Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Формирование активного фотопротеинового комплекса на примере обелина и акворина и их мутантных форм

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Формирование активного фотопротеинового комплекса на примере обелина и акворина и их мутантных форм"

На правах рукописи

Еремеева Елена Владимировна

ФОРМИРОВАНИЕ АКТИВНОГО ФОТОПРОТЕИНОВОГО КОМПЛЕКСА НА ПРИМЕРЕ ОБЕЛИНА И АКВОРИНА И ИХ МУТАНТНЫХ ФОРМ

03.01.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ИМ46И7063

Красноярск-2010

004607063

Работа выполнена в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН, г. Красноярск

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Высоцкий Евгений Степанович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Гаевский Николай Александрович

Кандидат биологических наук Межевикин Владислав

Валентинович

Ведущая организация:

Государственное учебно-научное учреждение Химический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Защита состоится « ^ » 2010 г. в /О час. на заседании диссерт

ционного совета Д 003.007.01 в Институте биофизики СО РАН по адрес 660036, г. Красноярск, Академгородок, д. 50, стр. 50. С диссертацией мож ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН.

Автореферат разослан « 6 » 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Франк Л.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на то, что биолюминесценция была открыта более 100 лет назад, интерес ученых к изучению этого явления не только не ослабевает, но и возрастает. Главным образом это обусловлено тем, что в настоящее время биолюминесцентные белки нашли широкое аналитическое применение в различных областях. Поскольку свет с помощью современных регистрирующих приборов может быть измерен с высокой чувствительностью, методы с использованием биолюминесцентных белков позволяют измерять вещества даже ниже 10"18 моля.

Биолюминесценция - явление, широко представленное в природе и присущее многим организмам в различных филогенетических ветвях: от бактерий до рыб. Широко распространены виды, использующие в качестве субстрата биолюминесцентной реакции целентеразин: это мягкий коралл ЯепШа, креветки ОрЬрЬогия, медузы РепрЪуИа, коиеподы Саы.ча1а и МеМсНа, остракоды СопсЬоеаа, цефалоподы Уатруго1еи!к1,ч и другие. Наиболее изученными белками, использующими целентеразин в качестве субстрата, являются Са2+-регулируемые фотопротеины, ответственные за свечение ряда морских кишечнополостных организмов.

Все Са2 -регулируемые фотопротеины, исследованные к настоящему времени, демонстрируют высокую степень гомологии как аминокислотных последовательностей, так и пространственных структур. Фотопротеины являются односубъединичными белками (~22 кДа), содержащими три Са2+-связывающих центра «Г.К-Ьапс!» типа. Фотопротеины представляют собой стабильный фермент-субстратный комплекс, состоящий из апофотопротеина, и молекулы органического субстрата - преактивированного кислородом целентеразина (2-гидропероксицелентеразина), который прочно, но нековалентно связан с белком. Связывание ионов кальция с фотопротеином, приводящее к изменению конформации белка, запускает реакцию декарбоксилирования 2-гидропероксицелентеразина, в результате которой образуется целентерамид в возбужденном состоянии и С02. Переход целентерамида из возбужденного состояния в основное сопровождается излучением кванта света.

Предыдущие исследования фотопротеинов были направлены в основном на изучение механизма биолюминесценции, и в данной области был достигнут значительный прогресс. Однако, несмотря на широкое применение рекомби-нантных фотопротеинов, процесс формирования активного фермент-субстратного комплекса из апофотопротеина, целентеразина и кислорода все (

еще очень слабо изучен, и его молекулярный механизм по-прежнему остается загадкой.

Выяснение молекулярного механизма формирования активного фотопротеинового комплекса, безусловно, имеет и фундаментальное, и прикладное значение, так как является необходимым шагом в понимании механизма биолюминесценции и, в перспективе, будет способствовать существенному повышению эффективности аналитического применения фотопротеинов, в особенности при их использовании в качестве репортерных молекул in vivo. Цель и задачи исследования. Целью представленной работы являлось исследование процесса образования активного -регулируемого фотопротеина из апобелка, целентеразина и кислорода, а также функциональной роли отдельных аминокислотных остатков активного центра фотопротеинов в этом процессе. Выполнение данного исследования требовало:

1. Исследовать кинетические характеристики образования активного фотопротеинового комплекса на примере формирования активного обелина и акворина из апобелка, целентеразина и молекулярного кислорода и разработать математическую модель, описывающую этот процесс.

2. Для выявления функциональной роли аминокислот целентеразин-связывающей полости в формировании активного фотопротеина методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза получить мутанты обелина и акворина с заменами His 175, Тгр179 и Туг190 на остатки с различными донорно-акцепторными свойствами боковых цепей, выделить мутантные белки в гомогенном виде и изучить их основные физико-химические свойства.

При решении поставленных задач были получены новые результаты, которые выносятся на защиту:

1. Образование активного фотопротеинового комплекса является двухста-дийным процессом, в котором первый этап соответствует формированию комплекса между апофотопротеином и целентеразином и занимает миллисекунды. Вторая стадия соответствует конвертации связанного целентеразина в 2-гидропероксицелентеразин и занимает от нескольких десятков минут до нескольких часов в зависимости от состояния апобелка и условий инкубации с субстратом, что свидетельствует о том, что данная стадия является лимитирующей в образовании активного фотопротеина.

2. Согласно предложенному механизму образования активного фотопротеинового комплекса, His 175 выполняет функцию переносчика протона

от Ы7-атома азота на С2-атом углерода целентеразина, а Туг138 обеспечивает позиционирование молекулы кислорода возле протонированного С2-атома углерода, необходимое для образования 2-гидропероксицелентеразина. Научная новизна и практическая ценность работы. Все результаты, представленные в данной работе, получены впервые и имеют фундаментальный характер, поскольку добавляют новую информацию к пониманию механизма образования активного фотопротеинового комплекса. Кроме того, полученные результаты могут найти применение в прикладных исследованиях. К примеру, возможность управлять процессом образования активного фотопротеинового комплекса чрезвычайно важна для использования фотопротеинов в качестве репортерных молекул in vivo, так как фотопротеины экспрессируются внутри клетки-мишени в форме апобелков и там же конвертируются в форму активного фотопротеина инкубацией с экзогенным целентеразином. Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на Международных симпозиумах по Биолюминесценции и Хемилюминесценции (Сан-Диего, США, 2006; Шанхай, Китай, 2008; Лион, Франция, 2010), на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН, департамента биохимии Университета Вагенингена (Вагенинген, Нидерланды) и Национальной лаборатории Биомакромолекул Института биофизики Китайской академии наук (Пекин, Китай).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ. Структура и объем работы. Работа изложена на 121 странице машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение результатов исследования, заключение, выводы и список цитируемой литературы (115 источников). Диссертационная работа проиллюстрирована 35 рисунками, содержит 8 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы-продуценты, экспрессирующие апообелин и апоакворин, были сконструированы старшим научным сотрудником лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН Марковой С.В. Для получения мутантов обелина и акворина с точечными заменами использовали набор для мутагенеза QuickChange site-directed mutagenesis kit.

Трансформированные клетки Е. coli (штаммы BL21 Gold и XL 1-Blue) культивировали в LB-среде, содержащей ампициллин (200 мг/мл) при 37°С.

Индукцию лактозного оперона осуществляли добавлением в культуральную среду ИПТГ в конечной концентрации 0,5 мМ при достижении клетками оптической плотности OD590= 0,7-0,8 и растили 3 часа при интенсивном перемешивании. Выделение и очистку апообелина и апоакворина, а также их мутантов из телец включений проводили по методу, разработанному в лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН для рекомбинантного апообелина дикого типа с небольшими модификациями.

Для всех экспериментов по исследованию связывания с целентеразином и кинетики формирования активного комплекса апофотопротеины инкубировали в течение ночи с 10 мМ дитиотреитола и пропускали через колонку Superdex 200, для того чтобы получить моиомерную форму апофотопротеинов, свободную от дисульфидных связей и агрегатов.

Измерение собственной флуоресценции апофотопротеинов проводили на спектрофлуориметре AMINCO, оснащенном системой контроля температуры. Длина волны возбуждения - 295 нм, спектр записывался в диапазоне от 300 до 500 нм при 20°С. Во всех измерениях использовалась постоянная концентрация апобелка - 1,22 мкМ. Спектры корректировали на разведение образца за счет добавления раствора целентеразина и на эффект внутреннего фильтра, наблюдающегося при взаимодействии белка и лиганда.

Кажущиеся константы диссоциации для комплекса апофотопротеин-целентеразин определяли из тушения триптофановой флуоресценции апофотопротеинов разными концентрациями субстрата, целентеразина. Данные анализировали исходя из предположения, что фракция связанного целентеразина соответствует отношению тушения флуоресценции (Q = F0 — Fq) к максимальному тушению (Qmax = F0 ■ Fqmax), где F0, Fq и Fqmax - интенсивности флуоресценции при 336 нм без добавления субстрата, в присутствии субстрата и при насыщающей концентрации субстрата, соответственно. Для расчета кажущихся констант диссоциации использовали формулу:

Q = (C + L + Kd)~ -¡(С + L + K0)2 - ACL fi- ~ 2 где С, L и Ко — концентрации апофотопротеина и целентеразина, и константа диссоциации, соответственно.

Апофотопротеины активировали инкубацией апобелков с 15-кратным молярным избытком синтетического целентеразина (0,05 мкМ) при температуре 20°С. Кинетику активации апофотопротеинов определяли по биолюминесцентной активности в аликвотах зарядочной смеси, отобранных через опреде-

ленные промежутки времени. Биолюминесценцию регистрировали с помощью люминометра БЛМ8802, оснащенного нейтральными фильтрами с различными коэффициентами пропускания для расширения линейного диапазона измерения.

Спектры поглощения регистрировали при помощи спектрофотометра UVIKON 943. Для определения кинетических параметров и относительной удельной активности биолюминесценцию фотопротеинов измеряли с помощью планшетного люминометра Luminoskan Ascent. Спектры биолюминесценции и флуоресценции измеряли на спектрофлуориметре AMINCO. Все спектры корректировали на спектральную чувствительность ФЭУ, а также на спад биолюминесцентного сигнала. Измерение кинетики тушения флуоресценции трипто-фанов с помощью метода остановленной струи проводили на «stopped-flow» спектрометре Hi-Tech SF-51 при 20°С.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Связывание целентеразина с апофотопротеинами

Все Са2 -регулируемые фотопротеины, аминокислотные последовательности которых известны к настоящему моменту, содержат 6 триптофановых остатков; 4 из них (Trp92, Trpl 14, Тгр135 и Trpl79 в случае обелина) локализованы в целентеразин-связывающей полости (рис. 1).

Максимумы спектров собственной флуоресценции апообелина и апо-акворина наблюдаются при 336 нм (рис. 2). Наблюдаемая флуоресценция определяется исключительно остатками триптофана, так как длина волны возбуждения - 295 нм. Для активных фотопротеинов, отделенных от незаряженного апобелка ионообменной хроматографией на колонке Mono Q, характерен очень слабый уровень собственной флуоресценции (Хтах = 336 нм), составляющий примерно 5-6 % от флуоресценции апофотопротеинов (рис. 2). Очевидно, что связывание целентеразина с апобелком с последующим формированием активного фотопротеино-

Рис. 1. Пространственная структура обелина (РВВ код 1С>У0). Молекула 2-гидропероксицелентеразина показана стрелкой.

вого комплекса приводит к тушению собственной флуоресценции. Поскольку спектр поглощения целентсразина в буфере имеет плечо при 340 нм, что соответствует максимуму флуоресценции триптофанов апофотопротеинов, можно предположить, что увеличение интенсивности флуоресценции целентеразина при взаимодействии с апобелком происходит вследствие резонансного переноса энергии между триптофанами и связанным целентеразином (рис. 3). Поскольку целентеразин обладает слабой флуоресценцией, можно также предположить, что именно резонансный перенос энергии приводит к тушению собственной флуоресценции апофотопротеинов при связывании с целентеразином.

а>

^ 2

о

ш

с; в 1

О

300

Л

1 \

1 \ \

\

500

350 400 450 Длина волны, нм Рис. 2. Спектры флуоресценции апо-обелина (пунктирная линия), активного обелина отделенного ионооб-

300

550

350 400 450 500 Длина волны, нм Рис. 3. Спектры флуоресценции апообелина (пунктирная линия), свежеприготовленного целентерази-менной хроматографией на колонке на (черная линия) и их смеси в мо-Мопо С) от незаряженного апобелка лярном соотношении 1:1 (серая ли-(темно-серая линия) и свежеприго- ния). Возбуждение при 295 нм для товленного целентеразина (черная всех измерений; концентрация апо-линия). Возбуждение при 295 нм для обелина и целентеразина - 1,22 всех измерений; концентрация всех мкМ. образцов - 1,22 мкМ.

С помощью последовательной замены триптофанов на фенилаланин определен вклад каждого остатка триптофана в собственную флуоресценцию апообелина (рис. 4). Несмотря на то, что Тгр92 находится глубоко в целентеразин-связывающей полости белка (рис. 1.), интенсивность собственной флуоресценции мутанта \V92F снижена примерно на 40% по сравнению с флуоресценцией обелина дикого типа (рис. 4). Тгр! 14, Тгр179 и Тгр18, из которых два, Тгр114 и

Тгр179, также как и Тгр92, находятся в целентеразин-связывающей полости, вносят по 20% в собственную флуоресценцию апообелина (рис. 4). Замена Тгр135, четвертого триптофана субстрат-связывающей полости, практически не влияет на общий уровень собственной флуоресценции, что, по-видимому, обусловлено тушением его флуоресценции аминокислотным окружением. ТгрЮЗ -единственный остаток триптофана, расположенный на поверхности молекулы фотопротеина (рис. 1). Однако вклад этого триптофана в собственную флуоресценцию апообелина составляет только около 5% (рис.4). Вполне вероятно, что именно этот триптофан ответственен за слабую собственную флуоресценцию активного фотопротеина, интенсивность которой составляет примерно 5-6% от флуоресценции апофотопротеина (рис. 2).

Из зависимости тушения собственной флуоресценции апофотопротеина от концентрации целентеразина (рис. 5А и 5Б) определены кажущиеся константы диссоциации для комплексов апообелин-целентеразин и апоак-ворин-целентеразшг, которые составили 1,2 ± 0,12 мкМ - в случае апоак-ворина и 0,2 ± 0,04 мкМ - в случае апообелина. Необходимо отметить, что полученные константы диссоциации для комплексов апофотопротеин-целентеразин не являются равновесными константами диссоциации (или ассоциации), так как диссоциацию целентеразина из комплекса при быстром разбавлении образца зафиксировать не удалось. Таким образом, в данном случае более корректно использовать термин «кажущиеся константы диссоциации».

Попытки определить кинетические параметры связывания целентеразина с апобелком с помощью метода остановленной струи форресШолу) потерпели неудачу. Связывание целентеразина с апобелком оказалось настолько быстрым, что использованное оборудование («мертвое время» 1,5 мс) не позволило зарегистрировать кинетику тушения собственной флуоресценции. Однако из этого

300

450

350 400

Длина волны, нм Рис. 4. Нормированные спектры флуоресценции апообелина дикого типа и его мутантов \V18F, '\^92Р, \V103F, \V114F, №135Р, и \V179F. Возбуждение при 295 нм для всех измерений.

следует вывод, что связывание целентеразина происходит менее чем за 1,5 мс и, следовательно, с большой скоростью.

А Б

Рис. 5. Тушение собственной флуоресценции апофотопротеинов целей гера-зином. А - спектры флуоресценции апообелина в диапазоне 310-380 нм без добавления (а) и в присутствии 1,22 (б) и 9,15 мкМ (в) целентеразина. Б -определение кажущихся констант диссоциации для комплексов апообелин-(■) и апоакворин-целентеразин (А) по тушению собственной флуоресценции при связывании целентеразина. Возбуждение при 295 нм.

2. Кинетика формирования активного фотопротеинового комплекса из апофотопротеина, целентеразина и кислорода

Скорость образования активного фотопротеинового комплекса зависит от состояния апобелка, инкубируемого с целентеразином. В случае если для активации используется апофотопротеин, получаемый после экспрессии и очистки с помощью ионообменной хроматографии, который представляет собой смесь агрегированной и мономерной форм апобелка, время образования активного фотопротеинового комплекса составляет примерно 3 часа при 20°С. Однако, если для активации использовать только мономерную фракцию апофотопротеинов, то скорость образования активного фотопротеинового комплекса значительно возрастает: для апообелина концентрация активного комплекса при 20°С достигает максимума уже через 15 минут после начала инкубации с субстратом (рис. 6).

Упрощенно формирование активного фотопротеина из апобелка, целентеразина и кислорода может быть представлено как двухстадийный процесс:

X

к, к.

X,

►х,

в, в,

где Бь целентеразин; 52, молекулярный кислород; X, апофотопротеин; Хь комплекс апофотопротеина с целентеразином; Х2, активный фотопротеин; к,, и к2, константы скорости реакции. На первом этапе образуется комплекс между апо-фотопротеином и целентеразином. Этот процесс очень быстрый, занимающий менее 1,5 мс. Второй этап соответствует образованию 2-гидро-пероксицелентеразина из связанного целентеразина и молекулярного кислорода. Для мономерной формы апофотопротеина продолжительность процесса составляет 15-20 мин (рис. 6).

3.60

6 9 12 ю 3 40 3 45 3 50 3 55

Время, мин 1/Тх103, К-1

Рис. 6. Кинетика образования актив- Рис. 7. График Аррениуса для обра-ного обелина из мономерной формы зования активного фотопротеиново-апообелина, целентеразина и кисло- го комплекса из мономерного апо-рода. ЯЫ] - относительные люми- обелина, целентеразина и кислорода, несцентные единицы. Каждая точка выполнена в трех по-

вторах.

Мы не рассматриваем обратные процессы (к_1 и к.2), так как экспериментально диссоциацию целентеразина из комплекса с апобелком при разбавлении образца зарегистрировать не удалось, а образование целентеразина из 2-гидропероксицелентеразина вряд ли возможно. Кроме того, так как, исходя из пространственных структур различных конформационных состояний фотопротеинов, сложно предположить наличие какого-либо специфического сайта связывания кислорода, исключен из кинетической схемы и промежуточный ком-

плекс ХЗ^г, в котором апофотопротеин, целентеразин и кислород связаны одновременно.

На основании кинетической схемы предложена математическая модель,

описывающая формирование активного фотопротеинового комплекса из апо-

фотопротеина, целентеразина и кислорода, которая может быть записана в виде

системы дифференциальных уравнений:

8Х(1).

д.I

аад

а/ а/

81 35,(0

адмад-ад (олг,«) ^,(0^,(0

81

Начальные условия: Луб) = Х0; Х^О) = 0; Х2(0) = При 8[ и » X систему

дифференциальных уравнений можно записать в виде:

8Х( о _

81

= *Дох(0-*2ЗД(0

от

?Ш = кМ(0 01

>

где Бю и Бго - начальные концентрации целентеразина и молекулярного кислорода, соответственно.

В результате решения системы дифференциальных уравнений получено уравнение зависимости концентрации комплекса от времени инкубации:

верное при условии »^м •

Данное уравнение полностью соответствует уравнению, описывающему необратимую бимолекулярную химическую реакцию Л + В=>С. В сущности, формирование 2-гидропероксицелентеразина можно рассматривать как обычную химическую реакцию целентеразина с молекулярным кислородом, но происходящую в белковом окружении.

Для оценки константы скорости формирования активного обелина использовали уравнение для Х2(1) и экспериментальные данные по активации мономерного апобелка, представленные на рис. 6. Константа скорости образования активного обелина из апобелка, целентеразина и кислорода при температу-

ре 20°С и рН 6,5 составила 11 ± 0,4 М'сек"1. Из зависимости константы скорости от температуры в диапазоне от 4 до 20°С и фиксированном рН 6,5 (рис. 7) определена также энергия активации (Еа) образования активного обелина, которая составила 45,0 кДж/моль.

3. Характеристика мутантов обелина и акворина с заменами Hisl75, Туг190 и Тгр179

Согласно пространственньш структурам обелина и акворина атомы боковых цепей His, Тгр и Туг (Hisl75, Тгр179 и Туг190 в случае обелина) формируют водородные связи с 2-гидроперокси-группой и карбонильной группой 2-гидропероксипроизводного целентеразина (рис. 8). Предполагается, что именно водородные связи между 2-гидроперокси-группой и атомами этих аминокислотных остатков стабилизируют нестабильную молекулу 2-гидроперокси-целентеразина в целентеразин-связывающей полости фотопротеинов.

Для выяснения функциональной роли His, Тгр и Туг и водородных связей, которые они образуют, в формировании активного фотопротеинового комплекса с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза эти аминокислоты были заменены аминокислотными остатками с различными донорно-акцепторными свойствами боковых цепей как в обелине, так и в акворине. Все 36 мутантов были экспрессированы, выделены, очищены, переведены в форму активного фотопротеина и охарактеризованы по следующим параметрам: относительная биолюминесцентная активность, Са2+-независимая люминесценция, константа спада биолюминесцентной реакции, спектры поглощения, биолюминесценции и флуоресценции.

В целом, практически все замены His, Тгр и Туг привели к существенному снижению биолюминесцентной активности мутантов по сравнению с фотопротеинами дикого типа (табл. 1). Необходимо, однако, отметить, что, несмотря на высокую структурную гомологию обелина и акворина, в ряде случаев аналогичные замены приводили к различному влиянию на биолюминесцентные свойства фотопротеинов. Например, замена Тгр180 на Туг и Phe в акворине привела к существенному снижению биолюминесцентной активности (мутанты сохранили 0,25 и 3,5% активности от активности акворина дикого типа, соответственно), в то время как соответствующие им мутанты обелина сохранили 23 и 67% активности фотопротеина дикого типа. Замена His на Gin также по-разному влияла на активность. Мутант акворина сохранил около 23% активности, тогда как активность мутанта обелина составила менее 1% от активности обелина дикого типа (табл. 1). В то же самое время замена Туг на Phe в обоих

фотопротеинах привела к практически одинаковому эффекту - сохранению примерно пятой части активности.

Рис. 8. Молекула 2-гид-ропероксицелентерази-на в окружении аминокислотных остатков в целентеразин-связываю-щей полости обелина (РОВ код 1(ЗУ0). Водородные связи показаны пунктиром; расстояние указано в А; молекула воды изображена в виде шарика.

Все мутанты обелина и акворина обладали люциферазоподобной биолюминесцентной активностью, наблюдающейся в течение инкубации апофотопро-теинов с целентеразином в отсутствие ионов кальция (рис. 9). Однако, после инжекции кальция в раствор, содержащий апофотопротеин и целентеразин, наблюдается вспышка биолюминесценции, типичная для фотопротеинов. Кроме того, для этих мутантов характерен низкий выход активного фотопротеина и высокий уровень Са2+-независимой люминесценции. Таким образом, замена даже одного из вышеуказанных аминокислотных остатков приводит к формированию нестабильного фотопротеинового комплекса.

Мутанты обелина и акворина, сохранившие наибольший процент биолюминесцентной активности, имеют спектр поглощения, близкий к спектру поглощения фотопротеинов дикого типа. Например, и мутант Н176(2 (24% активности дикого типа), и акворин дикого типа в спектре поглощения имеют плечо на 310 нм и максимум на 460 нм, что показывает наличие 2-гидро-пероксицелентеразина в составе комплекса. По мере снижения биолюминесцентной активности мутантов исчезает максимум на 460 нм и увеличивается пик на 350 нм, что указывает на появление продукта реакции, целентерамида, образующегося в результате интенсивной Са2+-независимой биолюминесценцией. Некоторые мутанты с очень низкой активностью (например, АУ179А и \V180A), не имеют поглощения не только на 460 нм, но и на 350 нм, что вероятно обусловлено диссоциацией целентерамида.

Таблица 1

Биолюминесцентная активность мутантов обелина и акворина

Мутанты обелина Биолюминесцентная активность, % от обелина дикого типа Биолюминесцентная активность, % от акворина дикого типа Мутанты акворина

WT 100 100 WT

H175Q 0,8 23,8 H176Q

H175N 1,7 3,3 H176N

Н175А 0,5 0,18 HI 76 А

Н175Е 0,2 0,024 Н176Е

H175D 0,01 6,0 H176D

H175R 0,02 0,76 H176R

H175Y 0,3 0,16 H176Y

H175F 0,3 0,98 H176F

W179K 0,7 0,18 W180K

W179E 0,6 0,004 W180E

W179A 0,02 0,03 W180A

W179Y 23 0,25 W180Y

W179R 0,02 0,001 W180R

W179F 67,0 3,5 W180F

Y190R 0,01 0,4 Y191R

Y190K 0,03 1,0 Y191K

Y190F 143 22,0 Y191F

Y190E 1,9 1,5 Y191E

Жирным шрифтом выделены мутанты обелина и акворина, в которых

идентичные аминокислотные замены привели к различному влиянию на

биолюминесцентную активность.

В некоторых случаях замена His, Тгр и Туг приводит также к изменению спектров биолюминесценции. Например, у мутантов акворина HI76A, H176F, W180K, W180A и Y191K в спектре биолюминесценции появляется плечо на 390 нм, которое свидетельствует о присутствии нейтральной формы целентера-зина и которое отсутствует в спектре акворина дикого типа. Значительные изменения наблюдаются и во флуоресцентных свойствах Са2+-разряженных мутантов. Например, для многих из них характерно появление ярко выраженной

бимодальной флуоресценции, которая отсутствует в Са2+-разряженном обелине и акворине.

Из спектральных свойств мутантов можно сделать заключение, что His, Тгр и Туг играют важную роль в позиционировании молекулы субстрата в целентеразин-связывающей полости и с их заменой происходит нарушение водородных связей, не только стабилизирующих 2-гидролерокси-производное целентеразина, но и водородных связей, участвующих в формировании эмиттера.

Кажущиеся константы диссоциации для комплекса апофотопротеин-целентеразин, а также скорости образования активного фотопротеина для мутантов обелина H175N, W179Y, W179A, WI79F, YI90E и Y190F приведены в таблице 2. Помимо этих мутантов, выбор которых, прежде всего, определялся различным влиянием аминокислотных замен на биолюминесцентную активность, кажущаяся константа диссоциации и константа скорости образования активного комплекса определена также для мутанта обелина Y138F. Мутант Y138F был включен в исследование, потому что атом кислорода ОН-группы Туг138 образует водородную связь с Nl-атомом 2-гидропероксицелентеразина (рис. 8) и потому что, согласно квантово-химическим расчетам, если в районе N1-атома целентеразина отсутствуют полярные группы, молекула кислорода не способна приблизиться к С2-атому целентеразина на расстояние, необходимое для образования его 2-гидроперокси-производного.

Для всех мутантов с заменой Тгр 179 независимо от введенного остатка и биолюминесцентной активности мутанта наблюдается 5-6-кратное увеличение кажущейся константы диссоциации для комплекса апофотопротеин-целентеразин по сравнению с обелином дикого типа (табл. 2). Аналогичное увеличение кажущейся константы диссоциации характерно и для мутанта Y190E. Однако для двух мутантов, H175N и Y190F, кажущиеся константы диссоциации комплекса апофотопротеин-целентеразин не изменились, несмотря на то, что относительные биолюминесцентные активности этих мутантов отли-

ЕЕ -----

-------

— ТТ-

ра_ . . . исиыш фотсигчггст [НОВ! sJL ®Е ш. - —

люмтш; х 10-' дещ ИВ:: ________

ЕЁ ---- -—

___j _1 —^

-jfcr Лин бш зМ torn >азт fleet енн 5йая НЁг ЕЕ

- — --

.........^ —-

______ — ■.Caf

— - — ---

----- V- ___

--------- — -- —-1——

Рис. 9. Люциферазоподобная и фотопротеиновая биолюминесцентные активности на примере мутанта обелина H175Q.

чаются почти в 10 раз. Хотя мутант У138Р сохраняет 60% активности обелина дикого типа, кажущаяся константа диссоциации для этого мутанта увеличилась почти в 3 раза (табл. 2). Необходимо, однако, отметить, что константы скорости образования активного комплекса в случае всех исследованных мутантов снижены приблизительно на порядок по сравнению с константой скорости для обелина дикого типа (табл. 2). Вероятнее всего, связывание целентеразина с апобелком в случае мутантов 1117514, У138Р и У190Р происходит достаточно эффективно из-за того, что эти замены не нарушают существенно конформа-цию как молекулы в целом, так и конформацию целентеразин-связывающей полости. Однако на этапе активации кислородом, по-видимому, происходят нарушения, которые приводят к снижению скорости образования 2-гидро-пероксицелентеразина.

Таблица 2

Основные характеристики процесса формирования активного

фотопротеинового комплекса для некоторых мутантов обелина

Относительная Кажущаяся Константа

биолюминесцентная константа скорости

активность, % от диссоциации к2, М"'сек"'

обелина дикого типа Ко, мкМ

Обелин \УТ 100,0 0,2 ± 0,04 11,0 ±0,4

У138Р 60,0 0,65 ±0,06 0,8 ± 0,05

Н17514 1,7 0,15 ±0,01 1,3 ±0,1

\V179Y 23,0 1,0 ±0,07 1,6 ±0,06

\V179A 0,02 1,1 ±0,09 1,5 ±0,4

\V179F 67,0 1,2 ±0,07 1,5 ±0,2

У190Е 1,9 1,0 ±0,08 1,4 ±0,3

У190Р 14,3 0,2 ±0,01 0,4 ± 0,03

4. Роль остатков №$175 и Туг138 в процессе формирования активного фотопротеинового комплекса

Согласно существующему гипотетическому механизму образования 2-гидропероксицелентеразина в целентеразин-связывающей полости фотопротеина, первым этапом этой реакции является депротонирование Ы7-атома азота целентеразина при участии основания. Однако, согласно пространственным структурам различных конформационных состояний фотопротеинов, вблизи Ы7-атома азота нет ни одной боковой цепи аминокислотных остатков, которые

могли бы играть роль основания. Следовательно, депротонирование Ш-атома азота должно происходить до того, как целентеразин займет окончательное положение в субстрат-связывающей полости, то есть в течение миллисекунд, за которые происходит его связывание. Вполне вероятно, что в этом процессе принимает участие один из His, который может выступать в роли основания при нейтральных рН, особенно в паре с карбоксильной группой Asp или Glu.

Рис. 10. Предполагаемая роль Hisl75 в образовании активного фотопротеинового комплекса обелина.

Из пространственной структуры целентеразин-связывающей полости обелина, а также исследований влияния различных мутаций His 175 на образование активного фотопротеинового комплекса и результатов квантово-химических расчетов, было предположено, что наилучшим кандидатом на роль основания является Hisl75, который к тому же может выполнять двойную функцию (рис. 10). На начальном этапе в момент связывания целентеразина с апобелком His 175 забирает протон отШ-атома азота целентеразина, используя «основный» атом азота. Это приводит к образованию Ш-целентеразин-аниона, который за счет быстрой перестройки системы связей преобразуется в С2-анион целентеразина (рис. 10). На следующем этапе положительно заряженный His 175 отдает протон от своего «кислого» атома азота на С2-анион целентеразина с образованием целентеразина, протонированного по С2-атому углерода (С2(Н)-целентеразин). Таким образом, Hisl75 выполняет функцию переносчика протона ("proton shuttle mechanism"), на разных этапах реакции являясь и «основанием» и «кислотой» (рис. 10).

Согласно предложенному механизму, после формирования целентеразина, протонированного по С2-атому, он взаимодействует с 02, образуя 2-гидропероксицелентеразин. Наличие полярной группы (ОН-группа Туг138 или Н:0) в непосредственной близости от имидазолпиразинового кольца целенте-

Hisl 75

?

разина приводит к поляризации N1-атома азота. В результате так называемого индукционного эффекта С2-Н связь также поляризуется. Под воздействием дисперсионных сил молекула кислорода притягивается к С2-атому целентера-зина на расстояние 2,3 А, увеличивая вероятность инициации реакции образования 2-гидроперокси-производного (рис. 11). Важность Туг138 для образования активного фотопротеинового комплекса подтверждена и мутагенезом (табл. 2). Необходимо отметить, что, несмотря на драматическое снижение скорости в случае мутации У138Р, активный фотопротеин все же образуется. Это обусловлено тем, что присоединение кислорода является вероятностным процессом, а поляризация С2-Н связи увеличивает вероятность присоединения, но не является строго необходимой для него.

Рис. 11. Предполагаемая роль Туг138 в образовании активного фотопротеинового комплекса обелина.

Таким образом, в результате исследований была предложена функциональная роль аминокислот целентеразин-связывающей полости в образовании активного фотопротеинового комплекса. Согласно гипотезе, Шз175 участвует не только в стабилизации 2-гидропероксицелентеразина, но и в процессе образования целентеразина, протонированного по С2-атому, играя роль переносчика протона от Ш-атома. В свою очередь, Туг138 поляризует С2-Н связь, обеспечивая тем самым позиционирование молекулы кислорода возле протонированного С2-атома целентеразина, необходимое для последующего эффективного образования 2-гидроперокиси-производного.

выводы

1. Определен вклад каждого из шести остатков триптофана в собственную флуоресценцию апофотопротеинов на примере апообелина с использованием мутантов с заменами остатков триптофана на фенилаланин. Показано, что наибольший вклад в собственную флуоресценцию апофотопротеинов вносят Тгр92 (40%), Тгр179 (20%) и Tip 114 (20%), боковые цепи которых направлены внутрь целентеразин-связывающей полости.

2. Показано, что степень тушения флуоресценции триптофанов апообелина и апоакворина зависит от концентрации целентеразина. Это позволило впервые определить кажущиеся константы диссоциации комплекса с це-лентеразином для апоакворина (1,2 ± 0,12 мкМ) и апообелина (0,2 ± 0,04 мкМ).

3. Установлено, что связывание целентеразина с апофотопротеинами происходит в течение нескольких миллисекунд. Так как связывание занимает миллисекунды, а формирование активного фотопротеинового комплекса из апобелка, целентеразина и кислорода занимает несколько десятков минут, сделано заключение, что лимитирующим этапом реакции является образование 2-гидропероксицелентеразина.

4. Предложена математическая модель, описывающая процесс формирования активного фотопротеинового комплекса. Данная модель позволила оценить константу скорости реакции для образования 2-гидро-пероксицелентеразина из целентеразина и молекулярного кислорода в активном центре обелина (11,0 ± 0,4 М 'сек"1) и определить энергию активации этого процесса (45,0 кДж/моль).

5. Методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза получено 36 мутантов акворина и обелина с заменами Hisl75, Тгр179 и Туг190 на аминокислотные остатки с различными донорно-акцепторными свойствами боковых цепей. Все мутантные белки выделены в гомогенном виде и охарактеризованы. Показано, что все мутации Hisl75, Тгр179 и Туг190 приводят к снижению биолюминесцентной активности и скорости образования активного фотопротеинового комплекса.

6. Предложен механизм образования активного фотопротеинового комплекса, согласно которому His 175 участвует в образовании целентеразина, протонированного по С2-атому, выполняя функцию переносчика протона от Ы7-атома, а Туг138 обеспечивает позиционирование молекулы кисло-

рода возле протонированного С2-атома целентеразина, необходимое для последующего образования его 2-гидропсрокси-производного.

7. Установлено, что, несмотря на высокую идентичность аминокислотных последовательностей, а также сходство пространственных структур обе-лина и акворина, аналогичные замены №б175, Тгр179 и Туг190 в этих фотопротеинах в ряде случаев по-разному отражаются на биолюминесцент-пых свойствах. Это свидетельствует о том, что акворин и обелин, несмотря на высокую гомологию, в ответ на связывание кальция могут претерпевать различные конформационные переходы, приводящие, например, к разной кинетике биолюминесцентного ответа или различной чувствительности к ионам кальция.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Eremeeva E.V. The intrinsic fluorescence of apo-obelin and apo-aequorin and use of its quenching to characterize coelenterazine binding / E.V. Eremeeva, S.V. Markova, A.H. Westphal, A.J.W.G. Visser, W.J.H. van Berkel, E.S. Vysotski // FEBS Letters. - 2009. - V. 583. - P. 1939-1944.

2. Eremeeva E.V. The main function of Hisl75, Trpl79 and Tyr]90 residues of the obelin binding site is to stabilize the hydroperoxycoelenterazine intermediate / E.V. Eremeeva, S.V. Markova, L.A. Frank, E.S. Vysotski // In: Bioluminescence & Chemiluminescence: Chemistry, Biology and Application. Eds A.A. Szalay, P.J. Hill, L.J. Kricka, P.E. Stanley. Singapore: World Scientific. - 2007. - P. 7-10.

3. Eremeeva E.V. The kinetics of coelenterazine binding with apo-obelin and apo-aequorin ! E.V. Eremeeva, S.V. Markova, L.A. Frank, J. Lee, W.J.H. van Berkel, A.J.W.G. Visser, E.S. Vysotski // Luminescence. - 2008. - Vol. 23. - P. 66-67.

4. Eremeeva E.V. The main function of Hisl75, TrpI79 and Tyrl90 residues of the obelin binding site is to stabilize the hydroperoxycoelenterazine intermediate / E.V. Eremeeva, S.V. Markova, L.A. Frank, E.S. Vysotski // Luminescence. - 2006. -Vol. 21.-P. 275-276.

5. Tomilin F.N. Quantum chemical study of mechanism of active photoprotein generation /F.N. Tomilin, L.U. Antipina, E.V. Eremeeva, S.G. Ovchinnikov, E.S. Vysotski // Luminescence. - 2010. - Vol. 25. - P. 210-211.

6. Vysotski E.S. Ca2+-regulated photoproteins: structure, bioluminescent reaction mechanism, engineering, and application / E.S. Vysotski, S.V. Markova, L.A. Frank, N.P. Malikova, G.A. Stepanyuk, L.P. Burakova, E.V. Eremeeva, S. Golz, J. Lee // Luminescence. -2010. - Vol. 25. - P. 212-213.

Подписано в печать 28.04.10 г. Тираж 80 экз. Заказ №13

Отпечатано в типографии Института физики СО РАН 660036, Красноярск, Академгородок, 50

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Еремеева, Елена Владимировна

1.1. 1.2.

ГЛАВА 2.

2.1. 2.2.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Са2+-регулируемые фотопротеины и перспективы использования собственной флуоресценции белков для их изучения

Са -регулируемые фото протеины

Пространственная структура Са -регулируемых фотопротеинов

Возможные пути формирования 2-гидроперокси-целентеразина

Механизм биолюминесценции Са -регулируемых фотопротеинов

Спектральные свойства ароматических аминокислот и собственная флуоресценция белков

Тушение собственной флуоресценции и ее использование для изучения свойств белков

Использование собственной флуоресценции для изучения биолюминесцентных белков

Материалы и методы

Олигонуклеотид-направленный мутагенез

Приготовление компетентных клеток Е. coli XLI-Blue и BL21 Gold и их трансформация плазмидной ДНК

Выделение плазмидной ДНК

Культивирование клеток Е. coli, выделение и очистка белков

2.5. Изучение кинетики активации апофотопротеинов

2.6. Измерение собственной флуоресценции апофотопротеинов

2.7. Измерение удельной биолюминесцентной активности

2.8. Метод остановленной струи (stopped-flow)

2.9. Измерение спектральных характеристик апофотопротеинов и их мутантных форм

2.10. Реактивы

ГЛАВА 3.

ГЛАВА 4.

Исследование регенерации обелина и акворина из апофотопротеина, целентеразина и молекулярного кислорода

Собственная флуоресценция апообелина и апоакворина

Вклад каждого остатка триптофана в собственную флуоресценцию апообелина

Тушение собственной флуоресценции апофотопротеинов акриламидом

Тушение собственной флуоресценции апообелина и апоакворина целентеразином и определение кажущихся констант диссоциации соответствующих комплексов

Кинетика формирования активного фотопротеинового комплекса из апофотопротеина, целентеразина и кислорода

Исследование роли отдельных аминокислотных остатков (His 175, Туг 190 и Тгр179) в образовании активного фотопротеинового комплекса

4.1. Выделение и очистка мутантных форм обелина и акворина

4.2. Относительная биолюминесцентная активность мутантов обелина и акворина

4.3. Люциферазоподобная и фотопротеиновая биолюминесцентные активности мутантов

О 44.4. Са -независимая люминесценция мутантов обелина

4.5. Спектры поглощения мутантов акворина и обелина

4.6. Кинетика биолюминесценции мутантов акворина и обелина

4.7. Спектры биолюминесценции мутантов акворина и обелина

4.8. Спектры флуоресценции Са -разряженных мутантов акворина и обелина

4.9. Константы диссоциации комплекса апофотопротеин-целентеразин и константы скорости образования активного фотопротеинового комплекса мутантов обелина

4.10. Функциональная роль остатков His и Туг в формировании активного фотопротеинового комплекса

Введение Диссертация по биологии, на тему "Формирование активного фотопротеинового комплекса на примере обелина и акворина и их мутантных форм"

Биолюминесценция представляет собой хемилюминесцентную реакцию, в которой происходит окисление субстрата «люциферина», катализируемое специфическим ферментом «люциферазой». Люциферины и люциферазы разных организмов являются соединениями различной структуры, поэтому это скорее собирательное и функциональное понятие, чем структурно-химическое. Несмотря на то, что биолюминесценция была открыта более 100 лет назад, интерес ученых к изучению этого явления не только не ослабевает, но и возрастает. Главным образом это обусловлено тем, что в настоящее время биолюминесцентные белки нашли широкое аналитическое применение в различных областях. Поскольку свет с помощью современных регистрирующих приборов может быть измерен с высокой чувствительностью, методы с использованием биолюминесцентных

1 о белков позволяют измерять вещества даже ниже 10" моля. В настоящее время биолюминесцентные методы широко используются в клеточной биологии и экологии для мониторинга внутриклеточных процессов и загрязнения окружающей среды, соответственно, а также в медицинской диагностике. Спектр биолюминесцентных методов с каждым годом растет, так как постоянно возникают все новые и новые области их приложения.

Биолюминесценция — явление, широко представленное в природе и присущее многим организмам в различных филогенетических ветвях: от бактерий до рыб. Широко распространены виды, использующие в качестве субстрата биолюминесцентной реакции целентеразин [Thompson et al., 1997]: это мягкий коралл Renilla, креветки Oplophorus, медузы Periphylla, копеподы Gaussia и Metridia, остракоды Conchoecia, цефалоподы Vampyroteuthis и другие. Наиболее изученными белками, использующими целентеразин в качестве субстрата, являются Са -регулируемые фотопротеины, ответственные за свечение ряда морских кишечнополостных организмов.

Все Са -регулируемые фотопротеины, исследованные к настоящему времени, демонстрируют высокую степень гомологии как аминокислотных последовательностей, так и пространственных структур. Фотопротеины являются односубъединичными белками (~22 кДа), содержащими три Са -связывающих центра «EF-hand» типа, характерные для семейства «EF-hand» I

Са -связывающих белков. Фотопротеины представляют собой стабильный фермент-субстратный комплекс, состоящий из апофотопротеина и молекулы органического субстрата — преактивированного кислородом целентеразина (2-гидропероксицелентеразина), который прочно, но нековалентно связан с белком [Shimomura, Johnson, 1978; Head et al., 2000; Liu et al., 2003]. Связывание ионов кальция с фотопротеином, приводящее к изменению конформации белка, запускает реакцию декарбоксилирования 2-гидропероксицелентеразина, в результате которой образуется целентерамид в возбужденном состоянии и С02- Переход целентерамида из возбужденного состояния в основное сопровождается излучением кванта света.

Предыдущие исследования фотопротеинов были направлены в основном на изучение механизма биолюминесценции, и в данной области достигнут значительный прогресс [Shimomura, 2006; Высоцкий и др., 2006; Vysotski, Lee, 2004; Vysotski, Lee, 2007]. Однако, несмотря на широкое применение рекомбинантных фотопротеинов, процесс формирования активного фермент-субстратного комплекса из апофотопротеина, целентеразина и кислорода все еще очень слабо изучен и его молекулярный механизм по-прежнему остается загадкой.

Выяснение молекулярного механизма формирования активного фотопротеинового комплекса, безусловно, имеет и фундаментальное, и прикладное значение, так как является необходимым шагом в понимании механизма биолюминесценции и, в перспективе, будет способствовать существенному повышению эффективности аналитического применения фотопротеинов, в особенности при их использовании в качестве репортерных молекул in vivo.

Целью представленной работы являлось исследование процесса образования активного Са -регулируемого фотопротеина из апобелка, целентеразина и кислорода, а также функциональной роли отдельных аминокислотных остатков активного центра фотопротеинов в этом процессе.

Выполнение данного исследования требовало решения ряда экспериментальных задач. Было необходимо:

1. Исследовать кинетические характеристики образования активного фотопротеинового комплекса на примере формирования активного обелина и акворина из апобелка, целентеразина и молекулярного кислорода и разработать математическую модель, описывающую этот процесс.

2. Для выявления функциональной роли аминокислот целентеразин-связывающей полости в формировании активного фотопротеина методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза получить мутанты обелина и акворина с заменами Hisl75, Тгр179 и Туг190 на остатки с различными донорно-акцепторными свойствами боковых цепей, выделить мутантные белки в гомогенном виде и изучить их основные физико-химические свойства.

При решении поставленных задач были получены новые результаты, которые выносятся на защиту:

1. Образование активного фотопротеинового комплекса является двухстадийным процессом, в котором первый этап соответствует формированию комплекса между апофотопротеином и целентеразином и занимает миллисекунды. Вторая стадия соответствует конвертации связанного целентеразина в 2-гидропероксицелентеразин и занимает от нескольких десятков минут до нескольких часов в зависимости от состояния апобелка и условий инкубации с субстратом, что свидетельствует о том, что данная стадия является лимитирующей в образовании активного фотопротеина.

2. Согласно предложенному механизму образования активного фото протеинового комплекса, His 175 выполняет функцию переносчика протона от N7-aTOMa азота на С2-атом углерода целентеразина, а Туг 138 обеспечивает позиционирование молекулы кислорода возле протонированного С2-атома углерода, необходимое для образования 2-гидропероксицелентеразина.

Все результаты, представленные в данной работе, получены впервые и имеют фундаментальный характер, поскольку добавляют новую информацию к пониманию механизма образования активного фотопротеинового комплекса. Кроме того, полученные результаты могут найти применение в прикладных исследованиях. К примеру, возможность управлять процессом образования активного фотопротеинового комплекса чрезвычайно важна для использования фотопротеинов в качестве репортерных молекул in vivo, так как фотопротеины экспрессируются внутри клетки-мишени в форме апобелков и там же конвертируются в форму активного фотопротеина инкубацией с экзогенным целентеразином.

Работа выполнена при поддержке Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (проект № 22.2), Интеграционного проекта СО РАН № 2, грантов РФФИ № 09-04-12022-офим и № 09-04-13686-офиц.

Результаты диссертационной работы докладывались на Международных симпозиумах по Биолюминесценции и Хемилюминесценции (Сан-Диего, США, 2006; Шанхай, Китай, 2008; Лион, Франция, 2010), на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН, департамента биохимии Университета Вагенингена

Вагенинген, Нидерланды) и Национальной лаборатории Биомакромолекул Института биофизики Китайской академии наук (Пекин, Китай).

По результатам исследования опубликована 1 статья в рецензируемом журнале и 1 статья в сборнике материалов Международного симпозиума по Биолюминесценции и Хемилюминесценции.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Еремеева, Елена Владимировна

выводы

1. Определен вклад каждого из шести остатков триптофана в собственную флуоресценцию апофотопротеинов на примере апообелина с использованием мутантов с заменами остатков триптофана на фенилаланин. Показано, что наибольший вклад в собственную флуоресценцию апофотопротеинов вносят Тгр92 (40%), Тгр179 (20%) и Trpl 14 (20%), боковые цепи которых направлены внутрь целентеразин-связывающей полости.

2. Показано, что степень тушения флуоресценции триптофанов апообелина и апоакворина зависит от концентрации целентеразина. Это позволило впервые определить кажущиеся константы диссоциации комплекса с целентеразином для апоакворина (1,2 ± 0,12 мкМ) и апообелина (0,2 ± 0,04 мкМ).

3. Установлено, что связывание целентеразина с апофотопротеинами происходит в течение нескольких миллисекунд. Так как связывание занимает миллисекунды, а формирование активного фотопротеинового комплекса из апобелка, целентеразина и кислорода занимает несколько десятков минут, сделано заключение, что лимитирующим этапом реакции является образование 2-гидропероксицелентеразина.

4. Предложена математическая модель, описывающая процесс формирования активного фотопротеинового комплекса. Данная модель позволила оценить константу скорости реакции для образования 2-гидропероксицелентеразина из целентеразина и молекулярного кислорода в активном центре обелина (11,0 ± 0,4 М^сек"1) и определить энергию активации этого процесса (45,0 кДж/моль).

5. Методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза получено 36 мутантов акворина и обелина с заменами Hisl75, Тгр179 и Туг190 на аминокислотные остатки с различными донорно-акцепторными свойствами боковых цепей. Все мутантные белки выделены в гомогенном виде и охарактеризованы. Показано, что все мутации His 175, Тгр 179 и Туг 190 приводят к снижению биолюминесцентной активности и скорости образования активного фотопротеинового комплекса.

6. Предложен механизм образования активного фотопротеинового комплекса, согласно которому His 175 участвует в образовании целентеразина, протонированного по С2-атому, выполняя функцию переносчика протона от N7-aTOMa, а Туг138 обеспечивает позиционирование молекулы кислорода возле протонированного С2-атома целентеразина, необходимое для последующего образования его 2-гидроперокси-производного.

7. Установлено, что, несмотря на высокую идентичность аминокислотных последовательностей, а также сходство пространственных структур обелина и акворина, аналогичные замены His 175, Тгр 179 и Туг190 в этих фотопротеинах в ряде случаев по-разному отражаются на биолюминесцентных свойствах. Это свидетельствует о том, что акворин и обелин, несмотря на высокую гомологию, в ответ на связывание кальция могут претерпевать различные конформационные переходы, приводящие, например, к разной кинетике биолюминесцентного ответа или различной чувствительности к ионам кальция.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная работа посвящена изучению процесса образования активного Са -регулируемого фотопротеина из апобелка, целентеразина и кислорода, а также функциональной роли отдельных аминокислотных остатков активного центра фотопротеинов в этом процессе.

Образование активного фотопротеинового комплекса является двухстадийным процессом, в котором первый этап соответствует формированию комплекса между апофотопротеином и целентеразином, занимая миллисекунды. На второй стадии происходит конвертация связанного целентеразина в 2-гидропероксицелентеразин, занимающая от нескольких десятков минут до нескольких часов в зависимости от состояния апобелка и условий инкубации с субстратом, что свидетельствует в пользу того, что именно эта стадия является лимитирующей при образовании активного фотопротеина.

В результате проведенных экспериментов была впервые исследована собственная флуоресценция апофотопротеинов и определены константы диссоциации комплекса апофотопротеин-целентеразин для апообелина и апоакворина. На основе предложенной математической модели, описывающей формирование активного фотопротеинового комплекса, были оценены константы скорости этого процесса для обелина и ряда его мутантов. Адекватность предложенной модели подтверждается хорошим соответствием энергии активации фотопротеинового комплекса, рассчитанной с ее помощью, с величиной энергии активации, полученной с помощью квантово-химических вычислений.

Для выявления аминокислотных остатков целентеразин-связывающей полости, играющих важную роль в процессе образования активного фотопротеинового комплекса, методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза были получены мутанты обелина и акворина с заменами His 175,

Tip 179 и Туг 190 на остатки с различными донорно-акцепторными свойствами боковых цепей. На основании изучения полученных мутантов предложена гипотеза об образовании активного фотопротеинового комплекса, отражающая роль некоторых аминокислотных остатков в этом процессе. Согласно гипотезе, His 175 участвует не только в стабилизации 2-гидропероксицелентеразина, но и в процессе образования целентеразина, протонированного по С2-атому, играя роль переносчика протона от N7-атома. Остаток Туг 138 поляризует С2-Н связь, обеспечивая тем самым позиционирование молекулы кислорода возле протонированного С2-атома целентеразина, необходимое для последующего эффективного образования 2-гидроперокиси-производного.

Таким образом, полученные в данной работе результаты позволили пролить свет на процесс образования активного фотопротеинового комплекса и могут найти применение в прикладных исследованиях, в частности для использования фотопротеинов в качестве репортерных молекул in vivo.

В заключение выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю к.б.н. Е.С. Высоцкому, а также моим коллегам из лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН за помощь в постановке и проведении экспериментов, интерес к работе и обсуждение полученных результатов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Еремеева, Елена Владимировна, Красноярск

1. Бондарь B.C. Физико-химические свойства фотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima / B.C. Бондарь, К.П. Трофимов, Е.С. Высоцкий // Биохимия. - 1992. - Т. 57. - С. 1481-1490.

2. Высоцкий, Е.С. Выделение и очистка Са -зависимого фотопротеина — обелина из гидроидных полипов Obelia longissima / Е.С. Высоцкий, B.C. Бондарь, В.Н. Летунов // Биохимия. 1989. - Т. 54. - С. 965-973.

3. Высоцкий, Е.С. Кальций-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных / Е.С. Высоцкий, С.В. Маркова, Л.А. Франк // Молекулярная биология. 2006. - Т. 40, №3. - С. 404 - 417.

4. Илларионов, В.А. Клонирование и экспрессия кДНК кальций-активируемого фотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima / В.А. Илларионов, С.В. Маркова, B.C. Бондарь, Е.С. Высоцкий, И.И. Гительзон // Докл. Акад. наук. 1992. - Т. 326. - С.911-913.

5. Ababou, A. On the involvement of electron transfer reactions in the fluorescence decay kinetics heterogeneity of proteins / A. Ababou, E. Bombarda // Protein Sci. 2001. - V. 10. - P. 2102-2113.

6. Adams, P.D. Intramolecular quenching of tryptophan fluorescence by the peptide bond in cyclic hexapeptides / P.D. Adams, Y. Chen, К. Ma, M. Zagorski, F.D. Sonnichsen, M.L. McLaughlin, M.D. Barkley // J. Am. Chem. Soc. 2002. - V. 124. - P. 9278-9286.

7. Adman, E.T. Structural features of azurin at 2.1 К resolution / E.T. Adman, L.H. Jensen//Isr. J. Chem. 1981. - V. 21. -P.8-12.

8. Akyol, Z. Apo-calmodulin binds with its C-terminal domain to the N-methyl-D-aspartate receptor NR1 CO region / Z. Akyol, J.A. Bartos, M.A. Merrill, L.A. Faga, O.R. Jaren, M.A. Shea, J.W. Hell // J. Biol. Chem. -2004. V. 279. - P. 2166-2175.

9. Allen, D.G. Aequorin luminescence: relation of light emission to calcium concentration a calcium independent component / D.G. Allen, J.R. Blinks,

10. F.G. Prendergast // Science. 1977. - V. 195. - P. 996-998.

11. Ballew, R.M. Direct observation of fast protein folding: the initial collapse of apomyoglobin / R.M. Ballew, J. Sabelko, M. Gruebele // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93. - P. 5759-5764.

12. Bollen, YJ.M. Last in, first out: the role of cofactor binding in flavodoxin folding / YJ.M. Bollen, S.M. Nabuurs, W.J.H. van Berkel, C.P.M. van Mierlo // J. Biol. Chem. 2005. - V. 280. - P. 7836-7844.

13. Boyer, M. Quantitative characterization of the interaction between purified human estrogen receptor a and DNA using fluorescence anisotropy / M. Boyer, N. Poujol, E. Margeat, C.A. Royer // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28.-P. 2494-2502.

14. Burstein, E.A. Luminescence of protein chromophores / E.A. Burstein // In Model studies: science and technology results. 1976. - V. 6: Biophysics,1. VINITI, Moscow.

15. Callis, F.R. Quantitative prediction of fluorescence quantum yields for tryptophan in proteins / F.R. Callis, T. Liu // J. Phys. Chem. B. 2004. - V. 108.-P. 4248-4259.

16. Campbell, A. K. Extraction, purification and properties of obelin, the calcium -activated protein from the hydroid Obelia geniculata / A.K. Campbell//Biochem.- 1974.-V. 143.-P. 411-418.

17. Canet, D. High-sensitivity fluorescence anisotropy detection of protein-folding events: application to a-lactalbumin / D. Canet, K. Doering, C.M. Dobson, Y. Dupont // Biophys, J. 2001. - V. 80. - P. 1996-2003.

18. Chen, R.F. Fluorescence quantum yield of tryptophan and tyrosine / R.F. Chen // Anal. Lett. 1967. - V. 1 - P. 35-42.

19. Chen, Y. The peptide bond quenches indole fluorescence / Y. Chen, B. Liu, H.-T. Yu, M.D. Barkley // J. Am. Chem. Soc. 1996. - V. 118. - P. 92719278.

20. Chen, Y. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins / Y. Chen, M.D. Barkley // Biochemistry. 1998. - V. 37. - P. 9976-9982.

21. Cherednikova, E.Yu. Quenching of tryptophan fluorescence of firefly luciferase by substrates / E.Yu. Cherednikova, A.Yu. Chikishev, E.I. Dementieva, O.V. Kossobokova, N.N. Ugarova // J. Photochem. Photobiol., B.-2001.-V. 60.-P. 7-11.

22. Chudinova , E.A. Fluorescence of tryptophan residues in firefly luciferases and enzyme-substrate complexes / E.A. Chudinova, E.I. Dementieva, L.Yu. Brovko, A.P. Savitskii, N. N. Ugarova // Biochemistry (Moscow). 1999. -V. 64.-P. 1097-1103.

23. Conti, E. Crystal structure of firefly luciferase throws light on a superfamily of adenylate-forming enzymes / E. Conti, N. P. Franks, P. Brick // Structure. 1996.-V. 4.-P. 287-298.

24. Cormier, MJ. Evidence for similar biochemical requirements forbioluminescence among the coelenterates / M. J. Cormier, K. Hori, Y.D. Karkhanis, J.M. Anderson, J.E. Wampler, J.G. Morin, J.W. Hastings // J. Cell. Physiol. 1973. -V. 81. - P. 291-297.

25. Dement'eva, E.I. Inactivation of Luciola mingrelica firefly luciferase by guanidinium chloride and its reactivation / E.I. Dement'eva, L.G. Maloshenok, N.N. Ugarova // Moscow University Chem. Bull. 2000. - V. 55.-P. 23-28.

26. Deng, L. Structural basis for the emission of violet bioluminescence from a W92F obelin mutant / L. Deng, E.S. Vysotski, Z.-J. Liu, S.V. Markova, N.P. Malikova, J. Lee, J. Rose, B.-C. Wang // FEBS Lett. 2001. - V. 506. - P. 281-285.

27. Eckenhoff, R.G. Cooperative binding of inhaled anesthetics and ATP to firefly luciferase / R.G. Eckenhoff, J.W. Tanner, P.A. Liebman // Proteins. -2001.-V. 42.-P. 436-441.

28. Edelhoch, H. Spectroscopic determination of tryptophan and tyrosine in proteins / H. Edelhoch // Biochemistry. 1967. - V. 6. - P. 1948-1954.

29. Eftink, M.R. Indole fluorescence quenching studies on proteins and model systems: use of the inefficient quencher succinimide / M.R. Eftink, C.A. Ghiron // Biochemistry. 1984. -V. 23. - P. 3891-3899.

30. Eftink, M.R. Fluorescence techniques for studying protein structure / M.R. Eftink // Methods Biochem. Anal. 1990. - V. 35. - P. 117-129.

31. Eftink, M.R. Fluorescence quenching: theory and applications / M.R. Eftink // In Topics in fluorescence spectroscopy, Principles. Ed. J.R. Lakowicz -1991.-V. 2.-P. 53-126.

32. Eftink, M.R. Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions / M.R. Eftink // Methods Enzymol. -1997.-V. 278.-P. 221-257.

33. Fagan, T.F. Cloning, expression and sequence analysis of cDNA for the Ca(2+)-binding photoprotein, mitrocomin / T.F. Fagan, Y. Ohmiya, J.R. Blinks, S. Inouye, F.I. Tsuji // FEBS Lett. 1993. -V. 1. - P. 301-305.

34. Floehlich, P.M. Fluorescence quenching of indoles by amides / P.M. Floehlich, K. Nelson // J. Phys. Chen. 1978. - V. 82. - P. 2401-2403.

35. Gilmanshin, R. Structures of apomyoglobin's various acid-destabilized forms / R. Gilmanshin, M. Gulotta, R.B. Dyer, R.H. Callender // Biochemistry. 2001. - V. 40. - P. 5127-5136.

36. Goto, T. Chemistry of bioluminescence / T. Goto // Pure Appl. Chem. -1968.-V. 17.-P. 421-441.

37. Goto, T. Cypridina bioluminescence. IV. Synthesis and chemiluminescence of 3,7-dihydroimidazol,2-a.pyrazin-3-one and its 2-methyl derivative / T. Goto, S. Inoue, S. Sugiura// Tetrahedron Lett. 1968. - P. 3873-3876.

38. Gryczynski, I. Lifetime distributions and anisotropy decays of indole fluorescence in cyclohexane/ethanol mixtures by frequency-domain fluorometry / I. Gryczynski, W. Wiczk, M.L. Johnson, J.R. Lakowicz // Biophys. Chem.- 1988.-V. 32.-P. 173-185.

39. Head, J.F. The crystal structure of the photoprotein aequorin at 2.3 A resolution // J.F. Head, S. Inouye, K. Teranishi, O. Shimomura // Nature. -2000. V. 405. - P. 372-376.

40. Hori, K. Renilla luciferin as the substrate for calcium induced photoprotein bioluminescence. Assignment of luciferin tautomers in aequorin and mnemiopsis / K. Hori, J.M. Anderson, W.W. Ward, M.J. Cormier // Biochemistry. 1975. -V. 14. - P. 2371-2376.

41. Hori, K. Structure of native Renilla reniformis luciferin / K. Hori, H. Charbonneau, R.C. Hart, M.J. Cormier // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1977. V. 74. - P. 4285-^4287.

42. Illarionov B.A. Sequence of the cDNA encoding the Ca(2+)"activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissima / B.A. Illarionov, V.S. Bondar, V.A. Illarionova, E.S. Vysotski.// Gene. 1995. -V. 153. — P.273—274.

43. Illarionov B.A. Recombinant obelin: Cloning and expression of cDNA, purification, and characterization as a calcium indicator / B. A. Illarionov,

44. A. Frank, V.A. Illarionova, V. S. Bondar, E.S. Vysotski, J.R. Blinks // Methods of enzymology. 2000. - V. 305. - P. 223-249.

45. Imai, Y. Fluorescence properties of phenolate anions of coelenteramide analogues: the light-emitter structure in aequorin bioluminescence / Y. Imai, T. Shibata, S. Maki, S. Niwa, M. Ohashi, T. Hirano // Photochem. Photobiol. A.-2001.-V. 146.-P. 95-107.

46. Inouye S. Cloning and sequence analysis of cDNA for the luminescent protein aequorin / S. Inouye, M. Noguchi, Y. Sakaki, Y. Takagi, T. Miyata, S. Iwanaga, T. Miyata, F.I. Tsuji // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - V. 82.-P. 3154-158.

47. Inouye S. Expression of apoaequorin complementary DNA in Escherichia coli. / S. Inouye, Y. Sakaki, Y. Goto, F.H. Tsuji // Biochemistry. 1986. -V. 25.-P. 8425-8429.

48. Inouye S. Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca(2+)"activated photoprotein, clytins / S. Inouye, F.I. Tsuji // FEBS Lett. 1993. — V. 11.— P.343-346.

49. Ireland J.F. Acid-base properties of electronically excited states of organic molecules / J.F. Ireland, P.A.H. Wyatt // Adv. Phys. Org. Chem. 1976. -V. 12.-P. 131-221.

50. Jones, B.E. Local and global dynamics during the folding of Escherichia coli dihydrofolate reductase by time-resolved fluorescence spectroscopy / B.E. Jones, J.M. Beechem, C.R. Matthews // Biochemistry. 1995. - V. 24. - P. 1867-1877.

51. Kozlov, A.G. Stopped-flow studies of the kinetics of single-stranded DNA binding and wrapping around the Escherichia coli SSB tetramer / A.G. Kozlov, T.M. Lohman // Biochemistry. 2002. - V. 41. - P. 6032-6044.

52. Kretsinger, R. H. Carp muscle calcium binding protein. II. Structure determination and general description / R.H. Kretsinger, C.E. Nockolds // J. Biol. Chem.- 1973. V. 248. - P. 3313-3326.

53. Kurose, K. Bioluminescence of the calcium-binding photoprotein aequorin after cysteine modification / K. Kurose, S. Inouye, Y. Sakaki, F.I. Tsuji // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - Vol. 86. - P. 80-84.

54. Laemli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4 / U.K. Laemli // Nature. 1970. - V. 227. - P. 68685.

55. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. 2006. 3rd Ed., Springer, Singapore.

56. Lewis J.C. Bioluminescence and Secondary Structure Properties of Aequorin Mutants Produced for Site-Specific Conjugation and Immobilization / J.C. Lewis, J.J. Lopez-Moya, S. Daunert // Bioconjugate Chem. 2000. - V. 11. - P. 65-70.

57. Li, Z. Spectral properties of Trpl82, Trpl94, and Trp250 on the alpha subunit of bacterial luciferase / Z. Li, N. Valkova, E. Meighen // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. -V. 263. - P. 820-824.

58. Liu, Z.J. Structure of the Ca2+-regulated photoprotein obelin at 1.7 A resolution determined directly from its sulfur substructure / Z.J. Liu, E.S. Vysotski, C.J. Chen, J. Rose, J. Lee, B.-C. Wang // Protein Sci. 2000. - V.9. P. 2085-2093.

59. Loewenthal, R. Fluorescence spectrum of barnase: contributions of three tryptophan residues and a histidine-related pH dependence / R. Loewenthal, J. Sancho, A.R. Fersht // Biochemistry. 1991. -V. 30. - P. 6775-6779.

60. Madvar A.R. Implication of a critical residue (Glul75) in structure and function of bacterial luciferase / A.R. Madvar, S. Hosseinkhani, K. Khajeh, B. Ranjbar, A. Asoodeh // FEBS Lett. 2005. - V. 579. - P. 4701-4706.

61. Malikova, N. P. Spectral tuning of obelin bioluminescence by mutations of Trp92 / N.P. Malikova, G.A. Stepanyuk, L.A. Frank, S.V. Markova, E.S. Vysotski, J. Lee //FEBS Lett. -2003. -V. 554. P. 184-188.

62. McCapra, F. The chemiluminescence of Cypridina analogue / F. McCapra, Y.C. Chang// Chem. Commun. 1967. - P. 1011-1012.

63. Mori, K. Real light emitter in the bioluminescence of the calcium-activated photoproteins aequorin and obelin: light emission from the singlet-excited state of coelenteramide phenolate anion in a contact ion pair / K. Mori, S.

64. Maki, H. Niwa, H. Ikeda, Т. Hirano // Tetrahedron. 2006. - V. 62. - P. 6272-6288.

65. Morin, J. G. Biochemistry of the bioluminescence of colonial hydroids and other coelenterates / J.G. Morin, J.W. Hastings // J. Cell. Physiol. 1971. -V. 77.-P. 305-312.

66. Morin, J. G. Coelenterate bioluminescence / J. G. Morin; edited by L. Muscatine, H. M. Lenhoff // Coelenterate Biology: Reviews and New Perspectives. New York: Academic press, 1974. - P. 397—438.

67. Ohmiya, Y. Two excited states in aequorin bioluminescence induced by tryptophan modification / Y. Ohmiya, M. Ohashi, F.I. Tsuji // FEBS Lett. -1992.-V. 301.-P. 197-201.

68. Ohmiya Y. Bioluminescence of the Ca binding photoprotein, aequorin, after histidine modification / Y. Ohmiya, F.I. Tsuji // FEBS Lett. 1993. -V. 320.-P. 267-70.

69. Ohmiya, Y. Mass spectrometric evidence for a disulfide bond in aequorin regeneration / Y. Ohmiya, S. Kurono, M. Ohashi, T.F. Fagan, F.I. Tsuji // FEBS Lett. 1993. -V. 332. - P. 225-228.

70. Ohmiya, Y. Shining the light: the mechanism of the bioluminescence reaction of calcium-binding photoproteins / Y. Ohmiya, T. Hirano // Chem. Biol. 1996. - V. 3. - P. 337-347.

71. Pace, C.N. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein / C.N. Pace, F. Vajdos, L. Fee, G. Grimsley, T. Gray // Protein Sci. -1995.-V. 11.-P. 2411-2423.

72. Prasher D. Cloning and expression of the cDNA coding for aequorin, a bioluminescent calcium-binding protein / D. Prasher, R.O. McCann, M.J.

73. Cornier // Biochem.Biophys.Res.Commun. 1985. - V. 126. - P.1259-1268.

74. Raja, S.M. Localization and environment of tryptophans in soluble and membrane-bound states of a pore-forming toxin from Staphylococcus aureus / S.M. Raja, S.S. Rawat, A. Chattopadhyay, A.K. Lala // Biophys J. 1999. -V. 76.-P. 1469-1479.

75. Sambrook J. Molecular Cloning. A laboratory manual // J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - V. 2.

76. Sandalova, T.P. Model of the active site of firefly luciferase / T. P. Sandalova, N. N. Ugarova // Biochemistry (Moscow). 1999. - V. 64. - P. 962-967.

77. Shimomura, O. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea / O. Shimomura, F. H. Johnson, Y. Saiga // J. Cell. Сотр. Physiol. 1962. - V. 59.-P. 223-239.

78. Shimomura O. Extraction, purification and properties of halistaurin, a bioluminescent protein from hydromedusan, Halistaura / O. Shimomura, F.H. Johnson, Y. Saiga//J. Cell Сотр. Physiol. 1963. -V. 62. -P.9-15.

79. Shimomura O. Partial purification and properties of the Chaetopterus luminescence system / O. Shimomura, F.H. Johnson // Bioluminescence in progress. Princeton, 1966. -P.495-521.

80. Shimomura, O. Regeneration of the photoprotein aequorin / O. Shimomura , F.H. Johnson //Nature. 1975. -V. 256. - P. 236-238.

81. Shimomura, O. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin / O. Shimomura, F.H. Johnson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. -V. 75. - P. 2611-2615.

82. Shimomura, O. The relative rate of aequorin regeneration from apoaequorin and coelenterazine analogues / O. Shimomura, Y. Kishi, S. Inouye // Biochem. J. 1993. - V. 296. - P.549-551.

83. Shimomura, О. Light-emitters involved in the luminescence of coelenterazine / O. Shimomura, K. Teranishi // Luminescence. 2000. — V. 15.-P. 51-58.

84. Shimomura, O. Bioluminescence: Chemical Principles and Methods / O. Shimomura. Singapore: World Scientific Publishing Co., 2006. - p. 470.

85. Steiner R.A. Structural basis for cofactor-independent dioxygenation of N-heteroaromatic compounds at the a/p-hydrolase fold // R.A. Steiner, H.J. Janssen, P. Roversi, A.J. Oakley, S. Fetzner // PNAS. 2010. - V. 107. - P. 657-662.

86. Stewart, J. J. Optimization of parameters for semiempirical methods IV: extension of MNDO, AMI, and PM3 to more main group elements / J.J Stewart//J. Mol. Model.- 2004. -V. 10.-P. 155-164.

87. Strynadka, N. C. J. Crystal structures of the helix-loop-helix calcium-binding proteins / N. C. J. Strynadka, M.N.G. James // Annu. Rev. Biochem. 1989. - V. 58. - P. 951-998.

88. Szabo, A.G. Conformational heterogeneity of the copper binding site in azurin / A.G. Szabo, T.M. Stepanik, D.M. Wayner, N.M. Young // Biophys. J. 1983. - V. 41. - P. 233-244.

89. Szittner, R. Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium / R. Szittner, E. Meighen // J. Biol. Chem. 1990. -V. 265. - P. 16581-16587.

90. Terwilliger, T.C. The structure of melittin / T.C. Terwilliger, D. Eisenberg // J. Biol. Chem. 1982. - V. 257. -V.6016-6022.

91. Thomson, C.M. The widespread occurrence and tissue distribution of the imidazolopyrazine luciferins / C.M. Thomson, P.J. Herring, A.K. Campbell // J. Biolum. Chemilum. 1997. - V. 12. - P. 87-91.

92. Tomilin F.N. Quantum chemical study of mechanism of active photoprotein generation / F.N. Tomilin, L.U. Antipina, E.V. Eremeeva, S.G. Ovchinnikov, E.S. Vysotski//Luminescence. -2010. -V. 25. P. 210-211.

93. Tsuji, F.I. Molecular evolution of the Ca -binding photoproteins of the Hydrozoa / F.I. Tsuji, Y, Ohmiya, T.F. Fagan, H. Toh, S. Inouye // Photochem. Photobiol. 1995. -V. 62. - P. 657-661.

94. Ugarova, N.N. Interaction of firefly luciferase with substrates and their analogs: a study using fluorescence spectroscopy methods / N.N. Ugarova // Photochem. Photobiol. Sci. 2008. - V. 7. - P. 218-227.

95. Ulrich, A. Mapping the interface between calmodulin and MARCKS-related protein by fluorescence spectroscopy / A. Ulrich, A.A.P. Schmitz, T. Braun, T. Yuan, H.J. Vogel, G. Vergeres // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. -V. 97.-P. 5191-5196.

96. Usami, K. Low-temperature photooxygenation of coelenterate luciferin analog synthesis and proof of 1,2-dioxetanone as luminescence intermediate / K. Usami, M. Isobe // Tetrahedron. 1996. - V. 52. - P. 12061-12090.

97. Vysotski E.S. Preparation and X-ray crystallographic analysis of recombinant obelin crystals diffracting to beyond 1.1 A. / E. S. Vysotski, Z.J. Liu, J. Rose, B.C. Wang, J. Lee //Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. -2001.-V. 57.-P. 1919-1921.

98. Vysotski, E.S. Ca -regulated photoproteins: structural insight into the bioluminescence mechanism / E.S. Vysotski, J. Lee // Acc. Chem. Res. -2004.-V. 37.-P. 405^115.

99. Ward, W.W. Properties of mnemiopsin and berovin, calcium-activated photoproteins from the ctenophores Mnemiopsis sp. / W.W. Ward, H.H. Seliger//Biochemistry. 1974.-V. 13.-P.l500-1510.