Биолюминесцентный молекулярный микроанализ на основе Ca2+-регулируемого фотопротеина обелина

Франк, Людмила Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биолюминесцентный молекулярный микроанализ на основе Ca2+-регулируемого фотопротеина обелина
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биолюминесцентный молекулярный микроанализ на основе Ca2+-регулируемого фотопротеина обелина"

2 О АВГ 2009

Франк Людмила Алексеевна

БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МИКРОАНАЛИЗ НА ОСНОВЕ Са2+-РЕГУЛИРУЕМОГО ФОТОПРОТЕИНА ОБЕЛИНА

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Красноярск, 2009

Работа выполнена в Институте биофизики Сибирского отделения Российской академии наук.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, академик РАН Гнтельзон Иосиф Исаевнч

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, чл.-корр. РАН Рубин Андрей Борисович

доктор биологических наук, чл.-корр. РА Нетесов Сергей Викторович

доктор медицинских наук, профессор Савченко Андрей Анатольевич

Ведущая организация: Химический факультет Московского

государственного университета имени М.В. Ломоносова

Защита состоится «24» ноября 2009 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета Д 003.007.01 в Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, д.50, стр.50. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН

Автореферат разослан « » 2009 г.

Вр. и.о. ученого секретаря диссертационного совета, д.ф.-м.н. Кудряшева Н.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Одной из важнейших задач современной биотехнологии является поиск новых высокоэффективных аналитических инструментов, способных отвечать нуждам медицинской диагностики, микробиологии, геномики, экологии и т.д. Ключевыми элементами аналитических систем являются системы регистрации специфических взаимодействий аффинных комплексов. Основными требованиями, предъявляемыми к этим системам, являются их надежность, стабильность, простота мечения и детекции, а также способность обеспечить выявление сверхмалых количеств биомолекул-мишеней.

В настоящее время на отечественном рынке наблюдается явная потребность в чувствительных и высокоэффективных диагностических наборах. Радиоизотопные (РИА) диагностикумы и иммуноферментные (ИФА) диагностикумы на базе колориметрических меток, использующиеся в клинико-диагностической практике, обладают рядом недостатков, оказывающих существенное негативное влияние как на результаты таких анализов, так и на возможности широкого их использования в клинической диагностике. Для ИФА-методов, основанных на колориметрической детекции продукта, характерны значительная вариабельность результатов измерений и, как следствие, зачастую пониженная эффективная чувствительность. РИА-метод, оставаясь «золотым стандартом» в лабораторных исследованиях, требует соблюдения особых условий его использования, включая получение специальных разрешений (лицензии) на работу с радиоактивными веществами. Применение импортных аналитических приборов и наборов реактивов существенным образом отражается на стоимости анализа и делает отечественное здравоохранение зависимым от импортных поставок и состояния мирового рынка. В этом аспекте разработка отечественных высокочувствительных, надежных и относительно недорогих диагностикумов является чрезвычайно актуальной задачей.

Одним из решений этой задачи может стать разработка диагностикумов на основе светоизлучающих белков и, в частности, на основе Са2+-регулируемых фотопротеинов. Эти белки представляют собой стабильный фермент-

субстратный комплекс из белковой глобулы (односубъединичного полипептида с молекулярной массой около 20 кДа) и нековалентно иммобилизованного внутри нее окисленного субстрата - пероксицелентеразина. Биолюминесцентная реакция фотопротеинов происходит при присоединении ионов Са2+ с излучением света в голубой области (Хтах = 470-485 нм). Высокий квантовый выход - 0,25-0,35 позволяет обнаруживать эти белки в аттомольных количествах. Клонирование кДНК нескольких апофотопротеинов и получение рекомбинантных фотопротеинов - в частности, акворина медузы Aquorea victoria - обеспечили проведение широкомасштабных исследований по его применению в качестве репортеров в молекулярном анализе. Показано его успешное использование в качестве высокочувствительного репортерного белка в иммуноанализе ряда биологически важных соединений, а также в гибридизационном анализе для решения целого ряда задач - от изучения механизмов регуляции экспрессии генов в ответ на различные стимулы до определения генмодифицированных источников в пищевых продуктах. Эти исследования проводятся исключительно за рубежом с применением рекомбинантного акворина, производимого несколькими фирмами, к примеру, Prolume, Molecular Probes (США), стоимость которого высока, что сильно ограничивает перспективы его практического использования.

В России в Институте биофизики СО РАН на протяжении последних 20 лет велись интенсивные исследования биолюминесцентной систем гидроидного полипа Obelia longissima, обитающего в водах Белого моря. Свечение этого организма обусловлено наличием белка обелина, такж принадлежащего семейству Са2+-регулируемых фотопротеинов. К начал} наших исследований был получен в чистом виде и изучен природный обелин клонирован ген апообелина, получены генетические конструкции д; экспрессии рекомбинантного апообелина в клетках E.coli. Это обеспечил постоянный источник белка для проведения всесторонних исследований - о изучения его структурно-функциональной организации до разработки способо его использования как репортера в аналитических системах in vivo и in vitro.

Представляемая работа является комплексным исследованием рекомбинантного Са2+-регулируемого фотопротеина обелина применительно к биоаналитическим задачам, конечной целью которой является создание на его основе отечественных высокочувствительных надежных и простых для рутинного применения биолюминесцентных диагностикумов для определения социально-важных заболеваний и инфекций.

Целью настоящего исследования было создание биотехнологической основы нового направления молекулярного высокопроизводительного микроанализа с использованием рекомбинантного Са2+-регулируемого фотопротеина обелина и его генетически модифицированных аналогов в качестве биолюминесцентных репортеров.

Достижение поставленной цели требовало решения следующих задач:

1. Разработать высокоэффективную технологию получения рекомбинантного обелина и его генетически модифицированных аналогов в высокоочищенном виде.

2. Разработать способы получения производных обелина - химических коньюгатов и генноинженерных химер - с различными биоспецифичными молекулами, пригодных для использования в качестве высокочувствительных репортеров в анализе in vitro.

3. Показать перспективность применения обелиновых репортеров в иммуноанализе и ДНК-зондировании и обосновать конкурентоспособность предлагаемого нового направления биолюминесцентного молекулярного микроанализа.

Цель работы и комплекс задач сформулированы впервые. Их решение обеспечило получение новых фундаментальных знаний по различным аспектам биотехнологии рекомбинантных Са2+-регулируемых фотопротеинов и является основой для практического применения этих белков в различных молекулярно-биологических исследованиях. Научная новизна.

Впервые проведены комплексные исследования рекомбинантного Са2+-регулируемого фотопротеина обелина и его генетически модифицированных аналогов как высокочувствительных репортеров для биолюминесцентного молекулярного микроанализа.

Разработан эффективный способ получения рекомбинантного обелина в гомогенном виде с выходом около 50% от экспрессированного апобелка. Изучены основные физико-химические свойства рекомбинантного обелина (спектральные характеристики, параметры биолюминесцентной реакции, термоинактивация и условия хранения).

Выявлены закономерности химического модифицирования рекомбинантного обелина действием различных реагентов, направленного на получение его высокоактивных коньюгатов с биоспецифичными молекулами -гаптенами, авидином или стрептавидином, иммуноглобулинами, пригодных для использования в качестве высокочувствительных репортеров (меток) в биолюминесцентном микроанализе. Получен и охарактеризован как высокочувствительный биолюминесцентный репортер химерный белок proZZObe, обладающий биолюминесцентной активностью обелина и аффинностью белка А из Staphylococcus aureus к Fc фрагментам иммуноглобулинов класса G.

Экспериментально обоснована перспективность применения полученных коньюгатов для биолюминесцентного иммуноанализа на примере определения ряда биологически активных веществ - гормонов, онкомаркеров, инфекционных агентов в сыворотках. Показано, что метки на основе рекомбинантного обелина обеспечивают чувствительность микроанализа, равную или близкую чувствительности радиоизотопного анализа, стабильны при хранении в растворе, замороженном или лиофилизированном виде, обладают низким уровнем шума, просты и безопасны. В отличие от иммуноферментного анализа с колориметрической детекцией продукта, анализ на основе обелинового репортера исключает стадии длительного инкубирования с субстратом и остановки ферментативной реакции.

Впервые предложены варианты высокочувствительного двухпараметрического биолюминесцентного микроанализа: одновременного -на основе мутантных вариантов обелина с измененными спектрами биолюминесценции и последовательного - на основе обелина в тандеме с целентеразин-зависимой люциферазой Metridia longa.

Показано, что коньюгаты обелин-авидин (или стрептавидин) являются высокочувствительными и быстрыми репортерами для определения биотинилированных олигонуклеотидов в гибридизационном анализе продуктов ПЦР. Использование биолюминесцентого репортера позволяет определять 10'ИМ (10*15 моль) матрицы, что на порядок выше чувствительности аналогичного колориметрического репортера на базе щелочной фосфатазы. Практическая значимость.

На основе разработанной технологии получения рекомбинантого обелина высокой очистки налажено его мелкооптовое производство. Получение белка занимает в среднем 22-24 ч и может осуществляться специалистом технической квалификации. Этим способом получены ряд различных генетических вариантов обелина, а также рекомбинантные акворин и его варианты, клитин и Са2+-регулируемый целентеразин-связывающий белок Renilla muelleri.

Полученные коньюгаты обелина с биоспецифическими молекулами являются основными компонентами для создания отечественных высокочувствительных биолюминесцентных иммунодиагностикумов и наборов для ДНК-гибридизационного анализа, направленных на выявление социально-важных заболеваний и инфекций.

Предложенные варианты двухпараметрического биолюминесцентного микроанализа позволяют создавать двухпараметрические диагностикумы, а в перспективе - многопараметрические диагностикумы, использование которых существенным образом удешевит и интенсифицирует анализ, а также позволит исключить ошибки разнесенного во времени раздельного определения двух или нескольких антигенов в одном образце сыворотки.

В перспективе разработка биолюминесцентных высокочувствительных и простых для рутинного применения молекулярных диагностикумов на основе рекомбинантного обелина может способствовать решению задачи обеспечения отечественного здравоохранения тест-системами нового поколения. Положения, выносимые на защиту:

1. Разработан эффективный способ получения рекомбинантного Са2+-регулируемого фотопротеина обелина и его генетических вариантов, позволяющий за 22-24 ч получать высокоочищенный белок силами специалиста технической квалификации.

2. Выявлены закономерности химического модифицирования обелина и предложены способы получения его высокоактивных химических коньюгатов с гаптенами и биоспецифическими белками, пригодных для использования в качестве биолюминесцентных репортеров в молекулярном микроанализе.

3. Экспериментально обоснована перспективность и конкурентоспособность биолюминесцентных репортеров на базе рекомбинантного обелина в иммуно- и ДНК-гибридизационном микроанализе биологически важных веществ.

4. Предложены варианты высокочувствительного двухпараметрического биолюминесцентного микроанализа: одновременного - на основе мутантных вариантов обелина с измененными спектрами биолюминесценции и последовательного - на основе обелина в тандеме с целентеразин-зависимой люциферазой Metridia longa.

В результате проведенных комплексных исследований разработана биотехнологическая основа для создания отечественных биолюминесцентных диагностикумов социально значимых заболеваний и инфекций. Вклад автора. Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Апробация работы и публикации. Основные материалы, изложенные в работе, были представлены на: International Conference on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS, (Лениниград, 1991); International Bioluminescence Symposium (Гавайи, США, 1993); VIII-XV International Symposiums on Bioluminescence and Chemiluminescence (Кэмбридж, Великобритания, 1994; Вудсхол, США, 1996; Болонья, Италия, 1998; Асиломар, США, 2000; Кэмбридж, Великобритания, 2002; Йокогама, Япония, 2004; Парадиз Пойнт, США, 2006; Шанхай, Китай 2008); 2nd International Conference on Clinical Chemiluminescence (Берлин, 1996); 31st European Marine Biology Symposium (Санкт-Петербург, 1996); 5th International Conference on Instrumental Methods of Analysis, Modern Trends and Applications, (Патры, Греция, 2007); на конференциях «Фундаментальная наука - медицине» (Новосибирск, 2007, 2008); на V съезде Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008); на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 57 работ, из которых 18 - статьи в журналах, рекомендуемых ВАК, 10 - статьи в сборниках трудов Международных конференций, 1 заявка на патент, 1 - препринт и 27 - тезисы докладов на конференциях.

Объем н структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, шести глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 225 страницах машинописного текста, содержит 73 рисунка и 7 таблиц. Список цитируемой литературы включает 214 источников из них 189 - иностранных.

Работа выполнена при финансовой поддержке: РФФИ (гранты 93-04-21308а, 96-04-48489а, 99-04-48452а, 02-015-49419а, 05-04-48271а, 06-04-0807бофи, 06-04-89502-ннс_а, 07-04-01248а), ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники России на 2007-2012 годы» (ГК № 02.512.11.2008), Программы РАН «Молекулярно-клеточная биология», Гранта CRDF No. RB1-2495-KR-03.

ОСНОВНОЕ СОДЕЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Получение и основные физико-химические свойства рекомбинаитного обелина.

Биосинтез апообелина в клетках штамма-суперпродуцента £.co/i BL21gold (pET19-OL8), экспрессирующих апообелин, (Маркова С.В., ИБФ СО РАН) сопровождается упаковкой этого белка в виде нерастворимых телец включений. Для получения рекомбинаитного апообелина дикого типа (WT), а также других апофотопротеинов, экспрессированных на базе той же конструкции, был разработан способ, основные этапы которого показаны на Рис. 1. Рекомбинантные клетки разрушали УЗ-дезинтегрированием и осадок телец включений отделяли центрифугированием. Балластные вещества удаляли промыванием осадка различными буферными растворами. Полученный в результате осадок растворяли 6 М мочевиной в 20 мМ Трис НС1 рН 7,0, 5 мМ СаС12 и центрифугировали. Показано, что в тельцах включений сосредоточено 75-85% от общего экспрессированного клетками апобелка. Полученный препарат апобелка очищали ионообменной хроматографией на DEAE-Sepharose FF в денатурирующих условиях в градиенте NaOAc 0-0,5 М (буфер А: 6 М мочевина, 20 мМ Трис НС1 рН 7,0, 5 шМ СаСЬ; буфер Б: 1 М NaOAc в буфере А). В среднем выход апофотопротеинов составляет 35-45 мг на грамм сырой клеточной массы. Активацию апообелина синтетическим целентеразином проводили 10-20-кратным разбавлением полученного после хроматографии 6 М мочевинового раствора апобелка активационным буфером. Механизм этого процесса неизвестен и условия его эффективного протекания подбирали эмпирически. Были установлены: оптимальный состав активационного раствора - 20 мМ Трис НС1 рН 7, 10 мМ ДТТ, 5 мМ ЭДТА, 1,2-1,5 молярный избыток целентеразина, оптимальная концентрация апобелка - 0,2-0,4 мг/мл, минимальное время активации -4 ч. Конечная концентрация мочевины - 0,60,3 М, NaOAc - не более 0,02 М. Полученный в результате фотопротеин выделяли из активационного раствора ионообменной хроматографией на колонке MonoQ (GE Healthcare) или QAE-Sepharose FF (при препаративном

получении обелина АУТ) в градиенте ИаС1 0-0,35 М. При получении мутантых вариантов обелина эту хроматографию проводили только на колонке МопоО для отделения активного фотопротеина от исходного апобелка, поскольку

(Биомасса рекомбинантньпЛ __клеток Е. cotí_)

н_

УЗ-дезинтегрнрование клеток и отделение* телец-включений центрифугированием

Экстракция балластных веществ растворами 20 мМ TpucHCl, рН 7.0,

содержащими: а) 0,9<И> NaCl, б) 1% Тритон Х-100,в) 5 мМ Сааз

^Экстракция апообелина раствором: ^ б М мочевина, 20 мМ ТрисНСЛ, рН 7.0 5 мМ CaCh

|фияна I eFF

(0-0.5 М))

Ионообменная хроматография DEAE-Sepharose в градиенте NaOAc

5 |

Активация апообелина: 1.2-кратный избыток целентеразина . 5мМ ЭДТА, 10 мМ ДТТ

б|

^Ионообменная хроматогрфия на MonoQ > ^ в градиенте Nag (0-0.35 М) ^

Рис. 1. Основные стадии получения рекомбинантного обелина.

эффективность их активации в разработанных условиях зависит от произведенных аминокислотных замен. В среднем, с одного грамма клеточной

биомассы выделяется 20-35 мг рекомбинантного обелина \\'Т высокой очистки

(Рис. 2). Разработанный способ получения обелина занимает 22-24 ч, начиная

1 2 3 4 5 6 7 кДа

Рис. 2. Типичная электрофореграмма белковых препаратов при выделении и очистке рекомбинантного обелина. 1, 2 - клеточные белки до и после индукции, соответственно; 3 - раствор клеточных белков в супернатанте после разрушения клеток и центрифугирования; 4 - раствор телец включений в 6 М мочевине; 5 - апообелин, полученный после хроматографии на ОЕАЕ-Sepharo.se РТ; 6 - финальный препарат обелина; 7- маркерные белки.

Таблица 1. Основные физико-химические свойства рекомбинантного обелина в сравнении с природным белком.

Параметр Рекомбинантный белок Природный

Константа спада реакции (сек"1) 6,6 4

Удельная активность (кв/мг) 6,5х1015 4,95х1015

Электронный спектр поглощения Хтах^Онм Е1мг/мл=2,5

Хтах2=460нм Е1мг/мл=0,022

Спектр биолюминесценции >,тах = 478нм,

плечо при 390нм (18%)

Константы

термоинактивации (мин"1, х 10"4)

при г=30°С 16 5,8

при 1=40°С 230 54

при 1=50°С 1500 1500

с дезинтеграции биомассы, и может проводиться специалистом технической квалификации. По основным физико-химическим свойствам рекомбинантный обелин близок природному белку, выделенному из гидроида ОЬеНа ¡оп^зта (Таблица 1). Обелин непосредственно участвует в реакции светоизлучения, и потому зависимость величины биолюминесцентного сигнала от количества белка линейна во всем диапазоне исследуемых концентраций (Рис. 3).

Определены условия хранения рекомбинантного обелина. Белок не теряет активности в растворе (20 мМ Трис НС1, рН 7, 5 мМ ЭДТА, 0,2 М ИаС1) при 4-8°С в течение 6-8 месяцев. Полное сохранение активности при замораживании препаратов обелина обеспечивается снижением ионной силы раствора, а также добавлением 5-10% трегалозы или 0,1-1% БСА. Для лиофильного высушивания использовали растворы белка в 10 мМ Трис НС1, рН 7, 2,5 мМ ЭДТА, полученные гель-фильтрацией на Биогеле Р-6. Высушенный препарат полностью сохраняет активность в течение года при -20°С.

10° 10' 102 103 104 105 106 Белок, аттомоль

2. Получение биоспецифичных коньюгатов обелина, пригодных для использования в качестве меток в молекулярном анализе.

А) Химический синтез.

Коньюгаты обелин-биотин были синтезированы в разработанных нами условиях с использованием 5-кратного молярного избытка N-оксисукцинимидного эфира биотинамидогексановой кислоты (Sigma), в

Рис. 3. Зависимость биолюминесценции от количества обелина или его генетически модифицированных вариантов: Ш (-■-), У138Р (-А-), W92F;H22E (-•-). Пределы обнаружения (количество белка, при котором биолюминесцентный сигнал в 2 раза превышает фоновый) составляют 1,4, 4,2 и 12 аттомоль, соответственно.

растворе 0,1 М ИаНСОз, 5 мМ ЭДТА время реакции - 30 мин, при комнатной температуре. Коньюгат выделяли гель-фильтрацией. Было показано, что на поверхности белка иммобилизуется 2-3 молекулы биотина и сохраняется 7075% исходной активности.

Коньюгаты обелин-биоспецифичные белки и гаптены.

Для синтеза коньюгатов разработана универсальная схема с использованием в качестве бифункционального длинноцепочечного кросс- линкера -

R= (стрепт)авидин, иммуноглобулины, тироксин (Т4)

Рис. 4. Синтез коньюгатов обелина с биоспецифическими молекулами.

сукцинимидного эфира 4-малеимидометил циклогексановой кислоты (SMCC, Pierce, США), Рис. 4. Ранее нами было показано, что, несмотря на присутствие в аминокислотной последовательности обелина 5 цистеиновых остатков, они недоступны для химического модифицирования. В то же время, эксперименты по получению биотинилированных производных показали наличие на поверхности белка доступных для модификации аминогрупп. С помощью реагента Траута - 2-имитониолана, реакция которого протекает по доступным аминогруппам, был получен обелин с тионилированным спейсером на поверхности белка, пригодный для коньюгирования с малеимид-активированными биоспецифическими молекулами. Показано, что

использование 5-кратного молярного избытка 2-имитониолана при проведении реакции в 50 мМ BICINE, рН 8,5, 250 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 30 мин, приводит к появлению 2-х дополнительных SH-групп и при этом сохраняется около 80% исходной активности белка.

В дальнейшем сайт-направленным мутагенезом Asp 12, находящаяся на свободном NH2 конце обелина, была заменена на Cys (мутант D12C) (C.B. Маркова). При этом биолюминесцентная активность полученного ген-модифицированного белка практически не отличалась от активности обелина WT. Было показано, что введенный остаток цистеина обеспечил доступную для модификации SH-группу, и это позволило исключить стадию химического тионилирования белка.

Малеимид-активированные производные биоспецифических молекул (R-NH2, Рис. 2) получали с использованием 10-50-кратного молярного избытка SMCC, в 20 мМ PIPES, рН 7,5, 0,25 M NaCl, 5 мМ ЭДТА в течение 1,5-2 ч при комнатной температуре. При этом на модельном примере иммуноглобулина кролика было показано, что в его молекулу вводится 2-7 малеимидных групп. Избытки реагентов удаляли гель-фильтрацией на колонке, уравновешенной 20 мМ PIPES, рН 7,5, 0,25 M NaCl, 5 мМ ЭДТА. Малеимид-тироксином получали в 0,1 M растворе NaHC03 с применением 1,2-молярного избытка SMCC и использовали для дальнейшей работы без гель-фильтации.

Коньюгаты (Obe-R, Рис. 2) получали инкубированием SMCC-активированных биоспецифических молекул с тионилированным обелином в молярном соотношении 1:10 при комнатной температуре в течение 2 ч или при 4сС в течение ночи. Коньюгаты выделяли гель-фильтрацией на колонке Superóse 12 (GE Healthcare), уравновешенной 20 мМ ТрисНС1 рН 7,0, 0,1 M NaCl, 5 мМ ЭДТА. После всех модификаций потери активности обелина не превышали 30-35%. Полученные с помощью химических модификаций коньюгаты стабильны при хранении в растворе при 4-8°С в течение, как минимум, 6 месяцев - потери биолюминесцентной активности за этот период не превышали 10%. Коньюгаты стабильны при лиофилизации с добавлением

0.1% БСА - после растворения высушенных белков потерь фотопротеиновой и

иммуноглобулиновой активностей не наблюдали.

Б) Получение коньюгата в виде генетической химеры proZZ-Obe.

Для получения химерного белка proZZ-Obe использовали биомассу рекомбинантных клеток C600/pGPl-2, трансформированных плазмидой pTZZ02, в которой к гену апообелина была присоединена двойная нуклеотидная последовательность, кодирующая иммуноглобулин-связывающий фрагмент бежа А - proZZ (Илларионова В.А, ИБФ СО РАН). Рекомбинантный белок выделяли из телец включений, которые после УЗ-дезинтегрирования клеток отделяли центрифугированием. Затем белок растворяли в 6 М мочевине, центрифугировали и активировали белок в супернатанте целентеразином (1,2 молярный избыток) при 20-кратном разбавлении активационным буфером. Химерный белок (димер, с мол. массой 41 и 43 кДа) выделяли аффинной хроматографией на IgG- Agarose. Характеристики его биолюминесценции близки к таковым рекомбинантного обелина WT: удельная активность 8,5 * 1015 кв/мг, константа спада биолюминесцентного сигнала - 5,9 с"1. Аффинность полученной химеры к иммуноглобулинам была продемонстрирована модельным твердофазным микроанализом иммуноглобулинов кролика, мыши и человека (Рис. 5). Полученный фьюжин-белок proZZObe использовали в качестве

1000

а х ш я

100

Рис. 5. Твердофазный биолюминесцентный анализ иммобилизованных на поверхности иммуноглобулинов О - кролика (•), мыши (А), человека (■)•

« ю

0.01 0.1

[IgG], мкг/мл

биолюминесцентного репортера для определения антител к туберкулезному токсину и для определения альфафетопротеина в стандартных сыворотках. На Рис. 6 приведены схемы и результаты этих анализов. В случае определения антигена (АФП) поверхность активировали БаЬг фрагментами иммуноглобулинов, во избежание связывания рго220Ье с иммуноглобулинами

4—► >—В ]—ОЬе свет

к А/ СяСй

Повершосп., АТктоксицт рго^ОЬе 'ГКаЬ2 +АФГ1+АТ+ргоггОЬе->~свет

"ТЯГ" (сыворотки) ^ (сыворотки)

[АФП], нг/мл

Рис. 6. Схемы и результаты иммуноанализа антител к туберкулезному токсину (слева) и АФП (справа) с использованием в качестве репортера химерного белка рго^-ОЬе в стандартных сыворотках.

на поверхности. Некоторое сужение линейного диапазона в этом эксперименте может быть связано с насыщением поверхности лунок.

Результаты данных исследований показывают, что при экспрессии апообелина в виде единой полипептидной цепи с другими полипептидами он не теряет способность формировать активный фотопротеиновый комплекс: полученный химерный белок обладает двумя функциями -биолюминесценцией и аффинностью белка А к Бс фрагментам иммуноглобинов О. Этот результат демонстрирует принципиальную возможность конструирования разнообразных химерных протеинов, обладающих активностью обелина и биоспецифичностью добавленных полипептидов (например, миниантител), которые без дополнительных модификаций представляют собой биолюминесцентные репортерцые белки.

3. Биолюминесцентный иммуноанализ с использованием коньюгатов обелина в качестве меток.

Иммуноанализ альфафетопротеина (АФП).

Биотинилированные производные обелина, как и любого другого репортерного белка, в принципе являются универсальными метками, которые можно использовать для выявления любых биотинилированных молекул, используя высокоаффинный авидиновый или стрептавидиновый мостик. Пользуясь таким подходом, мы провели биолюминесцентный иммуноанализ альфафетопротеина в сыворотках. Схема анализа и его результаты приведены на Рис. 7. В лунки планшета вносили по 100 мкл раствора поликлональных AT к АФП (5 мкг/мл, PBS) и инкубировали 1 ч при 37°С. После промывки PBS, содержащим 0,1% Tween-20, 5 мМ ЭДТА (ПБ), блокировали свободные места на поверхности 1% раствором БСА 1 ч при 37°С и промывали, как описано выше. Затем в лунки вносили по 100 мкл стандартных, тестовых или контрольных сывороток АФП, инкубировали 1 ч 37°С и промывали. Последовательное инкубирование растворов биотинилированных антител (2,5 мкг/мл, PBS) и авидина (2,5 мкг/мл, PBS) и промывки проводили аналогично. Раствор Obe-Bio (1,5 мкг/мл, 20 мМ Трис НС1, рН 7,0, 0ДМ NaCl, 5 мМ ЭДТА) инкубировали при комнатной температуре 1-1,5 ч. После промывки биолюминесцентный сигнал

<0 >-• э^с «-о

СаС12

свет

анти- АФП оиотнн АФП IgG (сывор.)

Рис. 7. Схема и результаты биолюминесцентного твердофазного иммуноанализа АФП в контрольных сыворотках. Каждая точка представляет среднее значение от 10-ти независимых определений.

о 100 200

АФП, нг/мл

связавшегося обелина измеряли с помощью планшетного люминометра Luminoscan vi.30, сразу после внесения в лунки по 100 мкл 0,1 M раствора СаСЬ в 20 мМ Трис HCl, pH 8,8. Полученная зависимость биолюминесцентного сигнала от концентрации АФП линейна во всем исследуемом диапазоне (5 -200 нг/мл). Основные аналитические характеристики биолюминесцентного микроанализа сравнили с характеристиками пробирочного РИА (метка - 1251, МПП "ДИАС", г. Красноярск): чувствительность - 2-2,5 нг/мл (0,8-2,2 нг/мл); процент связывания метки в нулевой сыворотке (фон) - 0,5% (1,5%); тест на определение концентрации в пробе, полученной при смешивании проб с известным содержанием АФП - 98-105% (90-110%). Таким образом, полученные результаты показывают, что биолюминесцентный иммуноанализ даже в таком многостадийном варианте по своим параметрам не уступает традиционному РИА. В отличие от изотопного варианта, биолюминесцентный вариант реализуется в микропланшетах, что обеспечивает более высокую производительность.

Иммуноанализ тиреотропина (ТТГ) и 2-х форм тироксина - общего (ТТ4) и свободного (FT4).

Содержание ТТГ в сыворотках определяли одностадийно с помощью сэндвич-иммуноанализа (см. схему на Рис. 8). Активацию лунок планшета проводили инкубированием мышиных анти-Til -иммуноглобулинов (клон 10С7, 10 мкг/мл, PBS, по 150 мкл/лунку) при 37°С, 1 ч, затем промывали и блокировали свободную поверхность, как описано ранее. После промывки в лунки вносили по 50 мкл сыворотки (стандартной, контрольной или клинического образца) и по 50 мкл раствора коньюгата Obe-IgG-5E8 (1 мкг/мл, PBS, 0,25% BSA, 5 мМ ЭДТА). Смесь инкубировали при встряхивании (18°С, 45 мин). Затем лунки промывали и измеряли биолюминесценцию обелина, как уже описано. На Рис. 8 приведена полученная зависимость биолюминесценции от концентрации ТТГ в стандартных сыворотках. Эту зависимость использовали для определения содержания гормона в контрольных (Immunotech, lot С104, Чехия) и клинических сыворотках. Чувствительность проведенного анализа составила

0,0097 цЩ/мл (среднее значение стандартной нулевой сыворотки + 2SD). Чувствительность радиоизотопного иммуноанализа ТТГ для наборов фирмы Immunotech - 0,01 цШ/мл. Для сравнения на рисунке приведен результат анализа с использованием раствора предварительно лиофилизированной метки, которую хранили в течение 2-х месяцев при 4-8°С. Видно, что результаты практически совпадают с таковыми для метки, хранившейся в растворе. Результаты биолюминесцентного определения ТТГ в 34-х сыворотках пациентов сравнили с результатами РИА, полученными с помощью RIA gnost hTSH kit (CIS bio International, Франция) в клинической лаборатории Красноярской краевой больницы. Как видно из Рис. 8 (слева) результаты двух определений близки: полученные точки укладываются на прямую (R2=0,997) с угловым коэффициентом близким 1 и свободным членом близким 0. Определение двух форм тироксина, общего (ТТ4) и свободного (FT4),

А Са2+

4 Abi+ ТСТ(сыворотки)+АЬ2-ОЬе —свет

0.1 1 10 [ ТТГ ], ци/мл

0 10 20 30 40 50 60 цЫ/мл, RIA

Рис. 8. Справа: Твердофазный биолюминесцентный иммуноанализ ТТГ в стандартных сыворотках с использованием метки до (о) и после лиофильной сушки (А). Каждая точка представляет среднее от 8 независимых определений ± 1SD. цО - международные единицы (IRP80/558WHO). Слева: Сравнение результатов радиоиммунного анализа (RIA) и биолюминесцентного (BLIA) иммуноанализа ТТГ в клинических сыворотках (п=34). На врезке - сравнение образцов с низким содержанием гормона.

проводили одностадийным конкурентным иммуноанализом по схемам, представленным на Рис. 9. и 10. При анализе общего Т4 поверхность активировали раствором мышиных amn-T4-IgG (10 мкг/мл, PBS, 14 ч, 4-6°С, 100 мкл /лунку). После промывки и блокировки в лунки вносили по 20 мкл стандартных или контрольных сывороток и по 80 мкл коньюгата Obe-T4 (1 мкг/ мл, PBS, 5мМ ЭДТА, 0,05% ANSA) и инкубировали при встряхивании (18°С, 45 мин). Затем после промывки измеряли биолюминесценцию обелина, как описано выше. В процессе инкубирования сывороточный тироксин и тироксин в коньюгате с обелином конкурируют за связывание с иммуноглобулинами к Т4, иммобилизованными на поверхности лунок. Количество связанного коньюгата ОЬе-Т4 обратно пропорционально содержанию ТТ4 в сыворотках.

Рис. 9. Твердофазный конкурентный иммуно-анализ общего (ТТ4) тироксина в стандартных сыворотках. Каяздая точка - среднее значение от 5 определений ± 1SD. Результаты представлены в полулогарифмических и прямых (на врезке) координатах. L0 - биолюминесценция от стандартной сыворотки с нулевым содержанием гормона; L -люминесценция от

стандартных сывороток с различным содержанием ТТ4.

Используя полученную зависимость как калибровочную, определили содержание ТТ4 в контрольных сыворотках, (лот 112, Immunotech, Чехия). Полученный при этом результат хорошо коррелировал с содержанием гормона, указанного производителем (Таблица 2).

При анализе свободного Т4 поверхность активировали раствором коньюгата

1 , Са2+

j Ab + ТТ4(сыворотки) + Т4-ОЬе —свет

100 ТТ4. нМ

— :¡hc

0.8 0.7

в «

^0.5 0.4 0.3 0.2

FT4, пМ

Рис. 10. Слева: Твердофазный конкурентный иммуноанализ свободного тироксина (FT4) в стандартных сыворотках. Каждая точка - среднее значение от 8 определений ± 1SD. Результаты представлены в полулогарифмических и прямых (на врезке) координатах. L0 - биолюминесценция от стандартной сыворотки с нулевым содержанием гормона; L - люминесценция от стандартных сывороток с различным содержанием FT4. Справа: Сравнение результатов радиоиммунного (RIA) и биолюминесцентного иммуноанализа (BLIA) FT4 в клинических сыворотках (п=10).

гемоцианин-Т4 - НС-Т4 (20 мкг/мл, PBS, ночь, 4°С, 100 мкл/лунку). После промывки в лунки вносили по 20 мкл стандартных, контрольных или клинических сывороток и по 80 мкл коньюгата мышиных airra-T4-IgG-Obe (1 мкг/мл, PBS, 5 мМ ЭДТА, 0,25% BSA) и инкубировали при встряхивании (18°С, 45 мин). После промывки измеряли биолюминесценцию иммобилизованного коньюгата aimi-T4-IgG-Obe. В процессе инкубирования сывороточный FT4 и Т4 на поверхности конкурируют за связывание с коньюгатом amu-T4-IgG-Obe. Количество иммобилизованного aHTH-T4-IgG-Obe обратно пропорционально содержанию FT4 в сыворотках. Используя полученную зависимость как калибровочную кривую, определили содержание FT4 в контрольных (Immunotech, лот 005) и 10 клинических сыворотках. Результаты

Т4 + Т4 (сыв.)+янтиТ4-АЬ-ОЬе—»- свет

биолюминесцентного определения клинических образцов близки результатам РИА (Рис. 10).

Полученные нами основные параметры (содержание гормонов в соответствующих контрольных сыворотках и чувствительность) биолюминесцентного иммуноанализа (BLIA) сравнили с таковыми радиоизотопного иммуноанализа (RIA), (Таблица 2). Полученные при этом результаты показывают, что биолюминесцентная метка при иммуноанализе рассмотренных гормонов в сыворотках не уступает радиозотопной по чувствительности и надежности. При этом она лишена недостатков последней -безопасна, стабильна и позволяет проводить анализ в высокопроизводительном планшетном варианте.

Таблица 2. Аналитические параметры биолюминесцентного и радиоизотопного иммуноанализа ТТГ, ТТ4 и FT4.

Гормон Контрольные сыворотки Чувствительность

(ед. конц.) BLIA RIA* BLIA** RIA*

ТТГ 1,64 ±0,1 1,41 -2,11

(лотС104) ((iU/мл) 14,6 ±0,715 11,3-16,9 0,01 0,02

ТТ4 139,3 ±9,9 100-150

(лот 112) (нмол/мл) 232,3 ±10,7 190-285 15 13

FT4 (лот 005) (пмол/мл) 9,41 ±1,7 42,1 ±6,5 10-16,8 28-42 0,25 0,4

*www.immunotech.cz; * * Чу вствитель ность определяли как среднее значение сигнала от 8-ми определений стандартной нулевой сыворотки +2SD для ТТГ и - 2SD для ТТ4 и FT4.

Иммуноанализ инфекционных агентов

Аналитические возможности фотопротеиновых меток были также исследованы на примере иммуноанализа двух инфекционных агентов - бактерии Shigella sonnei (LPS) и вируса гепатита В (HbsAg) в сыворотках. Для работы были использованы соответствующие коммерческие наборы реактивов, изготовленные НПО Аквапаст (Санкт-Петербург) и ЗАО Вектор-Бест (Новосибирск), основанные на колориметрическом выявлении антигена. В ходе нашего анализа в качестве биолюминесцентных меток использовали

синтезированные коньюгаты обелина с соответствующими антителами. Анализы проводили в сэндвич формате, аналогично описанному выше анализу ТТГ, и их чувствительность без проведения специальной оптимизации составила: для HbsAg 0,37 нг/мл (0,1-0,5 нг/мл, Вектор-Бест), а для S.sonnei LPS, 0,25 нг/мл (1 нг/мл, Аквапаст). Отметим, что чувствительность тест-систем на вирус гепатита В, выпускаемых рядом фирм - лидеров на рынке иммунодиагностикумов (Organon, Labsystems, Sanofi Diagnostics Pasteur, Behring) колеблется в диапазоне 0,5-0,1 нг/мл. Таким образом, даже без оптимизации условий анализа, обелиновая метка обеспечивает чувствительность иммуноанализа на уровне коммерческих диагностикумов.

Одновременный иммуноанализ двух антигенов в одном образце с использованием «цветных» мутантов обелина.

Для диагностирования ряда заболеваний и установления эффективности назначенной терапии часто необходим одновременный скрининг содержания двух и более веществ. Это особенно характерно для эндокринных заболеваний, где важно не только определить содержание того или иного гормона, но и баланса между ними. Раздельное определение таких пар или форм (например, свободной и связанной) гормонов может вносить существенные искажения в результаты анализа. Нами был разработан подход иммуноанализа, позволяющий одновременно определять два антигена в одном образце сыворотки. Для примера использовали два гормона - лютеинизирующий (JIT) и фолликулостимулирующий (ФСГ), определение которых всегда производится в паре при диагностике ряда нарушений функций генеративных органов.

Дня работы в качестве репортеров были использованы мутантные формы

обелина с измененными спектрами биолюминесценции, полученные сайт-

направленным мутагенезом аминокислот активного центра обелина. Спектры

«фиолетового» мутанта W92F;H22E с Яшах= 388 нм и «зеленого» мутанта

Y138F с Хпгах = 492 нм (Рис. IIA) имеют малую область перекрывания, и их

сигналы эффективно разделяются с помощью широкополосных оптических

фильтров, установленных перед ФЭУ двухканального биолюминометра

О. 1,0

5.0,8 к

£0,6

8<м

I 0,2

Q | 0,0 Ш

1 и

\ \

i \ А \ \

\ /у \ \ \

1 \ ¡1 \ \

i \ 'А \

i i \

350 400

450 HM

500 550

время, сек

Рис 11. А: Нормированные биолюминесцентные спектры обелинов \У92Р;Н22Е (черный) и У138Р (серый); и спектры пропускания светофильтров: I - ФС6, II — ЖС16. Для сравнения на рисунке приведен спектр биолюминесценции обелина дикого типа (серый, штрих); Б: Пропускание биолюминесцентных сигналов смеси мутантов через светофильтры, встроенные в каналы I и II. Пунктиром показаны сигналы без светофильтров. Данные нормированы на концентрацию белка. Стрелками показан момент запуска реакции.

Таблица 3. Некоторые физико-химические свойства мутантных форм обелина в сравнении с обелином дикого типа.

Белок Биолюминесценция ^.шах/плечо (нм) Активность % от WT Ica-free/ белок (отн.ед. мг1) Ica-frc</ lea xlO'8 [Сонстанта спада (С)

WT 482/400 100 210 8,6 6,9

W92F;H22E 388 10 68,2 30 6,1

Y138F 493/400 68 461,5 25 0,6

Ica-free - интенсивность кальций-независимой люминесценции lea — интенсивность кальций-активируемой биолюминесценции

(модель Б JIM 8802М2К, СКБ «Наука», Красноярск) (Рис. 11 Б). Как видно из Таблицы 3, эти белки обладают высокой активностью и стабильностью, предел обнаружения этих белков составляет 4,2 и 12 аттомоль для Y138F и

\У92Р;Н22Е, соответственно (Рис. 3). ЛГ и ФСГ представляют собой двухсубъединичные гликопротеиды, у которых а-субъединицы структурно схожи и, таким образом, биологические и иммунологические свойства каждого гормона определяются его уникальной р-субъединицей. Антитела к а-субъединице использовали для активации поверхности, а в качестве «цветных» биолюминесцентных меток использовали коньюгаты: мышиные анти-р-ФСГ 1£0~\У92Р,Н22Е и мышиные анти-(3-ЛГ 1сО~У138Р. Анализ проводили по схеме, показанной на Рис. 12, слева. На этом же рисунке справа приведены

"фиолетовый" сигнал

I Са2*

"зеленый" /7 сигнал

и'92ГД22Е I

ФСГ

* *

V + V

У138Р I

аитир-ЛП^С ЛГ

анти -а-ФСГ 1§С

20 40 60 80 [ЛГ], [ФСГ], мМЕ/мл

Рис. 12. Схема проведения (слева) и результаты (справа) одновременного твердофазного иммуноанализа содержания ЛГ (А) и ФСГ (•) в стандартных сыворотках. Каждая точка представляет среднее значение от трех независимых определений ± ББ.

результаты определения гормонов в смешанных стандартных сыворотках. Чувствительность анализа при одновременном определении составила 0,57 мМЕ/мл для ФСГ и 1,1 мМЕ/мл для ЛГ (рассчитывали как среднее значение сигнала от нулевой сыворотки + 28Б, п=3). Чувствительность раздельного радиоизотопного иммуноанализа составляет 0,5 мМЕ/мл для каждого гормона (НПО Диас, Россия). Принимая во внимание, что одновременный биолюминесцентный анализ был выполнен без специальной оптимизации условий, полученные значения чувствительности можно считать вполне

удовлетворительными и демонстрирующими перспективность предлагаемого подхода.

Последовательный иммуноанализ двух антигенов в одном образце с использованием обелина в тандеме с люциферазой Metridia longa. Люцифераза Metridia longa представляет собой небольшой одноцепочечный белок (м.м. около 20 кДа), катализирующий реакцию окисления целентеразина молекулярным кислородом, с выделением кванта света (лтпах=482 нм). Клонирование генов, кодирующих несколько изоформ этого белка, получение бактериальных штаммов-продуцентов рекомбинантных белков проведено в Институте биофизики СО РАН (Markova V.V. et al., 2004). Для наших работ использовали одну из изоформ этой люциферазы - MLuc39. Белок выделяли из телец включений после ультразвуковой дезинтеграции рекомбинантых клеток E.coli. Тельца включения промывали последовательно раствором 20 мМ Трис-НС1, pH 7,0, 0,15 М NaCl, а затем 20 мМ Трис-HCl, pH 7,0, 0,5% Tween 20 (трижды), и растворяли в б М растворе гуанидин-HCl и центрифугировали. Полученный экстракт переводили в 100-кратный объем раствора, содержащего 20 мМ Трис-HCl pH 8,8, 5 мМ цистеина, 0,5 мМ цистина, 1 мМ ЭДТА, инкубировали в течение ночи при 4°С, концентрировали и хроматографировали на колонке Superóse 12 (GE Healthcare), уравновешенной 0,1 М NaHC03. Для работы использовали фракцию белка с молекулярной массой 21 кДа.

Нами было обнаружено, что биолюминесцентная реакция люциферазы инициируется не только свободным целентеразином, но и целентеразином, иммобилизованным внутри Са2+-зависимого целентеразин-связывающего белка Renilla muelleri (СВР) (Titushin M.S. et al., 2008) при добавлении Са2+. При этом наблюдается увеличение интегрального биолюминесцентного сигнала в 1,6 раза (Рис. 13, слева). Предел обнаружения MLuc39 при использовании раствора целентеразина составляет 10 атхомоль, а при использовании в качестве «субстрата» СВР - 1 атгомоль (Рис. 13, справа). Для сравнения на этом же рисунке представлена зависимость биолюминесценции обелина от количества белка. По сравнению с люциферазным, сигнал обелина несколько ниже (в

случае с использованием СВР - во всем диапазоне концентрации). Очевидно, наблюдаемая разница сигналов связана с принципиально различным устройством рассматриваемых биолюминесцентных систем: молекулы обелина непосредственно участвуют в реакции, а люцифераза катализирует окисление целентеразина растворенным кислородом, и в условиях избытка субстрата имеет место увеличение биолюминесцентного сигнала за счет большого числа оборотов фермента. Нами было показано, что СВР как «субстрат» обладает еще одним серьезным преимуществом.

Время, мин.

ю» ю1 102 10* 10» ю5 Белок, аттомоль

Рис. 13. Слева: Биолюминесценция МЬис39 при запуске раствором целентеразина (—) или СВР (—); Справа: Зависимость биолюминесценции МЬис от количества белка. Реакцию инициировали 6,3 цМ целентеразином (-•-) или 6,3 цМ СВР+Са2+ (-А-). Для сравнения приведена зависимость биолюминесценции обелина (-ш-) от количества белка.

Как известно, целентеразин быстро окисляется в растворе, что приводит к

появлению фонового хемилюминесцентного сигнала и делает необходимым

применение только свежеприготовленных препаратов реагента. В то время как

целентеразин, иммобилизованный внутри белка, защищен от автоокисления:

СВР устойчив при длительном (более года) хранении в растворе при 4-8°С, а

также в замороженном и лиофилизированном виде.

Биотинилированные производные МЬис39 получали с использованием 2-

кратного молярного избытка Ы-гидроксисуксинимидного эфира

биотинамидогексановой кислоты (Sigma) в ОД М NaHC03, 0,25 М NaCl (30 мин, 4°С). Реакцию останавливали добавлением глицина, который потом вместе с избытком реагента отделяли гель-фильтрацией. При этом люцифераза сохраняет 35-37% исходной биолюминесцентной активности.

Биотинилированные производные люциферазы (MLuc~Bio) и обелина (Obe~Bio) использовали в качестве репортеров для иммуноанализа гонадотропных гормонов ЛГ и ФСГ в смешанных стандартных сыворотках.

Биотинилирование антител к ЛГ и ФСГ (анти-ЛГ и анти-ФСГ) проводили 20-кратным избытком Bio~Su в PBS рН 8,5, 5 мМ ЭДТА, 1,5-2 ч при комнатной температуре, избыток реагента отделяли гель-фильтрацией. Комплексы MLuc-Bio~Stavi~Bio-aHTH-OCr и Obe-Bio~Stavi~Bio-aHTH-Hr получали инкубированием биотинилированных белков со стрептавндином в течение 40

мин при молярном

ОЬе

^ ЛГ ^-Bio-Stavl-Bio""1 + CaCk обелин +СВР MLuc

^ ФСГ^-Bio-Stavi-Bio^

MLuc

1.25 5 10 20 40 80

[ЛГ], [ФСГ], мМЕ/мл

соотношении MLuc-Bio (или Obe-Bio): Stavi : Bio-анти-ФСГ (или Bio-анти-ЛГ), равном 2:1:1, а затем выделяли гель-фильтрацией на колонке Superdex 200 (GE Healthcare), уравновешенной PBS, 5 мМ ЭДТА. Анализ проводили по схеме, представленной на Рис. 14. Лунки планшета активировали антителами к аФСГ (10 мкг/мл, 0,1 М NaHCOj, по 100 мкл/лунку)

Рис. 14. Схема проведения и результаты { ч при зтс и Пр0Мывали. анализа ФСГ (•) и ЛГ (А) в смешанных

стандартных сыворотках с использованием двух Блокировали свободную

биолюминесцентный репортеров. поверхность 1 % БСА в PBS

(1ч, 37°С). После промывки вносили по 100 мкл смеси стандартных сывороток ЛГ и ФСГ с концентрациями: 1,25 и 80; 5 и 40; 10 и 20; 20 и 10; 40 и 5; 80 и 1,25 мМЕ/мл, соответственно, инкубировали 1 ч при 37°С и снова промывали. Затем в лунки вносили смесь меток в РВ8, 5 мМ ЭДТА, 0,2% БСА, инкубировали при перемешивании 40 мин при 20°С. После промывки биолюминесценцию обелнна инициировали добавлением 100 мкл 0,1 М раствора СаС12. Сигнал интегрировали в течение 5 сек, а затем инициировали биолюминесценцию люциферазы добавлением в те же лунки по 50 мкл СВР (50 мкМ, 20мМ ТрисНС1, 5 мМ ЭДТА) и измеряли сигнал в течение 20 сек. Результаты анализа представлены на Рис. 14. Во всем диапазоне измерений величина сигналов, полученных от люциферазы, выше, чем от обелина, поскольку фермент работает в условиях избытка по субстрату. Суммарное время измерения сигналов составляет 25 сек, т.е. для измерения стандартного 96-луночного планшета необходимо 40 мин. В предложенном варианте анализа биолюминесцентные реакции обоих репортеров фактически запускаются одним реагентом - СаС12, измерения проводятся в планшетном биолюминометре и не требуют дополнительных оптических устойств, связанных с многоволновой детекцией сигнала, как в случае одновременного анализа с «цветными» мутантами обелина

4. Гибридизационный биолюминесцентный анализ с использованием фотопротеина обелина.

Чувствительность детекции продуктов полимеразной цепной реакции является важным фактором при диагностике различных заболеваний. Существующие на сегодняшнем рынке диагностические системы основаны либо на качественном обнаружении ДНК-мишени методом гель-электрофореза, либо на колориметрическом определении с помощью репортерных ферментов (щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена и пр.). Эти методы обладают недостаточно высокой чувствительностью и большими временными затратами. Системы, основанные на анализе продуктов ПЦР в реальном времени (Яеа1-

time PCR assay), достаточно дороги. В данном разделе приведены результаты исследований применения коньюгатов обелина с авидином или стрептавидином для выявления продуктов гибридизации в твердофазном анализе в сравнении с таким же коньюгатом щелочной фосфатазы. Эксперименты по колориметрическому выявлению проводились И.А. Пышной (ИХБФМ СО РАН, Новосибирск). В качестве твердофазного носителя были исследованы мелкодисперсный отечественный полимер на основе диметакрилового эфира этиленгликоля - ДМЭГ-7 (Институт особо чистых препаратов, Санкт-Петербург) и ряд коммерческих планшетов разных производителей с различными активированными поверхностями лунок. Модельную ДНК-матрицу выявляли методом молекулярной гибридизации с помощью зонда 31 (5'-TCAGGCAGTACCACAAGGCC), иммобилизованного на поверхность. В качестве ДНК-матрицы использовали олигонуклеотид Ml (5'-GTTGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGA) или Ml*, содержащий на 3'-

*agtccgtcatggtggtccggaaagcgttg5' | _ TCAGGCAGTACCACAAGGCC

5 Ml,

5. * agtccgtcatggtgttccggaaagcgttg5'

Ю у

rs /

u ^ 1. отмывки

s 5'TCAGGCAGTACCACAAGGCC ^^ 2. конъюгат

3. отмывки

4. выявление

§ \ Ml

я agtccgtcatggtgttccggaaagcgttg5

gj dt/rP^v^^ agtccgtcatggtgttccggaaagcgttg5'

g u Taq - полимераза TCAGGCAGTACCACAAGGCC ЦЩ1

I 5 &

где ^(твердофазный носитель,* - остаток биотина

Рис. 15. Схема проведения гибридизационного анализа.

А) - Выявление биотинилированной ДНК-матрицы М1* с иммобилизованным зондом 31; Б) - Выявление немеченой ДНК-матрицы М1 путем ферментативного удлинения иммобилизованного зонда 31 в составе гибридизационного комплекса в присутствии биотин-содержащего нуклеотидтрифосфата (ШТР* и Гад-ДНК-полимеразы.

конце остаток биотина (*). Введение биотина в состав гибридизационного комплекса осуществляли гибридизацией иммобилизированного зонда 31 с матрицей MI* (10"7 - 10"12 М, 30 мин, 62°С) (Рис. 15А) или ферментативным удлинением иммобилизированного зонда 31 в составе комплекса 3I/MI с помощью Гад-ДНК-полимеразы в присутствии биотинилированного дезоксиуридинтрифосфата dUTP* (30 мин, 62°С) (Рис. 15Б). В последнем случае метка оказывается ковалентно связанной с носителем, что позволяет, без потери специфичного сигнала выявления, применять более жесткие процедуры отмывки для снижения фонового сигнала. На Рис. 16 приведены результаты выявления ДНК-матрицы Ml на поверхности ДМЭГ с иммобилизованным

Рис. 16. Зависимость сигнала от концентрации выявляемой ДНК-матрицы при проведении анализа на поверхности полимерных частиц ДМЭГ: (а) колориметрическое выявление: зависимость окраски полимера от концентрации ДНК-матрицы через 10 (1), 30 (2), 120 (3) мин после добавления субстратов BCIP + NBT, (10D - интенсивность оптической плотности в шкале серых тонов), на врезке -сканированное изображение частиц в лунках через те же промежутки времени, где н/с -неспецифический сигнал; (б) -биолюминесцентное выявление с использованием коньюгата обелин-авидин.

олигонуклеотидным зондом 31. Биотиновую метку вводили в последовательность зонда 31 с помощью Тац-ДНК-полимеразы (по схеме на

7 8 9 10 11

-lg(WHK матрица), М)

Рис. 15Б) в течение 30 мин при 62°С. Данная температура проведения реакции обеспечивает условия эффективного комплексообразования (а > 0.5), поскольку температура плавления комплекса в условиях проведения реакций составляет 65,9°С и близка к температурному оптимуму Год-ДНК-полимеразы. В случае колориметрического анализа после 10-минутного инкубирования с хромогенными субстратами для щелочной фосфатазы BCIP+NBT окрашивание полимера наблюдали только в случае концентрации анализируемой ДНК-матрицы MI 10'7 и 10"8 М. Через 2 ч достоверный сигнал регистрировали в лунке с концентрацией Ml Ю'10 М (Рис. 16а). Окраска полимера в последней лунке (концентрация матрицы MI 10"11 М) практически совпадала с неспецифической фоновой окраской полимера (н/с), которая накапливалось за это же время. При использовании обелиновой метки (Рис. 166), зависимость биолюминесцентного сигнала от концентрации матрицы была линейна (R2 = 0.91) во всем исследуемом диапазоне концентраций. Сканирование сигнала от каждого образца производили в течение 5 сек. Таким образом, информацию о содержании анализируемой матрицы в 5 образцах получали всего через 25 сек. При этом биолюминесцентная метка позволяет определять наличие матрицы Ml в концентрации 10'n М.

Для проведения твердофазного анализа весьма удобным является микропланшетный формат. В наших экспериментах были использованы три вида планшет NucleoLink™ Strip, CovaLink™NH (Nalge Nunc International, США) и DNA-BIND™ (Costar, США), содержащих на поверхности лунок различные реакционноспособные группы. При этом сравнение меток при проведении анализа в планшетах всех видов выявило одинаковые закономерности. Для примера на Рис. 17 приведены результаты, полученные с использованием планшет DNA-Bind. При биолюминесцентном способе обнаружения модельных матриц MI* (по схеме на Рис. 15.А) и Ml (по схеме на Рис. 15.Б) сигналы имеют хорошую воспроизводимость (разброс 5-10%, п=4), и их величина линейно зависит от концентрации матрицы в диапазоне от 10"8 М до 10"12 М (R2 = 0,97). Предел обнаружения матриц Ml* и Ml составляет 10'" М.

Этот предел определяли как концентрацию матрицы, при которой сигнал (0,03 и 0,026 для М1* и М1, соответственно) достоверно отличается от контрольного, плюс 2БО. Полученную линейную зависимость сигнала от концентрации матриц можно использовать как калибровочную кривую для определения содержания данной ДНК-матрицы в исследуемом растворе. Колориметрическое выявление в аналогичном варианте после 4-часового инкубирования достоверно обнаруживает в образце Ю-10 М ДНК-матрицы. В области высоких концентраций внесенной матрицы (10"*М0"8 М) для обеих меток разницы между сигналами практически нет. Очевидно, это связано с насыщением поверхности лунок при данных концентрациях олигонуклеотидов в образцах.

Рис. 17. Результаты выявления ДНК-матриц М1*(») и MI (А) на планшетах DNA-Bind: (а) - биолюминесцентная метка коньюгат обелин-стрептавидин, (б) - колориметрическая метка (1 - через 15мин, 2 - через 4 ч после внесения субстрата-NPP).

Особый интерес представляют эксперименты по выявлению ПЦР продуктов вируса гепатита С (ВГС), выделенных из разных клиничесю образцов. Амплифицированные фрагменты кДНК вируса гепатита С (ВГС были любезно предоставлены Пышной И.А. (ИХБФМ СО РАН) Двухцепочечный ПЦР-фрашент длиной 230 п.о. был предварительн денатурирован. Биотиновую метку в последовательность зонда 31 вводили помощью 7а<?-ДНК-полимеразы (по схеме на Рис. 15Б). На Рис. 18 приведен результаты определения одного из фрагментов на поверхности планшет DNA

7 8 9 10 11 12 контроль JgdiUK матрица), М)

7 8 9 10

-ВДДНК матрица), М)

Bind. Видно, что, как и в модельных экспериментах, для колориметрического анализа существенным параметром является возможность накопления сигнала, и, если в первые 30-60 мин интенсивность окраски в пробах практически не отличается от контрольной, то через 4 ч можно выявить матрицу в образце с 500-кратным разбавлением (Рис. 186). Для обелиновой метки ДНК-матрица выявляется непосредственно в момент внесения раствора СаС12 в лунки и, как

2,0

5 0,8

И 0,0

1,5 (Ь)

1,0 V?:

2 Щ г

о О 0,5 щ

0,0

0 5 10 15 20 25 Время, час

£1

х20 хЮО х500 хЮОО ШО

х20 хЮО х500 Н20

Рис. 18. Выявление ПЦР-фрагмента ВГС на планшетах ОЫА-ВМ. По оси абсцисс указаны разбавления образца ПЦР-фрагмента, «Н20» -контрольный образец (вода вместо раствора ДНК), (а) - биолюминесцентная метка коньюгат обелин-стрептавидин; (б) - колориметрическая метка через 4 ч после внесения субстрата №Р; на врезке - кинетика накопления колориметрического сигнала при внесении матрицы с разбавлением в 20 (1), 100 (2) и 500(3) раз.

показано на Рис. 18(а), сигнал от образца с 1000-кратным разведением целевой ДНК достоверно (более чем в 2 раза) отличается от контрольной пробы.

Таким образом, в ходе проведенных экспериментов нами показано, что

I биолюминесцентная метка, представляющая собой химические коньюгаты Са2+" ( ре^лируемого фотопротеина обелина с авидином (Рис. 16) или I стрептавидином (Рис. 17 и 18) может успешно использоваться для выявления ДНК фрагментов методом молекулярной гибридизации. При этом она обладает | рядом преимуществ по сравнению с колориметрической меткой. Это: высокая (более чем на порядок) чувствительность; простота запуска реакции (надо I только добавить раствор СаС12) и регистрации сигнала; возможность получения

результата практически сразу после проведения анализа (отсутствуют процедуры длительного инкубирования ферментативной метки с субстратом, а также остановки реакции); величина биолюминесцентного сигнала фотопротеина линейно зависит от его количества, что позволяет строить соответствующие калибровочные кривые и не только определять наличие целевой ДНК-последовательности, но и оценивать ее количество; высокая чувствительность выявления позволяет проводить ПЦР-анализ с меньшим количеством циклов ПЦР, что позволяет повысить его специфичность.

ВЫВОДЫ

1. Разработан эффективный способ получения рекомбинантного Са2+-регулируемого апофотопротеина обелина из штамма-суперпродуцента Е.соИ ВЬ2^оШ (рЕТ19-ОЬ8). Разработанный подход успешно использован для выделения ряда мутантных вариантов апообелина и других рекомбинантных целентеразин-связывающих Са2+-активируемых белков, полученных на основе аналогичной экспрессирующей конструкции. Выход высокоочищенных апобелков - 30-45 мг на грамм сырой клеточной пасты.

2. Разработаны эффективные условия получения активированного рекомбинантного обелина дикого типа в практически индивидуальном состоянии с выходом 75-80% от исходного апобелка. Выход активированных мутантных вариантов обелина в тех же условиях зависит от произведенных аминокислотных замен.

3. Рекомбинантный обелин дикого типа обладает физико-химическими свойствами, близкими природному обелину: удельная биолюминесцентная активность: 6,3х1015 кв мгконстанта спада биолюминесцентного сигнала:

= 6,6 с'1; спектральные характеристики свечения: Ххпах=482 нм, плечо при Х=390 нм; спектр абсорбции содержит две характерные полосы с лтаХ]=280 нм, ЕГ/МЛ=2,5 и Хтах2=460 нм, Е2мг/мл=0,022. Предел обнаружения рекомбинантного обелина составляет 1,4 аттомоль. Белок обладает относительной стабильностью к действию протеаз. Определены условия

хранения в растворе, замороженном и лиофилизированном виде без потери биолюминесцентной активности.

4. Разработан эффективный способ получения коньюгатов обелина с биоспецифичными молекулами (гаптенами, иммуноглобулинами, авидином или стрептавидином), позволяющий сохранить 75-80% исходной биолюминесцентной активности белка. Полученные производные стабильны в условиях проведения модельного анализа, при хранении в растворе, а также в замороженном и лиофилизированном виде.

5. На примере твердофазного иммуноанализа ряда биологически важных веществ в сыворотках (гормонов, инфекционных агентов и др.) показано, что полученные коньюгаты обладают чувствительностью, равной или близкой радиоизотопной метке, широким линейным диапазоном, низким уровнем шума, безопасны и стабильны в условиях анализа и при хранении. Би о люминесцентная реакция обелиновых меток отличается простотой (надо только добавить раствор Са2+) и высокой скоростью (на измерение стандартного 96-луночного планшета требуется 8 мин).

6. На примере твердофазного иммуноанализа двух гонадотропных гормонов показано, что репортеры на основе мутантных вариантов обелина с измененными характеристиками свечения позволяют одновременно и с высокой чувствительностью определять две мишени в одном образце сыворотки: сигналы от каждой мишени эффективно разделяются с помощью широкополосных оптических фильтров.

7. Разработан вариант иммуноанализа двух антигенов с использованием двух разных репортеров - обелина и люциферазы МеМсНа с последовательным запуском биолюминесцентных реакций. Показано, что применение в качестве «субстрата» люциферазы Са2 "-зависимого целентеразин-связывающего белка 11епШа позволяет инициировать биолюминесценцию обеих меток ионами

8. Коньюгаты обелин-авидин (или стрептавидин) являются высокочувствительными и быстрыми репортерами для определения

биотинилированных олигонуклеотидов в гибридизационном анализе продуктов ПЦР. Использование биолюминесцентого репортера исключает стадии длительного инкубирования с субстратом и остановки ферментативной реакции и позволяет определять 1(Г"М (10"15 моль) матрицы, что на порядок выше чувствительности аналогичного колориметрического репортера на базе щелочной фосфатазы.

Список публикаций

Статьи в научных журналах.

1. Vysotski E.S., Trofimov С.Р., Bondar V.S., Frank L.A., Markova S.V, Illarionov B.A. Mn2+-activated luminescence of photoprotein obelin. // Arch. Biochem. Biophys.-1995. - Vol.315. - P. 92-99.

2 Frank L.A., Illarionova V.A., Vysotski E.S. Use of proZZ-obelin fusion protein in bioluminescent immunoassay. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1996. -V. 219. - P. 475-479.

3 Франк JI.A., Высоцкий E.C., Петунин А.И., Навдаев А.В. Са2+-активируемый фотопротеин обелин как метка в иммуноферментном анализе. //Иммунология. -1997.-№ 1. -С. 59-61.

4 Illarionov В.А., Frank L.A., Illarionova V.A., Bondar V.S., Vysotski E.S., Blinks J.R. Recombinant obelin: cloning and expression of cDNA, purification and characterization as a calcium indicator. // Methods in Enzymology. -2000-V. 305. - P. 223-249.

5. Бондарь B.C., Пуртов K.B., Маликова Н.П., Франк JI.A., Илларионов Б.А. О роли консервативного Cysl58 при образовании активного фотопротеинового комплекса обелина. //Биохимия. - 2001, - Т. 66. - С.1245-1251.

6. Vysotski E.S., Liu Zhi-Jie, Markova S.V., Blinks J.R., Deng Lu, Frank L.A., Herko M., Malikova N.P., Rose J.P., Wang Bi-Cheng, Lee J. Violet bioluminescence and fast kinetics from W92F obelin: Structure-Based proposals for the bioluminescence triggering and the identification of the emitting species. // Biochemistry. - 2003. - V. 42. - P. 6013-6024.

7. Malikova N.P., Stepanyuk G.A., Frank L.A., Markova S.V., Vysotski E.S., Lee J. Structural tuning of obelin bioluminescence by mutations of Trp92. // FEBS Lett. - 2003.- V. 554.-P. 184-188.

8. Франк JI.A., Петунин А.И., Высоцкий E.C. Синтез конъюгатов Са2+-регулируемого фотопротеина обелина с иммуноглобулинами и их использование в качестве меток в иммуноанализе. // Биоорган, хим. - 2004. -Т.ЗО.-С. 364-368.

9. Frank L.A., Petunin A.I., Vysotski E.S. Bioluminescent immunoassay of thyrotropin and thyroxine using obelin as a label. // Anal. Biochem. - 2004. - V. 305. - P. 240-246.

lO.Markova S.V., Golz S., Frank L.A., Kalthof В., Vysotski E.S. Cloning and expression of cDNA for a luciferase from the marine copepod Metridia longa. И J. Biol. Chem. - 2004. - V. 279. - P. 3212-3217.

ll.Stepanyuk G.A., Golz S., Markova S.V., Frank L.A., Lee J., Vysotski E.S. Interchange of aequorin and obelin bioluminescence color is determined by substitution of one active site residue of each photoprotein. // FEBS Lett. - 2005. -V. 579. - P. 1008-1014.

12.Высоцкий E.C., Маркова C.B., Франк JI.A. Кальций-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных. Молекуляр. биология. 2006. Т. 40. С. 404-417.

13.Frank L., Markova S., Remmel N., Vysotski E., Gitelson I. Bioluminescent signal system: bioluminescence immunoassay of pathogenic organisms. // Luminescence.- 2007. - V. 22. - P. 215-220.

14.Titushin M.S., Markova S.V., Frank L.A., Malikova N.P., Stepanyuk G.A., Lee J., Vysotski E.S. Coelenterazine-binding protein of Renilla muellerv. cDNA cloning, overexpression, and characterization as a substrate of luciferase. // Photochem. Photobiol. Sci. - 2008. - V. 7. - P. 189-196.

15.Borisova V.V., Frank L.A., Markova S.V., Burakova L.P., Vysotski E.S. Recombinant Metridia luciferase isoforms: expression, refolding and applicability for in vitro assay. // Photochem. Photobiol. Sci. - 2008. - V. 7. - P. 1025-1031.

16.Frank L.A., Borisova V.V., Markova S.V., Malikova N.P., Stepanyuk G.A., Vysotski E. S. Violet and greenish photoprotein obelin mutants for reporter applications in dual-color assay. // Anal. Bioanal. Chem. - 2008. -V. 391.- P. 2891-2896.

17.Борисова B.B., Пышная И. А, Пышный Д.В., Франк JI. А. Высокочувствительный и быстрый метод выявления ДНК-фрагментов с использованием фотопротеина обелина как репортера. // Биоорган, химия. -2008. - Т. 34. - С. 792-798.

18.Франк Л.А., Борисова В.В., Верещагина Т.А., Фоменко Е.В., Аншиц А.Г., Гительзон И. И. Выделение рекомбинантных белков с использованием аффинных магнитных сорбентов на основе микросфер энергетических зол. // Прикл. биохим. микробиол. - 2009. - Т. 45. - С. 237-242.

Статьи в сборниках научных конференций.

19. Frank L.A., Markova S.V., Illarionova V.A., Illarionov B.A., Vysotski E.S. Calcium-activated photoprotein obelin derivatives in immunoassay: perspectives. // In: Bioluminescence and Chemiluminescence. Fundamentals and Applied Aspects. Eds: A.K. Campbell, L.J. Kricka, P.E. Stanley. John Wiley & Sons, Chichester. 1994. P. 249-252

20. Frank L.A., Vysotski, E.S. Bioluminescent immunoassay of alphafetoprotein with Ca2+-activated photoprotein obelin. // In: Bioluminescence and Chemiluminescence. Molecular Reporting with Photons. Eds: J.W. Hastings, L.J. Kricka, P.E. Stanley. John Wiley & Sons. Chichester. 1997. P. 439-442

21. Bondar V.S., Frank L.A., Inzhevatkin E.V., Malikova N.P., Illarionova V.A., Vysotski E.S. Bioluminescent activity of the recombinant obelin after chemical modification of histidine and cysteine residues. // In: Bioluminescence and Chemiluminescence. Perspectives for the 21-th Century. Eds: A. Roda, M. Pazzagli, L.J. Kricka, P.E. Stanley. John Wiley& Sons. Chichester. 1999. P. 400403.

22. Frank L.A., Efimenko S.A., Petunin A.I., Vysotsky E.S. Chimeric protein proZZ-Obe as universal label for bioluminescent immunoassay. // In: Bioluminescence and Chemiluminescence. Perspectives for the 21-th Century. Eds: A. Roda, M. Pazzagli, L.J. Kricka, P.E. Stanley. John Wiley & Sons. Chichester. 1999. P. 111-114.

23. Bondar V.S, Frank L.A., Vysotski E.S. Efficiency of apophotoprotein charging depends strongly on protein concentration. // In: Bioluminescence & Chemiluminescence 2000. Eds: J.F. Case, PJ. Herring, B.H. Robison, S.H.D. Haddock, L.J. Kricka, P.E. Stanley. World Scientific. Singapore. 2001. P. 139-142

24. Frank L.A., Bondar V.S., Vysotski E.S. Sensitivity of obelin and apoobelin to digestion by some proteases. // In: Bioluminescence & Chemiluminescence 2000 Eds: J.F. Case, P.J. Herring, B.H. Robison, S.H.D. Haddock, L.J. Kricka, P.E. Stanley. World Scientific. Singapore. 2001. P. 55-58

25. Markova, S.V. Apoobelin biotinylated in vivo: overproduction in Esherichia coli cells. / S.V. Markova, G.A. Stepanyuk, L.A. Frank, E.S. Vysotski. // In: Bioluminescence and Chemiluminescence. Progress and current application. Eds: P.E. Stanley, L.J. Kricka. World Scientific. Singapore. 2002. P. 107-110.

26. Frank L.A., Borisova V.V., Vysotski E.S. Calcium-regulated photoprotein obelin as a label in immunoassay: an outlook for applications. // In: Bioluminescence and Chemiluminescence. Progress and Perspectives. Eds: A. Tsuji, M. Matsumoto, M. Maeda, L.J. Kricka, P.E. Stanley. World Scientific. Singapore. 2005. P. 463-466.

27. Eremeeva E.V., Markova S.V., Frank L.A., Vysotski E.S. The main function of Hisl75, Trpl79 and Tyrl90 residues of the obelin binding site is to stabilize the hydroperoxycoelenterazine intermediate. // In: Bioluminescence & Chemiluminescence: chemistry, biology and applications. Eds: A. Szalay P. Hill L. Kricka, P. Stanley. World Scientific. Singapore. 2007. P. 7-10.

28. Borisova V.V., Frank L.A., Markova S.V., Golz S., Vysotski E.S. Refolding of the recombinant luciferases of Metridia longa. // In: Bioluminescence & Chemiluminescence: chemistry, biology and applications. Eds: A. Szalay P. Hill, L. Kricka, P. Stanley. World Scientific. Singapore. 2007. P.3-6.

29.Франк Л.А., Бондарь B.C., Тюлькова H.A., Высоцкий E.C.. Ca2+-активируемый фотопротеин обелин и бактериальная люцифераза в иммунологическом микроанализе.- Препринт № 113Б, Красноярск: Изд-во ИФ СО РАН, 1992,22с.

30.Борисова В.В., Франк Л.А., Маркова С.В., Высоцкий Е.С. «Способ одновременного определения двух аналитов биолюминесцентным молекулярным микроанализом». Заявка на патент № 2008122723/15(027309) от 24.06.2008.

Подписано в печать 23 июня 2009 г. Тираж 70 экз. Заказ № 35 Отпечатано в типографии Института физики СО РАН 660036 Красноярск, Академгородок.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Франк, Людмила Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. РЕКОМБИНАНТНЫЕ Са2+-РЕГУЛИРУЕМЫЕ ФОТОПРОТЕИНЫ КАК РЕПОРТЕРНЫЕ БЕЖИ В МОЛЕКУЛЯРНОМ АНАЛИЗЕ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Получение и очистка рекомбинантных Ca -регулируемых фотопротеинов.

1.2.Получение биоспецифичных производных рекомбинантных фотопротеинов, пригодных для использования в качестве меток в микроанализе in vitro.

1.2.1. Химический синтез коньюгатов.

1.2.2. Получение бифункциональных химерных белков акворин -биоспецифичный полипептид.

1.3. Биолюминесцентный молекулярный микроанализ с использованием акворина в качестве репортерного белка

1.3.1. Биолюминесцентный иммуноанализ с использованием акворина как репортерного белка.

1.3.2. ДНК-гибридизационный анализ с использованием акворина в качестве репортерного белка.

ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 3.ВЫ ДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОГО ОБЕЛИНА.

3.1. Экстракция апообелина из рекомбинантных клеток Е. coli (этапы 1-3).

3.2. Очистка апообелина ионообменной хроматографией в денатурирующих условиях (этап 4).

3.3. Активация апообелина целентеразином. (этап 5).

3.3.1. Влияние природы восстановителя и его концентрации на эффективность активации апообелина.

3.3.2. Зависимость эффективности активации от остаточной концентрации мочевины.

3.3.3. Зависимость эффективности активации от pH активационного буфера.

3.3.4. Зависимость эффективности активации от концентрации апобелка.

3.3.5. Кинетика активации.

3.4. Очистка обелина ионообменной хроматографией (этап 6).

3.5. Основные физико-химические свойства рекомбинантного обелина.

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ БИОСПЕЦИФИЧНЫХ КОНЬЮГАТОВ РЕКОМБИНАНТНОГО ОБЕЛИНА, ПРИГОДНЫХ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ МЕТОК В МОЛЕКУЛЯРНОМ АНАЛИЗЕ.

4.1. Получение биоспецифичных коньюгатов обелина химическими методами.

4.1.1 Синтез биотинилированных производных.

4.1.2. Синтез коньгатов с другими гаптенами и с белками.

4.2. Получение коньюгатов обелина в виде генетических химер.

4.2.1. Биотинилирование обелина in vivo.

4.2.2. Получение химерного белка proZZ-Obe.

ГЛАВА 5. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОНЬЮГАТОВ ОБЕЛИНА В КАЧЕСТВЕ МЕТКИ.

5.1. Биолюминесцентный иммуноанализ альфафетопротеина (АФП).

5.2. Биолюминесцентный • иммуноанализ тиреотропина (ТТГ) и двух форм тироксина — общего (ТТ4) и свободного (FT4).

5.3i, Бйолюминесцентнышиммуноанализ инфекционных агентов.'.

5.4. Био люминесцентный ä иммуноанализ; антител к туберкулезному ТОКСИН^!.';.'1.1.

5.5. Одновремешшй биолюминесцентный иммуноанализ . двух антигенов в. одном образце с ипользованием мутантных вариантов обелина с измененными^ спектрами биолюминесценции :.;.:.

5.6. Биолюминесцентный иммуноанализ двух антигенов в одном образце с ипользованием обелина в тандеме с целентеразин-зависимой люциферазой

Metridia longa.

5.6.1. Выделение, очистка и некоторые физико-химические свойства целентеразин-зависимой рекомбинантной люциферазы Metridia longa (MLuc39).

5.6.2. Биотинилирование MLuc39 и использование полученных производных в твердофазном микроанализе двух антигенов в одном образце в тандеме с обелином.

ГЛАВА 6. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ГИБРИДИЗАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ОБЕЛИНА.

6.1. Твердофазный гибридизационный анализ в модельных системах.

6.1.1. Анализ на мелкодисперсном полимере ДМЭГ-7.

6.1.2. Анализ на поверхности микропланшет.

6.2. Анализ продуктов ПЦР гена вируса гепатита С.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биолюминесцентный молекулярный микроанализ на основе Ca2+-регулируемого фотопротеина обелина"

Биолюминесценция - это излучение света в видимом диапазоне, происходящее в процессе жизнедеятельности живых организмов [Hastings J.W., 2001]. Хотя светящиеся организмы стоят на разных ступенях эволюционной лестницы — от бактерий до рыб, — все они имеют одинаковую природу свечения. Фактически, биолюминесценция - это хемилюминесцентная реакция, в которой происходит окисление субстрата -люциферина, катализируемое специфическим ферментом — люциферазой. Все люциферазы принадлежат к классу оксигеназ и катализируют реакции окисления субстратов молекулярным кислородом, в результате чего образуются молекулы продукта в высокоэнергетичном (возбужденном) состоянии. При переходе в основное состоянии избыток энергии высвобождается в виде кванта света. Важным преимуществом биолюминесцентных реакций, по сравнению с хемилюминесцентными, является высокий квантовый выход, достигающий в некоторых случаях 90%. Этот факт предопределил перспективность создания сверхчувствительных и высокоспецифичных аналитических систем с использованием биолюминесцентных белков в качестве репортеров биоспецифического взаимодействия [Kricka L., 1988]. Сейчас люциферазы используются как репортерные белки во всех областях фундаментальной биологической науки, где требуется визуализация протекающих процессов — от изучения белок-белковых взаимодействий в отдельных клетках до поведенческих реакций организмов. Гены люцифераз широко используются для визуализации экспрессии генов в молекулярно-биологических и медицинских исследованиях. Люцифераза светляка используется как репортер в пиросеквенировании ДНК. Активно развивается применение люцифераз в аналитических методах in vitro для решения! широкого спектра аналитических задач — от экологического мониторинга среды обитания человека (интегральные биотесты) до молекулярной диагностики различных заболеваний и инфекций. применения фотопротеинов в качестве репортеров в анализе in vitro [Lewis J.C., Daimert S., 2000, Actor J., 2000]. Мощным стимулом для развития этого направления послужило клонирование кДНК ряда апофотопротеинов (акворина, обелина и других) в период с 1985-1995 и получение рекомбинантных белков, практически не отличающихся по своим физико-химическим свойствам от природных. В последующий период появился ряд работ, описывающий эффективное использование рекомбинантного фотопротеина акворина в качестве репортерного белка в иммуноанализе ряда биологически важных соединений, а также в гибридизационном анализе для решения целого ряда задач - от изучения механизмов регуляции экспрессии генов в ответ на различные стимулы, до определения генмодифицированных источников в пищевых продуктах. Эти исследования проводятся исключительно за рубежом, и хотя некоторые фирмы производят этот белок, его коммерческая стоимость велика, что делает его недоступным для широкомасштабного практического использования.

В-Институте биофизики СО РАН на протяжении последних 20-ти лет проводились интенсивные исследования биолюминесцентной системы гидроидного полипа Obelia longissima, обитающего в водах Белого моря. Свечение этого организма обусловлено наличием белка обелина, также принадлежащего семейству Са2+-регулируемых фотопротеинов. Были получены в чистом виде и изучены* несколько изоформ природного обелина, клонирован ген апообелина, получены генетические конструкции для экспрессии рекомбинантного апообелина в клетках Е. coli, что обеспечило постоянный источник, рекомбинантного белка. Проведенные исследования; создали предпосылки? для, разработки высокоэффективных биолюминесцентных аналитических систем на основе обелина. Современная; отечественная? медицина, фундаментальная? биология» и биотехнология нуждаются в новых высокочувствительных, высокоспецифичных; и; в то же время, недорогих методах, молекулярной диагностики. К создаваемым новым аналитическим системам предъявляются следующие основные требования:

1) высокая чувствительность, сравнимая с радиоизотопным анализом, но при этом все компоненты должны отличаться стабильностью и безопасностью для работы персонала; 2) доступность всех составляющих компонентов; 3) возможность проведения анализа в автоматическом режиме; 4) простота процедуры анализа, не требующая высокой квалификации персонала.

К сожалению, современные российские медицинские лаборатории в огромной степени оснащены либо морально устаревающими радиоизотопными диагностикумами, либо импортными аналитическими приборами и наборами реактивов. Последнее существенным образом отражается на стоимости анализа и делает отечественное здравоохранение зависимым от импортных поставок и состояния мирового рынка.

В этом аспекте разработка отечественных высокочувствительных, надежных и относительно недорогих диагностикумов является чрезвычайно актуальной задачей. Одним из ее решений может стать разработка диагностикумов на основе светоизлучающих белков и, в частности, на основе Са2+-регулируемых фотопротеинов. Это определило направление исследований данной работы, ориентированной на комплексное исследование рекомбинантного Са2+-регулируемого фотопротеина обелина применительно к биоаналитическим задачам, конечной целью которой является создание на его основе отечественных высокочувствительных надежных и простых для рутинного применения биолюминесцентных диагностикумов для определения социально-важных заболеваний и инфекций.

Целью настоящего исследования было создание биотехнологической основы нового направления молекулярного высокопроизводительного микроанализа с использованием рекомбинантного Са2+-регулируемого фотопротеина обелина и его генетически-модифицированных аналогов, в. качестве биолюминесцентных репортеров.

Достижение поставленной цели требовало решения следующих задач:

1. Разработать высокоэффективную технологию получения рекомбинантного обелина и его мутантных аналогов в высокоочищенном виде.

2. Разработать способы получения производных обелина - химических коньюгатов и генноинженерных химер — с различными биоспецифичными молекулами, пригодных для использования в качестве высокочувствительных репортеров в анализе in vitro.

3. Показать перспективность применения обелиновых репортеров в иммуноанализе и ДНК-зондировании и обосновать конкурентноспособность ' предлагаемого нового направленйя биолюминесцентного молекулярного микроанализа

Цель работы и комплекс задач сформулированы впервые. Их решение обеспечило получение новых фундаментальных знаний по различным аспектам биотехнологии рекомбинантных Са регулируемых фотопротеинов и являются научной основой для практического применения этих белков в различных молекулярно-биологических исследованиях, а также созданию отечественных высокочувствительных биолюминесцентных диагностикумов для определения биологически важных веществ и инфекционных агентов. Научная новизна.

Впервые проведены комплексные исследования рекомбинантного Са2+-регулируемого фотопротеина обелина как высокочувствительного репортера для биолюминесцентного молекулярного микроанализа.

Разработан эффективный способ получения рекомбинантного обелина в гомогенном виде с выходом около 50% от экспрессированного апобелка. Изучены основные физико-химические свойства рекомбинантного обелина (спектральные характеристики, параметры биолюминесцентной* реакции, термоинактивации и условия хранения).»

Выявлены закономерности химического модифицирования рекомбинантного обелина действием различных реагентов, направленного на получение его высокоактивных коньюгатов с биоспецифичными молекулами гаптенами, авидином или стрептавидином, иммуноглобулинами, пригодных для использования в качестве высокочувствительных репортеров (меток) в биолюминесцентном микроанализе. Получен и охарактеризован как высокочувствительный биолюминесцентный репортер химерный белок proZZObe, обладающий биолюминесцентной активностью обелина и аффинностью белка А из Stapyilococcus aureus к Fe фрагментам иммуноглобулинов класса G.

Экспериментально обоснована перспективность применения полученных коньюгатов для биолюминесцентного иммуноанализа на примере определения ряда биологически-активных веществ - гормонов, онкомаркеров, инфекционных агентов в сыворотках. Показано, что метки на основе рекомбинантного обелина обеспечивают чувствительность микроанализа, равную или близкую чувствительности радиоизотопного анализа, стабильны при хранении в растворе, замороженном или лиофилизированном виде, обладают низким уровнем шума, просты и безопасны. В отличие от иммуноферментного анализа с колориметрической детекцией продукта, анализ на основе обелинового репортера исключает стадии длительного инкубирования с субстратом и остановки ферментативной реакции.

Показано, что коньюгаты обелин-авидин (или стрептавидин) являются высокочувствительными и быстрыми репортерами для определения биотинилированных олигонуклеотидов. в гибридизационном анализе продуктов ПЦР. Использование биолюминесцентого репортера позволяет определять 10~ПМ (10~15 моль) матрицы, что на- порядок выше чувствительности аналогичного кориметрического репортера на базе щелочной фосфатазы.

Практическая значимость

На основе разработанной технологии получения рекомбинантого обелина высокой очистки налажено его мелкооптовое производство. Получение белка занимает в среднем 22-24 часа и может осуществляться специалистом технической квалификации. Этим способом получены ряд различных генетических вариантов обелина, а также рекомбинантные акворин

24" и его варианты, клитин и Са -регулируемый целентеразин-связывающий белок КепШа тиеПеп.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработан эффективный способ получения рекомбинантного Са -регулируемого фотопротеина обелина и его генетических вариантов, позволяющий за 22-24 ч получать высокоочищенный белок силами специалиста технической квалификации.

3. Экспериментально обоснована перспективность и конкурентноспособность биолюминесцентных репортеров на базе рекомбинантного обелина в иммуно- и ДНК-гибридизационном микроанализе биологически важных веществ.

4. Предложены варианты высокочувствительного двух-параметрического биолюминесцентного микроанализа: одновременного — на основе мутантных вариантов обелина с измененными спектрами биолюминесценции и последовательного - на основе обелина в тандеме с целентеразин-зависимой люциферазой Metridia longa.

В результате проведенных комплексных исследований разработана биотехнологическая основа для создания отечественных биолюминесцентных диагностикумов социально-важных заболеваний и инфекций. Вклад автора. Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании' и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Апробация работы и публикации

Основные материалы, изложенные в работе были представлены на Международной конференции по медицинской биотехнологии, иммунизации и СПИДу (Ленинград, 1991), Симпозиуме по биолюминесценции (Гаваи, США, 1993), на VIII-XV Симпозиумах по биолюминесценции и хемилюминесценции (Кэмбридж Великобритания, 1994 г.; Вудсхол США, 1996 г.; Болонья- Италия, 19981 г.; Асиломар США, 2000 г.; Кэмбридж Великобритания, 2002 г.; Йокогама Япония, 2004 г.; Парадиз Пойнт США, 2006, Шанхай Китай 2008 гг.), П-й Международной конференции по клинической хемилюминесценции- (Берлин, 1996), 31-ом Международном. симпозиуме по морской биологии (С.Петербург, 1996), на Международной конференции по инструментальным методам анализа (Патры, Греция, 2007), на Международных конференциях «Фундаментальная наука - медицине» (Новосибирск, 2007, 2008 гг.), на V съезде Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008), на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН.

По материалам диссертации опубликовано 57 работ, из которых 18 -статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 10 — статьи в сборниках трудов Международных конференций, 1 заявка на патент, 1— препринт и 27 — тезисы докладов на конференциях.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Франк, Людмила Алексеевна

ВЫВОДЫ

1. Разработана эффективный способ получения рекомбинантного Са2+ -регулируемого апофотопротеина обелина из штамма-суперпродуцента Е.соИ ВЬ2^оМ (рЕТ19-ОЬ8). Разработанный подход успешно использован для выделения ряда мутантных вариантов апообелина и других рекомбинантных целентреразин-связывающих Са - активируемых белков, полученных на основе аналогичной экспрессирующей конструкции. Выход высокоочищенных апобелков составляет 30-45 мг на грамм сырой клеточной пасты.

3. Рекомбинантный обелин дикого типа обладает физико-химическими свойствами, близкими природному обелину: удельная биолюминесцентная активность: б.ЗхЮ15 кв мг"1; константа спада биолюминесцентного сигнала: к^ = 6.6 с"1; спектральные характеристики свечения: Хтах=482 нм, плечо при А.=390 нм; спектр абсорбции содержит две характерные полосы с Хтах)=280 нм, Е]МГ/МЛ=2.5 и А,тах2=460 нм, Е2мг/мл=0.022. Предел обнаружения рекомбинантного обелина составляет 1 амоль. Белок обладает относительной стабильностью к действию протеаз. Определены условия хранения в растворе, замороженном и лиофилизированном виде без потери биолюминесцентной активности.

4. Разработан,эффективный способ получения коньгатов обелина.с биоспецифичными молекулами4 (гаптенами, иммуноглобулинами, авидином или стрептавидином), позволяющий сохранить 75-80% исходной биолюминесцентной активности белка. Полученные производные стабильны в условиях проведения модельного анализа, при хранении в растворе, а также в замороженном и лиофилизированном виде.

5. На примере твердофазного иммуноанализа ряда биологически важных веществ в сыворотках (гормонов, инфекционных агентов и др.) показано, что полученные коньюгаты обладают чувствительностью равной или близкой радиоизотопной метке, широким линейным диапазоном, низким уровнем шума, безопасны и стабильны в условиях анализа и при хранении. Биолюминесцентная реакция обелиновых меток отличается простотой (надо только добавить раствор Са2+) и высокой скоростью (на измерение стандартного 96-луночного планшета требуется 8 мин).

6. На примере твердофазного иммуноанализа двух гонадотропных гормонов показано, что репортеры на основе мутантных вариантов обелина с измененными характеристиками свечения позволяют одновременно и с высокой чувствительностью определять две мишени в одном образце сыворотки: сигналы от каждой мишени эффективно выделяются с помощью широкополосных оптических фильтров.

7. Разработан вариант иммуноанализа двух антигенов с использованием двух разных репортеров - обелина и люциферазы МегНсНа с последовательным запуском биолюминесценых реакций. Показано, что применение в качестве «субстрата» люциферазы Са2+-зависимого целентеразин-связывающего белка КепШа позволяет инициировать биолюминесценцию обеих меток ионами Са2+.

8. Коньюгаты обелин-авидин (или стрептавидин) являются высокочувствительными и быстрыми репортерами для определения биотинилированных олигонуклеотидов в гибридизационном анализе продуктов ПЦР. Использование биолюминесцентого репортера исключает стадии длительного инкубирования с субстратом и остановки ферментативной реакции и позволяет определять 10~ПМ (10*15 моль) матрицы, что на порядок выше чувствительности аналогичного кориметрического репортеров на базе щелочной фосфатазы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа посвящена комплексным исследованиям рекомбинантного Са -регулируемого фотопротеина обелина как перспективного белка для использования в качестве биолюминесцентного репортера в аналитических системах in vitro.

Современные методы молекулярной диагностики - иммуноанализ и ДНК-гибридизационный анализ основаны на образовании высокоспецифичных комплексов антиген-антитело или комплексов комплементарных нуклеотидных последовательностей, одна из которых является мишенью. Для выявления этих комплексов используется ряд различных физико-химических методов, основанных на измерении радиоактивного, хемилюминесцентного, колориметрического, флуоресцентного или электрохимического сигнала. В этом ряду все большее внимание привлекают методы, основанные на регистрации светового сигнала, генерируемого светоизлучающими белками — люциферазами. Преимуществом биолюминесцентных систем, по сравнению с хемилюминесцентными, является высокий квантовый выход, позволяющий производить измерения с чувствительностью, близкой или превосходящей чувствительность радиоизотопного анализа. Среди известных на сегодняшний день биолюминесцентных систем особое место занимают кальций-регулируемые фотопротеины кишечнополостных. Эти небольшие (около 20 кДа) односубъединичные белки представляют собой устойчивые комплексы из апобелка и окисленного субстрата — 2-пероксицелентеразина. В аминокислотной последовательности белка находятся 3 кальций-связывающих сайта, присоединение ионов кальция по которым вызывает практически мгновенное декарбоксилирование субстрата с выделением энергии в виде света с квантовым выходом-около 0,25.

Как показывает анализ литературных данных, исследования- по применению одного из наиболее изученных фотопротеинов — акворина. медузы Aequoria victiria, проводимые учеными ряда стран — США, Великобритании; Греции, Италии и других - демонстрируют его перспективность как репортерного белка в исследованиях внутриклеточной динамики кальциевых потоков, а также в молекулярной диагностике. Было показано успешное использование этого белка как в иммуноанализе для определения ряда биологически активных и диагностически важных веществ так и в гибридизационном анализе для тестирования инфекционных агентов, генетического полиморфизма и генетически-модифицированных продуктов. Однако несмотря на то, что к настоящему времени рекомбинантный акворин производится несколькими зарубежными фирмами, стоимость его достаточно велика, а коммерческих препаратов представляющих собой биоспецифические коньюгаты, пригодные в качестве репортеров для производства диагностикумов не существует. Это существенным образом ограничивает перспективы практического использования акворина.

В нашей стране сотрудниками лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН проводятся многолетние исследования другого фотопротеина - обелина гидроидного полипа ОЬеИа 1оп2188та. После клонирования в 1992 году кДНК обелина и получения рекомбинатного аналога этого белка была поставлена задача его всестороннего исследования в том числе и для определения перспективности создания диагностических систем на его основе.

Потребность в создании аналитических систем нового поколения — высокочувствительных, недорогих и простых для рутинного применения - в нашей стране связана с тем, что зачастую медицинские лаборатории производят диагностику либо- с помощью морально устаревающих радиоизотопных методов, либо с помощью дорогостоящих импортных систем. Последнее приводит к зависимости отечественного здравоохранения от внешних поставок и- состояния мирового рынка, что, в. конечном- счете, отражается на качестве жизни,населения.

Таким образом; сформулированная цель исследований — создание биотехнологической основы для использования рекомбинантного Са -регулируемого фотопротеина обелина в качестве репортера для биолюминесцентного микроанализа in vitro и обоснование перспективности и конкурентноспособности биолюминесцентных диагностикумов на базе этого белка — является весьма актуальной.

Для ее достижения было необходимо решить ряд экспериментальных задач и, прежде всего, разработать эффективный способ получения рекомбинантного белка, чтобы обеспечить его доступность для проведения развернутых исследований и возможного практического применения.

Для экспрессии апобелка сотрудниками лаборатории - Б.А. Илларионовым и C.B. Марковой были сконструированы несколько разных штаммов-продуцентов апобелка. Наиболее удачным ' оказался продуцент, сконструированный C.B. Марковой на базе рЕТ системы (Novagen, США) -штамм Е. coli BL21gold (pET19-OL8), который и был использован в данной работе в качестве бактериального источника рекомбинантного белка. В результате проведенных исследований был создан эффективный способ, позволяющий получить высокоочищенный рекомбинантный обелин за относительно короткий промежуток времени - процедура занимает 22-24 часов суммарного времени и может проводиться специалистами технической квалификации. С одного грамма рекомбинантных бактериальных клеток в среднем получается около 25 мг белка высокой очистки. Этого количества достаточно чтобы провести микроанализ в более чем двух тысячах стандартных 96-луночных планшетах.

Разработанный способ позволил наладить мелкооптовое производство этого белка и успешно используется на протяжении почти 10 лет для ополучения не только обелина дикого типа, но и его мутантных вариантов, а также других фотопротеинов и их мутантных форм, полученных на базе той же экспрессирующей системы.

Следующей задачей было получение коньюгатов рекомбинантного обелина с гаптенами и, другими белками, способными образовывать биоспецифические комплексы с анализируемыми молекулами.

Ассортимент современных химических реагентов, предлагаемый рядом фирм (Pierce, Sigma-Aldrich, Uptima и др.) весьма обширен и позволяет выбрать кросс-линкеры, осуществляющие соединение молекул с использованием доступных реакционно-способных групп на их поверхности - -NH2, -SH, -ОН, -СООН. Задачей экспериментатора состоит в том, чтобы подобрать такие условия коньюгирования, которые позволяют максимально сохранить специфическую активность репортерного фермента. Иногда, как это было показано для люциферазы светляка, это становится неразрешимой проблемой. В результате проведенного в работе поиска были найдены условия получения коньюгатов рекомбинантного обелина с минимальными потерями его биолюминесцентной активности, не превышающими 20-30%. При этом был получен набор коньюгатов обелина с различными гаптенами и белками. Как было показано, разработанный универсальный способ получения коньюгатов в принципе позволяет получать коньюгаты с любыми молекулами, обладающими доступными аминогруппами - от аминокислот до иммуноглобулинов.

Другим подходом для получения бифункциональных молекул, обладающих активностью репортерного белка и специфической аффинностью к молекулам-мишеням является конструирование генетически слитых (химерных) белков. С использованием этого подхода в работе был получен функционально активный химерный белок, имеющий в своем составе иммуноглобулин-связывающий фрагмент белка А и обелин. Этот белок является универсальным биолюминесцентным репортером для определения антител. В принципе, его можно использовать для скрининга аффинности вновь полученных антител на определенный антиген. Показана принциальная возможность его использования* и для определения антигенов с помощью сэндвич-иммуноанализа, если для первичной сорбции в системе используются Fab-фрагменты иммуноглобулинов.

Полученные результаты показывают, что при экспрессии апообелина в виде единой полипептидной цепи с другими полипептидами он не теряет способность формировать активный фотопротеиновый комплекс. Таким образом, показана принципиальная возможность конструирования разнообразных химерных белков, обладающих активностью обелина и биоспецифичностыо добавленных полипептидов (например, миниантител), которые без дополнительных модификаций представляют собой биолюминесцентные репортерные белки.

Модельные эксперименты показали, что полученные химические коньюгаты и генетические химеры стабильны при хранении в растворе и лиофилизированном виде и пригодны для использования как биолюминесцентных метки в твердофазном анализе. Это позволило перейти к решению третьей задачи - экспериментальному обоснованию пригодности полученных биолюминесцентных меток для иммуноанализа в сыворотках. В качестве антигенов были исследованы: онкомаркер альфафетопротеин, тиреотропин и гормон щитовидной железы - тироксин (общий и свободная форма), лютеинизирующий и фолликулостимулирующий гормоны. При этом в случае тиреотропина и тироксина были исследованы не только стандартные и контрольные сыворотки, но и сыворотки пациентов, предоставленные сотрудниками диагностического отделения эндокринологического центра Красноярской краевой больницы. Было показано, что результаты радиоизотопного анализа и биолюминесцентного анализа тиреотропина (34 клинических образца) и свободного тироксина (10 клинических образцов) близки.

Возможность биолюминесцентного определения инфекционных агентов в сыворотках, а также в водной среде была показана на примерах иммуноанализа вируса гепатита В и бактерии Shigella sonnei, а также антител к туберкулезному токсину.

В ходе работ был разработан оригинальный- способ- одновременного иммуноанализа двух антигенов в одном образце. В качестве репортеров были использованы мутантные варианты обелина с измененными спектрами биолюминесценции: «фиолетовый», с максимумом при 390 нм и «зеленый», с максимумом при 492 нм. Спектры этих белков имеют низкое перекрывание и это позволяет эффективно разделять их биолюминесцентные сигналы с помощью широкополосных оптических фильтров. Потребность в методах одновременного определения двух мишеней связана с тем, что для правильной диагностики и установлении эффективности назначенной терапии часто необходим одновременный скрининг содержания двух и более веществ. Это особенно характерно для эндокринных заболеваний, где важно не только установить содержание того или иного гормона, но и баланса между ними. Например, для диагностики нарушений функций генеративных органов всегда в паре определяют содержание лютеинизи'рующего (JIT) и фолликуло-стимулирующего (ФСГ) гормонов; при нарушениях работы щитовидной железы всегда в паре определяют ТЗ (трийодтиронин) и Т4 (тироксин), свободные и связанные формы гормонов и т.д. Причем, «раздельное» определение свободных и связанных форм гормонов может вносить существенные искажения в результаты анализа.

В представляемой работе для одновременного определения были исследованы стандартные сыворотки, содержащие смесь лютенизирующего и фолликулостимулирующего гормонов. Полученные результаты показали, что без дополнительной оптимизации условий, при использовании одних и тех же коммерчески доступных антител, значение чувствительности одновременного биолюминесцентного иммуноанализа не уступает таковой раздельного радиоиммуноанализа. При этом одновременный анализ занимает меньшее время и позволяет избежать ошибок разнесенного во времени определения.

Другим предложенным подходом для определения двух антигенов в одном образце является использование в качестве репортеров двух различных биолюминесцентных белков — обелина и целентеразин-зависимой люциферазы Metridia longa. Обнаруженная возможность применениям в качестве «субстрата» Са2+-зависимого целентеразин-связывающего белка Renilla muelleri позволяет производить запуск биолюминесцентной реакции обоих репортеров ионами кальция.

Отметим, что в состав традиционного иммунодиагностикума на основе колориметрического выявлениякак правило входят 6-7 компонентов (Таблица), часть из которых является нестабильными или агрессивными соединениями. Процедура анализа включает 4 операции. Состав ИФА набора с применением обелина должен включать только 4 компонента и проводиться с помощью 2-х операций. Таким образом предлагаемые биолюминесцентные диагностикумы на основе обелина по составу и количеству операций существенно проще для рутинного применения. Обелиновый репортер позволяет существенно сократить время анализа, поскольку исключается стадия длительного инкубирования с субстратом, а регистрация биолюминесценции обелина от каждой лунки длится всего 5 сек, т.е. на измерение 96-луночного планшета требуется 8 мин.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Франк, Людмила Алексеевна, Красноярск

1. Абелев, Г.И. Альфафетопротеин: биология, биохимия, молекулярная генетика / Г.И. Абелев // Иммунология.- 1994. № 3 - С. 4-10.

2. Бондарь, В. С. Получение, свойства и применение кальций-чувствительного фотопротеина из гидроида Obelia longissima. / B.C. Бондарь, Е.С. Высоцкий, И.А. Гамалей, А.Б. Каулин. // Цитология 1991. -Т. 33.-№6.-С. 50-58.

3. Бондарь, B.C. Физико-химические свойства фотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima / B.C. Бондарь, К.П. Трофимов, Е.С. Высоцкий // Биохимия. 1992. - Т.57. - С. 1481-1489

4. Бондарь, B.C. О роли консервативного Cysl58 при образовании активного фотопротеинового комплекса обелина / B.C. Бондарь, К.В.Пуртов, Н.П. Маликова, Л.А. Франк, Б.А. Илларионов // Биохимия. — 2001.-Т. 66.-С. 1245-1251.

5. Борисова, В.В. Высокочувствительный и быстрый метод выявления ДНК-фрагментов с использованием фотопротеина обелина как репортера / В.В. Борисова, И.А Пышная, Д.В. Пышный, Л.А. Франк.// Биоорган, химия. -2008. Vol. 34. - Р. 792-798.

6. Вербов, В.Н. Принципы твердофазного иммуноферментного анализа. // Твердофазный иммуноферментный анализ. Сборник научных трудов. Л. Изд. Института им. Пастера. 1988. 160с. С. 3-27

7. Виноградова, O.A. Повышение эффективности гибридизационного анализа путем ограниченной фрагментации ДНК-пробы / O.A. Виноградова, И.А. Пышная, В.Ф. Зарытова, Е.М. Иванова, Д.В. Пышный // Молекуляр. биология 2007. - Т. 41. - № 1. - С. 163-172.

8. Высоцкий, Е.С. Выделение и очистка Са-зависимого фотопротеина обелина из гидроидного полипа Obelia longissima I Е.С. Высоцкий, B.C. Бондарь, В.Н. Летунов // Биохимия. 1989.-Т.54. - С. 965-973.

9. Высоцкий, Е.С. Выделение и свойства различных молекулярных форм Ca2 *-активируемого фотопротеина обелина. / Е.С. Высоцкий, B.C. Бондарь, И.И. Гительзон // Докл. АН СССР. 1991. - Т. 321. - С. 214-217.

10. Ю.Высоцкий, Е.С. Кальций-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных. / Е.С. Высоцкий, C.B. Маркова, J1.A. Франк // Молекуляр. Биология. 2006. - Т.40. - № 3. - С. 404-417.

11. П.Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак М.: Мир. 2002. - 589 с.

12. Дегтярев, С.Х. Иммобилизованные олигонуклеотиды как аффинные сорбенты для эндонуклеаз рестрикции. / С.Х.' Дегтярев, П.А. Белавин, И.Г. Шишкина, В.Ф. Зарытова, Л.П. Гаврюченкова, С.Н. Морозов // Биоорган, химия 1989.-Т. 15.-№ 3. - С. 358-362.

13. Дегранян, P.A. Методическое руководство по проведению контроля качества наборов реагентов для иммуноферментного анализа. / P.A. Дегранян, Н.Ф. Калита, A.C. Роганов -М.: МЗиМП РФ. 1994.

14. Илларионов, Б. А. Клонирование и экспрессия кДНК кальций-активируемого фотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima. / Б.А. Илларионов, C.B. Маркова, B.C. Бондарь, Е.С. Высоцкий, И.И. Гительзон. //Докл. АН. 1992.- Т. 326. -№ 5. -С. 911-913.

15. H Лавин, «Эндокринология». М.: Практика, 1999. 1128 с.

16. Микеш Щ. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам. Т. 1. М.: Мир. 1982. 400 с.

17. Нго, Т.Т. Иммуноферменный анализ / Т.Т. Нго, Г.М. Ленхофф. М.: Мир, 1988.-445 с.

18. Пузырь, А.П. Получение комплекса наноалмаз-белок-оксид алюминия. / А.П. Пузырь, B.C. Бондарь, П.И. Белобров, A.A. Букаемский // Докл. РАН.- 20001 Т. 373.- С. 408-410.

19. Пышный, Д.В. Выявление однобуквенных замен в амплифицированных фрагментах ДНК путем лигирования тандемов коротких олигонуклеотидов в растворе и на твердофазном носителе./ Д.В.

20. Пышный, JI.M. Скобелыдина, Е.Н. Гущина, И.А. Пышная, И.Г. Шишкина, Г.М. Дымшиц, В.Ф. Зарытова, Е.М. Иванова // Молекуляр. биология. -2000. Т.34. - № 6. - С. 984-997.

21. Торчинский Ю.М. Сера в белках. М.: Наука. 1977.-302 с.

22. Франк, JT.A. Са -активируемый фотопротеин обелин и бактериальная люцифераза в иммунологическом микроанализе. / Л.А. Франк, B.C. Бондарь, Н.А. Тюлькова, Е.С. Высоцкий // Препринт №113Б, Красноярск: Изд-во ИФ СО РАН. 1992. - 22с.

23. Франк, Л.А. Синтез конъюгатов Са -регулируемого фото протеина обелина с иммуноглобулинами и их использование в качестве меток в иммуноанализе / Л.А Франк, А.И. Петунин, Е.С. Высоцкий // Биоорган, химия. 2004,- Т. 30.- № 4. - С. 364-368.

24. Франк Л.А. Рекомбинантный фотопротеин обелин гидроидного полипа Obelia longissima: выделение и использование в иммуноферментном анализе. // Дисс. канд. биол. наук. Красноярск. — 1997а). — 97 с.

25. Франк, Л.А. Са -активируемый фотопротеин обелин как метка в иммуноферментном анализе / Л.А. Франк, Е.С. Высоцкий, А.И. Петунин, А.В. Навдаев. // Иммунология.-1997. -№ 1. С. 55-57.

26. Actor, J.K. A flexible bioluminescent-quantitative polymerase chain reaction assay for analysis of competitive PCR amplicons. / J.K. Actor, J.R. Limor, R.L. Hunter//J. Clin. Lab. Anal. 1999. - Vol. 13.-P. 40-47.

27. Actor, J.K. Bioluminescent quantitation and detection of gene expression during infectious disease. / J.K. Actor // Comb. Chem. High Throug. Screen. -2000.-Vol. 3.- P. 277-288.

28. Ahmed, F.E. Detection of genetically modified organisms in food. / F.E Ahmed // Trends in Biotechnol. 2002 - Vol. 20. No.5. -. P. 215-223

29. Adamczyk, M. Dual analyte detection using tandem flash luminescence / M. Adamczyk, J.A. Moore, K. Shreder // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002. - Vol. 12.-P. 395-398.

30. Alard, P. A versatile ELISA-PCR assay for mRNA quantitation from a few cells. / P. Alard, O. Lantz, M. Sebagh, C.F. Calvo, D. Weill, G. Chavanel, A. Senik, B. Charpentier // Biotechniques.— 1993 -Vol. 15. -No.4.-P. 730-737.

31. Allen D.G Aequorin luminescence: relation of light emission to calcium concentration—a calcium-independent component. / D.G. Allen, J.R. Blinks, F.G. Prendergast // Science 1977. - Vol. 195 (4282). - P. 996-998.

32. Altmann, F. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins / F. Altmann, E. Staudacher, I. B. Wilson, L. März. // Glycoconj. J.- 1999.-Vol. 16.-P. 109-123.

33. Belogurova, N.V. Spectral components of bioluminescence of aequorin and obelin / N.V. Belogurova, N.S. Kudryasheva, R.R. Alieva, A.G. Sizykh // J. Photochem. Photobiol. B. 2008. - Vol. 92. - P. 117-122:

34. Bieniarz, C. Extended length heterobifunctional coupling agents for protein conjugations / C. Bieniarz, V. Husain, G. Barnes, C.A. King, C.J. Welch. // Bioconjugate Chem. -1996 Vo. 6 - P. 88-95.

35. Blinks, J.R. Measurement of Ca++ concentrations in living cells / J.R. Blinks, W.G. Wier, P. Hess, F.G. Prendergast // Prog. Biophys. Mol. Biol. 1982. -Vol. 40.-P. 1-114.

36. Blinks, J.R. Intracellular Ca2+ measurements / J.R. Blinks. // The Hart and Cardiovascular System. Eds. Fozzard H.A. et al. Raven Press, New York, -1986.-P. 671-701.

37. Borisova, V. V. Recombinant Metridia luciferase isoforms: expression, refolding and applicability for in vitro assay. / V. V. Borisova, L. A. Frank, S. V. Markova, L. P. Burakova, E. S. Vysotski // Photochem. Photobiol. Sci.2008.-Vol. 7.-P. 1025-1031

38. Campbell, A.K. Extraction, partial purification and properties of obelin, the calcium-activated luminescent protein from hydroid Obelia geniculata. / A.K. Campbell. 11 Biochem. J. 1974. -Vol. 143. - P. 411-418

39. Casadei, J. Characterization of a chimeric aequorin molecule expressed in myeloma cells. / J. Casadei, M.J. Powell, J.H. Kenten // J. Biolumin. Chemilumin. 1989. - Vol. 4. - P. 346-350.

40. Casadei, J. Expression and secretion of aequorin as a chimeric antibody by means of a mammalian expression vector. / J. Casadei, M. J. Powell, J. H. Kenten. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - P. 2047-2051

41. Gingeras, T.R. Fifty years of molecular (DNA/RNA) diagnostics. / T.G. Gingeras, R. Higuchi, L.J. Kricka, Y.M.D. Lo, C.T. Wittner. // Clin. Chem. 2005.-Vol. 51.-P. 661-671.

42. Cormier, M.J. The enzymology and molecular biology of the Ca" -activated photoprotein, aequorin. / M.J. Cormier, D.C. Prasher, M. Longiaru, R.O. McCann. // Photochem.Photobiol. -1989. Vol. 49. - P. 509-512.

43. Christopoulos, T.K. Expression immunoassay. Antigen quantitation using antibodies labeled with enzyme-coding DNA fragments. / T.K. Christopoulos, N.H.L. Chiu // Anal. Chem. 1995. - Vol 67.- P. 4290-4294.rj T

44. Deng, L. Structural basis for the emission of violet bioluminescence from a W92F obelin mutant / L. Deng, E.S. Vysotski, Z.-J. Liu, S.V. Markova, N.P. Malikova, J. Lee, B.-C. Wang // FEBS Lett. 2001. - Vol. 506. -P. 281-285.

45. Deo, S.K. Bioluminescence detection of proteolytic bond cleavage by using recombinant aequorin. / S.K. Deo, J.C. Lewis, S. Daunert // Anal. Biochem -2000.- Vol. 281.-P. 87-94.

46. Deo, S.K. C-terminal and N-terminal fusions of aequorin with small peptides in immunoassay development. / S.K. Deo, J.C. Lewis, S. Daunert // Bioconjugate Chem. -2001.- Vol. 12. P. 378-384.

47. Deo, S.K. An immunoassay for Leu-enkephalin based on a C-terminal aequorin-peptide / S.K. Deo, S. Daunert. // Anal. Chem. 2001a).- Vol. 73. -P. 1903-1908.

48. Doleman, L. Bioluminescence DNA hybridization assay for Plasmodium falciparum based on the photoprotein aequorin / L. Doleman, L. Davies, E.A. Moschou, L. Rowe, S. Deo, S. Daunert // Anal. Chem. 2007. - Vol. 79. - P. 4149-4153.

49. Drake, D. R. Patterns of expression of viral and cytokine gene transcripts during mouse polyoma virus infection. / D. R. Drake, L. Knoepp, J. K. Actor,

50. A. E. Lukacher. // Comb. Chem. High Throug. Screen. 2000. - Vol. 3. - P. 329-341.

51. Elenis, D.S. Quadruple-analyte chemiluminetric hybridization assay. Application to double quantitative competitive polymerase chain reaction. / D.S. Elenis, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulos. // Anal. Chem. 2007 - Vol. 79. - No. 24. - P. 9433-9440.

52. Elenis, D.S. Advances in molecular techniques for detection of genetically modified organisms. / D.S. Elenis, D.P. Kalogianni, K. Glynou, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulos. // Anal. Bioanal. Chem. -2008. Vol. 392. - P. 347-354.

53. Erikaku, T. Bioluminescent immunoassay using a monomeric Fabphotoprotein aequorin conjugate / T. Erikaku, S. Zenno, S. Inouye // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. - Vol. 174.-No. 3.-P.1331-1336.

54. Fagan, T.F. Cloning, expression and sequence analysis of cDNA for the Ca2+-binding photoprotein, mitrocomin / T.F. Fagan, Y. Ohmiya, J.R. Blinks, S. Inouye, F.I. Tsuji. //FEBS Lett. 1993. - Vol. 333. - P. 301-305.

55. Ford, C. F. Fusion tails for the recovery and purification of recombinant proteins. / C. F. Ford, I. Suominen, C.E. Glatz // Protein Expr. Purif. — 1991. — Vol. 2.-P. 95-107.

56. Feltus, A. Interaction of immobilized avidin with an aequorin-biotin conjugate: an aequorin-linked assay for biotin / A. Feltus, S. Ramanathan, S. Daunert // Anal. Biochem. 1997. - Vol. 254. - P. 62-68

57. Feltus, A. Detection of biotin in individual sea urchin oocytes using a bioluminescence binding assay / A. Feltus, A.L. Grosvenor, R.C. Conover, K.W. Anderson, S. Daunert//Anal. Chem. -2001. Vol. 73. -P. 1403-1407

58. Frank, L.A. Use of proZZ-obelin fusion protein in bioluminescent immunoassay. / L.A. Frank, V.A. Illarionova, E.S. Vysotski // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996.- Vol. 219. - P. 475-479.

59. Frank, L.A. Bioluminescent immunoassay of thyrotropin and thyroxine using obelin as a label / L.A. Frank, A.I. Petunin, E.S. Vysotski. // Anal. Biochem. -2004. Vol. 305. - P. 240-246.

60. Frank, L. Bioluminescent signal system: bioluminescence immunoassay of pathogenic organisms. / L.Frank, S. Markova, N. Remmel, E. Vysotski, I. Gitelson // Luminescence. 2007. - Vol. 22. - P. 215-220.

61. Friedhoff, P. Quantitative polymerase chain reaction with oligodeoxynucleotide ligation assay/enzyme-linked immunosorbent assay detection. / P. Friedhoff, M. Hahn, H. Wolfes, A. Pingoud // Anal. Biochem. -1993.-Vol. 15.-P. 9-16.

62. Galvan, B. Bioluminescence hybridization assays using recombinant aequorin. Application to the detection of prostate-specific antigen mRNA. / B. Gal van, T.K. Christopoulus // Anal. Chem. 1996. - Vol. 68. - P. 3545-3550.

63. Glynou, K. Affinity capture-facilitated preparation of aequorin-oligonucleotede conjugates for rapid hybridization assays. / K. Glynou, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulus. // Bioconjugate Chem. 2003.- Vol. 14. - P. 1024-1029.

64. Glynou, K. One-step purification and refolding of recombinant photoprotein aequorin by immobilized metal-ion affinity chromatography. / K. Glynou, P. C.Ioannou, T. K.Christopoulos // Protein Expr. Purif. 2003a). - Vol .27. - P 384-390.

65. Gorokhovatsky, A. Y. Cell-free bioluminescent screening of translation inhibitors. / A. Y. Gorokhovatsky, L.A. Shaloiko, V.S. Bondar, E.S. Vysotski, E.E. Maximov, H. von Doehren, Y.B. Alakhov // Biotechnol. Appl. Biochem. 1998. - Vol. 27. - P. 259-263.

66. Green, N.M. Spectrophotometric determination of avidin and biotin / N.M. Green // Meth. Enzym. 1970. - Vol. 18 - P. 418-424.

67. Guenthner, P.C. Quantitative, competitive PCR assay for HIV-1 using a microplate-based detection system. / P.C. Guenthner, C.E. Hart // Biotechniques. 1998. - Vol. 24. - P. 810-816.

68. Hastings, J.W. Total quantum flux of isotopic sources / J.W. Hastings, G. Weber //J. Opt. Soc. Am. 1963.-Vol. 53.-P.1410-1415.

69. Hastings, J.W. Calcium-triggered light emission in Renilla. A unitary biochemical scheme for coelenterate bioluminescence / J.W. Hastings, J.G.

70. Morin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1969. Vol. 37. No. 3. - P. 493438.

71. Hastings, J.W. Bioluminescence / J.W. Hastings // In "Cell Physiology". 3rd edition. Ed.: N. Sperelakis. Academic Press. NY. 2001. - P. 1115-1130.

72. Head, J.F. The crystal structure of the photoprotein aequorin at 2.3 angstrom resolution. / J.F. Head, S. Inouye, K. Teranishi, O. Shimomura. // Nature. -2000. Vol. 405. - P. 372-376.

73. Hirano, T. Revision of the structure of the light-emitter in aequorin bioluminescence / T. Hirano, I. Mizoguchi, M. Yamaguchi, F.-Q. Chen, M. Ohashi, Y. Ohmia, F.I. Tsuji // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1994.- P. 165-167.

74. Hockney, R.C. Recent developments in heterologous protein production in Escherichia coli / R.C. Hockney // Trends Biotechnol. 1994 - Vol. 12. - No. 11.-P. 456-463

75. Ho, J. A. Application of liposomal bioluminescent label in the development of a flow injection immunoanalytical system. / J.A. Ho, M.-R. Huang // Anal. Chem. 2005. - Vol. 77. - P. 3431 -3436.

76. Hori, K. Structure and chemical synthesis of a biologically active form of Renilla (Sea Pansy) luciferin. / K. Hori, M.J. Cormier. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1973.-Vol. 70.-P. 120-123.

77. Hori, K. Renilla luciferin as the substrate for calcium induced photoprotein bioluminescence. Assignment of luciferin tautomers in aequorin and mnemiopsin / K. Hori, J.M. Anderson, W.W. Ward, M.J. Cormier // Biochemistry 1975. - Vol. 14. - P.2371-2376.

78. Hori, K. Sructure of native Renilla reniformis luciferin. / K. Hori, H. Charbonneau, R.C. Hart, M.J. Cormier//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. -Vol. 74. - P. 4285-4287.

79. Inouye S. Overexpression and purification of the recombinant Ca -binding photoprotein, aequorin / S. Inouye , S. Aoyama , T. Miyata, F.I. Tsuji, Y. Sakaki. // J. Biochem. 1989. - Vol. 105 .- P .473-477

80. Inouye, S. High-level expression and purification of apoaequorin./ S. Inouye,

81. S. Zenno, Y. Sakaki, F.I. Tsuji. // Protein Expr.Purif.-1991.-Vol.2.-P.122-126.i

82. Inouye, S. Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca -activated photoprotein, clytin / S. Inouye, F.I. Tsuji. // FEBS Lett. -1993. Vol. 315. -P. 343-346.

83. Inouye, S. Soluble protein expression in E. coli cells using IgG-binding domain of protein A as a solubilizing partner in the cold induced system / S. Inouye, Y. Sahara. // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2008. — Vol. 376 — P. 448-453.

84. Inouye, S. Cloning, expression, purification and characterization of an isotype of clytin, a calcium-binding photoprotein from the luminous hydromedusa Clytia gregarium. / S. Inouye // J. Biochem. 2008a).- Vol. 143.- No. 5 - P. 711-717.

85. Inouye, S. Recombinant aequorin with a reactive cysteine residue for conjugation with maleimide-activated antibody. / S. Inouye, J. Sato // Anal. Biochem. 20086). - Vol. 378.- No. 1. - P. 105-107.

86. Jackson, R.J. Lumonometry: a novel bioluminescent immunoassay enhances the quantitation of mucosal and systematic antibody responses / R.J. Jackson, K. Fujihashi, H. Kiyono, J.R. McGhee // J. Immunol. Meth. 1996. - Vol. 190.-P. 189-197.

87. Jaenicke, R. Folding proteins. / R. Jaenicke, R. Rudolph // In: Protein structure: a practical approach. Ed.: T.E. Creighton. IRL Press. Oxford. — 1995. -P. 191-223.

88. Jones, K. Glowing jellyfish, luminescence and a molecule called coelenterazine. / K. Jones, F. Hibbert, M. Keenan // Trends Biotechnol. -1999. -Vol. 17.-P. 477-481.

89. Jue, R. Addition of sulfhydryl groups to Esherichia coli ribosomes by protein modification with 2-iminothiolane (methyl 4-mercaptobutyrimidate). / R. Jue, J.M. Lambert, L.R. Pierce, R.R. Traut. // Biochemistry. 1978. - Vol. 17. - P. 5399-5406.

90. Kakoi, H. Synthesis of 2-amino-3-benzyl-5-(p-hydroxyphenyl) pyrazine. / H. Kakoi // Chem. Pharm. Bull. 2002. -Vol. 50. - P. 301-302.

91. Keenan, M. Highly efficient and flexible total synthesis of coelenterazine / M. Keenan, K. Jones, F. Hibbert// Chem. Commun. -1997. P. 323-324.

92. Keenan, M. Highly efficient and flexible total synthesis of coelenterazine / M. Keenan, K. Jones, Hibbert F. // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1997. - P. 323-324.

93. Khanna, M. Multiplex PCR/LDR for detection of K-ras mutations in primary colon tumors. / M. Khanna, P. Park, M. Zirvi, W. Cao, A. Picon, J. Day, P. Paty, F. Barany. // Oncogene. 1999. - Vol. 18. - P. 27 - 38.

94. Kishi, Y. Cypridina bioluminescence III. Total synthesis of Cypridina luciferin. / Y. Kishi, T. Goto, S. Inoue, S. Sagiura, H. Kishimoto. // Tetrahedron Lett. -1966. Vol. 29. - P. 3445-3450.

95. Konstantinou, J. Genotyping of single nucleotide polymorphisms by primer extension reaction and dual-analyte bio/chemiluminometric assay / J. Konstantinou, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulos // Anal. Bioanal. Chem. -2007. Vol. 388. - P. 1747-1754.

96. Kopp, P. Perspective: genetic defects in the etiology of congenital hypothyroidism / P. Kopp // Endocrinology. 2002. - Vol. 143. - P. 20192024.

97. Kricka, L.J. Clinical and biochemical applications of luciferases and luciferins. / L.J. Kricka. // Anal. Biochem. 1988. - Vol. 175. - P. 14-21.

98. Krotkiewski, M. Thyroid hormones in the pathogenesis and treatment of obesity / M. Krotkiewski // Eur. J. Pharmacol. 2002. - Vol. 440. - P. 85-98.

99. Kurose, K. Bioluminescence of the Ca2+-binding photoprotein aequorin after cysteine modification / K. Kurose, S. Inouye, Y. Sakaki, F. Tsuji // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1989.-Vol. 86.-No. l.-P. 80-84.

100. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4 / U.K. Laemli // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680-685

101. Laios, E. Enzyme-amplified aequorin-based bioluminometric hybridization assays / E. Laios, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulus // Anal. Chem 2001. — Vol. 73.-P. 689-692.

102. Laios, E. Novel hybridization assay configurations based on in vitro expression of DNA reporter molecules. / E. Laios, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulus // Clin. Biochem. 1998. -Vol. 31. - P. 151-158.

103. Langone, J.J. Protein A of Staphylococcus aureus and related immunoglobulin receptors produced by streptococci and pneumonococci. / J.J. Langone // Adv. Immunol. 1982. - Vol. 32. -P. 157-252.

104. Law, G.H.E. Mutagenesis of solvent-exposed amino acids in Photinus pyralis luciferase improves thermostability and pH-tolerance / G.H.E. Law, O.A. Gandelman, L.C Tisi, C.R. Lowe, J.A.H. Murray // Biochem.J. 2006. - Vol. 397.-P. 305-312.

105. Lewis, J.C. Bioluminescence and secondary structure properties of aequorin mutants produced for site-specific conjugation and immobilization (part I) / J.C. Lewis, J.J. Lopez-Moya, S. Daunert // Bioconjugate Chem. — 2000a). -Vol. 11.-P. 65-70.

106. Lewis, J.C. Photoproteins as luminescenct labels in binding assay./ J.C. Lewis, S. Daunert // Fresenius J. Anal. Chem. 2000. - Vol. 366.- P. 760-768.

107. Liu, Z.J. Structure of the Ca2+-regulated photoprotein obelin at 1.7 Ä resolution determined directly from its sulfur substructure. / Z.J. Liu, E.S. Vysotski, C.J. Chen, J.P. Rose, J. Lee, B.C. Wang // Protein Sci. 2000. - Vol. 9.-P. 2085-2093.

108. Loening, A.M. Consensus guided mutagenesis of Renilla luciferase yields enhanced stability and light output / A.M. Loening, T.D. Fenn, A.M. Wul, S.S. Gambhir // Protein Eng. Des. Sei. 2006. - Vol. 19. - P. 391-400

109. Lomzov, A.A. Influence of Na2+ and Mg2+ ions on terminal stability of oligonucleotide duplexes / A.A. Lomzov, D.V. Pyshnyi // J. Biomol. Struct. Dyn. 2007. - Vol. 24. - No. 6. - P. 679-680.

110. Malikova, N.P. Structural tuning of obelin bioluminescence by mutations of Trp92 / N.P. Malikova, G.A. Stepanyuk, L.A. Frank, S.V. Markova, E.S.Vysotski, J. Lee. // FEBS Letters. 2003. - Vol. 554. - P. 184-188.

111. Manukhov, V. Folding and refolding of thermolabile and thermostable bacterial luciferases: the role of DnaKJ heat-shock proteins / V. Manukhov, G.E. Eroshnikov, M.Yu. Vyssokikh, G.B. Zavilgelsky // FEBS Letters. 1999. -Vol. 448.-P. 265-268.

112. Markova, S.V. Cloning and expression of cDNA for a luciferase from the marine copepod Metridia longa / S.V. Markova, S. Golz, L.A. Frank, B. Kalthof, E.S. Vysotski. // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279. - P. 3212-3217.

113. Martin, C.S. Quantitation of PCR products with chemiluminescence./ C.S. Martin, L. Butler, I. Bronstein // Biotechniques 1995. - Vol. 18. - No.5. - P. 908-913.

114. Matveev, S.V. Obelin mRNA — a new tool for studies of translation in cellfree systems. / S.V. Matveev, B.A. Illarionov, E.S. Vysotski, V.S. Bondar, S.V. Varkova, Y.B. Alakhov. // Anal. Biochem. 1995. - Vol. 231. - P. 34-39.

115. Mavropoulou, A.K. High-throughput double quantitative competitive polymerase chain reaction for determination of genetically modified organisms. / A.K. Mavropoulou, T. Koraki, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulos //Anal. Chem.-2005.-Vol. 77.-P. 4785-4791.

116. Morin, J.G. Biochemistry of the colonial hydroids and other coelenterates. / J.G. Morin, J.W. Hastings // J. Cell. Physiol. 1971. Vol. 77.- No. 3. - P. 305311.

117. Morin, J.G. Coelenterate bioluminescence. / J.G. Morin, // In: Coelenterate Biology: Reviews and New Perspectives. Eds: L. Muscatine, H.M. Lenhoff. Acad. Press. NY. 1974. - P. 397-438.

118. Morrison, C. The impact of the PCR plateau phase on quantitative PCR. / C. Morrison, F. Gannon // Biochim. Biophys. Acta. 1994. - Vol. 1219. - P. 493498.

119. Musicki, B. Structure of the functional part of photoprotein aequorin. / B. Musicki, Y. Kishi, O. Shimomura. // J. Chem.Soc. Chem. Commun. 1986. -P. 1566-1568.

120. Nilsson B, Forsberg G, Hartmanis M. Expression and purification of recombinant insulin-like growth factors from Escherichia coli. // Methods Enzymol.-1991.-Vol. 198.-P. 3-16.

121. Nomura, M. A C-terminal proline is required for bioluminescence of the Ca2+ binding photoprotein, aequorin./ M. Nomura, S. Inouye, Y. Ohmiya, F.I. Tsu i.// FEBS Lett. 1991. - Vol. 295. - P. 63-66

122. Ohmiya, Y. Two excited states in aequorin bioluminescence induced by tryptophan modification / Y. Ohmiya, M. Ohashi, Tsuji F.I. // FEBS Lett. -Vol. 301.-P. 197-201.

123. Piatak, M. Jr. Quantitative competitive polymerase chain reaction for accurate quantitation of HIV DNA and RNA species. / M.Jr. Piatak, K.C. Luk, B. Williams, J.D. Lifson//Biotechniques. 1993. - Vol. 14.-P. 70-81.

124. Prasher, D.C. Sequence comparison of complementary DNAs encoding aequorin izotypes / D.C Prasher, R.O. McCann, M. Longiaru, M.J. Cormier. // Biochemistry. 1987.-Vol. 26.-No. 5.-P. 1326-1332.

125. Prendergast, F.G. Bioluminescence illuminated / F.G Prendergast F.G. // Nature. 2000.- Vol. 405. - P. 291-293.

126. Reading, N.S. Engineering a disulfide bond in recombinant manganese peroxidase results in increased thermostability / N.S. Reading, S.D. Aust // Biotechnol. Prog. 2000. - Vol. 16. - P. 326-333.

127. Rudolf, R. In vitro folding of inclusion body proteins / R. Rudolf, H. Lilie // The FASEB Journal. 1996. - Vol. 10. - P. 49-56.

128. Sgoutas, D.S. AquaLite bioluminescence assay of thyrotropin in serum evaluated / D.S. Sgoutas, T.E. Tuten, A.A. Verras, A. Love, E.G. Barton. // Clin. Chem.- 1995.-Vol. 41.-No. 11.-P. 1637-1643.

129. Shimomura, O. Extraction and properties of halistaurin, a bioluminescent protein from the hydromedusan, Halistaura. / Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. // J. Cell. Comp. Physiol. 1963. - Vol. 62 - P. 9-15.

130. Shimomura, O. Partial purification and properties of the Chaetopterus luminescence system / O. Shimomura, F.H. Johnson. // In: Bioluminescence in Progress. Eds: F.H. Johnson, Y. Haneda. Princeton University Press. Princeton. NJ. — 1966. — P.495-521/

131. Shimomura, O. Properties of the bioluminescent protein aequorin. / O. Shimomura, F.H. Johnson // Biochemistry. 1969. - Vol: 8. - P. 3991-3997.

132. Shimomura, O. Mechanism of the luminescent intramolecular reaction of aequorin / O. Shimomura, F.H. Johnson H. Morise// Biochemistry. — 1974. — Vol. 13.-P. 3278-3286/

133. Shimomura, O. Regeneration of the photoprotein aequorin. / O. Shimomura, F.H. Johnson//Nature. 1975. - Vol. 256. - P. 236-239.

134. Shimomura, O. Chemical nature of bioluminescence systems in Coelenterates. / O. Shimomura, F.H. Johnson // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1975a).-Vol. 72.-P. 1546-1549.

135. Shimomura, O. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin / O. Shimomura, F.H. Johnson // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978.-Vol. 75.-P. 2611-2615.

136. Shimomura, O. Recombinant aequorin and recombinant semi-synthetic aeguorins. Cellular Ca~ indicators. / O. Shimomura, S. Inouey, B. Musicki, Y. Kisho//Biochem. J. 1990. - Vol. 270. - No. 1. - P. 309-312.

137. Shimomura, O. A short story of aequorin / O. Shimomura. // Biol. Bull.1995.-Vol. 189 .-P. 1-5.

138. Shimomura, O. Cause of spectral variation in the luminescence semisynthetic aequorins / O.Shimomura // Biochem. J. 1995a). - Vol. 306. - P. 537-543.

139. Shimomura, O. Light-emitters involved in the luminescence of coelenterazine. / O. Shimomura, K. Teranishi. // Luminescence. — 2000. —Vol 15.-P. 51-58.

140. Siddiqi, A.M. Evaluation of electrochemiluminescence- and bioluminescence-based assays for quantitating specific DNA. / A.M. Siddiqi, V.M. Jennings, M.R. Kidd, J.K. Actor, R.L. Hunter // J. Clin. Lab. Anal.1996.-Vol. 10.-P. 423-431.

141. Singh, S.M. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins / S.M. Singh, A.K. Panda // J. Biosci. Bioeng. 2005 - Vol. 99 - P. 303-310.

142. Smith, D.F. Recombinant aequorin, a bioluminescent signal for molecular-diagnostics / D.F. Smith, N.L. Stults, M.J. Cormier, J.K. Actor // J. Clin. Ligand Assay 1999.-Vol. 22.-P. 158-172.

143. Song, X. Quantitation of Chlamidia trachomatis 16S rRNA using NASBA amplification and a bioluminescent mirotiter plate assay I X. Song, B.K. Coombes, J.B. Mahony // Comb. Chem. High Throug. Screen. 2000. - Vol. 3.-P. 303-313.

144. Taniguchi, A. Competitive RT-PCR ELISA: a rapid, sensitive and nonradioactive method to quantitate cytokine mRNA / A. Taniguchi, H. Konsaka, D.A. Carson//J. Immunol. Meth. 1994. - Vol. 169. - P. 101-109.

145. Tannous, B.A. Combined flash and"glow-type chemiluminescent reaction for high-througput genotyping of biallelic polymorphism./ B.A. Tannous, M.

146. Verhaegen, T.K. Christopoulos, A. Kourakli // Anal. Biochem. 2003.- Vol. 320. - P. 266-272.

147. Tatsumi, H. Construction of biotinylated firefly luciferases using biotin acceptor peptides / H.Tatsumi, S.Fukuda, M. Kikuchi, Y. Koyama. // Anal. Biochem. 1996. - Vol. 243. - P. 176-180.

148. Teranishi, K. Luminescence of imidazol,2-a.pyrazin-3(7H)-one compounds. / K. Teranishi. // Bioorganic Chem. -2007. Vol. 35. - P. 82-111.

149. Tsuji, F.I. Molecular evolution of the Ca~ -binding photoproteins of the Hydrozoa. / F.I. Tsuji, Y. Ohmia, T.F. Fafan, H. Toh, S. Inouye. // Photochem. Photobiol. 1995. - Vol. 62. - No. 4 - P. 657-661.

150. Tsuzuki, K. Thermostable mutants of the photoprotein aequorin obtained by in vitro evolution / K. Tsuzuki, L. Tricoire, O. Courjean, N. Gibelin, J. Rossier, B. Lamboler. //J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280. - P. 34324-34331.

151. Verhaegen, M. Bacterial expression of in v/vo-biotinylated aequorin for direct application to bioluminometric hybridization assays / M. Verhaegen, T.K. Christopoulos // Anal. Biochem. 2002. - V. 306. - P. 314-322.

152. Verhaegen, M. Recombinant Gaussia luciferase. Overexpression, purification and analytical application of a bioluminescent reporter for DNA hybridization. / M Verhaegen, T.K. Christopoulos. // Anal Chem. 2002a). Vol. 74. - P. 4378-4385.

153. Vysotski, E.S. Mn2+-activated luminescence of photoprotein obelin. / E.S. Vysotski, C.P. Trofimov, V.S. Bondar, L.A. Frank, S.V. Markova, B.A. Illarionov // Arch. Biochem. Biophys. Vol. 315. - 1995. - P. 92-99.

154. Vysotski, E.S. Ca~ -regulated photoproteins: Structural insight into the bioluminescence mechanism / E.S. Vysotski, J. Lee // Acc. Chem. Res. 2004. -Vol. 37.-P. 405-415.

155. Ward, W.W. Extraction and purification of calcium-activated photoproteins from the ctenophores Mnemiopsis sp. and Beroe ovata / W.W. Ward, H.H. Seliger // Biochemistry. 1974.- Vol. 13. No. 7. - P. 1491-1499.

156. Wiesner, R.J. Quantitative PCR. / R.J. Wiesner, B. Beinbrech, J.C. Riiegg // Nature. 1993. - Vol. 366. - P. 416-423.

157. White, S.R. Signal amplification system for DNA hybridization assays based on in vitro expression of a DNA label encoding apoaequorin / S.R. White, T.K. Christopoulos // Nucl. Acids Res. 1999. - Vol. 27. - No. 19. P. e25.

158. White, S.R. Expression immunoassay. / S.R. White, N.H.L. Chui, T.K. Christopoulos // Methods. 2000. - P. 24-32.

159. Wilchek, M. Avidin-biotin technology ten years on: has it lived up to its expectation? / M: Wilchek, E.A. Bayer // TBS. 1989. -Vol. 14. - No. 10. - P. 408-412.

160. Zatta, P.F. A new bioluminescent assay for studies of protein G and protein A binding to IgG and IgM. / P.F. Zatta // J. Biochem. Biophys. Meth. 1996. -Vol. 32.-P. 7-13.

161. Zenno, S. Bioluminescent immunoassay using a fusion protein and the photoprotein aequorin / S. Zenno, S. Inouye // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. -Vol. 171.-P. 169-174.

162. Xiao,' L. Quantitation of RT-PCR amplified cytokine mRNA by aequorin-based bioluminescence immunoassay / L. Xiao, C. Yang, C.O. Nelson, B.P. Holloway, V. Udhayakumar, A.A Lai. // Immunol. Methods. 1996. - Vol. 199.-P. 139-147.

Информация о работе

Франк, Людмила Алексеевна
доктора биологических наук
Красноярск, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Биолюминесцентный молекулярный микроанализ на основе Ca2+-регулируемого фотопротеина обелина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы