Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Са2+-активируемый фотопротеин обелин из гидроидных полипов Obelia longissima

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Са2+-активируемый фотопротеин обелин из гидроидных полипов Obelia longissima"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ

На правах рукописи

Бйздерь Влодгашр Станиславович

Са2+-АКТЙВИРУИШ ФОТОПРОТШ! ОБЕЛИН ИЗ ГИДРОИДНЫХ ПОЛИПОВ ОЬаИа 1опв1вв1па

03.00.02 - ЕпсОязвка

Апторофорат

даоозртецяи иа ооиоквнно ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск - 1992

Роботе вшалнэяа в Лаборатории фотобиологии Института биофизика СО АН СССР (Красноярск)

Научные руководители: академик, профвооор

И.И.Гительзон

кандидат биологичеокшс наук Е.С.Высоцкий

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

В.И.Окшоб

кандидат биологических наук Е.В.Смолина

Ведущая организация Институт физиологии им. А.А.Бого

шльца АН Украшу

Защита состоится "_"_199_г. в_часов

на заоеданш Специализированного Совета Д 003.45.01 по защитам диссертаций на оопокание ученой отепени доктора наук при Институте бисфшики СО АН СССР (660036, г.Красно-ярок, Академгородок).

С диооертацией иокна ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО АН СССР.

Автореферат разослан и_"_199_г.

Ученый секретарь Совета кандидат пат.' наук

Л.Г.Коселилова

ОВДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биолюминесценция многих видов иораках кишечнополостных объясняется надаяеы в гидребионтах споци-фических белков, получивших название Са -активируемые фотипро-теши, которые обладают способностью генерировать кванты света при взаимодействии с ионами кальция. Фотопротешги представляют собой фермент-субстратный комплекс белка и связа>шого с ним лю-циферина, находящийся в неактивном ооотоянии. Реакция светоизлу-чения дашюго класса белков не требует присутствия молекулярного кислорода, каких-либо кофакторов, а также органических субстратов. Для излучения свата достаточно присутствия фотопротеина и инициирующего реакцию иона. Это отличает реакцию фотопротешов от биолшянесцентннх реакций, например, бактериальной или свет-ляковой люцифераз, в которых фермент в присутствии кислорода катализирует окисление люциферина о переводом ого в возбуаденноз состояние и последующим излучением света.

В настоящее время известно до 25 видов люминесцирующих морских кишечнополостных, включающих семейства Сп1йаг1а и (Непор1го-га, обладающих фотопротеиновш типом биолюминесценции. Шесть из известных Са2+-активируеыых фотопротеинов выделены о применением хроматографических методов, причем только три в гомогенном виде, и охарактеризовали.

Высокая специфичность и чувствительность (до 10~%) к ионам кальция позволили использовать фотопротеины для прижизненной индикации кальция в клетках различии! оукарютических организмов, а тагсхе в различных биологических еидкостях. Несошюшшш преимуществами фотопротеинов как индикаторов кальция являются:легкость регистрации жглтесцентного сигнала, шрокзтй диапазон измерения (10~7 - 10" ^ М), устойчивость к внутриклеточному окружению , отсутствие токсичности. Два из известных фотопротошгов, ак-ворш из гидромедузы Аедиогеа ГогякаЛеа и оболги из гидроидов 0Ье11а йеп!ои1а1а, активно и весьма успешю иопользуютоя для измерения ионов кальция.

Цель и задв'Ш исследования. Целью работы являлось исслодо-

?1 ~.....

воние Са -активируемого фотопротеиг.» обелила из лм-тнесцирумяе-

го колониального гидроидного псшша 0Ье11а 1ощ1вб1ш, одного из паис5олее массовых видов, обитающих в территориальных водах России. Выполнение данного исследования требовало решения следуюадгх экспериментальных задач:

2+

1. Разработать метод выделения и очистки Са -активируемого фотопротоина обелшш из гидроидного псшша ОЪеИа 1оп£1ва1та и па ого основа получить високоочвдешшй препарат этого белка.

2+

2. Исследовать £изико-химичеокие свойства выделэнного Са -активируемого фотопротеина обелина.

3. Проверить возможность использования полученного препарата обелина для индикации влутршшеточного кальция.

Ыаучная новизна и практическая ценность.

1. Газработаны технологии екстракщш фотопротоина обелина кз биоыасоы гидроидных полипов ОЪоИа 1оп^1вв1ша, обработки ок~ отракта для получения препарата, пригодного для хроматографичес-кого выделения, и предложена охеме последующей очистки белка до гомогенного ооотояния.

2. Наследованы ооновныо физико-химические СЕоЯотва выделенного фотопротеина: молекулярная масса белка в кативных н депату-рярующях условиях, спэстр люминесценции фотопротоина, удельная активность, константа поевдопервого цорядка опада люминесценции, квантовый выход, оптимуш температуры и рН, влияние температуры на активность и отабильнооть белка, чувствительность к ионам К'-льщш, вцц&леш три различные иолекулярхшо Зориы обелит.

3. С помощью полученного фотоцротеша, загруженного в макрофага мышей, изморена концентрация ионов кальция внутри интакт-1шх клеток, находяцихся в покое и пра воздействии на них различных епшулятороп.

Получешшо результаты позволяют одолать заключение о воз-мокноота использования фотопротоша обслшха из гидроидов ОЬеИа 1о1^1ео1та п кччоотво индикатора ионов кальция внутри интактных клеток и бнолопгчоэкгос жидкостях. Ооновнкш облаотями применения болка могут стать физиология, шдащшокзя диагностика, тсмуноло-

п1я.'

На основе технологии выделения и очасткл фотопротеино, разработанной; в данной работе, налажено молкосерайное проаэводотво

- ь -

препарата обелина для индикации ионов кальция.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на 1-ой Международной школе по биологической люминесценции (Польша, 1989), VII Всесоюзном симпозиуме "Инженерная ензи-ыология" (Москва, 1991), Всесоюзном совещании "Энергетичеокиэ аспекты клеточной физиологии" (Пущино, 1988), Всесоюзном оовеща-шш "Молекулярные механизмы и регуляция рнергетического обмена" (Пущино, 1990), на семинарах лаборатории фотобиологии Инотитута биофизики СО АН СССР. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи и 2 препринта.

Структура и бъвм работа. Диссертационная работа изложена на 131 странице машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение результатов исследования, заключенно, вывода и описок цитируемой литературы (123 источника, в том числе 100 иностранных).

Диссертационная работа проиллюстрирована 39 рисунками, содержит 8 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2+

Са -активируемый фотопротеин обелин получали из морского биолюминесцирущего гидроидного полипа ОЬеПа 1оп^1во1та. Выбор используемого объекта определялся щш<де всего тем, что данный вид гидроадов является наиболее массовым видом территориальных вод России, встречающимся преимущественно в холодных и умеренных водах (Степаньянц, 1980). Сбор гошотннх проводили в акватории Чупинской губы Кандалакшского залива Белого моря о мидиевой плантации Беломорской биологической станции Зоологического института АН СССР в осенний период, поскольку в это время года наблюдается наибольшая скорость роста и вегетации колоний гидроидов (Летунов, Степаньянц, 1986).

Активность обелина измеряли на биолшинометре БЛМ 8801 (ИБ35 СО АН СССР, Красноярск) в экранированной от внешнего сообщения кювете, содержащей 0,5 мл буфера (0,1 М Трио-Н01, 0,01 М ЭДТА, р1! 9,8) и 0,1 или 0,01 ил исследуемого образца. Реакцию инициировали впрыскиванием 0,2 мл Са012 (0,36 М Са012 в 0,1 Ы Трии-Н01 буфоре, рН 8,3). Биолшшюсцентнцй сигнал регистрировали при немощи самописца 2201 (Ыф, Швеция).

При очистке обелина использовали стандартное хроматографи-ческое оборудование фирм "LKB" и "Pharmacia" (Швеция).

Динамику процесса очистки белка контролировали с помощью SDS-електрофореза, проводимого по методу (Laemmli, 1974). Окраску гелевых пластинок после фореза проводили AgNO^.

Содержание белка в образцах на отапах очистки измеряли метолом микроопределения бе.»ка с биуретовым реактивом (Кочетов, 1971) и по методу Бредфорд (Bradford., 1976).

Молекулярную массу ваттного бежа определят гель-фильтрацией на колонке Superóse 12 HR 10/30 (PPLC). Молекулярную массу в денатурирующих условиях определяли влектрофорезом в 12,5$ ПААГ с добавлением 0,1SS SDS. Определение молекулярной массы проводили относительно калибровочных белков.

