Спектрально-люминесцентный анализ Ca2+-регулируемых биолюминесцентных реакций фотопротеинов

Белогурова, Надежда Валентиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Спектрально-люминесцентный анализ Ca2+-регулируемых биолюминесцентных реакций фотопротеинов
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Спектрально-люминесцентный анализ Ca2+-регулируемых биолюминесцентных реакций фотопротеинов"

004603088

Белогурова Надежда Валентиновна

СПЕКТРАЛЬНО-ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ С а2+-РЕГУЛИРУЕМЫХ

БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ РЕАКЦИЙ ФОТОПРОТЕИНОВ

Специальность 03.01.02. - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 6 СЕН 2010

Красноярск - 2010

004608088

Работа выполнена в лаборатории фотобиологии Института биофизики Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор физико-математических

наук, профессор Кудряшева Надежда Степановна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Трофимов Алексей Владиславович

доктор биологических наук,

профессор Исмаилов Анвар Джураевич

Ведущая организация: Национальный исследовательский

Томский государственный университет

Защита диссертации состоится 23 сентября 2010 года в 14 часов на заседании диссертационного Совета Д 501.001.96 при кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, «Новая» аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «ДО » СЦ&'Щ о>2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук Страховская Марина Глебовна

Актуальность проблемы. Са2+-регулируемые

биолюминесцентные реакции, катализируемые фотопротеинами, ответственны за свечение морских кишечнополостных. В настоящее время наиболее изученными фотопротеинами являются акворин и обелин, выделенные соответственно из медузы Aequorea victoria и гидроидного полипа Obelia longissima. Фотопротеин представляет собой стабильный фермент-субстратный комплекс, состоящий из апопротеина - односубъединичного полипептида (~22 кДа) и «преактивированного» кислородом субстрата, 2-гидропероксицелентеразина, прочно, но нековалентно связанного с белком внутри гидрофобной полости [1]. При связывании ионов кальция происходит реакция внутримолекулярного окислительного декарбоксилирования, продуктами которой являются С02 и целентерамид в возбужденном состоянии, релаксация которого сопровождается излучением кванта видимого света. Продукт биолюминесцентной реакции - комплекс апопротеина с целентерамидом - принято называть разряженным фотопротеином. Разряженные фотопротеины, в отличие от фотопротеинов, являются флуоресцентными белками и характеризуются эффективной сине-зеленой флуоресценцией.

Интенсивность исследования фотопротеинов в настоящее время связана с перспективностью их использования в современных биологических технологиях. Благодаря способности люминесцировать в присутствии ионов кальция, фотопротеины успешно используют для мониторинга внутриклеточного кальция и визуализации внутриклеточных процессов [2]. С помощью фотопротеиновых меток возможно решение ряда задач высокочувствительной и экспрессной аналитики - от диагностики заболеваний до анализа генетически модифицированных продуктов и единичных нуклеотидных замен.

Методы молекулярной биологии позволили конструировать линии клеток и целые организмы, способные стабильно экспрессировать ген, кодирующий апопротеин. Поскольку целентеразин является гидрофобным, он легко проникает через мембрану, трансформируя синтезирующийся апопротеин в фотопротеин, способный генерировать свет при появлении ионов кальция. Фактически, такие клетки и организмы имеют генетически встроенный индикатор кальция. В настоящее время получен целый ряд разнообразных клеточных систем, экспрессируюхцих ген фотопротеина.

Вместе с тем, проводимые исследования относятся в

г i

i f <■ 1 U '

основном к области биологических наук; фотофизические подходы не достаточно активно привлекались для исследования фотопротеинов. В связи с этим представляет интерес активность и природа электронно-возбужденных состояний эмиттера биолюминесценции кишечнополостных.

Спектры биолюминесценции фотопротеинов и фотолюминесценции разряженных фотопротеинов широкие и асимметричные, их можно представить в виде суперпозиции спектров нескольких излучателей (различных форм целентерамида) с разной энергией флуоресцентных состояний. Разложение данных спектров на составляющие до сих пор не проводилось. Такое разложение позволит определить количество, вклады и спектральные характеристики компонентов данных спектров, провести идентификацию эмиттеров и установить связь между спектральным составом люминесценции фотопротеинов и эффективностью протонных взаимодействий в активном центре белка.

биолюминесцентного эмиттера. Заселенность высших электронно-возбужденных состояний эмиттера экспериментально подтверждена для бактериальной биолюминесценции [4]. Было высказано предположение об универсальности этой гипотезы для биолюминесцентных реакций всех организмов. Поэтому представляет интерес тестирование заселенности высших электронно-возбужденных состояний эмиттера в биолюминесцентных реакциях кишечнополостных.

Цель исследования состояла в изучении заселенности электронно-возбужденных состояний эмиттеров

биолюминесценции фотопротеинов и фотолюминесценции разряженных фотопротеинов.

В работе поставлены следующие задачи.

1. Экспериментально доказать возможность заселения высших электронно-возбужденных состояний эмиттера в биолюминесценции кишечнополостных.

2. Выявить и охарактеризовать спектральные компоненты биолюминесценции фотопротеинов обелина и акворина, провести их соотнесение различным формам целентерамида.

3. Выявить и охарактеризовать спектральные компоненты фотолюминесценции разряженных акворина и обелина, провести их соотнесение различным формам целентерамида.

4. Исследовать зависимость спектральных характеристик биолюминесценции обелина и фотолюминесценции разряженного обелина от концентрации ионов кальция в ферментативной системе.

Научная новизна. Впервые, на примере биолюминесценции обелина дикого типа и его мутанта Б88У, экспериментально доказана возможность заселения высших электронно-возбужденных состояний эмиттера в Са2+ -регулируемой биолюминесцентной реакции кишечнополостных. Установлена энергия высших электронно-возбужденных состояний эмиттера биолюминесценции фотопротеинов - около 31000 см"1.

Выделены и описаны компоненты сложных спектров биолюминесценции обелина и акворина и фотолюминесценции разряженных обелина и акворина. Выделенные спектральные компоненты приписаны излучению ряда форм целентерамида, различающихся степенью ионизации во флуоресцентном состоянии.

Впервые продемонстрировано, что интенсивность и спектральный состав фотолюминесценции разряженного обелина зависят от концентрации ионов кальция в реакционной смеси, а также длин волн возбуждения и испускания.

Зарегистрирован конформационный переход в разряженном обелине при концентрации ионов кальция около 5-10"7 М.

Практическая значимость. Полученные закономерности формирования сложных спектров биолюминесценции и фотолюминесценции фотопротеинов являются теоретической основой для разработки новых методов варьирования их спектральных характеристик. Анализ изменений вкладов спектральных компонентов фотолюминесценции позволяет судить об изменениях, происходящих в активном центре фермента. Показана принципиальная возможность использования интенсивности фотолюминесценции разряженного обелина для определения концентрации ионов кальция.

наносистемах» (Москва. Россия, 2007), XXIX Европейском конгрессе по молекулярной спектроскопии (Опатия, Хорватия, 2008), V Съезде Российского фотобиологического общества «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2008), Конференции и выставке по нанотехнологиям «НаноИзраиль 2009» (Иерусалим, Израиль, 2009), XIII Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Палермо, Италия, 2009), X Международной конференции по молекулярной спектроскопии (Краков, Польша, 2009), XVI Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (Лион, Франция, 2010).

Работа выполнена при финансовой поддержке следующих грантов: Министерства Образования РФ REC-002 KR-006; ФСП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» по теме: «Биолюминесцентный анализ: биосенсоры и биокаталитические технологии»; РФФИ № 07-04-01248-а; Сибирского Федерального Университета для поддержки научных исследований студентов, аспирантов и молодых ученых: «Спектральная идентификация эмиттеров биолюминесцентной реакции Са2+-регулируемых фотопротеинов», 2007; «Ведущие научные школы» № 1211.2008.4, Программы РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Работа была удостоена государственной премии Красноярского края в 2009 году.

Личный вклад соискателя состоял в подборе биолюминесцентных систем и адаптации биолюминесцентных методик для проверки заселенности высших электронно-возбужденных состояний эмиттера биолюминесценции кишечнополостных, постановке и проведении всех экспериментов, обработке и обсуждении экспериментальных данных, подготовке публикаций. Основная часть результатов была получена в сотрудничестве с А.Г. Сизых, JI.A. Франк, Н.П. Маликовой, Ф.Н. Томилиным, P.P. Алиевой. Автор приносит благодарность всем коллегам за участие в совместных работах и обсуждении результатов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, 11 тезисов и материалов конференций, имеется заявка на патент Российской Федерации «Флуоресцентный способ определения концентрации кальция».

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста, состоит из

введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы. Работа, проиллюстрирована 42 рисунками и содержит 12 таблиц.

Список сокращений: РОРОР - 1,4-бис(5-фенилоксазол-2-ил)бензол; МСБ - п-бис(о-метилстерил)бензол; С - концентрация, М; [Са2+] - равновесная концентрация ионов кальция, М; [Ак], [Об], (Т88У] - концентрация акворина, обелина, мутанта обелина Б88У соответственно, М; ВЭВС - высшие электронно-возбужденные состояния.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Первая глава диссертационной работы посвящена обзору литературы по механизму биолюминесцентной реакции фотопротеинов. Описаны структура фотопротеинов и основные проблемы, связанные с изучением формирования эмиттера. Проанализированы имеющиеся в настоящее время гипотезы о механизме образования эмиттеров в Са2+-регулируемых биолюминесцентных реакциях и роли переноса протона в этом процессе. Описаны физико-химические основы теории хемилюминесценции и систематики молекул по спектрально-люминесцентным свойствам, на основе которых сформулирована гипотеза о возможности заселения ВЭВС в биолюминесцентном процессе. Представлены современные подходы к исследованию процессов переноса энергии в растворах флуоресцентных соединений при фотовозбуждении, а также в более сложных системах с химическим возбуждением.

Во второй главе «Материалы и методы» описаны использованные в работе приборы, реагенты и методические подходы. Рекомбинантные препараты акворина, обелина дикого типа и его мутантов F88Y, Y138F и I144H были получены в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН. Спектры биолюминесценции фотопротеинов, а также фотолюминесценции (испускания и возбуждения) разряженных фотопротеинов регистрировали на спектрометре Aminco-Bowman Series 2 (Thermo Spectronic, США). Для измерения спектров поглощения использовали двулучевой регистрирующий спектрофотометр UVIKON 943 (KONTRON Instruments, Италия). Обессоливание растворов фотопротеинов проводили гель-фильтрацией с помощью хроматографической колонки D-Salt™

Dextran Desalting Column.

Разряженные фотопротеины получали в результате проведения биолюминесцентной реакции либо при добавлении СаСЬ к растворам фотопротеинов, либо путем нагревания растворов фотопротеинов при 40°С в течение 2х часов в отсутствии Са2+ (термоинактивация). Таким образом, [Са2+] варьировали в диапазоне 0 - 0,005 М.

Тестирование заселенности ВЭВС эмиттера биолюминесценции проводили с помощью экзогенных флуоресцентных соединений (акцепторов энергии возбуждения) с различной энергией флуоресцентных состояний. Данная методика состояла в сравнении спектров биолюминесценции фотопротеинов до и после добавления в реакционную смесь флуоресцентного соединения и выявлении сенсибилизированной флуоресценции этого соединения. В этих экспериментах использовали следующие экзогенные флуоресцентные соединения: антрацен, РОРОР, МСБ, пирен, 2-метоксинафталин, нафталин, п-терфенил, 1,4-дифенилбутадиен.

Изложена методика подбора модельной функции для описания спектральных составляющих и способы разложения сложных спектров на компоненты. Спектры биолюминесценции акворина и обелина, а также спектры фотолюминесценции разряженных акворина и обелина были разложены на контуры, имеющие гауссову форму в координатах интенсивность люминесценции - волновое число, см"1. Сравнивали площади расчетного суммарного спектра и экспериментально полученного; отклонение площади расчетного спектра от экспериментального оценивали величиной d, определяемой по следующей формуле:

J^JvJ. 100о/

и экс

где S3KC - площадь экспериментального спектра; Spac4 - площадь расчетного спектра, т.е. сумма площадей, выделенных компонентов. Величина d для всех спектров не превышала 0,2 %.

В третьей главе «Изучение заселенности высших электронно-возбужденных состояний эмиттера

биолюминесценции кишечнополостных» экспериментально подтверждена заселенность ВЭВС эмиттера в Са2+-регулируемой биолюминесцентной реакции кишечнополостных.

Эмиттеры биолюминесценции всех видов представляют

собой гетероциклические молекулы, характеризующиеся высоким выходом флуоресценции [5]; уровни энергии их пл*-состояний не являются низшими [6]. Существует вероятность участия в биолюминесцентном процессе указанных пл*-состояний, формирующихся электронными подсистемами карбонильных групп молекулы, т.к. именно карбонильные группы образуются в реакциях окисления органических субстратов.

Для доказательства заселенности ВЭВС эмиттера биолюминесценции кишечнополостных в качестве акцепторов энергии использовали ряд экзогенных флуоресцентных соединений. При этом соблюдались два основных условия: (1) энергия флуоресцентного состояния акцептора (лл*-типа) была больше, чем энергия флуоресцентного состояния биолюминесцентного эмиттера (рис. 1); (2) спектр биолюминесценции не перекрывался со спектром поглощения акцептора. В этом случае исключается заселение флуоресцентного состояния акцептора за счет индуктивно-резонансного переноса энергии с флуоресцентного состояния биолюминесцентного эмиттера или за счет тривиальной абсорбции излучения. Таким образом, флуоресцентное состояние акцептора может заселяться только в результате межмолекулярного переноса энергии с ВЭВС эмиттера биолюминесценции (рис. 1). Сенсибилизированная флуоресценция акцептора, полученная в ходе биолюминесцентной реакции, является свидетельством заселенности ВЭВС эмиттера биолюминесценции.

Химическая <5

реакция ^ тпп» ..гмс*-

Био люм1 шесцентный эмиттер

я,

/IV]

Экзогенное соединение

Рис. 1. Диаграммы

Яблонского для

биолюминесцентного

эмиттера и

экзогенного

флуоресцентного

соединения.

Для подбора оптимальной системы «фотопротеин-акцептор» были проанализированы спектры биолюминесценции пяти фотопротеинов (акворина, обелина дикого типа и его мутантов Б88У, У138Р и 1144Н) и спектры поглощения (возбуждения) ряда

флуоресцентных молекул. Показано, что описанным выше условиям удовлетворяет биолюминесценция обелина дикого типа и его мутанта Б88У в присутствии следующих флуоресцентных молекул: пирена, нафталина, 2-метоксинафталина, п-терфенила и 1,4-дифенилбутадиена.

На рис. 2 представлено относительное расположение уровней энергии электронно-возбужденных состояний

биолюминесцентного эмиттера и выбранных флуоресцентных соединений. В результате изучения спектров биолюминесценции обелина и обелина Б88У в присутствии данных соединений была обнаружена сенсибилизированная флуоресценция пирена, нафталина и 2-метоксинафталина. В качестве примера, на рис. 3 приведены спектры биолюминесценции обелина Б88У в присутствии (3) и отсутствии (4) пирена. Разностный спектр (5), полученный вычитанием спектра 4 из спектра 3, совпадает по положению и форме со спектром флуоресценцией пирена при фотовозбуждении (2).

Е, см":

30000

20000

32500

31000

31700

^30

^26700

Ну1

30900

Иуз

Ну4

Иу5

_>к_±_^

Эмиттер 1 2 3 4 5

Рис. 2. Энергии электронно-возбужденных состояний биолюминесцентного эмиттера и экзогенных флуоресцентных соединений: 1 - пирен, 2 - 2-метоксинафталин, 3 - нафталин, 4 - п-терфенил, 5 - 1,4-дифенилбутадиен. Флуоресцентные состояния обозначены сплошными линиями; ВЭВС эмиттера биолюминесценции - пунктиром.

I 1

5 0,8

1 °'6

I 0,4

e 0,2 о

300 350 400 450 500 550

Длина волны, нм

Рис. 3. Спектры люминесценции: (1) возбуждения пирена (Лисп = 400 нм), С = 3-10"6 М; (2) испускания пирена (Хвозб = 315 нм), С = 3-Ю"6 М; (3) биолюминесценции обелина F88Y в присутствии пирена, С = 10"бМ; (4) биолюминесценции обелина F88Y, [F88Y] = 10"5 М; (5) сенсибилизированной флуоресценции пирена, усредненной по 20 экспериментам (увеличен в 10 раз).

В ходе биолюминесцентной реакции обелина дикого типа и его мутанта F88Y не найдена сенсибилизированная флуоресценция п-терфенила и 1,4-дифенилбутадиена.

Таким образом, наличие сенсибилизированной флуоресценции соединений 1-3 (рис. 2) и ее отсутствие для соединений 4-5 доказывает заселенность ВЭВС биолюминесцентного эмиттера кишечнополостных и позволяет локализовать их энергию около 31 000 см"1.

На рис. 4 приведена кристаллическая структура обелина. Из этого рисунка видно, что молекула хромофора находится в центре белковой глобулы на расстоянии приблизительно 25 X от поверхности. В этих условиях индуктивно-резонансный (Ферстеровский) синглет-синглетный перенос энергии с эмиттера на молекулу акцептора является более вероятным, по сравнению с обменно-резонансным, благодаря его большему эффективному радиусу переноса - порядка 30-50 X. Этот факт дает основание предполагать, что ВЭВС биолюминесцентного эмиттера кишечнополостных имеют синглетную природу.

Предложены химические преобразования, связанные с формированием высших электронно-возбужденных состояний пл*-

типа в Са2+ -регулируемой биолюминесцентной реакции кишечнополостных. На рис. 5 изображен гетеролитический разрыв пероксидной связи (структура I). При этом образуется возбужденная карбонильная группа в синглетном пл*-состоянии, характеристика которого - частичное смещение электронной плотности с несвязывающей п-орбитали атома кислорода на л*-орбиталь ароматической молекулы (п—>тг* переход [6]). Образованию и стабилизации этого состояния должно благоприятствовать электронно-донорное окружение карбонила кетоимидной группы в активном центре фотопротеина. Таким образом образуется пя*-состояние, локализованное на карбонильной группе в положении 2, входящей в кетоимидную группу (структура II). Последующая внутримолекулярная деградация энергии распространяет возбуждение по всей молекуле (структура III), формируя ял*-возбуждение. Процесс завершается испусканием кванта света (ял*-флуоресценция). Схожий механизм локализации первичного возбуждения на кетоимидной группе ранее предлагался для эмиттера бактериальной биолюминесценции

[4].

Участие ВЭВС, вероятно, является общим свойством биолюминесцентных реакций различных светящихся организмов.

Рис. 4. Структура обелина (РОВ 18Ь9).

Целентеразин

(выделен

черным

цветом)

находится в

центре

белковой

глобулы.

О'

: С —^-С-R ,

I _

м N—-W,

- СО,

R 3 N

(I)

,N NH" Щ . "hv

(IV)

,NH-w2

Н,

'64

(II)

N W,

'64

Рис. 5. Стадии формирования возбуждения в Са2+-регулируемой биолюминесцентной реащии и образование высоковозбужденного состояния пл*-типа. Структуры: (I) - 2-пероксицелентеразин, (II) - шг*-состояние целентерамида в качестве высоковозбужденного предшественника эмиттера, (III) -лл*-состояние целентерамида, (IV) - целентерамид в основном состоянии. Аминокислота гистидин (Нв4) и молекула воды (V/) в активном центре обелина приведены в соответствии с [7].

Компоненты спектров био- и фотолюминесценции фотопротеинов. Спектры биолюминесценции фотопротеинов и фотолюминесценции разряженных фотопротеинов представляют собой суперпозицию нескольких спектров, каждый из которых можно соотнести с излучателем определенной структуры. На рис. 6 и 7 приведены спектры фотолюминесценции (испускания и возбуждения) разряженных обелина и акворина.

Разделение спектров фотолюминесценции на компоненты показало, что испускание обелина является суперпозицией спектров четырех излучателей (I, II, III, V, рис. 6), а акворина -двух (IV, V, рис. 7). В то же время, спектр возбуждения обелина

представлен тремя компонентами (VI, VII, VIII, рис. 6), а акворина -одним (VIII, рис. 7).

Положения максимумов выделенных компонентов, а также их вклады в экспериментальные спектры фотолюминесценции приведены в таблице 1. Из таблицы видно, что максимумы соответствующих компонентов близки, но вклады их различны.

Спектр возбуждения Спектр испускания

Длина волны, нм

Рис. 6. Спектры фотолюминесценции разряженного обелина и их составляющие, [Са2+] = 3-10'6М, [Об] = 5-10~7М.

Спектр возбуждения Асп = 460 нм

Спектр испускания ^возб = 325 нм

300

350

400

600

650 700

450 500 550 Длина волны, нм

Рис 7. Спектры фото-люминесценции разряженного акворина и их составляющие, [Са2+] = 3-Ю"6 М, [Ак] = 5-10~7М.

Результаты разделения спектров биолюминесценции обелина и акворина представлены на рис. 8 и 9. Из этих рисунков видно, что в случае акворина спектр представлен тремя компонентами, а обелина - четырьмя. В таблице 1 приведены положения максимумов компонентов и экспериментального спектра биолюминесценции, а также вклады компонентов в суммарный

спектр. Из таблицы видно, что максимумы соответствующих компонентов близки для спектров био- и фотолюминесценции. Определяющий вклад в спектры биолюминесценции обелина и акворина имеет компонент IV; компонент V отсутствует в спектре биолюминесценции акворина.

Таблица 1.

Спектральные характеристики компонентов био- и фотолюминесценции фотопротеинов: Х,Пах (нм) - положение

максимума, \у - вклад компонента в экспериментальный спектр.

№ компонента Фотолюминесценция Биолюминесценция

Обелин Акворин Обелин Акворин

^max/W ^таах / W ^max/w Атоах/W

I 572/0,14 —

II 550 / 0,03 - 555 0,13 560 / 0,05

III 510/0,79 — 510/0,14 518/0,08

IV - 472 / 0,77 470 / 0,65 470 / 0,87

V 423 / 0,04 406 / 0,23 400 / 0,08 -

Эксперимент 510/1 474/1 480/1 475/1

VI 365/0,07 —

VII 350 / 0,4 -

VIII 335/0,53 335/1

Эксперимент 345/1 335 /1

Проведено соотнесение компонентов ¡-V спектров биолюминесценции и фотолюминесценции фотопротеинов различным формам целентерамида, которые были описаны в работе [8]. Компонент V приписан излучению протонированной формы целентерамида. Компоненты 1-^ вероятно соответствуют формам целентерамида, образующимся в результате переноса протона от 5-(р-гидрокси)фенил группы молекулы целентерамида к протонно-акцепторным группам аминокислотных остатков в активном центре фотопротеина (рис. 10). Таким образом, предполагается существование четырех депротонированных флуоресцентных эмиттеров, которые, различаются своей кислотностью, т.е. эффективным положением протона между фенольной группой целентерамида и акцептором протона.

Используя значения максимумов спектральных компонентов биолюминесценции и фотолюминесценции обелина,

мы рассчитали изменения констант кислотности 5-(п-гидрокси)фенильной группы целентерамида в возбужденном состоянии {ЛрК, таблица 2) для форм I, II, II, IV относительно протонированной формы V:

АрК*= {hc(vAH — vA-)}/kBT},

где h - постоянная Планка; с - скорость света; vA!i - волновое число спектрального максимума протонированной формы целентерамида (компонент V), vA- - волновое число спектрального максимума депротонированных форм целентерамида (компоненты I, II, III или IV); кв- константа Больцмана; Г - температура, К.

Данные, представленные в таблице 2, демонстрируют увеличение кислотности целентерамида в возбужденном состоянии в ряду компонентов V - IV - III - II - I в спектрах биолюминесценции и фотолюминесценции обелина.

1 Т

300 350

400

Рис. 8.

450 500 550 600 650 700 Длина волны, нм

Спектр биолюминесценции обелина (Бл) и его

составляющие, Сса2+ = 10"6 М, [Об] = 10~6М.

Длина волны, нм

Рис. 9. Спектр биолюминесценции акворина (Бл) и его составляющие, Сса2+ = 10"6 М, [Ак] = 10"6М.

Таблица 2

Значения АрК молекулы целентерамида для спектральных компонентов I—IV в спектрах биолюминесценции обелина и фотолюминесценции разряженного обелина.

№ компонента IV III II I

* АрК биолюминесценция 18,2 26,4 34,2 -

фотолюминесценция - 19,7 26,7 30,2

Спектр испускания разряженного акворина имеет перекрытие со спектром поглощения (возбуждения) (рис. 7). В случае обелина перекрытие отсутствует, наблюдается большой Стоксов сдвиг - порядка 165 нм (рис. 6). При этом вклад протонированной формы (компонент V) в спектр испускания обелина (рис. 6) почти в 8 раз меньше, чем в спектр испускания акворина (рис. 7). Вероятно, в случае разряженного обелина можно говорить о наиболее эффективном переносе протона в возбужденном состоянии по сравнению с разряженным акворином.

На основе данных о кристаллических структурах разряженного обелина и акворина проанализированы различия во вкладах выделенных компонентов в спектрах испускания (рис. 10).

А Б

Рис. 10. Фенольный фрагмент целентерамида (CL) и его аминокислотное окружение в (А) акворине (PDB 1UHK) и (Б) обелине (PDB 2F8P). Красным цветом выделены протонно-донорные группы, синим - протонно-акцепторные группы аминокислотных остатков. Расстояния указаны в ангстремах. His -гистидин; Тгр - триптофан; Туг - тирозин; Phe - фенилаланин.

На рис. 10 приведен фенольный фрагмент целентерамида и его аминокислотное окружение в акворине и обелине с указанием расстояний (в ангстреммах) между группами, вовлеченными в протонные донорно-акцепторные взаимодействия. Из рисунков видно, что аминокислота гистидин (Же 16 в акворине и Н1з22 в обелине) может являться акцептором протона от фенольной группы целентеразина, в то время как триптофан - донором протона. Гидроксильная группа тирозина при этом может быть донором протона в акворине. Вероятно, большой вклад протонированной формы (компонент V) в спектр испускания разряженного акворина связан с присутствием дополнительного (по сравнению с обелином) протона, донором которого является тирозин (рис. 10 А, Туг82).

Зависимость спектров био- и фотолюминесценции обелина от концентрации кальция. Изучение спектров биолюминесценции обелина при различных концентрациях ионов кальция в ферментативной системе ([Са2+] = 4-Ю"7 - 5-10"3 М) показало, что спектральные характеристики биолюминесценции обелина не зависят от [Са2+].

Анализ спектров фотолюминесценции (испускания и возбуждения) разряженного обелина при различных концентрациях ионов кальция ([Са2+] = 0 + 5-Ю"3 М) показал, что спектральные характеристики фотолюминесценции обелина зависят от [Са2+]. На рис. 11 приведены спектры фотолюминесценции разряженного обелина, полученного термоинактивацией ([Са2+] = 0) и путем добавления к раствору обелина избытка СаС12.

я я и Я о и К К

¡0.5

ч о н о

Спектры возбуждения н ЛЬ ^исп = 470 нм

320

Спектры испускания Хвоз6 = 340нм

370

420 470 520 Длина волны, нм

570

620

Рис. 11. Спектры фотолюминесценции разряженного обелина

(1) в отсутствии и (2) присутствии ионов кальция, [Са2+] = 10"4 М,

[Об] = 510"7М.

Присутствие Салт вызывает сдвиг максимума спектра возбуждения в коротковолновую (на 4 нм), а максимума спектра испускания в длинноволновую (на 13 нм) область. При этом наблюдается уменьшение интенсивности коротковолнового плеча в спектре испускания.

Были проанализированы интенсивность и спектральный состав фотолюминесценции обелина, разряженного при различных [Са2+]. Зависимость интенсивности люминесценции от [Са2+] в спектрах испускания приведена на рис. 12, в спектрах возбуждения -на рис. 13.

Рис. 12. Зависимость интенсивности фотолюминесценци и разряженного обелина в спектрах испускания от [Са2+] (при Ящах = 510 нм), ^возб = 340 нм, [Об] = 5-10"7М.

Рис. 13. Зависимость интенсивности фотолюминесценции разряженного обелина в спектрах возбуждения от [Са2+] (при Х,тх = 345 нм), ^исп = 510 нм, [Об] = 5-10"7М.

Из рис. 12 и 13 видно, что в двойных логарифмических координатах зависимости имеют линейные участки в интервале концентраций 2-10"7-1,5-10"6 М. Коэффициенты корреляции линейной аппроксимации для спектров испускания и возбуждения

равны 0,984 и 0,996 соответственно. Приведенные данные указывают на принципиальную возможность использования фотолюминесценции разряженного обелина, наряду с биолюминесценцией [9], для количественного определения ионов кальция.

Спектры фотолюминесценции (возбуждения и испускания) разряженного обелина, полученные при различных [Са2+], были разложены на компоненты. Установлено, что положения максимумов соответствующих компонентов в спектрах фотолюминесценции близки, не зависят от [Са2+] и соответствуют приведенным в таблице 1. В то же время, вклады компонентов изменяются с ростом [Са2+].

На рис. 14 представлены вклады компонентов в спектры испускания обелина, разряженного при различных [Са2+]. В прямоугольнике приведены данные для спектра испускания разряженного обелина, полученного термоинактивацией ([Са2+] = 0). Из рисунка видно, что изменение вкладов компонентов происходит скачкообразно при [Са2+] ~ 5-10"7 М. При этом с увеличением [Са2+]:

• вклад компонента V уменьшается;

• вклад компонента III увеличивается;

• исчезает компоненты IV, но появляется компонент I.

На рис. 15 представлены вклады компонентов в спектры возбуждения обелина, разряженного при различных [Са2+]. Из рисунка видно, что с увеличением [Са2+] вклады компонентов VI и VII уменьшаются, а вклад компонента VIII увеличивается.

Зависимость спектров фотолюминесценции разряженного обелина от [Са2+], вероятно, связана с заполнением Са2+-связывающих сайтов. Известно, что фотопротеины содержат три Са2+-связывающих сайта [1], вероятно, последовательное их заполнение приводит к изменению конформации белка, т.е. изменению расстояний между атомами в активном центре. В то же время, структура активного центра фотопротеина влияет на эффективность переноса протона и вероятность образования того или иного эмиттера, что, в конечном счете, определяет спектры возбуждения и испускания. Из рис. 14 и 15 следует, что конформационный переход осуществляется при концентрациях кальция около 5-10"7М. При [Са2+] > 10"6М наблюдается насыщение системы кальцием, и дальнейшее его увеличение в растворе не изменяет вклад компонентов в общий спектр.

Таким образом, показано, что спектр биолюминесценции

обелина не зависит от [Са2+] в системе, в то время как спектры фотолюминесценции разряженного обелина (испускания и возбуждения) зависят. Это может указывает на то, что излучение света при биолюминесценции происходит при одной жесткой конформации белка, а фотолюминесценция разряженного обелина осуществляться, как минимум, при двух конформациях белка.

Рис. 14. Вклады компонентов в спектры испускания обелина, разряженного при различных [Са2+]. В прямоугольнике приведены данные для спектра испускания обелина, разряженного термоинактивацией, [Са2+] = 0. [Об] = 5-10"7 М.

Рис. 15. Вклады компонентов в спектры возбуждения обелина, разряженного при различных [Са2+]. В прямоугольнике приведены данные для спектра возбуждения обелина, разряженного термоинактивацией, [Са2+] = 0. [Об] = 5-10"7 М.

Зависимость спектров фотолюминесценции

разряженного обелина от длины волны возбуждения и испускания. Исследованы спектры возбуждения и испускания разряженного обелина при варьировании длин волн испускания и возбуждения соответственно. Спектры возбуждения регистрировали при длинах волн испускания 400-520 нм с шагом 10 нм. Спектры испускания регистрировали при длинах волн возбуждения 260-420 нм с шагом 10 нм. Полученные спектры были разложены на компоненты.

Установлено, что спектры испускания разряженного обелина являются суперпозицией четырех излучателей при всех длинах волн возбуждения. Спектры возбуждения разряженного обелина являются суперпозицией спектров трех излучателей при длинах волн испускания 450-480 нм (компоненты VI, VII, VIII, рис. 6), и четырех - при 490-510 нм. Положения максимумов соответствующих компонентов при варьировании длин волн возбуждения и испускания были близки значениям, приведенным в таблице 1. При этом вклады компонентов в значительной степени зависели от длины волны.

Зависимость спектров фотолюминесценции от длины волны возбуждения/испускания связана с их многокомпонентностью: меняя длину волны возбуждения/испускания, мы увеличиваем вклад того или иного излучателя в общий спектр. Эта зависимость, а также зависимость интенсивности фотолюминесценции от [Са2+] закладывают основу для соотнесения компонентов спектра возбуждения с компонентами спектра испускания и анализа процессов перенос протона в возбужденном состоянии.

ВЫВОДЫ:

1 На примере обелина дикого типа и его мутанта Б88У экспериментально подтверждено заселение высших электронно-возбужденных состояний в Са2+-регулируемой биолюминесцентной реакции кишечнополостных. Энергия высших электронно-возбужденных состояний локализована около 31000 см"1.

2 Предложен молекулярный механизм формирования первичного возбуждения в Са2+-регулируемой биолюминесцентной реакции, который включает стадию локализации возбуждения на кетоимидной группе целентерамида. Данная стадия предлагается в качестве общей для биолюминесцентных реакций бактерий и кишечнополостных.

3 Определены количество, вклады и спектральные характеристики компонентов в спектрах биолюминесценции обелина и акворина, а также спектрах фотолюминесценции разряженных обелина и акворина.

4 Проведено соотнесение выделенных компонентов спектров биолюминесценции и фотолюминесценции обелина и акворина различным эмиттерам - протонированной и депротонированным формам целентерамида; проиллюстрирована связь между эффективностью переноса протона в возбужденном состоянии целентерамида и аминокислотным окружением в активном центре фотопротеина.

5 Обнаружен линейный участок зависимости интенсивности фотолюминесценции разряженного обелина от концентрации ионов кальция в двойных логарифмических координатах в интервале концентраций 2-Ю"7- 1,5-10"6 М.

6 На основе анализа вкладов компонентов в спектры испускания и возбуждения обелина, разряженного при различных концентрациях ионов кальция, установлено наличие конформационного перехода в обелине при [Са2+] ~ 5-10"7 М.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи:

1. Белогурова Н.В., Кудряшева Н.С., Сизых А.Г. Спектральный и кинетический анализ биолюминесцентной реакции обелина // Вестник КрасГУ. Физико-математические науки, Красноярск, 2005, Т.4, С.99-104.

2. Belogurova N.V., Kudryasheva N.S., Alieva R.R., Sizykh A.G. Spectral components of bioluminescence of aequorin and obelin // J.Photochem. Photobiol.B, 2008, V.92, P.l 17-122.

3. Belogurova N.V., Alieva R.R., Kudryasheva N.S. Activity of upper electron-excited states in bioluminescence of coelenterates // J.Mol.Struct., 2009, V.924-926, P. 148-152.

4. Belogurova N.V., Kudryasheva N.S. Discharged photoprotein obelin: fluorescence peculiarities // J.Photochem. Photobiol.B, 2010, V.101, P.103-108.

Тезисы конференций:

5. H.C. Кудряшева, Е.В. Немцева, Т.Н. Кириллова, Н.В. Белогурова. Формирование электронно-возбужденных состояний в биолюминесценции // Тезисы докладов 111-го Съезда биофизиков России, Воронеж, 2004, Т.2, С. 429.

6. N.S. Kudryasheva, E.V. Nemtseva, T.N. Kirillova, N.V. Belogurova. Electron-excited states and energy transfer processes in bioluminescent reactions of luminous organisms // Abstracts of the 13 th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence, J. Luminescence, Japan, 2004, V.19. №3. P.156-157.

7. N. Belogurova, N. Kudryasheva, R. Alieva, A. Sizykh. Spectral components of bioluminescence of aequorin and obelin // Abstract of the 12th European conference on the spectroscopy of biological molecules, Bobingy, France, 2007. P. 144.

8. N.S. Kudryasheva, N.V. Belogurova. Energy conversion in bioluminescent reaction // Abstract of the International conference molecular and nano scale systems for energy conversion "MEC-2007", Moscow, Russia, 2007, P. 106.

9. N.V. Belogurova. N.S. Kudryasheva, R.R. Alieva and A.G. Sizykh. Upper Electron-Excited States in Coelenterate Bioluminescence // Abstract of the XXIX European Congress on Molecular Spectroscopy, Opatija, Croatia, 2008, P. 119.

10. Н.В. Белогурова, H.C. Кудряшева, P.P. Алиева.

Экспериментальная проверка гипотезы об активности высших электронно-возбужденных состояний в биолюминесценции кишечнополостных // Тезисы Международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе», V Съезд Российского фотобиологического общества, Пущино, Россия, 2008-С. 199.

11. N.V. Belogurova, R.R. Alieva, N.S. Kudryasheva. Spectroscopic calibration of calcium nano-indicator: photoprotein obelin // Abstract of Conference "Nanolsrael 2009", Israel, 2009.

12. N.S. Kudryasheva, N.V. Belogurova. Spectral components in coelenterate bioluminescence and in photoluminescence of Ca2+-discharged photoproteins // Abstract of the XIII European conference on the spectroscopy of biological molecules, Palermo, Italy, 2009, P. pa72.

13. N.V. Belogurova, R.R. Alieva, N.S. Kudryasheva. Activity of upper electron-excited states in coelenterate bioluminescence // Abstract of the XIII European conference on the spectroscopy of biological molecules, Palermo, Italy, 2009 P. 76.

14. N.S. Kudryasheva, N.V. Belogurova. Spectral components in coelenterate bioluminescence and in photoluminescence of Ca2+-discharged photoproteins // Abstract of the X International conference on molecular spectroscopy, Krakow, Poland, 2009, P. 29.

15. N.V. Belogurova, N.S. Kudryasheva. Fluorescence characteristics of discharged photoprotein obelin // Abstract of the 16th International symposium on bioluminescence and chemiluminescence, Lyon, France, 2010, P. 135.

Цитируемая литература

1. Liu, Z.J. Structure of the Ca2+- regulated photoprotein obelin at 1.7 A resolution determined directly from its sulfur substructure / Z.J. Liu, E.S. Vysotski, C.J. Chen, J.P. Rose, J. Lee, B.C. Wang // J. Protein Science, 2000. - V. 9, N 11. - P. 2085-2093.

2. Высоцкий, E.C. Кальций-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных / E.C. Высоцкий, С.В. Маркова, Л.А. Франк // Журн. молекулярной биологии, 2006. - Т.40, № 3. - С. 404-417.

3. Кудряшева Н.С. Электронновозбужденные состояния при биолюминесценции / Н.С. Кудряшева, П.И. Белобров, В.А. Кратасюк, Д.Н. Шигорин // Докл.АН СССР, 1991. - Т. 321, № 4. - С. 837-841.

4. Немцева Е.В. Механизм электронного возбуждения в биолюминесцентной реакции бактерий / Е.В. Немцева, Н.С. Кудряшева // Журн. Успехи химии, 2007. - Т. 76, № 1. - С. 101112.

5. Wilson Т. Bioluminescence / Т. Wilson, J.W. Hastings // Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 1998. - V. 14. - P. 197 - 230.

6. Шигорин Д.Н. Электронно-возбужденные состояния многоатомных молекул / Д.Н. Шигорин, Г.А. Валькова, Е.А. Гастилович // М.: Наука, 1993. - 495с.

7. Liu Z. J. Crystal structure of obelin after Ca2+-triggered bioluminescence suggests neutral coelenteramide as the primary excited state / Z. J. Liu, G.A. Stepanyuk, E.S. Vysotski, J. Lee, S.V. Markova, N.P. Malikova, B.C. Wang // PNAS, 2006. - V. 103 N 8. -P. 2570-2575.

8. Shimomura O. Light-emitters involved in the luminescence of coelenterazine / O. Shimomura, K. Teranishi // J. Luminescence, 2000.-V. 15.-P. 51-58.

9. Illarionov B.A. Recombinant obelin: cloning and expression of cDNA, purification, and characterization as a calcium indicator / B.A. Illarionov, L.A. Frank, V.A. Illarionova, V.S. Bondar, E.S. Vysotski, J.R. Blinks // J. Methods in enzymology, 2000. - V. 305. -P. 223-249.

Подписано в печать 17.08.2010 Формат 60x84/16. Уч.-изд. л. 1,3 Тираж 70 экз. Заказ № 2014

Отпечатано в типографии БИК СФУ 660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 82а

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Белогурова, Надежда Валентиновна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биолюминесценция: природа и свойства.

1.2. Механизм биолюминесцентной реакции и структура фотопротеинов.

1.3. Флуоресцентные формы целентерамида.

1.4. Применение фотопротеинов.

1.5. В озможность заселения высших электронно-возбужденных состояний эмиттера в ходе биолюминесцентного процесса.

1.6. Механизмы переноса энергии электронного возбуждения в люминесцентных системах. Природа донора и акцептора.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Спектрально-люминесцентный анализ Ca2+-регулируемых биолюминесцентных реакций фотопротеинов"

Актуальность проблемы. Са2+-регулируемые биолюминесцентные реакции, катализируемые фотопротеинами, ответственны за свечение морских кишечнополостных. В настоящее время, наиболее изученными фотопротеинами являются акворин и обелин, выделенные соответственно из медузы Aequorea victoria и гидроидного полипа Obelia longissima. Фотопротеин представляет собой стабильный фермент-субстратный комплекс, состоящий из апопротеина - односубъединичного полипептида (-22 кДа) и «преактивированного» кислородом субстрата, 2-гидропероксицелентеразина, прочно, но нековалентно связанного с белком внутри гидрофобной полости [1]. При связывании ионов кальция происходит реакция внутримолекулярного окислительного декарбоксилирования, продуктами которой являются С02 и целентерамид в возбужденном состоянии, релаксация которого сопровождается излучением кванта видимого света. Продукт биолюминесцентной реакции - комплекс апопротеина с целентерамидом - принято называть разряженным фотопротеином. Разряженные фотопротеины, в отличие от фотопротеинов, являются флуоресцентными белками и характеризуются эффективной сине-зеленой флуоресценцией.

Интенсивность исследования фотопротеинов в настоящее время связана с перспективностью их использования в современных биологических технологиях. Благодаря способности люминесцировать в присутствии ионов кальция, фотопротеины успешно используют для мониторинга л внутриклеточного кальция и визуализации внутриклеточных процессов [2]. С помощью фотопротеиновых меток возможно решение ряда задач высокочувствительной и экспрессной аналитики — от диагностики заболеваний до анализа генетически модифицированных продуктов и единичных нуклеотидных замен.

Вместе с тем, проводимые исследования относятся в основном к области биологических наук; фотофизические подходы не достаточно активно привлекались для исследования фотопротеинов. В связи с этим представляет интерес заселенность и природа электронно-возбужденных состояний эмиттера биолюминесценции кишечнополостных.

Наименее изученной стадией всех биолюминесцентных процессов является стадия, предшествующая образованию флуоресцентных состояний эмиттера. В работе [3] была теоретически обоснована гипотеза о возможности заселения высших электронно-возбужденных состояний биолюминесцентного эмиттера. Заселенность высших электронно-возбужденных состояний эмиттера экспериментально подтверждена для бактериальной биолюминесценции [4]. Было высказано предположение об универсальности этой гипотезы для биолюминесцентных реакций всех организмов. Поэтому представляет интерес тестирование заселенности высших электронно-возбужденных эмиттера состояний в биолюминесцентных реакциях кишечнополостных.

Цель исследования состояла в изучении заселенности электронно-возбужденных состояний эмиттеров биолюминесценции фотопротеинов и фотолюминесценции разряженных фотопротеинов.

В работе поставлены следующие задачи.

Научная новизна. Впервые, на примере биолюминесценции обелина дикого типа и его мутанта F88Y, экспериментально доказана возможность заселения высших электронно-возбужденных состояний эмиттера в регулируемой биолюминесцентной реакции кишечнополостных. Установлена энергия высших электронно-возбужденных состояний эмиттера биолюминесценции фотопротеинов - около 31000 см"1.

Зарегистрирован конформационный переход в разряженном обелине при концентрации ионов кальция около 5-10"7 М.

Практическая значимость. Полученные закономерности формирования сложных спектров биолюминесценции и фотолюминесценции фотопротеинов являются теоретической основой для разработки новых методов варьирования их спектральных характеристик. Анализ изменений вкладов компонентов фотолюминесценции позволяет судить об изменениях, происходящих в активном центре фермента. Показана принципиальная возможность использования интенсивности фотолюминесценции разряженного обелина для определения концентрации ионов кальция.

Апробация работы. Основные положения работы представлены на III Съезде биофизиков России (Воронеж, Россия, 2004), XII Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Бобигни, Франция, 2007), Международной конференции «Конверсия энергии в молекулярных и наносистемах» (Москва. Россия, 2007), XXIX Европейском конгрессе по молекулярной спектроскопии (Опатия, Хорватия, 2008), V Съезде

Российского фотобиологического общества «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2008), Конференции и выставке по нанотехнологиям «НаноИзраиль 2009» (Иерусалим, Израиль, 2009), XIII Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Палермо, Италия, 2009), X Международной конференции по молекулярной спектроскопии (Краков, Польша, 2009), XVI Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (Лион, Франция, 2010).

Работа выполнена при финансовой поддержке следующих грантов: Министерства Образования РФ REC-002 KR-006; ФСП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» по теме: «Биолюминесцентный анализ: биосенсоры и биокаталитические технологии»; РФФИ № 07-04-01248-а; Сибирского Федерального Университета для поддержки научных исследований студентов, аспирантов и молодых ученых: «Спектральная идентификация эмиттеров биолюминесцентной реакции Са -регулируемых фотопротеинов», 2007; «Ведущие научные школы» № 1211.2008.4, Программы РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Работа была удостоена государственной премии Красноярского края в 2009 году.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, 11 тезисов и материалов конференций. Принято решение о выдачи патента Российской Федерации, заявка per. № 2009130133/13 от 05.08.2009 «Флуоресцентный способ определения концентрации кальция».

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 132 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы. Работа, проиллюстрирована 40 рисунками и содержит 13 таблиц. Библиография включает 114 источников.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Белогурова, Надежда Валентиновна

ВЫВОДЫ:

1 На примере обелина дикого типа и его мутанта F88Y экспериментально подтверждено заселение высших электронно-возбужденных состояний в Са -регулируемой биолюминесцентной реакции кишечнополостных. Энергия высших электронно-возбужденных состояний локализована около 31000 см"1.

2 Предложен молекулярный механизм формирования первичного возбуждения в Са -регулируемой биолюминесцентной реакции, который включает стадию локализации возбуждения на кетоимидной группе целентерамида. Данная стадия предлагается в качестве общей для биолюминесцентных реакций бактерий и кишечнополостных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ГЛАВЕ 1

Интенсивность исследования фотопротеинов связана с перспективностью их использования в современных биологических технологиях. Благодаря способности люминесцировать в присутствии ионов кальция фотопротеины успешно используют для мониторинга внутриклеточного кальция вот уже более 30 лет. С помощью фотопротеиновых меток возможно решение рядя задач высокочувствительной и экспрессной аналитики - от диагностики заболеваний до анализа генетически модифицированных продуктов и единичных нуклеотидных замен.

Вместе с тем, из приведенного обзора видно, что исследования относятся в основном к области биологических наук; фотофизические подходы не достаточно активно привлекались для исследования фотопротеинов. В связи с этим представляет интерес заселенность и природа электронно-возбужденных состояний эмиттера биолюминесценции кишечнополостных.

Наименее изученной стадией всех биолюминесцентных процессов является стадия, предшествующая образованию флуоресцентных состояний эмиттера. В предыдущих исследованиях (Кудряшева и др., 1991; Немцева и Кудряшева, 2007) была теоретически обоснована гипотеза о возможности заселенния высших электронно-возбужденных состояний биолюминесцентного эмиттера. Заселенность высших электронно-возбужденных состояний эмиттера была экспериментально подтверждена для бактериальной биолюминесценции (Kudryasheva et al., 2001, Kudryasheva et al., 2002). Было высказано предположение об универсальности этой гипотезы для биолюминесцентных реакций всех организмов. Поэтому представляет интерес тестирование заселенности высших электронно-возбужденных состояний в биолюминесцентных реакциях кишечнополостных.

В данной работе были получены экспериментальные доказательства заселенности высших электронно-возбужденных состояний эмиттера в биолюминесцентном процессе кишечнополостных. В качестве акцепторов энергии возбуждения были подобраны флуоресцентные органические соединения с необходимыми спектрально-люминесцентными характеристиками и изучены спектры биолюминесценции в присутствии этих соединений.

Разложение на спектральные составляющие сложных спектров биолюминесценции фотопротеинов и фотолюминесценции разряженных фотопротеинов до сих пор не проводилось. Такое разложение позволит определить количество, вклады и спектральные характеристики компонентов данных спектров, провести идентификацию эмиттеров и установить связь между спектральным составом люминесценции фотопротеинов и эффективностью протонных взаимодействий в активном центре белка.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Реактивы.

В работе использовали следующие реактивы: рекомбинантные препараты акворина, обелина дикого типа и мутантов обелина F88Y, Y138F и I144H, полученные генно-инженерным методом в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН; синтетический целентеразин (Kleinblittersdorf), ТРИС (трис[гидроксиметил]аминометан) (Fluka); ЭДТА (Aldrich); PIPES (пиперазин-К,ЪГ-бис[2-этансульфониковая кислота], C8H18N206S2) (Fluka); EGTA (этилен-бис-оксиэтиленнитрилотетра-уксусная кислота, C14H24N2O10) (Aldrich); СаС12 ч.д.а.; КОН ч.д.а.; КС1 ч.д.а.

В качестве акцепторов энергии были использованы следующие флуоресцентные соединения: антрацен (Fluka), 1,4-бис(5-фенилоксазолил-2)бензол (РОРОР), ч.д.а. (Eastman), п-бис(о-метилстерил)бензол (МСБ) (Eastman), нафталин (Sigma), 2-метоксинафталин (Sigma), п-терфенил (Sigma), 1,4-дифенилбутадиен (Fluka). Образцы исследованных соединений растворяли в 0,02 М TrisHCl буфере, рН 7.

При измерении спектральных характеристик фотопротеинов и флуоресцентных соединений особое внимание уделялось чистоте водного растворителя, поэтому применялась деионизованнный бидистиллят.

Готовили водные и водно-этанольные растворы флуоресцентных соединений. В водно-этанольных растворах МСБ, РОРОР и антрацена концентрация этилового спирта составляла 50 об.%, концентрация флуоресцентного соединения - 5-10 М. В водных растворах пирена, нафталина, 2-метоксинафталина, 1,4-дифенилбутадиена и п-терфенила, концентрация флуоресцентного соединения зависела от растворимости данного соединения в воде.

2.2. Экспериментальные приборы и установки. 2.2.1. Прибор для регистрации спектров поглощения.

Для измерения спектров поглощения использовали двулучевой регистрирующий спектрофотометр UVIKON 943 (KONTRON Instruments, Италия). Характеристики этого прибора следующие:

Источник света: вольфрамо-галогеновая лампа (в диапазоне 290900 нм) и дейтериевая лампа (в диапазоне 190-370 нм)

Детектор: ФЭУ R 446 и R 928

Точность определения длины волны: ± 0,3 нм

Воспроизводимость длины волны: ± 0,01 нм

Фотометрическая точность: ± 0,003 при D=1

Фотометрическая воспроизводимость: ± 0,0005 при D=1 Измерения спектров поглощения проводили в ультрафиолетовой и видимой областях; использовали кварцевую кювету с квадратным сечением (10x10 мм).

2.2.2. Прибор для регистрации спектров биолюминесценции и фотолюминесценции.

Спектры флуоресценции фотопротеинов и флуоресцентных соединений были измерены с помощью спектрометра Aminco-Bowman Series 2 (Thermo Spectronic, США).

Для усиления регистрируемого сигнала биолюминесценции была использована флуориметрическая кварцевая кювета с квадратным (5x5 мм) сечением и двумя зеркальными стенками, изготовленная в Институте биофизики клетки (г. Пущино, Россия).

2.2.3. Установка для обессоливания растворов фотопротеинов.

Обессоливание растворов фотопротеинов проводили гель-фильтрацией с использованием установки, представленной на рисунке 2.1.

Рис. 2.1. Схема хроматографической установки.

Для обессоливания использовалась хроматографическая колонка D-Salt™ Dextran Desalting Column с характеристиками, представленными в таблице 2.1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Белогурова, Надежда Валентиновна, Красноярск

1. Антипина, Л.Ю. Теоретическое моделирование процесса флуоресценции и формирование излучающего субстрата белка обелина / Л.Ю. Антипина, С.Г. Овчинников // В мире научных открытий, Физико-математические науки. 2010. - Т. 5, № 11. - С 35 - 36.

2. Бабушкин, А.А. Методы спектрального анализа / А.А. Бабушкин, Л.А. Бажулин, Ф.А. Королев, Л.В. Левшин, В.К. Прокофьев, А.Р. Стриганов // М.: Изд-во Московского университета. 1962. 510 с.

3. Беляков, В.А. Электронная модель возбуждения хемилюминесценции в реакциях окисления органических соединений / В.А. Беляков, Р.Ф. Васильев, Н.М. Иванова, Б.Ф. Минаев, О.В. Осяева, Г.В. Федорова // Изв.АН СССР, Сер.Физ. 1987. - Т.51, №3. - С.540 - 547.

4. Бондарь, B.C. Получение, свойства и применение кальций-чувствительного фотопротеина из гидроида Obelia longissima / B.C. Бондарь, Е.С Высоцкий, И.А. Гамалей, А.Б. Каулин // Цитотология. 1990. - Т. 33. - С. 57 - 66.

5. Бондарь, B.C. Физико-химические свойства фотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima / B.C. Бондарь, К.П. Трофимов, Е.С. Высоцкий // Биохимия. 1992. - Т. 57. - С. 1481-1490.

6. Бурштейн, А.И. Концентрационное тушение некогерентныхвозбуждений в раствовах / А.И. Бурштейн // Успехи физических наук. — 1984.-Т.143.-С. 553-600.

7. Вавилов, С.И. Собрание сочинений / С.И. Вавилов // М.: Гостехиздат.1954. — Т. II.-C.116- 153.

8. Васильев, Р.Ф. Механизм возбуждения хемилюминесценции / Р.Ф. Васильев // Изв. АН. СССР, Сер.физ. 1982. - Т.46, №2. - С. 323 - 329.

9. Васильев, Р.Ф. Пути возбуждения хемилюминесценции в органическихсоединениях / Р.Ф. Васильев // Биохемилюминесценция. М: Наука, 1983. 1. С.31-55.

10. Высоцкий, Е.С. Выделение и очистка Са2+-зависимого фотопротеина -обелина из гидроидных полипов Obelia longissima / Е.С. Высоцкий, B.C. Бондарь, В.Н. Летунов // Биохимия. 1989. - Т. 54. - С. 965 - 973.

11. Высоцкий, Е.С. Выделение и свойства различных молекулярных форм Са -активируемого фотопротеина обелина / Е.С. Высоцкий, B.C. Бондарь, И.И. Гительзон // ДАН СССР, 1991. №321. С.214-217.

12. Высоцкий, Е.С. Кальций-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных / Е.С. Высоцкий, С.В. Маркова, Л.А. Франк // Молекулярная биология. 2006. - Т. 40, №3. - С. 404 - 417.

13. Галанин, М.Д. К вопросу о влиянии концентрации на люминесценцию растворов / М.Д. Галанин // ЖЭТФ. 1955. - Т.28, №4. - С.485 - 495.

14. Гительзон, И.И. Экологическая биофизика / И.И. Гительзон, В.А. Кратасюк, В.Н. Лопатин, А.А. Тихомиров, Л.А. Щур, B.C. Филимонов // Учебное пособие. М.: Логос. 2002. - Т.З, - 127с.

15. Гительзон И.И. Светящиеся бактерии / И.И. Гительзон, Э.К. Родичева, С.Е. Медведева // Новосибирск: Наука. 1984. - 298с.

16. Ермолаев, В. Л. Безызлучательный перенос энергии в конденсированных средах / В.Л. Ермолаев, Е.В. Бодунов, Е.В. Свешникова, Т.А. Шахвердов // Л.: Наука. 1977.

17. Журавлев, А.И. Спонтанная биохемилюминесценция животных тканей / А.И. Журавлев // Биохемилюминесценция. М.: Наука. 1983. - С. 3 - 30.

18. Илларионов, В. А. Клонирование и экспрессия кДНК кальций-активируемого фотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima / В.А. Илларионов, С.В. Маркова, B.C. Бондарь, Е.С. Высоцкий, И.И. Гительзон // Докл. Акад. наук. 1992. - Т. 326. - С.911-913.

19. Карнаухов, В.Н. Люминесцентный спектральный анализ клетки / В.Н. Карнаухов // М: Наука. 1978. - 204 с.

20. Кудряшева, Н.С. Изучение механизма биолюминесценции с помощью молекул тушителей / Н.С. Кудряшева, П.И. Белобров, В.А. Кратасюк, Д.Н. Шигорин // Красноярск: АН СССР, Сиб.отделение, Ин-т.физики им. Л.В.Киренского. 1991. - Т. 156Б. - 22 с.

21. Кудряшева, Н.С. Электронновозбужденные состояния при биолюминесценции / Н.С. Кудряшева, П.И. Белобров, В.А. Кратасюк, Д.Н. Шигорин // Докл.АН СССР. 1991. - Т.321, №4. - С.837 - 841.

22. Кудряшева, Н.С. Хемилюминесценция и биолюминесценция / Н.С. Кудряшева, В.А. Кратасюк, Е.Н. Есимбекова // Физико-химические основы биолюминесцентного анализа. Красноярск. 2000. - 154 с.

23. Лабас, Ю.А. Неразгаданная Дарвиным биолюминесценция / Ю.А. Лабас, А.В. Гордеева. // Природа. 2003. №.2 - С.25 - 31.

24. Левшин, Л.В. Практикум по спектроскопии / Л.В. Левшин // М.: Изд-во Московского университета. 1976. - 320 с.

25. Мельников, М.Я., Иванов В.Л. Экспериментальные методы химической кинетики. Фотохимия. // М.: Изд-во Московского университета. -2004.-125 с.

26. Михайленко, В.И. Разделение перекрытых ассиметричных полос / В.И. Михайленко, Ю.Р. Редкин // Ж. прикладн. спектроскопии. 1979. - Т. 31. Вып. 5. - С.919 - 921.

27. Немцева, Е.В. Механизм электронного возбуждения в биолюминесцентной реакции бактерий / Е.В. Немцева, Н.С. Кудряшева // Журн. Успехи химии. 2007. - Т. 76. - С. 101 - 112.

28. Плотников В.Г. Теоретические основы спектрально-люминесцентной систематики молекул//Успехи химии. 1980. - Т. 49, № 2. - С.327 - 361.

29. Шигорин, Д.Н. Систематика молекул по спектрально-люминесцентным свойствам и Периодический закон Менделеева / Д.Н. Шигорин // Журн.физ.химии. 1977. - Т. 51, №8. -С. 1894- 1919.

30. Шигорин, Д.Н. К систематике молекул. Закон гомологических рядов в изменении свойств молекул / Д.Н. Шигорин // Журн.физ.химии. 1980. - Т. 54, №8.-С. 1935- 1960.

31. Шигорин, Д.Н. Электронно-возбужденные состояния многоатомных молекул / Д.Н. Шигорин, Г.А. Валькова, Е.А. Гастилович // М.: Наука. 1993. - 495 с.

32. Яцимирский, К. Б. Рациональный спектрофотометрический метод определения состава и устойчивости комплексных соединений / К.Б. Яцимирский, Т.В. Мелькова // Спектроскопические методы в химии комплексных соединений М.-Л.:Химия. 1984. - С. 102 - 116.

33. Allen, D.G. Aequorin luminescence: relation of light emission to calcium concentration a calcium-independent component / D.G. Allen, J.R. Blinks, F.G. Prendergast // Science. - 1977. - V 195. - P. 996 - 998.

34. Ando, Y. Firefly bioluminescence quantum yield and colour change by pH-sensitive green emission / Y. Ando, К Niwa, N. Yamada, T. Enomoto, T. Irie, H. Kubota, Y. Ohmiya, H. Akiyama // J. Nature Photonics. 2008. - V 2. - P. 44-47.

35. Barros, M.P. Bioluminescence as a possible auxiliary oxygen detoxifying mechanism in elaterid larvae / M.P. Barros, E.J. Bechara // Free Radical in Biol. Med. 1998. - V. 24, № 5. - P. 767 - 777.

36. Blinks, J.R. Measurement of Ca"^ concentrations in living cells / J.R. Blinks, W.G. Wier, P. Hess, F.G. Prendergast // Prog. Biophys. Mol. Biol. 1982. -V.40.-P. 1-114.

37. Brini, M. Targeted recombinant aequorins: tools for monitoring Ca2+. in the various compartments of a living cell / M. Brini, P. Pinton, T. Pozzan, R. Rizzuto // Microsc. Res. Tech. 1999. - V. 46. - P. 380 - 389.

38. Campbell, A.K. Extraction, partial purification and properties of obelin, the calcium-activated luminescent protein from hydroid Obelia geniculata I A.K. Campbell // J. Biochemistry. 1974. - V. 143. - P. 4111 - 4418.

39. Campbell, A.K. Coelenterate photoproteins as indicators of cytoplasmic free Ca2+ in small cells / A.K. Campbell, R.L. Dormer, M.B. Hallet // Cell Calcium. -1985.-V 6.-P. 69-82.

40. Charbonneau, H. Amino acid sequence of the calcium-dependent photoprotein aequorin / H. Charbonneau, K.A. Walsh, K.O. McCann, F.G. Prendergast, M.J. Cormier, T.C. Vanaman // Biochemistry. 1985. - V 24. - P. 6762-6771.

41. Cormier, J. Evidence for similar biochemical requirements for bioluminescence among the coelenterates / J. Cormier, K. Hori, Y.D. Karkhanis,

42. J.M. Anderson, J.E. Wampler, J.G. Morin, J.W. Hastings // J. Cell. Physiol. -1973.-V. 81.-P. 291 -297.

43. Deng, L. Structural basis for the emission of violet bioluminescence from a W92F obelin mutant / L. Deng, E.S. Vysotski, Z.J. Lui, S.V. Markova, N.P. Malikova, J. Lee, J. Rose, B.C. Wang // J. FEBS Letters, 2001. V. 506. - P. 281 -285.

44. Dupriez, V.J. Aequorin-based functional assays for G-protein-coupled receptors, ion channels, and tyrosine kinase receptors / V.J. Dupriez, K. Maes, E.Le Poul, E. Burgeon, M. Detheux // Receptors Channels. 2002. - V. 8. - P. 319 -330.

45. El-Sayed, J. Spin-orbital coupling and radiationless process in nitrogen heterocycles / J. El-Sayed // J. Chem. Phys. 1963. - V. 12, N. 38. - P. 2834 -2838.

46. Fagan, T.F. Cloning, expression and sequence analysis of cDNA for the Ca(2+)-binding photoprotein, mitrocomin / T.F. Fagan, Y. Ohmiya, J.R. Blinks, S. Inouye, F.I. Tsuji // FEBS Lett. 1993. - V. 1. - P. 301 - 305.

47. Forster Th. Intermolecular energy migration and fluorescence / Th. Forster // An.Phys. 1948. - V. 2. - P. 55 - 75.

48. Haddok, S.H. Can coelenterates make coelenterazine? Dietary requirement for luciferin in cnidarian bioluminescence / S.H. Haddok, T.J. Rivers, B.H. Robison//Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001. - V 98. - P. 11148-11151.

49. Hastings, J.W. Bioluminescence / J.W. Hastings, T. Wilson // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1998. V. 14. - P. 197 - 230.

50. Head, J.F. The crystal structure of the photoprotein aequorin at 2.3 A resolution // J.F. Head, S. Inouye, K. Teranishi, O. Shimomura // Nature. 2000. -V. 405.-P. 372-376.

51. Heelis, P.F. The photophysical and photochemical properties of flavins (isoalloxazines) / P.F. Heelis // Chem. Soc.Rev. 1982. - V. 11. - P. 15 - 49.

52. Hirano, T. Bioluminescent properties of fluorinate semisynthetic aequorins / T. Hirano, Y. Ohmiya, S. Maki, H. Niwa, M. Ohashi // Tetrahedron Lett. -1998. -V. 39.-P. 5541 -5544.

53. Jeffrey, G.A. An introduction to hydrogen bonding / G.A. Jeffrey // New York: Oxford University Press. 1997. - 458 p.

54. Kendall, J.M. Engineering the Ca -activated photoprotein aequorin with reduced affinity for calcium / J.M. Kendall, G. Sala-Newby, V. Ghalaut, R.L.

55. Dormer, A.K. Campbell // BiocheT. Biophys. Res. Commun. 1992. - V. 187. - P. 1091 -1097.

56. Kozlova, O. A new short -term toxicity assay using Aspergillus awamori with recombinant aequorin gene / O. Kozlova, M. Zwinderman, N. Christofi // BMC Microbiol. 2005. - V.5. - P. 40.

57. Kudryasheva, N.S. Mechanisms of xenobiotics' effects on bacterial bioluminescence / N.S. Kudryasheva // Luminescence. 1999. - V. 14. - P. 199-200.

58. Kudryasheva, N.S. Upper electron-excited states in bioluminescence: experimental indication/ N.S. Kudryasheva, E.V.Nemtseva, Yu.P. Meshalkin, A.G. Sizykh // J. Luminescence. 2001. - V. 16. - P. 243 - 246.

59. Malikova, N. P. Spectral tuning of obelin bioluminescence by mutations of Trp92 / N.P. Malikova, G.A. Stepanyuk, L.A. Frank, S.V. Markova, E.S. Vysotski, J. Lee//FEBS Lett.-2003.-V. 554.-P. 184- 188.

60. Matthews, J.C. Substrate analogue binding properties of Renilla luciferase / J.C. Matthews, K. Hori, M.J. Cormier // J. Biochemistry. 1977. - V. 16. - P. 5217-5236.

61. McCapra, F. The chemiluminescence of Cypridina analogue / F. McCapra, Y.C. Chang // Chem. Commun. 1967. - P. 1011 - 1012.

62. McCapra, F. Chemical generation of excited states: The basis of chemiluminescence and bioluminescence / F. McCapra // Methods in Enzymology. -2000.-V 305.-P. 3-47.

63. Morin, J.G. Coelenterate bioluminescence / J.G. Morin; edited by L. Muscatine, H.M. Lenhoff // Coelenterate Biology: Reviews and New Perspectives. -New York: Academic press. 1974. - P. 397 - 438.

64. Ohmiya, Y. Two excited states in aequorin bioluminescence induced by tryptophan modification / Y. Ohmiya, M. Ohashi, F.I. Tsuji // FEBS Lett. 1992. -V. 301.-P. 197-201.

65. Shimomura, O. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea i O. Shimomura, F. H. Johnson, Y. Saiga // J. Cell. Сотр. Physiol. 1962. - V. 59. -P. 223-239.

66. Shimomura, О. Partial purification and properties of the Chaetopterus luminescence system / O. Shimomura, F.H. Johnson // Bioluminescence in progress. Princeton. - 1966. - P.495 - 521.

67. Shimomura, O. Calcium binding, quantum yield, and emitting molecule in aequorin bioluminescence / O. Shimomura, F.H. Johnson // Nature. 1970. - V. 227.-P. 1356- 1357.

68. Shimomura, O. Structure of the light-emitting moiety of aequorin / O. Shimomura, F.H. Johnson // Biochemistry. 1972. - V. 11. - P. 1602 - 1608.

69. Shimomura, O. Properties and reaction mechanism of the bioluminescence system of the deep-sea shrimp Oplophorus gracilorostris / O. Shimomura, T. Masugi, F.H. Johnson, Y. Haneda // J. Biochemistry. 1978. - V. 17. - P. 994 - 1001.

70. Shimomura, O. Bioluminescence in the sea: photoprotein systems / O. Shimomura // J. Symp. Soc. Exp. Biol. 1985. - V. 39. - P. 351 - 422.

71. Shimomura, O. Cause of spectral variation in the luminescence of semisynthetic aequorins / O. Shimomura // J. Biochemistry. 1995. - V. 306. - P. 537-543.

72. Shimomura, O. Light-emitters involved in the luminescence of coelenterazine / O. Shimomura, K. Teranishi // Luminescence. 2000. - V. 15. -P. 51-58.

73. Shimomura, O. Bioluminescence: Chemical Principles and Methods / O. Shimomura. Singapore: World Scientific Publishing Co., 2006. - p. 470.

74. Teranishi, K. Luminescence of imidazol,2-a.pyrazin-3(7H)-one compounds / K. Teranishi // J. Bioorganic Chemistiy. 2007. - V. 35. - P. 82 - 111.

75. Toma, S. The crystal structures of semi-synthetic aequorin / S. Toma, K.T. Chong, A. Nakagawa, K. Teranishi, S. Inouye, O. Shimomura // J. Protein Science. -2005. V. 14.-P. 409-416.

76. Tomilin, F.N. Quantum chemical study of mechanism of active photoprotein generation / F.N. Tomilin, L.U. Antipina, E.V. Eremeeva, S.G. Ovchinnikov, E.S. Vysotski // Luminescence. 2010. - V. 25. - P. 210 - 211.

77. Tsien, R.Y. New calcium indicators and buffers with high selectivity against magnesium and protons: design, synthesis, and properties of prototype structures / R.Y. Tsien // Biochemistry. 1980. - V. 19. - P. 2396 - 2404.

78. Tsuji, F.I. Molecular evolution of the Ca2+-binding photoproteins of the Hydrozoa / F.I. Tsuji, Y, Ohmiya, T.F. Fagan, H. Toh, S. Inouye // Photochem. Photobiol. 1995. - V. 62.-P. 657-661.

79. Turro, N.J. Modern molecular photochemistry / N.J. Turro // University Science Book: California. 1991. - 620 p.

80. Usami, K. Low-temperature photooxygenation of coelenterate luciferin analog synthesis and proof of 1,2-dioxetanone as luminescence intermediate / K. Usami, M. Isobe // Tetrahedron. 1996. - V. 52. - P. 12061 - 12090.

81. Vetrova E.V. N.S. Kudryasheva, К. H. Cheng. Effect of quinone on the fluorescence decay dynamics of endogenous flavin bound to bacterial luciferase // Biophysical Chemistry. 2009. - V. 141. - P. 59 - 65.04. 04

82. Villalobos, C. Mitochondrial Ca . oscillations driven by local high [Ca ] domains generated by spontaneous electric activity / C. Villalobos, L. Nunez, P. Chamero, M.T. Alonso, J. Garcia-Sancho // J. Biol. Chem. 2001. - V 276. - P. 40293 - 40297.

83. Vysotski, E.S. Violet bioluminescence and fast kinetics from W92F obelin: Structure-based proposals for the bioluminescence triggering and the identification of the emitting species / E.S. Vysotski, Z.J. Liu, S.V. Markova, J.R. Blinks, L.

84. Deng, L.A. Frank, M. Herko, N.P. Malikova, J.P. Rose, B.C. Wang, J. Lee // Biochemistry. 2003. - V. 42. - P. 6013 - 6024.

85. Vysotski, E.S. Ca2+-regulated photoproteins: structural insight into the bioluminescence mechanism / E.S. Vysotski, J. Lee // Acc. Chem. Res. 2004. -V37.-P. 405-415.

86. Ward, W.W. Extraction and purification of calcium-activated photoproteins from the ctenophores Mnemiopsis sp. and Beroe ovata / W.W. Ward, H.H. Seliger // Biochemistry. 1974. - V 13. - P. 1491 - 1499.

87. Wilson, T. Bioluminescence / T. Wilson, J.W. Hastings // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1998.-V 14.-P. 197-230.

Информация о работе

Белогурова, Надежда Валентиновна
кандидата физико-математических наук
Красноярск, 2010
ВАК 03.01.02

Диссертация

Спектрально-люминесцентный анализ Ca2+-регулируемых биолюминесцентных реакций фотопротеинов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы