Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль триптофановых остатков активного центра в биолюминесцентной реакции фотопротеина обелина

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль триптофановых остатков активного центра в биолюминесцентной реакции фотопротеина обелина"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ

На правах рукописи

Маликова Наталья Петровна

РОЛЬ ТРИПТОФАНОВЫХ ОСТАТКОВ АКТИВНОГО ЦЕНТРА В БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ РЕАКЦИИ ФОТОПРОТЕИНА ОБЕЛИНА

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Красноярск, 2004

Работа выполнена в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН (Красноярск)

Научные руководители:

академик И.И. Гительзон

кандидат биологических наук

Л.А. Франк (Институт биофизики СО РАН)

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

H.A. Гаевский (Красноярский

Государственный Университет)

доктор биологических наук

Т.Г. Волова (Институт биофизики СО РАН)

Ведущая организация:

Химический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится « и » (Х-^г^и2004г. в часов на заседании

Специализированного Совета Д 003.007.01. по защитам диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук при Институте биофизики СО РАН (660036, г. Красноярск, Академгородок). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН.

Автореферат разослан « Л € » алир'Ш 2004г.

Учёный секретарь Специализированного Совета, к. ф-м. наук

Косолапова Л.Г.

и

шт

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биолюминесцентная система Са2+-регулируемых фотопротеинов морских кишечнополостных организмов является на сегодняшний день одной из наиболее изученных. Уникальность этих белков состоит в том, что они представляют собой устойчивый фермент-субстратный комплекс из одноцепочечного нолипептида (около 20 кДа), целентеразина и кислорода. Присоединение ионов кальция вызывает конформационные перестройки в белке, в результате которых практически мгновенно развивается реакция окислительного декарбоксилирования целентеразина, продуктами которой являются целентерамид, СОг и квант света в голубой области спектра. Несмотря на то, что, на данный момент накоплены глубокие знания о структуре и свойствах фотопротеинов, остаётся невыясненной роль ключевых аминокислотных остатков активного центра в осуществлении биолюминесцентной функции фотопротеинов.

В 2000г. были установлены пространственные структуры двух фотопротеинов - акворина из медузы Aequoria victoria и обелина из гидроидного полипа Obelia longissima. Показано, что в обоих белках субстрат локализован в виде пероксицелентеразина внутри гидрофобной полости белковой глобулы нековалентными связями. Среди аминокислотных остатков, участвующих в локализации пероксицелентеразина, в обоих белках находятся 4 триптофановых остатка, образующих «сэндвич»-структуры с ароматическими остатками молекулы целентеразина. Эти триптофановые остатки являются строго консервативными среди всех фотопротеинов, для которых к настоящему времени определены аминокислотные последовательности.

Цели и задачи исследования. Целью представленной работы являлось определение роли триптофановых остатков активного центра в биолюминесцентной реакции Са2+-регулирусмого фотопротеина обелина на основе исследования основных физико-химических свойств мутантных форм обелина с разными заменами триптофановых остатков активного центра.

Выполнение данного исследования требовало:

1. Выделить в чистом виде мутантные формы рекомбинантного фотопротеина обелина, имеющие замены по триптофановым остаткам активного центра на фенилаланин, и мутантные формы, имеющие замены по 92-му триптофановому остатку на гистидин, аргинин, лизин и глутаминовую кислоту.

2. Исследовать основные характеристики полученных мутантных форм рекомбинантного обелина: скорость и эффективность образования фермент-субстратного комплекса, стабильность образованного фотопротеина, его биолюминесцентная активность, а также спектральные характеристики биолюминесценции, поглощения и флуоресценции.

3. Сравнить полученные данные с физико-химическими свойствами обелина дикого типа. На основе влияния той или иной мутации на

рос. национальная!

СИБЛ«ОТЕКА I

¿*Sfc?v/l

основные характеристики обелина установить функцию триптофановых остатков активного центра.

При решении поставленных задач получены результаты, которые выносятся на защиту:

I. Замена 114-го и 135-го триптофановых остатков активного центра обелина, локализованных у 2-гидроксибензильной группы целентеразина, приводят к существенному уменьшению способности апобелков образовывать устойчивые фотопротеиновые комплексы и резкому падению специфической активности, что свидетельствует о важной роли этих остатков в локализации молекулы целентеразина.

II. Замены 92-го триптофанового остатка обелина, который локализован у 6-п-гидроксифенильной группы целентеразина, приводят к изменению спектральных характеристик биолюминесценции. Это изменение связано со сдвигом равновесия между таутомерными формами эмиттера - фенолят-анионом в ион-парном состоянии (Х,„ах = 475 нм) и нейтральной формой (hmx = 390 нм) возбужденной молекулы целентерамида. Тгр92 участвует в формировании структуры молекулы-эмиттера.

III. Предложена гипотеза, согласно которой финальной стадией образования эмиттера биолюминесцентной реакции Са2+-регулируемых фотопротеинов является перенос протона 6-п-гидроксифенильной группы возбужденного целентерамида на His22, эффективность которого регулируется водородной связью между атомом азота индольного кольца и 6-п-гидроксифенильной группой целентеразина.

Научная новизна и практическая ценность. Все результаты данной работы получены впервые и перспективны для использования в фундаментальных и в прикладных исследованиях. Высокая скорость биолюминесцентного ответа и высокая чувствительность к ионам Са2+ в сочетании с разными спектральными характеристиками некоторых полученных мутантных белков делают их перспективными для использования в качестве индикаторов для одновременного изучения кальциевых потоков в различных клеточных органеллах. Это позволит оценить функционально связанные переходы кальция в разных частях клетки и углубить понимание регуляторной функции ионов кальция в различных клеточных процессах. Также перспективным может быть использование мутантов обелина с изменёнными спектральными характеристиками как меток в иммуноанализе для одновременного определения нескольких антигенов с регистрацией сигнала на разных длинах волн.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на XII-M Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (Кэмбридж, Великобритания, 2002) и на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы.

Структура и объём работы. Работа изложена на 93 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение результатов исследования, заключение, выводы и список цитируемой литературы (80 источников). Диссертационная работа проиллюстрирована 32 рисунками, содержит 11 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работы по сайт-направленному мутагенезу и получению штаммов-продуцентов, экспрессирующих мутантные варианты апообелина, были проведены старшим научным сотрудником лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН Марковой C.B. Все произведенные мутации подтверждены сиквенсом.

1. Выделение и очистка белков

Культивирование трансформированных клеток E.coli BL21Gold в среде LB, содержащей ампициллин (200 мг/л), проводили при 37°С до плотности OD590 = 0,6 - 0,8. Индукцию синтеза белков проводили ИПТГ (100 мг/л), далее клетки культивировали еще в течение 3 ч и осаждали центрифугированием (11000 g, 20 мин). Супернатант отбрасывали, а полученную клеточную массу ресуспендировали в 0,9% NaCl и вновь центрифугировали. Полученные в осадке клетки использовали для выделения апобелков.

Очистку мутантных апобелков проводили по схеме, разработанной в лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН для рекомбинантного апообелина дикого типа с небольшими модификациями. При очистке использовали стандартное хроматографическое оборудование фирмы «Pharmacia». Чистоту рекомбинантных апобелков, полученных после выделения, оценивали с помощью электрофореза в 12,5% ПААГ в денатурирующих условиях по методу Лэммли.

Содержание белка определяли микробиуретовым методом, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин (БСА).

2. Изучение биолюминесцентных свойств мутантных белков

а) кинетика процесса активации

Активацию апобелков синтетическим целентеразином проводили инкубацией апобелков с 10-кратным молярным избытком целентеразина в буфере, содержащем 5 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитола, 20 мМ Трис-HCl, рН 7.0 при 4°С.

Биолюминесцентный сигнал фотопротеинов измеряли с помощью люминометра (БЛМ8802, СКТБ Наука, Россия). Измерения проводили в 100 мМ Трис-HCl рН 8.8, содержащем 10 мМ ЭДТА, сразу после внесения насыщающей концентрации СаС12. Сигнал регистрировали с помощью самописца (LKB, модель 2210). Приведённые значения представляют собой среднее значение, как минимум, от 3-х измерений.

б) удельная биолюминесцентная активность

Активированные белки отделяли от неактивированных (апобелков) ионообменной хроматографией на колонке Mono Q 5/5 (хромат ографическая система FPLC, Pharmacia, Швеция). Элюцию белков с колонки проводили в 20 мМ Трис-HCl рН 7.0, 5 мМ ЭДТА градиентом NaC! (0-0,35 М).

Относительную удельную биолюминесцентную активность (относительно обелина дикого типа) мутантов определяли с помощью планшетного люминометра Luminoskan vl.30 (Labsystems, Финляндия). Для этого в лунки непрозрачного планшета вносили по 50 мкл раствора фотопротеина в 20 мМ Трис-НС1-буфере рН 7.0, содержащем 5 мМ ЭДТА и 0,2 М NaCl. Реакцию запускали впрыскиванием 50 мкл 100 мМ Трис-НС1-буфера, рН 8.8, содержащего 100 мМ СаС12, в каждую лунку планшета. Время сканирования сигнала - 5 сек. Приведенные значения представляют собой средние от 5-ти независимых определений.

в) кальций-независимая люминесценция

Кальций-независимая люминесценция была измерена в белковых образцах (0,5-2,0 мг/мл) (20 мМ Трис-HCI рН 7.0, 5 мМ ЭДТА), помещённых в кювету люминометра.

г) термоинактивация мутантных белков

Термоинактивацию мутантов проводили, инкубируя белки при 30°С и 40°С в растворе 20 мМ Трис-HCl рН 7.0, содержащем 5 мМ ЭДТА, степень которой оценивали по остаточной биолюминесцентной активности, которую периодически измеряли в течение 80 - 90 мин.

д) спектральные характеристики мутантных белков

Спектры биолюминесценции и флуоресценции были измерены на спектрофлуориметре AM1NCO (Thermo Spectronic, США). Все спектры излучения были корректированы на чувствительность ФЭУ к различным длинам волн с помощью программного обеспечения прибора. Спектры биолюминесценции измеряли в белковых растворах, содержащих 1 мМ ЭДТА, 50 мМ Бис-Трис пропан с рН 5,5, 7,0 или 8,5 при впрыскивании раствора СаС12 в том же буфере. Концентрация свободного кальция в реакционной смеси составляла около 0,5 цМ, (концентрация была рассчитана с помощью компьютернрй программы Maxichelator) для того, чтобы обеспечить постоянный уровень свечения во время записи спектра излучения. Спектры флуоресценции были записаны для кальций-разряженных белков. Образцы капьций-разряженных белков готовили 10-кратным разбавлением растворов фотопротеинов 50 мМ Бис-Трис пропановым буфером (рН 5.5, 7.0 или 8.5), содержащим 1 мМ СаСЬ-

Спектры поглощения белковых растворов регистрировали с помощью спектрофотометра UVIKON 943 (Kontron Instruments, Италия).

Наиболее вероятные конформации боковых цепей аминокислотных остатков активного центра обелина и его мутантов оценивали с помощью компьютерной программы Swees-PdbVewer 3,7.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и характеристика мутантных форм фотопротеина обелина с заменами триптофановых остатков активного центра на фенилаланин.

Все полученные апобелки с заменой одного триптофанового остатка на фенилаланин - \V92F, \V114F, \V135F, \V179F, а также с заменой двух триптофановых остатков - \УУ/92,179РР и \\^114,135РР - гомогенны по данным гель-электрофореза. Выход мутантных апобелков составлял 29-32 мг белка с грамма сырой биомассы трансформированных клеток Е.соИ.

Активация апобелков синтетическим целентеразином. На рис. 1 представлены кинетики реакции активации мутантов и обелина дикого типа.

Рис.1. Активация WT (-о-) и его мутантных форм по триптофановым остаткам: (-•-) - W92F, (-А-) - W114F, (-▼-)-W135F, (-■-) - W179F, (-♦-). WW114,135FF, (-О-) - WW92.179FF.

Скорости образования фермент-субстратного комплекса мутантов отличаются от таковой обелина дикого типа в разной степени. Меньше всего на активационном процессе отразилась мутация по 92-му триптофановому остатку. Для остальных мутантов процесс активации протекал с существенно меньшей скоростью и меньшей эффективностью. На основе аппроксимации одной экспонентой кривых кинетики активации мутантных апобелков с помощью уравнения L = А X (1- е "kt) и программы Sigma Plot 2000 были рассчитаны значения констант скорости активации, значения которых составили для W92F - 4,47x10"3 мин1, для W179F - 2,85х103 мин1, для WW92,179FF- З,7х10"3 мин"1, для W114F - 1,05х10-7 мин 11,для W135F - 1,73х10'7 мин"1 и для WW114,135FF - 9.9X10"4 мин"1. Для обелина дикого типа константа скорости активации составляет 8,7х10"3 мин"1.

В целом отмечено, что мутации Тгр92 и Trpl 79, расположенных в области 6-п-гидроксифенильной группы целентеразина, отразилось на процессе активации в меньшей степени, чем мутация Trpl 14 и Trpl35, расположенных около 2-п-гидроксибензильной группы целентеразина. Для последних константа скорости образования активного фотопротеина существенно (в 8000, 5000 и 80 раз, соответственно) отличается от WT.

Максимальные биолюминесцентные активности (отн. ед./ мг белка) всех мутантов, исключая W92F, существенно отличаются от активности дикого варианта. Это может быть связано с низкой эффективностью образования активного фотопротеина и/или низким квантовым выходом биолюминесцентной реакции мутантных фотопротеинов. Для определения эффективности процесса активации фотопротеины и исходные апобелки разделили с помощью ионообменной хроматографии на колонке MonoQ (5/5). Оказалось, что W92F, W179F и WW92.179FF активировались практически полностью, а количество активного белка для мутантов W114F, W135F и WW114,135FF составило 12%, 21% и 6% от исходного апобелка, соответственно. Низкая эффективность активации последней группы мутантов, возможно, связана с изменениями конформации активного центра, вызванными данной мутацией.

Для дальнейших исследований были использованы мутантные фотопротеины, активированные в течение суток. Апобелки удаляли с помощью ионообменной хроматографии на колонке MonoQ (5/5).

Удельная биолюминесцентная активность. В таблице 1 представлены значения удельной биолюминесцентной активности полученных мутантных белков. Результат выражен в процентных долях по отношению к удельной специфической активности обелина дикого типа. Приведённые данные измерены при рН 7.0. В скобках приведены значения при t^,, = 10 сек.

Мутантный вариант обелина W92F имел такую же биолюминесцентную активность, как и дикий вариант. Два других мутанта, W114F и W135F, имели специфическую активность, близкую к обелиновой Замена Trpl 79 приводит к падению специфической активности на 70%, и наиболее драматичной для биолюминесцентной активности оказалась одновременная замена Trpl 14 и Тгр135 (остаточная активность составила 0,76%). Такая низкая биолюминесцентная активность свидетельствует о том, что мутации этих остатков приводят к крайне низкой эффективности преобразования энергии химической реакции окисления целентеразина в световую.

Таблица 1

Основные биолюминесцентные свойства мутантных белков

Относительная Удельная

Белок удельная биолюм инесцентная активность (% от WT обелина ) кальций-независимая люминесценция (отн.ед./мг) Ica-free^ca> отн.ед.хЮ'7 lg Icafree/Ica

WT 100 ± 4,6 0,8 х 102 0,86 -7,07

W92F 99 ± 1,1 2,3 х 102 1,85 -6,73

W179F 50 ± 1,04 (67 ± 3) 2,8 х 102 17,85 -5,75

W92.179F 38 ± 0,54 (71 ± 1,5) 4,1 х 102 15,22 -5,82

W114F 92,5 ± 2,63 1,2 х 104 67,56 -5,17

W135F 94 ± 6,2 1,0 х 10" 59,88 -5,22

W114.135F 0,76 ± 0,015 0,2 х 104 16,11 -5,79

Кальций-независимая люминесценция Важной характеристикой фотопротеинов является уровень фонового свечения, так называемой Са2+-независимой люминесценции, который является одним из показателей устойчивости фотопротеинового комплекса. Показано, что все мутакгные фотопротеины обладают более высоким уровнем Са2+-незав исимой люминесценции, увеличивающимся в ряду \V92F < \У92,179Р < W114,l35F < \V179F < НЧЗЗР < \V114F (таблица 1). Причём для \V92F этот показатель незначительно отличается от \\НГ, для остальных белков он увеличивается на один и даже два порядка. Таким образом, выявлено, что мутации триптофановых остатков активного центра приводит к снижению устойчивости фотопротеинового комплекса.

Кинетика биолюминесцентной реакции мутантных белков. Кинетика биолюминесцентного сигнала всех мутантных белков характеризуется высокой скоростью подъема. В то же время, спад сигнала существенным образом отличается и не может быть описан одной экспонснтой. Для мутантов \V92F, XVI14Р, Х¥135Р и \У114,135Р биолюминесцентная реакция заканчивается быстро в течение примерно 1 сек. Сигнал XVI79Р равномерно спадает в течение примерно 10 сек. А для двойного мутанта ЛМ92,\79¥ он имеет сложный характер и состоит из участка с быстрым спадом сигнала и из участка с существенно более медленным спадом, длительность которого составляет также примерно 10 сек.

Кинетику биолюминесцентной реакции одного из мутантов - \V92F -исследовали с помощью метода «остановленной струи» в присутствии и в отсутствие ионов На рис. 2 показана кинетика биолюминесцентного

ответа мутантного обелина в сравнении с диким вариантом. Скорость подъёма люминесцентого сигнала мутанта существенно выше, чем дикого обелина. Значение констант скорости подъема, подсчитанные аппроксимацией одной

экспонентой, составляют для мутанта - 992 + 37 сек'1 (без Мя2+) и 774 ± 14 сек"1 (с М§2+), а для дикого обелина, соответственно, 405 ± 4 сек4 и 352 ± 4 сек"'.

Рис. 2. Биолюминесцентные сигналы дикого обелина (вверху) и мутантного белка W92F (внизу), полученные методом «остановленной

струи». Верхние кривые - в отсутствие ионов нижние - в присутствии 1 ОмМ М§2+.

№М в« »ж

Т>те, (в)

Для белка W92F была также исследована зависимость люминесценции от

концентрации ионов Са + (рис. 3).

3

Рис. 3. Зависимости

интенсивности люминесценции от концентрации ионов Са2+ для W92F обелина в отсутствие (кружки) и в присутствии ионов

М§2+(треугольники) и для WT обелина (сплошная и пунктирная линия, соответственно). Заполненные

символы - концентрация кальция -задавалась с помощью Са-ЭДТА буфера. Открытые символы концентрация кальция - задавалась с помощью разведения раствора СаС12.

и

И мутант и обелин \УТ имеют одинаковый диапазон чувствительности к ионам кальция (10~7 М - 10"4 М). Однако максимум люминесценции в насыщающих концентрациях кальция для >Л^92Р располагается немного ниже, чем для \УТ. Наблюдается также одинаково слабое влияние присутствия 10 мМ + на чувствительность к Са2+ для обоих белков.

Спектры поглощения мутантных белков. В спектре поглощения обелина наблюдаются два максимума: Хтах=280 нм, соответствующая поглощению белковой части молекулы и ^^=460 нм, соответствующая поглощению целентеразиновой части молекулы. После замены триптофановых остатков, находящихся в активном центре (Тгр92, Тгр114, Тгр135 и Тгр179) меняется соотношение между максимумами (ОО460/ОВ280), связанное с заменой одного (W92F, W114F, \V135F, \V179F) или двух (W92,179F, W114,135F) из шести триптофановых остатков. Коэффициенты молярной экстинкции мутантных белков на 280 нм при рН 7.0 приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Коэффициенты молярной экстинкции обелина и

С°Л мем

\УТ 2.1

W92F 1.78

\V179F 1.77

\\ОУ92,179РР 1.27

\V114F 1.75

\У135Р 1.82

\¥Ш14,135РР 1.4

Помимо кванта света, продуктом биолюминесцентной реакции фотопротеинов является устойчивый комплекс агюбелок - целентерамид. Кальций-разряженный обелин имеет две полосы в спектре поглощения: 275нм (поглощение белковой части) и 345нм (поглощение целентерамида). Спектры поглощения кальций-разряженных мутантов не отличаются от спектра обелина.

Спектры биолюминесценции Обелин дикого типа излучает в голубой области спектра с максимумом - 475 нм и плечом в районе 400 нм (рис. 4). Спектр излучения не меняется при изменении рН среды, что свидетельствует о недоступности активного центра молекулы для влияния окружения.

1 О

Рис. 4. Нормализованный спектр биолюминесценции обелина при разных рН:

5.5 (—), 7.0 (»..), 8.5 (---).

600

НМ

Спектры излучения мутантных белков: W92F, \V114F, '\V135F, \V179F, >\Г\\'92,179РР, >^>У114,135РР, записанные при разном рН среды, представлены на рисунке 5. Спектры всех мутантов имеют две полосы излучения: в фиолетовой и голубой области спектра. Для мутантов данной группы наблюдается увеличение вклада фиолетовой составляющей спектра в ряду \У135И < \УТ < \V114F < \V179F < \У\У114,135РР < \V92F < \У\У92,179РГ. Наиболее существенные изменения в спектре излучения наблюдаются при замене Тгр92 (мутанты W92F и 179РР). Эти фотопротеины в отличие от

обелина имеют бимодальную биолюминесценцию с практически

эквивалентными по величине максимумами - около 465 нм и 400 нм. Наличие двух полос в спектре свидетельствует о наличии 2-х форм целентерамида -ион-парного состояния фенолят аниона и нейтральной формы. На соотношение двух составляющих спектра и, соответственно, на соотношение этих форм излучателя влияет рН среды. Закисление среды приводит к снижению относительного вклада голубой полосы.

Таким образом, замена 114 и 135-го триптофановых остатков приводит к значительному замедлению и снижению эффективности процесса образования активного фотопротеина, а также к существенному снижению стабильности фотопротеинового комплекса. При этом замены 114 и 135-го остатков практически не меняют такие биолюминесцентные характеристики белка, как кинетика биолюминесцентного сигнала, спектральные характеристики свечения. Можно сделать вывод, что основная роль Тгр114 и Тгр135 заключается в локализации молекулы субстрата с образованием устойчивой конформации активного центра.

350 400 450 500 550

400 450 «О 560

Рис. 5. Нормализованные спектры биолюминесценции мутантных форм обелина:

1 - \V92F,

2 - \V179F, 3-\У\У92Д79Щ

5 - W135F,

6-WW114Д35FF

при рН 5.5 (—), рН 7.0 (-.. )

и рН 8.5 (---)•

Э50 400 450 500

400 430 500 550

При мутации 92-го и 179-го триптофановых остатков зарегистрировано существенное изменение биолюминесцентных свойств обелина: меняются кинетические параметры биолюминесцентного сигнала и спектральные характеристики свечения. Поэтому можно заключить, что основная роль Тгр92 и Тгр179 сводится не только к локализации молекулы субстрата, но также и к формированию разных форм молекулы-эмиттера. В особенности, это относится к белку '\V92F, в котором заменён Тгр92, который в обелине дикого типа образует водородную связь между азотом индольного кольца и 6-п-гидроксифенильной группой целентеразина. Замена этого аминокислотного остатка на остатки, боковые радикалы которых имеют разные кислотно-основные свойства, возможно, приведёт к преимущественному формированию эмиттера фиолетовой люминесценции. С этой целью была исследована другая группа мутантов, полученных с помощью сайт-направленного мутагенеза с заменой Тгр92 на гистидин, лизин, глутаминовую кислоту и аргинин.

Выделение, очистка и свойства мутантных форм обелина с заменой Тгр 92 на другие аминокислотные остатки. Полученные апобелки с заменой триптофана-92 на гистидин (W92H), лизин (W92K), глутаминовую кислоту (W92E) и аргинин (W92R) гомогенны по данным SDS гель-электрофореза, и выход их составлял 22-30 мг белка с грамма сырой биомассы трансформированных клеток E.coli.

Активация апобелков синтетическим целентеразином. Процесс образования фотопротеинового комплекса у мутантов этой группы также протекает с разной скоростью и эффективностью (рис. 6).

100 150 200 250 300 350

Время, мин

Рис. 6. Активация обелина (о) и мутантных белков W92H (*),W92K (Д), W92E (Г), W92R (■) синтетическим целентеразином.

Значения констант скоростей активации апобелков, рассчитанные на основе аппроксимации одной экспонентой, приведены в таблице 3. Процесс активации всех мутантов протекает медленнее процесса активации обелина.

Таблица 3.

Константы скорости активации для обелина ^Т) и его мутантных форм

WT W92H W92K W92E W92R

кает, МИН 1 X 103 8,7 5,9 2,6 1,88 1,1

Максимальные биолюминесцентные активности (отн. ед./ мг белка) мутантов W92E и W92R существенно отличаются от активности дикого варианта. Активированные фотопротеины и исходные апобелки были разделены с помощью ионообменной хроматографии на колонке MonoQ (5/5) и было показано, что количество активного белка для мутанта W92E составило 40% и для W92R лишь 25%.

Удельная биолюминесцентная активность. В таблице 4 представлены значения относительной удельной биолюминесцентной активности полученных мутантных белков.

Таблица 4.

Основные биолюминесцентные свойства мутантных белков

Мутанты Относительная удельная биолюминесцентная активность (% от '№Т) Кальций - независимая люминесценция, отн.ед./мгхЮ2 1са-(гмЛса> отн.ед. X 10"7

\УТ 100 ± 5,7 0,8 0,86

\V92H 99 ± 4,3 3,64 1,75

\V92K 61 ±2,2 0,85 1,0

\V92E 19 ±0,14 1,0 2,0

W92R 8 ±0,1 0,44 3,7

Замена \У92 на фенилаланин и гистидин (мутанты W92F и W92H) не отражается на их биолюминесцентной активности. Остальные замены приводят к падению специфической активности в разной степени. Уровень кальций-независимой люминесценции мутантов незначительно отличается от значения, полученного для обелина. Таким образом, мутантные белки образуют стабильные фотопротеиновые комплексы и понижение квантового выхода биолюминесценции некоторых из них связано с неэффективным преобразованием энергии химической реакции в световую.

Кинетика биолюминесцентной реакции мутантных фотопротеинов Кинетика биолюминесцентного сигнала всех мутантных форм характеризуется высокой скоростью подъема. Спады биолюминесцентного сигнала различаются и их длительность колеблется от, примерно, 1 сек для ■\V92E до 4-5 сек для \V92R. Кинешки спада биолюминесцентного сигнала не могут быть описаны с помощью одной экспоненты.

Спектры поглощения мутантных белков. Обелин и его мутантные варианты имеют одинаковые максимумы в спектре поглощения: 275нм, соответствующий поглощению белковой части фотопротеина и 460 нм, соответствующий поглощению целентеразина. При этом коэффициент молярной экстинкции мутантов на 275нм на 15-20% меньше, чем у обелина, из-за отсутствия у мутантов одного из шести триптофанов.

Несмотря на то, что спектры поглощения заряженных мутантов идентичны, спектры кальций-разряженных мутантов имеют значительные различия (рис. 7.).

Рис 7. Нормированные спектры

поглощения кальций-разряженного

\УТ(-) и кальций-разряженных

мутантных белков:

W92H (—), \V92K (-•-), W92E (-••-),

\У92Ы(аа).

240 260 2В0 300 320 340 360 380 400 420 КМ

Только разряженные ^У92Н и \V92K имеют похожий на спектр поглощения. В спектре поглощения \V92E и \V92R отсутствует полоса, соответствующая поглощению целентерамида (Хтах=334нм), что указывает на неустойчивость комплекса анобелок-целентерамид, что приводит к диссоциации целентерамида в названных мутантных белках.

Спектры биолюминесценции На рис. 8 представлены спектры излучения мутантных белков, записанные при разном значении рН среды.

10 /"Ч 1 1 0

г 3

1 00 / \ 108

I ое / \ 7 Об

1 | 04 ■ ^ \ $ I 04

3 г 02 • / ч X я а ^ 02

с: I ^

00 г........... Ой

350 400 450 500

3 £ 08

350 400 450 500 550

А 4

V

ч\

ЧЧ

Уч.

V,, ...................'

Рис. 8.

Нормализованные спектры

биолюминесценции мутантных форм обелина:

1 - \V92H, 2 - \V92K, 3 - \V92E, 4 - \V92R при рН 5.5 (-), 7.0 (••• ) и 8.5 (---).

350 400 450 Я» 550

350 400 450 500

Все спектры являются бимодальными с максимумами в голубой (445-470 нм) и фиолетовой (около 390 нм) области, вклад которых у разных мутантов различный (таблица 4). Для сравнения в таблице приведены спектральные характеристики дикого обелина. Для мутантов данной группы наблюдается увеличение вклада фиолетовой составляющей спектра в ряду \¥Т< '\\Г92Н< \\^92К< \У92Е< \V92R. Причем замена триптофана на аргинин привела к практически мономодалыюму спектру излучения с Хмах-390 нм и плечом около 450 нм. Таким образом, замена Тгр92 на аминокислотные остатки, имеющие в боковом радикале функциональные группы, способные служить донорами или акцепторами водородной связи, существенным образом меняет распределение между таутомерными формами молекулы-эмиттера этой реакции.

Таблица 5

Соотношение интенсивностей полос люминесценции в фиолетовой и голубой области спектра (Ь39онм/ 1*75™)

рн \УТ \V92H \V92K \V92E \V92R

5,5 0,14 0,35 0,71 1,15 2,6

7,0 0,16 0,31 0,67 1,12 3,3

8,5 0,16 0,32 0,71 1,09 3,3

Формирование эмиттера в биолюминесцентной реакции обелина.

Полученные данные о биолюминесцентных свойствах мутантных форм обелина позволили предложить гипотезу о механизме формирования эмиттера и роли триитофановых остатков активного центра в этом процессе.

Идентификация структуры излучающей молекулы является необходимым условием для определения механизма биолюминесцентной реакции. Ранее МакКапра и Чанг исследовали хемилюминесценцию различных аналогов целентеразина и установили механизм реакции его окисления. Согласно их гипо1езе в апротонных растворителях в присутствии сильного основания реакция протекает с образованием диокситанона с последующим отщеплением молекулы С02 и образованием амид-аниона в возбужденном состоянии. Переход молекулы в основное состояние сопровождается излучением (^тах=455нм). Однако в биолюминесцентных системах первично образующийся возбуждённый анион целентерамида расположен в активном центре белка и водородными связями связан с окружающими его аминокислотными остатками, поэтому высока вероятность протонного переноса, который може-1 изменять структуру молекулы-излучателя. Как известно, такие процессы протекают с высокой скоростью (наносекунды) и могут конкурировать со скоростью излучения амид- аниона.

Позднее в работах Шимомуры с сотрудниками было показано, что в зависимости от окружения, излучающими молекулами являются либо нейтральная форма целентсрамида (фиолетовая область спектра излучения 386423 нм), либо его анионные формы: фенолят анион (480-490 нм) пиразин-К(4)-анион (530-565 нм) или фенолят анион в виде ион-парного состояния (465-479нм) (рис. 10.).

Рис. 10. Структурные формулы различных излучающих форм молекулы целентерамида.

Спектр биолюминесценции обелина имеет максимум при 475 нм с небольшим плечом при 400 нм, что соответствует излучению целентерамида в виде фенолят аниона в ион-парном состоянии и его нейтральной формы.

Биолюминесцентную реакцию обелина можно представить следующим образом (рис. 11.). Присоединение ионов кальция вызывает конформационные перестройки молекулы, в результате которых запускается реакция окисления целентеразина. Первично образующийся амид-анион присоединяет прогон с образованием нейтральной формы излучателя. Зная структурную организацию активного центра обелина и предполагая, что в момент образования возбуждённого состояния не происходит больших изменений в целентеразин-связывающей полости, можно утверждать, что наиболее вероятным источником протона для протонирования возбуждённого амид-аниона является His 175. Наряду с этим процессом имеет место диссоциация протона 6-п-гидроксифенильной группы целентеразина.

7>-о

©О.

У190

ь

У»90

III

е°г/

ОЛ/ХААУХ

VI

Рис. 11. Гипотетическая схема формирования эмиттера при биолюминесценции фотопротсинов.

У обелина эта группа водородными связями связана с His22 и Тгр92 (рис.12).

У] 90

Н22

У180 ¿

К7

ОН

н

\ 1 09 |Ьз 24

Рис. 12. Положение аминокислотных остатков, а также водородных атомов и водородных связей в целентеразин-связывающем сайте обелина.

Известно, что рК фенольной группы в возбуждённом состоянии может быть на несколько единиц ниже, чем в основном состоянии. Следовательно, рК ОН-группы п-гидроксифенила целентеразина может быть даже ниже, чем рК His22. Поскольку His22 находится в нейтральном состоянии, перенос протона на His22 с образованием фенолят-аниона возбужденного целентерамида вполне вероятен. Таким образом, наличие смеси нейтральной и фенолятной формы возбуждённых состояний целентерамида можно объяснить возможностью двойного переноса протона (стадии VI и VII, Рис.11).

При замене триптофана-92 на фенилаланин (W92F) происходит изменение спектральных характеристик биолюминесценции обелина: плечо в районе 400 нм значительно вырастает и становится практически эквивалентным по величине максимуму около 475 нм, т.е увеличивается вклад нейтральной формы целентерамида в спектр излучения. Кристаллографические исследования W92F обелина показали, что третичные структуры мутанта и обелина WT отличаются незначительно. Однако в структуре субстрат-связывающего сайта произошли определенные изменения. При замене Тгр92 на

Phe водородная связь с п-гидроксифенильной группой в 6-ом положении целентеразина теряется. Таким образом, водородная связь Тгр92 в обелине дикого типа может стабилизировать фенолят-анион, и излучение именно этой формы возбужденною целентерамида становится преимущественным. Утрата этой водородной связи при замене Trp—» Phe сдвигает равновесие между двумя формами целентерамида в сторону нейтральной формы. Не исключено также, что эта замена изменяет диэлектрические свойства окружения п-гидроксифенильной группы, что отражается на эффективности переноса протона от п-гидроксифенильной группы на His22.

Соотношение нейтральной и фенолятной формы возбужденного целентерамида в случае биолюминесценции W92F мутанта зависит от рН среды - (рис. 5, 1) При рН 5,5 вклад фенолятной формы самый низкий, что, по-видимому, связано с протонированием His22 и потерей его способности акцептировать протон от п-гидроксифенильной группы. Этот факт - еще одно подтверждение гипотезы двойного протонного переноса после образования первичного амидного аниона.

Также эту гипотезу подтверждают эксперименты с мутантами, имеющими замены по 92-му триптофановому остатку на аминокислоты с различными функциональными группами в боковом радикале - His, Arg, Lys и Glu. Поскольку мы не знаем пространственную структуру мутантов этой группы, то для объяснения полученных эффектов использовали метод компьютерного моделирования, предполагая при этом, что размеры целентеразин-связывающей полости не изменяются при данных мутациях. Из ряда возможных конформаций в каждом случае можно выделить две наиболее вероятных: первая - когда боковая цепь аминокислоты-заместителя направлена к гидроксильной группе целентеразина, и вторая - когда боковая цепь взаимодействует с His22. В случае каждого из мутантов, вероятно, реализуются обе конформации, но в разном соотношении. Так, для W92H мутанта наиболее вероятной конформацией, в которой находится молекула эмиттера, является первая, где His92 образует водородную связь с 6-п-гидроксифенилыюй группой целентеразина, стабилизируя фенолятную форму эмиттера. Но вклад нейтральной формы у этого мутанта в два раза больше, чем у обелина WT (рис. 7). Поэтому, можно предположить, что увеличение вклада нейтральной формы возбуждённого целентерамида происходит за счёт второй конформации, в которой отсутствует данная водородная связь. Для W92E мутанта вероятность в юрой конформации выше, чем для W92H. В результате формируется смесь нейтральной и фенолятной форм излучающей молекулы приблизительно в равном соотношении. А для мутанта W92R вторая конформация является преобладающей, и в спектре наблюдается преимущественное излучение нейтральной формы целентерамида. Таким образом, роль водородной связи между Тгр92 и 6-гидроксифенилом целентеразина заключается в стабилизации фенолят-аниона возбуждённого целентерамида.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1 Впервые выделены в гомогенном виде мутантные белки с заменами триптофановых остатков, локализованных в активном центре обелина, ¡та фенилаланин: >У92Р, \V114F, >У135Р, \V179F, Ъ'Ш2,\79?Т и WW114,135РР, а также с заменами 92-го триптофанового остатка на аминокислоты, имеющие разные заряды боковой цепи - гистидин, аргинин, лизин и глутаминовую кислоту (\V92H, \V92R, W92K, W92E) и исследованы их основные физико-химические свойства.

2. Установлено, что замены XV114—>Р, \V135—>Р и одновременная замена этих двух аминокислотных остатков существенным образом уменьшают способность апобелков образовывать фотопротеиновый комплекс, стабильность этого комплекса и его удельную активность (в случае двойной мутации), но не приводят к изменениям спектральных характеристик биолюминесценции. Это свидетельствует о том, что 114-й и 135-й триптофановые остатки активного центра обелина, расположенные у 2-п-гидроксибензильной группы целентеразина, играют важную роль в локализации молекулы субстрата.

3. Установлено, что замена \V92->Р не отражается на удельной активности и чувствительности к ионам кальция мутанта по сравнению с обелином ДД/Т, однако существенным образом меняет спектральные характеристики биолюминесценции и ее кинетику: спектр биолюминесценции содержит две полосы (1|пах| = 405 нм, Хиах2 = 475 нм ) равной интенсивности, а скорость подъема биолюминесцентного сигнала мутанта более чем в два раза выше чем у \\ИГ обелина (кП5е = 992 сек"1). Бимодальный спектр биолюминесценции свидетельствует о наличии двух разных форм молекулы эмиттера, в формировании которых важную роль играет Тгр92 посредством образования водородной связи между азотом индольного кольца и 6-п-гидроксифенильной группой целентеразина.

4. Показано, что замена \V179—'>Р и двойная замена 79—>Р,\¥92 >Р приводят к незначительному (до 70%) падению удельной биолюминесцентной активности и замедлению биолюминесцентной реакции. Спектр биолюминесценции содержит две полосы (л>ШХ1 = 405 нм, ^■1шх2 = 475 нм ) равной интенсивности для \У\У92,179РР и в соотношении 0,4'1 для ДУ179Р. Данные замены не отражаются на способности мутантных белков эффективно образовывать фотонротеиновый комплекс и на его стабильности.

5. Показано, что замены 92-го триптофана на гистидин, аргинин, лизин и глутаминовую кислоту привели к увеличению вклада фиолетовой полосы в спектре люминесценции мутантов в ряду \V92H < \V92K < W92E < Х\'92Я с одновременным падением активности от 99% до 8% по отношению к дикому варианту обелина Для мутантного белка \V92R вклад фиолетовой полосы составил более 80%. Таким образом, замена Тгр92 на аминокислотные

остатки, имеющие в боковом радикале функциональные группы, способные служить донорами или акцепторами водородной связи, существенным образом меняет распределение между формами молекулы-эмиттера этой реакции.

6 Предложена гипотеза, согласно которой финальной стадией образования эмиттера биолюминесцентной реакции Са +-регулируемых фотопротеинов является перенос протона от 6-п-гидроксифенильной группы возбужденного целентерамида на \Yis22, эффективность которого регулируется водородной связью между атомом азота индольного кольца Тгр92 и 6-п-гидроксифенильной группой целентеразина.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В РАБОТАХ:

1 Deng L., Vysotski E.S., Liu Z-J , Markova S.V., Malikova N.P., Lee J., Rose, J., and Wang B-C. Structural basis for the emission of violet bioluminescence from a W92F obelin mutant // FEBS I,ett.- 2001.- V. 506, P. 281-285.

2. Vysotski E.S., Liu Z-J., Markova S.V., Blinks J.R., Deng L., Frank L.A., Ilerko M., Malikova N.P., Rose J.P., Wang B-C., and Lee J. Violet bioluminescence and fast kinetics from W92F obelin: Structure-based proposals for the bioluminescence triggering and the identification of the emitting species // Biochemistry.- 2003.- V. 42, P. 6013-6024.

3. Malikova N.P., Stepanyuk G.A., Frank L.A., Markova S.V., Vysotski E.S., Lee J. Spectral tuning of obelin bioluminescence by mutations of Trp92 // FEBS Letters. - 2003. - V.554. - P.184 - 188.

%

t

-4

Подписано в печать 22.о^ -С'<Ч.формат 60x84/16. Бумага тип. Печать офсетная. Усл. печ. л. Тираж *>~о Заказ (10

Издательский центр Красноярского государственного университета 660041 Красноярск, пр. Свободный, 79.

t

•í

\

I

ß

>

РНБ Русский фонд

2004-4 36350

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Маликова, Наталья Петровна

Введение.

Глава 1. Роль триптофановых остатков в биолюминесценции различных систем.

1.1. Люцифераза светляков.

1.2. Бактериальная люцифераза.

1.3. Фотопротеины.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Выделение и очистка белков.

2.2. Биолюминесцентные свойства мутантных белков.

2.3. Реактивы.

Глава 3. Выделение, очистка и характеристика мутантных форм фотопротеина обелина с заменами триптофановых остатков активного центра на фенилаланин.

3.1. Выделение и очистка мутантных форм обелина.

3.2. Активация апобелков синтетическим целентеразином.

3.3. Основные люминесцентные свойства полученных мутантных форм.

3.4. Влияние температуры на биолюминесцентную активность мутантных белков.

3.5. Спектральные характеристики полученных мутантов.

Глава 4. Выделение, очистка и свойства мутантных форм обелина с заменой Тгр 92 на другие аминокислотные остатки.

4.1. Выделение и очистка мутантных белков.

4.2. Активация апобелков синтетическим целентеразином.

4.3. Основные люминесцентные свойства полученных мутантов.

4.4. Влияние температуры на биолюминесцентную активность мутантных форм обелина.

4.5. Спектральные характеристики полученных мутантов.

Глава 5. Гипотеза о механизме формирования эмиттера в биолюминесцентной реакции фотопротеина обелина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль триптофановых остатков активного центра в биолюминесцентной реакции фотопротеина обелина"

Биолюминесцентная система Са2+-регулируемых фотопротеинов морских кишечнополостных организмов является на сегодняшний день одной из наиболее изученных. Уникальность этих белков состоит в том, что они представляют собой устойчивый фермент-субстратный комплекс из одноцепочечного полипептида (около 20 кДа), целентеразина и кислорода. Присоединение ионов кальция вызывает конформационные перестройки в белке, в результате которых практически мгновенно развивается реакция окислительного декарбоксилирования целентеразина, продуктами которой являются целентерамид, СОг и квант света в голубой области. Гены нескольких фотопротеинов клонированы [Inouye S et al, 1993; Faganet al, 1993; Illarionov et al, 1995; Markova et al, 2002] и получены рекомбинантные белки, свойства которых практически не отличаются от свойств природных белков.

В 2000г. были установлены третичные структуры двух фотопротеинов — акворина из медузы Aequoria victoria [Head et al, 2000] и обелина из гидроидного полипа Obelia longissima [Liu et al, 2000]. Было показано, что в обоих белках целентеразин и кислород локализованы нековалентными связями в виде пероксицелентеразина внутри гидрофобной полости белковой глобулы. Среди аминокислотных остатков, участвующих в локализации пероксицелентеразина в обоих белках находятся 4 триптофановых остатка, образующих «сэндвич»-структуры с ароматическими остатками молекулы целентеразина. Ранее для акворина было показано, что мутирование некоторых триптофановых остатков влияет на устойчивость фотопротеинового комплекса и меняет характеристики его биолюминесцентного свечения [Ohmiya et al, 1992], что указывает на возможность участия этих остатков в формировании структуры молекулыизлучателя. Более детальных исследований этого вопроса как для акворина так и для обелина не проводилось.

В лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН на протяжении нескольких лет ведутся работы по изучению биолюминесцентной системы одного из Са -регулируемых фотопротеинов — обелина из гидроидного полипа Obelia longissima. Накоплены глубокие знания - от определения нуклеотидной последовательности гена, кодирующего этот белок, до установления его третичной структуры [Illarionov et al, 1995; Illarionov et al, 2000; Markova et al, 2001; Liu et al, 2000]. Показана перспективность использования обелина в различных аналитических системах [Illarionov et al, 2000; Frank et al, 1996; Frank et al, 1997; Berestovskaya et al, 1999; Gorokhovatsky et al, 1998].

В результате генно-инженерных работ были сконструированы штаммы-продуценты мутантных белков с заменами триптофановых остатков активного центра молекулы обелина.

Целью данной работы было изучение свойств этих мутантных белков и определение на основе полученных данных роли триптофановых остатков активного центра в биолюминесцентной реакции Са -регулируемого фотопротеина обелина.

Выполнение данного исследования требовало решения следующих задач:

1. Выделить в чистом виде мутантные формы рекомбинантного фотопротеина обелина, имеющие замены по триптофановым остаткам активного центра на фенилаланин, и мутантные формы, имеющие замены по 92-му триптофановому остатку на гистидин, аргинин, лизин и глутаминовую кислоту.

2. Исследовать основные физико-химические свойства полученных мутантных форм рекомбинантного обелина.

3. Выявить механизм формирования молекулы-излучателя на основе исследования влияния произведенных замен на биолюминесцентную функцию мутантных форм обелина.

При решении поставленных задач были получены результаты, которые выносятся на защиту:

1. 114-й и 135-й триптофановые остатки активного центра обелина, локализованные у 2-гидроксибензильной группы целентеразина, играют важную роль в локализации молекулы целентеразина — их замены приводят к существенному уменьшению способности апобелков образовывать устойчивые фотопротеиновые комплексы и резкому падению специфической активности.

2. 92-й триптофановый остаток обелина локализован у 6-п-гидроксифенильной группы целентеразина и участвует в формировании структуры молекулы-эмиттера: все замены этого остатка приводят к изменению спектральных характеристик биолюминесценции. Оно связано со сдвигом равновесия между таутомерными формами эмиттера - фенолят-анионом (Х^ах = 475нм) и нейтральной формой (Хщах = 390нм) возбужденной молекулы целентерамида.

3. Предложена гипотеза, Финальной стадией образования эмиттера

•ji биолюминесцентной реакции Са -регулируемых фотопротеинов является перенос протона от 6-п-гидроксифенильной группы возбужденного целентерамида на His22, скорость которого регулируется водородной связью между атомом азота индольного кольца Тгр92 и 6-п-гидроксифенильной группой целентеразина.

Все результаты данной работы получены впервые и перспективны для использования в фундаментальных и в прикладных исследованиях. Высокая скорость биолюминесцентного ответа и чувствительность к ионам Са в сочетании с разными спектральными характеристиками некоторых полученных мутантных белков позволяют использовать их в качестве датчиков для одновременного изучения кальциевых потоков в различных клеточных органеллах. Использование «цветных» мутантов обелина как меток в иммуноанализе перспективно для одновременного определения нескольких антигенов с регистрацией сигнала на разных длинах волн.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ № 99-04-48452, № 0204-49419 и Красноярского Фонда Науки № 13G062, а также программы РАН «Физико-химическая биология».

Материалы диссертационной работы докладывались на ХН-м Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (Кэмбридж, Великобритания, 2002) и на семинаре лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН.

По результатам исследования опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Маликова, Наталья Петровна

ВЫВОДЫ

1. Впервые выделены в гомогенном виде мутантные белки с заменами триптофановых остатков, локализованных в активном центре обелина, на фенилаланин: W92F, W114F, W135F, W179F, WW92,179FF и WW114,135FF и исследованы их основные физико-химические свойства.

3. Показано, что замены W114—>F, W135—>F существенным образом уменьшают способность апобелков образовывать стабильный фотопротеиновый комплекс, но не приводят к изменениям спектральных характеристик биолюминесценции. Замены W92—»F и W179—>F практически не отражаются на физико-химических свойствах мутантных белков, но существенным образом меняют спектральные характеристики биолюминесценции и ее кинетику. Замена W92—>F, элиминирующая водородную связь между азотом индольного кольца и 6-(р-гидроксифенильной) группой целентеразина, приводит к появлению дополнительной полосы излучения мутантного белка W92F в фиолетовой области спектра (А,тах = 405 нм), ускорению биолюминесцентной реакции (krise = 992 сек"1) более чем в два раза по сравнению с WT обелином и не влияет на чувствительность к ионам кальция.

4. Впервые выделены в гомогенном виде мутантные белки с заменами 92-го триптофанового остатка на аминокислоты, имеющие разные заряды боковой цепи - гистидин, аргинин, лизин и глутаминовую кислоту и исследованы их основные физико-химические свойства. Показано, что все перечисленные замены привели к увеличению вклада фиолетовой полосы в спектре люминесценции в ряду W92H < W92K < W92E < W92R с одновременным падением активности от 99% до 8% по отношению к дикому варианту обелина. Для мутантного белка - W92R вклад фиолетовой полосы составляет более 80%.

5. Результатами исследования физико-химических свойств мутантных форм обелина установлено, что: 114-й и 135-й триптофановые остатки активного центра обелина, локализованные у 2-п-гидроксибензильной группы целентеразина играют важную роль в локализации молекулы целентеразина; 92-й триптофановый остаток обелина, локализованный у 6-п-гидроксифенильной группы целентеразина, участвует в формировании структуры молекулы-эмиттера;

6. Предложена гипотеза, согласно которой финальной стадией образования эмиттера биолюминесцентной реакции Са -регулируемых фотопротеинов является перенос протона от 6-п-гидроксифенильной группы возбужденного целентерамида на His22, скорость которого регулируется водородной связью между атомом азота индольного кольца Тгр92 и 6-п-гидроксифенильной группой целентеразина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Са -регулируемый фотопротеин обелин из гидроидного полипа Obelia longissima как и ряд других фотопротеинов из морских кишечнополостных организмов представляет собой устойчивый фермент-субстратный комплекс, состоящий из одноцепочечного полипептида (22,4 кДа) и пероксицелентеразина, локализованного внутри гидрофобной полости белковой глобулы нековачентными связями. Установленная в 2000г. третичная структура этого белка выявила, что из 6-ти триптофановых остатков его аминокислотной последовательности - 4 находятся в активном центре. Эти остатки являются строго консервативными для всех известных в настоящее время фотопротеинов.

Представленная работа посвящена определению роли триптофановых остатков активного центра молекулы Са2+-регулируемого фотопротеина обелина в его биолюминесцентной реакции.

Для этого с помощью сайт - направленного мутагенеза в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН были сконструированы штаммы-продуценты мутантных форм апообелина с различными заменами триптофановых остатков активного центра. В настоящей работе все мутантные белки были выделены в гомогенном виде и изучены их основные физико-химические свойства. Результаты проведённой работы показали, что триптофановые остатки активного центра участвуют не только в локализации субстрата с образованием устойчивого фотопротеинового комплекса, но и в процессах формирования структуры молекулы — излучателя.

Результаты настоящей работы показали, что некоторые мутантные белки обладают уникальными свойствами. Например, мутантный белок W92F обладает бимодальным спектром излучения (на глаз - фиолетовый) и самой высокой скоростью биолюминесцентного ответа (krise = 992 сек"1, что более чем в два раза выше чем для обелина дикого типа). А мутантный белок

W92R имеет практически мономодальную биолюминесценцию (вклад фиолетовой полосы в спектре составляет более 80%). Эти качества делают их перспективными для использования в качестве датчиков для одновременного изучения кальциевых потоков в разных компартментах клетки. Кроме того, становится возможным применение «цветных» мутантов обелина, например, в качестве меток в иммуноанализе для одновременного определения нескольких антигенов с регистрацией сигнала на разных длинах волн.

В заключение выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю к.б.н. JI.A. Франк, а также к.б.н. Е.С. Высоцкому, к.б.н. С.В. Марковой за помощь в постановке и проведении экспериментов, интерес к работе и обсуждение полученных результатов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маликова, Наталья Петровна, Красноярск

1. Зайцев Г.Н. Математическая статистика в экспериментальной ботанике.-М.: "Наука", 1984.- 23с., 35с.

2. Кочетов Г.А. Практическое руководство по этимологии.- М.: Высшая школа, 1971.-224с.

3. Морозов В.М., Угарова Н.Н. // Биохимия.- 1996.- Т.61.- С. 1068-1072.

4. Сандалова Т.П., Угарова Н.Н. Модель активного центра люциферазы светляков // Биохимия.- 1999.- Т.64.- С. 1143-1150.

5. Чудинова Е.А., Дементьева Е.И., Бровко Л.Ю., Савицкий А.П., Угарова Н.Н. Флуоресценция остатков триптофана в люциферазах светляков и их комплексах с субстратами // Биохимия.- 1999.- Т.64.- С.1301-1308.

6. Allen D.G., Blinks J.R., and Prendergast F.G. Aequorin luminescence: relation of light emission to calcium concentration—a calcium-independent component // Science.- 1977.- V.195.- P.996-998.

7. Baldwin Т.О., Chen L.H., Chlumsky L.J., Devine J.H., Ziegler M.M. Site-directed mutagenesis of bacterial luciferase: analysis of the «essential» thiol // J. Biolum. Chemilumen.- 1989.- V.4.- P.40-48.

8. Baldwin Т.О., Hastings J.W., Riley P.L. Proteolytic inactivation of the luciferase from the luminous marine bacterum Beneckea harveyi // J. Biol. Chem.- 1978.- V.253.- P.5551-5554.

9. Blinks J.R. Sarcoplasmic reticulum function in intact cells: information from intracellular Ca++ indicators. // In Entman M.L., Van Winkle W.B. editors. The

10. Sarcoplasmic Reticulum in Phisiology, Muscle, Volume II. CRC Press, Boca Raton, FL.- P.73-107.

11. Branchini B.R., Magyar R.A., Murtiashaw M.H., Anderson S.M., Helgerson L.C., Zimmer M. Site-directed mutagenesis of firefly luciferase active site amino acids: a proposed model for bioluminescence color // Biochemistry.-1999.- V.38.- P.13223-13230.

12. Cline T.W., Hastings J.W. Mutationally altered bacterial luciferase. Implication for subunit function // Biochemistry.- 1972.- V.l 1.- P.3359-3370.

13. Conti E., Franks N.P., Brick P. Crystal structure of firefly luciferase throws light on a superfamily of adenylate-forming enzymes // Structure. 1996. -V.4.-P.287-298.

14. DeWet J.R., Wood K.V., DeLuca M., Helinski D.R., Subramani S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells// Mol. Cell. Biol.-1987.- V.7.- P.725-737.

15. Fagan T.F., Ohmiya Y., Blinks J.R., Inouye S., Tsuji F.I. Cloning, expression and sequence analysis of cDNA for the Ca2+-binding photoprotein, mitrocomin // FEBS Letters.- 1993.- V.333.- P.301-305.

16. Fisher В., Perry В., Summer I., and Goodenough P. A novel sequential procedure to enhance the renaturation of recombinant protein from Escherichia coli inclusion bodies // Protein Engineering.- 1992.- V.5.- . 593-596.

17. Fisher A.J., Raushel F.M., Baldwin Т.О., Rayment I. Three-dimensional structure of bacterial luciferase from Vibrio harveyi at 2,4A resolution // Biochemistry.- 1995.- V.34.- P.6581-6586.

18. Fisher A.J., Thompson T.B., Thoden J.B., Baldwin Т.О., Rayment I. The 1. sA resolution cristal structure of bacterial luciferase in low salt conditions // The Journal of Biological Chemistry.- 1996.- V.271.- P.21956-21968.

19. Frank L.A., Illarionova V.A., Vysotski E.S. Use of proZZ-obelin fusion protein in bioluminescent immunoassay // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996.-V.219.- P.479-484.

20. Gorokhovatsky A.Y., Shaloiko L.A., Bondar V.S., Vysotski, E.S., Maximov J.E., Doehren H., and Alakhov Y.B. Cell-free bioluminescent screening of translation inhibitors // Biotechnol. Appl. Biochem.- 1998.- V.27.- P.259-263.

21. Goto Т., Inouye S., Sugiura S., Nishikawa K., Isobe M., Abe Y. Cypridina bioluminescence V. Structure of emitting species in the luminescence of cypridina luciferin and its related compounds // Tetrahedron Lett.- 1968.-P.4035-4038.

22. Hastings W. Bioluminescence // Cell Physiology Sourcebook. A molecular Approach. Third edition.- 2001.- P. 1115-1131.

23. Hastings J.W., Morin J.G. Calcium-triggered light emission in Renilla. A unitary biochemical scheme for coelenterate bioluminescence // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1969.- V.37.- P.493-498.

24. Head J.F., Inouye S., Teranishi K., Shimomura O. The crystal structure of the photoprotein aeguorin at 2,3A resolution // Nature.- 2000.- V.405.- P.372-376.

25. Illarionov B.A., Bondar V.S., Illarionova V.A., Vysotski E.S. Sequence of theIcDNA encoding the Ca -activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissima // Gene.- 1995.- V.153.- P.273-274.

26. Illarionov B.A., Frank L.A., Illarionova V.A., Bondar V.S., Vysotski E.S., Blinks J.R.,. Recombinant obelin: cloning and expression of cDNA, purification and characterization as a calcium indicator// Methods Enzymol. -2000.-V. 227.- P. 1356-.

27. Imai Y., Shibata Т., Maki S., Niwa H., Ohashi M., and Hirano T. // Photochem. Photobiol. A: Chemistry.- 2001.- V.146.- P.95-107.

28. Inouye, S., Noguchi, M., Sakaki, Y., Takagi, Y., Miyata, Т., Iwanaga, S., and Tsuji, F.I. Cloning and sequence analysis of cDNA for the luminescent protein aequorin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1985.- V. 82, P. 3154-3158.

29. Inouye S., Tsuji F.I. Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca -activated photoprotein, clytin // FEBS Letters.- 1993.- V.315.- P.343-346.

30. Johnston T.C., Thompson R.B., Baldwin Т.О. Nucleotide sequence of the lux В gene of Vibrio harveyi and the complete amino acid sequence of the beta subunit of bacterial luciferase // The Journal of Biological Chemistry.- 1986.-V.261.- P.4805-4811.

31. Kretsinger R.H., and Nakayama S. Evolution of EF-hand calcium-modulated proteins. IV. Exon shuffling did not determine the domain compositions of EF-hand proteins // J. Mol. Evol.- 1993.- V.36.- P.477-488.

32. Kurose K., Inouye S., Sakaki Y., Tsuji F.I. Bioluminescence of the Ca2+-binding photoprotein aequorin after cysteine modification // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1989.- V.86.- P.80-84.

33. Leammli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4 // Nature.- 1970.- V. 227.- P. 680-685.

34. Lee C.Y., O'Kane D.J., and Gibson B.G. Dynamic fluorescence properties of bacterial luciferase intermediates //Biochemistry.- 1988.- V.27.- P.4862-4870.

35. Li Zhi, Meighen E.A. Tryptophan 250 on the a subunit plays an important role in flavin and aldehyde binding to bacterial luciferase. Effects of W-)Y mutations on catalytic function // Biochemistry.- 1995.- V.34.- P. 15084-15090.

36. Lin L.Y-C., Sulea Т., Szittner R., Vassilyev V., Purisima E.O., Meighen E.A. Modeling of the bacterial luciferase-flavin mononucleotide complex combining flexible docking with structure-activity data // Protein Science.- 2001.- V.10.-P.1563-1571.

37. Liu Z-J., Vysotski E.S., Chen C-J., Rose J.P., Lee J., Wang B-C. Structure of the Ca2+-regulated photoprotein obelin at 1.7A resolution determined directly from its sulfur substructure // Protein Science.- 2000.- V.9.- P.2085-2093.

38. Mager H.I.X., Tu S-C. Chemical aspects of bioluminescence // Photochemistry and Photobiology.- 1995.- Vol.62, №4.- P.607-614.

39. Markova S.V., Vysotski E.S., Blinks J.R., Burakova L.P., Wang B-C., and Lee

40. J. Obelin from the bioluminescent marine hydroid Obelia geniculata: cloning,j iexpression, and comparison of some properties with those of the other Ca -regulated photoproteins // Biochemistry.- 2002.- V.41.- P.2227-2236.

41. Masuda Т., Tatsumi H., Nakano E. Cloning and sequence analysis of cDNA for luciferase of a Japanese firefly, Luciola cruciata // Gene.- 1989.- V.77.-P.265-270.

42. McCapra F., and Chang Y.C. The chemiluminescence of a Cypridina luciferin analogue // Chem. Commun.- 1967.- V.19.- P.1011-1012.

43. Musicki В., Kishi Y., Shimomura O. Structure of the functional part of photoprotein aequorin// J. Chem. Soc., Chem. Commun.- 1986.- P.1566-1568.

44. Nemtseva E.V., Kudryasheva N.S., Leontieva O.V., Ugarova N.N. Red shifts in firefly bioluminescence spectra // In Stanley P.E., Kricka L.J. editors. Bioluminescence and Chemiluminescence. Progress and Current Applications. -2002. P.49-52.

45. Nicoli M.Z., Hastings J.W. Bacterial luciferase. The hydrophobic environment of the reactive sulfhydryl // The Journal of Biological Chemistry.- 1974.-V.249.- P.2393-2396.

46. Nicoli M.Z., Meighen E.A., Hastings J.W. Bacterial luciferase. Chemistry of the reactive sulfhydryl // The Journal of Biological Chemistry.- 1974.- V.249.-P.2385-2392.

47. Nomura M., Inouye S., Ohmiya Y., Tsuji F.I. A C-terminal proline is required for Bioluminescence of the Ca2+-binding photoprotein, aequorin // FEBS Lett.-1991.- V.295.- P.63-66.

48. Ohmiya Y., Ohashi M., Tsuji F.I. Two excited states in aequorin bioluminescence induced by tryptophan modification // FEBS Lett.- 1992.-V.301.- P. 197-201.

49. Ohmiya Y.,Ohba N., Toh., Tsuji F. Cloning, expression and sequence analysis of cDNA for the luciferases from the Japanese fireflies, Pyrocoelia miyako and Hotaria parvula.// Photochem. Photobiol.- 1995.- V.62.- P. 309-313.1. Л I

50. Ohmiya Y., Tsuji F.I. Bioluminescence of the Ca -binding photoprotein, aequorin, after histidine modification // FEBS Lett.- 1993.- V.320.- P.267-270.

51. Prasher D., McCann R.O., Cormier M.J. Cloning and expression of cDNA coding for aequorin, a bioluminescent calcium-binding protein // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1985.- V. 126.- P. 1259-1268.

52. Sandalova T. A model of the 3D structure of obelin // Protein Folds, a distance-based approach / Eds. H. Bohr, S. Brunak.- CRC Press.- 1996.- P.308-315.

53. Shi P.-Y., Maizels N., and Weiner A.M. Recovery of soluble, active recombinant protein from inclusion bodies // BioTechniques.- 1997.- V. 23,-P. 1036-1038.

54. Shimomura O. Cause of spectral variation in the luminescence of semisynthetic aequorins // Biochem. J.- 1995.- V.306.- P.537-543.

55. Shimomura O., Johnson F.H. Partial purification and properties of the Chaeptopterus luminescence sistem // Bioluminescence in Progress. Eds.

56. Johnson F.H. and Haneda Y.- Princeton University Press, Princeton,N J., 1966.-P.495-521.

57. Shimomura O., Johnson F.H. Peroxidized coelenterazine? The active group in the photoprotein aequorin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1978.- V.75.- P.2611-2615.

58. Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea // J. Cell. Сотр. Physiol.- 1962.- V.59.-P.223-240.

59. Shimomura O., Musicki В., Kishi Y. Semi-synthetic aequorins with improved sensitivity to Ca2+ ions // Biochem. J.- 1989.- V.261.- P.913-920.

60. Shimomura O., Musicki В., Kishi Y. Semi-synthetic aequorin. An improved tool for the measurement of calcium ion concentration // Biochem. J.-■ 1988.-V.251.- P.405-410.

61. Shimomura O., and Teranishi K. Light-emitters involved in the luminescence of coelenterazine // Luminescence.- 2000,- V.15.- P.51-58.

62. Szittner R., Meighen E.A. Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium // J.Biol.Chem.-1990.- V.265.- P.16581-16587.

63. Tatsumu M., Kajiyama N., Nakano E. Molecular cloning and expression in Escherichia coli of a cDNA clone encoding luciferase of a firefly, Luciola lateralis.//Biochim. Biophis. Acta.- 1992.-V.1331.-P.161-165.

64. Tsuji F.I., Inouye S., Goto Т., Sakaki Y. Site-specific mutagenesis of the calcium-binding photoprotein aequorin // Proc. Natl. Acad.Sci. USA.- 1986.-V.83.- P.8107-8111.

65. Tsuji F.I., Ohmiya Y., Fagan T.F., Toh H., Inouye S. Molecular evolution of the Ca2+-binding photoproteins of the Hydrozoa // Photochemistry and photobiology.- 1995.- V.62.- P.657-661.

66. Ugarova N.N., Brovko L.Yu. Protein structure and bioluminescence spectra for firefly bioluminescence // Luminescence.- 2002.- V.17.- P.321-330.

67. Ugarova N.N., Brovko L.Yu. Protein structure and bioluminescence spectra for firefly bioluminescence // In Stanley P.E., Kricka L.J. editors. Bioluminescence and Chemiluminescence. Progress and Current Applications. 2002. - P.61-66.

68. Van Eerd, J.P. and Takahshi, K. Determination of the complete amino acid sequence of bovine cardiac troponin // C. Biochemistry.- 1976.-V. 15.- P. 1 Hill 80.

69. Vysotski E.S., Liu Z-J., Rose J.P., Wang B-C., Lee J. Preparation and X-ray cristallographic analysis of recombinant obelin cristals diffracting to beyond 1.1 A// Acta Cristallogr.D. Biol.Cristallog.-2001.- V.57.- P.1919-1921.

70. Wnuk. W., Schoechlin, M., and Stein, E.A. Regulation of actomyosin ATPase by a single calcium-binding site on troponin С from crayfish // J. Biol. Chem. -1984.- V. 259.- P. 9017-9023.

71. Xin X., Xi L., Tu S.C. Functional consequences of site-directed mutation of conserved histidyl residues of the bacterial luciferase alpha subunit // Biochemistry.- 1991.- V.30.- P.l 1255-11262.

72. Ye L., Buck L.M., Schaeffer H.J., Leach F.R. Cloning and sequencing of a cDNA for firefly luciferase from Photuris pennsylvanica // Biochim. Biophis. Acta. 1997. - V. - 1339. - P. 39-52.