Спектр люминесценции фотопротеина записывали на спектрофлу-ориметре F-4000 (Hitaohi, Япония).

Зависимость интенсивности люминесценции обелина от концентрации ионов кальция исследовали с помощью кальциевых буферов. При раочете соотношения хелаторов и ионов кальция, проводимом на ЭВМ "Иекра-226", за основу была взята программа, предложенная в работе (Fabiato, Fabiato, 1979).

Нагрузку перитоноальных макрофагов мышей линии CC57/W обе-линои проводили методом лизиса пиносом (Okada, Rachstelner, 1982), модифицированным для макрофагов и обелина из гидроидов Obelia genioulata (Hallett, Oampbell, 1983).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение препарата обелина. Технология получения чистого фотопротеина включала два основных етапа: 1) экстракцию из гидроидов, фракционирование 10% поливтилеигликолем (ПЭГ) с молекулярной иаооой 6000 И оульфатом аммошя в диапазоне 40-75% насыщения; 2) галь-фильтрацию на оефадекое С-75 (fine), ионообменную хроматографию на Полиоил СА-300 (10 мкм), гидрофобную хроматографию па фенил-сефарозе CL-4B, гель-фяльтрацию на софакрило S-200, ионообменную хроматограф® на колонке Hono Q при pi! 7,0, хроматофокуеированиэ на колонке Kono Р, последовательные ионообменные хроиатографщ на коленке Ног.о С при рН среды 5,5, 8,В и 7,0, соответственно.

Перед началом экстракции колонии гидроидов выдерживал! 2-3 часа в морской воде при экологической температуре +4°С, так как при механическом воздействии во время обора гидроидов значительная часть фотопротеина самопроизвольно высвечивалась. Ионы кальция из среды удаляли помещая гидроиды из морской воды в изотони-' ческий буфер (ЗОС мМ Had, 100 мМ ЭДТД, 10 мМ Трис~НС1, рН 7,0) на 1 минуту. Экстракцию фотопротеина проводили перенося колонии гидроидов в гипотонический буфер (50 ыМ ЭДТА, 10 мМ Трис-Н01, рН 7,0) и подвергая их механической обработке руками в течение 5-10 »жнут. При таком способе обработки из гидроидов экстрагируется более 80% активного фотопротеина. Последующее фракционирование екстракта ПЭГом и оульфатом аммония позволяет значительно отделить балластные белки и получить высокую кратность очистки фотопротеина (Табл.1). Существенное повышение выхода обелина на стопах, следующих за экстракцией белка, вероятно, иокно объяснить тэм, что в исходном препарате присутствует ингибитор (или несколько ингибиторов) люминесценции, который удаляется при обработке ПЭГом. В пользу отого предположения может свидетельствовать тот факт, что при относительно малой (в 2,5 раза) очистке по белку на этой стадии наблюдается семикратное увеличение удильной активности фотопротеина. Полученный препарат использовали для дальнейшей хроматографической очистки.

Хроматографические методы комбинировали таким образом, чтобы общий процесс очистки обелина был наиболее технологичным п позволял использовать образец после предыдущего этапа оразу ка без дополнительных подготовительных стадий. Из динамики очистки фотопротеина (Рис.1) видно, что наиболее аффективными оказались стадия хроматотофокусироващ1Я на колонке Mono Р, при которой количество балластных белков удалось свести к минимуму, и стадия ионообменной хроматографии на колонке Mono Q при рН 8,8 поскольку после нее фотопротеин практически не содержит примесей.

Разработанная технология позволила получить в гомогенном

р I

виде (Рио.1) Са -активируемый фотопротвин обелин из гидроидов вида Qbelia longlaaima, основные физико-химические характориоти-ш* которого представлены в Тьбл.2.

На последней стадии очистки белка (хроматография на колонке

Таблица 1.

