Рис.7. Зависимость константы Михаэлиса по тетрадеканалю (См) и деканалю (Сш) от концентрации ацетона(1), метанола(2) и этанола(З) для лкшиферазы I '.1ютеу1.

Константа спада биолюминесценции при концентрациях растворителя больше пороговой в средах, содержащих воду и растворители с диэлектрической проницаемостью, меньшей, чем у воды, уменьшается. Наиболее сильное уменьшение константы спада происходит в ДМСО, хотя этот растворитель изменяет диэлектрическую проницаемость среды в меньшей степени. В реакционной среде, содержащей формамид, который характеризуется диэлектрической проницаемостью, большей, чем у воды (е(ФА)=109,5), наблюдается увеличение ко, светоизлучения (рис.8).

Квантовый выход биолюминесцентной реакции люцифераз возрастает при активирующих интенсивность свечения концентрациях растворителей независимо от того, каким образом они изменяются диэлектрическую проницаемость среды (рис.9).

В третьем разделе главы Результатов исследований проведены анализ и обсуждение полученных экспериментальных результатов с точки зрения свойств растворителей и их влияния на образование и распад фермент-субстратного комплекса люцифераз с альдегидными субстратами, а также роли

воды. При введении органических растворителей в реакционные смеси ферментов наблюдается объемный электростатический эффект, связанный с понижением или повышением диэлектрической проницаемости среды, а также гидрофобный эффект, обусловленный ослаблением гидрофобных взаимодействий и экспонированием в растворитель гидрофобных участков молекул белка из-за разрыва гидрофобных контактов.

диэлектрическая проницаемость

Рис.8. Зависимость константы спада светоизлучения люцифераз ¡\lciognathi и Г.Лап'еу/ при использовании тетрадеканаля от диэлектрической проницаемости метанола (1), этанола (2), ацетона (3), ДМСО (4), формамида (5) и этиленгликоля (6).

70 75 80 85 69 74 79 84

диэлектическая проницаемость

Рис.9. Зависимость квантового выхода реакции люцифераз P.lciognathi и 1'.1ш/геу1 при использовании тетрадеканаля от диэлектрической проницаемости метанола (1), этанола (2), ацетона (3), ДМСО (4), формамида (5) и этиленгликоля (6).

Кинетические параметры биолюминесцентной реакции при введении органических растворителей в реакционную смесь изменяются. Эти изменения имеют некоторые различия для люцифераз Р. leiognalhl и У.Иапеу! и, по-видимому, определяется их структурными особенностями. Стадии биолю.ми-несцентного процесса: стадия образования фермент-субстратного комплекса, которая характеризуется начальной скоростью реакции; и распад фермент-. . субстратного комплекса (возбужденного интермедиата II), который характеризуется константой спада биолюминесценции, рассмотрены отдельно.

Как известно, характер нативной конформации белка определяется не каким-либо одним эффектом, а представляет собой результат совместного тонко сбалансированного действия целого ряда факторов и взаимодействий. Реально существующая структура белков упорядочена и компактна и определяется, в основном, гидрофобными взаимодействиями, которые чаще всего рассматриваются как стабилизирующий фактор для белковых макромолекул. Пороговые концентраций широкого круга органических растворителей (Сзо) для обеих люцифераз с альдегидами разной длиной цепи с параметром гидрофобности этих растворителей (-1оёР) коррелируют с низким коэффициентом линейной корреляции. Это значит, что процесс инактивации люцифераз нельзя описать только ослаблением гидрофобных взаимодействий. При построении подобной корреляции для растворителей, которые характеризуются значениями константы диэлектрической постоянной среды меньшей, чем у воды (то есть при исключении формамида), коэффициент линейной корреляции становится более 90%. Увеличение диэлектрической проницаемости (в формамиде), то есть ослабление электростатических взаимодействий в реакционной среде, усиливает ингибирую-щий эффект растворителя (табл.2, рис.2).

Проверка применимости термодинамической модели Беловой, Можаева с сооавторами (1991), основанной на представлении о том, что денатурация белков органическими растворителями происходит в основном из-за вытеснения молекул воды из гидратной оболочки фермента показала, что, во-первых, процесс инактивации ферментативной активности люцифераз складывается из процессов увеличения гидрофобности реакционной среды при введении органических растворителей и вытеснения молекул воды из гидратной оболочки белка; во-вторых, теоретически определенные значения пороговых концентраций органических растворителей на основании шкалы ДС превышают экспериментально полученные значения С50 для обеих люцифераз; в третьих, шкала ДС качественно характеризует действие органических растворителей на люциферазы: сильный денатурант, слабый денатурант (рис.3,А). Таким образом, термодинамическая модель также неудовлетворительно описывает процесс потери ферментативной активности, вызываемый денатурацией фермента.

Используемые в экспериментах концентрации растворителей, как активирующие, так и ингибирующие активность люцифераз, уже на 5-6 порядков превышают концентрации фермента и альдегидных субстратов. В то же время в этом же диапазоне концентрации растворителей меняется всего на несколько

процентов, и при этом происходит изменение типов взаимодействий органических растворителей с ферментом. При ингибирующих концентрациях растворителей, согласно проведенному формально-кинетическому анализу, все растворители конкурируют с Сы за место связывания на люциферазе, тогда как при активирующих концентрациях тип взаимодействия определяется как неконкурентный. Тип взаимодействий растворителей с люциферазой У.Иапеу! по отношению к См как при активации, так и при ингибировании реакции - конкурентный и не зависит от концентрации эффекторов. При использовании альдегидов с меньшим числом углеродных атомов не наблюдается конкурентных по природе взаимодействий растворителей с люциферазами. Исходя из этого, можно предполагать, что используемые нами органические растворители (по крайней мере спирты) могут специфически взаимодействовать с люциферазами в области присоединения к ней дистальной метальной группы Си- При связывании с более короткими альдегидами С|2 и Сю растворители не препятствуют их взаимодействию с люциферазами. При этом, исходя из разного типа ингибирования ацетоном, можно предположить, что область контакта с дистальной группой те-радеканаля представлена разными ионогенными группами у двух исследуемых люцифераз. Предположение о специфичности взаимодействий спиртов и ацетона в области контакта с дистальной метальной группы Сы на люциферазе подтверждается характером изменения пороговой концентрации (С50) одного и того же растворителя в зависимости от длины цепи альдегида (рис.2). То есть, для достижения эффекта инактивации в реакции с более коротким альдегидом, Сщ, необходима большая концентрация растворителя. Учитывая последнее и эффективные концентрации органических растворителей можно предполагать, что наряду со специфическими взаимодействиями происходят и конформационные изменения люцифераз.

Существенное увеличение начальной скорости биолюминесцентной реакции, катализируемой обеими люциферазами, происходило при относительно низких в сравнении с другими белкам концентрациях органических растворителей: до 10об.% - для люциферазы Р.¡ею^пшИ! и до 15об.% метанола -{■'.Ист/суч (табл.3). В соответствие с представлениями о том, что введение органических растворителей приводит к замещению воды, окружающей белок, и что люцифераза У.Иагхеу^ катализирует реакцию со значительно меньшей скоростью, чем люцифераза Р.кю^аШ, и является более термостабильным ферментом (Тюлькова, Сандалова, 1996) что предполагает меньшую гибкость и подвижность белковой молекулы люциферазы У.Ьатеуч, следует ожидать, что люцифераза У.Иапщч является менее гидратированным белком, или характеризуется более прочно связанными молекулами воды. Гибкость и подвижность белковых макромолекул обеспечивается за счет молекул воды, а у люциферазы У.Ьагхеу!, как более гидрофобного белка, связанных молекул воды должно быть меньше, по сравнению с люциферазой РАе'ю^паМ, или эти молекулы воды должны характеризоваться более прочной связью с ферментом. Введение органических растворителей, по видимому, в первую очередь, уменьшая гидрофобные взаимодействия, увеличивает подвижность гидрофобных аминокислотных

• остатков на поверхности белковой глобулы и тем самым способствует увеличению ее ферментативной активности, и только потом вытесняет воду, тесно связанную с ферментом, приводя к его инактивации.

Для люциферазы РАею^паМ картина несколько иная. Этот белок уже в буферном растворе характеризуется достаточно высокой активностью. Ослабление гидрофобных взаимодействии при введение органических растворителей не вызывает столь значительного увеличения интенсивности свечения. По-видимому, люцифераза Р.1е^па1Н1 более гидратирована. Вытеснение структурообразующей воды из гидратной оболочки РАеюярснЫ и уменьшение степени дегидратации при увеличении концентрации органического растворителя в реакционной среде приводит к смене кажущегося типа взаимодействия за счет изменения сольватации участка связывания дистапьного метильного остатка тетрадеканаля. С увеличением гидрофобности альдегидных субстратов их сродство к ферменту возрастает (так как Км изменяется от КГ'М для Сщ до Ю^М для Си) и изменение Км при добавлении органических растворителей также подтверждает, что для люциферазы У.Иап>еу1 при взаимодействии с субстратами определяющими являются гидрофобные взаимодействия (рис.7). В то время как для люциферазы РАею^аМ при переходе от См к Сщ гидрофобные механизмы связывания переходят в электростатические (рис.6). Поскольку в некоторых растворителях, например в ДМСО, вообще не наблюдается увеличения начальной скорости реакции люцифераз (рис.1), то понятно, что ослабление гидрофобных взаимодействий, хотя и вносит определенный вклад в увеличение конформационной подвижности люцифераз, особенно люциферазы У.Иап-еу/, но не играет ключевой роли в активации.

Поскольку часть ингибиторов неконкурентна по природе (для обеих люцифераз конкурентные взаимодействия органические растворители проявляют только по отношению к Си и не конкурируют за связывание на люциферазе с другими альдегидами), то вполне вероятно, что по крайней мере некоторые из сайтов связывания эффекторов находятся не в пределах участка связывания альдегида.

Поскольку вода, вероятно, играет определенную роль в проявлении каталитической активности люцифераз как в буферном растворе, так и в водно-органических средах, то это неразрывно связано с изменением сети объемных водородных связей, образуемых вокруг белковой глобулы. По физико-химическим характеристикам органических растворителей можно выделить метанол, как растворитель с промежуточной способностью образовывать Н-связи между водой, хорошо образующей Н-связи, и этанолом, слабо формирующим водородные связи. Обобщая все выше сказанное можно предполагать, что процесс активации люцифераз связан, конечно, с ослаблением гидрофобных взаимодействий в реакционной среде, но в большей степени зависит от изменения электростатических взаимодействий, поскольку максимальная степень активации наблюдается в растворителях, которые слабо нарушают гидратную оболочку белка и усиливают электростатические взаимодействия. Ослабление последних в формамиде не вызывает значительной активации люцифераз с Си, хотя

1 *

этот растворитель характеризуется такой же как и вода способностью образовывать объемную сеть водородных связей (рис.1).

Органические добавки оказывают существенное влияние не только на интенсивность светоизлучения биолюминесцентной реакции, но и на константу спада биолюминесценции. Очевидно, что в тех случаях, в которых происходит уменьшение константы спада, происходит стабилизация возбужденного интер-медиата II (рис.4,5). Анализ совместного влияния гидрофобности и диэлектрической проницаемости среды показал, что гидрофобность среды (но не субстрата) мало влияет на константу спада биолюминесценции. Наибольшая стабилизация интермедиата II наблюдается в ДМСО, который характеризуется средним значением параметра гидрофобности (-logP) (рис.8). В общем случае изменения константы спада светоизлучения, конечно, зависят от диэлектрической проницаемости среды. То есть, ослабление электростатических контактов путем введения формамида приводит к значительному росту скорости распада возбужденного интермедиата II. Расположение кривых изменения константы спада от диэлектрической проницаемости среды для разных растворителей качественно хорошо коррелирует с их донорно-акцепторными свойствами. То есть, в сильно полярном апротонном растворителе ДМСО наблюдается наибольшее уменьшение константы спада, чем в менее апротонном ацетоне. В растворителях со смешанными донорно-акцепторными свойствами константа спада практически не изменяется. Таким образом, стабилизирующим для возбужденного интермедиата II фактором является способность растворителя акцептировать протоны. Такое поведение константы спада прослеживается для тех субстратов, для которых преобладающий тип взаимодействия определен как гидрофобный. Тогда как для реакции люциферазы P.leiognathi Сю и С^ природа связывания которых определена как преимущественно электростатическая, наблюдается дестабилизация возбужденного эмиттера, что характеризуется увеличением скорости спада биолюминесценции, в том числе и в апротонном растворителе - ацетоне.

Основные результаты и выводы

1. Введение органических растворителей в реакционную среду в небольших концентрациях (0,5-18об.%) вызывает активацию биолюминесцентной реакции, которая выражается в возрастании начальной скороста и квантового выхода реакции. Увеличение интенсивности свечения с альдегидами разной длины цепи составляет от 110 до 170% для люциферазы P.leiognathi и от 110 до 370% для люциферазы V.harveyi. При более высоких концентрациях органические растворители ингибируют биолюминесцентную реакцию, катализируемую люциферазами Photobaclerium leiognathi и Vibrio harveyi.

2. Люцифераза l'.harveyi более стабильна к действию органических растворителей: для ее инактивация, также как и для активации требуется большая концентрация органического растворителя, чем для люциферазы P.leiognathi.

3. Изменения кинетических параметров реакции как интенсивности свечения, так и константы спада светоизлучения биолюминесцентной реакции при

добавлении органических растворителей для люциферазы P.leiognaihi в боль-' шей мере связаны с длиной цепи используемого альдегида, тогда как для люциферазы V.harveyi зависят от природы и свойств используемого растворителя.

4. Ингибирующнй'эффект органических растворителей на люциферазы коррелирует с константой их гидрофобности (-logP) и денатурирующей силой (ДС) с низкими коэффициентами линейной корреляции (50-80%), но эти параметры могут быть использованы для прогноза ингибирующего действия органических растворителей на люциферазы.

5. С увеличением концентрации органических растворителей возрастает Км по Си для обеих люцифераз и по Сю для люциферазы V.harveyi, и уменьшается Км по С|2 и Сю для люциферазы P.leiognaihi, то есть, при связывании люцифераз с альдегидами в первом случае преобладают гидрофобные, а во втором -электростатические взаимодействия.

6. Эффект введения органических растворителей характеризуется различными типами взаимодействий этих эффекторов с люциферазами, и зависит от концентрации растворителя и используемого субстрата. Общей чертой взаимодействия растворителей с люциферазами является конкурентный тип ингибирова-ния реакции.только с тетрадеканалем, что позволяет сделать предположение о специфическом связывании этих растворителей в области дистальной метиль-ной группы тетрадеканаля.

7. При введении в реакционную смесь органических растворителей с диэлектрической проницаемость .меньшей, чем у воды, происходит уменьшение константы спада светоизлучения или стабилизация возбужденного интермедиата, которая зависит от донорно-акцепторных свойств растворителя и типов взаимодействий люцифераз с субстратами. То есть, уменьшение константы спада светоизлучения наблюдается в полярных апротонных растворителях (ДМСО, ацетон) и в присутствии спиртов для реакции люцифераз с теми альдегидами, которые взаимодействиую с ними гидрофобно {V.harveyi с деканалем и тетрадеканалем, P.leiognaihi с терадеканалем). При введении в реакционную смесь органических растворителей с диэлектрической проницаемость большей, чем у воды (формамид), происходит возрастание константы спада светоизлучения или дестабилизация возбужденного интермедиата для обеих люцифераз с тетрадеканалем, вероятно, за счет ослабления электростатических взаимодействий при повышения диэлектрической проницаемости среды.

Публикации по теме диссертации.

1. N.A. Tyulkova and I.E. Sukovataya, INFLUENCE OF THE MEDIUM ENVEROMENT ON THE ACTIVITY OF LUCIFERASE// Abstract Book 9th International Symposium on. bioluminescence and chemiiuminescence, Massachusetts, USA, 4-8 October, 1996 (N152).

2. N.A. Tyulkova, I.E. Sukovataya, CATALYTIC ACTIVITY OF BACTERIAL LUCIFERASES IN WATER-ORGANIC MEDIA// Abstract of 10th International

I •

Symposium on bioluminescence and chemiluminescence in Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, July/August, 1998, vol.13, N 4, p. 248.

3. Суковатая И.Е. Каталитическая активность бактериальной люциферазы Photobacterium leiogiiathi в водно-органических смесях// Тезисы XXXVII Международной научной студенческой конференции, Новосибирск, апрель, 1999, стр. 40-41.

4. V.G. Isacova, G.N. Churilov, O.V. Trofimova, L.A. Solovjov, I.E. Sukovataya, N.V.Bulina, S.G. Ovchinnicov, Actnilacetonate Fullerene Derevatives Obtained From Fullerene And Fullerene Soot And Their Biological Activity// Abstract Book Third АРАМ (Asia-Pacific Academy Of Materials) Topical Seminar "Asian Priorities In Materials Development", Novosibirsk, Russia, 7-9 June, 1999, p. 67.

5. I.E. Sukovataya, N. A. Tyulkova. KINETYCS PROPERTIES OF BACTERIAL LUCIFERASES IN WATER-ORGANIC SOLVENTS// Abstract of XIII International Biophysics Congress, Jomal of Biosciences, vol.24, supplement 1, New Delhi, India, 1999, p. 57.

6. И.Е. Суковатая, H.A. Тюлькова. КИНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЛЮЦИФЕРАЗ ИЗ ДВУХ ВИДОВ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ P.LEIOGNATHI И V.HARVEYI В ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКИХ СРЕДАХ.// I Всесибирский конгресс женщин-математиков, Красноярск, 15-18 января, 2000, стр. 217.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Суковатая, Ирина Егоровна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура и каталитические свойства бактериальных люцифераз РЛе^паМ и К/шгуеу/.

1.2. Ферментативный катализ в водно-органических средах.

1.2.1. Роль различных взаимодействий в поддержании нативной конформации белков.

1.2.2. Классификация органических растворителей.

1.2.3. Эффекты воздействия среды на конформацию различных белков.

1.2.4. Роль воды в ферментативном катализе, проводимом в водно-органических средах.

1.2.5. Влияние микроокружения на каталитические свойства ферментов.

1.2.6. Модели действия органических растворителей на белковые макромолекулы.

1.3. Постановка задач исследования.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Влияние органических растворителей на кинетические параметры реакций, катализируемых люциферазами из РЛе'ю^шйЫ и V.кагуеу'г.

3.1.1. Интенсивность свечения люцифераз в водно-органических средах.

3.1.2. Влияние органических растворителей на константу спада биолюминесценции бактериальных люцифераз.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Кинетика биолюминесцентной реакции в нетрадиционных средах"

Люциферазы, флавинсодержащие монооксигеназы, из разных видов светящихся бактерий трансформируют энергию химических связей в световую. Это свойство и определяет пристальный интерес исследователей к этому ферменту. На основе бактериальных люцифераз разрабатываются методы биолюминесцентного анализа, которые характеризуются экспрессивностью и высокой чувствительностью. Ферментативные диагностикумы используются для мониторинга окружающей среды, контроля чистоты воздуха, качества природных и сточных вод, в медицине и гигиене, в сельском хозяйстве и пищевой промышленности [1, 2, 3]. Этим определяется и практический интерес к результатам фундаментальных исследований в области структурно-функциональной организации люциферазы.

Структурно-динамическая организация белков, представляющая собой фундаментальную проблему современной биофизики, включает в себя как баланс межмолекулярных взаимодействий, который приводит к установлению строго определенной структуры белка, так и физические механизмы вариации структуры биополимера, зависящие от биохимической (или функциональной) активности и от заданных внешних воздействий. Для направленного изменения структуры белков наряду с генной инженерией и белковым дизайном одним из перспективных подходов считается "дизайн среды", который предполагает многообразие методов в использовании неводных реакционных сред: мицелл, микроэмульсий, индивидуальных органических растворителей и их смесей, или водно-органических растворов. Моделирование физико-химических свойств среды для ферментативного катализа путем введения органических растворителей в последнее время получило широкое распространение. Помимо практического применения в биотехнологии и медицине методы "неводной" энзимологии позволяют смоделировать многие биохимические процессы 5 функционирование биомембранных белков, окружение ферментов in vivo, сдвиг равновесия каталитических реакций и т.д.) и вызывать при этом неожиданные эффекты: увеличение скорости ферментативного катализа, изменение рН-памяти, субстратной специфичности, термостабильности, количества продукта реакции и каталитических констант, катализ в практически безводных органических растворителях. Введение органических растворителей в реакционные смеси ферментов влияет на микроокружение белка. Активность ферментов в смесях с органическими растворителями определяется их различными физико-химическими характеристиками, такими как гидрофобность, сольва-тирующая способность, геометрия молекулы, диэлектрическая проницаемость, поверхностное натяжение, способность образовывать водородные связи, вязкость, рН-раствора, химическая природа используемого буферного иона [4, 5].

Сравнительное изучение кинетического поведения люцифераз при заданном изменении микроокружения в системах с органическими растворителями представляется одним из перспективных подходов к изучению структуры и свойств фермента. Сопоставление динамики кинетических параметров биолюминесценции с физико-химическими характеристиками среды, окружающей фермент, позволит получить информацию о том, за счет каких взаимодействий происходит образование и распад фермент-субстратного комплекса люцифераз с альдегидами, и расширить представления о самом ферменте и механизмах биолюминесценции.

Целью данной работы является сравнительное изучение кинетики биолюминесцентной реакции, катализируемой люциферазами из двух видов светящихся бактерий Photobacterium leiognathi и Vibrio harveyi при направленном изменении свойств реакционной среды посредством введения органических растворителей. 6

В задачи исследования входило:

1. Исследовать динамику кинетических параметров биолюминесценции люцифераз из двух видов светящихся бактерий РЛею^аШ и У.кап?еу1 при введении органических растворителей в реакционную среду.

2. Оценить применимость термодинамической модели влияния органических растворителей на белки для прогноза денатурирующего действия растворителей на люциферазы.

3. Сопоставить кинетические параметры биолюминесценции, характеризующие различные стадии реакции, со следующими параметрами органических растворителей: параметром гидрофобности (-1о§Р), способностью образовывать водородные связи, донорно-акцепторными свойствами растворителей и диэлектрической проницаемостью.

4. Определить типы взаимодействия органических растворителей с люциферазами по отношению к флавинмононуклеотиду и альдегидам разной длины цепи. 7

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Суковатая, Ирина Егоровна

ВЫВОДЫ

1. Введение органических растворителей в реакционную среду в небольших концентрациях (0,5-18об.%) вызывает активацию начальной скорости биолюминесцентной реакции, которая выражается в возрастании начальной скорости и квантового выхода реакции. Увеличение интенсивности свечения с альдегидами разной длины цепи составляет от 110 до 170% для люциферазы P.leiognathi и от 110 до 370% для люциферазы V.harveyi. При более высоких концентрациях органические растворители ингибируют биолюминесцентную реакцию, катализируемую люциферазами Photobacterium leiognathi и Vibrio harveyi.

2. Люцифераза V.harveyi более стабильна к действию органических растворителей: для ее инактивации, также как и для активации требуется большая концентрация органического растворителя, чем для люциферазы P.leiognathi.

3. Изменения кинетических параметров реакции как интенсивности свечения, так и константы спада светоизлучения биолюминесцентной реакции при добавлении органических растворителей для люциферазы P.leiognathi в большей мере связаны с длиной цепи используемого альдегида, тогда как для люциферазы V.harveyi зависят от природы и свойств используемого растворителя.

116

4. Ингибирующий эффект органических растворителей на лю-циферазы коррелирует с константой их гидрофобности (-^Р) и денатурирующей силой (ДС) с низкими коэффициентами линейной корреляции (50-80%), но эти параметры могут быть использованы для прогноза ингибирующего действия органических растворителей на люциферазы.

5. С увеличением концентрации органических растворителей возрастает Км по Си для обеих люцифераз и по Сю для люциферазы У.кап>еу1, и уменьшается Км по С12 и Сю для люциферазы РЛе^пшЫ, то есть, при связывании люцифераз с альдегидами в первом случае преобладают гидрофобные, а во втором - электростатические взаимодействия.

6. Эффект введения органических растворителей характеризуется различными типами взаимодействий этих эффекторов с люци-феразами, и зависит от концентрации растворителя и используемого субстрата. Общей чертой взаимодействия растворителей с лю-циферазами является конкурентный тип ингибирования реакции только с тетрадеканалем, что позволяет сделать предположение о специфическом связывании этих растворителей в области дисталь-ной метальной группы тетрадеканаля.

117

7. При введении в реакционную смесь органических растворителей с диэлектрической проницаемостью меньшей, чем у воды, происходит уменьшение константы спада светоизлучения или стабилизация возбужденного интермедиата, которая зависит от донорно-акцепторных свойств растворителя и типов взаимодействий люцифераз с субстратами. То есть, уменьшение константы спада светоизлучения наблюдается в полярных апротонных растворителях (ДМСО, ацетон) и в присутствии спиртов для реакции люцифераз с теми альдегидами, которые взаимодействуют с ними гидрофобно {У.кап?еу1 с деканалем и тет-радеканалем, РЛею^аШ с терадеканалем). При введении в реакционную смесь органических растворителей с диэлектрической проницаемостью большей, чем у воды (формамид), происходит возрастание константы спада светоизлучения или дестабилизация возбужденного интермедиата для обеих люцифераз с тетрадеканалем, вероятно, за счет ослабления электростатических взаимодействий при повышения диэлектрической проницаемости среды. iis

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Суковатая, Ирина Егоровна, Красноярск

1. Гительзон И.И., Рыгов С.А. и др. Биолюминесцентный способ определения активности антипротеаз.// Бил. эксп. биол. и мед., 1989, т. 100, N 11, с. 629-630.

2. Воеводина Т.В., Нифантьева О.Е. и др. Изучение степени интоксикации больных при перитонитах.// Лабораторное дело, 1990, N 9, стр. 23-25.

3. Кратасюк В.А., Гительзон И.И. Бактериальная биолюминесценция и биолюминесцентный анализ.// Биофизика, 1982, т.27, вып. 6, с. 937-953.

4. Гладилин А.К., Левашов А.В. Стабильность ферментов в системах с органическими растворителями.//Биохимия, 1998, т. 63, вып. 3, с. 408-421.

5. Gupta, M.N. Enzyme function in organic solvents.// Eur. J. Biochem., 1992, vol. 203, p. 25-32.

6. Гительзон И.И., Родичева Э.К. и др. Светящиеся бактерии.-Новосибирск: Наука, 1984.

7. Huang S., Tu S-C. Identification of a catalytic base in bacterial luciferase by chemical rescue of a dark mutant. //Biochem., 1997, vol. 36, N 48, p. 1460914615.

8. Escher А., О Kane D.J., Szalay A.A. The (3-subunit polypeptide of V.harveyi luciferase determines light emission at 42°C. //Mol.Gen.Genet., 1991, vol.230, p.385-393.

9. Fisher AJ, Raushel F.M., Baldwin T.O, Rayment I. Three-dimensional structure of bacterial luciferase from Vibrio harveyi at 2.4 A resolution. //J.Biol.Chem., 1995, vol. 34, N 20, p.6581-6586.

10. Fisher A.J., Thompson T.B., Thoden J.B., Baldwin Т.О., Rayment I. The 1.5 A resolution crystal structure of bacterial luciferase in low salt conditions.// J. Biol. Chem., 1996, vol. 271, N 34, p.21956-21968.119

11. Moore S.A., James M.N.G., О Kane D.J., Lee J. Crystal structure of a flavoprotein related to the submits of bacterial luciferase. //The EMBO Journal, 1993, vol.12, N5, p.1767-1774.

12. Sandalova Т., Lindqvist Y. Three-dimensional model of the a-subunit of bacterial luciferase. //Proteins: structure, function, genetics, 1995, vol.23, p.241-255.

13. Протопопов А.И.,Сандалова Т.П. Структурно-филогинетический анализ бактериальных люцифераз.// Препринт N73B СО АН СССР, Институт физики им. Л.В.Киренского, Красноярск, 1987.

14. Waddle J.J., Johnston T.C., Baldwin Т.О. Polypeptide folding and dimerization in bacterial luciferase occur by a concerted mechanism in vivo. //Biochemistry, 1987, vol.26, p.4917-4921.

15. Kuwabara S., Cjrmier M.J., Dure L.S. at all. Crystalline bacterial luciferase from Photobacterium fisheri.H Biochemistry, 1965, vol.53, p. 822-828.

16. Baldwin Т.О., Nicoli M., Becvar J.E., and Hastings J.W. Bacterial luciferase: binding of oxidized flavin mononucleotide. //J.Biol.Chem., 1975, vol.250, N8, p. 2763-2768.

17. Baldwin Т.О., Chen L.H. at all. Site-directed mutagenesis of bacterial luciferase: Analysis of the "essential" thiol. //Biolum. Chemilum., 1989, vol.4, p.40-48.

18. Meighen E.A., Hastings J.W. Binding site determination from kinetic data. //J.Biol.Chem., 1971, v.246, p.7666-7674.

19. Lee J. The mechanism of bacterial bioluminescence. //Chemi- and Bioluminescence, Marcel Dekker, New York, 1985.120

20. Mitchel G., Hastings J.W. The effect of flavin isomers and analogues upon color of bacterial bioluminescence. //J.Biol.Chem., 1969, vol.244, N10, p.2572-2576.

21. Ghisla S., Massey V., Yagi K. Preparation and some properties of 6-substituted flavins as active site probes for flavin enzymes. //Biochemistry, 1996, vol. 25, p. 3282-3289.

22. Межевикин B.B., Заворуев B.B., Высоцкий E.C., Получение и некоторые свойства «альдегидного фактора» из светящихся бактерий. //Изв. СО АН СССР, 1981, №15, Сер. биол. наук, вып.З, с.49-53.

23. Петушков В.Н., Кратасюк Г.А., Родионова Н.С., Фиш A.M., Белобров П.И. Биферментная система NAJDHiFMN-оксидоредуктаза-люцифераза из светящихся бактерий. //Биохимия, 1984, т.49, вып.4, с.692-702.

24. Петушков В.Н., Родионова Н.С., Белобров П.И. Изучение эффективности работы биферментной системы NADHiFMN-оксидоредуктаза-люцифераза из светящихся бактерий. //Биохимия, 1985, т.50, вып.З, стр.401-405.

25. Родионова Н.С., Петушков В.Н., Белобров П.И. Кинетические особенности переключения бактериальной люциферазы с одного альдегидного субстрата на другой. //Биофизика, т.ХХХШ, вып.З, с.396-400.

26. Блюменфельд JI.A. Проблемы биологической физики. М: Наука, 1977, 336с.

27. Holzman T.L., Baldwin Т.О. Isolation of bacterial luciferases by affinity chromatography on 2,2-diphenylpropylamine-sepharose: phosphate-mediated binding to an immobilized substrate analogue. // Biochemistry, 1982, vol.21, p.6194-6201.

28. Данилов B.C., Егоров H.C. Мультиферментная модель бактериальной люциферазы. //Боорг.химия, 1981, т.7, N11, с. 1605-1626.

29. Balny С., Hastings J.W. Fluorescence and bioluminescence of bacterial luciferase intermediates. // Biochemistry, 1975, vol. 14, N21, p.4719-4722.121

30. Hastings J.W., Balny С. The oxygenated bacterial luciferaseflavinintermediate. Reaction products via the light and dark pathways. // J.Biol.Chem., 1975, vol.250, N18, p.7288-7293.

31. Xi.L., Tu S-C. Construction and characterization of hybrid luciferases coded by lux genes from X. Luminescens and V. Fisheri. //Photochem. Photobiol., 1993, vol.57, N4, p.714-719.

32. Тюлькова H.A., Сандалова Т.П. Сравнительное изучение температурных эффектов на бактериальные люциферазы. //Биохимия, 1996, т. 61, N2, с.205-214.

33. Francisco W. A., Abu-Soud Н. М., Topgi R., Baldwin Т. О., Raushel F. М. Interaction of bacterial luciferase with 8-substituted flavin mononucleotide derivatives. // J.Biol.Chem., vol. 271, N 1, 1996 p. 104-110.

34. F. Mc Capra F. Mechanisms in chemiluminescence and bioluminescence -unfinished business. //Biolum. Chemilum., 1992, p.7-15.

35. Raushel F.M. and Baldwin Т.О. Proposed mechanism for the bacterial bioluminescence reaction involving a dioxirane intermediate. //Biochem. and Biophys. Reseach Communication, 1989, vol.164, N 3, p.1137-1142.

36. Baldwin Т.О. Deuterium Kinetic Isotope Effects and the Mechanism of the Bacterial Luciferase Reaction. // Biochemistry, 1998, vol. 37, p.2596-2606.

37. Tu, S-C. Isolation and properties of bacterial luciferase-oxygenated flavin intermediate complexed with long-chain alcohols. //Biochemistry, 1979, vol.18, N26, p.5940-5945.

38. Francisco, W.F., Abu-Soud, H.M., Baldwin Т.О., Raushel F.M. Interaction of bacterial luciferases with aldehyde substrates and inhibitors. //The Journal of Biologicol Chemistry, 1993, vol.268, N33, p. 24734-24741.

39. Curry S, Lieb W.R., and Franks N.P. Effects of general anesthetics on bacterial luciferases enzyme from Vibrio harveyi: An anesthetic target site with differential sensitive. // Biochemistry, 1990, vol. 29, p.46441-4652.

40. Диксон M., Уэбб Э., Ферменты,- Москва: Издатинлит, 1961.12242: Шульц, Г., Ширмер, Р., Принципы структурной организации белков.-Москва: Мир, 1982.

41. Рубин А.Б, Биофизика, кн.1.- Москва: Высшая школа, 1987.

42. Волькенштейн М.В, Биофизика.- Москва: Высшая школа, 1989.

43. Цоу Чун-Лу Роль гибкости активного центра в ферментативном катализе. //Биохимия, 1998, том 63, вып. 3, с. 300-307.

44. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. Москва: Высшая школа, 1989, с. 38-41.

45. Heris P.L., Severean F. FTIR spectroscopic characterization of protein structure in aqueous and nonaqueous media. // J.Mol.Catalysis B: Enzymatic, 1999, vol.7, N 1-4, p. 201-221.

46. Райхард X. Растворители и эффекты среды в органической химии. -Москва: Мир, 1991.

47. Фиалков Ю.А. Растворитель как средство управления химическим процессом. Ленинград: Химия, 1990.

48. Фиалков Ю.А. Не только в воде.- Ленинград: Химия, 1989.

49. Klibanov, A.M. Enzymatic catalysis in anhydrous organic solvents. // TIBS, 1989, vol.14, p.141-149.

50. Zaks A., Klibanov A.M. Enzyme-catalyzed processes in organic solvents. //Proc. Natl. Acad. Sci., 1985, vol. 82, N 10, p. 410-415.

51. Хургин, Ю.И., Азизов Ю.М., Абатуров Л.В., Коган, Г.А., Росляков В.Я. Влияние /JMSO на вторичную структуру некоторых глобулярных белков. //Биофизика, 1972, XVII, с. 390-395.

52. Arnold, F.H. Protein design for non-aqueous solvents.// Protein Engineering, 1988, N2, p.21-25.

53. Zaks, A., Klibanov, A.M. Enzymatic catalysis in organic media at 100°C. // Science, 1984, vol. 224, p. 1249-1251.

54. Клесов A.A., Березин И.В. Ферментативный катализ.- Из-во МГУ, 1980, стр.144.123

55. Schmitke J.L., Stern L. J., and Klibanov A. M. The crystal structure of subtilisin Carlsberg in anhydrous dioxane and its comparison with those in water and acetonitrile. // Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, vol. 94, p. 4250-4255.

56. Пожарский Э.В., Зенченко T.A. Упругие свойства триклинных кристаллов лизоцима в безводном растворителе. // Биофизика, 1998, т.43, вып. 1, с.31-34.

57. Serralheiro M.L.M. Irreversible thermoinactivation of a-chymotrypsin in buffer and water miscible organic solvent. Comparison with a reverse micellar system. //Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 1999, vol.7, N1-4, p.191-205.

58. Тяги P., Гупта M.H. Использование химической модификации и химического сшивания для стабилизации белков (ферментов). //Биохимия, 1998, том 63, вып. 3, с. 395-407.

59. Ке Т., Klibanov, A.M. On enzymatic activity in organic solvents as a enzyme history. //Biotech.Bioeng., 1998, vol.57, N 6, p. 746-750.

60. Khmelnitsky Yu.l., Mozhaev V.V., Belova A.B., Sergeeva M.V., Martinek K. Denaturation capacity: a new quantitative criterion for selection of organic solvents as reaction media in biocatalysis. //Eur. J. Biochem., 1991, vol. 198, p.31-41.

61. Mozhaev V.V., Khmelnitsky Y.L. at all. Catalytic activity and denaturation of enzymes in water/organic cosolvent mixtures. //Eur. J. Biochem., 1989, vol.184, p. 597-602.

62. Клибанов A.M., Семенов А. Ферментативные реакции в водноIорганических смесях: критерий для выбора оптимального органического растворителя. //Биоорганическая химия, 1978, т. 4, N1, с. 82-88.124

63. Можаев В.В. Стабильность белков. Рациональные подходы к повышению стабильности ферментов.//Новости науки и техники, 1990, N. 7, с. 20-47.

64. Herskovits Т.Т., Gadegbecu В., Jaillet H. On the structural stability and solvent denaturation of proteins. //J.Biol.Chem., 1970, v.245, N 10, p. 25882589.

65. Faller L., Sturtevant J.M., The kinetics of the a-chymotrypsin catalyzed hydrolysis of p-nitrophenyl acetate in organic solvent-water mixtures. //J. Biol.Chem., 1966, vol.241, N21, p. 4825-48-34.

66. Maurel P. Relevance of dielectric constant and hydrophobicity to the organic solvent effect in enzymology. // J. Biol.Chem., 1978, vol.253, N 5, p. 1677-1683.

67. Нарижнева H.B., Уверский B.H. Понижение диэлектрической проницаемости среды трансформирует белковую молекулу в состояние расплавленной глобулы. //Биохимия, 1998, том 63, вып. 4, с. 532-540.

68. Peters, G.H., van Aalten, D.M.V., Edholm, О., and Bywater, R. Dinamics of proteins in different solvent systems: analysis of essential mation in lipase. // Biophys. J., 1996, vol.71, N 5, p. 2245-2255.

69. Forsythe K.H., Hopfinger A.J. The influence of solvent on the secondary structures of poly(L-alanine) and poly(L-proline). //Macromolecules, 1973, vol.6, N3,p.423-438.125

70. Пучкарев А.В., Метелица Д.И. Каталитическая активность глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы в водно-органических средах. //Прикладная биохимия и микробиология, 1992, т.28, с. 27-32.

71. Заводник И.Б., Лапшина Е.А. Влияние диэлектрических свойств среды на стабильность глобулярных белков и мембран. // Биофизика, 1997, т.42, р.1035-1039.

72. Сапежинский И.И., Донцова Е.Г. О фотохемилюминесценции растворов глицин-триптофана. Влияние органических растворителей на хемелюминесценцию. // Биофизика, 1972, t.XVII, стр. 406-411.

73. Fink A.L. Effect of dimethyl sulfoxide on the interaction of proflavine with a-chymotrypsin. // Biochemistry, 1974, vol.13, N 2, p. 277-280.

74. Affleck R., Naynes C.A., Clark D.S. Solvent dielectric effects on protein dynamics. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol.89, p. 5167-5170.

75. Рожков С.П., Борисова, А.Г. Фазовый переход критического типа в водно-белковой матрице молекул сывороточного альбумина, индуцируемый солью. //Биофизика, 1993, т.38,вып.4, стр. 590-595.

76. Leikin S., Parsegian V. A., Yang W.-H., and Walrafen G. E. Raman spectral evidence for hydration forces between collagen triple helices. //Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, vol. 94, p. 11312-11317.

77. Shan S. and Herschlag D. The change in hydrogen bond strength accompanying charge rearrangement: Implications for enzymatic catalysis. //Proc. Natl. Acad. Sci., 1996, vol. 93, p. 14474-14479.

78. Cleland W. W., Frey P. A., and Gerlt J. A. The Low Barrier Hydrogen Bond in Enzymatic Catalysis. //J.Biol.Chem., 1998, vol. 273, N 40, p. 25529-25532.

79. Kuznetsova N, et al. Solvent hydrogen-bond network in protein self-assembly: solvation of collagen triple helices in nonaqueous solvents. // Biophys. J., 1997, vol.72 N1, p.353-62.

80. Хоштария Д.Э. Зависимость константы скорости реакции от вязкости среды и энергетические параметры элементарного биохимического акта. //Биофизика, 1986, том XXXI, вып. 3, с. 391-394.126

81. Ступишина Е.А, Вершинина В.И, Влияние вязкости среды на кинетику ферментативной реакции, катализируемой бактериальной рибонуклеазой. //Биохимия, 1998, том 83, вып. 11,с. 1503-1508.

82. Stigter D., Alonso D.O.V., Dill К.А. Protein stability: electrostatics and compact denatured states. //Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1991, vol.88, p. 41764180.

83. Inouye K., Lee S-B., Nambu K., Tonomura B. Effects of pH, temperature, and alcohol on the remarkable activation of thermolysin by salts. // J. Biochem. (Tokyo), 1997, vol.122 (2), p. 58-64.

84. Inouye K., Lee S-B., Tonomura B. Effects of nitration and amination of tirosyl residues in thermolysin on its hydrolytic activity and its remarkable activation by salts. // J. Biochem. (Tokyo), 1998, vol.124, p. 72-78.

85. Илларионов Б.А., Тюлькова H.A., патент N2073714 на изобретение Штамм бактерий Escherichia coli продуцент бактериальной люциферазы., 1997.

86. Tjulkova N.A., Purification of bacterial luciferase from Photobacterium leiognathi with use FPLS-system. //Biological luminescence/ B.Jezowska-Trzebiatowska, B.Kochel et al., W.S,Singapore. 1989, p.369-374.

87. Келети T, Основы ферментативной кинетики.,- Москва: Мир, 1990.

88. Эме Ф, Диэлектрические измерения, Москва: Химия, 1967, стр.123.