Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ca2+-регулируемый фотопротеин обелин и его производные как репортеры в биолюминесцентном анализе in vitro

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Ca2+-регулируемый фотопротеин обелин и его производные как репортеры в биолюминесцентном анализе in vitro"

На правах рукописи

Борисова Василиса Валерьевна

Са2+-РЕГУЛИРУЕМЫЙ ФОТОПЮТЕИН ОБЕЛИН

И ЕГО ПРОИЗВОДНЫЕ КАК РЕПОРТЕРЫ В БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОМ АНАЛИЗЕ Ш УГГКО

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск - 2009

003462926

Работа выполнена в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН, г. Красноярск

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Франк Людмила Алексеевна Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Бондарь Владимир Станиславович

Доктор медицинских наук Савченко Андрей Анатольевич

Ведущая организация:

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Защита состоится 2009 г. в час. на заседании

диссертационного совета Д 003.007.01 в Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, д.50, стр.50. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН

Автореферат разослан «

2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук ^ да. Франк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важнейшей задачей современной биотехнологии является поиск новых высокоэффективных аналитических инструментов, способных отвечать нуждам медицинской диагностики, микробиологии, геномики, экологии и т.д. Ключевыми элементами аналитических систем являются системы регистрации специфических взаимодействий аффинных комплексов. Основными требованиями, предъявляемыми к этим системам, являются их надежность, стабильность, простота мечения и детекции, а также способность обеспечить выявление сверхмалых количеств биомолекул-мишеней. Этим требованиям в полной мере удовлетворяют подходы, использующие биолюминесцентные метки. В этой связи разработка аналитических систем на базе рекомбинангных светящихся белков, пригодных для использования в диагностических и исследовательских целях, является актуальной задачей.

В лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН ведутся многолетние исследования биолюминесцентной системы Са2+-регулируемого фотопротеина обелина гидроидного полипа ОЬеИа 1ощ1$ыта: выделен и изучен природный белок, клонирована его кДНК, получен пггамм-суперпродуцент и разработана эффективная технология получения рекомбинаншош обелина, установлена его пространственная структура и предложен механизм биолюминесцентной реакции. На основе этих данных сайт-направленным мутагенезом был сконструирован ряд мутантов обелина, обладающих уникальными свойствами, в том числе и новыми спектральными характеристиками излучения. Это обусловило возможность использования мутангных форм обелина в качестве репортеров для одновременного определения нескольких мишеней с регистрацией сигналов на разных длинах волн.

Другим способом одновременного определения двух мишеней является использование двух меток, представляющих собой конъюгаты биоспецифических молекул с разными репортер ными ферментами. Определение мишеней осуществляется последовательным запуском репортеров при внесении соответствующих субстратов.

Известно, что диагностирование ряда заболеваний основано на установлении баланса (или его нарушений) между двумя антигенами

(соотношения JIT и ФСГ, тироидпых гормонов - трийодгиронина, тироксина, а также их свободных и связанных форм и т.д.). Как правило, определение этих веществ производится раздельно, с помощью диагностических наборов, специфических для каждого антигена. Одновременный анализ содержания нескольких антигенов в одном и том же образце позволит избежать ошибок из-за разнесенных во времени процедур определения, а также существенным образом сократит временные и материальные затраты на такую диагностику, что особенно важно при проведении широкомасштабных исследований.

Другим видом молекулярной диагностики является метод, основанный на определении определенных нуклеотидных последовательностей с помощью ДНК-гибридизации. В литературе имеются данные о перспективности использования фотопротеина акворина в качестве репортерного белка в таком анализе. Исследований по применению рекомбинангного обелина для этих цепей не проводилось.

Цель и задачи исследования. Целью представленной работы являлась разработка вариантов биолюминесцентного иммуноанализа, позволяющих проводить определение двух антигенов в одном образце, а также вариантов ДНК-гибридизационного анализа с применением фотопротеина обелина в качестве репортера. Выполнение данного исследования требовало:

1. Получить высокоочшценные препараты мутаптных форм обелина OL W92FJI22E и OL Y138F, имеющих разные спектральные характеристики биолюминесценции, исследовать их основные свойства и с помощью химических модификаций синтезировать активные коньюгаты с иммуноглобулинами к двум разным антигенам.

2. Разработать вариант одновременного биолюминесцентного иммуноанализа двух антигенов в одном образце с использованием полученных коньюгатов в качестве меток.

3. Получить высокоочшценный препарат рекомбинантной мономерной люциферазы Metridia longa, изучить ее основные свойства и синтезировать коньюгаты люциферазы, пригодные для использования в качестве биолюминесцентной метки в иммуноферментном анализе.

4. Разработать вариант биолюминесцентного иммуноанализа двух антигенов в одном образце с использованием в качестве репортеров фотопротеина обелина и люциферазы Metridia langa.

5. Синтезировать коньюгаш обегана с авидином или стрешавидином и исследовать их эффективность в качестве меток в твердофазном гибридизационном анализе.

6. Разработать способ получения хоньюгатов обелина и его мутантных форм с олигонуклеотидами. Продемонстрировать пригодность полученных коньюгатов в качестве метки в гибридизационном анализе продуктов ПЦР.

Научная новнзпа и практическая ценность работы. В представленной работе впервые показана возможность одновременного иммуноанализа двух антигенов в одном образце с использованием «цветных» мутантных форм обелина в качестве репортер пых белков и регистрацией сигналов на разных длинах волн на примере одновременного определения лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов.

Показано, что рекомбинантная целентеразин-зависимая люцифераза Metridia longa является перспективным репортерным белком для анализа т vitro. Обнаружено, что биолюминесценция люциферазы Metridia инициируется целептеразин-связывающим Са2+-зависимым белком Renilla reniformis в присутствии ионов Са2+. Разработан иммуноанализ двух антигенов в одном образце с использованием двух разных биолюминесцентных репортеров -фотопротеина обелина и люциферазы Metridia с последовательным запуском биолюминесцентных реакций этих репортеров.

Показана перспективность использования фотопротеина обелина как репортера в гибридизационном анализе в различных форматах.

Результаты данной работы могут быть использованы для создания отечественных высокоэффективных и чувствительных биолюминесцентных диагностикумов для определения биологически важных соединении и инфекционных агентов. Исследованные биолюминесцентные белки могут использоваться дня различных научных исследований как высокочувствительные репоргерные молекулы.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на конференциях молодых ученых КНЦ СО РАН (Красноярск, 2006, 2007), международных симпозиумах по Биолюминесценции и Хемилюминесценции (Йокогама, Япония, 2004; Сан-Диего, США, 2006; Шанхай, Китай, 2008), международной конференции по инструментальным методам анализа (Патры, Греция, 2007), международной конференции молодых ученых по молекулярной

биологии и генетике, посвященной 120-му юбилею М.И. Вавилова (Киев, Украина, 2007), международной конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, 2006), международном семинаре молодых ученых «Нуклеиновые кислоты как мишени и инструменты» (Новосибирск, 2006).

Публикации. По результатам исследования опубликовано 5 статей и 16 тезисов международных и российских конференций.

Структура и объем работы. Работа изложена на 104 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение результатов исследования, заключение, выводы и список цитируемой литературы (88 источников). Диссертационная работа проиллюстрирована 27 рисунками, содержит 1 таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Клонирование и получение экспрессионных плазмид дня обелина Obelia longissima, его мутантов и целентеразин-зависимой люциферазы Metridia longa (MLuc39) было выполнено старшим научным сотрудником лаборатории фотобиологаи ИБФ СО РАН Марковой C.B.

Получете рекамбинантных фотопротеинов проводили по способу, разработанному в лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН для рекомбинантного апообелина дикого типа [Dlaiionov В.А. et al., 2000], с небольшими модификациями, описанными в [Markova S.V. et al., 2002].

Рекомбитптную целентеразин-заеисимую люциферазу Metridia longa MLuc39 выделяли из телец-включений после ультразвуковой дезинтеграции рекомбинантых клеток Е. coli. Тельца включения промывали последовательно буфером 20 мМ Трис-HCl, pH 7,0, содержащим 0,15 M NaCl и 0,5% Tweea 20 (трижды), и растворяли в 6 M растворе 1уанидин-НС1. Полученный экстракт переводили в 100-кратный объем раствора, содержащего 20 мМ Трис-HCl pH 8,8, 5 мМ цистеина, 0,5 мМ цистина, 1 мМ ЭДТА и инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем образец концентрировали ультрацентрифугированием в пробирках Amicon Ultra 15 (Millipore, США) и хроматографировали на колонке Superose 12 (GE Healthcare), уравновешенной 0,1 M NaHCOî. Для работы использовали фракцию с молекулярной массой 21 кДа.

Рсхамбинантпый целентперазин-спязываюишй белок Renilla muelleri выделяли, как описано в работе [Titushin M.S. et al., 2008].

Биолюминесцентный сигнал измеряли с помощью кюветного люминометра (модель БЛМ 8802, СКВ «Наука», Красноярск). Сигнал регистрировали с помощью самописца (модель 2210) фирмы LKB (Швеция).

Биолюминесцентную активность фотопротеинов определяли в 0,1 М Трис-HCl рН 8,8 буфере, содержащем 10 мМ ЭДТА. Реакцию инициировали добавлением 0,1 М СаС12 в 0,1 М Трис-HCl рН 8,8. Биолюминесцешную активность люциферазы MLuc39 определяли в SM-буфере (50 мМ Трис-HCl рН 7,5, 0,1 М NaCl, 10 мМ MgS04, 0,01 % желатина), реакцию инициировали добавлением 5 мкл 10 мкМ раствора целентеразина в метаноле. Концентрацию целентеразина определяли по его поглощению при длине волны 434 нм, используя коэффициент экстинкции 8900 см"1 М1 [Hon К. et al., 1977]. Для измерения биолюминесценгной активности в микропланшетах использовали планшетный люминометр Luminoscan Accent (ThermoElectron Со, Финляндия).

1. Одновременный иммунофсрмыгпгый анализ двух антигенов с использованием «цветных» мутантных форм обелина в качестве меток.

Для работы использовали полученные нами высокоочшценные препараты мутангных формы обелина W92F;H22E и Y138F. В таблице 1 представлены основные физико-химические свойства этих белков в сравнении с о бел ином дикого типа. Биолюминесцентый сигнал Y138F сдвинут в длинноволновую область спектра (7^^=493 нм), a W92F;H22E — В КОРОТКОВОЛНОВУЮ (А-ггах—388 нм) (рис. 1.). Уровень Са2+-независимой люминесценции, который является одним из показателей устойчивости фотопротеинового комплекса, для обелина W92F;H22E в 3 раза меньше, а для обелина Y138F в 2 раза выше, чем для обелина дикого типа. При этом для всех фотопротеинов уровень Са2+-активируемой биолюминесценции на 6-7 порядков выше, чем Са2+-независимой люминесценции. Кинетика биолюминесцентных сигналов представленных фотопротеинов характеризуется высокой скоростью подъема (рис. 1.). В то же время, спад сигнала существенным образом отличается: для обелинов WT и W92F;H22E биолюминесцентный сигнал спадает примерно с одной скоростью - ка=6,9 и 6,1 с"1, соответственно, а спад биолюминесцентного сигнала обелина Y138F существенно медленнее - kd=0,6 с"1. Биопюминесцентная активность обелинов Y138F и W92F;H22E составляет 70% и 10% от биолюминесцентной

активности обелила дикого типа, соответственно, что отражается на пределе обнаружения этих белков. Предел обнаружения, определяемый как количество белка, при котором величина сигнала в два раза превосходит сигнал от буфера, составляет 1,4, 4,2 и 12 атгомоль дм обелинов У138Р и Ш92Р;Н22Е, соответственно.

Таблица 1

Физико-химические свойства мутантпых форм обелина

Белок Биолюминесценция Хтш/плечо (нм) Активность %от WT IcaWßeJIOK (отн.ед. мг"1) 1са-йиЛса хЮ"8 Константа спада (с"1)

WT 482/400 100 210 8,6 6,9

W92FJI22E 388 10 68,2 30 6,1

Y138F 493/400 68 461,5 25 0,6

Ica-free - интенсивность кальций-независимой люминесценции

lo - интенсивность кальций-активируемой биолюминесценции

Мутангные формы обелина Y138F и W92F;H22E стабильны в растворе и в замороженном виде при хранении в ТЕ буфере (20 мМ Трис-HCl pH 7,0,5 мМ ЭДТА), с добавлением 1% БСА. При лиофшшзации обелина Y138F из того же раствора добавление 10% трегалозы позволяет сохранить 100% его активности. Активность W92F;H22E при лиофшшзации теряется значительно и при добавлении даже 20% трегалозы сохраняется только 47% от исходной активности белка.

Значительная спектральная разнесенность сигналов (максимумы биолюминесценции различаются на 105 нм) и слабое их перекрывание делают возможным разделение биолюминесцентных сигналов каждого белка из их смеси с помощью широкополосных оптических фильтров (рис. 1). В работе были использованы светофильтры: ЖС16, имеющий 100% пропускание от 1=450 нм и далее в длинноволновую область и полностью поглощающий свечение в более коротковолновой области, и ФС6, со 100% пропусканием только в коротковолновой области (от 300 до 420 нм), рис. I.A. На рис. 1.Б показано пропускание биолюминесцентпых сигналов через светофильтры, встроенные в каналы двухканального люминометра (модель БЛМ 8802М2К, СКВ Наука, Красноярск). Видно, что оба светофильтра пропускают излучение от «своего» мутанта эффективно (поглощение не превышает 8-9%). В то же

время, каждый светофильтр практически полностью (больше, чем на 96%) задерживает биолюминесцентный сигнал «соседнего» фотопротеина. Таким образом, разработанный подход позволяет одновременно регистрировать сигналы от двух репоргерных белков, смешанных в одной кювете.

А Б

нм время, сек

Рис. 1. А Нормированные спектры биолюминесценции '№92Р;Н22Е (темно-серый) и У138Р (светло-серый); Спектры пропускания светофильтров: I - ФС6, II - ЖС16. Б Пропускание биолюминесцентных сигналов через светофильтры, встроенные в каналы I и II. Пунктиром показаны сигналы без светофильтров. Данные нормированы на концентрацию белка. Стрелками показан момент внесения Са^.

В качестве объекта для одновременного иммуноанализа были выбраны гонадотропные гормоны - лютеинизирующий (ЛГ) и фолликуло-стимулирующий (ФСГ). Соотношение содержания этих гормонов важно для диагностики нарушений функций генеративных органов (синдром поликистоза яичников, анорхизм, гипогонадизм, бесплодие). ЛГ и ФСГ - это гормоны передней доли гипофиза, которые вырабатываются под воздействием гонадотропного рилизинг-гормона гипоталамуса. Они представляют собой двух-субъ единичные гликопротеиды, у которых а-субьединицы структурно очень схожи и, таким образом, биологические и иммунологические свойства каждого гормона зависят от их уникальной р-субъединицы [Балаболкин М.И., 1998]. Для анализа ЛГ и ФСГ в сыворотках были получены коныогаты «цветных» мутантов обелина с антителами к (3-субъединицам данных гормонов.

9

Синтез коньюгатов проводили в условиях, разработанных для модификации обелина дикого типа [Frank L.A. et al., 1997]. Коныогаты выделяли гель-фильтрацией на колонках Superosel2. Коньюгирование мутантных форм обелина с иммуноглобулинами проходило эффективно и не приводило к существенной потере активности обелинов (не более 30% от исходной после всех манипуляций). На рис. 2 представлена схема проведения анализа.

W92F-H22E V

« Л

антиР-ФСГ-!д0

II 493 нм

:|11й Y138

гЧ '

aHiHß-JT-IgG

V + V

антвО- Фсг-lgG

У / У У У

20 40 60 ВО

[ЛГ],[ФСГ], мМЕ/мл

Рис. 2. Схема проведения и результаты одновременного твердофазного иммуноаналнза ЛГ (А) и ФСГ (•) в стандартных сыворотках. Каждая точка представляет среднее значение от трех независимых определений ± стандартное отклонение.

Поверхность пластиковых пробирок (НПК Бион, Минск) активировали анги-аФСГ иммуноглобулинами (200 мкл, 10 мкг/мл, PBS) в течение ночи при 4°С. После промывки (PBS буфер, содержащий 0,1% Tween 20 и 5 мМ ЭДТА) вносили по 200 мкл смеси стандартных сывороток ЛГ и ФСГ с конечной концентрацией по каждому гормону 1,25; 5; 10; 40; 80 мМЕ/мл, инкубировали 1 час при 37°С и снова промывали. Затем вносили по 200 мкл смеси меток в соотношении 1:1 (анти-|ЗФСГ ~ W92FJÍ22E (7,8 мкг/мл) и анти-(ШГ ~ Y138F (1 мкг/мл)) и инкубировали 40 мин при комнатной температуре. После промывки биолюминесценцию инициировали добавлением 0,1 М СаС12 в 0,1 М Трис-НС1 pH 8,8. Полученная зависимость биолюминесценции от концентрации гормонов в стандартных сыворотках представлена на рис. 2.

Чувствительность анализа при одновременном определении составила 0,57 мМЕ/мл для ФСГ и 1,1 мМЕ/мл для ЛГ (¡рассчитывали по среднему значению сигнала от нулевой сыворотки плюс два стандартных отклонения,

n=3). Чувствительность раздельного радиоизотопного иммуноанализа составляет 0,5 мМ Е/мл дня каждого гормона (НПО Диас, Россия). Принимая во внимание, что одновременный биолюминесцентный анализ был выполнен без оптимизации условий (pH и состав буферов, время реакций, подбор иммуноглобулинов и т.д.), полученные значения чувствительности можно считать удовлетворительными и демонстрирующими перспективность предлагаемого подхода.

2. Последовательный нммуноферментньш анализ двух антигенов с использованием фотопротеина обелина в паре с целентеразин-зависимой люциферазой MLuc39

Люцифераза Metridia longa представляет собой небольшой одноцепочечный полипептид (MW = 22,8 кДа). Фермент катализирует реакцию окисления целентеразина молекулярным кислородом, одним из продуктов которой является квант света в видимом диапазоне (1^=482 нм).

Нами было обнаружено, что биолюминесцентная реакция люциферазы инициируется не только свободным целенгеразином, но и целенгеразином, иммобилизованным внутри кальций-зависимого целентеразин-связывающего белка Renilla muelleri (СВР) [Titushin M.S. et al., 2008] при добавлении в реакционную смесь ионов кальция. В одинаковых условиях измерения (концентрации субстрата и люциферазы, буферный раствор, температура) обе реакции характеризуются высокой скоростью подъема и медленным спадом, однако, при инициировании биолюминесценции целентеразин-связывающим белком наблюдается более замедленный спад и увеличение интегрального биолюминесцентного сигнала в 1.6 раз (рис. 3. В) Обнаруженные факты, вероятно, можно объяснить наличием белок-белковых взаимодействий, как это показано для люциферазы Renilla muelleri (СВР) [Titushin M.S. et al., 2008; Stepanyuk G.A. et al. 2008], увеличением времени жизни возбужденного продукта реакции, замедленным высвобождением целентеразина из молекулы СВР и др. Для выяснения этого вопроса необходимы дополнительные исследования, выходящие за рамки данной работы.

Зависимость биолюминесценции MLuc39 от концентрации субстрата, а также фоновые сигналы субстратов рассматривали в диапазоне концентраций СЕ и СВР от 0,01 до 10 мкМ. Результаты представлены на рис. 3 АД

I

X &

к

3

е> X 5 5

г

с о

5

ш

4 6x1о:

5

2 §

ш

2*104

10г «< 10» 10" [СЕ],[СВР], мкМ

ш о

5 104

Е ю'

0

« юг 5 ю'

110« X

1 ю-' §

х

и» 10»

5 10 15 Время, мкм.

10° 10' 10г 10' 101 105 Белок, аттомояь

Рис. 3. А Зависимость биолюминесценции МЬис39 от концентрации целентеразина (-•-) и СВР в присутствии Са2+ (-А-). Б Фоновые сигналы от растворов пелептеразипа (-о-), СВР (-Л-) и смеси СВР с МЬис39 (-Т-). Концентрация люциферазы - 7 рМ в обоих случаях. В Биолюминесценция МЬисЗЭ при запуске раствором целентеразина (—) или СВР (—). Г Зависимость биолюминесценции МЬис39, инициированной раствором целентеразина (-•-) или СВР (-А-), от количества белка. Зависимость биолюминесценции обелина от количества белка (-■-).

Как видно из рис. З.Б, в результате автоокисления целентеразина наблюдается фоновый люминесцентный сигнал, который существенно возрастает при концентрациях выше 1 мкМ. Значение же фонового сигнала растворов СВР или СВР в смеси с МЬис39 в отсутствие Са2+ не изменяется с увеличением концентрации СВР. Таким образом, СВР как «субстрат» обладает серьезным преимуществом: целентеразин, связанный внутри белка, защищен от автоокисления, в то время как целентеразин, находящийся в растворе, быстро окисляется. Это приводит к увеличению фонового сигнала и делает необходимым применение только свежеприготовленных растворов этого субстрата.

Предел обнаружения MLuc39 (количество белка, при котором соотношение биолюминесцентного сигнала к фоновому равно 2) с помощью раствора целентсразина составляет 10х10"18 моль, а при использовании в качестве «субстрата» СВР - 1х10"18 моль MLuc39 (рис. З.Г). Для сравнения на этом же рисунке представлена зависимость биолюминесценции Са2+-регулируемого фотопротеина обелина от количества белка в этом же диапазоне концентраций. По сравнению с биолюминесцентным сигналом люциферазы сигнал обелина несколько ниже (в случае с использованием СВР - во всем диапазоне концентрации). Очевидно, наблюдаемая разница сигналов связана с принципиально различным устройством рассматриваемых биолюминесценгпых систем: молекулы обелина непосредственно участвуют в реакции, и при этом только 20-30% молекул высвобождают энергию в виде кванта света (квантовый выход реакции). Люцифераза катализирует окисление целентеразина растворенным кислородом, и в условиях избытка субстрата имеет место увеличение биолюминесцентного сигнала за счет большого числа оборотов фермента.

При выборе оптимальных условий коньюгирования MLuc39 с молекулой биотина мы использовали 2, 5, 10, 15 или 30-кратный молярный избыток N-гидроксисуксинимидного эфира биотина (Bio~Su) в 0,1 М NaHCCb, содержащем 0,25 М NaCl (30 мин, 4°С). Реакцию останавливали добавлением глицина, избыток реагента отделяли гель-фильтрацией на колонке D-salt desalting (Pierce, США). При этом было показано, что использование двукратного избытка биотинилирующего реагента позволяет сохранить 35% исходной биолюминесцентной активности.

Биотиншшрованные производные люциферазы (MLuc~Bio) и обелина (Obe~Bio) использовали в качестве репортеров для иммуноанализа гонадотропных гормонов ЛГ и ФСГ в смешанных стандартных сыворотках.

Обелин биотинилировали, как описано в работе [L.A. Frank, et al. 1997]. Биотинилирование антител к ЛГ и ФСГ (анш-ЛГ и анш-ФСГ) проводили 20-кратным избытком Bio~Su в PBS рН 8,5, 5 мМ ЭДТА в течение 1,5-2 часов при комнатной температуре, избыток реагента отделяли гель-фильтрацией на колонке D-salt desalting. Комплексы MLuc~Bio-Stavi-Bio~aH-ra-®Cr и Ob^Bio-Stavi-Bio~aHTH-.Jir получали инкубированием биотинилированных белков со стрепгавидином в течение 40 мин при молярном соотношении

л < 05«

>В«НЙ»»ЬВ1« +СаС1

t .. л

/ ^JÍ j^nio-Siavi-iiitV -..^!

w* j

i2 Обелии +CBP Mluc свет свет

MLuc~Bio (или Obe~Bio): Stavi : Bio~ анти-ФСГ (или Bio~ анти-ЛГ), равном 2:1:1, а затем выделяли гель-фильтрацией на колонке Supeidex 200 (GE Healthcare), уравновешенной PBS, 5 мМ ЭДТА.

Анализ проводили по схеме, представленной на рис. 4. Лунки планшета активировали антителами к аФСГ (100 мкл, 10 мкг/мл, 0,1 М NaHCOs) 1 час при 37°С и промывали. Блокирование свободной поверхности проводили 1% раствором БСА в PBS (1 час, 37°С. После промывки вносили по 100 мкл смеси стандартных сывороток ЛГ и ФСГ с концентрациями: 1,25 и 80; 5 и 40; 10 и 20; 20 и 10; 40 и 5; 80 и 1,25 мМЕ/мл, соответственно, инкубировали 1 час при 37°С и снова промывали.

Затем в лунки вносили смесь меток (MLuc~Bio-Stavi-Bio~í>Cr и 06e~Bio-Stavi-Bio~JIT) в PBS, 5 мМ ЭДТА, 0,2% БСА, инкубировали 40 мин при 20°С. После промывки биолюминесценцию обелина инициировали добавлением 100 мкл раствора СаС12. Сигнал интегрировали в течение 5 сек, а затем инициировали биолюминесценцию люциферазы добавлением в те же лунки по 50 мкл СВР (50 мкМ, ТЕ буфер) и измеряли его в течение 20 сек. Результаты анализа представлены на рис. 4.

Полученные сигналы линейны во всем диапазоне исследуемых концентраций гормонов. Следует также заметить, что во всем диапазоне измерений величина сигналов, полученных от люциферазы, выше, чем от обелина. Вероятно, и здесь имеет место накопление люциферазного сигнала,

[ЛГ], [ФСГ|, мМЕ/мл

Рис. 4. Схема проведения и результаты анализа ФСГ (•) и ЛГ (■) в смешанных стандартных сыворотках.

так как фермент работает в условиях избытка по субстрату. Суммарное время дня измерения обоих сигналов составляет 25 секунд, т.е. для измерения стандартного 96-луночного планшета необходимо 40 минут и при этом могут быть получены данные о содержании 192 антигенов.

3. Гнбриднзацншшый биолюминесцентный анализ с использованием фотопротеяна обелила

Гибридизационный анализ с использованием в качестве меток коньюгатов стрептавидина с обелином или щелочной фосфатазой.

Модельную ДНК-матрицу выявляли методом молекулярной гибридизации с помощью зонда 31 (5' -ТС АШС АОТ АСС АС ААШСС), иммобилизованного на поверхность планшет СЫА-Впк! (рис. 5.). В качестве ДНК-матрицы использовали олигонуклеотид М1 (5'-ОПССОААА&ЗССТТОТСОТАСТСССТОА) или Ш*. содержащий на 3'-конце остаток биотина (*). Введение биотина в состав габридизационного комплекса осуществляли гибридизацией иммобилизированнош зонда 31 (10"6 10"12 М) с матрицей Ш* (30 мин, 62°С) (рис. 5.А) или ферментативным удлинением иммобилизированного зонда 31 (Ю45 + 10"12М) в составе комплекса 31/М1 с помощью 7а£-ДНК-полимеразы в присутствии биотинилированнош дезоксиуридингрифосфата (ЮТР\30 мин, 62 °С) (рис. 5.Б).

/ 31

" V г. коаьмаг • з. отпкьки 4. вядгяение

Т^Я -П У.СШ1 ер йа'____

г : * !

зс^ъ-с едете аадед-гд ? ^^тскмАатдсслс^етссгрр,

Р-йг перлофззвам яогктеяь, * - остаток бестии®

Рис. 5. Схема проведения габридизационного анализа.

Иммобилизованный биотинилированный продукт инкубировали с конъюгатами стрептавидина со щелочной фосфатазой или обелином (0,5-1 мкг/мл, в ТЕ буфере). В случае использования в качестве метки щелочной фосфатазы конечный комплекс выявляли колориметрически (выполнено Пышной И.А. в ИХБиФМ СО РАН). Биолюминесценцию фотопротеина обелила инициировали раствором СаС12 и измеряли с помощью планшетного

Рис. 6. Результаты выявления ДНК-матриц М1*(») и М (А) на планшетах ОМА-Вш<1: (а) - биолюминесцентное, (б) - колориметрическое (1- через 15мин, 2- через 4 ч после внесения субстрата-ИРР).

На рис. 6 (а) приведены результаты четырех независимых измерений при биолюминесценгаом способе обнаружения модельных матриц Ш* (рис. 5.А) и М1 (рис. 5.Б) на поверхности планшет БНА-ВшА Видно, что сигналы имеют хорошую воспроизводимость (разброс 5-10%), и их величина линейно зависит от концентрации матрицы в диапазоне от 10"8 М до 10~12 М (Д2=0,97). Предел обнаружения матриц М1* и М1 соответствует 10"п М. Этот предел определяли как концентрацию матрицы, при которой сигнал (0,03 и 0,026 для Ш* и МП, соответственно) достоверно отличается от контрольного, плюс 28Э (эти значения составили 0,016 и 0,014). Полученную линейную зависимость сигнала от концентрации МП можно использовать как калибровочную кривую для определения содержания данной ДНК-матрицы в исследуемом растворе.

Колориметрическое выявление в аналогичном варианте после 4-часового инкубирования достоверно обнаруживает в образце Ю~10 М ДНК-матрицы. В области высоких концентраций внесенной матрицы (Ю^-ЧОГ8 М) наблюдается небольшая разница между сигналами. Очевидно, это связано с насыщением поверхности лунок при данных концентрациях олигонуклеотидов в образцах.

Особый интерес для нас представляли эксперименты по выявлению ПЦР-продуктов вируса гепатита С (ВГС), выделенных из разных клинических образцов. Амплифицированные фрагменты кДНК вируса гепатита С (ВГС), были любезно предоставлены Пышной И.А. (ИХБФМ СО РАН). Двухцепочечный ПЦР-фрагмент длиной 230 п.о. был предварительно денатурирован. Биотиновую метку в последовательность зонда 31 вводили с помощью Гад-ДНК-полимеразы (рис. 5.Б). На рис. 7 приведены результаты

Рис. 7. Выявление ПЦР-фрагмента ВГС на планшетах БЫД-ВЫ. По оси абсцисс указаны разбавления образца ПЦР-фрагмента, «НгО» - контрольный образец (вода вместо ДНК), (в) - биолюминесцентная метка; (б) - колориметрическая метка через 4 ч после внесения субстрата ЫРР; на врезке - кинетика накопления колориметрического сигнала при внесении матрицы с разбавлением в 20 (1), 100 (2) и 500 (3) раз.

Видно, что, как и в модельных экспериментах, для колориметрического анализа существенным параметром является возможность накопления сигнала, и, если в первые 30-60 мин интенсивность окраски в пробах практически не отличается от контрольной, то через 4 часа можно выявить матрицу в образце с 500-кратным разбавлением. Для обелиновой метки ДНК-матрица выявляется непосредственно в момент внесения раствора СаС12 в лунки и, как показано на рис. 7(а), сигнал от образца с 1000-кратным разведением целевой ДНК достоверно (более, чем в 2 раза) отличается от контрольной пробы.

Гибридизационпый анализ с использованием в качестве метки коньюгата олигонуклеотидюго зонда с обелином или его мутантпыми вариантами ¥]38Р и Ш92Р,Н22Е

В качестве универсальной метки для ДНК-габридизационного анализа нами были синтезированы конъюгаты обелина и его мутангных вариантов

17

Y138F и W92F-H22E с олигонуклеотидом (dT)30, которые можно использовать для анализа любых матриц с использованием специфического зонда с концевым поли-А фрагментом. В работе нами были использованы два способа синтеза (Рис. 8.).

Первый предполагает введение SH группы в молекулу обелина с помощью 2-иминотиолана (10-кратным молярный избыток, 30 мин, при комнатной температуре в PBS рН 8,5), модификацию аминогруппы олигонуклеотида гетеробифункциональным реагентом SMCC (100-кратный молярный избыток, 30 мин, при комнатной температуре в 0,1 М NaHC03) и коньюшрование тионилированного обелина с малеимидной группой SMCC-активированного олигонуклеотида (в молярном соотношении 1:3 в течение ночи при 4°С) - способ, похожий на разработанный ранее для получения коньюгатов обелина с белками.

: ЛИ, V.I

II N„¡.„»1---—* VaiA -'-ЖАч

о

«*М!\ " 3 <

| 'ч -«j--', . HN-Wigo

В

!T-,N-©!reo

BS'

issfp р

О Зч. \

б [ N-0

ь

tibe-NH;

I ?

Oiw-M I ' <CH2)5 H\'-oiigo

Рис. 8. Схема синтеза коньюгатов олигонуклеотидов с обелином с помощью гепгеробифункционального (А) и гомобифункционального (Б) реагентов, где о^о - ((1Т)зо, ОЬе - обелин.

Второй способ предполагает модификацию олигонуклеотида по ИНг-группе с помощью большого (100-кратного) избытка гомобифункционального сшивающего реагента В83 (30 мин, при комнатной температуре в 0,1 М ЫаНСОз, в темноте), который содержит две №гидроксисукцинимидные группы (сульфопроизводные), разделенные линейным углеводородным спейсером (СН2)б. При большом избытке ВБ3 лимитируется побочное коньюгирование

18

двух олигонуклсотпдсв между собой. В8з-акшвированные оштгонуклеотиды инкубировали с обелином в молярном соотношении 1:2 в течение ночи при 4°С в темноте). Очистку коныогатов проводили с помощью анионо-обменной хроматографии на колонке МопоС2. Профили элюции представлены на рис. 9. Для эффективного разделения был использован сложный профиль градиента концентрации ЫаС1. Не прореагировавший обелин элюируется первым при 0,21 М ЫаС1, затем при 0,45 М №С1 элюируется коньюшт обелина с олишнуклеотидом, а затем - не прореагировавший олигонуклеотид.

<• к (V V} №

О*; чй (Х! V*«, мп 0<

Рис. 9. Профили элюции и биолюминесцентная активность фракций при хроматографической очистке коныогатов обелинов с ошгонуклеотидом ((1Т)зо. Серым цветом показаны фракции с исходным обелином, стрелками - фракции, содержащие коньюгаты (<Щзо с обелинами У138Р и \V92F-H22E.

Полученные коньюгаты устойчивы при хранении в растворе и в замороженном виде в буфере 20 мМ Трис-НС1 рН 7,0, 5 мМ ЭДТА, 0,4 М №С1, содержащем 0,2% БСА. Потери биолюминесцентной активности коныогатов У138Г-(сГГ)зо и W92FH22E-(dT)зo при хранении в растворе в камере бытового холодильника в течение месяца составляют 20%, и 14%, соответственно. При трехкратной процедуре замораживания-оттаивания растворов коныогатов добавление 0,2% БСА позволяет сохранить 94% от их исходной биолюминесцентной активности.

Коньюгаты обелина и его мутантных форм с (сГГ)зо были использованы для проведения шбридизационного анализа продуктов ПНР ДНК вируса гепатита С (ВГС). ПЦР амплификацию 5'-нетранслируемой области ВГС проводили в объеме 20 мкл, содержащем: 1х Taq буфер, 2 мМ М£С12, по 0,4 мМ каждого с[ЫТР, 4 ед. акт. Taq ДНК полимеразы, 26 иг ДНК ВГС и по 1 мкМ праймеров (5' -Вю-ССТССССЮОАОАСтССАТАСТООТС,

5'-GGCACTCGCAAGCACCCTATCAGG). Параметры ПЦР: денатурация (95°С, 30 сек), далее 30 циклов (95°С - 30 сек, 55°С - I мин, 68°С - 2 мин) с последующем прогреванием реакционной смеси при 72°С в течение 10 мин. Концентрацию продуктов ПЦР определяли денситометрически по картинке электрофореза в 1% агарозном геле, окрашенном этидием бромидом с помощью программного обеспечения AlphaEasy™ (Alpha Innotech Corporation, США). В качестве калибровочных маркеров использовали 100 bp DNA Ladder (New England Biolabs, Англия).

Oóe.vm

10? Щ> 103 ЕОродуКтыГВД'З.лМ

Рис. 10. Схема (слева) и результаты (справа) гибридизационного анализа ПЦР продуктов ВГС. Каждая точка представляет среднее значение от трех независимых определений. Сверху показаны коэффициенты вариации.

Продукты ПЦР ВГС анализировали методом молекулярной гибридизации

по схеме, представленной на рис. 10. В лунки планшета (Costar, США)

добавляли по 50 мкл 1,4 нг/мкл стрепгавидана в PBS буфере рН 7,5, сорбцию

проводили в течение 2 часов при 37°С. После промывки в лунки вносили по 50

мкл растворов биотинилированных во время амплификации ПЦР фрагментов,

разбавленных габридизационным буфером (10 мг/мл блокирующего реагента,

0,1 М малеиновой кислоты, 0,15 М NaCl, 5 мМ ЭДТА рН 7,5) до конечных

концентраций: 2696,5, 539,3, 107,86, 21,57, 4,3 и 0,86 пМ. Инкубировали, при

перемешивании, при комнатной температуре 30 минут, затем снова промывали.

Небиотинилированные комплементарные цепочки ДНК были удалены

обработкой 0,05 М NaOH (20 мин при комнатной температуре). После

20

промывки имтсбияизсЕйппие продукты ПЦР гибрндизовали с зондом 5'-АСССААСАСТАСТСООСТАССАОТС, несущим на З'-конце поли-А фрашент (12,5 нМ в шбридизационном буфере) при 42°С 10 минут. Лунки планшета промывали, а затем вносили по 50 мкл коныогата (<1Т)зо с обелином \УТ, У138Р или W92F-H22E в буфере, содержащем 20 мМ Трис-НС1 рН 7,0,5 мМ ЭДТА, 50 мМ №С1, 0,2% БСА, 0,05% Т\уееп 20, инкубировали 30 мин при комнатной температуре и снова промывали. Биолюминесценцию сорбированного комплекса инициировали добавлением 50 мкл раствора СаС12) сигнал интегрировали в течение 5 секунд. Результаты анализа представлены на рис. 10.

Во всем диапазоне исследуемых концентраций продуктов ПЦР ВГС наблюдается линейная зависимость биолюминесцентного сигнала. Предел обнаружения продуктов ПЦР ВГС при использовании в качестве метки коньюгатов (сГГ)з0 с обелином составляет 0,86х10~12 М продуктов ПЦР ВГС с соотношением полезного сигнала к фоновому - 2,7. А при использовании коньюгатов (сГГ)30 с У138Р и \У92Р;Н22Е предел обнаружения составляет 4,3х10"12 М продуктов ПЦР ВГС, с соотношением полезного сигнала к фоновому 2,75 и 2,47, соответственно. Фон определен как биолюминесцентный сигнал в отсутствие ДНК-мишени, и появляется за счет неспецифического связывания метки с поверхностью планшета. Воспроизводимость гибридизационнош анализа определяли, анализируя в трех повторах образцы, содержащие ЮООхЮ"12, 200х10"12 и 50х10"12 М ДНК-мишени. Коэффициенты вариации (СУ) для метки обелил WT-(dT)зo составляли 6, 14,5 и 22,8%, для У138Р-(сГГ)зо - 11,7, 2 и 2,5%, а для \У92Р,Н22Е-(сП)зо - 6,7, 2 и 0,5%, соответственно.

ВЫВОДЫ

1. Получены высокоочшценные препараты мугантных форм обелина ОЬ \У92Р;Н22Е и ОЬ У138Р, имеющие разные спектральные характеристики биолюминесценции, исследованы их свойства и синтезированы активные коныогаты с иммуноглобулинами.

2. Разработан вариант одновременного биолюминесцентного иммуноанализа, эффективность которого продемонстрирована на примере определения лютеинизирующеш и фолликулостимулирующего гормонов в контрольных и стандартных сыворотках. Чувствительность одновременного

21

биолюминесцентного анализа составила 0,57 мМЕ/мл для ФСГ и 1,1 мМЕ/мл для ЛГ.

3. Получен высокоочшценный препарат рекомбинантной люциферазы Metridia longa и изучены ее основные свойства. Показано, что целентеразин, иммобилизованный в целентеразин-связывающем белке (СВР) Renilla muelleri, является более эффективным «субстратом» для люциферазы (предел обнаружения фермента 1 атгомоль), чем целентеразин в растворе (предел обнаружения 10 атгомоль). Люцифераза термостабипьна (время полужизни при 37, 42 и 50°С составляет 60, 30 и 7 мин, соответственно) и устойчива к химическим модификациям.

4. Разработан вариант иммуноанализа двух антигенов с использованием двух разных репортеров - обелина и люциферазы Metridia с последовательным запуском биолюминесцентных реакций.

5. Показано, что синтезированные коньюгаты обелина со стрептавидином являются высокочувствительными метками для шбридизационного анализа. Во всех исследованных условиях проведения анализа использование обелиновой метки обеспечило предел обнаружения ДНК-матрицы 10~u М, что на порядок выше такового при колориметрическом анализе с применением щелочной фосфатазы в качестве репортера.

6. Разработан способ получения и очистки коньюгатов обелина и его мутантных форм OL W92F;H22E и OL Y138F с олигонуклеотидами. Полученные коньюгаты стабильны при хранении в растворе в течение месяца при 8°С и в замороженном виде. Пределы обнаружения модельной ДНК-мишени составили 0,3х10"12 М и 1,4х10"12 М при анализе с использованием коныогатов обелина дикого типа, Y138F и W92F;H22E, соответственно. Пределы обнаружения продуктов ПЦР ДНК вируса гепатита С составили 0,86х10*12 М и 4,3х10'12 М при анализе с использованием коньюгатов обелина дикого типа, Y138F и W92F;H22E, соответственно.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Борисова. В.В. Высокочувствительный и быстрый метод выявления ДНК-фрагментов с использованием фотопротеина обелина как репортера / В.В. Борисова, И.А. Пышная, Д.В. Пышный, Л.А.Франк // Биоорган, химия. -2008-Т. 34-№6-с. 1-7.

2. Frank, L.A. Violet and greenish photoprotein obelin mutants for reporter applications in dual-color assay / L.A. Frank, V.V. Borisova. S.V. Markova, N.P. Malikova, G.A. Stepanyuk, E.S.Vysotski // Anal Bioanal Chem. - 2008 -V. 391 - P. 2891-2896.

3. Borisova. V.V. Recombinant Metridia luciferase isoforms: expression, refolding and applicability for in vitro assay / V.V. Borisova, L.A. Frank, S.V. Markova, L.P. Burakova, E.S. Vysotski // Photochem Photobiol Sci. - 2008 -V. 7.-P. 1025-1031.

4. Borisova. V.V. Refolding of the recombinant luciferases of Metridia longa / V.V. Borisova, L.A. Frank, S.V. Markova, S. Golz, E.S. Vysotski // In: Bioluminescence & Chemiluminescence: Chemistry, Biology and Application. Eds A.A. Szalay, P.J. Hill, L.J. Kricka, P.E. Stanley. Singapore: World Scientific - 2007. - P. 3-6.

5. Frank, L.A. Calcium-regulated photoprotein obelin as a label in immunoassay: an outlook for applications / L.A. Frank, V.V. Borisova. E.S.Vysotski // In: Bioluminescence & Chemiluminescence: progress and perspectives. Eds A. Tsuji, M Matsumoto, M. Maeda, L.J. Kricka, P.E. Stanley. Singapore: World Scientific - 2005. - P. 463-466.

V

\24

Подписано в печать 12.02.2009г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная 80г/м2. Отпечатано на ризографе. Тираж 80 экз. Заказ № 288

Отпечатано в типографии «ДарМа-печать». 660036 г. Красноярск, Академгородок, 50/28 офис 156. Тел 290-72-32

\

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Борисова, Василиса Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ

Условные обозначения

ГЛАВА 1. Использование кальций-регулируемых фотопротеинов в качестве репортеров в диагностики in vitro

1.1. Использование Са -регулируемых фотопротеинов в иммуноферментном анализе

1.2. Использование Са -регулируемых фотопротеинов в гибридизационном анализе

1.3. Одновременный анализ двух мишеней

ГЛАВА 2. Материалы и методы

2.1. Оборудование

2.2. Материалы и реактивы

2.3. Культивирование трансформированных клеток Е. coli, выделение и очистка белков

2.4. Определение концентрации белков, биолюминесцентной активности и спектральные измерения

2.5. Химическая модификация белков и олигонуклеотидов

ГЛАВА 3. Одновременный иммуноферментный анализ двух антигенов с использованием «цветных» мутантных форм обелина в качестве меток

3.1. Основные физико-химические свойства мутантных форм обелина W92F;H22E и Y138F

3.2. Одновременный твердофазный иммуноанализ двух антигенов

ГЛАВА 4. Последовательный иммуноферментный анализ двух антигенов с использованием фотопротеина обелина в паре с целентеразин-зависимой люциферазой Metridia longa

4.1. Основные физико-химические свойства люциферазы Metridia longa

4.2. Использование люциферазы MLuc39 в твердофазном микроанализе

ГЛАВА 5. Гибридизационный биолюминесцентный анализ с использованием фотопротеина обелина

5.1. Гибридизационный анализ с использованием в качестве метки коньюгата стрепт/авидина с обелином или щелочной фосфатазой

5.2. Гибридизационный анализ с использованием в качестве метки коньюгата олигонуклеотидного зонда с обелином или его мутантными вариантами Y138F и W92F;H22E

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ca2+-регулируемый фотопротеин обелин и его производные как репортеры в биолюминесцентном анализе in vitro"

Важнейшей задачей современной биотехнологии является поиск новых высокоэффективных аналитических инструментов способных отвечать нуждам медицинской диагностики, микробиологии, геномики, экологии и т.д. Ключевыми элементами аналитических систем являются системы регистрации специфических взаимодействий аффинных комплексов. Основными требованиями, предъявляемыми к этим системам, являются их надежность, стабильность, простота мечения и регистрации, а также способность обеспечить выявление сверхмалых количеств биомолекул-мишеней. Этим требованиям в полной мере удовлетворяют подходы, использующие биолюминесцентные метки.

Са2+- регулируемые фотопротеины кишечнополостных представляют собой устойчивый фермент-субстратный комплекс, состоящий из белковой части - апопротеина (одноцепочечный полипептид, -20 кДа) и субстрата 2-гидропероксицелентеразина. В аминокислотной последовательности белка находятся 3 кальций-связывающих сайта. Присоединение ионов Са практически мгновенно вызывает реакцию внутримолекулярного окислительного декарбоксилирования субстрата с образованием целентерамида, СО2 и испусканием кванта света в голубой области. Благодаря этому свойству фотопротеины успешно используются для мониторинга внутриклеточного Са более 40 лет. Клонирование кДНК генов ряда фотопротеинов и получение высокоактивных рекомбинантных белков в практически неограниченном количестве открыло новые возможности их применения, в частности, в качестве репортеров в гибридизационном и иммунном анализах.

В лаборатории фотобиологии СО РАН ведутся многолетние исследования биолюминесцентной системы Са -регулируемого фотопротеина обелина гидроидного полипа Obelia longissima: выделен и изучен природный белок, клонирована его кДНК, получен штамм-суперпродуцент и разработана эффективная технология получения рекомбинантного обелина, установлена его пространственная структура и предложен механизм биолюминесцентной реакции. На основе этих данных сайт-направленным мутагенезом были сконструированы ряд мутантов обелина, обладающих уникальными свойствами, в том числе и новыми спектральными характеристиками излучения. Таким образом, появилась возможность использования мутантных форм обелина в качестве меток для одновременного определения нескольких аналитов и регистрацией сигналов на разных длинах волн.

Одной из задач клинической иммунодиагностики является определение не только количества, но и баланса между содержанием двух антигенов (соотношения ЛГ и ФСГ, тироидных гормонов - трийодтиронина, тироксина, а также их свободных и связанных форм; анализ ряда гормонов и белков-переносчиков, в норме присутствующих в кровяном русле и т.д.). Одновременный анализ содержания нескольких антигенов позволит избежать ошибок из-за разнесенных во времени процедур определения, а также существенным образом сократит временные и материальные затраты на такую диагностику, что особенно важно при проведении широкомасштабных исследований.

Другим видом молекулярной диагностики является метод, основанный на определении определенных нуклеотидных последовательностей с помощью ДНК-гибридизации. В литературе имеются данные о перспективности использования фотопротеина акворина в качестве репортерного белка в таком анализе. Исследований по применению рекомбинантного обелина для этих целей не проводилось.

Целью представленной работы являлось разработка вариантов биолюминесцентного иммуноанализа, позволяющих проводить определение двух антигенов в одном образце, а также вариантов ДНК-гибридизационного анализа с применением фотопротеина обелина в качестве репортера.

Выполнение данного исследования требовало решения следующих экспериментальных задач:

1. Получить высокоочищенные препараты мутантных форм обелина OL W92F;H22E и OL Y138F, имеющих разные спектральные характеристики биолюминесценции, исследовать их основные свойства и с помощью химических модификаций синтезировать активные коныогаты с иммуноглобулинами к двум разным антигенам.

2. Разработать вариант одновременного биолюминесцентного иммуноанализа двух антигенов в одном образце с использованием полученных коньюгатов в качестве меток.

3. Получить высокоочищенный препарат рекомбинантной мономерной люциферазы Metridia longa изучить ее основные свойства и синтезировать коныогаты люциферазы, пригодные для использования в качестве биолюминесцентной метки в иммуноферментном анализе.

4. Разработать вариант биолюминесцентного иммуноанализа двух антигенов в одном образце с использованием в качестве репортеров фотопротеина обелина и люциферазы Metridia longa.

5. Синтезировать коньюгаты обелина с авидином или стрептавидином и исследовать их эффективность в качестве меток в твердофазном гибридизационном анализе.

6. Разработать способ получения коньюгатов обелина и его мутантных форм с олигонуклеотидами. Продемонстрировать пригодность полученных коньюгатов в качестве метки в гибридизационном анализе продуктов ПЦР.

При решении поставленных задач были получены новые результаты, которые выносятся на защиту:

1. Разработан вариант одновременного иммуноанализа двух антигенов в одном образце с использованием «цветных» мутантных форм обелина в качестве репортерных белков и регистрацией сигналов на разных длинах волн.

2. Разработан метод иммуноанализа двух антигенов в одном образце с использованием двух разных биолюминесцентных репортеров - фотопротеина обелина и целентеразин-зависимой люциферазы Metridia longa с последовательным запуском биолюминесцентных реакций.

3. Показана перспективность использования фотопротеина обелина как репортера в гибридизационном анализе в различных форматах.

Все результаты данной работы получены впервые и могут быть использованы для создания отечественных высокоэффективных и чувствительных биолюминесцентных диагностикумов для определения биологически важных соединений и инфекционных агентов.

Работа выполнена при поддержке грантов: РФФИ 06-04-08076-офи, INTAS № 06-1000014-6163 (2007-2008 гг.) и лаврентьевского конкурса молодежных проектов № 83 (2006-2007 гг.).

Результаты диссертационной работы докладывались на Конференциях молодых ученых КНЦ СО РАН (Красноярск, 2006, 2007), Международных симпозиумах по Биолюминесценции и Хемилюминесценции (Йокогама, Япония, 2004; Сан-Диего, США, 2006; Пекин, Китай, 2008), международной конференции по инструментальным методам анализа (Патры, Греция, 2007), международной конференции молодых ученых по молекулярной биологи и генетике, посвященной 120-му юбилею М.И. Вавилова (Киев, Украина, 2007), международной конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, 2006), международном семинаре молодых ученых «Нуклеиновые кислоты как мишени и инструменты» (Новосибирск, 2006).

По результатам исследования опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах и 2 статьи в сборниках материалов международных конференций.

Условные обозначения:

Obe WT - рекомбинантный обелин дикого типа СЕ - целентеразин

СВР - целентеразин связывающий белок

MLuc -люцифераза морских копепод Metridia longa изоформа 39

Bio-MLuc - биотинилированная люцифераза Metridia longa

Bio-БСА - биотинилированный бычий сывороточный альбумин

Avi - авидин

Stavi - стрептавидин

Bio - биотин

SMCC - сукцинимидный эфир 4-(Ы-малеимидометил-) циклогексановой кислоты

BS3 - бис(сульфосукцинимидил) суберат

Bio~Su - iV-гидроксисукцинимидный эфир биотинамидогексановой кислоты

HIgG - человеческие иммуноглобулины G

RIgG - кроличьи иммуноглобулины G

ФСГ - фолликулостимулирующий гормон

ЛГ - лютеинизирующий гормон аФСГ -а субъединица фолликулостимулирующего гормона

ЗФСГ - р субъединица фолликулостимулирующего гормона

РЛГ - Р субъединица лютеинизирующего гормона

ВГС - вирус гепатита С

ИПТГ - изопропил-Р-В-тиогалактопиранозид

БСА - бычий сывороточный альбумин dNTP - дезоксинуклеозидтрифосфорная кислота dATP - дезоксиаденозинтрифосфорная кислота

Био-11-dUTP - 5-[Ы-(Ы-биотинил-8-аминокапроил)-3-аминоаллил]-2'дезоксиуредин-5'-трифосфат

BCIP - 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат

NBT - нитротетразолиевый синий

NPP - п-нитрофенилфосфат

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ПААГ - полиакриламидный гель

TEMED - тетраметилэтилендиамин

ДСН - додецилсульфат натрия

ПСА - персульфат аммония

ДТТ - дитиотреитол

DMSO - диметилсульфоксид

K-Mes - 2№-морфалинэтансульфоновая кислота - КОН ед. акт. - единицы активности мМЕ/мл - миллимеждународные единицы на миллилитр

LB-среда: 20 г/л пептона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5-7 г/л NaCl, рН 7,4

LB-агар: 1,5% агара в LB-среде

ТЕ буфер-. 20 мМ Трис-HCl рН 7,0, 5 мМ ЭДТА

PBS: 0,1 М NaH2P04, 0,1 М К2НР04, 0,15 М NaCl

SM-буфер: 50 мМ Трис-HCl рН 7,5, 0,1 М NaCl, 10 мМ MgS04,

0,01 % желатина

Кальциевый буфер: 0,1 М СаС12, 0,1 М Трис-HCl рН 8,8

Промывочный буфер №1: 20 мМ Трис-HCl рН 7,5, 100 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2,

20% этанола, 0,5% Tween-20

Промывочный буфер №2: 20 мМ Трис-HCl рН 7,5, 100 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2, 1% БСА, 0,5% Tween-20

Промывочный буфер №3: 50 мМ Трис-HCl рН 7,0, 0,15 М NaCl, 5 мМ ЭДТА, 0,1% Tween 20

TBS буфер: 10 мМ Трис-HCl рН 8,0, 150 мМ NaCl

TTBS буфер: 10 мМ Трис-HCl рН 8,0, 150 мМ NaCl, 0,1% Tween-20 SSC буфер-. 15 мМ цитрат натрия, 1,5 мМ NaCl, рН 7,3

Гибридизационный буфер: 10 мг/мл блокирующего реагента, 0,1 М малеиновой кислоты, 0,15 М NaCl, 5 мМ ЭДТА рН 7,5

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Борисова, Василиса Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. Получены высокоочищенные препараты мутантных форм обелина OL W92F;H22E и OL Y138F, имеющие разные спектральные характеристики биолюминесценции, исследованы их свойства и синтезированы активные коныогаты с иммуноглобулинами.

2. Разработан вариант одновременного биолюминесцентного иммуноанализа, эффективность которого продемонстрирована на примере определения лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов в контрольных и стандартных сыворотках. Чувствительность одновременного биолюминесцентного анализа составила 0,57 мМЕ/мл для ФСГ и 1,1 мМЕ/мл для ЛГ.

3. Получен высокоочищенный препарат рекомбинантной люциферазы Metridia longa и изучены ее основные свойства. Показано, что целентеразин, иммобилизованный в целентеразин-связывающем белке (СВР) Renilla miielleri является более эффективным «субстратом» для люциферазы (предел обнаружения фермента 1 аттомоль), чем целентеразин в растворе (предел обнаружения 10 аттомоль). Люцифераза термостабильна (время полужизни при 37, 42 и 50 °С составляет 60, 30 и 7 мин, соответственно) и устойчива к химическим модификациям.

4. Разработан вариант иммуноанализа двух антигенов с использованием двух разных репортеров - обелина и люциферазы Metridia с последовательным запуском биолюминесценых реакций.

5. Показано, что синтезированные коныогаты обелина со стрептавидином являются высокочувствительными метками для гибридизационного анализа. Во всех исследованных условиях проведения анализа использование обелиновой метки обеспечило предел обнаружения

ДНК-матрицы Ю-11 М, что на порядок выше такового при колориметрическом анализе с применением щелочной фосфатазы в качестве репортера.

6. Разработан способ получения и очистки коньюгатов обелина и его мутантных форм OL W92F;H22E и OL Y138F с олигонуклеотидами. Полученные коныогаты стабильны при хранении в растворе в течение месяца при 8 °С и в замороженном виде. Пределы обнаружения модельной ДНК-мишени составили 0,3х10"12 М и 1,4х10"12 М при анализе с использованием коньюгатов обелина дикого типа, Y138F и W92FH22E, соответственно. Пределы обнаружения продуктов ПЦР ДНК вируса гепатита С составили 0,86x10"12 М и 4,3x10"12 М при анализе с использованием коньюгатов обелина дикого типа, Y138F и W92FH22E, соответственно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная работа посвящена изучению применения Са2+-регулируемого фотопротеина обелина гидроидного полипа Obelia longissima и его производных в качестве репортеров в имунно- и гибридизационном микроанализах.

В результате проведенных исследований показано, что мутантные варианты обелина W92F;H22E и Y138F являются высокочувствительными и стабильными репортерными белками. Были синтезированы устойчивые химические производные мутантных форм обелина с иммуноглобулинами и показано их использование в иммуноанализе. Уникальные спектральные характеристики биолюминесценции этих белков делают возможным проведение одновременного анализа двух антигенов в одном образце, что показано на примере биолюминесцентного иммуноноанализа лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов в смешанных стандартных сыворотках. Разделение сигналов осуществляется с помощью двухканального люминометра, в оптические пути которого вмонтированы широкополосные оптические фильтры. Показано, что даже без специальной оптимизации условий анализа, чувствительность одновременного биолюминесцентного иммуноанализа не уступает раздельному радиоизотопному иммуноанализу.

В представленной работе впервые показана перспективность применения целентеразин-зависимой люциферазы морских копепод Metridia longa MLuc39 как репортера для анализ in vitro. Показано, что биолюминесцентная реакция люциферазы Metridia инициируется не только раствором целентеразина, но и кальций зависимым целентеразинI связывающим белком Renilla muelleri при добавлении Са . Разработан вариант иммуноанализа двух антигенов в одном образце, с использованием в качестве репортерных белков фотопротеина обелина и MLuc39. Регистрация сигналов биолюминесцентных репортеров производится последовательным внесением в лунки планшета растворов Са2+ и целентеразин-связывающего белка Renilla muelleri. Суммарное время для измерения сигналов от обеих мишеней составляет 25 секунд, т.е. для измерения стандартного 96-луночного планшета необходимо 40 минут и при этом будут получены данные о содержании 192 антигенов.

Предлагаемые подходы по проведению анализа двух мишеней в одном образце могут быть особенно полезными в случаях, когда для правильной диагностики важно не только определение содержания каждого антигена в отдельности, но и их соотношения. Одновременное определение двух веществ в одном образце поможет интенсифицировать и удешевить анализ, а также избежать ошибок из-за разнесенных во времени процедур определения.

В ходе проведенных экспериментов показано, что синтезированные коньюгаты обелина со стрептавидином или авидином, а также коньюгаты обелина и его мутантных форм W92F;H22E и Y138F с олигонуклеотидом (сГГ)зо являются высокочувствительными метками для гибридизационного анализа. Широкий линейный диапазон зависимости биолюминесцентного сигнала от количества репортера обеспечивает возможность не только выявлять наличие целевой ДНК-последовательности, но и определять ее количество, пользуясь соответствующими стандартами.

Таким образом, полученные в данной работе результаты позволяют сделать заключение о возможности создания эффективных биолюминесцентных диагностикумов на базе Са2+-регулируемого фотопротеина обелина и его мутантных вариантов, а также рекомбинантной люциферазы Metvidia longa для иммуно- и гибридизационного микроанализа биологически-важных веществ, инфекцонных агентов и т.п.

В заключение выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю к.б.н. JI.A. Франк и моим коллегам — сотрудникам лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН за помощь в постановке и проведении экспериментов, интерес к работе и обсуждение полученных результатов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Борисова, Василиса Валерьевна, Красноярск

1. Балаболкин, М.И. Эндокринология / М.И. Балаболкин - М: Универсум паблишинг, 1998. - 416 с.

2. Виноградова, О.А. Повышение эффективности гибридизационного анализа путем ограниченной фрагментации ДНК-пробы / О.А. Виноградова, И.А. Пышная, В.Ф. Зарытова, Е.М. Иванова, Д.В. Пышный // Молекул, биология 2007. - Т. 41. - № 1. - С. 163-172.

3. Высоцкий, Е.С. Выделение и очистка Са2+-зависимого фотопротеина — обелина из гидроидных полипов Obelia longissima / Е.С. Высоцкий, B.C. Бондарь, В.Н. Летунов // Биохимия 1989. - Т. 54. - С. 965-973.

4. Высоцкий, Е.С. Кальций-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных / Е.С. Высоцкий, С.В. Маркова, Л.А. Франк // Молекул, биология 2006. -Т.40. - № 3. - С. 404-417.

5. Зайцев, Г.Н. Математическая статистика в экспериментальной ботанике. М.: «Наука», 1984. -35с.

6. Франк, Л.А. Бондарь B.C., Тюлькова Н.А., Высоцкий Е.С. Са активируемый фотопротеин обелин и бактериальная люцифераза в иммунологическом микроанализе: Препринт 113 Б. Красноярск, 1992. -22 с.

7. Франк, Л.А. Рекомбинатный фотопротеин обелин гидроидного полипа Obelia longissima: выделение и использование в иммуноферментном анализе. Дисс. канд-та биол. наук: 03.00.02 Красноярск, 1997. - 91 с.

8. Франк, Л.А. Синтез коньюгатов1. Са-регулируемого фотопротеина обелина с иммуноглобулинами и их использование в качестве меток в иммуноанализе / Л.А. Франк, А.И. Петунин, Е.С. Высоцкий // Биоорган, химия 2004. - Т. 30. - № 4. - С. 364-368.

9. Actor, J.K. A flexible bioluminescent-quantitative polymerase chain reaction assay for analysis of competitive PCR amplicons / J.K. Actor, J.R. Limor, R.L. Hunter//J. Clin. Lab. Anal. 1999. V. 13. - No. 1 - P. 40-47.

10. Actor, J.K. Bioluminescent quantitation and detection of gene expression during infectious disease / J.K. Actor // Comb. Chem. High Throughput Screen. 2000. - Vol. 3. - No. 4. - P. 277-288.

11. Adamczyk, M. Dual analyte detection using tandem flash luminescence / M. Adamczyk, J.A. Moore, K. Shreder // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002. -Vol. 12. - P. 395-398.

12. Campbell, A.K. Extraction, partial purification and properties of obelin, the calcium-activated luminescent protein from hydroid Obelia geniculata / A.K. Campbell //Biochem. J. 1974. - V. 143. - P. 4111-4118.

13. Deo, S.K. An immunoassay for Leu-enkephalin based on a C-terminal aequorin-peptide fusion / S.K. Deo, S. Daunert // Anal. Chem. 2001. - Vol. 73.-P. 1903-1908.

14. Deo, S.K. C-terminal and N-terminal fusions of aequorin with small peptides in immunoassay development / S.K. Deo, J.C. Lewis, S. Daunert // Bioconjugate Chem. 2001. - Vol. 12. - P. 378-384.

15. Doleman, L. Bioluminescence DNA hybridization assay for Plasmodium falciparum based on the photoprotein aequorin / L. Doleman, L. Davies, E.A. Moschou, L. Rowe, S. Deo, S. Daunert // Anal. Chem. 2007. - Vol. 79.-No. 11.-P. 4149-53.

16. Elenis, D.S. Quadruple-analyte chemiluminometric hybridization assay. Application to double quantitative competitive polymerase chain reaction / D.S. Elenis, P.C. Ioannou, Т.К. Christopoulos // Anal. Chem. 2007. - Vol. 79.-No. 24.-P. 9433-40.

17. Erikaku, T. Bioluminescent immunoassay using a monomeric Fab"-photoprotein aequorin conjugate / T. Erikaku, S. Zenno, S. Inouye, //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. - Vol. 174. - No. 3. - P. 13311336.

18. Fagan, T.F. Cloning, expression and sequence analysis of cDNA for then i

19. Ca -binding photoprotein, mitrocomin / T.F. Fagan, Y. Ohmiya, J.R. Blinks, S. Inouye, F.I. Tsuji // FEBS Letters. 1993. - Vol. 333. - P. 301305.

20. Fahey, R.C. On the cysteine and cystine content of proteins. Differences between intracellular and extracellular proteins / R.C. Fahey, J.S. Hunt, C.C. Windham //Mol. Evol. 1977. - Vol. 10. - P. 155-163.

21. Frank, L.A. Bioluminescent immunoassay for alphafetoprotein using theл i

22. Ca -activated photoprotein obelin / L.A. Frank, E.C. Vysotski // In: J.W. Hastings, L.J. Kricka, P.E. Stanley eds. Bioluminescence & Chemiluminescence: Molecular Reporting with Photons. Chichester: John Wiley. 1997.-P. 435-438.

23. Frank, L.A. Bioluminescent immunoassay of thyrotropin and thyroxin using the obelin as a label / L.A. Frank, A.I. Petunin, E.C. Vysotski // Anal. Biochem. 2004. - Vol. 325. - P. 240-246.

24. Frank, L.A. Use of proZZ-obelin protein in bioluminescent immunoassay / L.A. Frank, V.A. Illarionova, E.S. Vysotski / Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. - Vol. 219. - P. 475-479.

25. Galvan, В., Bioluminescence hybridization assays using recombinant aequorin. Application to the detection of prostate-specific antigen mRNA / B. Galvan, Т.К. Christopoulos // Anal. Chem. 1996. - Vol. 68. - P. 35453550.

26. Glynou, K. Affinity capture-facilitated preparation of aequorin-oligonucleotide conjugates for rapid hybridization assay / K. Glynou, P.C. Ioannou, Т.К. Christopoulos // Bioconjugate Chem. 2003. - Vol. 14. - P. 1024-1029.

27. Green, N.M. Spectophotometric determination of avidin and biotin / N.M. Green // Methods Enzimol. 1970. - V.15A. -P.418-424.

28. Guenthner, P.C. Quantitative, competitive PCR assay for HIV-1 using a microplate-based detection system / P.C. Guenthner, C.E. Hart // Biotechniques 1998.-Vol. 24.-No. 5.-P. 810-816.

29. Hastings, J.W. Total quantum flux of isotopic sources / J.W. Hastings, G. Weber // J. Opt. Soc. Am. 1963. -V. 53. - P. 1410-1415.

30. Hauber, R. New, sensitive, radioactive-free bioluminescence-enhanced detection system in protein blotting and nucleic acid hybridization / R. Hauber, W. Miska, L. Schleinkofer, R. Geiger // Biolum. Chemilum. 1989. -Vol. 4.-P. 367-372.

31. Hori, K. Structure of native Renilla reinformis luciferin / K. Hori, H. Charbonneau, R.C. Hart, M.J. Cormier //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. -Vol. 74.-P. 4285-4287.

32. Inouye, S. Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca -activated photoprotein, clytin / S. Inouye, F.I. Tsuji // FEBS Letters. 1993. - Vol. 315.-P. 343-346.

33. Inouye, S. Cloning and sequence analysis of cDNA for the luminescenct protein aequorin / S. Inouye, M. Noguchi, Y. Sakaki, Y. Takagi, T. Miyata, S. Iwanaga, F.I. Tsuji // Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1985. - Vol. 82. - P. 3154-3158.

34. Jablonski, E. The preparation of bacterial luciferase conjugates for immunoassay and application to rubella antibody detection / E. Jablonski // Anal. Biochem. 1985.-Vol. 148.-P. 199-206.

35. Jackson, R.J. Lumonometry: a novel bioluminescent immunoassay enhances the quantitation of mucosal and systematic antibody responses / R.J. Jackson, K. Fujihashi, H. Kiyono, J.R. McGhee // J. Immunol. Methods -1996.-Vol. 190.-P. 189-197.

36. Konstantou, J. Genotyping of single nucleotide polymorphisms by primer extension reaction and dual-analyte bio/chemiluminometric assay / J. Konstantou, P.C. Ioannou, Т.К. Christopoulos // Anal. Bioanal. Chem. -2007.-Vol. 388. -P.1747-1754.

37. Kricka, L. Clinical and biochemical applications of luciferases and luciferins /L.Kricka//Anal. Biochem.-1988. Vol. 175.-P. 14-21.

38. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. - Vol. 227. -P. 680-685.

39. Laios, E. Enzyme-amplified aequorin-based bioluminometric hybridization assays / E. Laios, P.C. Ioannou, Т.К. Christopoulos // Anal.Chem. 2001. -Vol. 73.-P. 689-692.

40. Laios, E. Novel hybridization assay configurations based on in vitro expression of DNA reporter molecules / E. Laios, P.C. Ioannou, Т.К. Christopoulos//Clin. Biochem. 1998.-Vol. 31.-No. 3.-P. 151-158.

41. Law, G.H.E. Mutagenesis of solvent-exposed amino acids in Photinus pyralis luciferase improves thermostability and pH-tolerance / G.H.E. Law, O.A. Gandelman, L.C Tisi, C.R. Lowe, J.A.H. Murray // Biochem.J. 2006. -Vol. 397.-P. 305-312.

42. Lewis, J.C. Bioluminescence and secondary structure properties of aequorin mutants produced for site-specific conjugation and immobilization / J.C. Lewis, J.J. Lopez-Moya, S. Daunert // Bioconjugate Chem. 2000. - Vol. 11.-P. 65-70.

43. Loening, A.M. Consensus guided mutagenesis of Renilla luciferase yields enhanced stability and light output / A.M. Loening, T.D. Fenn, A.M. Wul, S.S. Gambhir // Protein Eng. Des. Sel. 2006. - Vol. 19. - P. 391-400.

44. Lomzov, A.A. Influence of Na2+ and Mg2+ ions on terminal stability of oligonucleotide duplexes / A.A. Lomzov, D.V. Pyshnyi // J. Biomol. Struct. Dyn. 2007. - V. 24. - No. 6. - P. 679-680.

45. Manukhov, V. Folding and refolding of thermolabile and thermostable bacterial luciferases: the role of DnaKJ heat-shock proteins / V. Manukhov, G.E. Eroshnikov, M.Yu. Vyssokikh, G.B. Zavilgelsky // FEBS Letters. -1999. Vol. 448. - P. 265-268.

46. Matveev, S.V. Genetically engineered obelin as a bioluminescent label in an assay for a peptide / S.V. Matveev, J.C. Lewis, S. Daunert // Anal. Biochem. 1999. - No. 270. - P. 69-74.

47. Mirasoli, M. Bioluminescence immunoassay for Cortisol using recombinant aequorin as a label / M. Mirasoli, S.K. Deo, J.C. Lewis, A. Roda, S. Daunert // Anal. Biochem. 2002. - No. 306. - P. 204-211.

48. Мопп, J.G. Coelenterate bioluminescence / J.G. Morin // Coelenterate biology. Reviews and New Perspectives — N.Y.: Acad. Press. — 1974. -P.397-438.

49. Prasher, D. Cloning and expression of cDNA coding for aequorin, a bioluminescent calcium-binding protein / D. Prasher, R.O. McCann, M.J. Cormier // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985. - Vol. 126. - P. 12591268.

50. Reading, N.S. Engineering a disulfide bond in recombinant manganese peroxidase results in increased thermostability / N.S. Reading, S.D. Aust // Biotechnol. Prog. 2000. - Vol. 16. - P. 326-333.

51. Shatz, P.J. Use of peptide libraries to map the substrate specifity of peptide modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide biotinylation in Escherichia coli / P.J. Shatz // Biotechnology 1993. - Vol. 11. - P. 11381143.

52. Shimomura, О. Extraction and properties of halistaurin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Halistaura / O. Shimomura, F.H. Johnson, Y.Saiga // J. Cell. Сотр. Physiol. 1963. -V. 62. - P. 9-15.

53. Shimomura, O. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea / O. Shimomura, F.H. Johnson, Y.Saiga // J. Cell. Сотр. Physiol. 1962. - V. 59.-P. 223-239.

54. Siddiqi, A.M. Evaluation of electrochemiluminescence- and bioluminesce-based assays for quantitating specific DNA / A.M. Siddiqi, V.M. Jennings, M.R. Kidd, J.K. Actor, R.L. Hunter // J. Clin. Lab. Anal. 1996. - Vol. 10. -P. 423.

55. Smith, D.F. Recombinant aequorin, a bioluminescent signal for molecular diagnostics / D.F. Smith, N.L. Stults, M.J. Cormier, J.K. Actor // J. Clin. Ligand Assay 1999. - Vol. 22. - P. 158-172.

56. Song, X. Quantitation of Chlamidia trachomatis 16S rRNA using NASBA amplification and a bioluminescent microtiter plate assay / X. Song, B.K. Coombes, J.B. Mahony // Comb. Chem. High Throughput Screen. 2000. -Vol.3.-P. 303-313.

57. Stults, N.L. Use of recombinant biotinylated aequorin in microtiter and membrane-based assays: purification of recombinant apoaequorin from

58. Escherichia coli / N.L. Stults, N.F. Stocks, H. Rivera, J. Cray, R.O. McCann, D. O'Kane, R.D. Cummings, M.J. Cormier, F. Smith // Biochemistry 1992.-Vol. 31.-P. 1433-1442.

59. Tannous, B.A. Combined flash- and glow-type chemiluminescent reactions for high-throughput genotyping of biallelic polymorphisms / B.A. Tannous, M. Verhaegen, Т.К. Christopoulos, A. Kourakli // Anal. Biochem. 2003. -Vol. 320. -P.266-272.

60. Tatsumi, H. Construction of biotinylated firefly luciferases using biotin acceptor peptides / H. Tatsumi, S. Fukuda, M. Kikuchi, Y. Koyama // Anal. Biochem. 1996. -V. 243. - P. 176-180.

61. Tsuzuki, K. Thermostable mutants of the photoprotein aequorin obtained by in vitro evolution / K. Tsuzuki, L. Tricoire, O. Courjean, N. Gibelin, J. Rossier, B. Lamboler // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280. - P. 34324-34331.

62. Verhaegen, M. Bacterial expression of in v/vo-biotinylated aequorin for direct application to bioluminometric hybridization assays / M. Verhaegen, Т.К. Christopoulos // Anal. Biochem. 2002. - V. 306. - P. 314-322.

63. Ward, W.W. Extraction and purification of calcium-activated photoproteins from the ctenophores Mnemiopsis sp. and Beroe ovata / W.W. Ward, H.H. Seliger//Biochemistry-1974.-V. 13.-P. 1491-1499.

64. White, S.R. Signal amplification system for DNA hybridization assays based on in vitro expression of a DNA label encoding apoaequorin / S.R. White, Т.К. Christopoulos // Nucleic Acids Research 1999. - Vol. 27. - No. 19. -e25.

65. Wilchek, M. Avidin-biotin technology ten years on: has it lived up to its expectations / M. Wilchek, E.A. Bayer // Trends Biochem. Sci. 1989. -Vol. 14. - No. 10. - P. 408-412.

66. Xiao, L. Quantitation of RT-PCR amplified cytokine mRNA by aequorin-based bioluminescence immunoassay / L. Xiao, Y. Chumfu, C.O. Nelson // J. Immunol. Methods 1996. - Vol. 199. - P. 139-147.