Белок-белковые взаимодействия в биолюминесцентных системах кишечнополостных Renilla muelleri и Clytia gregaria

Титушин, Максим Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Белок-белковые взаимодействия в биолюминесцентных системах кишечнополостных Renilla muelleri и Clytia gregaria
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Белок-белковые взаимодействия в биолюминесцентных системах кишечнополостных Renilla muelleri и Clytia gregaria"

На правах рукописи . Г\А ^

□Ü34QÜG31

Титушин Максим Сергеевич

БЕЛОК-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕИСТВИЯ В БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ СИСТЕМАХ КИШЕЧНОПОЛОСТНЫХ REN ILLA MUELLER1 И CLYTIA GREGARIA

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 ЯНВ

Красноярск - 2009

003490691

Работа выполнена в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН, г. Красноярск

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук Кандидат биологических наук

Высоцкий Евгений Степанович

Овчинников Сергей Геннадьевич

Межевикин Владислав Валентинович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт Биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита состоится «2-С> » 2010 г. в час. на заседании диссер-

тационного совета Д 003.007.01 в Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, д. 50, стр. 50. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН

Автореферат разослан «2£» _2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук с . Франк Л.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Классическими представителями целентеразин-зависимых биолюминесцентных систем являются системы мягкого коралла ЯепШа и медузы Аедиогеа. Главный компонент биолюминесцентной системы Аедиогеа, Са2+-регулируемый фотопротеин акворин, представляет собой комплекс из белка и нековалентно связанного 2-гидропероксицелентераизна. Биолюминесценция возникает при добавлении ионов кальция, инициирующих реакцию декарбоксилирования 2-гидропероксицелентеразина. В результате образуется молекула целентерамида в возбужденном состоянии и СО2. Переход целентерамида в основное состояние сопровождается излучением кванта света. В биолюминесцентной системе ЯепШа функции фотопротеина как бы поделены между двумя белками: Са2+-зависимый целентеразин-связывающий белок (СВР) хранит субстрат и реагирует на ионы кальция, а люцифераза катализирует окисление целентеразина при участии кислорода.

Окисление целентеразина в активном центре люциферазы или фотопротеина сопровождается излучением в голубой области спектра, тогда как свечение медузы Аедиогеа и коралла ЯепШа является зеленым. Это обусловлено наличием зеленого флуоресцентного белка (СРР), который выступает в роли акцептора энергии возбужденного состояния продукта, целентерамида, и который, затем, излучает в зеленой области спектра. Поскольку такой бе-зызлучательный перенос энергии наблюдается в сильно разбавленных растворах донорного и акцепторного белков, было сделано заключение, что перенос происходит с образованием белок-белкового комплекса. Однако достоверно образование комплекса было показано только для люциферазы и ОБР из ЯепШа, но не для фотопротеина и йРР из Аедиогеа.

Впервые формирование комплекса в биолюминесцентной системе фотопротеинового типа было косвенно показано для клитина и ОБР из медузы С1уйа в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН. Однако в силу слабой природы взаимодействия клитина и ОБР не удалось получить кристаллы комплекса, а следовательно, и определить его структуру. Пространственная структура комплекса представляет фундаментальный интерес, поскольку в рамках этого комплекса происходит безызлучательный перенос энергии, понимание механизма которого важно не только для биолюминесценции, но и для процессов фотосинтеза и дыхания. Другое направление исследований было связано с изучением биолюминесцентной системы морского коралла ЯепШа, в которой белок-белковое взаимодействие между люци-

феразой и GFP было продемонстрировано в работах американских ученых более 30 лет назад. Тогда же было высказано предположение, что все 3 белка системы Renilla - люцифераза, СВР и GFP - функционируют в комплексе, однако дальнейших исследований в этом направлении проведено не было. Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось определение пространственных структур белок-белковых комплексов между Са2+-регулируемым фотопротеином клитином и зелёным флуоресцентным белком (GFP), а также Са2+-регулируемым целентеразин-связывающим белком (СВР) и люциферазой, входящими в состав биолюминесцентных систем медузы Clytia gregaria и мягкого коралла Renilla muelleri, соответственно. Выполнение исследования требовало решения следующих задач:

1. Определить биохимические и спектральные свойства СВР и кинетику биолюминесцентной реакции люциферазы Renilla с СВР в качестве «субстрата», а также, предполагая вид поверхности взаимодействия белков, рассчитать пространственную структуру комплекса при помощи программы стыковки (докинга) HADDOCK2.Ü.

2. Получить пС,15М-меченые клитин и GFP для исследования методом ЯМР, провести отнесение резонансов в 'H-I5N HSQC спектрах клитина и GFP и на основе данных ЯМР-титрования определить аминокислотные остатки обоих белков, формирующие поверхность взаимодействия.

3. Используя данные об аминокислотных остатках поверхности взаимодействия, рассчитать пространственную структуру комплекса клитин-GFP в программе HADDOCK2.0, а также с помощью мутантов клитина, полученных олигонуклеотид-направленным мутагенезом, экспериментально подтвердить правильность рассчитанной структуры комплекса.

При решении поставленных задач получены результаты, которые выносятся на защиту:

1. Исходя из кинетических характеристик реакции люциферазы с СВР, спектральных свойств СВР, а также кристаллических структур люциферазы и СВР из Renilla muelleri, рассчитана пространственная структуры комплекса люцифераза-СВР-Са2+.

2. Методом ЯМР-титрования с использованием изотопно-меченых белков определены аминокислотные остатки поверхности взаимодействия клитина и GFP.

3. На основе данных о кристаллических структурах клитина и GFP и данных об аминокислотных остатках зоны контакта рассчитана пространственная

структура комплекса клитин-GFP, правильность которой подтверждена экспериментально.

Научная новизна и практическая ценность работы. Все результаты, представленные в данной работе, получены впервые и имеют фундаментальный характер, так как добавляют новую информацию для понимания устройства и функционирования биолюминесцентных систем кишечнополостных, а также роли белок-белковых взаимодействий в этих процессах. Комплекс клитин-GFP является хорошей модельной системой для исследования деталей молекулярного механизма индуктивно-резонансного переноса энергии в белковых структурах. Полученные результаты могут найти применение и в прикладных исследованиях. Так, использование СВР в качестве «субстрата» для люциферазы Renilla может повысить чувствительность биолюминесцентного анализа. В свою очередь, система клитин-GFP является новым перспективным кандидатом для использования в BRET системах, широко используемых для прижизненной визуализации белок-белковых взаимодействий в клетках и целых организмах. Данные о пространственной структуре комплекса клитин-GFP являются основой для возможной модификации аффинности белков в комплексе с целью повышения эффективности переноса энергии и следовательно, чувствительности BRET анализа. Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на Международной Конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2004); Конференции молодых ученых КНЦ СО РАН (Красноярск, 2007); на Международном симпозиуме по Биолюминесценции и Хеми-люминесценции (Шанхай, 2008); на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН и Национальной лаборатории биологических макромолекул Института биофизики Пекина (КНР).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы. Результаты структурных исследований включены в международные базы данных PDB и BMRB.

Структура и объем работы. Работа изложена на 148 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение результатов исследования, заключение, выводы и список цитируемой литературы (207 источников). Диссертационная работа проиллюстрирована 42 рисунками, содержит 4 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клонирование и получение экспрессионных плазмид для клитина и GFP из Clytia gregaria и для люциферазы и СВР из Renilla muelleri было выполнено старшим научным сотрудником лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН Марковой C.B. Олигонуклеотид-направленный мутагенез клитина проводили методом ПЦР с использованием Quick-Change site-directed mutagenesis kit.

Трансформированные клетки Е. coli (штаммы BL21-RIL и XL 1-Blue) культивировали в LB-среде, содержащей ампициллин. Индукцию осуществляли добавлением ИПТГ. Для получения изотопно-меченых клитина и GFP трансформированные клетки выращивали в минимальной М9 среде, содержащей 15NH4C1 и 13С-глюкозу. Для получения дейтерированного GFP минимальная среда готовилась на тяжёлой воде D20.

Выделение и очистку рекомбинантных белков, их мутантных или изотопно-меченых форм проводили по схемам, разработанным в лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН. Апо-клитин и ano-СВР выделяли из телец включений, проводили рефолдинг с субстратом целентеразином и очищали с помощью ионообменной хроматографии. Люциферазу и GFP выделяли из клеточного лизата металл-аффинной хроматографией за генетически пришитый полигистидиновый фрагмент, который затем удаляли инкубацией с TEV протеазой или энтерокиназой. Все белки дополнительно очищались при помощи гель-фильтрации.

Спектры поглощения белковых растворов регистрировали при помощи спектрофотометра UVIKON 943. Кинетику биолюминесцентной реакции люциферазы измеряли с использованием люминометра БЛМ 8802. Спектры биолюминесценции люциферазы и флуоресценции СВР измеряли на спек-трофлуориметре AMINCO. Спектры биолюминесценции клитина и его мутантных форм в комплексе с GFP, а также кинетику люминесцентного сигнала измеряли с помощью планшетного спектрофлуориметра Varioskan. Все спектры корректировались на чувствительность ФЭУ к различным длинам волн, а также с учетом кинетики спада биолюминесцентного сигнала.

Поиск условий кристаллизации клитина выполняли с использованием 384 коммерческих растворов при помощи робота Mosquito и 96-луночного планшета методом сидячей капли. Дифракционные данные получали при облучении кристаллов длинной волны 1,54 Â рентгеновского излучения от трубки с вращающимся анодом Rigaku. Фазы рассчитывали в программе

PHASER по методу молекулярных замещений с использованием структуры обелина из Obelia geniculata (код в PDB банке 1JFO) в качестве модельной. Модель белка автоматически строили с помощью программы PHENIX. Расчет параметров модели и ее усовершенствование выполняли в программах MOLPROB1TY и COOT.

Гетероядерные ЯМР спектры регистрировали на ЯМР спектрометрах Bruker DMX 600 и Bruker Advance 800 с рабочей частотой на протонах 600 МГц и 800 МГц, соответственно. Отнесение резонансов 1SN и 'Н клитина проводили на основании гетероядерных спектров 15N-HSQC, 3D 'H-^N-^C HNCA, HNCACB, CBCA(CO)NH, HNCO, HN(CA)CO, HBHA(CBCA)NH и HBHA(CBCA)(CO)NH при температуре 293 К с использованием 13C,15N-меченого клитина. Отнесение резонансов 1SN и 'H GFP проводили на основании гетероядерных спектров 3D HNCACB, CBCA(CO)NH, HNCO и HN(CA)CO с использованием 2H,13C,15N -меченого GFP и спектра модифицированного 4D 13C,lsN-NOESY, используя 13С,'^-меченый GFP, при температуре 310 К.

Аминокислотные остатки клитина и GFP, «затронутые» взаимодействием в рамках комплекса клитин-GFP, определяли в серии титрований 15N-меченого клитина немеченым GFP или 2Н,'^-меченого GFP немеченым кли-тином (или его мутантными формами). Полученные lsN-HSQC спектры сравнивали с исходными спектрами и рассчитывали величину возмущения химического сдвига для каждого резонанса.

Структуру комплекса клитин-GFP и люцифсраза-СВР-Са2+ рассчитывали с помощью программы «многозначной управляемой стыковки белков» HADDOCK2.0 на ядре CNS при использовании пространственных структур клитина (код в PDB банке ЗКРХ) и GFP (код в PDB банке 2HPW), люцифера-зы и СВР-Са2+ (код в PDB банке 2HQ8) и ограничений по взаимодействующим аминокислотным остаткам. Метод последовательных приближений включал стадии жёсткой и гибкой стыковок и стадию уточнения структур в водном окружении. Результаты расчётов ранжировались в соответствии со значением свободной энергии связывания пространственных структур, которая включает термы ван-дер-ваальсовых и электростатических взаимодействий, десольватации, соответствия ограничениям по взаимодействующим аминокислотам и площади поверхности контакта.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Доказательство существования комплекса Renilla люцифераза-СВР

Целентеразин-связывающий белок (СВР) содержит в своём составе молекулу целентеразина, который становится доступным для окисления люци-феразой после связывания Са2+ с образованием продукта реакции - целенте-рамида. В спектре поглощения СВР имеется характерный белковый пик на 280 нм и пик, соответствующий поглощению молекулы целентеразина (444 нм). Связывание Са2+ смещает максимум поглощения СВР в видимой области на 12 нм (432 нм). Однако этот спектр отличается от спектра поглощения свободного целентеразина в водном растворе (рис. 1А). Это позволяет сделать заключение, что целентеразин остаётся связанным с молекулой СВР после присоединения Са2+, а изменения в спектре поглощения комплекса СВР-Са2+ отражают конформационные перестройки в белковой молекуле. Такие перестройки, очевидно, делают целентеразин более доступным для окисления люциферазой, а следовательно, и для некаталитического окисления растворённым в воде кислородом. Некаталитическое окисление целентеразина идёт медленно, а образующийся целентерамид остаётся связанным с СВР, о чём свидетельствует слабая флуоресценция СВР (532 нм), возрастающая при добавлении Са2+ (рис. 1Б). Известно, что флуоресцентными свойствами обладает молекула целентерамида в белковом, но не водном окружении. Для примера показана флуоресценция целентерамида в обелине после добавления ионов кальция (рис. 1Б).

300 350 400 450 500

Длина волны, нм

450 500 550 600 Ь50

Длина волны, нм

Рис. 1. (А) Спектры поглощения СВР, СВР со связанным кальцием и свободного целентеразина (СЕ). (Б) Спектры флуоресценции обелина и СВР после добавления ионов кальция.

Биолюминесцентная реакция люциферазы in vitro может быть инициирована как добавлением целентеразина, так и раствора Са2+ в смесь люциферазы и СВР (схема рис. 2).

люцифераза + целентеразин (СЕ) люцифераза + СВР + Са2+

н □

1000

S 2

2 ц

0.1 1 10 100 [СВР] и [СЕ], мкМ

s 600

н о 500

5 400

■з

ш 300

5 9 100

о s 0

20 40 60

Время, мин

0.0 1.0 2.0 3.0

[СВР]-1, [СЕ] \ мкМ1

450 500 550 600

Длина волны, нм

Кт|СВР1= 26 мкМ V„MC8P,= 6700 отн.ед.

К„СЕ,= 10 мкМ QCBP = 2 X QCE

Vi„„ce,= 1080 отн.ед.

/К

k«CE/K.

,m(CBP1= 136 мкМ'с' = 57 мкМ V

Рис. 2. Кинетические исследования биолюминесцентной реакции люциферазы при запуске реакции целентеразином или ионами Са2+ в присутствии СВР. (А) Зависимость люминесцентного сигнала от концентрации целентеразина и СВР. (Б) Кинетика люминесцентного сигнала в реакции с целентеразином и СВР. (В) Определение Кт и Утах из графика Лайнувера-Берга. (Г) Спектры биолюминесценции с целентеразином и СВР.

Кинетические исследования показали, что интенсивность свечения лю-циферазы в реакции с СВР в несколько раз выше, чем с целентеразином во всём диапазоне концентраций субстрата (рис. 2А). Из графика Лайнувера-Берга (рис. 2В) определены кинетические параметры реакции (Кт, Утах) и показано, что люцифераза совершает в 6 раз большее число оборотов с СВР, чем со свободным целентеразином (Утах(СЕ) = 1080 отн.ед., Утах(Свр) = 6700 отн.ед. при одинаковых концентрациях люциферазы). Общая эффективность работы люциферазы, оценённая из кса,/Кт, в реакции с СВР в 2,5 раза выше, чем с целентеразином (кса,(Свр/Кт(Свр) = 136 мкМ'с"1, кса((СЕ/Кт(сЕ) = 57 мкМ" 'с"1). Квантовый выход реакции при использовании СВР в качестве «субстрата» также в 2 раза выше, чем со свободным целентеразином (рис. 2Б). Спектры биолюминесценции с СВР и свободным целентеразином практически идентичны, что свидетельствует об общем молекулярном механизме окисления целентеразина в активном центре люциферазы (рис. 2Г).

Полученные данные позволили сделать заключение, что протекание биолюминесцентной реакции требует образования короткоживущего белок-белкового комплекса между люциферазой и СВР, в рамках которого происходит доставка целентеразина в активный центр люциферазы. Увеличение квантового выхода реакции с СВР, вероятно, может быть объяснено ослаблением колебательной релаксации возбужденного состояния целентерамида в более жёстком белковом окружении.

Пространственная структура комплекса ИепШа люцифераза-СВР

Пространственные кристаллические структуры СВР из КепШа тиеНеп в Са2+-свободном и Са2+-связанном состояниях были определены научным сотрудником лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН Степанюк Г.А. Пространственная структура СВР имеет вид глобулы, подобной глобуле фотопротеинов (рис. ЗА). Примечательно, что конформационные перестройки в молекуле СВР в ответ на связывание Са2+ приводят к образованию отверстия на поверхности белковой глобулы, которое открывается непосредственно в целентеразин-связывающую полость белка (рис. ЗБ). Поскольку, как было показано, целентеразин остаётся в СВР при связывании Са2+, представляется наиболее вероятным, что его доставка в активный центр люциферазы осуществляется непосредственно через образующееся отверстие.

Пространственная структура люциферазы из кепШа тиеНеп была получена в результате компьютерного моделирования в программе

Рис. 3. Изображение поверхности белковой глобулы СВР в целентеразин- (А) и Са2+-связанной (Б) формах. Стрелка показывает «отверстие» на поверхности СВР, образующееся в результате связывания Са2*. (В) Пространственная структура комплекса люцифераза-СВР-Са2', рассчитанная в программе стыковки НАБООСК2.0. Электростатический потенциал поверхности показан для СВР с кальцием (верхняя молекула) и люциферазы (нижняя молекула). Стрелками отмечены участки комплементарности электростатических потенциалов поверхностей (синий цвет соответствует положительному заряду, красный - отрицательному).

8\\'158МСЮЕЬ с использованием кристаллической структуры люциферазы из ЯепШа геП1/огт1х в качестве первичной модели. В силу высокой гомологии аминокислотных последовательностей данных люцифераз ЯепШа (98%) про-

странственные структуры люциферазы из Renilla muelleri (модель) и люци-феразы из Renilla reniformis практически идентичны (среднеквадратичное отклонение RMSD 1,0 А).

Моделирование пространственной структуры комплекса люцифераза-СВР-Са2+ проводили с помощью программы стыковки (докинга) HADDOCK2.0 и первичных структур люциферазы и СВР-Са2+. Аминокислотные остатки, окружающие активный центр люциферазы и отверстие на поверхности СВР, составили условия ограничения стыковки (остатки D158, Е161, КПЗ, Е183, S188 люциферазы и Q67, V74, Е80, S88, Е96, Q103 СВР). Рассчитанные структуры ранжировали в соответствии со свободной энергией связывания. Для более чем 60% структур среднеквадратичное отклонение координат (RMSD) от структуры с наименьшей свободной энергией связывания составило 7.5 А.

Пространственная структура комплекса с наименьшей свободной энергией связывания представлена на рис. ЗВ. Зона контакта люциферазы и СВР сформирована в равной степени остатками заряженных и нейтральных аминокислот, которые образуют относительно небольшое число водородных связей и гидрофобных контактов. Площадь поверхности контакта составляет порядка 1805 ±118 А2, что является средним значением для известных белок-белковых комплексов. Поверхность СВР имеет участки с преобладающим положительным зарядом (R9, К91, К93, К97, К209) и преобладающим отрицательным зарядом (D66, Е95, Е96), которые комплементарны соответствующим участкам поверхности люциферазы, сформированным остатками D158, Е160, Е161, D162 и К4, К189, К193, К282 (рис. ЗВ). Перечисленные особенности являются характерными для слабых белок-белковых взаимодействий. Отверстие, открывающееся в субстрат-связывающую полость СВР, располагается напротив активного центра люциферазы. Образующийся белковый «карман» вполне вероятно может экранировать возбуждённое состояние целентерамида и тем самым обеспечивать наблюдаемое повышение квантового выхода реакции.

Поверхность взаимодействия клитина и GFP из Clytia gregaria, определённая методом ЯМР-тигрования

В присутствии мкМ концентраций GFP спектр биолюминесценции клитина (А.тах = 470 нм) становится практически идентичен спектру флуоресценции GFP (Хтах = 500 нм) (рис. 4). Очевидность безызлучательного переноса энергии в данной системе следует из сохранения квантового выхода реакции. Сближение хромофоров на расстояние не менее 100 Á (необходимое условие для индуктивно-резонансного переноса энергии) при мкМ концентрациях белков представляется возможным лишь в рамках белок-белкового комплекса. Несмотря на то, что исходя из биолюминесцентного анализа KD комплекса клитин-GFP лежит в мкМ диапазоне (10" М), из существующих на сегодняшний день методов (гель-фильтрация, аналитическое ультрацентрифугирование, плазменный резонанс, ЯМР) образование комплекса удалось показать только методом ЯМР (чувствительность 102 М). В ходе работы также не удалось получить кристаллы комплекса клитин-GFP, хотя по отдельности клитин и GFP образовывали кристаллы, которые были использованы для определения их пространственных кристаллических структур с высоким разрешением (1,9 Á для клитина и 1,55 Á для GFP).

Ш 350 400 450 500 550 600 Длина волны, нм

Клитин представляет собой компактную белковую глобулу (Mr 22,4 кДа), сформированную 8 а-спиралями (А - Н), и имеет 3 Са2+-связывающих петли (I, 111, IV) (рис. 5А). Структура клитина высоко гомологична структуре фотопротеина обелина (RMSD 0.66 Ä); целентеразин-связывающие полости обоих белков сформированы идентичными аминокислотными остатками. N-конец клитин (Т2 - А9) не структурирован, поэтому для него отсутствуют данные электронной плотности.

1.0

Рис. 4. Спектры биолюминесценции клитина (0,057 мкМ) при разных концентрациях

GFP (0 - 4,24 мкМ). Чёрным цветом показан спектр флуоресценции GFP.

Кристаллическая структура GFP была определена научным сотрудником Института биофизики СО РАН Степанюк Г.А. Пространственная структура GFP (Mr мономера 26,6 кДа) имеет вид «бочонка», сформированного 11 ß-слоями (S1 - Sil) (рис. 5Г). В центре «бочонка» расположен хромофор -результат автокаталитической циклизации аминокислот S68, Y69 и G70. Уникальная структура «бочонка» эффективно изолирует хромофор от внешней среды, обеспечивая высокий квантовый выход флуоресценции GFP. В растворе GFP образует гомодимер (Mr 53,2 кДа), что подтверждено данными гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования.

Для проведения ЯМР экспериментов были получены образцы клитина и GFP, меченные изотопами 13С и 15N. Для образца 2H,I5N- и 2H,I3C,I5N-меченого GFP были подобраны условия обратимой денатурации белка с целью замены способных к обмену атомов 2Н N-H групп на атомы 'Н. Основой для определения аминокислотных остатков клитина и GFP, формирующих зону контакта, послужили двумерные спектры HSQC (гетероядерный одно-квантовый перенос когерентности), полученные на ядрах 'Н и ,5N. Каждый кросс-пик (резонанс) такого спектра соответствует N-H группе основной цепи белка и боковых радикалов аминокислот Asn, Gin, Trp, His и Arg. Образование белкового комплекса меняет локальное электронное окружение аминокислот поверхности взаимодействия, что отражается в изменении химического сдвига соответствующих кросс-пиков в HSQC спектре.

Последовательное отнесение 'Н и l5N химических сдвигов основной цепи клитина и GFP проводили, как описано в материалах и методах. Отнесение осложнялось относительно большими размерами белковых молекул (клитин 22,4 кДа и димер GFP 53,2 кДа). Проблему уширения линий ЯМР сигналов GFP по причине быстрой релаксации решали с использованием образца ренатурированного 2Н,'3С,15Ы-меченого GFP. На основе значений химических сдвигов атомов 'HN, 'На, 'Нр, 15N, 13СО, 13Са, 1 3Ср было проведено отнесение 95% резонансов клитина и GFP.

Сравнение 'H-15N HSQC спектров изолированного N-клитина и N-клитина в смеси с немеченым GFP позволило определить кросс-пики, которые испытывают возмущение химического сдвига в результате комплексооб-разования, и соотнести их с конкретными аминокислотными остатками белка (рис. 5Б). Аналогично определяли «возмущенные» аминокислотные остатки GFP (рис. 5Д). Величину возмущения химического сдвига (ВХС) рассчитывали по формуле:

S7 S8 S9 S10 S11

Аминокислотный остаток

cj 0 08

2 006

d °M X

CO 000

Аминокислотный остаток

Рис. 5. Определение методом Я MP-титрования аминокислотных остатков поверхности взаимодействия клитина и GFP. На пространственных структурах клитина (А) и GFP (Г) «возмущенные» остатки показаны цветными линиями и обозначены цветом на поверхности белка. (Б, Д) участки HSQC спектров, полученные наложением спектров '^-меченого клитина (Б, чёрный цвет) и 2Н,'5Ы-меченого GFP (Д, чёрный цвет) при добавлении немеченых GFP (Б, синий) и клитина (Д, пурпурный). (В, Д) Возмущение химического сдвига (ВХС) аминокислотных остатков клитина (В) и GFP (Е) при титровании немеченым GFP и клитином, соответственно. Порог в 1 и 2 среднеквадратичных отклонения показан серым и синим (либо пурпурным) цветами.

ВХС = sqrt(A5H2 + 0.2 A8N2) (1),

где ASn и Д8н - изменение величины химического сдвига 15N и 'Н, выраженной в миллионных долях (м.д.). Параметр «возмущённые» присваивался аминокислотным остаткам, для которых значение ВХС превышало среднее возмущение всех остатков на величину среднеквадратичного отклонения (рис. 5В, Д), а также остаткам со значительным уменьшением интенсивности кросс-пиков.

Возмущение химических сдвигов (и интенсивности сигналов) затрагивает 23 остатка клитина, большинство которых формирует равномерную поверхность на пространственной структуре клитина (рис. 5А). Определенная таким образом поверхность взаимодействия клитина с GFP включает аминокислотные остатки участков N-конца (А9 - Е17), a-спирали D (К100 - N109) и С-концевого сегмента (G180 - Y193), которые в молекуле клитина пространственно сближены. Возмущение некоторых остатков (L103, L105, G180, Т184, L192, Y193), не доступных растворителю, можно объяснить близостью их пространственного расположения к остаткам поверхности взаимодействия.

Возмущение химических сдвигов затрагивает 25 остатков GFP, которые входят с состав петли S3-S4 и следующей за ней короткой а-спирали (D55 - S65), протяженной петли S6-S7 (К132 - Н149) и петли S10-S11 (G209 - D218). Поверхность взаимодействия GFP с клитином выглядит боле дискретной (рис. 5Г), поскольку для ряда остатков, находящихся в «зоне возмущения», не удалось провести отнесение, либо разделить сигналы в силу высокой степени перекрытия (Р57, S133, N134, 1137, R141, Y144, Р147, Р148, А150, К168, D171, VI72, G174, Р212, D215). Интересно возмущение остатков GFP, не доступных растворителю (V58, Т60, А61, Т62, 163, S65, F856 S146, Н149), которые как бы соединяют поверхность контакта с хромофором GFP, либо образуют водородные связи с молекулой хромофора (S146, Н149). Вероятно, связывание клитина может приводить к минорным конформацион-ным перестройкам центральной оси GFP, несущей хромофор.

Пространственная структура комплекса Clytía клитин-GFP

Поверхности взаимодействия с клитином мономеров GFP в димере расположены таким образом, что молекула клитина не может занять оба сайта связывания одновременно. Поэтому 1 мономер GFP способен связать 1 мономер клитина, а в растворе вполне вероятен тетрамерный симметричный комплекс (2 молекулы клитина : 1 молекула димера GFP). Для упрощения

расчетов модели пространственной структуры комплекса в программе НАВВОСК2.0 в качестве исходной бралась структура мономера йРР. Более 40% рассчитанных структур составляют кластер с наименьшим значением свободной энергии связывания; среднеквадратичное отклонение (ЯМБО) координат структур в «лучшем» кластере не превышает 4 А.

Пространственная структура комплекса с наименьшей свободной энергией связывания представлена на рис. 6. Выражена комплеменгарность формы поверхностей белков: а-спираль О клитина занимает «желоб» на вершине «бочонка» вРР, сформированного петлями 86-87 и 810-811. Хромофоры белков в комплексе сближены на расстояние (45 А), которое является более чем достаточным для обеспечения эффективного индуктивно-резонансного переноса энергии.

Рис. 6. Стереоизображение пространственной структуры комплекса клитин-ОРР. Указано расстояние между хромофорами (45 А). Отмечены элементы вторичной структуры, формирующие зону контакта (1Ч-конец и а-спираль О клитина; петли 86-87 и 810-811 СИР).

Зона контакта белков (площадь 1913 ± 87 А2) характеризуется выраженной комплементарностью электростатических потенциалов поверхностей клитина и GFP (рис. 7): положительный заряд сосредоточен на участке поверхности клитина (К11, К13, К100, К104), а отрицательный - на поверхности GFP (D211, D213, D214, D215, Е216). Другой участок взаимодействия сформирован аминокислотными остатками подвижного N-конца клитина (Т2, D3, Т4, А5, S6, К7, Y8, А9, V10) и участка петли S6-S7 GFP (S133, N134, L138, G139, М140, R141). Более высокая вариабельность контактов в этом участке отражает конформационную подвижность N-конца клитина. В целом, природа контактов поверхности взаимодействия клитина и GFP характерна для слабо взаимодействующих белков, что хорошо соотносится с данными ЯМР-титрования (KD комплекса 10 3 - 10° М). Однако в биолюминесцентных

экспериментах высокоэффективный перенос энергии происходит при мкМ концентрациях белков. Этот факт позволяет сделать предположение, что существует два типа комплексов клитин-ОРР: «возбужденный» комплекс, в рамках которого аффинность белков увеличивается на несколько порядков, и «невозбужденный» комплекс с низкой аффинностью, который, фактически, определяется с помощью ЯМР-титрования.

Рис. 7. Зона контакта клитина и вРР. Электростатический потенциал поверхности показан для йРР (А) и клитина (Б). Поверхность окрашена в соответствии с зарядом аминокислотного остатка (отрицательный - красным, положительный - синим и нейтральный - белым цветами). Аминокислотные остатки зоны контакта показаны в виде цветных линий (синих - для клитина и пурпурных - для вРР).

Экспериментальное подтверждение структуры комплекса клитин-СРР

Некоторые из аминокислотных остатков клитина, формирующих поверхность контакта с ОРР, были заменены на аланин методом олигонуклео-шд-направленного мутагенеза (К11А, К13А, М15А, Ы109А, 1М188А). Также были получены мутанты клитина с укороченным Ь1-концом (5А, 10У). Влияние мутаций на эффективность переноса энергии оценивали с помощью константы КА, рассчитанной из биолюминесцентных спектров клитина и его му-тантных форм в комплексе с ОРР. Дополнительно мутанты клитина К11А, К13А, М188А и 5А использовали для ЯМР-титрования 2Н,'^-меченого ОРР с целью оценить эффект воздействия мутации на аффинность белков в комплексе, которая оценивалась по степени возмущения кросс-пиков вРР. Все исследованные аминокислотные замены клитина снижали эффективность переноса энергии и аффинность белков друг к другу. Минимальный и максимальный эффекты показаны на примере мутантов Ы188А и КЛ 1А, соответственно (рис. 8). Интересно, что эффект от аминокислотных замен положительно заряженных К11 и К13 сопоставим с эффектом от делеции 8 остатков Ы-конца клитина. Это может подтверждать значительный вклад электростатического взаимодействия в образование комплекса клитин-ОРР.

от

К. = 4,31

о.е I \

04 / V

НиЛ

100 120 МО 160

. ____1..... 1

■Ш» Ди

120 140 160 180 200 220

400 450 500 МО 600

Длина волны, нм

40 60 «0 100 120 140 160 180 200 220

Аминокислотные остатки

Рис. 8. (А) Спектры биолюминесценции клитина (\УТ) и его мутантных форм (Ы188А, К11А) при титровании вРР. (Б) Возмущение химического сдвига аминокислотных остатков -меченого ОРР при добавлении 2-

кратного молярного избытка клитина и его мутантных форм.

выводы

1. Определены кинетические характеристики ферментативной реакции, катализируемой люциферазой из коралла Renilla muelleri, с целентеразином и целентеразин-связывающим белком (СВР). Показано, что использование СВР в качестве «субстрата» в два раза повышает эффективность работы люциферазы.

2. На основе кристаллических структур люциферазы Renilla и СВР, связанного с кальцием, рассчитана пространственная структура комплекса лю-цифераза-СВР-Са2+, объясняющая высокую эффективность биолюминесцентной реакции с СВР в качестве «субстрата» люциферазы.

3. Впервые получены кристаллы и определена кристаллическая структура Са2+ -регулируемого фотопротеина клитина из медузы Clyíia gregaria с разрешением 1,9 Á. Показано, что пространственная структура клитина высоко гомологична структуре фотопротеина обелина.

4. Впервые получены пС,15Ы-меченый клитин и 2Н,пС,15М-меченый зеленый флуоресцентный белок (GFP) и проведено полное отнесение резонан-сов основных цепей в 'H-'5N HSQC ЯМР спектрах этих белков. С помощью ЯМР-титрования определены аминокислоты клитина и GFP, формирующие поверхность взаимодействия белков. Установлено, что основными аминокислотными остатками зоны контакта клитина являются остатки N-конца, a-спирали D и С-конца белковой молекулы. Показано, что поверхность контакта GFP более дискретна и образована аминокислотами петель S3-S4, S6-S7 и S10-S11 верхушки «бочонка».

6. Получены мутанты клитина с заменами некоторых аминокислот, формирующих зону контакта. С помощью ЯМР и биолюминесцентных измерений показано, что замены уменьшают эффективность образования комплекса. Это является дополнительным подтверждением правильности рассчитанной структуры комплекса клитин-GFP.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Titushin, M.S. Coelenterazine-binding protein of Renilla muelleri: cDNA cloning, overexpression, and characterization as a substrate of luciferase / M.S. Titushin, S.V. Markova, L.A. Frank, N.P. Malikova, G.A. Stepanyuk, J. Lee, E.S. Vysotski // Photochem. Photobiol. Sci. - 2008. - V. 7 (2). - P. 189 - 196.

2. Titushin, M.S. Ca2+-dependent coelenterazine-binding protein of Renilla provides higher bioluminescence efficiency that free coelenterazine / M.S. Titushin, S.V. Markova, L.A. Frank, N.P. Malikova, G.A. Stepanyuk, J. Lee, E.S. Vysotski // Luminescence. - 2008. - V. 23 (2). - P. 95.

3. Титушин, M.C. Получение и некоторые биохимические свойства реком-бинантных белков биолюминесцентной системы коралла Renilla muelleri / M.C. Титушин // Материалы конференции молодых ученых КНЦ СО РАН. - Красноярск: ИВМ СО РАН, 2007. - С. 41 - 44.

4. Мапикова, Н.П. Исследование биолюминесцентной системы коралла Renilla muelleri и морских копепод Metridia longa / Н.П. Маликова, В.В. Борисова, М.С. Титушин, Г.А. Степанюк, Е.В. Еремеева // Материалы V конференции молодых ученых СО РАН, посвященной М.А. Лаврентьеву. - Новосибирск: Новосибирский государственный университет, 2007. - С. 8 - 11.

5. Титушин, М.С. Получение и некоторые биохимические свойства реком-бинантных белков биолюминесцентной системы коралла Renilla muelleri / М.С. Титушин // Материалы XLIII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». - Новосибирск: Новосибирский государственный университет, 2005. - С. 91 - 92.

СПИСОК ПРИНЯТНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВХС - возмущение химического сдвига

BRET - биолюминесцентный резонансный перенос энергии

СЕ - целенгеразин

СВР - целентеразин-связывающий белок GFP - зеленый флуоресцентный белок

HSQC - одноквантовый гетероядерный перенос когерентности RMSD - среднеквадратичное отклонение координат атомов

Подписано в печать 04.12.2009. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. псч. л. 1. Тир. 100. Зак. 700.

Компания «Печатный Двор» г. Красноярск, ул. Марковского, 19 Тел. 294-91-04, 266-12-90

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Титушин, Максим Сергеевич

Введение

ГЛАВА 1. Белок-белковые комплексы в биолюминесцентных системах кишечнополостных

1.1. Основные характеристики белок-белковых взаимодействий

1.1.1. Структура и свойства белок-белковых контактов

1.1.2. Силы, определяющие белок-белковое взаимодействие

1.1.3. Распределение свойств области белок-белкового контакта

1.2. Метод ЯМР в определении пространственных структур белок-белковых комплексов

1.2.1. Гетероядерная одноквантовая корреляционная спектроскопия (HSQC)

1.2.2. Кросс-релаксация NOESY

1.2.3. Остаточное взаимодействие диполей

1.3. Метод молекулярного докинга в расчете пространственных структур комплексов биологических макромолекул

1.3.1. Общие закономерности докинга биологических макромолекул

1.3.2. Проблема белок-белкового докинга

1.4. Белок-белковые комплексы в биолюминесцентных системах кишечнополостных

1.4.1. Фотопротеиновые системы

1.4.2. Белки системы Renilla

ГЛАВА 2. Материалы и методы

2.1. Молекулярная биология

2.2. Экспрессия и очистка белка

2.2.1. Выделение и очистка люциферазы из Renilla muelleri

2.2.2. Получение целентеразин-связывающего белка (СВР) из Renilla muelleri

2.2.3. Выделение и очистка фотопротеина клитина из Clytia gregaria

2.2.4. Выделение и очистка зеленого флуоресцентного белка (GFP) из Clytia gregaria

2.3. Спектральные измерения, определение биолюминесцентной активности и концентрации белка

2.4. ЯМР

2.4.1. Получение клитина и зеленого флуоресцентного белка (GFP), меченных изотопами 13С, ,5N и 2Н

2.4.2. Спектроскопия ЯМР

2.4.3. Титрование и определение величины возмущения химического сдвига

2.5. Расчет пространственной структуры комплекса клитин-GFP

2.5.1. Определение условий сближения и стыковки белков в комплексе

2.5.2. Метод последовательных приближений

2.5.3. Оценка результатов расчета пространственных структур

2.6. Кристаллография

2.7. Программное обеспечение

2.8. Реактивы

ГЛАВА 3. Белок-белковые взаимодействия между люциферазой и целентеразин-связывающим белком из Renilla muelleri

3.1. Характеристика целентеразин-связывающего белка (СВР)

3.1.1. Спектры полгощения СВР

3.1.2. Флуоресценция СВР

3.2. Биолюминесценция люциферазы с целентеразином и целентеразин-связывающим белком (СВР)

3.3. Расчет пространственной структуры комплекса люцифераза-СВР

3.3.1. Пространственная структура комплекса люцифераза-СВР

3.3.2. Пространственная структура комплекса люцифераза-СВР-Са2+

ГЛАВА 4. Образование белок-белкового комплекса межу клитином и зеленым флуоресцентным белком (GFP) из Clytia gregaria

4.1. Характеристика взаимодействия в системе клитин-GFP

4.1.1. Спектральные свойства клитина и GFP

4.1.2. Биолюминесценция клитина в присутствии GFP

4.1.3. Регистрация белок-белкового взаимодействия в системе кли-тин-GFP при помощи разных методов

4.2. Пространственная кристаллическая структура клитина из Clytia gregaria со связанным целентеразином

4.2.1. Кристаллизация

4.2.2. Общая структурная организация клитина

4.3. Пространственная кристаллическая структура зеленого флуоресцентного белка (GFP) из Clytia gregaria

4.4. Исследование Са2+-регулируемого фотопротеина клитина методом гетероядерного ЯМР

4.4.1. Отнесение резонансов в ^-^N HSQC спектре клитина

4.4.2. 'H-^NHSQC спектр Са2+-разряженного клитина, связанного с Са2+.

4.4.3. Определение методом ЯМР-титрования аминокислотных остатков клитина, «затронутых» взаимодействием с GFP

4.4.4. Поверхность взаимодействия клитина

4.5. Исследование GFP методом гетероядерного ЯМР

4.5.1. Отнесение резонансов в 'H-^N HSQC спектре GFP

4.5.2. Определение методом ЯМР-титрования аминокислотных остатков GFP, «затронутых» взаимодействием с клитином

4.5.3. Поверхность взаимодействия GFP

4.6. Пространственная структура комплекса клитин-GFP

4.7. Экспериментальное подтверждение структуры комплекса методом сайт-направленного мутагенеза

Введение Диссертация по биологии, на тему "Белок-белковые взаимодействия в биолюминесцентных системах кишечнополостных Renilla muelleri и Clytia gregaria"

Явление биолюминесценции широко распространено в природе. Фактически, биолюминесценция — это хемилюминесцентная реакция, в которой происходит окисление субстрата — люциферина, катализируемое специфическим ферментом люциферазой. Люциферины и люциферазы разных организмов являются соединениями различной структуры и поэтому это понятие скорее собирательное и функциональное, чем структурно-химическое.

Среди светящихся организмов подавляющее большинство представлено морскими обитателями. К настоящему времени большинство охарактеризованных биолюминесцентных систем морских животных принадлежит к так называемому целентеразин-зависимому типу, где субстратом биолюминесцентной реакции является целентеразин. Классическими представителями целентера-зин-зависимых систем являются биолюминесцентные системы мягкого коралла Reniña и медузы Aequorea.

Главным компонентом биолюминесцентной системы Aequorea является г\ |

Са -регулируемый фотопротеин акворин, который представляет собой комплекс, состоящий из белка и «преактивированного» кислородом целентеразина (2-гидропероксицелентераизна), прочно, но не ковалентно связанного с белком. Биолюминесценция инициируется добавлением ионов кальция и возникает при декарбоксилировании 2-гидропероксицелентеразина. В результате реакции образуется молекула целентерамида в возбужденном состоянии и СОг- Переход целентерамида из возбужденного в основное состояние сопровождается излучением кванта голубого света.

В биолюминесцентной системе Renilla функции фотопротеина как бы поделены между двумя белками, один из которых (Са -зависимый целентеразин-связывающий белок, СВР) хранит субстрат и реагирует на ионы кальция, а другой (люцифераза) катализирует биолюминесцентную реакцию при участии кислорода. Фактически, «субстратом» люциферазы Renilla в биолюминесцентной реакции in vivo является СВР, содержащий одну молекулу прочно связанного целентеразина. Целентеразин становится доступным для реакции с люцифера-зой и 02 только после связывания с СВР ионов кальция.

Окисление целентеразина в активном центре люциферазы или фотопротеина сопровождается излучением кванта голубого цвета, тогда как природное свечение Aequorea и Renilla является зеленым. Это обусловлено наличием дополнительного белка системы, зеленого флуоресцентного белка (GFP), который выступает в роли акцептора энергии возбужденного состояния продукта, це-лентерамида, с последующим излучением кванта зеленого света флуоресценции. Для описания безызлучательного переноса энергии с возбужденного продукта на хромофор GFP использовали с некоторыми ограничениями предложенный Форстером механизм индуктивно-резонансного переноса энергии. Поскольку такой перенос энергии наблюдается в сильно разбавленных растворах донорного и акцепторного белков, было сделано заключение, что перенос происходит с образованием белок-белкового комплекса. Однако достоверно образование короткоживущего комплекса удалось показать только для люциферазы и GFP из Renilla, но не для фотопротеина и GFP из Aequorea.

В лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН были клонированы кДНК гены, кодирующие Са -регулируемый фотопротеин клитин и зеленый флуоресцентный белок (GFP) из светящейся медузы Clytia gregaria, а также Са -регулируемый целентеразин-связывающий белок и люцифераза из мягкого коралла Renilla muelleri, и в настоящее время проводится всестороннее исследование этих белков. В частности, для рекомбинантных белков из Clytia — фотопротеина клитина и GFP — удалось продемонстрировать безызлучательный перенос энергии in vitro при использовании микромолярных концентраций белка, что однозначно свидетельствует об образовании белок-белкового комплекса между клитином и GFP. Важно заметить, что это первый случай, когда формирование комплекса было косвенно показано для биолюминесцентной системы фотопротеинового типа. Однако в силу слабой природы взаимодействия клитина и GFP не удалось получить кристаллов комплекса, а следовательно, и определить его пространственную структуру. Пространственная структура комплекса представляет фундаментальный интерес, поскольку в рамках этого комплекса происходит безызлучательный перенос энергии, который важен не только в биолюминесцентных реакциях, но и в процессах фотосинтеза и дыхания. Другое направление было связано с исследованием биолюминесцентной системы Renilla, в которой белок-белковое взаимодействие между люциферазой и GFP было продемонстрировано в работах американских ученых более 30 лет назад. Тогда же было высказано предположение, что все 3 белка системы Renilla - люцифераза, СВР и GFP - функционируют в комплексе, однако дальнейших исследований в этом направлении проведено не было.

Целью данной работы являлось определение пространственных структур

2+ белок-белковых комплексов между Са -регулируемым фотопротеином клити-ном и зелёным флуоресцентным белком (GFP), а также Са -регулируемым це-лентеразин-связывающим белком (СВР) и люциферазой, входящими в состав биолюминесцентных систем медузы Clytia gregaria и мягкого коралла Renilla muelleri, соответственно. Выполнение исследования требовало решения следующих задач:

2. Получить 13С,15Ы-меченые клитин и GFP для исследования методом ЯМР, провести отнесение резонансов в 'H-^N HSQC спектрах клитина и GFP и на основе данных ЯМР-титрования определить аминокислотные остатки обоих белков, формирующие поверхность взаимодействия.

При решении поставленных задач получены результаты, которые выносятся на защиту:

3. На основе данных о кристаллических структурах клитина и GFP и данных об аминокислотных остатках зоны контакта рассчитана пространственная структура комплекса клитин-GFP, правильность которой подтверждена экспериментально.

Все результаты, представленные в данной работе, получены впервые и имеют фундаментальный характер, так как добавляют новую информацию к пониманию устройства и функционирования биолюминесцентных систем кишечнополостных, а также роли белок-белковых взаимодействий в этих процессах. Комплекс клитин-GFP является хорошей модельной системой для исследования деталей молекулярного механизма индуктивно-резонансного переноса энергии в белковых структурах. Полученные результаты могут найти применение и в прикладных исследованиях. Так, использование СВР в качестве «субстрата» для люциферазы Renilla может повысить чувствительность биолюминесцентного анализа. В свою очередь, система клитин-GFP является новым перспективным кандидатом для использования в BRET системах, широко используемых для прижизненной визуализации белок-белковых взаимодействий в клетках и целых организмах. Данные о пространственной структуре комплекса клитин-GFP являются основой для возможной модификации аффинности белков в комплексе с целью повышения эффективности переноса энергии и, следовательно, чувствительности BRET анализа.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 08-04-92209-ГФЕНа и 05-04-48271а, а также программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Материалы диссертационной работы докладывались на Международной Конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2004); Конференции молодых ученых КНЦ СО РАН (Красноярск, 2007); на Международном симпозиуме по Биолюминесценции и Хемилюминесценции (Шанхай, 2008); на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН и Национальной лаборатории биологических макромолекул Института биофизики Пекина (КНР).

Результаты исследований опубликованы в 1 статье в рецензируемом журнале и включены в международную базу данных РОВ и ВМЯВ.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Титушин, Максим Сергеевич

ВЫВОДЫ

2. На основе кристаллических структур люциферазы Renilla и СВР, связанного с кальцием, рассчитана пространственная структура комплекса люцифе-раза-СВР-Са2+, объясняющая высокую эффективность биолюминесцентной реакции с СВР в качестве «субстрата» люциферазы.

3. Впервые получены кристаллы и определена кристаллическая структура Са -регулируемого фотопротеина клитина из медузы Clytia gregaria с разрешением 1,9 Á. Показано, что пространственная структура клитина высоко гомологична структуре фотопротеина обелина.

4. Впервые получены 13С,15Ы-меченый клитин и 2Н,13С,1 "N-меченый зеленый флуоресцентный белок (GFP) и проведено полное отнесение резонансов основных цепей в 'H-^N HSQC ЯМР спектрах этих белков. С помощью ЯМР-титрования определены аминокислоты клитина и GFP, формирующие поверхность взаимодействия белков. Установлено, что основными аминокислотными остатками зоны контакта клитина являются остатки N-конца, а-спирали D и С-конца белковой молекулы. Показано, что поверхность контакта GFP более дискретна и образована аминокислотами петель S3-S4, S6-S7 и S10-S11 верхушки «бочонка».

5. На основе кристаллических структур клитина и GFP и данных об аминокислотных остатках поверхности взаимодействия рассчитана пространственная структура комплекса клитин-GFP, отражающая взаимную ориентацию белков. Так как KD комплекса клитин-GFP, оцененная из биолюминесцентных измерений, лежит в мкМ диапазоне, а из данных ЯМР — в мМ диапазоне, еделан вывод, что структура комплекса клитин-ОБР соответствует комплексу, предшествующему «возбужденному состоянию». 6. Получены мутанты клитина с заменами некоторых аминокислот, формирующих зону контакта. С помощью ЯМР и биолюминесцентных измерений показано, что замены уменьшают эффективность образования комплекса. Это является дополнительным подтверждением правильности рассчитанной структуры комплекса клитин-ОРР.

126

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Регуляция важнейших клеточных процессов, таких как репликация ДНК, транскрипция, сплайсинг, клеточная сигнализация и др. осуществляется в рамках белок-белковых взаимодействий. Образование белок-белковых комплексов также важно для функционирования некоторых целентеразин-зависимых биолюминесцентных систем кишечнополостных, однако детали таких белок-белковых взаимодействий остаются малопонятными.

Представленная работа посвящена определению и анализу пространственных структур белок-белковых комплексов между фотопротеином клитином и зеленым флуоресцентным белком (ОРР) из медузы С1уйа ^еа^апа и между люциферазой и целентеразин-связывающим белком (СВР) из коралла ЛепШа тиеИеп. Фотопротеин клитин функционирует как биолюминесцентный белок вследствие индукции ионами кальция реакции окислительного декарбоксили-рования связанного в активном центре 2-пероксицелентеразина. Энергия возбужденного продукта реакции индуцирует флуоресценцию ОРР по индуктивно-резонансному механизму. Функцией СВР является Са -индуцированное высвобождение субстрата для реакции с ЯепШа люциферазой.

Биолюминесцентные белки С1уйа и ЯетИа образую слабые и неустойчивые белок-белковые комплексы, что накладывает существенные методологические ограничения при их исследовании. В настоящей работе были успешно применены методы рентгеноструктурного анализа, белкового ЯМР и компьютерного моделирования для определения пространственных структур комплексов клитин-ОБР и люцифераза-СВР, которые объясняют некоторые функциональные особенности биолюминесцентной реакции С1уйа и ЯетПа. Оба комплекса характеризуются относительно малым количеством межмолекулярных контактов и комплементарностью электростатического потенциала поверхностей взаимодействия белков, что является характерным свойством слабых белок-белковых комплексов, известных на сегодняшний день. Взаимодействие люциферазы с СВР формирует белковый карман, который экранирует возбужденное состояние продукта реакции целентерамида, что объясняет высокую эффективность биолюминесценции в системе люцифераза-СВР. В комплексе клитин-GFP некоторые структурные элементы белков, формирующие зону контакта, являются конформационно нестабильными, что может обеспечивать «гибкую стыковку» белковых молекул. Хромофоры обоих белков сближены на расстояние 45 А, что является достаточным условием для осуществления индуктивно-резонансного переноса энергии. Важно отметить, что индуктивно-резонансный перенос энергии на настоящий момент описан только феноменологически, тогда как физический механизм процесса малопонятен. Установленная структура комплекса клитин-GFP является удобной модельной системой для исследования процесса переноса энергии в белковых структурах.

В заключение выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю к.б.н. Е.С. Высоцкому, моим коллегам из лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН за помощь в постановке и проведении экспериментов, интерес к работе и обсуждение полученных результатов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Титушин, Максим Сергеевич, Красноярск

1. Высоцкий, Е.С. Кальций-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных / Е.С. Высоцкий, С.В. Маркова, Л.А. Франк // молекулярная биология. - 2006. - Т. 40, №3. - С. 404-417.

2. Фримэн, М. Магнитный резонанс в химии и медицине / Р. Фримэн // Пер. с англ. М.: КРАСАНД, 2009. - 336 с.

3. Abagyan, R. High-throughput docking for lead generation / R. Abagyan, M. Totrov // Curr. Opin. Chem. Biol. 2001. - V. 5. - P. 375-382.

4. Allen, D.G. Aequorin luminescence: relation of light emission to calcium concentration a calcium independent component / D.G. Allen, J.R. Blinks, F.G. Prendergast // Science. - 1977. -V. 195. - P. 996-998.

5. Alvarez, J.C. High-throughput docking as a source of novel drug leads / J.C. Alvarez // Curr. Opin. Chem. Biol. 2004. - V. 8. - P. 365-370.

6. Andmsier, N. Principles of flexible protein-protein docking / N. Andrusier, E. Mashiach, R. Nussinov, H.J. Wolfson // Proteins. 2008. -V. 73. - P. 271289.

7. Aqvist, J. The linear interaction energy method for predicting ligand binding free energies / J. Aqvist, J. Marelius // Comb. Chem. High Throughput Screen. 2001. - V. - 4. - P. 613-626.

8. Archakov, A.I. The optical biosensor study of the protein-protein interactions with cytochrome P450s / A.I. Archakov, Y.D. Ivanov // In Biophysics of electron transfer and molecular Bioelectronics, Pleum Publication Corporation: USA.-1999.-P. 173-194.

9. Argos, P. An investigation of protein subunit and domain interfaces / P. Argos // Protein Eng. 1988. - V. 2. - P. 101-113.

10. Arunkumar, A.I. Insights into hRPA32 C-terminal domain-mediated assembly of the simian virus 40 replisome / A.I. Arunkumar, V. Klimovich, X. Jiang, R.D. Ott, L. Mizoue, E. Fanning, W.J. Chazin // Nat. Struct. Mol. Biol. -2005.-V. 12.-P. 332-339.

11. Barlow, D.J. The distribution of charged groups in proteins / D.J. Barlow, J.M. Tornton// Biopolymers. 1986. -V. 25. -P. 1717-1733.

12. Bax, A. Comparison of different modes of two-dimensional reverse-correlation NMR for the study of proteins / A. Bax, M. Ikura, L.E. Kay, D. A. Torchia, R. Tschudin // J. Magn. Reson. 1990. - V. 86. - P. 304-318.

13. Bax, A. Dipolar couplings in macromolecular structure determination / A. Bax, G. Kontaxis, N. Tjandra // Methods Enzymol. 2001. - V. 339. - P. 127-174.

14. Böhm, H.J. Prediction of binding constants of protein ligands: A fast method for the prioritization of hits obtained from de novo design or 3D database search programs / H.J. Böhm // J. Comput. Aid. Mol. Des. 1998. - V. 12. -P. 309-323.

15. Böhm, H.J. The development of a simple empirical scoring function to estimate the binding constant for a protein-ligand complex of known three-dimensional structure / H.J. Böhm // J. Comput. Aid. Mol. Des. 1994. - V. 8.-P. 243-256.

16. Bolon, P.J. Residual dipolar coupling derived orientational constraints on ligand geometry in a 53 kDa protein-ligand complex / P.J. Bolon, H.M. Al-Hashimi, J.H. Prestegard // J. Mol. Biol. 1999. -V. 293. - P. 107-115.

17. Bonvin, A.M. Flexible protein-protein docking / A.M. Bonvin // Curr. Opin. Struct. Biol. 2006. - V. 16. - P. 194-200.

18. Bouzida, D. A Monte-Carlo study of ligand-protein binding energy landscape with the weighted analysis histogram methods / D. Bouzida, P. Rejto, G. Verkhivker // Int. J. Quantum Chemistiy. 1999. - V. 73. - P. 113-121.

19. Braden, B.C. Structure and energetics of anti-lysozyme antibodies / B.C. Braden, R.J. Poljak // In Protein-protein recognition, Oxford University Press:1. USA. 2000. - P. 126-161.

20. G.M. Clore // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 25191-25206.

21. Cai, W. Protein-ligand recognition using spherical harmonic molecular surfaces: towards a fast and efficient filter for large virtual throughput screening / W. Cai, X. Shao, B. Maigret // J. Mol. Graph. Model. 2002. - Y. 20. - P. 313-328.

22. Camacho, C.J. Free energy landscapes of encounter complexes in proteinprotein association / C.J. Camacho, Z. Weng, S. Vajda, C. DeLisi // Biophysics J. 1999.-V. 76.-P. 1166-1178.

23. Campbell, A.K. Extraction, partial purification and properties of obelin, the calcium-activated luminescent protein from the hydroid Obelia geniculata / A.K. Campbell // Biochem. J. 1974. - V. 143. - P. 411-418.

24. Charbonneau, H. Ca -induced bioluminescence in Renilla reniformis. Purification and characterization of a calcium-triggered luciferin-binding protein /

25. H. Charbonneau, M.J. Cormier // J. Biol. Chem. 1979. - V. 254. - P. 769780.

26. Chaudhury, S. Conformer selection and induced fit in flexible backbone protein-protein docking using computational and NMR ensembles / S. Chaudhury, J.J. Gray// J. Mol. Biol. -2008. -V. 381. P. 1068-1087.

27. Chen, R. ZDOCK: an initial-stage protein-docking algorithm / R. Chen, L. Li, Z. Weng // Proteins. 2003. -V. 52. - P. 80-87.

28. Clore, G.M. Theory of the time-dependent nuclear Overhauser effect applications to structural analysis of ligand-protein complexes in solution / G.M. Clore, A. Crohenborn // J. Magn. Reson. - 1983. - V. 53. - P. 423-442.

29. Cody, C.W. Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein / C.W. Cody, D.C. Prasher, W.M. Westler, F.G. Prendergast, W.W. Ward // Biochemistry. 1993. - V. 32. - P. 1212-1218.

30. Cole, J.C. Protein-ligand docking and virtual screening with GOLD / J.C. Cole, J. W.M. Nissink, R.D. Taylor // in Virtual Screening in Drug Discovery (Eds. B. Shoichet, J. Alvarez), Taylor & Francis CRC Press, Boca Raton, Florida, USA.-2005.

31. Connolly, M.L. Analytical molecular surface calculation / M.L. Connolly // J. Appl. Crystallogr. 1983. - V. 16. - P. 548-558.

32. Cormier, M.J. Evidence for similar biochemical requirements for bioluminescence among the coelenterates / M. J. Cormier, K. Hori, Y.D. Karkhanis, J.M. Anderson, J.E. Wampler, J.G. Morin, J.W. Hastings // J. Cell. Physiol. 1973. -V. 81.-P. 291-297.

33. Cutler, M.W. Characterization and energy transfer mechanism of green-fluorescent protein from Aequorea victoria / M.W. Cutler // Ph.D. Dissertation, Rutgers University, New Brunswick, NT, 1995.

34. Cutler, M.W. Protein-protein interaction in Aequorea bioluminescence / M.W.

35. Cutler, W.W. Ward // Bioluminescence Symposium, Maui, Hawaii, Nov. 310, 1993.

36. Davies, D.R. Interactions of protein antigen with antibodies / D.R. Davies, G.H. Cohen // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996. - V. 93. - P. 7-12.

37. DeWitte, R.S. SMoG: de novo design method based on simple, fast, and accurate free energy estimates. 1. Methodology and supporting evidence / R.S. DeWitte, E.I. Shakhnovich // J. Am. Chem. Soc. -1996. -V. 118. P. 1173311744.

38. Feher, M. BHB: a simple knowledge-based scoring function to improve the efficiency of database screening / M. Feher, E. Deretey, S. Roy // J. Chem. Inf. Comput. Sei.-2003.-V. 43.-P. 1316-1327.

39. Fernández-Recio, J. Soft protein-protein docking in internal coordinates / J. Fernández-Recio, M. Totrov, R. Abagyan // Protein Sei. — 2002. V. 11. — P. 280-291.

40. Fischer, D. A geometry-based suite of molecular docking processes / D. Fischer, S.L. Lin, H.L. Wolfson, R. Nussinov // J. Mol. Biol. 1995. - V. 248. -P. 459^177.

41. Fitzjohn, P.W. Guided docking: first step to locate potential binding sites / P.W. Fitzjohn, P.A. Bates // Proteins. 2003. - V. 52. - P. 28-32.

42. Fogolari, F. Protocol for MM/PBSA molecular dynamics simulations of proteins / F. Fogolari, A. Brigo, H. Molinari // Biophys J. 2003. - V. 85. - P. 159-166.

43. Garrett, D.S. Solution structure of the 40,000 Mr phosphoryl transfer complex between the N-terminal domain of enzyme I and HPr / D.S. Garrett, Y J. Seok, A. Peterkofsky, A.M. Gronenbom, G.M. Clore // Nat. Struct. Biol. 1999. -V. 6.-P. 166-173.

44. Giegerich, R. A discipline of dynamic programming over sequence data / R. Giegerich, R. C. Meyer, P. Steffen // Sci. Comput. Program. 2004. - V. - 51. -P. 215-263.

45. Glaser, F. Residue frequencies and pairing preferences at protein-protein interfaces / F. Glaser, D. Steinberg, I.A. Vakser, N. Ben-Tal // Proteins. 2001. -V. 43.-P. 89-102.

46. Gorovits, B.M. The molecular chaperonin cpn60 displays local flexibility that is reduced after binding with unfolded protein / B.M. Gorovits, P.M. Horowitz // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 13057-13062.

47. Gray, J.J. High-resolution protein-protein docking / J.J. Gray // Curr. Opin. Struct. Biol.-2006.-V. 16.-P. 183-193.

48. Gray, J.J. Protein-protein docking with simultaneous optimization of rigid-body displacement and side-chain conformations / J.J. Gray, S. Moughon, C. Wang, O. Schueler-Furman, B. Kuhlman, C.A. Rohl, D. Baker // J. Moh Biol. 2003 - V. 331. - P. 281-299.

49. Gschwend, D.A. Molecular docking towards drug discovery / D.A. Gschwend, A.C. Good, I.D. Kuntz // J. Moh Recognit. 1996. - V. 9. - P. 175-186.

50. Halperin, I. Principles of docking: an overview of search algorithms and a guide to scoring functions /1. Halperin. B. Ma, H.J. Wolfson, R. Nussinov // Proteins. 2002. V. - 47. - P. 409-443.

51. Hart, R.K. Potential energy smoothing: A deterministic analog of simulated annealing / R.K. Hart, R.V. Pappu, J.W. Ponder // J. Comput. Chem. 2000. -V.-21.-P. 531-552.

52. Hastings, J.W. Calcium-triggered light emission in Renilla. A unitary biochemical scheme for coelenterate bioluminescence / J.W. Hastings, J.G. Morin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1969. - V. 37. - P. 493-498.

53. Hastings, J.W. Intermediates in the bioluminescent oxidation of reduced flavin mononucleotide / J.W. Hastings, Q.H. Gibson // J. Biol.Chem. 1963. - V. 238.-P. 2537-2554.

54. Head, J.F. The crystal structure of the photoprotein aequorin at 2.3 A resolution // J.F. Head, S. Inouye, K. Teranishi, O. Shimomura // Nature. 2000. -V. 405.-P. 372-376.

55. Honig, B. Classical electrostatics in biology and chemistry / B. Honig, A.

56. Nicholls // Science. 1995. - V. 268. - P. 1144-1149.

57. Huang, S.Y. An iterative knowledge-based scoring function to predict protein-ligand interactions: I. Derivation of interaction potentials / S.Y. Huang, X. Zou // J. Comput. Chem. 2006. -V. 27. - P. 1866-1875.

58. Hubbard, S.J. Cavities and packing at protein interfaces / S.J. Hubbard, P. Argos //Protein Sci. 1994. -V. 3. - P. 2194-2206.

59. Inouye, S. Expression, purification and characterization of calcium-triggered luciferin-binding protein of Renilla reniformis / S. Inouye // Protein Expr. Pu-rif. 2007. - V. 52. - P. 66-73.

60. Inouye, S. Secretional luciferase of the luminous shrimp Oplophorus gracili-rostris: cDNA cloning of a novel imidazopyrazinone luciferase / S. Inouye, K. Watanabe, H. Nakamura, O. Shimomura // FEBS Lett. 2000. - V. 481. - P. 19-25.

61. Ishchenko, A.V. SMall molecule growth 2001 (SMoG2001): An improved knowledge-based scoring function for protein-ligand interactions / A.V. Ishchenko, E.I. Shakhnovich // J. Med. Chem. 2002. - V. 45. - P. 27702780.

62. Jain, A.N. Scoring functions for protein-ligand docking / A.N. Jain // Curr. Protein Pept. Sci. 2006. - V. 7. - P. 407^120.

63. Janin, J. Principles of protein-protein recognition from structure to thermodynamics / J. Janin // Biochimie. 1995. - V. 77. - P. 497-505.

64. Janin, J. The structure of protein-protein recognition sites / J. Janin, C.

65. Chothia // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. - P. 16027-16030.

66. Jayaram, B. Solvation free energy of biomacromolecules: Parameters for a modified generalized born model consistent with the AMBER force field / B. Jayaram, D. Sprous, D.L. Beveridge // J. Phys. Chem. B. 1998. V. - 102. -P. 9571-9576.

67. Jiang, F. "Soft docking": matching of molecular surface cubes / F. Jiang, S.H. Kim//J. Mol. Biol. 1991. -V. 219. - P. 79-102.

68. Jiang, F. SOFTDOCK: understanding of molecular recognition through a systematic docking study / F. Jiang, W. Lin, Z. Rao // Protein Eng. 2002. - V. 15.-P. 257-263.

69. Johnson, B.A. NMR view: A computer program for the visualization and analysis of NMR data / B.A. Johnson, R.A. Blevins // J. Biomol. NMR. -2004.-V. 4.-P. 603-614.

70. Johnson, F. H. Quantum efficiency of Cypridina luminescences, with a note on that of Aequorea / F.H. Johnson, O. Shimomura, Y. Saiga, L.C. Gershman,

71. G. Reynolds, J.R. Waters // J. Cell, and Comp. Physiol. 1962. - V. 60. - P. 85-103.

72. Jones, S. Principles of protein-protein interactions / S. Jones, J.M. Thornton // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996. -V. 93. - P. 13-20.

73. Jorgensen, W.L. Rusting of the lock and key model for protein-ligand binding / W.L. Jorgensen // Science. 1991. - V. 254. - P. 954-955.

74. Jung, Y.S. Mars robust automatic backbone assignment of proteins / Y.S. Jung, M. Zwecksteller // J. Biomol. NMR. - 2004. V. - 30. - P. 11-23.

75. Kahraman, A. Shape variation in protein binding pockets and their ligands / A. Kahraman, R.J Morris, R.A. Laskowski, J.M. Thornton // J. Mol. Biol. 2007. -Y.368.-P. 283-301.

76. Kamiya, N. Protein-inhibitor flexible docking by a multicanonical sampling: Native complex structure with the lowest free energy and a free-energy barrier distrinsuishing the native complex from the others / N. Kamiya, Y. Yonezawa,

77. H. Nakamura, J. Higo // Proteins. 2008. - V. 70. - P. 41-53.

78. Kang, R.S. Solution structure of a CUE-ubiquitin complex reveals a conserved mode of ubiquitin binding / R.S. Kang, C.M. Daniels, S.A. Francis, S.C. Shih, W.J. Salerno, L. Hicke, I. Radhakrishnan // Cell. 2003. - V. 113. - P. 621630.

79. Kitchen, D.B. Docking and scoring in virtual screening for drug discovery: methods and applications / D.B. Kitchen, H. Decornez, J.R. Fun-, J. Bajorath // Nat. Rev. Drug Discov. 2004. - V. 3. - P. 935-949.

80. Krammer, A. LigScore: a novel scoring function for predicting binding affinities / A. Krammer, P.D. Kirchhoff, X. Jiang, C.M. Venkatachalam, M. Waldman // J. Mol. Graph. Model. 2005. - V. 23. - P. 395-407.

81. Kroemer, R.T. Molecular modelling probes: docking and scoring / R.T. Kroemer // Biochem. Soc. Trans. -2003. -V. 31. P. 980-984.

82. Kumar, S. Amino acid sequence of the Ca -triggered luciferin binding protein of Renilla reniformis / S. Kumar, M. Harrylock, K.A. Walsh, M.J. Cormier, H. Charbonneau // FEBS Lett. 1990. - V. 268. - P. 287-290.

83. Kumar, S. Folding funnels and conformational transitions via hinge-bending motions / S. Kumar, B. Ma, C.J. Tsai, H. Wolfson, R. Nussinov // Cell Biochem. Biophys. 1999. -V. 31. - P. 141-164.

84. Larsen, T.A. Morphology of protein-protein interfaces / T.A. Larsen, A .J. Olson, D.S. Goodsell // Structure. 1998. - V. 6. - P. 421-427.

85. Lee, B. The interpretation of protein structures: estimation of static accessibility / B. Lee, F.M. Richards // J. Mol. Biol. 1971. - 55. - P. 379^100.

86. Lee, J. Protein conformational changes in obelin shown by 15N-HSQC nuclear magnetic resonance / J. Lee, J.N. Glushka, S.V. Markova, E.S. Vysotsi // Bioluminescence and Chemiluminescence 2000. World Scientific Publishing Co., Singapore, 2001. P. 99-102.

87. Lengauer, T. Computational methods for biomolecular docking / T. Lengauer, M. Rarey // Curr. Op. in Struct. Biol. 1996. - V. 6. - P. 402-406.

88. Li, X.D. Comparative studies of 14 binding free energies scoring functions / X.D. Li, T.J. Hou, X.J. Xu // J. Acta Phys. Chim. Sin. 2005. - V. - 21. - P. 504-507.

89. Liang, S. A simple reference state makes a significant improvement in near-native selections from structurally refined docking decoys / S. Liang, S. Liu, C. Zhang, Y. Zhou // Proteins. 2007. - V. 69. - V. 244-253.

90. Lijnzaad, P. Hidrophobic patches on protein subunit interfaces: Characteristics and prediction / P. Lijnzaad, P. Argos // Proteins. 1997. - V. 28. P. 333-343.

91. Liu, Z.J. Structure of the Ca2+-regulated photoprotein obelin at 1.7 A resolution determined directly from its sulfur substructure / Z.J. Liu, E.S. Vysotski, C.J. Chen, J. Rose, J. Lee, B.C. Wang // Protein Sci. 2000. - V. 9. - P. 2085-2093.

92. Lo Conte, L. The atomic structure of protein-protein recognition sites / L. Lo Conte, C. Chothia, J. Janin // J. Mol. Biol. 1999. - V. 285. - P. 2177-2198.

93. Lorenz, W.W. Isolation and expression of a cDNA encoding Renilla reni-formis luciferase / W.W. Lorenz, R.O. McCann, M. Longiaru, M.J. Cormier //

94. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991. -V. 88. - P. 4438^1442.

95. Lu, H. Development of unified statistical potentials describing protein-protein interactions / H. Lu, L. Lu, J. Skolnick // Biophys. J. 2003. - V. 84. - P. 1895-1901.

96. Lyskov, S. The RosettaDock server for local protein-protein docking / S. Ly-skov, J.J. Gray // Nucleic Acids Research. 2008. - V. 36 (Web Server Issue). -P. W233-W238.

97. Ma, J. Simulated annealing using the classical density distribution / J. Ma, J.E. Straub //J. Chem. Phys. 1994. -V. 101. -P. 533-541.

98. Markova, S.V. Cloning and expression of cDNA for a luciferase from the marine copepod Metridia longa / S.V. Markova, S. Golz, L.A. Frank, B. Kalthof, E.S. Vysotski // J. Biol. Chem. -2004. -V. 279. P. 3212-3217.

99. Massova, I. Computational alanine scanning to probe protein-protein interactions: A novel approach to evaluate binding free energies /1. Massova, P.A. Kollman //J. Am. Chem. Soc. 1999. -V. 121. - P. 8133-8143.

100. Matthews, J.C. Purification and properties of Renilla reniformis luciferase / J.C. Matthews, K. Hori, M.J. Cormier // Biochemistry. 1977. - V. 16. - P. 85-91.

101. McCapra, F. The chemiluminescence of Cypridina analogue / F. McCapra, Y.C. Chang // Chem. Commun. 1967. -P. 1011-1012.

102. McCoy, A.J. Electrostatic complementarity at protein/protein interfaces / A.J. McCoy, E.V. Chandana, P.M. Colman // J. Mol. Biol. 1997. - V. 268. - P. 570-584.

103. McCoy, M.A. Structures of protein-protein complexes are docked using only NMR restraints from residual dipolar coupling and chemical shift perturbations / M.A. MacCoy, D.F. Wyss // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. - P. 2104-2105.

104. Meng, E.C. Automated docking with grid-based energy evaluation / E.C. Meng, B.K. Shoichet, I.D. Kuntz // J. Comp. Chem. 1992. - V. 13. - P. 505524.

105. Miller, D.W. Ligand binding to proteins: the binding landscape model / D.W. Miller, K.A. Dill //Prot. Sci. 1997. -V. 6. - P. 2166-2179.

106. Mohan, V. Docking: successes and challenges / V. Mohan, A.C. Gibbs, M.D. Cummings, E.P. Jaeger, R.L. DesJarlais // Curr. Pharm. Des. 2005. - V. 11, -P. 323-333.

107. Moont, G. Use of pair potentials across protein interfaces in screening predicted docked complexes / G. Moont, H.A. Gabb, M.J. Sternberg // Proteins. -1999.-V. 35.-P. 364-373.

108. Morin, J. G. Biochemistry of the bioluminescence of colonial hydroids and other coelenterates / J.G. Morin, J.W. Hastings // J. Cell. Physiol. 1971. - V. 77.-P. 305-312.

109. Morin, J.G. Coelenterate bioluminescence / J.G. Morin; edited by L.

110. Muscatine, H.M. Lenhoff // Coelenterate Biology: Reviews and New Perspectives. New York: Academic press, 1974. - P. 397-438.

111. Morise, H. Intermolecular energy transfer in the bioluminescent system of Aequorea / H. Morise, O. Shimomura, F.H. Johnson, J. Winant // Biochemistry. 1974. -V. 13. - P. 2656-2662.

112. Morris, G.M. Automated docking using a lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function / G.M. Morris, D.S. Goodsell, R.S. Halliday, R. Huey, W.E. Hart, R.K. Belew, A.J. Olson // J. Comput. Chem. -1998.-V. 19.-P. 1639-1662.

113. Morris, R.J. Real spherical harmonic expansion coefficients as 3D shape descriptors for protein binding pocket and ligand comparisons / R.J. Morris, R. J. Najmanovich, A. Kahraman, J. M. Thornton // Bioinformatics. — 2005. — V. 21.-P. 2347-2355.

114. Muegge, I. Evaluation of PMF scoring in docking weak ligands to the FK506 binding protein /1. Muegge, Y.C. Martin, P.J. Hajduk, S.W. Fesik // J. Med. Chem. 1999. -V. 42. - P. 2498-2503.

115. Muegge, I. PMF scoring revisited /1. Muegge //. J. Med. Chem. 2006. - V. 49.-P. 5895-5902.

116. Northrup, S.H. Kinetics of protein-protein association explained by Brownian dinamics computer simulation / S.H. Northrup, H.P. Erickson // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992. -V. 89. - P. 3338-3342.

117. Nussinov, R. Efficient detection of three-dimensional structural motifs in biological macromolecules by computer vision techniques / R. Nussinov, H.J. Wolfson//Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991. -V. 88. -P. 10495-10499.

118. Obiol-Pardo, C. Comparative evaluation of MMPBSA and XSCORE to compute binding free energy in XIAP-peptide complexes / C. Obiol-Pardo, J. Rubio-Martinez // J. Chem. Inf. Model. 2007. - V. 47. - P. 134-142.

119. Ohashi, W. Backbone 1II, l3C and l3N resonance assignments for the Mg2+-bound form of the Ca~ -binding photoprotein aequorin / W. Ohashi, S. Inouye, T. Yamazaki, H. Hirota // J. Biomol. NMR. 2005. - V. 31. - P. 375-376.

120. Ormô, M. Crystal structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein / M. Ormô, A.B. Cubitt, K. Kallio, L.A. Gross, R.Y. Tsien, S.J. Remington. -Science. 1996. - V. 273. - P. 1392-1395.

121. Palma, P.N. BiGGER: a new (soft) docking algorithm for predicting protein interactions / P.N. Palma, L. Krippahl, J.E. Wampler, J.J. Moura // Proteins. -2000.-V. 39.-P. 372-384.

122. Pappu, R.V. A potential smoothing algorithm accurately predicts transmembrane helix packing / R.V. Pappu, G.R. Marshall, J. W. Ponder // Nature Struct. Biol. 1999. - V. 6. - P. 50-55.

123. Pawson, T. Protein modules and signalling networks / T. Pawson // Nature. -1995.-V. 373.-P. 573-580.

124. Prestegard, J.H. Residual dipolar couplings in structure determination of bio-molecules / J.H. Prestegard, C.M. Bougault, A.I. Kishore // Chem. Rev. -2004.-V. 104.-P. 3519-3540.

125. Ritchie, D.W. Recent progress and future directions in protein-protein docking / D.W. Ritchie // Curr. Protein Pept. Sci. 2008. - V. 9. - P. 1-15.

126. Shaul, Y. Exploring the charge space of protein-protein association: a proteo-mic study / Y. Shaul, G. Schreiber // Proteins. 2005. - V. 60. - P. 341-352.

127. Shimomura, O. Bioluminescence: Chemical principles and methods / O. Shi-momura. Singapore: World Scientific Publishing Co., 2006. - p. 470.

128. Shimomura, O. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea / O. Shimomura, F.H. Johnson, Y. Saiga // J. Cell. Comp. Physiol. 1962. - V. 59. - P. 223239.

129. Shimomura, O. Isolation and properties of the luciferase stored in the ovary of the scyphozoan medusa Periphylla periphylla / O. Shimomura, P.R. Flood, S. Inouye, B. Bryan, A. Shimomura // Biol. Bull. 2001. - V. 201. - P. 339-347

130. Shimomura, O. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin / O. Shimomura, F.H. Johnson // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1978. V. 75. - P. 2611-2615.

131. Shoemaker, B.A. Speeding molecular recognition by using the folding funnel: the fly-casting mechanism / B.A. Shoemaker, J.J. Portman, P.G. Wolynes // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000. - V. 97. - P. 8868-8873.

132. Shoichet, B.K. Lead discovery using molecular docking / B.K. Shoichet, S.L. McGovern, B. Wei, J.J. Irwin // Curr. Opin. Chem. Biol. 2002. - V. 6. - P. 439^446.

133. Shoichet, B.K. Molecular docking using shape descriptors / B.K. Schoichet, D.L. Bodian, I.D. Kuntz // J. Comp. Chem. 1992. - V. 13. - P. 380-397.

134. Sitkoff, D. Accurate calculation of hydration free energies using macroscopicsolvent models / D. Sitkoff, K.A. Sharp, B. Honig // J. Phys. Chem. 1994. -V. 98.-P. 1978-1988.

135. Smith, G.R. Prediction of protein-protein interactions by docking methods / G.R. Smith, M.J. Sternberg // Curr. Opin. Struct. Biol. 2002. -V. 12. - P. 28-35.

136. Sousa, S.F. Protein-ligand docking: current status and future challenges / S.F. Sousa, P. A. Fernandes, M. J. Ramos // Proteins. V. 65. — P. 15-26.

137. Srinivasan, J. Continuum solvent studies of the stability of DNA, RNA, and phosphoramidate-DNA helices / J. Srinivasan, T.E. Cheatham, P. Cieplak, P.A. Kollman, D.A. Case // J. Am. Chem. Soc. 1998. -V. 120. - P. 94019409.

138. Stanfield, R.L. Antigen-induced conformational changes in antibodies: a problem for structural prediction and design / R.L. Stanfield, I.A. Wilson // Trends Biotechnol. 1994. - V. 12. - P. 275-279.

139. Stepanyuk, G.A. Structure based mechanism of the Ca~ -induced release of coelenterazine from the Renilla binding protein / G.A. Stepanyuk, Z.J. Liu, E.S. Vysotski, J. Lee, J.P. Rose, B.C. Wang // Proteins. 2009. - V. 74. - P. 583-593.

140. Sternberg, M.J. Predictive docking of protein-protein and protein-DNA complexes / M.J. Strenberg, H.A. Gabb, R.M. Jackson // Curr. Opin. Struct. Biol. 1998.-V. 8.-P. 250-256.

141. Stites, W.E. Protein-protein interactions: interface structure, binding thermodynamics, and mutational analysis / W.E. Stites, I.A. Wilson // Chem. Rev. -1997. -V. 97. P. 1233-1250.

142. Takahashi, H. A novel NMR method for determining the interfaces of large protein-protein complexes / H. Takahashi, T. Nakanishi, K. Kami, Y. Arata, I.

143. Shimada // Nat. Struct. Biol. 2000. - V. 7. - P. 220-223.

144. Taylor, R.D. A review of protein-small molecule docking methods / R.D. Taylor, P.J. Jewsbury, J.W. Essex // J. Comp. Aid. Mol. Design. 2002. - V. 16. -P. 151-166.

145. Thomson, C.M. The widespread occurrence and tissue distribution of the imi-dazolopyrazine luciferins / C.M. Thomson, P.J. Herring, A.K. Campbell // J. Biolum. Chemilum. 1997. -V. 12. -P. 87-91.

146. Tortov, M. Detailed ab initio prediction of lysozyme-antibody complex with 1.6 À accuracy / M. Totrov, R. Abagyan // Nat. Struct. Biol. 1994. - V. 1. -P. 259-263.

147. Tovchigrechko, A. How common is the funnel-like energy landscape in protein-protein interactions? / A. Tovchigrechko, I.A. Vakser // Protein Sci. -2001.-V. 10.-P. 1572-1583.

148. Trosset, J.Y. PRODOCK: a new software package for protein modeling and docking / J.Y. Trosset, H.A. Scheraga // J. of Comp. Chem. 1999. - V. 20. -P. 412-427.

149. Trosset, J.Y. Reaching the global minimum in docking simulations: A Monte Carlo energy minimization approach using Bezier splines / J.Y. Trosset, H. A. Scheraga//Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. V. - 95.-P. 8011-8015.

150. Tsai, C.J. Studies of protein-protein interfaces: a statistical analysis of hydrophobic effect / C.J. Tsai, S.L. Lin, H.J. Wolfson, R. Nissinov // Protein Sci. — 1997a.-V. 6.-P. 53-64.

151. Tsai, C.J. Structural motifs at protein-protein interfaces: protein cores versus two-state and three-state model complexes / C.J. Tsai, D. Xu, R. Nissinov // Protein Sci. 1997b. - V. 6. - P. 1797-1809.

152. Tsai, C.J. Hydrophobic folding units at protein-protein interfaces: Implications to protein folding and to protein-protein association / C.J. Tsai, R. Nissinov // Protein Sci. 1997. - V. 6. - P. 1426-1437.

153. Tsai, C.J. Protein-protein interfaces: Architectures and interactions in proteinprotein interfaces and in protein cores. Their similarities and differences / C.J.

154. Tsai, S.L. Lin, HJ. Wolfson, R. Nissinov II Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol.1996.-V. 31.-P. 127-152. i

155. Tsuji, F.I. Molecular evolution of the Ca -binding photoproteins of the Hydrozoa / F.I. Tsuji, Y, Ohmiya, T.F. Fagan, H. Toh, S. Inouye // Photochem. Photobiol. 1995. -V. 62. - P. 657-661.

156. Vakser, I.A. A systematic study of low-resolution recognition in proteinprotein complexes / I.A. Vakser, O.G. Matar, C.F. Lam // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999. -V. 96. - P. 8477-8482.

157. Vakser, I.A. Long-distance potentials: An approach to the multiple-minima problem in ligand-receptor interaction / I.A. Vakser // Protein Eng. 1999. -V. 9. - P. 37^41.

158. Verdonk, M.L. Improved protein-ligand docking using GOLD / M.L. Verdonk, J.C. Cole, M.J. Hartshorn, C.W. Murray, R.D. Taylor // Proteins. -2003.-V. 52.-P. 609-623.

159. Vysotski, E.S. Ca -regulated photoproteins: structural insight into the bioluminescence mechanism /E.S. Vysotski, J. Lee // Acc. Chem. Res. — 2004. -V.37.-P. 405-415.

160. Vysotski, E.S. Extraction and purification of obelin, the Ca -dependent photoprotein from the hydroid Obelia longissima /E.S. Vysotski, V.S. Bondar, V.N. Letunov // Biochemistry-Moscow. 1989. - V. 54. - P. 965-973.

161. Wampler, J.E. Structured bioluminescence. Two emitters during both the in vitro and the in vivo bioluminescence of the sea pansy, Renilla / J.E. Warnpier, K. Hori, J.W. Lee, M.J. Cormier // Biochemistry. 1971. - V. 10. - P. 2903-2909.

162. Wang, C. RosettaDock in CAPRI rounds 6-12 / C. Wang, O. Schueler-Furman, I. Andre, N. London, S.J. Fleishman, P. Bradley, B. Qian, D. Baker// Proteins. 2007. - V. 69. - P. 758-763.

163. Wang, R. An extensive test of 14 scoring functions using the PDBbind refined set of 800 protein-ligand complexes / R. Wang, Y. Lu, X. Fang, S. Wang // J. Chem. Inf. Comput. Sci. 2004. - V. 44. - P. 2114-2125.

164. Wang, R. Comparative evaluation of 11 scoring functions for molecular docking / R. Wang, Y. Lu, S. Wang // J. Med. Chem. 2003. - V. 46. - P. 22872303.

165. Wang, R. Further development and validation of empirical scoring functions for structure-based binding affinity prediction / R. Wang, L. Lai, S. Wang // J. Comput. Aid. Mol. Des. 2002. - V. 16. - P. 11-26.

166. Wang, R. SCORE: a new empirical method for estimating the bind affinity of a protein-ligand complex / R. Wang, L. Liu, L. Lai, Y. Tang // J. Mol. Model. 1998.-V. 4.-P. 379-394.

167. Ward, W. W. Biochemical and physical properties of green fluorescent protein. In, Chalfie, M. & Kain, S. (eds.) Green Fluorescent Protein, P. 45-75 Wiley-Liss, New York (1998).

168. Ward, W.W. In vivo energy transfer in Renilla bioluminescence / W.W. Ward, M.J. Cormier // J. Phys. Chem. 1976. - V. 80. - P. 2289-2291.

169. Ward, W.W. Properties of mneopsin and berovin, calcium-activated photoproteins from the ctenophores Mnemiopsis sp. / W.W. Ward, H.H. Seliger // Biochemistry. 1974. -V. 13. - P. 1500-1510.

170. Webster, D.M. Antibody-antigen interactions / D.M. Webster, A.H. Henry, A.R. Rees // Curr. Opin. Struc. Biol. 1994. - V. 4. - P. 123-129.

171. Weis, A. Ligand affinities predicted with the MM/PBSA method: dependence on the simulation method and the force field / A. Weis, K. Katebzadeh, P. Söderhjelm, I. Nilsson, U. Ryde // J. Med. Chem. 2006. V. - 49. - P. 65966606.

172. Wells, J.A. Binding in the growth hormone receptor complex / J.A. Wells // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1996. - V. 93. - P. 1-6.

173. Wiehe, K. The performance of ZDOCK and ZRANK in rounds 6-11 of CAPRI / K. Wiehe, B. Pierce, W.W. Tong, H. Hwang, J. Mintseris, Z. Weng // Proteins. 2007. - V. 69. - P. 719-725.

174. Wilson, I.A. Antibody-antigen interactions / I.A. Wilson, R.L. Stanfield // Curr. Opin. Struct. Biol. 1993. - V. 3. - P. 113-118.

175. Xu, D. Hydrogen bonds and salt bridges across protein-protein interfaces / D. Xu, C.J. Tsai, R. Nissinov // Protein Eng. 1997b. - V. 10. - P. 999-1012.

176. Xu, D. Protein binding versus protein folding: the role of hydrophilic bridges in protein associations / D. Xu, S.L. Lin, R. Nissinov // J. Mol. Biol. 1997a. -V. 265.-P. 68-84.

177. Yang, F The molecular structure of green fluorescent protein / F. Yang, L.G. Moss, G.N. Phillips Jr. // Nature Biotechnol. 1996. - V. 14. - P. 1246-1251.

178. Zeden-Lutz, G. Thermodynamic analysis of antigen-antibody binding using biosensor measurements at different temperatures / G. Zeden-Lutz, E. Zuber, J. Witz, M.H. Van Regenmortel //Anal. Biochem. 1997. - V. 246. - P. 123132.

179. Zhang, C. Protein-protein recognition: exploring the energy funnels near the binding sites / C. Zhang, J. Chen, C. DeLisi // Proteins. 1999. - V. 34. - P.255.267.

180. Zhang, N. NMR-based model reveals the structural determinants of mammalian arylamine N-acetyltransferase substrate specificity / N. Zhang, L. Liu, F. Liu, C.R. Wagner, P.E. Hanna, K.J. Walters // J. Mol. Biol. 2006. - V. 363. -P. 188-200.

Информация о работе

Титушин, Максим Сергеевич
кандидата биологических наук
Красноярск, 2009
ВАК 03.00.02

Диссертация

Белок-белковые взаимодействия в биолюминесцентных системах кишечнополостных Renilla muelleri и Clytia gregaria - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы