Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование структурно-функционального организации СА2+-активируемого фотопротеина обелина из гидроидного полипа Obelia longissima методами генной инженерии

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование структурно-функционального организации СА2+-активируемого фотопротеина обелина из гидроидного полипа Obelia longissima методами генной инженерии"

„л

^ Российская академия наук

ордена ленина сибирское отделение институт биофизики

На правах рукописи

Илларионова Виктория Альбертовна

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ СА2+-^КТИВИРУЕМОГО ФОТОПРОТЕИНА ОБЕЛИНА ИЗ ГИДРОИДНОГО ПОЛИПА ОЬеПа Ьпфзша МЕТОДАМИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск -1997

Работа выполнена в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН (Красноярск)

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Е.С. Высоцкий (Институт биофизики СО РАН)

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Т.Г. Волова (Институт биофизики СО РАН)

кандидат биологических наук Н.М.Титова (Красноярский Государственный университет)

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор"

Защита состоится п 1997 г. в часов на

заседании Специализированного Совета Д 003.45.01 по защитам диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биофизики СО РАН (660036 г. Красно^ ярск, Академгородок). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН.

Автореферат разослан " М" 1997 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор технических наук

А.П.ШевырногоЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Са^-активируемые фотопротеины обнаружены в более чем 25 видах биолюминесцесцирующих морских кишечнополостных организмов. Они представляют собой устойчивый комплекс из трех компонентов: апобелка, полициклического хромофора (целентеразина) и молекулярного кислорода. При связывании Са2+ EF-подобными Са2+-связываюищми сайтами фотопротеина запускается реакция окислительного декарбоксилирования целентеразина, в ходе которой генерируется свет в видимой области спектра. Изучение фотопротеинов актуально по нескольким причинам. Во-первых, механизм фотопротеиновой реакции остается еще во многом неясным. Исследования в этой области расширят представления о принципах и возможностях ферментативного катализа. Во-вторых, пока неизвестно каким образом связывание Са2+ и индуцированный этим конформационный переход в структуре Са5+-связывающих сайтов регулирует активность Са2+-активируемых белков. Исследование механизма конформационных изменений в структуре фотопротеинов, вызванных конформационными переходами в Са2+-связывающих сайтах, внесет вклад в установление общих принципов структурно-функциональных отношений в Са2+-активируемых белках. В третьих, поскольку фотопротеины находят широкое .применение в качестве индикаторов внутриклеточного Са2* и люминесцентных меток в иммуноанализе, знание первичной структуры кДНК, кодирующей фотопротеин, и его люминесцентных свойств совершенно необходимо для его практического использования.

ЦЕЛЬЮ диссертационной работы явилось исследование первичной структуры фотопротеина обелина из гидроидного полипа Ohelia longissima, его люминесцентных свойств, а также влияния аминокислотных замен в Са2+-связывающих сайтах обелина на его люминесцентную функцию.

Были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Определить нуклеотидную последовательность кДНК апообелина из гидроидного полипа Obelia longissima. Определить полную аминокислотную последовательность белка, восстановленную по нуклеотидной последовательности кДНК апообелина. Локализовать Са2+-связывшощие сайты в первичной структуре апообелина.

2. Разработать метод эффективной экспрессии гена апообелина в E.coli.

3. Изучить биолюминесцентные свойства выделенного из E.coli и заряженного синтетическим целентеразином обелина и оценить возможность

его использования в качестве биологического индикатора внутриклеточного Са2+.

4. Получить с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза мутантные' варианты апообелина с заменами высококонсервативных аминокислот в Са2+-связывающих сайтах. Изучить влияние этих замен на люминесцентную функцию мутантных вариантов обелина и выявить функционально-важные позиции в структуре Са2+-связывающих сайтов.

На защиту выносятся следующие ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ.

Нуклеотидная последовательность кДНК апообелина - апофотопротеина из гидроидного полипа ОЬеИа longíssima состоит из 585 нуклеотидов. Полная аминокислотная последивателькссп, аг.ссбелнна, восстановленная по нуклеотидной последовательности кДНК, состоит из 195 аминокислотных остатков и содержит три участка, формирующие Са2+-связывающие сайты.

кДНК апообелина эффективно экспрессируется в рекомбинантном штамме Е.соИ с использованием Т7 РНК-полимеразы. Содержание сшггезированного в Е.соИ апобелка составляет 5 мг на 1 грамм сырой клеточной биомассы.

Заряженный синтетическим целентеразином обелин обладает самой быстрой кинетикой люминесценции среди изученных на сегодня фотопротеинов. Ионы магния в физиологических концентрациях не снижают его чувствительность к Са2+. Эти свойства определяют преимущество обелина как биологического индикатора внутриклеточного Са2+ по сравнению с другими фотопротеинами.

