Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные особенности кальций-регулируемых целентеразин-связывающих белков

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные особенности кальций-регулируемых целентеразин-связывающих белков"

На правах рукописи

Степанюк Галина Анатольевна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ КАЛЬЦИЙ-РЕГУЛИРУЕМЫХ ЦЕЛЕНТЕРАЗИН-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 8 СЕЧ 2008

Красноярск - 2008

003445998

Работа выполнена в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН, г Красноярск

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук

Высоцкий Евгений Степанович

Официальные оппоненты:

Кандидат биологических наук Межевикин Владислав Валентинович Доктор химических наук,

Ведущая организация:

Химический факультет Московского Государственного Университета им М В. Ломоносова

Защита состоится «21» окухуЛ*?^-Я 2008 г. в час на заседании

диссертационного совета Д 003.007 01 в Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, д 50, стр 50 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики

профессор

Савицкий Александр Павлович

СО РАН

Автореферат разослан «2%» о£ллаог<хсу 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Франк Л А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Наиболее известными и изученными представителями целентеразин-зависимых биолюминесцентных систем являются Са2+-регулируемые фотопротеины Фотопротеины представляют собой комплекс, состоящий из молекулы белка (~22 кДа) и 2-гидропероксицелентеразина прочно, по не ковалентно связанного с белком Биолюминесценция инициируется добавлением ионов кальция и возникает при декарбоксшшровании 2-гидропероксицелентеразина В результате реакции образуются молекула целентерамида в возбужденном состоянии и С02 Переход целентерамида из возбужденного в основное состояпие сопровождается излучением кванта света Фотопротеины гидроидов (например, обелин из Obeha longissima) и светочувствительные фотопротеины из гребневиков (беровин из Beroe abysstcola) не выявляют гомологии первичных последовательностей, однако выполняют одну функцию - биолюминесцентное окисление целентеразина

Люцифераза мягкого коралла Remlla также использует целентеразин в качестве субстрата Однако в биолюминесценцию животных т vivo вовлечено три белка люцифераза, зеленый флуоресцентный белок и Са2+-регулируемый целентеразин-связывающий белок (СВР) Фактически, «субстратом» люциферазы Remlla в биолюминесцентной реакции т vivo является СВР, содержащий одну молекулу прочно связанного целентеразина Целентеразин становится доступным дня реакции с люциферазой и СЬ только после связывания с СВР ионов кальция В отличие от Са2+-регулируемых фотопротеинов в молекуле СВР не происходит активации кислородом молекулы целентеразина

Хотя как СВР, так и Са2+-регулируемые фотопротеины связывают целентеразин, они выполняют различные функции, вероятно, используя для этого различные молекулярные механизмы Так, до сих пор остаются невыясненными следующие вопросы каким образом Са2+-регулируемые фотопротеины, не выявляющие гомологии аминокислотных последовательностей, выполняют одну и ту же функцию - биолюминесцентное окисление целентеразина, каковы механизмы формирования эмиттера люминесцентной реакции фотопротеинов шш стабилизации субстрата в Remlla СВР, какие конформационные изменения в белках, индуцированные связыванием кальция, инициируют биолюминесцентную реакцию в Са2+-

регулируемых фотопротеинах или освобождение целентеразина в Са2+-регулируемом целентеразин-связывающем белке

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было определение пространственных кристаллических структур целентеразин-связывающих белков, принадлежащих разным биолюминесцентным системам, и установление их структурно-функциональных особенностей Выполнение данного исследования требовало

1 Найти условия кристаллизации для каждого отдельного белка и получить пригодные для рентгеновской дифракции кристаллы

2 Получить дифракционные данные от кристаллов и разрешить фазовую проблему Построить модели кристаллической структуры белка по полученной электронной плотности

3 Проверить гипотезу о формировании эмиттера в биолюминесцентной реакции Са2+-регулируемых фотопротеинов с помощью замен ключевых аминокислотных остатков, локализованных в активных центрах обелина (Phe88, Met 25, Не 144) и акворина (Туг82)

При решении поставленных задач были получены результаты, которые выносятся на защиту

1 Все исследованные в данной работе Са2+-регулируемые целентеразин-связывающие белки относятся к Са2+-связывающим белкам «EF-hand» типа, принадлежат к классу модуляторов кальциевых сигналов и выявляют высокую структурную гомологию между собой

2 Са2+-регулируемые фотопротеины - обелин и беровин - образуют гидрофобные полости в центре белковой молекулы со сходной геометрией и расположением Однако аминокислоты, формирующие гидрофобную полость двух фотопротеинов, не выявляют структурной гомологии друг с другом, за исключением некоторых ключевых аминокислот, участвующих в окислении субстрата

3 Увеличение полярности целентеразин-связывающей полости и формирование дополнительной водородной связи с 6-(и-гидрокси)-фенильной группой целентеразина приводит к изменению спектра биолюминесценции Исходя из пространственной структуры Са2+-разряженного обелина, связанного с продуктом реакции, целенгерамидом, и

ионами кальция, предложен механизм образования первичного возбужденного состояния в биолюминесцентной реакции фотопротеинов 4 В отличие от фотопротеинов в Са2+-регулируемом целентеразин-связывающем белке Remlla субстрат располагается в гидрофобной полости, доступной растворителю В связывании целентеразина и защите его от окисления участвует карбонильная группа Туг 180 Связывание кальция с белком приводит к потере водородных связей, участвующих в координации субстрата, и высвобождению целентеразина из гидрофобной полости

Научная повнзнд и практическая ценность работы. Все результаты данной работы получены впервые и имеют фундаментальный характер, так как добавили новую информацию к пониманию механизма биолюминесцентной реакции, к происхождению целентеразин-зависимых биолюминесцентных систем и позволили найти различия для трех различных классов этих белков на молекулярном уровне Кроме того, полученные результаты могут найти применение при разработке новых биолюминесцентных технологии для биологии, медицины, фармацевтической промышленности Например, установление роли отдельных аминокислотных остатков в связывании субстрата, биолюминесцентном катализе и формировании эмиттера обеспечит основу для белковой инженерии целентеразин-зависимых белков с целью получения репортерных белков с измененными свойствами Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международных симпозиумах но биолюминесценции и хемшноминесценции (Йокогама, Япония, 2004, Сан-Диего, США, 2006), на 3-м симпозиуме «Ser-САТ» (Атланта, США, 2006), на конференции молодых ученых КНЦ СО РАН (Красноярск, 2004)

Публикации По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ Структура и объем работы. Работа изложена на 121 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение результатов исследования, заключение, выводы и список цитируемой литературы (131 источников) Диссертационная работа проиллюстрирована 51 рисунком, содержит 9 таблиц

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Клонирование и получение экспрессиошшх плазмид для обелина из Obelia longissima, его мутантов и СВР из Remlla muellen было выполнено старшим научным сотрудником лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН Марковой С В Клонирование и получение экспрессионной плазмиды для беровина из Beroe abyssicola было выполнено научным сотрудником лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН Бураковой JI П

1. Выделение и очистка белков

Культивирование трансформированных клеток Е coli (штамм RIL (DE3)) проводили в LB-среде, содержащей ампициллин (250 мг/мл) при 37°С Синтез белка индуцировали добавлением ИПТГ в среду в финальной концентрации 1 мМ при достижении клеток оптической плотности OD46o 0 6-0 8 и растили 3 часа при интенсивном перемешивании Селено-меченные производные беровина и СВР были получены при экспрессии рекомбинантных белков в В384 (DE3) штамме Е coli Трансформированные клетки выращивали в минимальной среде PASM-5052, содержащей ампициллин (250 мкг/мл), в течение 16 часов (37°С)

Выделение и очистку обелина, его мутантных форм, беровина и СВР проводили по схеме, разработанной в лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН для рекомбинантного обелина дикого типа с некоторыми модификациями

2. Кристаллографии

Первоначальный поиск условий кристаллизации белков выполняли с использованием 384 коммерческих растворов при помощи робота Honey Bee и 96-луночных планшет («Greiner CrystalQuick») методом сидячей капли 0 5 мкл раствора белка смешивали с 0 5 мкл раствора для кристаллизации, планшеты запаивали воздухонепроницаемой пленкой и хранили при 4°С

Дифракционные данные для Se-производного СВР и апоберовина со связанным кальцием, а также Са21-разряжешгого обелина были получены при облучении кристаллов длиной волны 0 9725 А с использованием рентгеновского излучения синхротрона (22ГО, Advanced Photon Source, Чикаго, США) Дифракционные данные для Са2+-связанной апоформы СВР были получены при облучении кристалла длиной волны как 1 0 А, так и 1 7 А

Рентгеновскую дифракцию кристалла записывали с помощью МагЗОО CCD камеры (дистанция от кристалла до камеры 150-180 мм, время экспозиции 2

сек. вращение кристалла 360° с шагам 1°). Обработка дифракционных данных была выполнена с использованием программы HKL2000 suite. Фазы были рассчитаны Se-SAS методом (метод аномального рассеивания селена) для структуры СВР со связанным целентеразином и Ca-SAS методом для структуры апоформы СВР со связанным кальцием с помощью программы SOLVE/RESOLVE. Модель белка автоматически построена с использованием программы ARP/wARP. Расчет параметров модели и ее усовершенствование выполняли при помощи программ MOLPROBITY, XFIT и REFMAC5.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Пространственная структура кальций-разряжениого об слипа со связанным целентерамидом и ионами кальция (разрешение 1.9 А)

Пространственная структура Са2+-разряженного обелина из О. longissima со связанным целентерамидом представляет собой компактную белковую глобулу (рис. 1), образованную N— и С— концевыми доменами. Общая пространственная структура Са2+-разряженного обелина сходна со структурой обелина с 2-гидропероскицелентеразином, т.е. с кристаллической структурой обелина до биолюминесцентной реакции (PDB код 1EL4).

Рис. 1. Пространственная структура Са2+-разряженного обелина со связанным целентерамидом в активном центре. Ионы кальция показаны в виде сфер серого цвета. Молекула целентерамида показана в центре белковой глобулы.

Среднеквадратичное отклоните атомов основной цепи обелина и разряженного обелшт составляет всего 1 7 А Это указывает на то, что кальций-регулируемые фотопротеины относятся к классу модуляторов кальциевого сигнала, а не к Са2+-сенсорным белкам

Рис. 2. Схематическое изображение 2-гидропероксицелентеразин-связывающей полости в обелине (А) и целентерамид-связывающей полости в Са2+-разряженном обелине после биолюминесцентной реакции (Б). Водородные связи показаны пунктирными линиями, расстояние - в А.

Целентерамид располагается в цешре белковой глобулы в той же ориентации и положении, как и 2-шдропероксицелентеразин в молекуле заряженного обелина Ионы кальция координируются в каждом из предполагаемых центров связывания кальция (EF-hand I, III, IV) по типичной схеме пенгагоналыюй бипирамиды После биолюминесцентной реакции, большинство аминокислотных остатков активного центра обелина сохраняют свою прежнюю конфорчацию и положение Внутренняя полость по-прежнему остается закрытой для растворителя и, как и до реакции, в активном центре присутствуют две молекулы воды (рис 2 А, Б) В обелине Туг138 связан водородной связью с N1 атомом целентеразипа После биолюминесцентной реакции он оказывается на поверхности молекулы, а его место занимает молекула воды, образуя водородную связь с амидной группой целептерамида

Y JO

<У\ ' Y190 V190

HU5 ОН * ОН ОН ¿

V& н,7>, tU ,со H17S у*

н«. /А^нег AV* «М«-«

Рис 3 Механизм образования первичного эмиттера (нейтральной формы целептерамида) в биолюминесцентной реакции обелина

Предложенная схема (рис 3) показывает функциональную роль этой молекулы воды в биолюминесцентной реакции Было сделано предложение о том, что связывание кальция индуцирует сдвиг Hisl75, следствием которого являются перенос протона с Туг190 на Hisl75 (реакция 1), депротонирование гидроксипероксида (реакция 2) и образование диоксиэтанон аниона Предполагается, что молекула воды меняет свое положение именно на этом этапе реакции Так как рК амида выше, чем воды, диоксиэтанон анион быстро протонируется (реакция 3), образуя нейтральную форму Таким образом, функция воды в реакции декарбоксшшрования - протонирование диоксиэтанон аниона, распад которого приводит к образованию возбужденного целентерамида в нейтральной форме - первичного эмиттера в биолюминесцентной реакции фотопротеинов (излучение при 386-420 нм) Ранее в экспериментах с аналогами целентеразина было показано, что реакция декарбоксилирования может осуществляться двумя путями либо в результате распада нейтрального диоксюганона, либо диоксиэтанон аниона Это также поддерживает заключение, сделанное из структурных исследований

Предложенный механизм образования первичного эмиттера (рис 3) способен объяснить многие особенности биолюминесценции фотопротеинов Спектральные максимумы биолюминесценции люцифераз и фотопротеинов находятся в диапазоне от 460 до 495 нм, что соответствует излучению возбужденного целентерамида в форме фенолят-аниона В случае фотопротеинов предполагается, что фенолят-анион целентерамида в возбужденном состоянии образуется в результате переноса протона от 6-(и-гидрокси)-фенильной группы на Н1з22 Однако целентеразин-связывающая полость фотопротеинов из различных организмов образована практически одинаковыми аминокислотными остатками, и поэтому и механизм реакции, и механизм образования эмиттера должны быть одинаковы Но за счет различных взаимодействий целентерамида с боковыми радикалами аминокислот, образующих субстрат-связывающую полость, возможно смещение равновесия при образовании эмиттера биолюминесцентной реакции, что определяет максимумы биолюминесценции и флуоресценции

Например, фотопротеины кишечнополостных акворин и обелин имеют максимумы биолюминесценции при 470 и 485 нм При этом в спектре обелина имеется пеболыпое плечо при 400 нм, отсутствующее в спектре акворина Кальций-разряженный акворин флуоресцирует при 465 нм, обелин - при 510 нм Однако сравнение пространственных структур фотопротеинов показало лишь одно отличие в организации их целентеразин-связывающих полостей у обелина в позиции 88 располагается РЬе, а у акворина в этом положении находится Тут, который образует дополнительную водородную связь с кислородом 6-(и-шдрокси)-фенильной группы В стабилизации фенолят-анионной формы целентерамида в акворине участвуют три водородные связи В молекуле обелина стабилизация фенолят-анионной формы менее жесткая, и в его спектре присутствует плечо в фиолетовой области, соответствующее излучению нейтральной формы целентерамида В этих белках были сделаны взаимные мутации Показано, что замена Р88У в обелине сдвигает максимумы биолюминесценции и флуоресценции в коротковолновую область спектра относительно максимумов для обелина дикого типа, делая их характерными для акворина Напротив, замена У82Р в акворине сдвигает максимумы биолюминесценции и флуоресценции в длинноволновую область спектра относительно максимумов для акворина дикого типа, делая их характерными для обелина (рис 4, 5)

«П 450 50D 550 длина волны ни

Рис. 4. (А) Биолюминесценция акворина (пунктирная линия) и его Y82F мутанта (сплошная линия)

(Б) Биолюминесценция обелина (пунктирная лиши) и его F88Y мутанта (сплошная линия)

Рис. 5. (А) Флуоресценция Са2+-разряженного акворина (пунктирная линия) и его Y82F мутанта (сплошная линия) (Б) Флуоресценция Са2+-разряженного обелина (пунктирная линия) и его F88Y длина волны, км мутанта (сплошная линия) Известно, что фенолят-анион целентерамида может существовать в различных резонансных формах, в зависимости от полярности растворителя При этом максимумы флуоресценции различных резонансных форм могут варьировать от 452 до 615 нм Было показано, что сдвиг равновесия между резонансными формами фенолят-аниона может достигаться не только при замене аминокислот, непосредственно координирующих целентеразин, но и «нейтральных» аминокислот активного центра Замена гидрофобных аминокислот М25 и 11е144, находящихся вблизи N7 атома целентеразина, на аминокислоты, несущие положительный заряд боковой цепи, приводит к сдвигу биолюминесценции в зеленую область спектра с максимумами при 520 и 510 нм для мутантов M25R и М25Н, соответственно, и при 509 нм и 505 нм для мутантов I144R и I144H

2 Прострапствеипая кристаллическая структура аиоформы беровпиа со связанным кальцием (разрешение 2 0 Á)

Пространственная структура апоберовина из Beroe abyssicola, со связанными ионами кальция, представляет собой компактную, слегка ассиметричную глобулу с дополнительной А'г-концевой спиралью Глобула образована двумя «чашеобразными» доменами (рис 6) Среднеквардратичное отклонение атомов основной цепи обелина и беровина составляет 2 2 А, что указывает на их высокую структурную гомологию Ионы кальция

координируются в каждом из предполагаемых центров связывания кальция (ЕР-Ьапс! I, III, IV) по типичной схеме пентагональной бипирамиды.

Несмотря на высокую общую структурную гомологию беровина и обелина, существенное различие обнаружено в организации субстрат-связывающей полости. Гидрофобная полость беровина была найдена с помощью программы РоскйРт(1ег. На рисунке 7 показаны некоторые аминокислотные остатки, образующие полость объемом 639 А, в центре белковой глобулы.

Рис. 6. Пространственная структура Са21 -связанного апоберовина из Beroe abyssicola. Латинскими буквами обозначены а-сгшрали. Ионы кальция показаны в виде сфер серого цвета.

Гидрофобная полость беровина обладает неоднородной полярностью: TV-терминальная часть полости богата полярными аминокислотами (Lys90, Asnl()7, Arg41), а С-терминальная часть является более гидрофобной и незаряженной, образованной в основном остатками Met, Phe и Leu. В связывающей полости найдены две молекулы воды: одна, связанная водородной связью с ОН-группой тирозина 133 (соответствует Туг 138 обелина), другая связывает Asn 107 и Lys90 посредством водородной связи.

Положение гидрофобной полости практически соответствует положению и форме целентеразин-связывающей полости обелина. Исходя из этого сделано предположение, что и целентеразин, и целентерамид могут координироваться в аналогичной ориентации в беровине (рис. 7). Однако, несмотря на сохранение общей геометрии гидрофобной полости беровшга и обелина, образующие их аминокислотные остатки не выявляют гомологии. Так, в положении 5-(п)-

гидроксильной группы целенгерамида находятся две поляршле аминокислоты (Ьуз90 и Айн 107) и ТгрЮЗ, потенциально способные образовывать водородные связи с целентерамидом. В обелине в соответствующем положении находятся Тгр92, Шв22 и РЬе88.

Рис. 7. Гидрофобная полость беровина. Показаны предположительное положение целентерамида в гидрофобной полости и гипотетические водородные связи (серые линии).

Другие аминокислоты образуют и С-терминальную часть полости беровина. Это два Met и многочисленные остатки Phe и Leu. Имидазольное кольцо His 186 (соответствует His 175 в обелине) в беровине ориентировано к поверхности белковой глобулы, что, по всей видимости, является результатом связывания кальция, как и в случае Са2+-разряженного обелина. Туг204 в беровине (Туг 190 в обелине) при выравнивании аминокислотных последовательностей находится в соответствующем положении. 4. Пространственная структура целентеразин-связывающего белка (СВР) со связанным целентеразином (разрешение 1.7 Ä)

Пространственная структура СВР из Я. muelleri представляет собой компактный глобулярный белок (диаметр около 40 А), образованный двумя «чашеобразными» доменами, каждый состоящий из 4-х а-спиралей, обозначенных как A-D в тУ-концевом домене и Е-Н в С-домене. Молекула

целентеразина располагается во внутренней полости белка и окружена аминокислотными остатками всех восьми а-спиралей (рис. 8 А, Б).

Рис. 8 (А). Кристаллическая структура целентеразин-связывающего белка из К. тиеИеп с целентеразином, показанным в центре белковой молекулы. (Б). Кристаллическая структура СВР с увеличением в районе 6-(и)-гидроксильного кольца целентеразина.

Рис. 9. (А). Структурное наложение СВР (рс1Ь код 2НР8, светло-серый цвет) и обелина (р(1Ь код К^УО, показан в темном цвете). (Б). Структурное наложение целентеразина в СВР (светло-серый цвет) и 2-гидроксипероксицелентеразин в

обелине (темно-серый).

Среднеквадратичное отклонение атомов основной цепи обелина и СВР составляет 2.6 А, что указывает на высокую структурную гомологию, несмотря на низкую гомологию первичных последовательностей (22%). Тем не менее,

существенное различие обнаружено в организации и положении субстрат-связывающей полости СВР, где целентеразин повернут на 90° относительно оси 2-гидропероксицелентеразина в обелине (рис. 9 А, Б).

Помимо гидрофобных неполярных аминокислот, выстилающих полость (большинство из них РЬе), также присутствуют несколько полярных остатков (ТугЗб, А^22 и 19, Ьуз139, Азр183), которые непосредственно координируют целентеразин. Субстрат-связывающая полость частично открыта и образует щель между С-терминальной петлей и а-спиралью О, что делает полость доступной для растворителя и позволяет молекулам воды участвовать в связывании субстрата (рис. 10, черные линии).

Рис. 10. Схематическое изображение целентеразин-связывающей полости СВР до (черные линии) и после (серые лилии) связывания Са +. Расстояние водородных связей указано в А.

Боковая цепь А^19 ориентирована перпендикулярно полости и препятствует продвижению целентеразина вглубь белковой глобулы. 6-(и-гидрокси)-фенильная группа целентеразина располагается почти на поверхности белка, и две молекулы воды связаны с ней водородными связями (рис. 10, черные линии). Ьуз139 и Азр183 функционируют как «ворота»: молекула воды 0^1) взаимодействует с атомом азота основной цепи Авр183, и

вторая молекула воды (W2) образует водородную связь с карбонилом Lysl39 2-(н-гадрокси)-фенил целентеразина образует водородную связь с шдроксильной группой ТугЗб и атомом азота Argl9 СЗ карбонильная группа целентеразина окружена пирамидой из трех молекул воды, взаимодействующих с боковой цепью и карбонильной группой Arg22 посредством водородных связей N7 атом азота пиразинового кольца целентеразина связан водородной связью с карбонилом Phel80 (рис 10, черные линии)

В противоположность фотопротеинам, СВР не активирует молекулу целентеразина кислородом, а защищает молекулу субстрата от окисления Целентеразин не стабилен в растворе, и раннее исследование хемилюминесценции аналогов целентеразина показало, что кислород атакует Ы7-аиион - неустойчивую формы целентеразина Образование Ш-аниона происходит при сдвиге pH в щелочную область Защита целентеразина от окисления в СВР обеспечивается системой водородных связей и более кислотным окружением атома азота N7, приводящим к появлению положительного заряда на этом атоме Так, атом азота N7 связан водородной связью с карбонильной группой Phel80, что может стабилизировать положительный заряд в этом положении

4. Пространствепиая структура апоформы СВР со связанным кальцием (разрешение 1.8 Ä)

Пространственная структура апо-СВР с тремя связанными ионами кальция имеет компактную форму и характерную двухдоменную архитектуру как и СВР с целентеразином (рис II) Однако обнаруживаются видимые конформационные изменения как в Са2+-связывающих петлях, так и в а-спиралях Ионы кальция располагаются в каждом из канонических Са2+-связывающих сайтов (EF-hand петли I, III и IV) Среднеквадратичное отклонение атомов основной цепи СВР в двух состоящих составляет 3 91 А.

В субстрат-связывающей полости СВР после связывания кальция выявлены следующие изменения боковая цепь Arg22 сгибается и увлекает за собой пирамидальную сеть из 3-х молекул воды из их исходного положения над СЗ атомом кислорода целентеразина Теряются водородные связи между аминокислотами в области исходной 2-(«-гидрокси)-бензильной группы целентеразина бензольное кольцо ТугЗб разворачивается на 90°, Glnl03 - на 180°, боковая цепь Arg 19 смещается слегка вверх Боковые радикалы Lysl39 и Aspl83, которые координировали 6-(и)-гидроксифенил целентеразина через две

молекулы воды, оказываются сближенными друг к другу (рис. 10, серые линии).

Рис. 11. Пространственная структура апоформы СВР со связанными ионами кальция (показаны в виде сфер серого цвета).

В

Рис. 12. Поверхность белка СВР в целентеразин- (А) и кальций-связанной (Б) форме. Стрелка на панеле Б указывает на открытое «отверстие».

(В) Компьютерное моделирование белок-белкового взаимодействия и образование комплекса между ЯепШа люциферазой (слева) и СВР со связанным

кальцием (справа).

Помимо конформационных изменений аминокислот, участвующих в связывании субстрата, уменьшается объем (с 1044 А до 960 А) и форма полости: С-концевая часть полости «схлопывается», в то время как А/-концевая

часть слегка раскрывается, а-спирали С, БиЕ расходятся, образуя открытое для растворителя «отверстие» (рис. 12 А, Б).

Компьютерное моделирование белок-белкового взаимодействия СВР с люциферазой ЯепШа показывает, что поверхности двух белковых молекул контактируют в районе «отверстия», из которого предположительно высвобождается целентеразин, и активного центра люциферазы (рис. 12 В). 5. Филогенетические взаимосвязи «ЕР-Ьапй» целентеразин-связывающих белков

Три различных класса целентеразин-связывающих белков: СВР из мягкого коралла ЯепШа тиеИеп, фотопротеин беровин из гребневика Вегое аЬузз1со1а и фотопротеин обелин из гидроидного полипа ОЬеНа 1оп°1$йта обладают общей структурной организацией (рис. 13), общей аффинностью к кальцию, схожей локализацией «ЕР-Ьаш!» Са2+-связывающих мотивов в белке; все три белка связывают целентеразин, но выполняют различные функции.

Рис. 13. Структурное наложение трех представителей класса целентеразин-связывающих Са2+-регулируемых белков. СВР со связанным кальцием показан желтым цветом, кальций-разряженный обелин - голубым, кальций-связанный беровин - зеленым. Ионы кальция показаны в виде сфер в соответствующем цвете для каждого белка.

Несмотря на высокую структурную гомологию, все эти белки не выявляют какой-либо значимой гомолоши в первичной структуре. Высоко консервативными являются только последовательности Са2 -связывающих сайтов, а также некоторые ключевые аминокислоты, участвующие в

стабилизации 2-гадропероксицелентеразина у обелина и беровина Аминокислоты, образующие субстрат-связывающие полости (выделены серым цветом) хотя и находятся в схожих позициях, консервативными не являются

(рис 14)

обелин ---------н^куаукьктвгб------ирвигайгада>го>1нсн<жгп.БЕГУз

беровин Ш'ЕШ1Е0ИЖЗТКаЕ:ЗУСН0И(У1ПЛ:В1ЛРККЬ31Ц.7КЙГ1)Х('ВЬВЗБСКИЕ1ШЕУЬУ

СВР ИРЕПТЗЕЙАТБ------------------1КОШТШГОЛ)1ПтаХ;Е13К£1>5Е1.

■ *! " *

обелин КАЗВСЗСХКЬЕАТРЕОТКИВдаСУЕАГГКССОНЕУОКЕХАГРОГЬВОтеОЬАТЗЕЬККИА

беровин Ш>-ОЙЛЕйЬТОАТРЕОТгеИ1ШАдаТОЬШОУЕРШС1АКЕ11етЕШКдаАЕАЕКЕЕЕК

СВР 1А^1АК1АКЬЗАЕКАЕЕТК0Е|ЬВДА])аС.О1ЛРС7й13----УЕЕААШАТОЗЦЖНК

* . . * *

обелин ШЕРТЬГкШОВАетхГОКЬСЗОТХТЪЬЕВтсЫ&ЗГЗРЗОЕОСЕАТГЕЖВКВЫЗО

беровин —РСЕААТТгГЕКАГ'ТОКЗС

СВР 0ЕЕКАЛАУХфЬ1ДТОСТ1)ТВКС0ЭТЗЬРЕГК^ЬаЮОТ1)1|ТВЩАГП;ГНТЬВПШК

* * *.*»* :..*.*

обелин оътоаш.шь&'Чтт-ьътЕА--

беровин И-ЕНТЕЬТВЬГЫХШЕРТЕРС!«—ООГТАТК-Г

СВР

. * * ф

Рис. 14. Элайнмент аминокислотных последовательностей обелина, беровина и СВР Аминокислоты, образующие субстрат-связывающие полости, выделены серым цветом Идентичные аминокислотные остатки выделены звездочками, замена консервативной аминокислоты показана точкой, замена полуконсервативного остатка обозначена двумя точками

Возникновение целентеразин-зависимой биолюминесценции в различных организмах, по-видимому, связано с появлением в этих организмах самого целентеразина, который мог попадать в организмы по пищевой цепи В настоящее время обнаружено множество различных биолюминесцентных морских организмов, где субстратом реакции является целентеразин, но аминокислотные последовательности люцифераз не выявляют какой-либо гомологии между собой Вероятнее всего, не удастся обнаружить и какой-либо структурной гомологии между ними Это лишний раз указывает на то, что биолюминесценция многократно и независимо возникала в ходе эволюции, а последующая эволюция протекала независимо и шла по пути оптимизации как самого белка для оптимального протекания хемшпоминесцентной реакции, так и белкового окружения, приспосабливая для эффективной биолюминесценции дополнительные белки, например, СВР

выводы

1 Впервые получены кристаллы и определены кристаллические структуры Са2+-разряженного фотопротеина обелина из гидроида Obeha longissima со связанными целентерамидом и ионами кальция с разрешением 1 9 Á, апоформы фотопротеина беровина из Beroe abyssicola со связанными ионами кальция с разрешением 2 О А и целентеразин-связывающего белка из Remlla muelleri как в апоформе с ионами кальция (разрешение 1 8 А), так и со связанным целентеразином (разрешение 1 7 А)

2 Установлено, что данные целентеразин-связывающие белки принадлежат к представителям класса модуляторов кальциевых сигналов Са2+-связывающих белков «EF-hand» типа и выявляют высокую структурную гомологию между собой, несмотря на низкую идентичность аминокислотных последовательностей Ионы кальция координируются «EF-hand» мотивами I, Ш и IV во всех трех белках по схеме пентагональной бипирамиды

3 Для СВР, связанного с целентеразином, показано, что молекула субстрата располагается в гидрофобной полости белка, доступной для растворителя, и в непосредственном связывании целентеразина участвует пять молекул воды Показано, что карбонильная группа Phel80 стабилизирует субстрат и защищает его от окисления Нарушение водородных связей, координирующих субстрат, после связывания с СВР ионов кальция приводит к высвобождению целентеразина из гидрофобной полости Компьютерное моделирование белок-белкового взаимодействия СВР с люциферазой Remlla показывает, что поверхности двух белковых молекул контактируют в районе «отверстия», из которого, предположительно, высвобождается целентеразин из молекулы СВР после связывания ионов кальция, и активного центра люциферазы

4 Показано, что субстрат-связывающая полость в обелине остается недоступной растворителю и после биолюминесцентной реакции Сделано заключение, что молекула воды активного центра обелина участвует в протонировашга аниона диоксготанона, распад которого приводит к образованию первичного возбужденного состояния целентерамида в нейтральной форме

5 На мутантах обелина (Р88У) и акворина (У82Б) впервые показано, что дополнительная водородная связь между шдроксилыюи группой Туг и атомом кислорода 6-(л-гадрокси)-фепилыюи группы целентеразина определяет различие спектральных характеристик этих двух фотопротеинов

6 На мутантах обелина с заменами гидрофобных аминокислотных остатков Не 144 и Мс(25 на полярные аминокислоты (аргинин, гастидин) впервые показано, что изменение полярности окружения эмиттера приводит к сдвигу максимума биолюминесценции в длинноволновую область спектра Сделано заключение, что сдвиг максимума биолюминесценции обусловлен резонансными формами фенолят-аниона целентерамида в возбужденном состоянии

7 Показано, что аминокислотные остатки, формирующие субстрат-связывающие полости в беровине и обелине, различаются, за исключением трех аминокислот Туг133, №$186 и Туг204 (Туг138, Ню 175 и Туг 190 в обелине), образующих каталитическую «триаду» Сделано заключение, что механизм биолюминесцентной реакции является одинаковым для всех Са2+ -регулируемых фотопротеинов

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1 Stepanyuk, G.A Crystal structure of coelenterazine-binding protein from Remlla muelleri at 1 7 A Why it is not a calcium-regulated photoprotem / G A Stepanyuk, Z J Liu, S S Markova, L A. Frank, J Lee, E S Vysotski, В С Wang//PhotochemPhotobiol Sci -2008 -V4 -P 442-447

2 Liu, Z J Crystal structure of obelm after Ca2+-tnggered bioluminescence suggests neutral coelenteramide as the primary excited state / Z J Liu, G.A. Stepanyuk, ES Vysotski, J Lee, SV Markova, NP Malikova,BC Wang//P Natl acad sci U S A. - 2006 -V21 -P 2570-2575

3 Stepanyuk, G.A Interchange of aequorin and obelm bioluminescence color is determined by substitution of one active site residue of each photoprotem / G.A. Stepanyuk, S Golz, S V Markova, L A Frank, J Lee, E S Vysotski // FEBS Lett -2005 -V 14 -P 1008-1014

4 Степашок, Г.А Tyr82 - одна из ключевых аминокислот активного центра акворина, определяющая его спектральные свойства / ГА Степанюк // Материалы конференции молодых ученых КНЦ СО РАН -Красноярск ИВМ СО РАН, 2004 - С 53-56

5 Stepanyuk, G.A. Coelenterazine-binding protem or Remlla muelleri cloning and determination of three-dimensional structure / G A Stepanyuk, S V Markova, Z J Liu, L A Frank, J Lee, В С Wang // Luminescence - 2006 -V 21 -P 292

6 Stepanyuk, G.A. Spectral difference between obelm and aequorin is determined by the residue on position 88 / G A Stepanyuk, S V Markova, LA Frank, J Lee, E S Vysotski // Luminescence -2004 -V 19 -P 175-176

Подписано в печать 17 06 08 Тираж 80 экз Заказ №277

Отпечатано в типографии «ДарМа-печать» 660036 г Красноярск, Академгородок, 50/28 офис 156, т 90-72-32

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Степанюк, Галина Анатольевна

Введение

ГЛАВА 1 Многообразие Са -связывающих белков.

1.1 Структура Са2+-связывающих мотивов «ЕР-Ьапс!» типа.

1.2 Структурная организация Са -связывающих белков «ЕР-Ьапс!» типа.

1.2.1 Классические Са -связывающие сенсорные белки.

1.2.2 Классические «ЕР-Ьапё» модуляторы кальциевого сигнала.

1.3 Биолюминесцентные Са -регулируемые белки «ЕР-Ьапс!» типа.

1.3.1 Механизм биолюминесценции Са -регулируемых фотопротеинов.

ГЛАВА 2 Материалы и методы.

2.2 Экспрессия и очистка белка.

2.2.1 Получение Са -разряженного обелина со связанным целентерамидом

2.2.2 Выделение и очистка беровина.

2.2.3 Получение целентеразин-связывающего белка со связанным целентеразином.

2.2.4 Получение апоформы целентеразин-связывающего белка со связанным кальцием.

2.3 Определение удельной биолюминесцентной активности, концентрации белка и спектральные измерения.

2.4 Кристаллография.

2.5 Программное обеспечение.

2.6 Реактивы.

ГЛАВА 3 Кристаллические структуры «ЕБ-Иапс!» Са" -регулируемых фотопротеинов из ОЬеНа \ongissima и Вегое аЬуз8юо1а.

3.1 Пространственная кристаллическая структура Са2+-разряженного обелина из ОЬеНа 1ощ1з8та со связанным целентерамидом.

3.1.1 Кристаллизация.

3.1.2 Общая структура белка.

3.1.3 «ЕР-ЬапсЬ Са~ -связывающие петли.

3.1.4 Целентерамид-связывающая полость.

3.1.5 Механизм образования первичного эмиттера в биолюминесценции

Са -регулируемых фотопротеинов.

3.1.6 Влияние аминокислот целентеразин-связывающей полости на формирование вторичного эмиттера.

3.2 Пространственная кристаллическая структура Са" -связанного апоберовина из Вегое аЬуззгсо1а.

3.2.1 Кристаллизация.

3.2.2 Общая белковая структура.

3.2.3 «ЕР-Ьапё» Са -связывающие петли беровина.

3.2.4 Целентеразин-связывающая полость беровина.

3.2.5 Фотоинактивация.

ГЛАВА 4 Пространственная кристаллическая структура целентеразин-связывающего белка из ЯепШа тиеНетч.

4.1 Пространственная кристаллическая структура целентеразин-связывающего белка со связанным целентеразином.

4.1.1 Кристаллизация целентеразин-связывающего белка со связанным целентеразином.

4.1.2 Общая структурная организация целентеразин-связывающего белка.

4.1.3 Целентеразин-связывающая полость.

4.2 Пространственная кристаллическая структура апоформы целентеразинсвязывающего белка со связанным кальцием.

4.2.1 Кристаллизация.

4.2.2 Пространственная структура апоформы целентеразин-связывающего белка со связанным кальцием.

4.2.3 Взаимодействие между «ЕР-Иапс!» мотивами и Ы- и С-доменами.

4.2.4 Углы, образованные а-спиралями.

4.2.5 «ЕР-Ьапё» кальций-связывающие петли целентеразин-связывающего белка.

4.2.6 Изменения в целентеразин-связывающей полости в Са -связанной апоформе целентеразин-связывающего белка.

ГЛАВА 5 Филогенетические взаимосвязи и функциональные особенности «ЕР-Иат!» целентеразин-связывающих белков.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональные особенности кальций-регулируемых целентеразин-связывающих белков"

Биолюминесценция — явление, широко представленное в природе. Светящиеся организмы встречаются среди бактерий, грибов, простейших, кишечнополостных, червей, моллюсков, насекомых и рыб. Хотя светящиеся организмы стоят на разных ступенях эволюционной лестницы, все они имеют одинаковую природу свечения. Фактически, биолюминесценция - это хемилюминесцентная реакция, в которой происходит окисление субстрата -люциферина, катализируемое специфическим ферментом — люциферазой. Люциферины и люциферазы разных организмов являются соединениями различной структуры и поэтому это понятие скорее собирательное и функциональное, чем структурно-химическое. Это также показывает, что биолюминесценция многократно и независимо возникала в ходе эволюции. Несмотря на то, что биолюминесценция исследуется уже более 100 лет, причины возникновения, значение для организмов, ею обладающих, все еще остаются загадкой.

Несмотря на широкое распространение биолюминесценции в природе, к настоящему времени наибольшее количество светящихся видов обнаружено все же среди морских организмов. Среди морских светящихся видов, чьи биолюминесцентные системы хотя бы немного охарактеризованы, наиболее часто встречаются организмы, использующие целентеразин как субстрат биолюминесцентной реакции. Так, целентеразин является субстратом Са" -регулируемых фотопротеинов и целого ряда люцифераз из животных, принадлежащих к различным классам организмов.

Наиболее известными и изученными представителями целентеразин-зависимых биолюминесцентных систем являются Са2+-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных. Фотопротеины представляют собой комплекс, состоящий из молекулы белка (-22 кДа) и «преактивированного» кислородом целентеразина (2гидропероксицелентеразина) прочно, но не ковалентно связанного с белком.

Биолюминесценция инициируется добавлением ионов кальция и возникает при декарбоксилирования 2-гидропероксицелентеразина. В результате реакции образуется молекула целентерамида в возбужденном состоянии и ССЬ. Переход целентерамида из возбужденного в основное состояние сопровождается излучением кванта света. Са2+-регулируемые фотопротеины принадлежат к суперсемейству Са -связывающих белков «EF-hand» типа. Это семейство представляет собой обширный класс белков с разнообразной структурной организацией, но обладающих одним общим свойством - функциональная активность этих белков регулируется ионами кальция. К суперсемейству белков «EF-hand» типа принадлежат белки, регулирующие клеточные процессы, модуляторы внутриклеточных кальциевых сигналов и многие ферменты. Например, в организме представители этого суперсемейства регулируют мышечное сокращение, фоторецепцию, клеточную дифференциацию и пролиферацию, апоптоз и многие другие процессы.

Люцифераза мягкого коралла Renilla также использует целентеразин в качестве субстрата. Однако, в случае Renilla, биолюминесцентная система устроена более сложно. В биолюминесценцию животных in vivo вовлечено три i белка: люцифераза, зеленый флуоресцентный белок и Са -регулируемый целентеразин-связывающий белок (СВР). Фактически, «субстратом» люциферазы Renilla в биолюминесцентной реакции in vivo является СВР, содержащий одну молекулу прочно связанного целентеразина. Целентеразин становится доступным для реакции с люциферазой и 02 только после связывания с СВР ионов кальция. В отличие от Са2+-регулируемых фотопротеинов в молекуле СВР не происходит активации кислородом молекулы целентеразина. Хотя как СВР, так и Са" -регулируемые фотопротеины связывают целентеразин, они выполняют различные функции, используя, вероятно, для этого различные молекулярные механизмы.

В лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН были клонированы кДНК гены, кодирующие Са" -регулируемый фотопротеин обелин из гидроида Obelia longissima, светочувствительный Са2+-регулируемый о | фотопротеин беровин из гребнивика Beroe abyssicola и Са -регулируемый целентеразин-связывающий белок из Renilla muelleri, и в настоящее время проводится всестороннее изучение этих целентеразин-связывающих белков. В течение последних нескольких лет были определены пространственные кристаллические структуры трех конформационных состояний Са2+-регулируемого фотопротеина обелина [Liu et al., 2000; Deng et al., 2005; Deng et al., 2004] из пяти, обнаруженных с помощью ЯМР. Эти структуры позволили высказать предположения относительно функции некоторых аминокислотных остатков в каталитической реакции фотопротеинов. Однако до недавнего времени отсутствовала информация о пространственной структуре обелина непосредственно после биолюминесцентной реакции, т.е. с ионами кальция и I продуктом реакции в активном центре (Са~ -разряженный обелин). Также не были установлены третичные структуры ни для Са2+-регулируемого целентеразин-связывающего белка из мягкого коралла Renilla, ни для светочувствительных фотопротеинов из гребневиков.

Целью данной работы было установление пространственных кристаллических структур Са2+-регулируемых целентеразин-связывающих белков, принадлежащих разным биолюминесцентным системам: Са -разряженного обелина из гидроидного полипа Obelia longissima, беровина из гребневика Beroe abyssicola, СВР из мягкого коралла Renilla muelleri для установления их структурно-функциональных особенностей.

Выполнение исследования требовало решения следующих задач:

1. Найти условия кристаллизации для каждого отдельного белка и получить пригодные для рентгеновской дифракции кристаллы.

2. Получить дифракционные данные от кристаллов и разрешить фазовую проблему. Построить модели кристаллической структуры белка по полученной электронной плотности.

3. Проверить гипотезу о формировании эмиттера в биолюминесцентной реакции Са2+-регулируемых фотопротеинов с помощью замен ключевых аминокислотных остатков, локализованных в активных центрах обелина (Phe88, Met 25, Ilel44) и акворина (Туг82). При решении поставленных задач были получены результаты, которые выносятся на защиту:

1. Все исследованные в данной работе Са2+-регулируемые целентеразин-связывающие белки относятся к Са2+-связывающим белкам «EF-hand» типа и принадлежат к классу модуляторов кальциевых сигналов. Са2+-регулируемые целентеразин-связывающие белки выявляют высокую структурную гомологию, несмотря на низкую гомологичность их первичных аминокислотных последовательностей. Ионы кальция координируются I, III и IV «EF-hand» мотивами белков по классической схеме пентагональной бипирамиды. л г

2. Исходя из пространственной структуры Са -разряженного обелина (обелин, связанный с продуктом реакции, целентерамидом, и ионами кальция), предложен механизм образования первичного возбужденного состояния в биолюминесцентной реакции Са2+-регулируемых фотопротеинов. Мутации «некаталитических» аминокислот (Met25 и Не 144) в субстрат-связывающей полости обелина, изменяющие полярность гидрофобной полости или приводящие к образованию дополнительной водородной связи (F88Y) с 6-(и-гидрокси)-фенильной группой целентеразина, приводят к изменению спектра биолюминесценции.

3. Са2+-регулируемый фотопротеин беровин образует гидрофобную полость в центре белковой молекулы со сходной с обелином и акворином геометрией и расположением. Однако аминокислоты, формирующие гидрофобную полость беровина, не выявляют какой-либо структурной гомологии с амнокислотами субстрат-связывающих полостей обелина или акворина, за исключением двух аминокислот -His 186 и Туг204. Эти аминокислоты находятся в тех же позициях, что и His 175 и Туг 190 в обелине, и ответственны за стабилизацию высоколабильного 2-гидропероксицелентеразина в активном центре фотопротеина и за инициацию биолюминесцентной реакции. Несмотря на вариабельность аминокислотного окружения в субстрат-связывающих центрах фотопротеинов, предполагается, что каталитический механизм биолюминесцентной реакции для всех Са2+-регулируемых фотопротеинов одинаков.

4. В отличие от Са -регулируемых фотопротеинов в Са~ -регулируемом целентеразин-связывающем белке ЯепШа молекула целентеразина располагается в гидрофобной полости, доступной растворителю, и 5 молекул воды участвуют в непосредственном связывании субстрата. В связывании целентеразина и защите его окисления участвует карбонильная группа Туг180 через образование водородной связи с 1ЧН-группой целентеразина. Связывание ионов кальция с белком приводит к изменениям в положении аминокислот и молекул воды в субстрат-связывающей полости СВР, приводя к потере водородных связей, участвующих в координации субстрата, и высвобождению целентеразина из гидрофобной полости через образовавшееся «отверстие» между а-спиралями С, О и Е.

Все результаты, представленные в данной работе, получены впервые и имеют фундаментальный характер, так как добавили новую информацию к пониманию механизма биолюминесцентной реакции, к происхождению целентеразин-зависимых биолюминесцентных систем и позволили найти различия для трех различных классов этих белков на молекулярном уровне. Кроме того, полученные результаты могут найти применение в прикладных исследованиях. Например, установление роли отдельных аминокислотных остатков в связывании субстрата, биолюминесцентном катализе и формировании эмиттера обеспечит основу для белковой инженерии целентеразин-зависимых белков с целью получения репортерных белков с измененными свойствами (увеличенная удельная активность, измененные спектральные свойства и т. д.), которые могут найти применение при разработке новых биолюминесцентных технологий для биологии, медицины, фармацевтической промышленности.

Работа выполнена при поддержке Программы РАН «Молекулярная и клеточная биология», грантов РФФИ № 02-04-49419 и № 05-04-48271.

Материалы диссертационной работы докладывались на Конференции молодых ученых КНЦ СО РАН (Красноярск, 2004), Международных симпозиумах по Биолюминесценции и Хемилюминесценции (Йокогама, Япония, 2004; Сан-Диего, США, 2006); на 3-м симпозиумуме БЕЯ-САТ (Атланта, США, 2006); на семинарах лаборатории Фотобиологии Института биофизики СО РАН и Департамента Биохимии и Молекулярной биологии Университета штата Джорджии (США).

Результаты исследований опубликованы в 3 статьях в рецензируемых журналах.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Степанюк, Галина Анатольевна

106 выводы

1. Впервые получены кристаллы и определены кристаллические структуры Са2+-разряженного фотопротеина обелина из гидроида Obelia longissima со связанными целентерамидом и ионами кальция с разрешением 1.9 Ä, апоформы фотопротеина беровина из Beroe abyssicola со связанными ионами кальция с разрешением 2.0 Ä и целентеразин-связывающего белка из Renilla muelleri как в апоформе с ионами кальция (разрешение 1.8 Ä), так и со связанным целентеразином (разрешение 1.7 Ä).

2. Установлено, что данные целентеразин-связывающие белки принадлежат к о. представителям класса модуляторов кальциевых сигналов Са -связывающих белков «EF-hand» типа и выявляют высокую структурную гомологию между собой, несмотря на низкую идентичность аминокислотных последовательностей. Ионы кальция координируются «EF-hand» мотивами I, III и IV во всех трех белках по схеме пентагональной бипирамиды.

3. Для СВР, связанного с целентеразином, показано, что молекула субстрата располагается в гидрофобной полости белка, доступной для растворителя, и в непосредственном связывании целентеразина участвуют пять молекул воды. Показано, что карбонильная группа Phel80 стабилизирует субстрат и защищает его от окисления. Нарушение водородных связей, координирующих субстрат, после связывания с СВР ионов кальция приводит к высбождению целентеразина из гидрофобной полости. Компьютерное моделирование белок-белкового взаимодействия СВР с люциферазой Renilla показывает, что поверхности двух белковых молекул контактируют в районе «отверстия», из которого предположительно высвобождается целентеразин из молекулы СВР после связывания ионов кальция, и активного центра люциферазы.

4. Показано, что субстрат-связывающая полость в обелине остается недоступной растворителю и после биолюминесцентной реакции. Сделано заключение, что молекула воды активного центра обелина участвует в протонировании аниона диоксиэтанона, распад которого приводит к образованию первичного возбужденного состояния целентерамида в нейтральной форме.

5. На мутантах обелина (Р88У) и акворина (У82Р) впервые показано, что дополнительная водородная связь между гидроксильной группой Туг и атомом кислорода 6-(и-гидрокси)-фенильной группы целентеразина определяет различие спектральных характеристик этих двух фотопротеинов.

6. На мутантах обелина с заменами гидрофобных аминокислотных остатков Не 144 и Ме125 на полярные аминокислоты (аргинин, гистидин) впервые показано, что изменение полярности окружения эмиттера приводит к сдвигу максимума биолюминесценции в длинноволновую область спектра. Сделано заключение, что сдвиг максимума биолюминесценции обусловлен резонансными формами фенолят-аниона целентерамида в возбужденном состоянии.

7. Показано, что аминокислотные остатки, формирующие субстрат-связывающие полости в беровине и обелине, различаются, за исключением трех аминокислот Туг133, Н1з186, и Туг204 (Туг138, Н1з175 и Туг190 в обелине), образующих каталитическую «триаду». Сделано заключение, что механизм биолюминесцентной реакции является одинаковым для всех Са2+-регулируемых фотопротеинов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целентеразин-зависимые люминесцентные белки представляют собой обширный класс белков из разнообразных морских организмов, утилизирующих целентеразин как субстрат биолюминесцентной реакции.

Представленная работа посвящена определению и анализу кристаллических пространственных структур трех классов целентеразин-связывающих белков: фотопротеина обелина из кишечнополостных со связанным кальцием и продуктом реакции в активном центре белка, светочувствительного кальций-связанного апофотопротеина беровина из гребневиков и целентеразин-связывающего белка из мягкого коралла ЯепШа как со связанным целентеразином, так и в кальций-связанной апоформе. Все эти белки участвуют в связывании целентеразина и регулируются ионами кальция, однако выполняют различные функции. Фотопротеины функционируют как биолюминесцентные белки вследствие индукции ионами кальция реакции окислительного декарбоксилирования связанного в активном центре 2-пероксицелентеразина. Функцией СВР является кальций-индуцированное высвобождение субстрата для реакции с ЯетПа люциферазой.

Структурно-функциональная геномика и анализ пространственных белковых структур может приблизить понимание их эволюционного происхождения и особенностей функционирования. Результаты настоящей работы демонстрируют структурные особенности организации целентеразин-связывающих белков из разных классов и объясняют некоторые функциональные особенности этих белков, исходя из их кристаллической структуры.

Представленные целентеразин-связывающие белки относятся к суперсемейству кальций-связывающих белков «ЕР-Ьапс!» типа и обладают сходной общей белковой структурой. В настоящее время основным подходом для выяснения филогенетического родства белков является анализ первичных белковых последовательностей и построение эволюционного дерева на основе этих данных. Целентеразин-связывающие белки не обладают высокой гомологией первичных последовательностей, однако проявляют высокую гомологию в структурной организации и участвуют в связывании субстрата одной химической природы. Так, для выяснения филогенетического родства белков может применяться как анализ первичных последовательностей белков, так и установление структурного родства.

Структурно-функциональное разнообразие класса целентеразин-связывающих белков может объясняться тем, что целентеразин-зависимая биолюминесценция многократно и независимо возникала в природе. Как предполагается, изначально целентеразин выступал как антиоксидант в классе Crustacea, а перенос люциферина по пищевой цепи привел к его использованию в качестве билюминесцентного субстрата многими организмами классов Hydrozoa, Anthozoa и других. Однако в силу видового многообразия светящихся организмов целентеразин-связывающие белки также являются разнообразными белками, и существуют различные механизмы осуществления реакции биолюминесценции и ее контроля. По всей видимости, одним из условий обретения кальций-связывающими белками «EF-hand» типа способности связывать целентеразин явилось наличие гидрофобной полости, обеспечивающей оптимальное окружение для развития хемилюминесцентной реакции в фотопротеинах, и гидрофобной полости в СВР, позволяющей стабилизировать и сохранять субстрат для использования Renilla люциферазой. В дальнейшем целентеразин-связывающие белки эволюционировали независимо для приобретения оптимального окружения субстрат-связывающих полостей и оптимальной регуляции функций ионами кальция.

В заключение выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю к.б.н. Е.С. Высоцкому, моим коллегам из лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН за помощь в постановке и проведении экспериментов, интерес к работе и обсуждение полученных результатов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Степанюк, Галина Анатольевна, Красноярск

1. Высоцкий, Е.С. Кальций-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных / Е.С. Высоцкий, С.В. Маркова, J1.A. Франк // молекулярная биология. - 2006. - Т.40, №3. - С. 404 - 417.

2. Пермяков, Е.А. Кальций-связывающие белки / Е.А. Пермяков. М: Наука, 1993.- 192 с.

3. Ahmad, I. Effect of light intensity and wavelengths on photodegradation reactions of riboflavin in aqueous solution / I. Ahmad, Q. Fasihullah, F.H. Vaid // J. Photochem. Photobiol. B. 2006. - V. 82. - P. 21-27.

4. Akke, M. Solution structure of Cd2+-calbindin D9k reveals details of the stepwise structural changes along the Apo—>(Ca2+)IIl—э>(Са2+)1Д12 binding pathway / M. Akke, S. Forsen, W.J. Chazin // J. Mol. Biol. 1995. - V. 252. -P. 102-121.

5. Allen, D.G. Aequorin luminescence: relation of light emission to calcium concentration a calcium independent component / D.G. Allen, J.R. Blinks, F.G. Prendergast // Science. - 1977. - V. 195. - P. 996-998.

6. Ames, J.B. Molecular mechanics of calcium-myristoyl switches // J.B. Ames, R. Ishima, T. Tanaka, J.I. Gordon, L. Stryer, M. Ikura // Nature. 1997. - V. 389.-P. 198-202.

7. Ames, J. B. Structure and calcium-binding properties of Frql, a novel calcium sensor in the yeast Saccharomyces cerevisiae / J.B. Ames, K.B. Hendricks, T. Strahl, I.G. Huttner, N. Hamasaki, J. Thorner // Biochemistry. 2000. - V. 39. -P. 12149-12161.

8. Anctil, M. Mechanism of photoinactivation and re-activation in the bioluminescence system of the ctenophore Mnemiopsis / M. Anctil, O. Shimomura // Biochem. J. 1984. - V. 221. - P. 269-272.

9. Babini, E. Principal component analysis of the conformational freedom within the EF-hand superfamily / E. Babini, I. Bertini, F. Capozzi, C. Luchinat, A. Quattrone, M. Turano // J. Proteome Res. 2005. - V. 4. - P. 1961-1971.

10. Babu, Y.S. Three-dimensional structure of calmodulin / Y.S. Babu, J.S. Sack, T.J. Greenhough, C.E. Bugg, A.R. Means, W.J. Cook // Nature. 1985. - V. 315.-P. 37-40.

11. Bahler, M. Calmodulin signaling via the IQ motif / M. Bahler, A. Rhoads // FEBS Letters.-2002.-V. 513.-P. 107-113.

12. Berman, H.M. The Protein Data Bank / H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 235-242.

13. Berridge, M. J. The versatility and universality of calcium signaling / M.J. Berridge, P. Lipp, M.D. Bootman // Nat Rev. Mol. Cell Biol. 2000. - V. 1. -P. 11-21.

14. Biekofsky, R. R. Co-operative cyclic interactions involved in metal binding to pairs of sites in EF-hand proteins / R.R. Biekofsky, J. Feeney // FEBS Lett. — 1998.-V. 439.-P. 101-106.

15. Brunei, S. Modulation of CaVl .2 channels by Mg acting at an EF-hand motif in the COOH-terminal domain / S. Brunei, T. Scheuer, R. Klevit, W.A. Catterall // J. Gen. Physiol. 2005. - V. 126. - P. 311-323.

16. Campbell, A. K. Extraction, partial purification and properties of obelin, the calcium-activated luminescent protein from the hydroid Obelia geniculata / A. K. Campbell // Biochem. J. 1974. - V. 143. - P. 411-418.

17. Capozzi, F. EF-hand protein dynamics and evolution of calcium signal transduction: an NMR view / F. Capozzi, F. Casadei, C. Luchinat // Biol. Inorg. Chem. J. 2006. - V. 11. - P. 949-962.

18. Carafoli, E. Generation, control, and processing of cellular calcium signals / E. Carafoli, L. Santella, D. Branca, M. Brini // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. -2001.-V. 36.-P. 107-260.

19. Charbonneau, H. Ca -induced bioluminescence in Renilla reniformis. Purification and characterization of a calcium-triggered luciferin-binding protein / H. Charbonneau, M.J. Cormier // J. Biol. Chem. 1979. - V. 254. -P. 769-780.

20. Charbonneau, H. Amino acid sequence of the calcium-dependent photoprotein aequorin / H. Charbonneau, K.A. Walsh, R.O. McCann, F.G. Prendergast, M.J. Cormier, T.C. Vanaman // Biochemistry. 1985. - V. 24. - P. 6762-6771.1. Vi

21. Chen, C.-K. Ca -dependent interaction of recoverin and rhodopsin kinase / C.-K. Chen, J. Inglese, R.J. Lefkowitz, J.B. Hurley // J. Biol Chem. 1995. -V. 270.-P. 18060-18066.

22. Cook, W. J. Three-dimensional structure of a sarcoplasmic calcium-binding protein from Nereis diversicolor / W.J. Cook, S.E. Ealick, Y.S. Babu, J.A. Cox, S. Vijay-Kumar // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. - P. 652-656.

23. Cook, W. J. Structure of a sarcoplasmic calcium-binding protein from amphioxus refined at 2.4 Â resolution / W.J. Cook, L.C. Jeffrey, J.A. Cox, S. Vij ay-Kumar// J. Mol. Biol. 1993. -V. 229. - P. 461-471.

24. Cormier M.J. Evidence for identity of the luminescent system of Porichthys porosissimus (fish) and Cypridina hilgendorfii (crustacean) / M. J. Cormier, J.M. Crane, Y. Nakano // Biochem. Biophys. Res.Commun. 1967. - V. 29. -P. 747-752.

25. Cormier, M.J. Evidence for similar biochemical requirements for bioluminescence among the coelenterates / M. J. Cormier, K. Hori, Y.D. Karkhanis, J.M. Anderson, J.E. Wampler, J.G. Morin, J.W. Hastings // J. Cell. Physiol. 1973. -V. 81. - P. 291-297.

26. Cox, J.A. Characterization of a new sarcoplasmic calcium-binding protein with magnesium-induced cooperativity in the binding of calcium / J.A. Cox, E.A. Stein//Biochemistry. 1981. - V. 20. - P. 5430-5436.

27. Cox, J. A. Remodeling of the AB site of rat parvalbumin and oncomodulin into a canonical EF-hand / J.A. Cox, I. Durussel, D.J. Scott, M.W. Berchtold // Eur. J. Biochem. 1999. - V. 264. - P. 790-799.

28. Crivici, A. Molecular and structural basis of target recognition by calmodulin / A. Crivici, M. Ikura // Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1995. - V. 24. -P. 85-116.

29. Daunert, S. Photoproteins in bioanalysis / S. Daunert, S.K. Deo. Weinheim: Wiley-VCH, 2006. - 240 p.

30. Deng, L. Structural basis for the emission of violet bioluminescence from a W92F obelin mutant / L. Deng, E.S. Vysotski, Z.-J. Liu, S.V. Markova, N.P. Malikova, J. Lee, J. Rose, B.-C. Wang // FEBS Lett. 2001. - V. 506. - P. 281-285.

31. Ebel H. Magnesium metabolism: a review / H. Ebel, T.J. Gunther // Clin. Chem. Clin. Biochem. 1980. -V. 18. - P. 257-270.

32. Evenas, J. Calcium / J. Evenas, A. Malmendal, S. Forsen // Curr. Opin. Chem. Biol. 1998. - V. 2. - P. 293-302.

33. Falke, J. J. Molecular tuning of ion binding to calcium signaling proteins / J.J. Falke, S. K. Drake, A.L. Hazard, O.B. Peersen // Quart. Rev. Biophys. 1994. -V. 27.-P. 219-290.

34. Finn, B.E. Calcium-induced structural changes and domain autonomy in calmodulin / B.E. Finn, J. Evanas, T. Drakenberg, J.P. Waltho, E; Thulin, S. Forsen // Nature Struct. Biol. 1995. - V. 2. - P. 777-783.

35. Gagne, S.M. Structures of the troponin C regulatory domains in the apo and calcium-saturated states / S.M. Gagne, S. Tsuda, M.X. Li, L.B. Smillie, B.D. Sykes // Nature Struct. Biol. 1995. - V. 2. - P. 784-789.

36. Gifford, J. L. Structural and metal ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs / J.L. Gifford, M.P Walsh, H.J. Vogel // Biochem. J.-2007.-V. 405.-P. 199-221.

37. Girsch, S.J. The properties of mnemiopsin, a bioluminescent and light sensitive protein purified by hollow fiber techniques / S.J. Girsch, J.W. Hastings // Mol. Cell. Biochem. 1978. -V. 19. - P. 113-124.

38. Godzika, A. Conservation of residue interactions in a family of Ca-binding proteins / A. Godzika, C. Sander // Protein Eng. 1989. - V. 2. - P. 589-596.

39. Goto, T. Chemistry of bioluminescence / T. Goto // Pure Appl. Chem. 1968. -V. 17.-P. 421-441.

40. Grabarek, Z. Molecular mechanism of troponin-C function / Z. Grabarek, T. Tao, J. Gergely // J. Muscle Res. Cell Motil. 1992. - V. 13. - P. 383-393.

41. Grabarek, Z. Structure of a trapped intermediate of calmodulin: calcium regulation of EF-hand proteins from a new perspective / Z. Grabarek // J. Mol. Biol.-2005.-V. 346.-P. 1351-1366.

42. Grabarek, Z. Structural basis for diversity of the EF-hand calcium-binding proteins / Z. Grabarek // J. Mol. Biol. 2006. - V. 359. - P. 509-525.

43. Haddock, S.H. Can coelenterates make coelenterazine? Dietary requirement for luciferin in cnidarian bioluminescence / S.H. Haddock, TJ. Rivers, B.H. Robison // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V. 98. - P. 11148-11151.

44. Hastings, J.W. Intermediates in the bioluminescent oxidation of reduced flavin mononucleotide / J.W. Hastings, Q.H. Gibson // J. Biol.Chem. 1963. - V. 238.-P. 2537-2554.

45. Hastings, J.W. Calcium-triggered light emission in Renilla. A unitary biochemical scheme for coelenterate bioluminescence / J.W. Hastings, J.G. Morin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1969. - V. 37. - P. 493-498.

46. Head, J.F. The crystal structure of the photoprotein aequorin at 2.3 A resolution // J.F. Head, S. Inouye, K. Teranishi, O. Shimomura // Nature. -2000. V. 405. - P. 372-376.

47. Hermann A. Sarcoplasmic calcium-binding protein / A. Hermann, J.A. Cox // Comp. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1995. - V. 235. - P. 271-275.

48. Herzberg, O. Refined crystal structure of troponin C from turkey skeletal muscle at 2.0 A resolution / O. Herzberg, M. N. James // J. Mol. Biol. 1988. -V. 203.-P. 761-779.

49. Hohenester, E. Structure of a novel extracellular Ca2+-binding module in Bm-40 / E. Hohenester, P. Maurer, C. Hohenadl, R. Timpl, J.N. Jansonius, J. Engel // Nature Struct. Biol. 1996. - V. 3. - P. 67-73.

50. Hori, K. Renilla luciferin as the substrate for calcium induced photoprotein bioluminescence. Assignment of luciferin tautomers in aequorin and mnemiopsis / K. Hori, J.M. Anderson, W.W. Ward, M.J. Cormier // Biochemistry. 1975. - V. 14. - P. 2371-2376.

51. Ikura, M. Solution structure of a calmodulin-target peptide complex by multidimensional NMR / M. Ikura, G.M. Clore, A.M. Gronenborn, G. Zhu, C.B. Klee, A. Bax // Science. 1992. - V. 256. - P. 632-638.

52. Ikura, M. Genetic polymorphism and protein conformational plasticity in thecalmodulin superfamily: two ways to promote multifunctionality / M. Ikura, J.B. Ames//. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2006. - V. 103.-P. 1159-1164.

53. Inouye, S. Secretional luciferase of the luminous shrimp Oplophorus gracilirostris: cDNA cloning of a novel imidazopyrazinone luciferase / S. Inouye, K. Watanabe, H. Nakamura, O. Shimomura // FEBS Lett. 2000. - V. 481.-P. 19-25.

54. Jia, J. Structure of apoptosis-linked protein ALG-2: insights into Ca -induced changes in penta-EF-hand proteins / J. Jia, S. Tarabykina, C. Hansen, M. Berchtold, M. Cygler // Structure. 2001. - V. 9. - P. 267-275.

55. Jurado, L.A. Apocalmodulin / L.A. Jurado, P.S. Chockalingam, H.W. Jarrett // Physiol. Rev. 1999. - V. 79. - P. 661-682.

56. Kahl, C.R. Regulation of cell cycle progression by calcium/calmodulin-dependent pathways / C.R. Kahl, A.R. Means // Endocr. Rev. 2003. - V. 24. -P. 719-736.

57. Kawasaki, H. Classification and evolution of EF-hand proteins / H. Kawasaki, S. Nakayama, R.H. Kretsinger // Biometals. 1998. - V. 11. - P. 277-295.

58. Kojetin, D.J. Structure, binding interface and hydrophobic transitions of Ca" -loaded calbindin-D28K / D.J. Kojetin, R.A. Venters, D.R. Kordys, R.J.

59. Thompson, R. Kumar, J. Cavanagh // Nat. Struct. Mol. Biol. 2006. - V. 13. -P. 641-647.

60. Kretsinger, R. H. Carp muscle calcium binding protein. II. Structure determination and general description / R.H. Kretsinger, C.E. Nockolds // J. Biol. Chem. 1973. - V. 248. - P. 3313-3326.

61. Kuboniwa, H. Solution structure of calcium-free calmodulin / H. Kuboniwa, N. Tjandra, S. Grzesiek, H. Ren, C.B. Klee, A. Bax // Nature Struct. Biol. -1995.-V. 2.-P. 768-776.

62. Kumar, S. Amino acid sequence of the Ca -triggered luciferin binding protein of Renilla reniformis / S. Kumar, M. Harrylock, K.A. Walsh, M.J. Cormier, H. Charbonneau // FEBS Lett. 1990. - V. 268. - P. 287-290.

63. Linse, S. Determinants that govern high-affinity calcium binding. In Advances in Second Messenger and Phosphoprotein Research / S. Linse, S. Forsen; edited by A.R. Means. New York: Raven Press, Ltd., 1995. - V. 30.

64. Linse, S. Domain organization of calbindin D28k as determined from the association of six synthetic EF-hand fragments / S. Linse, E. Thulin, L.K. Gifford, D. Radzewsky, J. Hagan, R.R. Wilk, K.S. Akerfeldt // Protein Sci. -1997.-V. 6.-P. 2385-2396.

65. Liu, Z.J. Structure of the Ca2+-regulated photoprotein .obelin at 1.7 A resolution determined directly from its sulfur substructure / Z.J. Liu, E.S. Vysotski, C.J. Chen, J. Rose, J. Lee, B.-C. Wang // Protein Sci. 2000. - V. 9. -P. 2085-2093.

66. Lorenz, W.W. Isolation and expression of a cDNA encoding Renilla reniformis luciferase / W.W. Lorenz, R.O. McCann, M. Longiaru, M.J. Cormier // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. - P. 4438^1442.

67. Lu, C.Y. Electron transfer oxidation of tryptophan and tyrosine by triplet states and oxidized radicals of flavin sensitizers: a laser flash photolysis study / C.Y. Lu C, Y.Y. Liu // Biochem. Biophys. Acta. 2002. - V. 1571. - P. 71-76.

68. Malikova, N. P. Spectral tuning of obelin bioluminescence by mutations of Trp92 / N.P. Malikova, G.A. Stepanyuk, L.A. Frank, S.V. Markova, E.S. Vysotski, J. Lee // FEBS Lett. 2003. - V. 554. - P. 184-188.

69. Malmendal, A. Structural dynamics in the C-terminal domain of calmodulin at low calcium levels / A. Malmendal, J. Evenas, S. Forsen, M. Akke // J. Mol. Biol. 1999. - V. 293. - P. 883-899.

70. Markova, S.V. Cloning and expression of cDNA for a luciferase from the marine copepod Metridia longa / S.V. Markova, S. Golz, L.A. Frank, B. Kalthof, E.S. Vysotski // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. - P. 3212-3217.

71. Martin, R.B. Bioinorganic Chemistry of Magnesium / R.B. Martin; eds by H. Sigel // Metal Ions in Biological Systems. New York: Marcel Dekker Inc.,1990.-P. 1-13.

72. Matsumura, H. A novel mode of target recognition suggested by the2Astructure of holo S100B from bovine brain / H. Matsumura, T. Shiba, T. Inoue, S. Harada, Y. Kai // Structure. 1998. - V. 6. - P. 233-241.

73. Matthews, J.C. Purification and properties of Renilla reniformis luciferase / J.C. Matthews, K. Hori, M.J. Cormier // Biochemistry. 1977. - V. 16. - P. 85-91.

74. McCapra, F. The chemiluminescence of Cypridina analogue / F. McCapra, Y.C. Chang // Chem. Commun. 1967. - P. 1011-1012.

75. McPhalen, C. A. Calcium-binding sites in proteins: a structural perspective / C.A. McPhalen, N.C.J. Strynadka, M.N.G. James // Advan. Protein Chem.1991.-V. 42.-P. 77-144.

76. Meador, W. E. Target enzyme recognition by calmodulin: 2.4 A structure of a calmodulin-peptide complex / W.E. Meador, A.R. Means, F.A. Quiocho //• Science. 1992.V. 257. - P. 1251-1255.

77. Moor, C. E. Biochemical aspects of psoralen photochemotherapy / C.E. Moor, F.P. Gasparro // Clinics in Derm. 1996. - V. 14. - P. 353-365.

78. Morin, J. G. Biochemistry of the bioluminescence of colonial hydroids and other coelenterates / J.G. Morin, J.W. Hastings // J. Cell. Physiol. 1971. - V. 77.-P. 305-312.

79. Morin, J. G. Coelenterate bioluminescence / J. G. Morin; edited by L. Muscatine, H. M. Lenhoff // Coelenterate Biology: Reviews and New Perspectives. New York: Academic press, 1974. - P. 397-438.

80. Nelson, M. R. An interaction-based analysis of calcium-induced conformational changes in Ca sensor proteins / M.R. Nelson, W.J. Chazin // Protein Sci. 1998. - V. 7. - P. 270-282.

81. Nelson, M. R. Structures of EF-hand Ca" -binding proteins: diversity in the• »j jorganization, packing and response to

82. Ca binding / M.R. Nelson, W.J. Chazin //Biometals. 1998.- V. 11.-P. 297-318.

83. Nishimura T. Binding of calpain fragments to calpastatin / T. Nishimura, D.E. Goll // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. - P. 11842-11850.

84. O'Neil, K. T. How calmodulin binds its targets: sequence independent recognition of amphiphilic alpha-helices / K.T. O'Neil, W.F. DeGrado // Trends Biochem. Sci. 1990. -V. 15. - P. 59-64.

85. Ohmiya, Y. Shining the light: the mechanism of the bioluminescence reaction of calcium-binding photoproteins / Y. Ohmiya, T. Hirano // Chem. Biol. -1996.-V.3.-P. 337-347.

86. Ohmiya, Y. Two excited states in aequorin bioluminescence induced by tryptophan modification / Y. Ohmiya, M. Ohashi, F.I. Tsuji // FEBS Lett. -1992.-V. 301.-P. 197-201.

87. Pauls, T.L. The Ca -binding proteins parvalbumin and oncomodulin and their genes: new structural and functional findings / T.L. Pauls, J.A. Cox, M.W. Berchtold // Biochem. Biophys. Acta. 1996. - V. 1306. - P. 39-54.

88. Pidcock, E. Structural characterisctics of protein binding sites for calcium and lanthanide ions / E. Pidcock, G.R. Moore // J. Biol. Inorg. Chem. 2001. - V. 6.-P. 479-489.

89. Rabah, G. Solution structure and internal dynamics of NSCP, a compact calcium-binding protein / G. Rabah, R. Popescu, J.A. Cox, Y. Engelborghs, C.T. Craescu // FEBS Lett. 2005. - V. 272. - P. 2022-2036.

90. Reid, R. E. Synthetic fragments of calmodulin calcium-binding site III. A test of the acid pair hypothesis / R.E. Reid // J. Biol. Chem. V. 265. - P. 59715976.

91. Shaw, G. S. Calcium-induced peptide association to form an intact protein domain: 1HNMR structural evidence / G. S. Shaw, R. S. Hodges, B. D. Sykes, Science. 1990. - V. 249. - P. 280-283.

92. Shimomura, O. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea / O. Shimomura, F. H. Johnson, Y. Saiga // J. Cell. Comp. Physiol. 1962. - V. 59. -P. 223-239.

93. Shimomura, O. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin / O. Shimomura, F.H. Johnson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - V. 75. - P. 2611-2615.

94. Shimomura, 0. Light-emitters involved in the luminescence of coelenterazine / O. Shimomura, K. Teranishi // Luminescence. 2000. - V. 15. - P. 51-58.

95. Shimomura, O. Isolation and properties of the luciferase stored in the ovary of the scyphozoan medusa Periphylla periphylla / O. Shimomura, P.R. Flood, S. Inouye, B. Bryan, A. Shimomura // Biol. Bull. 2001. - V. 201. - P. 339 -347.

96. Shimomura, O. Bioluminescence: Chemical Principles and Methods / O. Shimomura. Singapore: World Scientific Publishing Co., 2006. - p. 470.

97. Silva, E. Riboflavin-sensitized photoprocesses of tryptophan / E. Silva, R. Ugarte, A. Andrade, A.M. Edwards // J. Photochem. Photobiol. B. 1994. -V. 23.-P. 43-48.

98. Skelton, N. J. Signal transduction versus buffering activity in Ca -binding proteins / N. J. Skelton, J. Kordel, M. Akke, S. Forsen, W.J. Chazin // Nature Struct. Biol. 1994. - V. 1. - P. 239-245.

99. Strynadka, N. C. J. Crystal structures of the helix-loop-helix calcium-binding proteins / N. C. J. Strynadka, M.N.G. James // Annu. Rev. Biochem. 1989. -V. 58.-P. 951-998.

100. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures / F. W. Studier // Protein Expr. Purif. 2005 - V. 41. - P. 207-234.

101. Takeda, S. Structure of the core domain of human cardiac troponin in the Ca" -saturated form / S. Takeda, A. Yamashita, K. Maeda, Y. Maeda // Nature. -2003.-V. 424.-P. 35-41.

102. Tanaka, T. Sequestration of the membranetargeting myristoyl group of recoverin in the calcium-free state / T. Tanaka, J. B. Ames, T. S. Harvey, L. Stryer, M. Ikura // Nature. 1995. - V. 376. - P. 444-447.

103. Tanokura, M. A calorimetric study of Ca~ -binding by the parvalbumin of the toad (Bufo): distinguishable binding sites in the molecule / M. Tanokura, M. Imaizumi, K. Yamada // FEBS Lett. 1986. - V. 209. - P. 77-82.

104. Terrak, M. Structure of the light chainbinding domain of myosin V / M. Terrak, G. Rebowski, R.C. Lu, Z. Grabarek, R. Dominguez // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.-2005.-V. 102.-P. 12718-12723.

105. Thomson, C.M. The widespread occurrence and tissue distribution of the imidazolopyrazine luciferins / C.M. Thomson, P.J. Herring, A.K. Campbell // J. Biolum. Chemilum. 1997. -V. 12. - P. 87-91.

106. Tsuji, F.I. Molecular evolution of the Ca -binding photoproteins of the Hydrozoa / F.I. Tsuji, Y, Ohmiya, T.F. Fagan, H. Toh, S. Inouye // Photochem. Photobiol. 1995. -V. 62. - P. 657-661.

107. Usami, K. Low-temperature photooxygenation of coelenterate luciferin analog synthesis and proof of 1,2-dioxetanone as luminescence intermediate / K. Usami, M. Isobe // Tetrahedron. 1996. - V. 52. - P. 12061-12090.

108. Vijay-Kumar, S. Structure of a sarcoplasmic calcium-binding protein from Nereis diversicolor refined at 2.0 A resolution / S. Vijay-Kumar, W.J. Cook // J. Mol. Biol. 1992. - V. 224. - P. 413-426.

109. Vinogradova, M. V. Ca" -regulated structural changes in troponin / M. V. Vinogradova, D.B. Stone, G.G. Malanina, C. Karatzaferi, R. Cooke, R.A. Mendelson, R. J. Fletterick // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102. -P. 5038-5043.

110. Vysotski, E.S. Extraction and purification of obelin, the Ca -dependent photoprotein from the hydroid Obelia longissima /E.S. Vysotski, V.S. Bondar, V.N. Letunov // Biochemistry-Moscow. 1989. - V. 54. - P. 965-973.

111. Vysotski, E.S. Ca2+-regulated photoproteins: structural insight into the bioluminescence mechanism / E.S. Vysotski, J. Lee // Acc. Chem. Res. -2004.-V. 37.-P. 405-415.

112. Ward, W.W. Properties of mneopsin and berovin, calcium-activated photoproteins from the ctenophores Mnemiopsis sp. / W.W. Ward, H.H. Seliger // Biochemistry. 1974. -V. 13. - P. 1500-1510.

113. Ward, W.W. Extraction of Renilla-type luciferin from calcium-activated photoprotein aequorin, mnemiopsin, and berovin / W.W. Ward, M.J. Cormier // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. - V. 72. - P. 2530-2534.

114. Ward, W.W. Action spectrum and quantum yield for the photoinactivation of mnemiopsin, a bioluminescent photoprotein from the ctenophore mnemiopsis sp. / W.W. Ward, H.H. Seliger // Photochemistry and photobiology. 1976. -V. 23.-P. 351-363.

115. Ward, W.W. In vivo energy transfer in Renilla bioluminescence / W.W. Ward, M.J. Cormier // J. Phys. Chem. 1976. - V. 80. - P. 2289-2291.

116. Yap, K. L. Diversity of conformational states and changes within the EF-hand protein superfamily / K.L. Yap, J.B. Ames, M.B. Swindells, M. Ikura // Proteins. 1999. - V. 37. - P. 499-507.

117. Zhang, M. Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin / M. Zhang, T. Tanaka, M. Ikura // Nature Struct. Biol. 1995. - V. 2. - P. 758-767.

118. Zot, A.S. Structural aspects of troponin-tropomyosin regulation of skeletal muscle contraction / A.S. Zot, J.D. Potter // Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1987. - V. 16. - P. 535-559.