Схема первичной очистт обелина из гидроидного полипа СЬеНа 1оп51551ша

Объем Балок Суммарный Активность Суммарная Удельная Выход Фактор

Стация . (мл) (ыг/ил) белок Сыт) (отн.ед./мл) активность (отн.ед.) активность (отн.ед./мг) с г ) очистки

1. ¡Грубый

экстракт 780 13,2 10296 3073 2396940 232,8 100 1

2. ^акционирова-

ние ПЗГоы 6000 600 6,4 3840 10000 6000000 1562,5 250 6,7

3. фракционирование г

(40Х насыщения) 640 5,8 3712 9466 6058240 1632,1 252 7,0

4. ^акционирование СКН^ЗО^

С752 насыщения) 20 - 12,6 252 332000 6640000 26349,2 277 113,2

Прииечание: В таблице представлены типичные данные очистки обелина из разового сбора гидроидов. Аналогичным образом обработана вся биомасса.

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

67 к Da

Р 45 kDa t

29 kDa 12.5 kDa

:£) ЬЧ ^ „i fj* ¡ 4 • Щ

f:í so* «»«* | sm» . ■

te -»i

lli

^ к "¡1 Г 3 1 __й

tí» » • " . ¡

' 6.5 KDa

raí»

Piio.1. Электрсфорогрсмма Сзлкоки препаратов на отяпах bu-делепия обелила.

1-исходный препарат; 2--Sephadoz С-75 (íino); З-Полнсил СА-300; 4 -Phenyl Sepliaroao CL-4B; 5-ЕйгЛгзсгу1 S-200; б-Uono Q (рН 7,0); 7 —Поло Р (рН 6,0-4.0); S-l'sno 0<рЛ 5,9; 9-Hono Q (рН 0,8); 10-líono Q (рН 7,0); И-цизксиоденулярнио маркерные белки. (29 Ь'Ва -карбоангидраза; 12,5 3¿Da - цитохром С; 6,5 KDa - ннгибптор трипсина бычий); 12-високомолекулярше маркерные белки (67 kDa ~ бычий сывороточный альбумин; 45 KDa -яичный альбумин; 29 KDa -карбоангидраза) .

Таблица 2.

Некоторые характеристики гомогенного обелииа

1. Выход чистого белка из 1 кг биомассы 62 шсг

2. Молекулярная насса:

а) Superóse 12 HR 10/30 30 kDa

б) электрофорез в 12,5% ПААГ с 0.1SÍ SDS 19,8 kDa

-1

3. Удельная активность 4,9x10 ^квант-иг

4. Константа скорости иоевдопервого порядка « " спада люминесценции 4 с"

5. Максимум люминесценции 469 ни

6. Квантовый выход 0,16

Mono Q при pH 7.0) было показано совпадение пика активности фотопротеина как минимум с тремя белковыми пиками, что послужило основанием для предположения о наличии в полученном препарате обелина неокольких молекулярных форм, как это, например, показано дли вкворина (Shimomura, 1936) и мнемиопсина (Ward, Seliger, 1974).

Выделение изофощ обелина. Схема выделения молекулярных форм обелина включала следующие стадии: последовательные ультрафильтрации о использованием системы "Klnitan" на мембранах с пределом исключения 30 и 10 kDa, ионообменные хроматографии ыа Полиоил СА-300 (10 мкм) и колонке Mono Q, хроиатофокусирование на колонке Mono Р о добавлением в елюенты детергента Тритона Х-100 (16), последовательные хроматографии на колонке Mono Q. При хроматофокусировании удалось разделить три пика фотопротеиновой активности, а последующими дополнительными хроматограХияш на колонке Hono Q выделить три практически гомогенных белка Ц, В и 0), обладавши фотопротаиновой активностью (Табл.3).

Таблица 3.

Свойство молекулярных форм обелина

Молекулярные формы обелина

Свойотва А В С

колокулярю маооа в) В ItßTKBMiX условиях (kDa) б) в донатурпрущах уоловиях (kDa) 30,0 19,8 30,0 . 19,8 30,0 19,8

Удельная актшшооть (квант/мг) 1,9 х Ю14 5,5 х Ю1* 2.2 X 1015

Константа поетдто-первого порядка спада лишне сцен- *

щш (о~1) 6,5 2.9 ' 3.2

Квантовый выход 0,01 0,2 0,1

Препарат обелина для индикации внутриклеточного кальция и его некоторые свойства. Препарат получали по основной схеме выделения (см. выше), используя пять хроматографических стадий. Очищенный примерно в 1000 раз с выходом 5456 (Табл.4) обелин имел удельную активность 1.6 х Ю1^ квант на 1 мг белка, что в пересчете на активность гомогенного фотопротеина соответствует ЗЭ# чистоте препарата. Некоторые свойства полученного препарата были изучены.

Оптимум рН. Для обелина из гидроидов 0.1огв1ва1гпа оптимум рН располагается в интервале 9,0-10,5 (Рис.2а). Молекулярные константы ионизации фотопротеина, рассчитанные из полуширины полученного графика, составили рК^ 6,8 и рК^ 12,2. Константы ионизации для активного центра фотопротеина, определенные из зависимости константы псевдолервого порядка скорости спада люминесцентной реакции от рН соотавяли рК1 9,1 к рК2 10,2. Это позволило предположить возможность влияния на каталитический акт люминесценции остатков аминокислот, ионизация которых лежит в интервале рН 9,0-10,0. В частности," ото могут Сыть БН-группа циотеи-на, с-аминогруппа лизина, гндрокопфонпльнал груша тирозина, а также Л-концевая аминогруппа белка. Поскольку дитиотреитол в концентрации 1,0 м$1 стабилизировал активнооть обелшш, а ДТНБ (О,1{ 1,0 мМ) ингибировал биолюминесценцию, то весьма вероятно предположить наличие существенно важной БН-группы (групп) в молекуле обелина, находящейся либо в активном центре, либо вблизи него.

Оптимум томпоратуры. Максимум люминесценции обелила наблюдается при температуре 4-15°0 (Рис.26), что коррелирует с оптимуме« люминесценции отдельного зооида (4-6°0), изолированного от колонии гидроидного полипа О.1огщ10а1ва (Летунов, Высоцкий, 1988).

Термоотабильиость и тормогтактивация фотопротеина. Минутная инкубация пгч температурах до 50°С практически но сказывается на активности оболина (Рио.2в). При б0°0.сохраняется около 4056 доходней активности белка. Обработка при 70°С практически полностью инактивируот фотопротеин (остоточная активность составляет но более 4%). Сульфат аммония значительно повышает термостабиль- II -

Таблица 4.

Схеыз очистки обелина из гидроидного полипа ОЬеНа 1опг1гг1та

Объем Белок Суммарный «Активность Суммарная Удельная Выход Сектор

Стадия Сип) Смг/ыл) белок (отн.ед./мл) активность активность ( % ) очистки

(иг) Сотк.ед.) (отн.ед./мг)

х 106

■ х 10 6 х 10б

1 Исходный

образец 108 15,75 1701 1,087 117,4 0,059 100 1

2 БерЬас}ех Б-75

(Ппе) 483 ' 1,05 507,6 0,209 101,1 0,199 86 2,9

3. Гюлисил С А-300 126 0,525 66,15 0,668 84,2 1,273 72 18,5

4. РИепу1

ЗерПагсее СЬ-4В 324 0,012 3,99 0,223 73,9 19,000 63 275

5. 2ерЬаггу1 Б-200

СгирегПге) 77 0,034 2,62 0,952 73,3 28,000 * 62 406

6. Мэпо 0 НК 5/5 4,5 0,215 0,97 14,140 53,6 65,767 54 953

0,1 » -0,1

-0,3

а Р®

рк, / \рк2

/о, 1 \ ■

ОД) 1 у 1 1 1

о/ ' / 1 1 --—'-1-- 1 1 -,1--

4 б 8 10 12 14 рН

0,8 0,60,4

' б

к.

Ч

температура, С

о

о

о

С\)

20 40 60 80 температура, °С

з-2 £

ш -4 ■

о - -%

в - +%

2f

-8-6-4-2 -рСа

Рис. 2. Зависимость интенсивности биолюминесценции обелина от рН (а), температуры (б), предварительного минутного инкубирования белка при разных температурах (в) и концентрации ионов кальция (г).

I/- интенсивность биолюминесценции обелина (отн. ед.); ^«-интенсивность биолюминесценции обелина при насыщающей концентрации кальция;Ь20°С-интенсипиость биолюминесценции обелина при 20° С.

-5 15 35 55

О

ность обелина, позволяя проводить его термообработку при более высоких температурах. При 65°, 70°и даже 75-80°С в течение 1 мин удается сохранить до 5056 активности белка при наоыщенш инкубационной среды сульфатом аммония 10-2035, 30-50$ и 60-90$, соответственно.

При температуре 20-22°0 фотопротеин полностью сохраняет активность в течение трех суток. При более низких температурах (около +4°С) препарат сохраняет активность в растворе не менее 3 месяцев, а в лиофильно Еысушеняом виде при -1Э°0 - в течение года. При 30°0 активность фотопротеина снижается через 1 час на 4$, при 40°0 - на 25-30%. Время термоинактива1т белка существенно сокращается при 50°С и выше. На основании полученных данных были рассчитаны константы терлоинактивации обелина, которые ооставилн 5,3x10"^ мшГ1; 5,4x10"^ мин-1; 1,5х10-1 шш'1; 1,04 мин-1; 2,8 мин-1 для температур 30, 40, 50, 60 и 70°С, соответственно. Сульфат аммония существенно снижает константу инактивации фотопротеина.

Чувствительность к ионам кальция. Из графика зависимости биолюминесценции обелина от концентрации ионов кальция (Рис.2г) видно, что обели» позволяет регистрировать концентрацию свобод-

9 1 _а

ного Са в среде от 10 М и выше. Это весьма существенно, поскольку физиологический диапазон концентрации ионов свободного кальция в различных ¡слетках составляет от 10 Ы (в покое) до 10"5 Н (при возбуждении) (ВИпкв е1; а1., 1982). Зависимость имеет сигмоидный вид, Пд = 1,51. Величина коэффициента Хилла указывает на то, что на молекуле обелина имеется, по крайней мере, два функционально ванашх центра связывания кальция, при заполнении которых происходит запуск биолюминесцеятной реакции. Ионы свободного магния в.концентрации 0,3 мМ незначительно сдвигают калибровочный график, однако характер сигмоидной кривой и угол наклона при етом практически не меняются (г^ = 1,48).

Применение обелина для индикации внутриклеточного кальция. Для стимуляции макрофагов, нагруженных обелином, использовали сыворотку крупного рогатого скота (сКРС), цАМ'5, ПаР, АТФ.

Известно, что сыворотка оказызает стимулирующее действие на макрофаги, способствуя процессу прикрепления и распластывания

20£ сыв. КРС

,51 ■-1|Ч

35 с.р.о.

■ 90е.

50 с.р.в. ->90 и.

20 мкМ цАМФ

Рис. 3. Уровень свободного цитоплазматического кальция в макрофагах, стимулированных сыпороткой крупного рогатого скота (а) и цАМ-5 (б). I - уровень шума прибора, 2 - уровень "фонового" с печения макрофагов в покое. Стрелкой отмочен момент добавки стимулятора.

I

клеток на твердой подложке (Кпшка1, МахПеЫ, 1987). Этот процесс можно рассматривать как фагоцитоз "частицы бесконечного размера". При добавлении в суспензию макрофагов 2056-ной оКРС, наблюдается быстрый (5 сек от момента добавки) всплеск биолюминесценции (Рио.За) о амплитудой до 100 импульсов, что соответствует повышению внутриклеточного кальция до 1,7 мкМ, и быстрым падением до фонового свечения 20-30 импульсов. Подобные воплески биолюминесценции о быстрым затуханием свечения с некоторой периодичностью наблюдаются в течениэ не менее 30 минут. Периодичность наблюдаемых сигналов может быть связана, вероятно, о тем, что прикрепление к стенкам кюветы не является <~тщоиашнтиш синхронным процессом, в силу большого (10-15.млн) количества клеток в суспензии, а носит•временной вероятностный характер.

24

Ионы Са и цАЫФ выполняют в организме функции посредников в процессах внутри- и межклеточной сигнализации, причем действие систем регуляции кизнедеятельности клетки с их участием пересекается Цлберто и др., 1987). цАМФ, добавленный к оуспензии клеток вызывает развитие быстрого (через 5-10 сек) люминесцентного

2+

сигнала с амплитудой до 200 импульсов (концентрация Са повышается до 2,2 шМ) <Рис.36) о падением к 30 сек до 100-80-50 иы-пульоов и последующим снижением до 20-30 импульсов. В последующие 5-10 мин наблюдений возникновения новых сигналов нэ отмечается. ЭГТА не снимает стимулирующего вффекта цАМФ, что указывает на повышение внутриклеточного Са под действием цАЫФ за очет выхода кальция из внутриклеточных депо.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Разработана технология получения в гомогенном виде Са -активируемого фотопротеина обелина из биолюыинесцирующих гидроидов вида ОЬеИа 1оп^1ев1та. Показано, что выход гомогенного белка из 1 кг биомасоы гидроидов составляет 62 мкг.

2. Определены основные характеристики обелина из гидроидов ОЪеНа 1оп^1в81ша: молекулярная масса в натишшх условиях сос тавляет 30 КЮа, в денатурирующих - 19,8 кОа; удельноч активность

1С

- 4,9 х 10 квант на 1 мг белка; квантовый выход - 0,16; конс-

танта псевдопервого порядка спада биолюминесценции - 4 о-1; спектральный максимум люминесценции - 469 нм; оптимум рН биолюминесценции - 9-10,5: оптимум температуры биолюминесценции -

— Л I _П

4-15 С; чувствительность к попам Сай - ЮМ.

3. Показано, что фотопротеин из гидроидов Obelia longionlm термоотабилон в интервале температур 20°-50°С, а добавка сульфата аммония позволяет существешго повысить устойчивость белка к тепловой денатурации при более высоких температурах.

4. Показано, что обелин из гидроидов Obolia longissima представлен тремя молекулярными формами, имеющими одинаковую молекулярную массу и различающимися удельной активностью, константами псевдопервого порядка спада лшпнесценцни и газантовым выходом.

5. Получен препррат обелина, пригодный для использования в

2+

качество индикатора ионов внутриклеточного Са , н налапено ого мелкосерийное производство. Препарат очищен п 1000 раз, имеет вктивпость 1,6 х 101^ квант на 1 мг белка. В лиофильно высушенном виде препарат хранится при -18°С в течение года без потери активности.

6. В модельных окопериментах но перитонеальных Макрофагах мышей показана пригодность полученного препарата обелина для количественного измерения концентрации ионизированного кальция как внутри покоящихся клеток, так и при воздейстшш на них различных стимуляторов, напрмер, сыворотки крупного рогатого скота, цЛМФ, АТФ, NaP.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В РАБОТАХ:

1. Виооцкий Е.С., Бондарь B.C. Срав!штольныя анализ способов выделения Са-завпсимого фотопротеина - обелина.из гидроидных полипов Obelia longiosima.- Пропршт Н76 Б, Красноярск: Изм-во ИЭ СО АН СССР, 1988, 45 о.

2. Высоцкий Е.С., Бондарь B.C., Летунов В.Н. Выделение и очистка С«-\~ чвисимого фотопротешш - обелина лз гидроидных полипов Obelia longiBsima.- Бнохпмпя, 1989, т.54, Кб, о.965-973.

3. Vysotoky E.G., Bondar' V.S.,'Giteloon J.I., Potrunyaka V.V., Gamaloi I.A., Kaulln A.B. Extraction, some properties and application of obelln, oaloium-notivated photoprotein.- Biologi-

cal lumineBoenoe/ Edc. B. Jesowska-Craebiatowska et al.- World Solentirio: Singapore, Mew Jersey, London, Hong-Kong, 1990.- p. 386-395.

4. Бондарь B.C., Высоцкий E.C., Гамалей И.А., Каулин А.Б. Использование фоюпротеина из гидроида Obelia longlEsima для измерения внутриклеточного Ca в макрофагах.- Препринт N137 Б, Красноярск: Изд-во ИБФ СО АН СССР, 1990, 45 о.

5. Бондарь B.C. ВысоцыФ Е.С., Гамалей И.А., Каулин А.Б. Получение, свойства а применение кальций-чувствительного фотопротеина из гидроида Obelia longißsim.- Отология, 1991, т.33, Мб, 0.57-66.

6. Высоцкий Е.С., Бондарь B.C., Гнтельзон К.И. Выделение н

2+

свойства различных молекулярных форм Ca -активируемого фотопротеина обелина.- ДАН СССР, 1991, т.321, 1J1, с.214-217.

Подписано к печати ¿7.01 91 г Тирах 100 Объем I п.л. Заказу Формат бумаги 60x90/16 Бесплатно

Отпечатано на ротапринте ИФ СО АН СССР 660036, Красноярск, Академгородок