Роль отдельных аминокислотных остатков в биолюминесценции Ca2+-регулируемых фотопротеинов

Наташин, Павел Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль отдельных аминокислотных остатков в биолюминесценции Ca2+-регулируемых фотопротеинов
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль отдельных аминокислотных остатков в биолюминесценции Ca2+-регулируемых фотопротеинов"

На правах рукописи

Наташин Павел Викторович

РОЛЬ ОТДЕЛЬНЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ Са2+-РЕГУЛИРУЕМЫХ ФОТОПРОТЕИНОВ

03.01.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 6 НАР 2014

Красноярск - 2014

005545644

Работа выполнена на кафедре биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Сибирский федеральный университет» и в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН (г. Красноярск)

Научный руководитель:

Высоцкий Евгений Степанович - кандидат биологических наук, Институт биофизики СО РАН, заведующий лабораторией.

Официальные оппоненты:

Овчинников Сергей Геннадьевич - доктор физико-математических наук, профессор, Институт физики им. Л.В. Киренского СО РАН, заведующий лабораторией.

Савицкий Александр Павлович - доктор химических наук, профессор Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, заведующий лабораторией.

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.И. Ломоносова, Химический факультет, Кафедра химической энзимологии.

Защита состоится «ОУ » оа^^а^л^ 2014 г. вЮ-Оочас. на заседании диссертационного совета Д003.007.01 при Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, д. 50, стр. 50. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН Электронная версия доступна по адресу:_ к ь/1/ ilp.ru,_

Автореферат разослан 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Франк Л.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биолюминесценция является широко распространенным в природе явлением. Светящиеся виды обнаружены среди живых организмов, различающихся не только средой обитания, но уровнем структурной организации. За последние время было сделано множество предположений о причинах возникновения биолюминесценции, а также важности данного явления для живых организмов.

К настоящему времени большинство охарактеризованных биолюминесцентных систем принадлежит к так называемому целентеразин-зависимому типу, где субстратом биолюминесцентной реакции является целентеразин. Наиболее изученными представителями целентеразин-зависимых систем являются Са2+-ре1улируемые фотопротеины морских кишечнополостных животных.

Большой интерес с теоретической и практической точки зрения вызывают результаты, полученные при изучении спектральных и кинетических свойств мутантов фотопротеинов с аминокислотными заменами в активном центре белка. Единичные замены определенных аминокислотных остатков в молекуле белка приводят к изменениям спектров биолюминесценции фотопротеинов и кинетики биолюминесцентной реакции. Исследования последних лет позволили высказать предположения относительно функции некоторых аминокислотных остатков в биолюминесценции фотопротеинов. Однако для более глубокого изучения данного вопроса целесообразно всесторонне исследовать свойства различных мутантов фотопротеинов, в том числе их пространственную организацию.

Выяснение особенностей протекания биолюминесцентной реакции Са2+-регулируемых фотопротеинов на молекулярном уровне, а именно установление конкретной роли аминокислот активного центра белка, является первоочередной задачей, поскольку это даст возможность вывести применение данных белков на совершенно новый качественный уровень, позволяя целенаправленно изменять биохимические свойства и создавать

биолюминесцентные белки с улучшенными или измененными характеристиками (увеличенная удельная активность, заданные спектральные свойства, измененная кинетика активности, термостабильность и т. д.) применительно к каждой конкретной задаче.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось выяснение функциональной роли отдельных аминокислот активного центра Са2+-регулируемых фото протеинов в процессе биолюминесценции. Выполнение исследования требовало решения следующих задач:

1. Найш условия кристаллизации для мутантов обелина с заменой Туг138 на РЬе (У138Р) и РЬе88 на Туг (Т88У) для двух ¡информационных состояний - до и после биолюминесцентной реакции, т.е. связанных с субстратом, 2-гидропероксицелентеразином, и с продуктом реакции, целентерамидом, и ионами кальция, соответственно.

2. Получить дифракционные данные от кристаллов и построить модели кристаллических структур мутангных белков по установленной электронной плотности.

3. Исследовать биолюминесцентные свойства мутанта обелина У138Р.

4. Отработать технологию получения анаэробного комплекса апо-обелин-целентеразин и исследовать его свойства.

При решении поставленных задач были получены результаты, которые выносятся на защиту:

1. Пространственные структуры двух копформационных состояний (до и после биолюминесцентной реакции) мутанта обелина У138Р и его биолюминесцентные свойства доказывают участие молекулы воды, расположенной в субстрат-связывающей полости фотопротеинов, в реакции декар боксилирования 2-гадропероксицелентеразина через протонирование диоксиэтанонового интермедиата. Остаток Туг138 необходим для оптимальной ориентации молекулы воды относительно субстрата для обеспечения максимальной скорости биолюминесцентной реакции.

2. Пространственные структуры двух конформациошшх состояний (до и после биолюминесценшой реакции) мутанта обелина F88Y, имеющего спектр биолюминесценции, практически совпадающий со спектром биолюминесценции акворина, доказывают, что отличие спектров биолюминесценции этих Са2+-регулируемых фотопротеинов обусловлено различной организацией сети водородных связей около атома кислорода 6-(и-гидрокси)-фенильной группы 2-гидропероксицелептеразина, зависящей от присутствия Phe или Туг в полости белка.

3. В анаэробных условиях апо-обелин и целентеразин образуют прочный комплекс. В анаэробном комплексе целентеразин связан в двух формах -протопировашгой и в форме С2(-)-аниона. Процесс образования активного фсггопротеина при экспозиции анаэробного комплекса апо-обелин-целентеразин кислороду протекает в несколько стадий. His 175 в обелине играет ключевую роль в формировании активного фотопротеина, выполняя функцию переносчика протона при образовании 2-гидропероксицеленгеразина.

Научная новизна и практическая ценность. Все результаты, представленные в данной работе, получены впервые и имеют фундаментальный характер, поскольку добавляют новую информацию к пониманию роли отдельных аминокислотных остатков в биолюминесценции фотопротеинов кишечнополостных. Они найдут свое применение в фундаментальных и прикладных исследованиях. Например, установление роли отдельных аминокислотных остатков в биолюминесценции фотопротеинов в будущем позволит повысить эффективность аналитического применения фотопротеинов, в особенности при их использовании в качестве репортерных молекул in vitro и от vivo, поскольку появится возможность конструировать мутантные формы фотопротеинов с заранее планируемыми физико-химическими свойствами применительно к каждой конкретной задаче при разработке новых биолюминесцентных технологий для биологии и медицины.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на Международном симпозиуме SISCS1 2012 (г. Куньмин, КНР, 2012 г.), на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН, на объединенных биолюминесцентных семинарах Сибирского федерального университета и семинарах Национальной лаборатории биологических макромолекул Института биофизики Пекина (КИР).

Публикации. Результаты исследований опубликованы в 3-х статьях в рецензируемых журналах и включены в международную базу данных PDB. Структура и объем работы. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение результатов исследования, заключение, выводы и список цитируемой литературы (134 источника). Диссертационная работа проиллюстрирована 39 рисунками, содержит 5 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клонирование и конструирование экспрессионных плазмид для обелила из Obelia longissima и его мутантов Y138F и F88Y было выполнено старшим научным сотрудником лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН Марковой C.B. Олигонуклеотид-направленный мутагенез проводили методом ПЦР с использованием Quick-Change site-directed mutagenesis kit.

Трансформированные клетки Е. coli (штаммы BL21-RIL и XL 1-Blue) культивировали в LB-среде, содержащей ампициллин. Индукцию осуществляли добавлением ИПТГ. Выделение и очистку рекомбинантных белков, их мутантных форм проводили по схемам, разработанным в лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН. Апобелки выделяли из телец включений, проводили рефолдинг с субстратом целентеразином и очищали с помощью ионообменной хроматографии.

Измерение кинетики биолюминесценции обелина дикого типа и его мутанта Y138F с помощью метода остановленной струи проводили на приборе Applied Photophysics SX20 с объемом камеры 20 мкл и мертвым

временем 1,1 мс. Температурный контроль осуществлялся циркулированием воды через водную баню (20°С).

Поиск условий кристаллизации выполняли, используя 672 коммерческих раствора с помощью робота Mosquito и 96-луночпого планшета методом сидячей капли. Дифракционные данные получали при облучении кристаллов длинной волны 0,9789 А с использованием рентгеновского излучения синхротрона (BL17U1, SSRF, Китай). Фазы рассчитывали в программе PHASER методом молекулярных замещений с использованием структур обелила и Са2+-разряженнош обелина из О. longissima (коды в PDB банке 1QV0 и 2F8P) в качестве модельных. Модели белков строили с помощью программы PHENIX. Расчет параметров модели и ее усовершенствование выполняли при помощи программ REFMAC5 (CCP4Í) и COOT.

Для анаэробного эксперимента удаление молекулярного кислорода из образцов и растворов проводилось путем вакуумного дегазирования (10 - 15 циклов) с использованием азота в качестве газового заместителя. Все этапы получения анаэробного апо-обелин-целентеразинового комплекса были проведены внутри анаэробной камеры Forma Anaerobic Station, Thermo Fisher. Для получения апо-обелин-целентеразинового комплекса дегазированный апо-обелин в 6 M мочевине разводился в активационном растворе, содержащем целентеразин и инкубировался в анаэробной камере в течение ночи. Для очистки образца от несвязанного целентеразина проводилась ионообменная хроматография на колонке Q Sepharose Fast Flow. Фракции желтого цвета собирались и концентрировались с помощью центрифужных концешратрационных ячеек. Для инструментальных измерений образец полученного чистого анаэробного апо-обелин-целентеразинового комплекса помещали в кювету с герметично запечатываемой крышкой (#117.104-QS; Hellma Analytics) и плотно запечатывали во избежание проникновения кислорода в образец. Спектры поглощения апо-обелин-целентеразинового комплекса в отсутствие и при

наличии кислорода измеряли на двухлучевом спектрофотометре Hitachi U-2010 против чистого буфера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Пространственные структуры обелина Y138F (разрешение 1,72 А) и Са2+-разряженного обелина Y138F (разрешение 1,3 А). Каталитическая функция молекулы воды и роль Туг138 в биолюминесцентной реакции

Кристаллические структуры обелина Y138F со связанным 2-гидропероксицелентеразином и Са2+-разряженного обелина Y138F со связанным целентерамидом сохраняют глобулярную пространственную организацию (рис. 1), характерную для всех Са2+-регулируемых фотопротеинов в аналогичных лиганд-зависимых конформационных состояниях. Среднеквадратичное отклонение (RMSD) атомов основной цепи обелина

Рис. 1. А - структурное сравнение обелина У138Р (желтый) и дикого обелина (зеленый). 2-гидропероксицелентеразин показан в центре белковой глобулы;. Б - структурное сравнение Са2+-разряженного обелина У138Р (синий) и Са2+-разряженного дикого обелина (золотой). Целентерамид показан в центре белковой глобулы, Са2+ - в виде сфер.

У138Р и дикого обелина всего 0,3 А. Для структур Са2+-разряженных конформационных состояний обелина У138Р и дикого обелина ЯМББ атомов основной цепи - 1,52 А. ЯМББ атомов основной цепи обелина У138Р и Са2+-разряженного обелина У138Р составляет 2,46 А, что несколько

больше, чем отклонение, получаемое при сравнении структур дикого обелина в тех же конформационных состояниях, равное 1,92 А. Несмотря на это, в пространственных структурах дикого обелина и его мутанта У138Р происходят практически одинаковые изменения в ответ на связывание ионов Са2+, например, конформационная трансформация С-концевого домена гораздо выше, чем Ы-концевого домена.

Организация субстрат-связывающей полости обелина У138Р, связанного с 2-гидропероксицелентеразином, аналогична таковой у обелина дикого типа. Более того, все аминокислотные остатки имеют схожее местоположение (рис. 2). Есть только одно, но очень важное отличие - во внутренней полости обелина У138Р отсутствует молекула воды, обозначенная в положении у дикого обелина (рис. 2).

Рис. 2. Изображение структурного наложения 2-гидропероксицеленте-разина в окружении ключевых аминокислотных остатков активного центра обелина дикого типа (зеленый) и обелина У138Р (желтый). Молекулы воды показаны в виде сфер соответствующего цвета.

В целентерамид-связывающей полости Са2+-разряженного обелина У138Р, в сравнении с обелином дикого типа в соответствующей конформации, практически все аминокислотные остатки сохраняют свое положение. Наиболее важной находкой в структуре целентерамид-связывающей полости Са2+-разряженного обелина У138Р (рис. 3) является молекула воды \У2, которая, как было описано выше, отсутствует в структуре обелина У138Р со связанным 2-гидропероксицелентеразином (рис. 2).

Рис. 3. изображение структурного наложения целентерамида в окружении ключевых аминокислотных остатков активного центра обелина дикого типа (золотой) и обелина У138Р (синий). Молекулы воды показаны в виде сфер соответствующего цвета.

На рисунке 4 показаны поверхности белковых глобул обелина У138Р и обелина дикого типа в двух конформационных состояниях, до и после биолюминесцентной реакции. Несмотря на то, что связывание ионов Са2+ незначительно влияет на пространственную структуру фотопротеинов, этих изменений вполне достаточно для образования открытого растворителю отверстия на поверхности белковой глобулы (рис. 4Б), что, по-видимому, связано со смещением остатков Ьуз45 и 8ег142. Вероятнее всего, молекула воды попадает внутрь целентерамид-связывающей полости Са2+-

разряженного мутанта через данное отверстие.

Замена Туг на РЬе в 138 положении не приводит к потере функциональной активности обелина, но некоторые биолюминесцентные характеристики меняются заметно. Значение константы подъема кинетики биолюминесцентной реакции уменьшается с 476,5± 1,4 сек"1 у дикого обелина до 305,3±1,4 сек"' у обелина У138Р. То есть мутационная замена остатка Туг снижает скорость подъема кинетики биолюминесцентной реакции в 1,5 раза.

Значение констант спада кинетики биолюминесцентной реакции обелина У138Р также уменьшается: к\ и к2 для обелина дикого типа равны 43,6±0,23 сек"1 и 5,0±0,01 сек"1, соответственно, тогда как у описываемого мутанта 13,7±0,3 сек"1 и 0,06±0,0003 сек"1. Кроме того, мутация повышает вклад «быстрой» и уменьшает вклад «медленной» компоненты на фазе спада.

РНЕ-138 А1_А-46\ ТУК-190

Рис. 4. Изображение поверхностей белковых глобул обелина У138Р в двух конформационных состояниях. А - обелин У138Р (с 2-гидроперокси-целентеразином). Б - Са2+-разряженный обелин У138Р. Доступное растворителю отверстие на поверхности показано желтой стрелкой.

2-гидропероксицелентеразин и аминокислотные остатки показаны в виде серых палочек. Молекулы воды показаны в виде сфер голубого цвета.

Максимум спектра биолюминесценции дикого обелина составляет 480 нм с небольшим плечом на 400 нм. Замена Туг на РЬе приводит к смещению максимума биолюминесценции в длинноволновую область на 10 нм и снижению интенсивности сигнала на 400 нм. Тем не менее, оба обелина в Са2+-разряженном состоянии имеют сходные спектры флуоресценции с максимумом примерно 510 нм.

Таким образом, учитывая полученные данные по спектрам, кинетике и кристаллическим структурам исследуемых белков, мы можем сделать вывод, что отсутствие молекулы воды \У2 во внутренней полости обелина У13 8 Р в начальный момент после связывания Са2+ является причиной снижения скорости биолюминесцентной реакции. Поскольку молекула воды \¥2 появляется в полости, скорее всего, путем диффузии через открывающееся отверстие на поверхности белковой молекулы, биолюминесцентная реакция все же происходит, но с замедленной кинетикой по сравнению с обелином дикого типа, в котором данная молекула воды изначально находится в положении около амидного азота целентерамида. Полученные результаты

подтверждают гипотезу о том, что молекула воды выполняет каталитическую функцию в реакции декарбоксшшровапия 2-гидропероксицелентеразина через протонирование диоксиэтанон-аниона перед его распадом с образованием СОг и возбужденного амид-аниона целентерамида. Остаток Туг138 необходим для оптимальной ориентации молекулы воды относительно субстрата для обеспечения максимальной скорости биолюминесцентной реакции.

2. Пространственные структуры о белила Г88У (разрешение 2,09 А)и Са2+-разряженного обелина Г88У (разрешение 1,5 А). Структурные основы особенностей спектров биолюминесценции Са2+-регулируемых фотопротепнов

Кристаллические структуры обелина Р88У со связанным 2-гадро-пероксицелентеразином и Са2+-разряженнога обелина Р88У со связанным целентерамидом и Са2+ имеют компактную глобулярную пространственную организацию. Обе описываемые структуры идентичны пространственным структурам дикого обелина в тех же конформационных состояниях. ИМБИ атомов основной цепи обелина Р88У и дикого обелина составляет 0,36 А, а для структур Са2+-разряженных конформационных состояний данных белков - 1,71 А, при этом практически все основные различия отмечаются в районе «ЕР-Ьапс1» петли Ш С-концевого домена. Дикий обелил и его мутант Б88У показывают одинаковые изменения пространственной организации в ответ на связывание Са2+. Следует отметить, что МИЖ атомов основной цепи для обелина Р88У и дикого акворина равно 0,78 А, что почти идентично значению для дикого обелина и дикого акворина (0,8 А).

На рисунке 5А показана сеть водородных связей, образованная между атомами 2-гидропероксицелентеразина и некоторых ключевых аминокислот обелина Р88У. Остатки Шэ22 и Туг88 связаны водородными связями с кислородом 6-(и-гидрокси)-фенильной группы целентеразина, а №-атом Тгр92 связан с гадроксшгьной группой Тут88, тогда как в обелине дикого типа кислород 6-(и-гадрокси)-фепильной группы целентеразина образует

водородную связь только с His22. В то же время системы водородных связей акворина и обелина F88Y практически идентичны. Сеть водородных связей в акворине, формируемая триадой His 16—Туг82-Тгр86, подобна системе связей у обелина F88Y (His22-Tyr88-Trp92) и имеет аналогичные обелину F88Y отличия от обелина дикого типа.

Система водородных связей, образованная между целентерамидом и ключевыми аминокислотными остатками Са2+-разряженного обелина F88Y, показана на рисунке 5Б. После биолюминесцентной реакции His22 и Туг88 сохраняют свое местоположение и образуют водородные связи с атомом кислорода уже 5-(и-гидрокси)-фенильпой группы целентерамида, а Тгр92 остается связанным с Туг88. То есть можно сказать, что система водородных связей, образованная данной триадой аминокислотных остатков, идентична системе связей в структуре белка до биолюминесцентной реакции. В Са2+-разряженном диком обелине His22, Phe88 и Тгр92 также остаются на своих местах, a His22 образует водородную связь с кислородом 5-(и-гадрокси)-фепилышй группы целентерамида. Поэтому можно заключить, что изменения, происходящие в данной части субстрат-связывающей полости обелина F88Y в ответ на связывание Са2+ и последующего декарбокси-лирования целентеразина, идентичны изменениям, происходящим в молекуле дикого обелина.

Ранее было показано, что замена Fhe88 на Туг влияет на спектры биолюминесценции обелина F88Y (Хшах^бЗ им) и флуоресценции его Са2+-разряженного состояния (>-тах=487 нм), которые сдвигаются в синюю сторону. Хотя при этом и не наблюдается полное совпадение, спектры обелина F88Y становятся похожи на спектры акворина (Д-вьявх^бЭ нм, ^,FLmax=466 нм). Предполагалось, что эти изменения обусловлены наличием дополнительной водородной связи, сформированной между гадроксильной группой Туг и атомом кислорода 6-(и-гидрокси)-феншгьной группы целентеразина.

Рис.5. Схематическое изображение: А — 2-гидропероксицелентеразин-связывающей полости в обелине Е88У, Б - целентерамид-связывающей полости в Са2+-разряженном обелине Е88У. Водородные связи показаны пунктирными линиями, расстояние - в А.

Таким образом, представленные в данном исследовании кристаллические структуры двух конформационных состояний мутанта обелина Е88У подтверждают предложенную гипотезу и дают молекулярное

объяснение различию спектров биолюминесценции и флуоресценции обелина и акворина. Поэтому, исходя из данных анализа пространственных структур обелина F88Y и их сравнения с уже имеющимися структурами обелина и акворина, можно сделать вывод, что основной причиной отличия спектральных характеристик этих фотопротеинов является различная организация сетей водородных связей около атома кислорода б-(и-гидрокси)-фенильной группы 2-гидропероксицелентеразина, в зависимости от присутствия Phe или Туг в полости белка.

3. Анаэробный апо-обелин-целентеразиновый комплекс. Роль His 175 в процессе формирования активного фотопротеина

Совсем недавно, с помощью метода тушения собственной флуоресценции белков было продемонстрировано, что связывание целентеразина с апофотопротеином протекает в течение нескольких миллисекунд, при том, что последующее формирование активного фотопротеинового комплекса занимает несколько часов. Было установлено, что лимитирующим этапом в образовании активного фотопротеина является превращение целентеразина в его пероксипроизводное, происходящее внутри субстрат-связывающей полости. Однако было не совсем понятно, что происходит с целентеразином после его связывания с апобелком и какие целентеразиновые интермедиаты предшествуют 2-гидропероксицеленте-разину. Для решения этих вопросов был поставлен эксперимент для изучения взаимодействия апо-обелина с целентеразином в анаэробных условиях.

Анаэробный апо-обелин-целентеразиновый комплекс был получен согласно методике, описанной в разделе «методы и материалы исследований». Успешная очистка данного комплекса с помощью ионообменной хроматографии свидетельствует об образовании устойчивого комплекса между апофотопротеином и целентеразином еще до образования пероксипроизводного целентеразина под действием кислорода.

Апо-обелин имеет спектр поглощения в ультрафиолетовом и видимом диапазонах, типичный для белков, не связанных с органическим лигандом, с

максимумом на 280 и плечом на 295 нм. Активный обелин, связанный с 2-гидропероксицелентеразином, имеет максимум поглощения на 470 и плечо на 310 нм. Спектр поглощения анаэробного апо-обелин-целентеразинового комплекса имеет максимум на 355 и плечо на 400 нм (рис. 6).

Длина волны, нм

Рис. 6. Спектры поглощения: анаэробного апо-обелин-целентеразинового комплекса в закрытой кювете (сплошная линия), анаэробного апо-обелин-целентеразинового комплекса в закрытой кювете спустя 435 минут (точечная линия) и образца в открытой кювете спустя 435 минут (пунктирная линия).

Учитывая результаты исследований Хори и Накаи, а также данные о спектральных свойствах целентеразина в анаэробных условиях при различных рН растворителя, поглощение на 355 нм можно отнести к поглощению Ы7-протонированной формы целентеразина, а на 400 нм - С2-анионной. Т.е. можно заключить, что целентеразин, связанный в анаэробном комплексе, находится в равновесии между этими двумя формами.

Дифференциальные спектры записывались с целью изучения

изменения поглощения апо-обелин-целентеразинового комплекса в процессе

насыщения образца атмосферным кислородом (в открытой кювете). В

качестве контроля использовался аналогичный образец, который находился в

запечатанной кювете, то есть без доступа кислорода. Во время проведения эксперимента отмечены факты исчезновения плеча на 400 нм, смещения максимума поглощения с 355 до 345 нм, а также появления нового пика поглощения на -470 нм, который объясняется наличием 2-гидро-пероксицелентеразина (рис. 7).

Рис. 7. Взаимодействие анаэробного апо-обелин-целентеразинового комплекса с кислородом. А - Изменения спектра поглощения образца в процессе его насыщения кислородом (430 минут). Б - Кинетика превращения комплекса в активный фотопротеин, измеренная при поглощении на 400 нм (слева) и на 470 нм (справа).

Кажущиеся константы скорости, рассчитанные, исходя из изменения поглощений на 400 и 470 нм, имеют значения кадонм = 9.0±0.05 х 10"3 мин"1 и к470нМ= 14.0 ± О.Зх 10"э мин"1.

Поскольку увеличение поглощения на 470 нм соответствует накоплению 2-гидропероксицелентеразина в субстрат-связывающей полости

обелина, мы сравнили кинетику образования активного обелина по поглощению при 470 нм с данными, определенными по уровню биолюминесценции. На основе полученных данных была построена кинетика и рассчитана кажущаяся константа скорости образования активного фотопротеинового комплекса по биодюминесцентному сигналу (kBL=24.7±1.4xlO"3 min1).

Поскольку активный фотопротеин образуется при нейтральном рН из апобелка, целентеразина и кислорода, вполне вероятно, что аминокислотные остатки активного центра белка выступают в качестве кислоты или основания в процессе формирования 2-гидропероксицелентеразина. Данные, полученные при анализе кристаллической структуры обелина, показали, что Hisl75 в обелине находится недалеко от С2-атома целентеразина. Этот His остаток имеет решающее значение для биолюминесценции фотопротеинов, т.к. его замена на Ala, Phe или Тгр приводит к полной потере активности белка. В нескольких кофактор-независимых оксидазах и оксигеназах, в том числе в люциферазе из коралла Renilla, активация субстрата для последующей вставки кислорода происходит с привлечением шстидина. В этих ферментах гистидин играет ключевую роль в системе передачи протона, действуя в качестве сильного основания и донора/акцептора протонов.

Исследование зависимости скорости образования активного фотопротеинового комплекса от рН показало, что при кислых и близких к физиологическим значениям рН скорость образования активного фотопротеина находится на максимальном уровне, тогда как при щелочных рН заметно снижается (рис. 8).

Как известно, имидазольное кольцо гистидина протонируется уже при слабокислых значениях рН, то есть в диапазоне рН 5-6 гистидин существует в протонированном состоянии. Поэтому, принимая во внимание информацию о свойствах мутантов обелина с заменой Hisl75, а также результаты квантово-химического моделирования образования активного фотопротеина, можно сделать заключение, что в Са2+-регулируемых фотопротеинах His

играет ключевую роль в образовании активного фотопротеина, выполняя функцию переносчика протона от ОТ-атома целенгеразина на пероксид-анион с образованием 2-гидропероксицелентеразина. Описанный процесс сопровождается конформационными перестройками молекулы белка, приводящими к формированию активного фотопротеина.

рН

Рис. 8. - Скорость образования активного фотопротеинового комплекса в зависимости от рН.

Таким образом, в этой работе были впервые получены данные, характеризующие особенности взаимодействия между апофотопротеином и целентеразином в анаэробных условиях. Проведенное исследование вносит существенный вклад в дальнейшее понимание механизма образования активного фотопротеинового комплекса из апобелка, целенгеразина и кислорода.

выводы

1. Впервые получены кристаллы мутанта обелина У138Б в двух конформационных состояниях — до и после биолюминесцептной реакции, т.е. связанных, соответственно, с субстратом, 2-гидропероксицелентеразином, и продуктом реакции, це-лентерамидом, и Са2+. С разрешением 1,72 А и 1,30 А определены их пространственные структуры. Показано, что кристаллические структуры обелина У138Р высоко гомологичны структурам соответствующих конформационных состояний обелина дикого типа.

2. При сравнении кристаллической структуры мутанта обелина У138Р, связанного с 2-гидропероксицелентеразином, со структурой соответствующего конформа-ционного состояния обелина дикого типа установлено, что замена Туг138 на РЬе, хотя и не меняет общую структуру фотопротеина и положение основных аминокислот активного центра, но приводит к исчезновению молекулы воды из субстрат-связывающей полости обелина. На основе анализа структуры субстрат-связывающей полости Са2+-разряженного мутанта обелина У138Е и ее сравнения с таковой Са2+-разряженного обелина дикого типа установлено, что молекула воды вновь появляется в субстрат-связывающей полости после биолюминесцентной реакции и обнаруживается в том же положении, что и в Са2+-разряженном обелине дикого типа. В результате анализа структуры Са2 -разряженного мутанта обелина У138Б сделано заключение, что молекула воды появляется во внутренней полости молекулы мутанта обелина через соединя-ющее внутреннюю полость с растворителем «отверстие», возникающее вследствие небольших конформационных изменений в ходе биолюминесцентной реакции, инициированной связыванием ионов кальция.

3. Показано, что замена Туг138 на РЬе в обелине приводит к снижению удельной биолюминесцентной активности на 40%, смещению спектра биолюминесценции в коротковолновую область на 10 нм (^^„=^490 нм) и уменьшению в 1,6 раза константы скорости подъема ((¡¿„=305,3+1,4 с"1) биолюминесцентного сигна-ла. На основании пространственных структур двух конформационных состояний мутанта обелина У138Б и обелина дикого типа, а также биолюминесцентных свойств мутанта и обелина дикого типа сделан вывод, что молекула воды выполняет каталитическую функцию в реакции декарбоксилирования 2-гидро-пероксицелентеразина через протонирование диоксиэтанонового интермедиата. Сделано заключение, что остаток Туг138 необходим для оптимальной

ориентации молекулы воды относительно субстрата для обеспечения максимальной скорости биолюминесцентной реакции.

4. Впервые получены кристаллы и определены пространственные структуры обелина F88Y со связанным 2-гидропероксицелентеразином с разрешением 2,09 А и Са2+-разряженного обелина F88Y со связанным целентерамидом и ионами Са2+ с разрешением 1,50 А. Показано, что пространственные структуры мутанта обелина F88Y высоко гомологичны структурам соответствующих конформационных состояний обелина дикого типа и акворина.

5. Сравнение пространственных структур двух конформационных состояний мутанта обелина F88Y с соответствующими структурами обелина и акворина позволило сделать вывод, что отличия спектральных свойств этих фотопротеинов обусловлены различной организацией сети водородных связей около атома кислорода 6-(и-гидрокси)-фенильной группы 2-гидроперокси-целентеразина, зависящей от присутствия Phe или Туг в полости белка.

6. Впервые получен прочный комплекс апо-обелина и целентеразина в анаэробных условиях. На основании спектров поглощения анаэробного комплекса и анаэробных спектров поглощения целентеразина при различных рН сделан вывод, что целентеразин, связанный в анаэробном комплексе, представляет собой смесь Ы7-протонированной и С2(-) анионной форм.

7. Исследована кинетика формирования активного фотопротеина в процессе насыщения кислородом анаэробного комплекса апо-обеяин-целентеразин двумя способами: спектроскопическим методом по изменению поглощения при 400 нм и 470 нм и по изменению биолюминесцентного сигнала. Показано, что процесс образования активного обелина описывается тремя константами: к4ооны=9,0± 0,05 хЮ"3 мин"1, к47они=14,0±03х10"3 мин"1 и k!!L=24,7±l,4xlO"3 мин"1. Сделан вывод, что процесс образования активного фотопротеина протекает в несколько стадий.

8. Исследована скорость образования активного фотопротеинового комплекса из апо-обелина, целентеразина и кислорода в зависимости от рН. Установлено, что максимальная скорость наблюдается в диапазоне рН 5-6. Исходя из результатов по скорости формирования активного фотопротеинового комплекса, донорно-акцепторных свойств His при различных рН, а также данных по свойствам мутантов с заметой Hisl75 в обелине, сделан вывод, что данный His играет ключевую роль в формировании активного фотопротеина, выполняя функцию переносчика протона при образовании 2-гидропероксицелентеразина.

Опубликованные статьи:

1. Natashin P.V. Crystal structures of the Ca2+-regulated photoprotein obelin Y138F mutant before and after bioluminescence support a catalytic function of a water molecule in the reaction / P.V. Natashin, W. Ding, E.V. Eremeeva, S.V. Markova, J. Lee, E.S. Vysotski, Z.J. Liu II ACTA Crystcdlogr. D. - 2014. - D70. -doi: 10.1107/S1399004713032434.

2. Natashin P.V. Crystal structures of F88Y obelin mutant before and after the bioluminescence reveal molecular insight into spectral tuning among hydromedusan photoproteins / P.V. Natashin, S.V. Markova, J. Lee, E.S. Vysotski, Z.J. Liu//FEBSJournal. -2014. -doi: 10.1111/febs. 12715.

3. Eremeeva E.V. Oxygen activation of apo-obelin-coelenterazine complex / E.V. Eremeeva, P.V. Natashin, W.J.H. van Berkel, E.S. Vysotski, Z.J. Liu // Chembiochem. - 2013. Vol. 14. - P. 739-745.

Подписано в печать 18.02.2014 г. Заказ № 426 Отпечатано на ризографе на бумаге офсетной 80 г/м2 Формат 60x84/16 Уч. узд. листов 0,83. Тираж 80 шт.

Отпечатано в типографии И.П. Дворядкин Б.В. г. Красноярск, Академгородок, 50, стр. 28, оф. 156 тел. 290-72-32

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Наташин, Павел Викторович, Красноярск

Федеральное государственное автономное

образовательное учреждение высшего профессионального образования «СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Институт фундаментальной биологии и биотехнологии Кафедра биофизики

Наташин Павел Викторович

РОЛЬ ОТДЕЛЬНЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ Са2+-РЕГУЛИРУЕМЫХ ФОТОПРОТЕИНОВ

На правах рукописи УДК 577.322.6

03.01.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.б.н. Е.С. Высоцкий

Красноярск, 2014

ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1

1.1 1.2

1.3

1.4

1.5

1.6 1.7

ГЛАВА 2 2.1

2.2

2.3

2.4

Биолюминесцентные белки.

Механизм биолюминесцентной реакции 12

Са2+-регулируемые фотопротеины 12

Пространственная структура Са2+-регулируемых фотопротеинов 16

Особенности пространственной структуры

2+ 91

Са -разряженного обелина

Возможные пути формирования

2-гидропероксицелентеразина 23

Функциональная роль остатков His и Туг в

формировании активного фотопротеинового

комплекса 26

Механизм биолюминесцентной реакции Са -регулируемых фотопротеинов 31

Механизм биолюминесцентных реакций других целентеразин-зависимых систем 40

Материалы и методы 46

Клонирование, олигонуклеотид-направленный мутагенез 46

Выделение и очистка мутантов фотопротеина обелина Y138F и F88Y 46

Получение Са -разряженных мутантов обелина

Y138F и F88Y со связанным целентерамидом 48

Получение анаэробного апо-обелин-

целентеразинового комплекса 48

2.5 Определение удельной биолюминесцентной активности, концентрации белка и измерение

спектров биолюминесценции 49

2.6 Измерение спектра поглощения апо-обелин-целентеразинового комплекса 50

2.7 Кинетические измерения методом остановленной

струи ^орреё-йоху) 51

2.8 Кристаллография 52

2.9 Программное обеспечение 52

2.10 Реактивы 53

ГЛАВА 3 Пространственные структуры обелина У138Б и

Са -разряженного обелина У138Р. Каталитическая функция молекулы воды и роль Туг138 в биолюминесцентной реакции 54

3.1 Пространственные кристаллические структуры обелина У138Б со связанным 2-гидроперокси-целентеразином и Са2+-разряженного обелина У138Б

со связанными целентерамидом и ионами Са2+ 54

3.1.1 Кристаллизация 54

3.1.2 Общая структура белков 55

3.1.3 «ЕР-Ьагк!» Са -связывающие петли 60

3.1.4 Субстрат-связывающие полости 61

3.1.5 Спектральные и кинетические свойства обелина

У138Б 67

3.2 Каталитическая функция молекулы воды и роль

Туг138 в биолюминесцентной реакции 69

ГЛАВА 4 Пространственные структуры обелина Р88У и Са2+-разряженного обелина Р88У. Структурные

основы особенностей спектров биолюминесценции

Са -регулируемых фотопротеинов 75

4.1 Пространственные кристаллические структуры обелина Б88У со связанным 2-гидроперокси-целентеразином и Са -разряженного обелина Б88У

со связанными целентерамидом и Са2+ 75

4.1.1 Кристаллизация 75

4.1.2 Общая структура белков 76

4.1.3 «ЕР-Ьап<1» Са2+-связывающие петли 80

4.1.4 Системы водородных связей в лиганд-связывающей полости обелина Р88У до и после

биолюминесцентной реакции 81

4.2 Структурные основы особенностей спектров биолюминесценции Са2+-регулируемых фотопротеинов 89

ГЛАВА 5 Анаэробный апо-обелин-целентеразиновый комплекс.

Роль Кб 175 в процессе формирования активного фотопротеина 95

5.1 Взаимодействие целентеразина с апо-обелином 95

5.2 Спектры поглощения цел ентеразина в анаэробных условиях при различных рН 96

5.3 Взаимодействие свободного цел ентеразина

с кислородом 97

5.4 Спектральные свойства анаэробного апо-обелин-целентеразинового комплекса. Кинетика превращения апо-обелин-целентеразинового комплекса в активный фотопротеин 99

5.5 Определение ионной формы целентеразина,

связанного с анаэробным апо-обелин-

целентеразиновым комплексом 104

5.6 His 175 как возможный переносчик протона 105

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 109

ВЫВОДЫ 111

ЛИТЕРАТУРА 114

ВВЕДЕНИЕ

Биолюминесценция является широко распространенным в природе явлением. Светящиеся виды были обнаружены среди живых организмов, различающихся не только средой обитания, но и уровнем структурной организации. Биолюминесцентные организмы можно встретить среди бактерий, грибов, простейших, кишечнополостных, червей, моллюсков, насекомых и рыб. Несмотря на то, что светящиеся организмы находятся на разных уровнях эволюционного пути, все они имеют одинаковую природу свечения. Фактически, биолюминесценция - это хемилюминесцентная реакция, которая протекает вследствие окисления субстрата - люциферина, специфическим ферментом - люциферазой. На самом деле, люциферины и люциферазы - это скорее собирательное и функциональное понятие, чем химическое, поскольку у разных организмов они являются соединениями различной структурной организации. Но, с другой стороны, это говорит о том, что биолюминесценция многократно и независимо возникала в ходе эволюции. За последнее время было сделано множество предположений о причинах возникновения биолюминесценции, а также важности данного явления для живых организмов. И, несмотря на то, что явление биолюминесценции исследуется уже более 100 лет, интерес ученых со всего мира к изучению данного феномена не ослабевает. В большей степени это объясняется широкими перспективами использования биолюминесцентных белков в аналитических целях. Поскольку современная техника обладает возможностями с высокой точностью регистрировать, измерять и характеризовать даже очень слабый световой сигнал, методы, основанные на использовании биолюминесцентных белков, позволяют работать с микроскопическими объемами исследуемых веществ. По этой причине биолюминесцентные методы нашли свое применение, например, в клеточной биологии для мониторинга внутриклеточных процессов, в экологии для изучения загрязнения окружающей среды и т.д. В наши дни

биолюминесцентные технологии стремительно развиваются, поскольку данные методы находят новые области применения для решения широкого спектра аналитических задач.

Большинство охарактеризованных биолюминесцентных систем, широко представленных среди морских организмов, принадлежит к так называемому целентеразин-зависимому типу, где субстратом биолюминесцентной реакции является целентеразин [Thompson et al., 1997]. Наиболее изученными представителями данных систем являются Са2+-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных животных. Са2+-регулируемые фотопротеины, в большей или меньшей степени исследованные на настоящий момент, демонстрируют высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей, в пределах 65 - 75%, при этом практически все аминокислоты, формирующие субстрат-связывающую полость белка, консервативны. Фотопротеины представляют собой комплекс, состоящий из молекулы белка (-22 кДа) и «преактивированного» кислородом целентеразина (2-гидропероксицелентеразина), прочно, но не ковалентно связанного с белком [Shimomura, Johnson, 1978; Head et al., 2000; Liu et al., 2000]. Реакция биолюминесценции инициируется добавлением ионов кальция и является следствием декарбоксилирования «преактивированного» субстрата. В результате реакции образуется молекула целентерамида в возбужденном состоянии и С02. Переход целентерамида из возбужденного в основное состояние сопровождается излучением кванта света.

Сотрудниками лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН были клонированы кДНК гены, созданы экспрессионные конструкции и проводятся всесторонние исследования ряда Са2+-регулируемых целентеразин-зависимых белков, таких как: обелины из Obelia longissima и Obelia geniculata, клитин из Clytia gregaria, митрокомин Mitrocoma cellularia, светочувствительный фотопротеин беровин из гребневика Beroe abyssicola.

Большой интерес с теоретической и практической точек зрения вызывают результаты, полученные при изучении физико-химических свойств мутантов фотопротеинов с аминокислотными заменами в активном центре белка. Единичные замены некоторых аминокислотных остатков в субстрат-связывающей полости белковой молекулы приводят к существенным изменениям спектров биолюминесценции фотопротеинов [Deng et al., 2001; Malikova et al., 2003; Stepanyuk et al., 2005; Liu et al., 2006], кинетики формирования активного фотопротеина из целентеразина и апобелка [Eremeeva et al., 2009, 2013], а также кинетики реакции декарбоксилирования 2-гидропероксицелентеразина [Vysotski et al., 2003; Liu et al., 2006]. В связи с данными наблюдениями у научного сообщества сформировался вопрос о роли отдельных аминокислотных остатков в биолюминесцентной реакции.

За последние годы были определены кристаллические структуры для четырех конформационных состояний Са -регулируемого фотопротеина обелина [Liu et al., 2000; Deng et al., 2004; Deng et al., 2005; Liu et al., 2006], пространственные структуры ряда других фотопротеинов и их мутантов, например, акворина [Head et al., 2000] и клитина [Titushin et al., 2010]. Полученные структуры позволили высказать предположения относительно функции некоторых аминокислотных остатков в биолюминесценции фотопротеинов [Shimomura, 2006; Высоцкий и др., 2006; Vysotski, Lee, 2004; Vysotski, Lee, 2007]. Однако для более глубокого изучения данного вопроса является целесообразным осуществить всестороннее исследование свойств различных мутантов фотопротеинов, в том числе изучить их пространственную организацию.

Выяснение роли отдельных аминокислотных остатков активного центра Са2+-регулируемого фотопротеина в реакции биолюминесценции, безусловно, имеет и фундаментальное, и прикладное значение, так как является необходимым шагом в понимании явления биолюминесценции в

целом. В перспективе это будет способствовать существенному повышению эффективности аналитического применения фотопротеинов, например, при их использовании в качестве репортерных молекул ш vivo.

Целью работы являлось выяснение функциональной роли отдельных аминокислот активного центра Са2+ -регулируемых фотопротеинов в процессе биолюминесценции.

Выполнение исследования требовало решения следующих задач:

1. Найти условия кристаллизации для мутантов обелина с заменой Туг138 на Phe (Y138F) и Phe88 на Туг (F88Y) для двух конформационных состояний — до и после биолюминесцентной реакции, т.е. связанных с субстратом, 2-гидроперокси-целентеразином, и с продуктом реакции, целентерамидом, и ионами кальция, соответственно.

2. Получить дифракционные данные от кристаллов и построить модели кристаллических структур мутантных белков по установленной электронной плотности.

3. Исследовать биолюминесцентные свойства мутанта обелина Y138F.

При решении поставленных задач были получены результаты, которые выносятся на защиту:

1. Пространственные структуры двух конформационных состояний (до и после биолюминесцентной реакции) мутанта обелина Y138F и его биолюминесцентные свойства доказывают участие молекулы воды, расположенной в субстрат-связывающей полости фотопротеинов, в реакции декарбоксилирования 2-гидропероксицелентеразина через протонирование диоксиэтанонового интермедиата. Остаток Туг 138 необходим для оптимальной ориентации молекулы воды

относительно субстрата для обеспечения максимальной скорости биолюминесцентной реакции.

2. Пространственные структуры двух конформационных состояний (до и после биолюминесцентной реакции) мутанта обелина F88Y, имеющего спектр биолюминесценции, практически совпадающий со спектром биолюминесценции акворина, доказывают, что отличие спектров биолюминесценции этих Са -регулируемых фотопротеинов обусловлено различной организацией сети водородных связей около атома кислорода 6-(и-гидрокси)-фенильной группы 2-гидроперокси-целентеразина, зависящей от присутствия Phe или Туг в полости белка.

3. В анаэробных условиях апо-обелин и целентеразин образуют прочный комплекс. В анаэробном комплексе целентеразин связан в двух формах - протонированной и в форме С2(-) аниона. Процесс образования активного фотопротеина при экспозиции анаэробного комплекса апо-обелин-целентеразин кислороду протекает в несколько стадий. His 175 в обелине играет ключевую роль в формировании активного фотопротеина, выполняя функцию переносчика протона при образовании 2-гидропероксицелентеразина.

Все результаты, представленные в данной работе, получены впервые и имеют фундаментальный характер, поскольку добавляют новую информацию к пониманию роли отдельных аминокислотных остатков в процессе биолюминесценции фотопротеинов кишечнополостных. В дальнейшем полученные результаты найдут свое применение в фундаментальных и прикладных исследованиях. Например, установление роли отдельных аминокислотных остатков в биолюминесцентной реакции в будущем позволит сконструировать мутантные формы фотопротеинов с измененными физико-химическими свойствами (увеличенная удельная активность, определенные спектральные свойства, измененная кинетика

активности, термостабильность и т. д.) применительно к каждой конкретной задаче. Это, безусловно, найдет широчайшее применение при разработке новых биолюминесцентных технологий для биологии, медицины, фармацевтической промышленности.

Работа выполнена при поддержке Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», грантов РФФИ №09-04-00172, 12-0400131 и 12-04-91153-ГФЕН, Программы Правительства РФ по привлечению ведущих ученых в образовательные учреждения (№11.034.31.0058) и НШ №3951.2012.4.

Материалы диссертационной работы докладывались на Международном симпозиуме 818С8' 2012 (г. Куньмин, КНР, 2012 г.), на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН, на объединенных биолюминесцентных семинарах Сибирского федерального университета и семинарах Национальной лаборатории биологических макромолекул Института биофизики Пекина (КНР).

Результаты исследований опубликованы в 3-х статьях в рецензируемых журналах и включены в международную базу данных РОВ.

ГЛАВА 1 Биолюминесцентные белки. Механизм биолюминесцентной реакции

1.1 Са -регулируемые фотопротеины

Биолюминесценция - повсеместно распространенное явление живой природы. В настоящее время известно огромное количество различных биолюминесцентных видов животных - несколько тысяч. На суше светящиеся организмы представлены в меньшей степени, чем в мировом океане. Это - бактерии, насекомые, черви и грибы. Но среди морских обитателей способность к самосвечению распространена более широко, для 90% жителей глубоководных районов океана она является неотъемлемой частью жизнедеятельности. Интересно, что при существовании различных биохимических механизмов биолюминесценции большое количество светящихся организмов использует один и тот же субстрат (и его производные) - целентеразин [Thompson et al., 1997].

На данный момент наиболее исследованы биолюминесцентные белки, использующие целентеразин как субстрат (рис. 1.1 А). Такими белками являются Са -регулируемые фотопротеины [Shimomura, 2006; Высоцкий и др., 2006; Vysotski, Lee, 2004; Vysotski, Lee, 2007], ответственные за свечение морских кишечнополостных животных [Morin et al., 1971; Morin, 1974]. Термин "фотопротеины" был введен Шимомурой и Джонсоном [Shimomura, Jonson, 1966] как общее определение предварительно заряженных белков, не требующих для своей работы наличия молекул кислорода и излучающих свет при взаимодействии с ионами металлов. Энергия запасена в предварительно заряженном белке и излучается в ходе реакции. Поскольку в большинстве известных фотопротеиновых систем реакция запускается добавлением ионов кальция, Гастингсом и Мориным был предложен термин "Са -регулируемые фотопротеины" [Hastings, Morin, 1969].

На сегодняшний день известно более 25-ти видов кишечнополостных животных, за свечение которых ответственны Са2+-регулируемые

фотопротеины. Но только для семи из них получены коплементарные ДНК, все они в разной степени исследованы и охарактеризованы: акворин [Prasher et al., 1985; Inouye et al., 1985], митрокомин [Fagan et al., 1993] и клитин [Inouye et al., 1993] из медуз Aequorea, Mitrocoma {Haiistaura) и Clytia (Phialidium) [Shimomura, 1962; Shimomura, 2006]; обелины из гидроидов Obelia geniculata [Markova et al., 2002] и Obelia longissima [Campbell, 1974; Высоцкий и др., 1989]; мнемиопсин и беровин из ктенофор (гребневиков) Mnemiopsis и Beroe [Ward, Seliger, 1974; Ward, Cormier, 1975].

Рисунок 1.1- Химическая структура целентеразина (А), 2-гидропероксицелентеразина (Б) и целентерамида (В).

Ca -регулируемые фотопротеины представляют собой стабильный в отсутствие ионов кальция фермент-субстратный комплекс, состоящий из апобелка и молекулы субстрата — преактивированного кислородом целентеразина, 2-гидропероксицелентеразина (рис. 1.1Б), прочно, но нековалентно связанного с белком [Shimomura et al., 1978, Hastings et al., 1963]. Биолюминесценция инициируется конформационными изменениями молекулы белка, опосредованными связыванием ионов кальция, и является следствием декарбоксилирования 2-гидропероксицелентеразина. Несмотря на то, что ионы кальция являются триггером биолюминесцентной реакции, для фотопротеинов также характерен очень низкий уровень самосвечения — Са2+-независимая люминесценция [Allen et al., 1977]. Продуктами реакции являются моле

Информация о работе

Наташин, Павел Викторович
кандидата биологических наук
Красноярск, 2014
ВАК 03.01.02

Диссертация

Роль отдельных аминокислотных остатков в биолюминесценции Ca2+-регулируемых фотопротеинов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы