Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование структурно-функциональной организации Са2+ - активируемого фотопротеина обелина из гидроидного полипа Obelia longissima методами генной инженерии

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование структурно-функциональной организации Са2+ - активируемого фотопротеина обелина из гидроидного полипа Obelia longissima методами генной инженерии"

'•а

ь ^ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ

На правах рукописи

Илларионова Виктория Альбертовна

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ СА2+-АКТИВИРУЕМОГО ФОТОПРОТЕИНА ОБЕЛИНА ИЗ ГИДРОИДНОГО ПОЛИПА ОЬеПа longissima МЕТОДАМИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск -1997

Работа выполнена в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН (Красноярск)

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Е.С. Высоцкий (Институт биофизики СО РАН)

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Т.Г. Волоаа (Институт биофизики СО РАН)

кандидат биологических наук Н.М.Титова (Красноярский Государственный университет)

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор"

Защита состоится " 1997 г. в часов на

заседании Специализированного Совета Д 003.45.01 по защитам диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биофизики СО РАН (660036 г. Красно-: ярск, Академгородок), С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН.

1997 г.

А.П.Шевырногов

Автореферат разослан

н /9 -

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор технических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Са2+-акгавируемые фотопротеины обнаружены в более чем 25 видах биолюминесцесцирующих морских кишечнополостных организмов. Они представляют собой устойчивый комплекс из трех компонентов: апобелка, полициклического хромофора (целентеразина) и молекулярного кислорода. При связывании Са2+ ЕР-подобнымн Са2+-связывающими сайтами фотопротеина запускается реакция окислительного декарбоксилированйя целентеразина, в ходе которой генерируется свет в видимой области спектра. Изучение фотопротеинов актуально по нескольким причинам. Во-первых, механизм фотопротеиновой реакции остается еще во многом неясным. Исследования в этой области расширят представления о принципах и возможностях ферментативного катализа. Во-вторых, пока неизвестно каким образом связывание Са2+ и индуцированный этим конформационный переход в структуре Са2<-связывающих сайтов регулирует активность Са2+-активируемых белков. Исследование механизма конформационных изменений в структуре фотопротеинов, вызванных конформационными переходами в Са2+-связывающих сайтах, внесет вклад в установление общих принципов структурно-функциональных отношений в Са2+-активируемых белках. В третьих, поскольку фотопротеины находят широкое применение в качестве индикаторов внутриклеточного Са2+ и люминесцентных меток в иммуноанализе, знание первичной структуры кДНК, кодирующей фотопротеин, и его люминесцентных свойств совершенно необходимо для его практического использования.

ЦЕЛЬЮ диссертационной работы явилось исследование первичной структуры фотопротеина обелина из гидроидного полипа ОЬеНа longissima, его люминесцентных свойств, а также влияния аминокислотных замен в Са2+-связывающих сайтах обелина на его люминесцентную функцию.

Были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Определить нуклеотидную последовательность кДНК апообелина из гидроидного полипа ОЬеНа longissima. Определить полную аминокислотную последовательность белка, восстановленную по нуклеотидной последовательности кДНК апообелина. Локализовать Са2+-связывающие сайты в первичной структуре апообелина.

2. Разработать метод эффективной экспрессии гена апообелина в Е.соИ.

3. Изучить биолюминесцентные свойства выделенного из Е.соИ и заряженного синтетическим целентеразином обелина и оценить возможность

его использования в качестве биологического индикатора внутриклеточного Са2+.

4. Получить с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза мутантные варианты апообелина с заменами высококонсервативных аминокислот в Са2+-связывающих сайтах. Изучить влияние этих замен на люминесцентную функцию мутантных вариантов обелина и выявить функционально-важные позиции в структуре Са2+-связывающих сайтов.

На защиту выносятся следующие ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ.

Нуклеотидная последовательность кДНК апообелина - апофотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima состоит из 585 нуклеотидов. Полная аминокислотная последовательность апообелина, восстановленная по нуклеотидной последовательности кДНК, состоит из 195 аминокислотных остатков и содержит три участка, формирующие Саг+-связывагощие сайты.

кДНК апообелина эффективно экспрессируется в рекомбинантном штамме E.coli с использованием Т7 РНК-полимеразы. Содержание синтезированного в E.coli апобелка составляет 5 мг на 1 грамм сырой клеточной биомассы.

Заряженный синтетическим целентеразином обелин обладает самой быстрой кинетикой люминесценции среди изученных на сегодня фотопротеинов. Ионы магния в физиологических концентрациях не снижают его чувствительность к Са2+. Эти свойства определяют преимущество обелина как биологического индикатора внутриклеточного Са2+ по сравнению с другими фотопротеинами.

6 мутантов обелина с аминокислотными заменами по высококонсервативным 6-й и 11,12-й позициям трех Са2+-связывающих сайтов сохраняют способность к люминесценции. Замена глицина на аргинин в 6-й позиции незначительно влияет на люминесцентные свойства белка, замена в 11,12-й позициях аспарагмновой и глутаминовой кислот на аланин и глицин, соответственно, приводит к существенным изменениям кинетических параметров люминесценции и диапазона чувствительности к Са2+.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Впервые определена нуклеотидная последовательность кДНК апообелина - апофотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima и восстановлена полная аминокислотная последовательность этого белка. На основе данных о первичной структуре апообелина возможно выявление наиболее консервативных аминокислотных остатков и исследование их функции, изучение структуры активного центра белка с помощью

направленных аминокислотных замен, изучение третичной структуры апообелина методами пространственного моделирования.

Впервые достигнута эффективная продукция апообелина в E.coli, исследованы его люминесцентные свойства после реактивации синтетическим целентеразином.

Впервые генерированы направленные аминокислотные замены в Са2+-связывающих сайтах обелина и изучено их влияние на люминесцентные свойства фотопротеина. Эти данные представляют большой интерес для дальнейшего изучения структурно-функциональной организации Са2+-связывающих сайтов всех Са2+-активируемых белков, входящих в EF-семейство.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Определение параметров люминесценции синтезированного в E.coli и заряженного синтетическим целентеразином обелина показало перспективность его использования для мониторинга Внутриклеточного кальция. Особенно полезным обелин может оказаться при исследовании процессов, которые регулируются быстрыми изменениями концентраций Са2+, поскольку среди изученных на сегодня фотопротеинов он обладает самой быстрой кинетикой люминесценции.

На основе данных о первичной структуре апообелина возможно создание методами генной инженерии или химической модификации новых иммунологических зондов, содержащих обелин в качестве биолюминесцентной метки. Определение нуклеотидной последовательности кДНК апообелина позволяет использовать ее также при создании систем мониторинга транскрипции и трансляции in vivo и in vitro.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Результаты проведенного исследования представлялись на VII-m Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции, Банфф, Канада 1993; Международном симпозиуме по биолюминесценции, Каанапапи-бич, Гаваи, США, 1993; VIII-м' Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции, Кембридж, Англия, 1994; IX-м Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции, Вудс Хоул, США, 1996.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 131 странице машинописного текста, содержит 23 рисунка и 8 таблиц.

Список литературы включает 133 источника, из них - 130 на английском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во ВВЕДЕНИИ дано обоснование темы диссертации, ее научная новизна, сформулированы цель и задачи исследования.

ГЛАВА 1. Са2+-АКТИВИРУЕМЫЕ ФОТОПРОТЕИНЫ МОРСКИХ КИШЕЧНОПОЛОСТНЫХ ОРГАНИЗМОВ: ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Ca21" -активируемые фотопротеины содержат в себе все необходимые компоненты для люминесцентной реакции. Этими компонентами кроме апобелка - единой полипептидной цепи с молекулярной массой около 22 кДа - являются замещенное производное имидазолпиразинона - целентеразин и молекулярный кислород. Два последних прочно связаны с белком и при физиологичеких условиях не диссоциируют. Люминесцентная реакция запускается после связывания ионов кальция Са2+-связывающими сайтами фотопротеина, организованными по типу EF-структур и имеет один цикл. Продуктами реакции являются голубой флуоресцентный белок - апобелок, содержащий целентерамид, СОг и квант света. Квантовый выход реакции in vitro составляет, как правило, 0,15. Са2+-связывающие сайты представляют собой непрерывные участки полипептидной цепи длиною 29 аминокислотных остатков, конкретная последовательность которых в конечном счете определяет сродство белка к Са2+.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы:

а) методы генетической инженерии - выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток, ее рестрикционный анализ, определение нуклеотидной последовательности ДНК, введение олигонуклеотид-направленных замен в структуру плазмид;

б) микробиологичекие методы - культивирование клеток E.coli для выделения плазмидной и фаговой ДНК;

в) биохимические методы - выделение апообелина и его мутантных вариантов из клеток E.coli, зарядка синтетическим целентеразином, определение кинетических параметров люминесцентной реакции обелина и его мутантных вариантов с помощью установки для быстрого смешивания, определение зависимости интенсивности люминесценции обелина и его мутантных вариантов от концентрации Са2+.

ГЛАВА 3. НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ кДНК

АПООБЕЛИНА ИЗ ГИДРОИДНОГО ПОЛИПА Obelia longissima, ОТРАБОТКА ЭКСПРЕССИИ ГЕНА АПООБЕЛИНА В E.coli.

■ Нуклеотидная последовательность клонированной ранее кДНК апообелина (Рис.1) была определена методом химического гидролиза по Максаму и Гилберту. Анализ нуклеотидной последовательности выявил две длинные открытые рамки считывания - OPCI и OPCII, ориентированные в одном направлении и смещенные относительно друг друга на один нуклеотид. OPCI состояла из 195 кодонов и кодировала апообелин, в структуре которого были обнаружены три Са2+-связывающих сайта. Аминокислотная последовательность апообелина обладала высоким уровнем гомологии с аминокислотными последовательностями изученных ранее апофотопротеинов - апоакворина (66%), апоклитина (76%) и апомитрокомина (64%).

Экспрессия гена апообелина в E.coli была проведена с использованием Т7 РНК-полимеразы. Для этого была сконструирована плазмида pTZOlO, представленная на Рис.2. Ген апообелина был поставлен под контроль промотора фага Т7. Методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза в структуру кДНК был введен сайт рестрикции BgUI, в ОРСП были введены два стоп-кодона для того, чтобы экспрессировался только ген апообелина. Синтетический сайт связывания рибосомы был генерирован С.В.Марковой. Плазмида pTZOlO была введена в клетки E.coli С600 вместе со вспомогательной плазмидой pGPl-2, которая несла ген Т7 РНК-полимеразы под контролем термоиндуцибельного промотора фага лямбда. Клетки полученного рекомбинантного штамма, содержавшего обе плазмиды, культивировали при 30°С в жидкой среде LB до оптической плотности (OD590) равной 1,0-1;5. Затем температуру культивирования быстро увеличивали до 42°С на 20 минут, что запускало синтез Т7 РНК-полимеразы и транскрипцию гена апообелина. Дальнейшее культивирование проводили при 37°С. Максимальное содержание апообелина в клетках наблюдалось через 3 часа после термоиндукции и составляло 5 мг на 1 грамм сырой клеточной пасты. Апообелин накапливался в клетках E.coli в виде нерастворимых агрегатов - так называемых тел включения. После разрушения клеток простое центрифугирование позволяло отделить плотные тела включения от растворимых компонентов цитоплазмы, что в значительной степени облегчало очистку апобелка.

acgarcgaaccaaacaactcagctcacagctactgaacaactcttgttgtgtacaatcaa 60

opci-

aatgtcttcaam.tacgcagttaaactcaagactgactttsataatccacgatggatcaa 120

->m sskyavkl ktdfdnprwik 20

aagacacaagcacatgtttgatttcgïcgacatcaatûgaaatggaaaaatcaccctcga 180

rhkhmfdfl d ihgngkiti.d 40

opcii->m emb'ksps 8

tgaaatxgtgrccaaggcatctgatgacatatgrgccaagctcgaagccacaccagaaca 240

_e ivskasddicakleatpeq 60

mklcprhbmtyvpsskphqh 28

aacaaaacgccatcaagtxtgtgttgaagctttctttagaggatgtggaatggaatatgg 300

tkrhqvcveaffrgcgmeyg 80

kqnaikfvlklsledvewnm 48

taaagaaattgccttcccaclaattcctcgatggatggaaacaattggcgacttcagaact 3 60

ke iafpqfi.dgwkqlatsei. 100

VKKLPSHNaSMDGNNMRLQN 68

caagaaatgggcaagaaacgaacctactctcattcgtgaatggggagatgctgtctttga 420

к к warm e p t l i rewgdavfd 120

srhgqe tnllsfvhgemlsx, 8s

tattttcgacaaagatggaagtggtacaatcactttggacgaatggaaagcttatggaaa 480

x f pkdg8gtitlde и к a y g к 140

ifstkmevvoslwtngklme 108

aatctctggtatctctccatcacaagaagattgtgaagcgacatttcgacattgcgattt 540

i3gispsqedceatfrhc d_l 160

kslvsbhhkkivkrhfdiai 128

ggacaacagtggtgaccttgatgttgacgagatgacaagacaacatcttggattctggta 600

dm3spldvde mtrqhlgfwy 180

wttvvï lmltr *** 139

cactttggacccagaagctgatggtctctatggcaacggagttccctaagctttttttcg 660

tldpeadglygh. g v p *** 195

AA 662

Рис.1. Нуклеотидная последовательность кДНК апообелина и аминокислотные последовательности, кодируемые OPCI и ОРСИ. Звездочками обозначены стоп-кодоны; аминокислоты, формирующие EF-петли Са2+-связывающих сайтов, подчеркнугы.

Рис.2. pTZOlO - плазмида, сконструированная для экспрессии гена апообелина. Обозначения: orí - район начала репликации плазмиды; Ар - ген (i-лактамазы; ароОЫ - ген апообелина; РТ7 -промотор фага Т7; Plac - промотор лактозного оперона E.colr, ССР - синтетический сайт связывания рибосомы, т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов; Xbal, Clal, PstI - сайты рестрикции. .

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ОБЕЛИНА КАК ИНДИКАТОРА ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО КАЛЬЦИЯ

После выделения из рекомбинантного штамма Exoii, очистки и зарядки синтетическим целентеразином, были изучены люминесцентные свойства полученного рекомбинантного обелина: кинетика люминесцентного ответа, диапазон чувствительности к Са2+, а так же влияние Mg24 на эти параметры. Исследования проводили при физиологических значениях рН, ионной силы (рН 7,0, 150 мМ КС1) и при температуре 20°С. Поскольку ранее для фотопротеинов акворина юАедиогеа victoria и обелина из Obelia geniculate было показано, что Mg^ в концентрациях, характерных для цитозоля (0,3-1,0 мМ), оказывает существенное влияние на их люминесценцию, исследование влияния Mg*+ на параметры люминесценции рекомбинантного обелина проводили при

концентрации 1 мМ и 10 мМ для того, чтобы гарантированно выявить его эффект.

Исследование . кинетики люминесцентного ответа оекомбинантного обелина проводили методом "остановленной струи" (Диксон и Уэбб, 1982). На Рнс.ЗА,Б представлены люминесцентные ответы рекомбинатного обелина при быстром, увеличении Са2+ в смеси до насыщающей концентрации в присутствии 10 мМ и без него. в концентрации 1мМ не влиял на кинетику люминесценцентного ответа обелина (данные не приведены).

Изучение фазы подъема люминесценции проводили, начиная с момента остановки потока (Рис.ЗА, нулевой момент времени). Она достаточно хорошо описывалась уравнением реакции первого порядка. Константа скорости подъема люминесценции для рекомбинантного обелина составила 379 сек"1, время полуподъема - 1,7 мсек. Параметры люминесценции рекомбинантного обелина приведены в таблице 1, для сравнения в ней также приведены данные для других исследованных ранее фотопротеинов. Добавление ионов Мц?* не оказывало существенного влияния на стадию подъема люминесценции обелина (Рис.ЗА). Константа скорости подъема люминесценции в присутствии 10 мМ составила 331 сек"1, время полуподъема - 2,1 мсек.

1.0

0.8

I 0.6

5 04 0.2

0.0 -0.01

0.00 . 0.01 Время, сек

0.02

0.4 0.8 1.2 Время, сек

1.6

Рис.3. Люминесценция рекомбинантного обелина в присутствии 10 мМ —) и без него (—) при насыщающей концентрации Са2+. А - фаза подъема; Б - фаза спада. Ь - интенсивность люминесценции, Ьщах - максимальная интенсивность люминесценции.

Таблица 1. Люминесцентные свойства рекомбинантного обелнна, акворина и обелина из гидроидного полипа Ь.^ШсиШа

Параметр РекомбиншгшыЙ обелии Акворин1 Обелин из О.^ея/са/а/о2

Константа скорости подъёма люминесценции (сек'1) 379 100 250-280

Константа скорости спада люминесценции (сек1) 8,3 1,2 не определялась

Диапазон чувствительности к Са2+ в отсутствие иных двухвалентных катионов (М) 10'7-4 - Ю"4,0 10'7'°-10^Ь Ю"6-5 - Ю'3,5

'Hastings et al. (1969), Blinks et al. (1978). 2Stephenson and Sutherland (1981).

Стадию спада люминесценции (Рис.ЗБ) с некоторым приближением можно описать уравнением реакции первого порядка. Константа скорости спада люминесценции рекомбинантного обелина, рассчитанная на основе аппроксимации экспоненциальной функцией, равнялась 8,3 сек"1. Добавление ионов магния снижало константу скорости спада до 3,8 сек'1, при этом удельная активность обелина не менялась. По всей видимости, этот эффект может быть объяснен конкурентным связыванием с ЕР-

структурами обелина.

Зависимость люминесценции рекомбинантного обелина от концентрации С а2* представлена на Рис.4 как функция логарифма нормированной люминесценции - 1од(1УЬтах) от логарифма концентрации Са2+ - 1с^[Са2+] в присутствии 10 мМ Мд2+ и без него, где Ь - максимальная интенсивность люминесценции при заданной концентрации Са2+, -максимальная . интенсивность люминесценции при насыщающей концентрации Са2+. Эта зависимость имет три хорошо выраженные фазы:

1) фаза Са2+-независимой люминесценции ([Са2+] < 10*7,4 М),

2) фаза роста люминесценции (Ю-7'4 М 2 [Са2+] £ 10чоМ),

3) фаза насыщения люминесценции ([Са2+]> Ю^М).

1. Фаза Са2+-независимой люминесценции обелина.

Са2+-независимая люминесценция обелина определяется его способностью к спонтанной разрядке при низких концентрациях Са2+ Ее интенсивность (Ь,„ш) не зависит от концентрации Са2+.

2. Фаза роста интенсивности люминесценции, Из представленной на Рис,4 сигмоидной зависимости видно, что рекомбинантный обелин чувствителен к изменению концентрации Са2+ в диапазоне от 10"7,4 М до JO"4,0 М, Известна, что концентрация внутриклеточного кальция в цитоплазме покоящейся клетки составляет 10'7S М, а при возбуждении достигает величин ]0*-10"5 М (Campbell, 1983). Таким образом, диапазон чувствительности к Са2+ рекомбилашного обелина, как и других изученных на сегодня фотопратекнов, позволяет использовать его

logtCa"14"]

Рис.4. Зависимость интенсивности люминесценции рекомбинантного обелина от концентрации Са2+ в присутствии 10 мМ магния (Д) и без него (о). Заполненные символы - концентрация кальция' задала с помощью Ca-EGTA буфера. Открытые символы - концентрация кальция задана с помощью разведения раствора СаСЬ. L -максимальная интенсивность люминесценции при заданной концентрации Са2+, Цщк - максимальная интенсивность люминесценции при насыщающей концентрации Са2+. Теоретические кривые построены с использованием модели Аплена, Блинкса и Прендергаста (Allen et а)., 1977).

дпя тестирования концентраций внутриклеточного Са2\

Как видно из Рис,4 при добавлении до концентрации 10 мМ диапазон чувствительности к Са2+ рекомбинантного обелина сместился и составил Ю"70 - 10"3,5 М. Mg2* в концентрации 1мМ не повлиял на чувствительность обелина к Са2+ (данные не приведены). Ранее для акворина и обелина из O.geniculala было показано, что Mg2+ уже в концентрации 1 мМ существенно снижал чувствительность к Са2+.

3. Фаза насыщения люминесценции.

Область насыщения на сигмоидной кривой соответствует концентрациям Са2+, при которых интенсивность люминесценции фотопротеина (L) достигает максимума (Lmax).

Полученные данные позволяют сделать заключение о перспективности использования рекомбинантного обелина как индикатора внутриклеточного кальция. При этом следует подчеркнуть, что он обладает важными преимуществами по сравнению с акнорином из медузы A-victoria и обелином из O.geniculala; самой быстрой кинетикой люминесценции и отсутствием влияния Mg24 в концентрации 1 мМ на диапазон чувствительности к Са2+.

ГЛАВА 5. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАНТНЫХ ВАРИАНТОВ ОБЕЛИНА

Введение направленных аминокислотных замен в Са2*-связывающие сайты апообелина. Для большинства известных Са2+ ■модулируемых белков показана высокая консервативность ряда аминокислот Са2+-связывшощих сайтов, в том числе гянцина в б-й позиции (Glyó) и глутамнновой кислоты в 12-й позиции (Glul2). При этом функция Gly6 до сих пор остается неясной. Боковая карбоксильная группа Glul2 является бидентатным лигандом, участвующим в связывании Са2+. Эти аминокислоты в каждом из трех Са3+-связывающих сайтов апообелина были заменены с помощью олигонуклеотид-направлениого мутагенеза. Глицин в 6-й позиции был заменен на аргинин (Gly6->Arg, глициновые мутанты), глутаминовая кислота в 12-й позиции - на глицин (Glnl2->Gly, глутаминовые мутанты). Исходя из структуры Са2+ -связывающих сайтов апообелина, нельзя исключить, что остаток аспарагиновой кислоты в 11-й позиции может координировать ион Са2+ своей боковой карбоксильной группой, компенсируя отсутствие остатка глутамиковой кислоты в случае замены Glul2-»Gly. Чтобы избежать этого, одновременно с заменой Glul2—>Gly, аспарагиновую кислоту а 11-й позиции каждого сайта меняли на аланин (AspU-»Ala),

Таблица 2. Мугантные варианты апообелина.

Мутант Са2+-связывающий сайт Аминокислотная замена Олигонуклеотиды, использованные для мутагенеза1 (5' - 3')

Сайт 1 DXNGHGKITLDE

G1 И R G35-»R GGGTGAiTTTTCgATTT

DE1 U И A G D40-+A E41-»G ACAATTcCAgCGAGG

Сайт 2 DKDGSGTITLDB

G2 U R G128->R AGTGATTGTACgACTTC

DE2 и U А О D133->A E134-»G TTCCATcCGgCCAAA

СайтЗ DLDNSODLDVDE

G3 ii R G164->R AAGGTCACgACTGTrG

DE3 U к A G D169-»A E170-»G TCATCcCGgCAACATC

олигонуклеотиды комплементарны последовательности алообелиновой кДНК, приведенной на Рис.1, строчными буквами обозначены нуклеотиды, генерирующие соответствующие замены в нукдеотидной последовательности гена апообелина.

Для получения в исходном рекомбинантном обелине (белок дикого типа) направленных аминокислотных замен были сконструированы олигонуклеотиды. Полученные б мутантов апообелина: три глициновых мутанта (Gl, G2, G3) и три глутаминовых мутанта (DEI, DE2, DE3), а также олигонуклеотиды, использованные для мутагенеза, представлены в таблице 2. Наличие ожидаемых нуклеотидных замен в мутантах было подтверждено сиквенсом соответствующих мутантных клонов алообелиновой кДНК.

Ни одна из аминокислотных замен в обелине не привела к полной потере люминесцентной активности (см. таблицу 3). Для всех полученных мутантов обелина была исследована кинетика люминесцентного ответа, а также определена зависимость люминесцентной активности от концентрации Са2+.

0.5 - 0.4

I

§ 0.3

Ts 0 2

J 0.1

0.0

0 5 10 15 20 25 30 Время, сек DE1

0.00

25 50 75 100 125 150 Время, сек

DE2

м и и

-)

10.0 7.5 5.0 2.5 0.0

1

-Н

10 15 20 25 30 Время, сек

DE3

0.0 0.4 0.8 1.2 Время, сек

Обелин дикого типа

1.6

5

Рис.5. Люминесценция глутаминовых мутантов и обелина дикого типа при насыщающей концентрации Са2+. L - интенсивность люминесценции, Int - суммарный световой выход.

Кинетику люминесцентного ответа мутантов обелина исследовали. методом "остановленной струи" при насыщающей концентрации Са2+. На Рис.5 представлены люминесцентные ответы только глутамшговых мутантов, поскольку глициновые мутанты практически не отличались от белка дикого типа. В таблице 3 приведены значения параметров люминесценции для всех мутантов.

Стадия подъёма люминесценции для всех мутантов, так же как и для белка дикого типа, хорошо списывалась экспоненциальной функцией. Если константа скорости подъема для глициновых мутантов и мутанта DE1 практически совпала с константой скорости подъема люминесценции для обелина дикого типа, то для DE2 и DE3 мутантов эта величина составила 0,45 и 0,61 величины для обелина дикого типа.

Стадия спада люминесценции хорошо описывалась экспоненциальной функцией только для глициновых мутантов. Кинетика спада люминесценции глутаминовых мутантов сильно отличалась от кинетики спада люминесценции белка дикого типа (см. Рис.5), ее было невозможно описать, одной экспонентой. Для того, чтобы сравнить мутанты по максимальной скорости утилизации, был введен показатель Lm^/lnt, где Ьщах -максимачьная интенсивность люминесценции. Int - суммарный световой выход - величина, полученная в результате численного интегрирования люминесцентного сигнала по времени. Для обелина дикого типа, стадия спада люминесценции которого хорошо описывалась одной экспонентой,

Таблица 3. Свойства мутантных вариантов обелина.

Фотопротеин Суммарный световой выход в % к обелину дикого типа Константа подъема люминесценции Lm„/Int, сек1 Lm„/Int в % к обелину дикого типа

Обелин дикого типа 100 379 8,53 100

Gl 79- 342 8,40 98

G2 78 349 5,20 61

G3 33 378 7,17 84

DEI 36 362 0,45 5,3

DE2 44 172 0,06 0,7

DE3 15 231 0,23 2,7

показатель ЬщщЛт совпадал с константой скорости спада люминесценции.

Если для глициновых мутантов значение Ьп^ДгИ несущественно отличалось от белка дикого типа, то для глутаминовых мутантов значение ЦпахЛш было значительно снижено (см. таблицу 3) и составляло 0,7-5,3% величины Ьтзх/Ы белка дикого типа.

Таким образом, только замены типа Азр11 ->А1а,01и12-^01у в Са2+-связывающих сайтах существенно сказались на кинетических параметрах люминесценции и привели к значительному снижению как константы скорости подъёма люминесценции, так и параметра Ьтах/Ы мутантных вариантов обелина.

Зависимость люминесцентной активности мутантов обелина от концентрации Са2<" представлена на Рис.6. Были определены следующие показатели:

а) Диапазон чувствительности к Са2+;

б) ЬтмтуЬяих - отношение нижней и верхней границ диапазона люминесцентного ответа.

в) ЦпшЛм - величина, характеризующая скорость утилизации фотопротеина в отсутствие Са2+, полученная умножением Ьпах/1п1 на Цпт/Т^тпах-

Значения этих показателей приведены в таблице 4. Видно, что по сравнению с белком дикого типа, величина ЬпцГ/Ь„тх практически не изменилась для глициновых мутантов по первому и второму Са2+-связывающим сайтам, и уменьшилась в десять раз для глицинового мутанта по третьему сайту. Это отразилось и на отношении Г^ш/Пи для мутаита вЗ -оно увеличилось в 6,7 раза по сравнению с обелином дикого типа. Диапазон чувствительности к Са2+ для глициновых мутантов С1 и С2 также существенно не отличался от диапазона чувствительности обелина дикого типа. Только для мутанта 03 было показано незначительное снижение чувствительности к Са2+. По всей видимости, присутствие глицина в 6-м положении ЕР-петель несущественно для связывания Са2+, по-крайней меря, в 1-м и 2-м Са2+-связывающих сайтах.

Величина Ьти/Ь1ШК для всех глутаминовых мутантов значительно уменьшилась по сравнению с белком дикого типа. Данные приведены на Рис. бив таблице 4. Такое изменение является следствием: а) снижения максимальной скорости утилизации ЭЕ-мугантов при насыщающей концентрации Са2+, что отражается в снижении величины Ьтач/1гЛ; б) возрастания скорости утилизации ОЕ-мутантов в отсутствие Са*т, что отражается в увеличении величины Ь,,ш/!п1.

Диапазоя чувствительности к Ca для мутанта DE1 практически не. изменился по сравнению с белком дикого типа (см. таблицу 4). Для мутанта DE2 нижняя граница диапазона осталась на уровне белка дикого типа,

-1

1S-3

J -5 g»-6 ~ -7

Г

EGTA-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 log[Ca2+]

с?

0

1

2

3

4

5

6

7

8 9

EGTA-8 -7 -6 -5 -4 log[Ca2+]

1 у

ff

Л

Г

J ?

Л

/

■3 -2 -1

Gl

G2

0

-1

-2

1 -3

} -4

2 -5

"еб -6

-7

О К.

-9 к

EGTA-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 log[Ca2+]

-1

_ -2 s -з

35

1? -б "" -7 -8

—

л f

//

)

/ < а г

у

/

V

-9 к> EGTA-8 -7 -6 -5 -4

log[Ca2+]

•3 -2 -1

G3

DEI

Рис.б (начало).

А Р

fr

/ г

/

/ i

/

/

J

/

f / Г

/ /

h

¥

__« 4

f

EGTA-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 log[Ca2+]

DE2

-9

EGTA-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 log[Ca2+]

DE3

Рис.6 (окончание). Зависимость интенсивности люминесценции мутантов обелина от концентрации Са2+. Обозначения: Д - люминесценция мутантов, о - люминесценция рекомбинантного обелина дикого типа. Заполненные символы - концентрация кальция задавалась с помощью Ca-EGTA буфера. Открытые символы - концентрация кальция задавалась с помощью разведения раствора СаСЬ. L - интенсивность люминесценции при заданной концентрации Са2+, Lmax - интенсивность люминесценции при насыщающей концентрации Са2+. Теоретические кривые построены с использованием модели Аллена, Блинкса и Прендергаста (Allen et al, 1977).

Таблица 4. Параметры люминесценции мутантов обелина

Фотопротеин Lmln/Lmw (xlO'9) Lmai/Int, сек'1 Lmb/Int (x ] 0"8) Lml„/Int В % К обелину дикого типа Диапазон чувствительности к Са2+ (log[Ca2+|)

Обелин дикого типа 9,99 8,53 8.5 100 -7,4 - -4.0

Gl 17,2 8,40 14,4 169 -7,1 - -3,5

G2 15,4 5,20 8,0 94 -7,4 - -3.5

G3 79,6 7,17 57,1 672 -6,9 - -3,7

DEI 2217,2 0,45 99,8 1174 -7,6 - -3,7

DE2 6822,6 0,06 40,9 481 -7,1 - -3,0

DE3 1785,7 0,23 41,1 483 -6,6 - -2,5

а верхняя граница сместилась в область более высоких концентраций Са2+ на. одну логарифмическую единицу. Для DE3 мутанта как нижняя, так и верхняя границы диапазона чувствительности сместились в область более высоких концентрации Са2+ на 0,8 и 1,5 логарифмической единицы, соответственно. Таким образом, замена глутаминовой кислоты в 12-м положении EF-петли на глицин, сократившая число лигандов, координирующих Са2+ с 7-ми до 5-ти, имела выраженный эффект на люминесценцию фотопротеина, в каком бы Са2+ -связывающем сайте не была генерирована такая мутация.

Из сравнения полученных данных о влиянии одинаковых аминокислотных замен в разных Са2+-связывающих сайтах на функцию обелина можно сделать вывод, что замены во втором и третьем Са2+-связываюхцих сайтах имели более выраженный эффект на люминесцентные свойства белка по сравнению с аналогичными заменами в первом Са2+-связывающем сайте. Это в свою очередь говорит о том, что сайты не тождественны по своему влиянию на люминесцентные свойста. фотопротеина и на его чувствительность к ионам Са2+.

ВЫВОДЫ

1. Определена нуклеотидная последовательность кДНК апообелина -апофотопротеина из гидроидного полипа Obelia long is si та. В этой последовательности обнаружены две открытые рамки считывания, одна из которых кодирует апообелин. По нуклеотидной последовательности восстановлена полная аминокислотная последовательность апообелина. Показано, что апообелин состоит из 195 аминокислотных остатков и содержит три Са2+-связывающих сайта, организованных по типу EF-структур, характерных для Са2+-акгивируемых белков.

2. Методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза получено 6 мутантов апообелина с заменой высококонсервативных аминокислот по шестому положению (Glyó—>Arg), а также по одиннадцатому и двенадцатому положениям (Asp 11-»Ala, Glul2-»Gly) каждого из трёх Са2+-связывающих сайтов. , '

3. Ген апообелина, а также гены его мутантных вариантов экспрессированы в E.coli с использованием Т7 РНК-полимеразы. Содержание синтезированных в E.coli апобелков составило 5 мг на 1 грамм сырой клеточной биомассы.

4. Определены параметры люминесценции рекомбинантного обелина: константа скорости подъема люминесценции - 379 сек'1, константа скорости

спада люминесценции - 8,3 сек"1, отношение нижней и верхней границ диапазона люминесцентного ответа -10'8, диапазон чувствительности к Ca2v - от 4х10"8 до IxIO"4 М. Показано, что Mg24" в концентрации 1 мМ не влияет на чувствительность рекомбинантного обелина к Са2+. Полученные данные свидетельствуют о перспективности рекомбинантного обелина для использования в качестве индикатора внутриклеточного кальция.

5. Показано, что замена глицина на аргинин в 6-ой позиции в первом и втором Са2+-связывающих сайтах существенно не влияет на константу скорости подъема люминесценции, максимальную скорость утилизации белка и диапазон люминесцентного ответа, но приводит к незначительному смещению верхней границы диапазона чувствительности к Са2+. Аналогичная замена в третьем сайте также не оказывает существенного влияния на кинетические параметры люминесценции, но приводит к сужению диапазона люминесцентного ответа и снижению чувствительности к Са2+.

6. Показано, что замена аспарагиновой и глутаминовой кислот в 11-й и 12-й позициях Са2+-связывающих сайтов на аланин и глицин, соответственно, приводит к существенному снижению максимальной скорости утилизации белка и значительному сужешпо диапазона люминесцентного ответа. Для мутантов по второму и третьему сайтам кроме этого наблюдается снижение константы скорости подъема люминесценции и смещение границ диапазона чувствительности к Са2+.

7. В каждой серии мутантов - по 6-й или 11-й,12-й позициям, аминокислотные замены во втором и третьем Са2+- связывающих сайтах имеют более выраженный эффект на люминесцентные свойства белка по сравнению с аналогичными заменами в первом Са2+-связываюшем сайте.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Illarionov В.A., Markova S.V., Bondar V.S., Illarionova V.A., Vysotski E.S. Clpning, expression and nucleotide sequence investigation of apoobeliti cDNA from the hydroid Obelia longissima II Bioluminescence and chemihuninescence / Eds. Szalay A.A. et al. - John Wiley & Sons, Chichester, 1993. - P. 183-185.

2. Illarionov B.A., Matveev S.V„ Bondar V.S., Illarionova V.A., Trofimov K.P., Vysotski E.S. Site-directed mutagenesis of cDNA coding for Ca-activated photoprotein obelin from hydroid Obelia longissima // Abstracts of International Bioluminescence Symposium. - Hawaii, USA. - 1993. - P.38.

3. Illarionov B.A., Illarionova V.A., Lee J.W., van Dongcn W., Vervoort I Expression and properties of the recombinant lumazine (riboflavin) protein from

Photobacterium leiognathi // Biochim. Biophys. Acta. - 1994. - V.1201. - P.251- • 258.

4. Frank L.A., Markova S.V., IUarionova V.A., Illarionov B.A., Vysotski E.S. Calcium-activated photoprotein obelin derivatives in immunoassay: perspectives // Biolurainescence and chemiluminescence: fundamentals and applied aspects I Eds. Campbell A.K. et ai. - John Wiley & Sons, Chichester, 1994. -P.249-252.

5. Illarionov B.A., Bondar V.S., IUarionova V.A., Vysotski E.S. Sequence of the cDNA encoding the Ca(++)-activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissima // Gene. - 1995. - V.153. - P.273-274.

6. Frank L.A., IUarionova V.A., Vysotski E.S. Use of proZZ-obelin fusion protein in bioluxninescent immunoassay // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1996. - V.219. - P.475-479. '

7. IUarionova V.A., Illarionov B.A., Bondar V.S., Vysotsky E.S., Blinks J.R. Characterization of recombinant obelin as an intracellular Ca" indicator // Bioluminescence and chemiluminescence: molecular reporting with photons / Eds. • Hastings J.W. et al. - John Wiley & Sons, Chichester, 1997. - P.427-430.

8. IUarionova V.A., Illarionov B.A., Bondar V.S., Vysotsky E.S., Blinks J.R. Removal of essential ligand in N-terminal calcium binding domain of obelin does not inactivate the photoprotein or reduce its calcium sensitivity, but dramatically alters the kinetics of the luminescent reaction // Bioluminescence and chemiluminescence: molecular reporting with photons I Eds. Hastings J.W. et al. -John Wiley & Sons, Chichester, 1997. - P.431-434.