6 мутантов обелина с аминокислотными заменами по высококонсервативным 6-й и 11,12-й позициям трех Са2+-связывающих сайтов сохраняют способность к люминесценции. Замена глицина на аргинин в 6-й позиции незначительно влияет на люминесцентные свойства белка, замена в 11,12-й позициях аспарагиновой и глутаминовой кислот на аланин и глицин, соответственно, приводит к существенным изменениям кинетических параметров люминесценции и диапазона чувствительности к Са2+.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Впервые определена нуклеотидная последовательность кДНК апообелина - апофотопротеина из гидроидного полипа ОЬеИа ¡ongissima и восстановлена полная аминокислотная последовательность этого белка. На основе данных о первичной структуре апообелина возможно выявление наиболее консервативных аминокислотных остатков и исследование их функции, изучение структуры активного центра белка с помощью

направленных аминокислотных замен, изучение третичной структуры апообелина методами пространственного моделирования.

Впервые достигнута эффективная продукция апообелина в E.coli, исследованы его люминесцентные свойства после реактивации синтетическим целентеразином.

Впервые генерированы направленные аминокислотные замены в Са2+-связывающих сайтах обелина и изучено их влияние на люминесцентные свойства фотопротеина. Эти данные представляют большой интерес для дальнейшего изучения структурно-функционачыгой организации Ca2*-связывающих сайтов всех Са2<-активируемых белков, входящих в EF-семейство.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Определение параметров люминесценции синтезированного в E.coli и заряженного синтетическим целентеразином обелина показало перспективность его использования для мониторинга Внутриклеточного кальция. Особенно полезным обелин может оказаться при исследовании процессов, которые регулируются быстрыми изменениями концентраций Ca21", поскольку среди изученных на сегодня фотопротеинов он обладает самой быстрой кинетикой люминесценции.

На основе данных о первичной структуре апообедина возможно создание методами генной инженерии или химической модификации новых иммунологических зондов, содержащих обелин в качестве биолюминесцентной метки. Определение нуклеотидной последовательности кДНК апообелина позволяет использовать ее также при создании систем мониторинга транскрипции и трансляции in vivo и in vitro.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Результаты проведенного исследования представлялись на VII-m Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценцин, Банфф, Канада 1993; Международном симпозиуме по биолюминесценции, Каанапали-бич, Гаваи, США, 1993; VIII-ní Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценцин, Кембридж, Англия, 1994; 1Х-м Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценцин, Вудс Хоул, США, 1996.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 131 странице машинописного текста, содержит 23 рисунка и 8 таблиц.

Список литературы включает 133 источника, из них - 130 на английском языке.

СО ДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во ВВЕДЕНИИ дано обоснование темы диссертации, ее научная новизна, сформулированы цель и задачи исследования.

ГЛАВА 1. Са2+-АКТИВИРУЕМЫЕ ФОТОПРОТЕИНЫ МОРСКИХ КИШЕЧНОПОЛОСТНЫХ ОРГАНИЗМОВ: ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Са24"-активируемые фотопротеины содержат в себе все необходимые компоненты для люминесцентной реакции. Этими компонентами кроме апобелка - единой полипептидной цепи с молекулярной массой около 22 кДа - являются замещенное производное имидазолпиразинона - целентеразин и молекулярный кислород. Два последних прочно связаны с белком и при физиологичеких условиях не диссоциируют. Люминесцентная реакция запускается после связывания ионов кальция Са2+-связывающими сайтами фотопротеина, организованными по типу EF-структур и имеет один цикл. Продуктами реакции являются голубой флуоресцентный белок - апобелок, содержащий целентерамид, СОг и квант света. Квантовый выход реакции in vitro составляет, как правило, 0,15. Са2+-связывающие сайты представляют собой непрерывные участки полипептидной цепи длиною 29 аминокислотных остатков, конкретная последовательность • которых в конечном счете определяет сродство белка к Са2+.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы:

а) методы генетической инженерии - выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток, ее рестрикционный анализ, определение нуклеотидной последовательности ДНК, введение олигонуклеотид-направленных замен в структуру плазмид;

б) микробиологичекие методы - культивирование клеток E.coli для выделения плазмидной и фаговой ДНК;

в) биохимические методы - выделение апообелина и его мутантныл вариантов из клеток E.coli, зарядка синтетическим целентеразином, определение кинетических параметров люминесцентной реакции обелина и его мутантных вариантов с помощью установки для быстрого смешивания определение зависимости интенсивности люминесценции обелина и его мутантных вариантов от концентрации Са2+.

ГЛАВА 3. НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ кДШС

АПООБЕЛИНА ИЗ ГИДРОИДНОГО ПОЛИПА Obelia Icngissima, ОТРАБОТКА ЭКСПРЕССИИ ГЕНА АПООБЕЛИНА В E.coli.

■ Нуклеотидная последовательность клонированной ранее кДНК апообелина (Рис.1) была определена методом химического гидролиза по Махсаму и Гилберту. Анализ нуклеотидной последовательности выявил две длинные открытые рамки считывания - OPCI и OPCII, ориентированные в одном направлении и смещенные относительно друг друга на один нуклеогид. OPCI состояла из 195 колонов и кодировала апообелнк, в структуре которого были обнаружены три Са2+-связывшощнх сайта. Аминокислотная последовательность апообелина обладала высоким уровнем гомологии с аминокислотными последовательностями изученных ранее апофогопротеинов - апоакворина (66%), апоклшгина (76%) и апомитрокомнна (64%).

Экспрессия гена апообелина в Е. coli была проведена с использованием Т7 РНК-полимеразы. Для этого была сконструирована плазмида pTZOlÖ, представленная на Рис.2. Ген апообелина был поставлен под контроль промотора фага Т7. Методом олигоиуклеогид-направленного мугагенеза в структуру кДШС был введен сайт рестрикции Bglll, п'ОРСП были введены два стоп-кодона для того, чтобы экспрессировался только ген апообелина. Синтетический сайт связывания рибосомы был генерирован С.ß.Марковой. Плазмида pTZOlO была введена в клетки E.coli С600 вместе со вспомогательной плазмидой pGPl-2, которая несла ген Т7 РНК-полимеразы под контролем термоиндуцибельного промотора фага лямбда. Клетки полученного рекомбинантиого штамма, содержавшего обе плазмиды, К)'Льтивировали при 30°С в жидкой среде LB до оптической плотности (OD590) равной 1,0-1 ;5. Затем температуру культивирования быстро увеличивали до 42°С на 20 минут, что запускало синтез Т7 РНК-пол им еразы и транскрипцию гена апообелина. Дальнейшее культивирование, проводили при 37°С. Максимальное содержание апообелина в клетках наблюдалось через 3 часа после термоиндукции и составляло 5 мг на 1 грамм сырой клеточной пасты. Апообелин накапливался в клетках E.coli в виде нерастворимых агрегатов - так называемых тел включения. После разрушения клеток простое центрифугирование позволяло отделить плотные тела включения от растворимых компонентов цитоплазмы, что в значительной степени облегчало очистку апобелка.

íkCGAXCGAACCAAACAACTCAGCTCACAGCTACTeAACAACTCTTGTTGTGTACAATCAA б О

OPCI-

AATGTCTTCAAAATACGCAGTTAAACTCAAGACTGACTTTGATAATCCACGATGGATCAA 120

->M SSKYAVKL KrDFDNPRWIK 20

AAGACACAAGCACATGTTTGATTTCCTCGACATCAATGGAAATGGAAAAATCACCCTCGA 180

RHKHMFDFL DIKGMGKITLD 40

OPCII->M EMb KSPS В

TGAAATXGTGTCCAAGGCATCTGATGACAXATGTGCCAAGCTCGAAGCCACACCAGAACA 240

_E IVSKASDDICAKLEATPEQ 60

MKLCPRHLMTYVPSSKPHQH 28

AACAAAACGCC^TCy^GTrTGTGTTGAAGCTTTCXTXAO,AGGATGTCC.^TGG?_bTATGG 300

TKRHQVCVEAFFRGCGMEYG 80

KQNAIKFVLKLSLEDVEWN M 48

TAAAGAAATTGCCTTCCCAaAATTCCTCGATGGATGGAAACAATTGGCGACTXCAGAACT 360

KE 1'AFPCFI.DGWKQLATSEl, 100

VKKLPSHMSSMDGNNWRLQN 68

CAAGAAATGGGCAñGAAACGAACCrACTCTCATTCGTGAATGGGGAGATGCXGTCTTTGA 420

К К WARN E P T L I REWGDAVF D 120

SRMGQETNLLSFVNGEMLSL 88

TATTTTCGACAAAGATGGAAGTGGTACAATCACTTTGGACGAATGGAAAGCTTATGGAAA 480

I F DKDGSGTITLDE W К А У G К 140

IFSTKMEVVQSLWTNGKLME 108

AArCTCIGGTATCTCTCCATCACAAGAAGATTGTGAAGCGACATTTCGACATTGCGATTT 540

X3GI SPSQEDCEATFRHC D_L 160

KSLVSLHHKKIVKRHFDIAI 129

GGACAACAGTGGTGACCTTGATGTTGACGAGATGACAAGACAACATCTTGGATTCTGGTA 600

DNSGDLDVDE MTRQHLGFWY 180

WTTVVYLMLTR *** 139

CACTTTGGACCCAGAAGCTGATGGTCTCTATGGCAACGGAGTTCCCTAAGCTTTTTTTCG 660

TLDPEADGLY G N. G V^ P *** 195

AA - 662

Рис.1. Нуклеотидная последовательность кДНК апообелина и аминокислотные последовательности, кодируемые OPCI и OPCII. Звездочками обозначены стоп-кодоны; аминокислоты, формирующие EF-петли Са2+-связывающих сайтов, подчеркнуты.

Рис.2. pTZOlO - плазмида, сконструированная для экспрессии гена апообелина. Обозначения: orí - район начала репликации плазмиды; Ар - ген р-лактамазы; ароОЫ - ген апообелина; РТ7 -промотор фага Т7; Plac - промотор лактозного оперона Е. coir, ССР - синтетический сайт связывания рибосомы, т.п.н. - .тысяча пар нуклеотидов; Xbal, Clal, PstI - сайты рестрикции. .

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ОБЕЛИНА КАК ИНДИКАТОРА ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО КАЛЬЦИЯ

После выделения из рекомбинантного штамма Е.сои, очистки и зарядки синтетическим целентеразином, были изучены люминесцентные свойства полученного рекомбинантного обелина: кинетика люминесцентного ответа, диапазон чувствительности к Са2+, а так же влияние на эти параметры. Исследования проводили при

физиологических значениях рН, ионной силы (рН 7,0, 150 мМ КС1) и при температуре 20°С. Поскольку ранее для фотопротеинов акворина из Aequorea victoria и обелина из Obelia geniculata было показано, что Mg2"1 в концентрациях, характерных для цитозоля (0,3-1,0 мМ), оказывает существенное влияние на их люминесценцию, исследование влияния Mg*+ на параметры люминесценции рекомбинантного обелина проводили при

концентрации 1 мМ и 10 мМ для того, чтобы гарантированно выявить его эффект.

Исследование кинетики люминесцентного ответа рекомбинантного обелина проводили методом "остановленной струи" (Диксон и Уэбб, 1982). На Рис.ЗА,Б представлены люминесцентные ответы рекомбинатного обелина при быстром, увеличении Са2+ в смеси до насыщающей концентрации в присутствии 10 мМ Мд?+ и без него. Мц?* в концентрации 1мМ не влиял на кинетику люминесценцентного ответа обелина (данные не приведены).

Изучение фазы подъема люминесценции проводили, начиная с момента остановки потока (Рис.ЗА, нулевой ™сме:гг времени). Она достаточно хорошо описывалась уравнением реакции первого порядка. Константа скорости подъема люминесценции для рекомбинантного обелина составила 379 сек"1, время полуподъема - 1,7 мсек. Параметры люминесценции рекомбинантного обелина приведены в таблице 1, для сравнения в ней также приведены данные для других исследованных ранее фотопротеинов. Добавление ионов не оказывало существенного

влияния на стадию подъема люминесценции обелина (Рис.ЗА). Константа скорости подъема люминесценции в присутствии 10 мМ составила 331 сек'1, время полуподъема - 2,1 мсек,

-0.01 0.00 . 0.01 0.02 о.о 0.4 0.8 1.2 1.6

Время, сек Время, сек

А Б

Рис.3. Люминесценция рекомбинантного обелина в присутствии 10 мМ —) и без него (—) при насыщающей концентрации Са2\ А - фаза подъема; Б - фаза спада. Ь - интенсивность люминесценции, Цих - максимальная интенсивность люминесценции.

Таблица 1. Люминесцентные свойства рекомбинантного обелина, акворина и обелина из гидроидного полипа О.дгШсиШа

Параметр РекомбинантныЙ обелин Акворин1 Обелин из О.демЫсМа2

Константа скорости подъема люминесценции (сек'() 379 100 250-280

Константа скорости спада люминесценции (сек"1) 8,3 1.2 не определялась

Диапазон чувствительности к Са2+ в отсутствие иных Двухвалентных катионов (М) ю-1-4-ю-40 10-i,o_]0Ab ю-65. ю-3-5

'Hastings et al. (1969), Blinks et al. (1978). JStephenson and Sutherland (1981).

Стадию спада люминесценции (Рис.ЗБ) с некоторым приближением можно описать уравнением реакции первого порядка. Константа скорости спада люминесценции рекомбинантного обелина, рассчитанная на основе аппроксимации экспоненциальной функцией, равнялась 8,3 сек"1. Добавление ионов магния снижало константу скорости спада до 3,8 сек'1, при этом удельная активность обелина не менялась. По всей видимости, этот эффект может быть объяснен конкурентным связыванием с ЕИ-

структурами обелина.

Зависимость люминесценции рекомбинантного обелина от концентрации Са21" представлена на Рис.4 как функция логарифма нормированной люминесценции - 1од(Ь/Цпах) от логарифма концентрации Са2+ - 1од[Са2+] в присутствии 10 мМ М^1" и без него, где Ь - максимальная интенсивность люминесценции при заданной концентрации Са2+, Ицш -максимальная интенсивность люминесценции при насыщающей концентрации Са2+. Эта зависимость имет три хорошо выраженные фазы:

1) фаза Са2+-независимой люминесценции ([Са2+] < 10'7,4М),

2) фаза роста люминесценции (10'7,4 М <. [Са2+] й Ю^М),

3) фаза насыщения люминесценции ([Са2+] > Ю"4,0 М).

1. Фаза Са2+-независимой люминесценции обелина.

Са2+-независимая люминесценция обелина определяется его способностью к спонтанной разрядке при низких концентрациях Са2+. Ее интенсивность (Ь,„т) не зависит от концентрации Са2+.

2. Фаза роста интенсивности люминесценции, Из представленной на Рис.4 еигмондной зависимости видно, что рекомбинантный обелнн чувствителен к изменению концентрации Са3+ в диапазоне от Ю'7,4 М до Ю"4,0 М. Известно, что концентрация внутриклеточного кальция в цитоплазме покоящейся клетки составляет 10"7,s М, а при возбуждении достигает величин 10-6-! О"5 М (Campbell, 1983). Таким образом, диапазон чувствительности к Са2+ рекомбижишюго обелит, как н других изученных на сегодня фотопротеинов, позволяет использовать его

1 В еЗ

I—)

о

о -1 -2 -3

-4 (-5 -6 -7 -8 -9 У г

/■— Л i^j

ft

А f 1

м

//

/._

EGTA -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 log[Ca++]

Рис.4. Зависимость интенсивности люминесценции рекомбинантного обелина от концентрации Са2+ в присутствии 10 мМ магния (Л) и без него (о). Заполненные символы - концентрация кальция' задана с помощью Ca-EGTA буфера. Открытые символы - концентрация кальция задана с помощью разведения раствора СаСЬ. L -максимальная интенсивность люминесценции при заданной концентрации Са2+, Ьщи - максимальная интенсивность люминесценции при насыщающей концентрации Са'+. Теоретические кривые построены с использованием модели Аллена, Блинкса и Прендергаста (Allen et а!., 1977).

для тестирования концентраций внутриклеточного Са2\

Как видно из Рис.4 при добавлении Mg24 до концентрации 10 мМ диапазон чувствительности к Са2+ рекомбинантного обелина сместился и составил Ю"70 - 10"3,5 М. Mg2* в концентрации 1мМ не повлиял на чувствительность обелина к Саг+ (данные не приведены). Ранее для акворина и обелина из O.geniculata было показано, что Mg2* уже в концентрации 1 мМ существенно снижал чувствительность к Саг+.

3. Фаза насыщения люминесценции.

Область насыщения на сигмоидной кривой соответствует концентрациям Са2+, при которых интенсивность шомннесцсншш фотопротеина (L) достигает максимума (1-шах)-

Полученные данные позволяют сделать заключение о перспективности использования рекомбинантного обелина как индикатора внутриклеточного кальция. При этом следует подчеркнуть, что он обладает важными преимуществами по сравнению с акворином из медузы A. victoria н обелнном из O.geniculata: самой быстрой кинетикой люминесценции и отсутствием влияния Mg2+ в концентрашш 1 мМ на диапазон чувствительности к Са2+.

ГЛАВА 5. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАНТНЫХ ВАРИАНТОВ ОБЕЛИНА

Введение направленных ашшокнелотых заме» i; Ся^-связмздющие сайты апообелина. Для большинства известных Са2+-модулируемых белков показана высоким консервативность ряда аминоклелот Саг*-связывающих сайтов, в том числе глнцина в б-й позиции (Gly6) и глутамниовой кислоты я 12-й позиции (GIul2). При этом функция Giy6 до сих пор остается неясной. Боковая карбоксильная группа Glul2 является бидентатным лигандом, участвующим в связывании Са2+. Эти аминокислоты в каждом из трех Са2+-связывающих сайтои апообелина были заменены с помощью олигонуклеотид-напраиленного мутагенеза. Глицин в 6-й позиции был заменен на аргннин (Gly6->Arg, глициновые мутанты), глутаминовая кислота в 12-й позиции - на глицин (G!ul2—>Gly, глутамиповые мутанты). Исходя из структуры Са2+-связывающнх сайтов апообелина, нельзя исключить, что остаток аспарапшоьой кислоты в 11-й позиции может координировать нон Са2+ своей боковой карбоксильной группой, компенсируя отсутствие остатка глутамниовой кислоты в случае замены Glul2->Gly. Чтобы избежать этого, одновременно с заменой Glul2-»Gly, аспарагнновую кислоту в 11-й позиции каждого сайта меняли на аланнн (AspU->Ala).

Таблица 2. Мутантнме варианты апообелина.

Мутант Са2+~связывающий сайт Аминокислотная замена Олигонуклеотиды, использованные для мутагенеза' (5' - 3')

Сайт! DINGNGKXT1.DE

G1 V R G35-»R GGGTGATTTTTCgATTT

DE1 и и А О D40-»A E41-»G ACAATTcCAgCGAGG

Сайт 2 DKDOsnTITLO!

G2 V R G128-»R AGTGA'ITU i ACgACTTC

DE2 ll И А О D133->A Et34->G TTCCATcCGgCCAAA

Сайт 3 dldhsqdldvde

G3 U я G164-»R AAGGTCACgACTGTTG

DE3 D U A G D169-»A E170-»G TCATCtCGgCAACATC

олигонуклеотиды комплементарны последовательности апообелиновой кДНК, приведенной на Рис.1, строчными буквами обозначены нуклеотиды, генерирующие соответствующие замены в нуклеотидной последовательности гена апообелина.

Для получения в исходном рекомбинантном обелине (белок дикого типа) направленных аминокислотных замен были сконструированы олигонуклеотиды. Полученные б мутантов апообелина: три глициновых мутанта (Gl, G2, G3) и три глутаминовых мутанта (DEI, DE2, DE3), а также олигонуклеотиды, использованные для мутагенеза, представлены в таблице 2. Наличие ожидаемых нуклеотидных замен в мутантах было подтверждено сиквенсом соответствующих мутантных клонов апообелиновой кДНК.

Ни одна из аминокислотных замен в обелине не привела к полной потере люминесцентной активности (см. таблицу 3). Для всех полученных мутантов обелина была исследована кинетика люминесцентного ответа, а также определена зависимость люминесцентной активности от концентрации Са2+.

0 5 10 15 20 25 30 Время, сек DE1

0.00

25 50 75 100 125 150 Время, сек

DE2

10 15 20 25 30 Время, сек

DE3

t£ О)

о

£ с; _)

10.0

7.5 ■I

5.0 -II

2.5 Li V

00 I

0.0 0.4 0.8 1.2 Время, сек

Обелин дикого типа

1.6

Рис.5. Люминесценция глутаминовых мутантов и обелина дикого типа при насыщающей концентрации Са2+. L - интенсивность люминесценции, Int - суммарный световой выход.

Кинетнку люминесцентного ответа мутантов обелина исследовали. методом "остановленной струи" при насыщающей концентрации Са2+. На Рис.5 представлены люминесцентные ответы только глутаминовых мутантов, поскольку глициновые мутанты практически не отличались от белка дикого типа. В таблице 3 приведены значения параметров люминесценции для всех мутантов.

Стадия подъёма люминесценции для всех мутантов, так же как и для белка дикого типа, хорошо описывалась экспоненциальной функцией. Если константа скорости подъема для глициновых мутантов и мутанта DE1 практически совпала с константой скорости подъема люминесценции для обелина дикого типа, то для DE2 и DE3 мутантов эта величина составила 0,45 и 0,61 величины для обелина дикого типа.

Стадия спада люминесценции хорошо описывалась экспоненциальной функцией только для глициновых мутантов. Кинетика спада люминесценции глутаминовых мутантов сильно отличалась от кинетики спада люминесценции белка дикого типа (см. Рис.5), ее было невозможно описать, одной экспонентой. Для того, чтобы сравнить мутанты по максимальной скорости утилизации, был введен показатель L^u/Int, где Lmax -максимальная интенсивность люминесценции, Int - суммарный световой выход - величина, полученная в результате численного интегрирования люминесцентного сигнала по времени. Для обелина дикого типа, стадия спада люминесценции которого хорошо описывалась одной экспонентой,

Таблица 3. Свойства мутантных вариантов обелина.

Фотопротеин Суммарный световой выход в % к обелину дикого типа Константа подъема люминесценции Lm„/Int, сек'1 Lra„/Int в % к обелину дикого типа

Обелин дикого типа 100 379 8,53 100

Gl 79- 342 8,40 98

G2 78 349 5,20 61

G3 33 378 7,17 84

DEI 36 362 0,45 5,3

DE2 44 172 0,06 0,7

DE3 15 231 0,23 2,7

показатель Ь1Тих/1п( совпадал с константой скорости спада люминесценции.

Если для глициновых мутантов значение ЦпюДт несущественно отличалось от белка дикого типа, то для глутаминовых мутантов значение ЬпшхЛт было значительно снижено (см. таблицу 3) и составляло 0,7-5,3% величины ЬтоачЛги белка дикого типа.

Таким образом, только замены типа А$р11—>А1а,01и12->01у в Са2+-связывающих сайтах существенно сказались на кинетических параметрах люминесценции и привели к значительному снижению как константы скорости подъёма люминесценции, так и параметра Ьдац/Ы мутантных вариантов обелина.

Зависимость люминесцентной активности мутантов обелина от концентрации Са2* представлена на Рис.6. Были определены следующие показатели:

а) Диапазон чувствительности к Са2+;

б) Ьтт/Ьлт - отношение нижней и верхней границ диапазона люминесцентного ответа.

в) ЬщтЛм - величина, характеризующая скорость утилизации фотопротенна в отсутствие Са'+, полученная умножением Ь^/Ш из

^пиа^тдх-

Значения этих показателей приведены в таблице 4. Видно, что по сравнению с белком дикого типа, величина ЦшгЛ-тах практически не изменилась для глициновых мутантов по первому и второму Са21"-связывающим сайтам, и уменьшилась в десять раз для глицинового мутанта по третьему сайту. Это отразилось и на отношении Ь,шп/!п1 для мутанта 03 -оно увеличилось в 6,7 раза по сравнению с обелином дикого типа. Диапазон чувствительности к Са2т для глициновых мутантов в! и 02 также существенно не отличался от диапазона чувствительности обелина дикого типа. Только для мутанта 03 было показано незначительное снижение чувствительности к Са2+. По всей видимости, присутствие глицина в 6-м положении ЕР-петель несущественно для связывания Са2+, г:с-крайней мере, в 1 -м и 2-м Са2+-связывагощих сайтах.

Величина Ьмп/Цшх для всех глутаминовых мутантов значительно уменьшилась по сравнению с белком дикого типа. Данные приведены на Рис. бив таблице 4. Такое изменение является следствием: а) снижения максимальной скорости утилизации ОЕ-мутантов при насыщающей концентрации Са2+, что отражается в снижении величины Ьтах/1гД; б) возрастания скорости утилизации БЕ-мутантов в отсутствие Са:", что отражается в увеличении величины ^¡„Лш.

Диапазон пупс'шгослыюсчи к Ca2t для мутанта DE1 практически не. изменился по сравнению с белком дикого типа (см. таблицу 4). Для мутанта DE2 нижняя граница диапазона осталась ш уровне белка дикого типа,

О -1

о"?

£d -J

~т

VJu

-7 ---^

»

i

EGTA-8 -7-6-5-4-3-2-1

Iog[Ca2+j

w И

I

о -1 .2 -3 -4

-6 -7 -8 -9

EGTA-8 -7 -6 -5-4-3-2-1 loB[Ca2+j

rtr/"-

G1

G2

or -l -2 -3

! 1/

I ^

1»

Ы

- In

/ —

-J*..-2

§ л J ^

3 -s -6 -7

-8

-9 $•

EGTA-B -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1

0 -1 -2

?-3

-И

<~) -5 ~ -7

f

У

/

/

j,/

log(Ca

2+!

-9

EGTA-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 logJCa24]

G3

DEI

l'nc.0 (начало).

0 -1 -2 -3 -4 -5 -б -7 -8 -9

EGTA-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 Iog[Ca2+]

/ №

¥

\ ! г

/

]

f

J

/

J

f\ ft /

_4 i

f

У

EGTA-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 Iog[Ca2+]

DE2 DE3

Рис.6 (окончание). Зависимость интенсивности люминесценции мутантов обелина от концентрации Са2+. Обозначения: Д - люминесценция мутантов, о - люминесценция рекомбинантного обелина дикого типа. Заполненные символы - концентрация кальция задавалась с помощью Ca-EGTA буфера. Открытые символы - концентрация кальция задавалась с помощью разведения раствора СаСЬ. L - интенсивность люминесценции при заданной концентрации Ca2*, L^ - интенсивность люминесценции при насыщающей концентрации Са2+. Теоретические кривые построены с использованием модели Аллена, Блинкса и Прендергаста (Allen et al., 1977).

Таблица 4. Параметры люминесценции мутантов обелнна

Фотопротеин Lmii/Lmex (xlO~9) Uisj/Int, сек"1 Lmln/Illt (xlO"8) LWInt в % к обелину дикого типа Диапазон чувствительности к Са2+ (log[Ca2+|)

Обелин дикого типа 9,99 8,53 8.5 100 -7,4 - -4.0-

Gl 17,2 8,40 14,4 169 -7,1 - -3,5

G2 15,4 5,20 8,0 94 -7,4 - -3.5

G3 79,6 7,17 57,1 672 -6,9 - -3,7

DEI 2217,2 0,45 99,8 1174 -7,6 - -3,7

DE2 6822,6 0,06 40,9 481 -7,1 - -3,0

DE3 1785,7 0,23 41,1 483 -6,6 - -2,5

а верхняя граница сместилась в область более высоких концентраций Са2+ на. одну логарифмическую единицу. Для DE3 мутанта как нижняя, так и верхняя границы диапазона чувствительности сместились в область более высоких концентраций Са2+ на 0,8 и 1,5 логарифмической единицы, соответственно. Таким образом, замена глутаминовой кислоты в 12-м положении EF-петли на глицин, сократившая число лигандов, координирующих Са2+ с 7-ми до 5-ти, имела выраженный эффект на люминесценцию фотопротеина, в каком бы Са2+-связывающем сайге не была генерирована такая мутация.

Из сравнения полученных данных о влиянии одинаковых аминокислотных замен в разных Са2+-связывающих сайтах на функцию обелина можно сделать вывод, чш замены ЕС итором и третьем Са2+-связывающих сайтах имели более выраженный эффект на люминесцентные свойства белка по сравнению с аналогичными заменами в первом Са2+-связывающем сайте. Это в свою очередь говорит о том, что сайты не тождественны по своему влиянию на люминесце1гтные свойста фотопротеина и на его чувствительность к ионам Са2+.

ВЫВОДЫ

1. Определена нуклеотидная последовательность кДНК апообелина -апофотопротеина из гидроидного полипа Obelia ■ longisstma. В этой последовательности обнаружены две открытые рамки считывания, одна из которых кодирует апообелин. По нуклеотидной последовательности восстановлена полная аминокислотная последовательность апообелина. Показано, что апообелин состоит из 195 аминокислотных остатков и содержит три Са2+-связывающих сайта, организованных по типу EF-струкгур, характерных для Са2+-акгивируемых белков.

2. Методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза получено 6 мутантов апообелина с заменой высококонсервативных аминокислот по шестому положению (GIy6-*Arg), а также по одиннадцатому и двенадцатому положениям (Aspll—»Ala, Glul2-»Gly) каждого из трёх Са2+-связывающих сайтов.

3. Геи апообелина, а также гены его мутантных вариантов экспрессированы в E.coli с использованием Т7 РНК-полимеразы. Содержание синтезированных в E.coli апобелков составило 5 мг на 1 грамм сырой клеточной биомассы.

4. Определены параметры люминесценции рекомбинантного обелина: константа скорости подъема люминесценции - 379 сек'1, константа скорости

спада люминесценции - 8,3 сек'1, отношение нижней и верхней границ диапазона люминесцентного ответа - 10"8, диапазон чувствительности к Са2+ - от 4x10'8 до lxlO"4 М Показано, что Mg2* в конце1прации 1 мМ не влияет на чувствительность рекомбинантного обелина к Са2+. Полученные данные свидетельствуют о перспективности рекомбинантного обелина для использования в качестве индикатора внутриклеточного кальция.

5. Показано, что замена глицина на аргинин в 6-ой позиции в первом и втором Са2+-связывающих сайтах существенно не влияет на константу скорости подъема люминесценции, максимальную скорость утилизации белка и диапазон люминесцентного ответа, но приводит к незначительному смещению верхней границы диапазона чувствительности к Са2+. Аналогичная замена в третьем сайте также не оказываег существенного влияния на кинетические параметры люминесценции, но приводит к сужению диапазона люминесцентного ответа и снижению чувствительности к Са2+.

6. Показано, что замена аспарагиновой и глутаминовой кислот в 11-й и 12-й позициях Са2+-связывающих сайтов на аланин и глицин, соответственно, приводит к существенному снижению максимальной скорости утилизации белка и значительному сужению диапазона люминесцентного ответа. Для мутантов по второму и третьему сайтам кроме этого наблюдается снижение константы скорости подъема люминесценции и смещение границ диапазона чувствительности к Са2+.

7. В каждой серии мутантов - по 6-й или 11-й,12-й позициям, аминокислотные замены во втором и третьем Са2+- связывающих сайтах имеют более выраженный эффект на люминесцентные свойства белка по сравнению с аналогичными заменами в первом Са2+-связываюшем сайте.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Illarionov В.А., Maikova S.V., Bondar V.S., Illarionova V.A., Vysotski E.S. Cloning, expression and nucleotide sequence investigation of apoobelin cDNA from the hydroid Obelia longissima // Bioluminescence and chemiluminescence / Eds. Szalay A.A. et al. - John Wiley & Sons, Chichester, 1993. - P.183-185.

2. Illarionov B.A., Matveev S.V., Bondar V.S., Illarionova V.A., Trofimov K.P., Vysotski E.S. Site-directed mutagenesis of cDNA coding for Ca-activated photoprotein obelin from hydroid Obelia longissima // Abstracts of International Bioluminescence Symposium. - Hawaii, USA. - 1993. - P.38.

3. Illarionov B.A., Illarionova V.A., Lee J.W., van Dongen W., Vervoort J. Expression and properties of the recombinant lumazine (riboflavin) protein from

Photobacterium leiognathi // Biochim. Biophys. Acta. - 1994. - V.1201. - P.251- • 258.

4. Frank L.A., Markova S.V., Illarionova V.A., Illarionov B.A., Vysotski E.S. Calcium-activated photoprotein obelin derivatives in immunoassay: perspectives // BioluminesceEce and chemiluminescence: fundamentals and applied aspects / Eds. Campbell A.K. et al. - John Wiley & Sons, Chichester, 1994. -P.249-252.

5. Illarionov B.A., Bondar V.S., Illarionova V.A., Vysotski E.S. Sequence of the cDNA encoding the Ca(++)-activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissmia // Gene. - 1995. - V.l 53. - P.273-274.

6. Frank L.A., Illarionova V.A., Vysotski E.S. Use of proZZ-obelin fusion protein in bioluminescent immunoassay II Biochem. Biophys. Res. Commun. -1996. - V.219. - P.475-479. '

7. Illarionova V.A., Illarionov B.A., Bondar V.S., Vysotsky E.S., Blinks J.R. Characterization of recombinant obelin as ail intracellular Ca** indicator // Bioluminescence and chemiluminescence: molecular reporting with photons / Eds. -Hastings J.W. et al. - John Wiley & Sons, Chichester, 1997. - P.427-430.

8. Illarionova V.A., Illarionov B. A., Bondar V.S., Vysotsky E.S., Blinks J.R. Removal of essential ligand in N-terminal calcium binding domain of obelin does not inactivate the photoprotein or reduce its calcium sensitivity, but dramatically alters the kinetics of the luminescent reaction // Bioluminescence and chemiluminescence: molecular reporting with photons / Eds. Hastings J.W. et al. -John Wiley & Sons, Chichester, 1997. - P.431-434.