Бактериальная биолюминесценция: Механизмы образования и взаимодействия с люциферазой альдегидных и флавиновых субстратов

Исмаилов, Анвар Джураевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Бактериальная биолюминесценция: Механизмы образования и взаимодействия с люциферазой альдегидных и флавиновых субстратов
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Бактериальная биолюминесценция: Механизмы образования и взаимодействия с люциферазой альдегидных и флавиновых субстратов"

Московский государственный университет

Биологический факультет

На правах рукописи

ИСМАИЛОВ Анвар Джураевич

БАКТЕРИАЛЬНАЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ : МЕХАНИЗШ ОБРАЗОВАНИЯ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ЛСЦИФЕРАЗОЙ АЛЬДЕГИДНЫХ И ФЛАВИНОВЫХ СУБСТРАТОВ.

03.00.02. - биофизика 03.00.07. - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ

официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор

Д.Н.Островский

Доктор биологических наук, профессор

А.Я.Потапенко

Доктор биологических наук, профессор

И.И.Иванов

Ведущая организация:

Институт физиологии и биохимии микроорганизмов РАН

Зашита состоится " 1995г. ___час

ни заседании Диссертационного Совета Д.053.05.53

ири Московском, государственом университете по адресу: 119699 Москва, горсбьеш горы, МГУ, Биологический факультет (ЛИК).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Ш'У

.»чопий о»к{»-;тарь. Лаос-.'ртгиношого Сои*та, диктор |"«г>жиичоских наук.

профессор

Т.Е.Кренделева

- J. -

Актуальность проблемы. Биолюминесценция - эмиссия видимого света живыми организмами - явление, присущее различным Оиологическш видам, в том числе морским бактериям родов Vibrio и Photobaoterium. Характерным отличием биолюминесценции, от хемилюминесценции является участие в процессе преобразования энергии, специфических ферментов -люцифераз, обеспечивающих крайне высокий энергетический выход реакции, в определенных случаях достигающий 10% и выше.

Бактериальные люциферазы, .независимо от источника получения, -бактериального штамма, катализируют одну и ту ке реакцию:

РМШг + RCHO + 02---> FMN + RCOOH + Н20 + hy

В качестве субстратов in vitro обычно используется восстановленный флавинмононуклеотид (fmnh2), алифатический альдегид с длиной цепи 6-18 атомов углерода и кислород.

Функционально фермент является монооксигеназой и. подобно другим монооксигеназам микробного или животного происхождения, осуществляет внедрение одного атома кислорода в молекулу гидрофобного субстрата (алифатического альдегида, rcho), гидроксилируя его до соответствующей карбоновой кислоты (RCOOH), и переход другого атома кислорода в молекулу н2о.

Отличительной особенностью монооксигеназной реакции, катализируемой лициферазой, является то, что она протекает с образованием интенсивной люминесценции в сине-зеленой области спектра ("'490 нм).

in vivo биолюминесцентная система представляет собой электронтранспортную цепь, осуществляющую перенос электронов от NAB(P)H к кислороду. Начальный участок цепи - nadh-дегидрогеиаза (had(p)н-?мм-оксидоредуктаза) осуществляет восстановление флавина:

NAD(P)H + Н* + РШ---> NAD(P+ ИШНг

Несмотря на существенный прогресс в исследовании бактериальной биолюминесценции, достигнутый в последние три десятилетия, основными нерешенными проблемами остаются: -

- биологическая функция свечения;

- локализация люминесцентной системы в клетках фотобактерий;

- структура природного альдегидного субстрата и пути его метаболизма;

- структура эмиттера, механизм миграции энергии на альтернативные

эмиттеры;

- элементарные стадии окисления вено в rcooh;

- природа "безальдегидного" свечения;

- механизм свечения.

Проблемы образования субстратов, механизм взаимодействия альдегидных и фшавиновых субстратов с люциферазой, особенности функционирования люминесцентной электронтранспортной цепи и локализации ферментной системы, непосредственно связаны с процессом преобразования энергии люциферазой и функциональной ролью люминесцентной системы в бактериальной клетке.

Особые требования к изучению процессов и факторов, контролирующих люминесцентную активность люциферазы как in vivo так и in vitro предъявляются в связи с широкомасштабным применением фотобактерий и ферментных препаратов люцифераз в качестве высокочувствительных биосенсеров на разнообразные биологически-активные соединения.

Основу представленных в данной работе экспериментов по механизмам образования и взаимодействия с люциферазой альдегидных и флавиновых субстратов составили представления о мембранной принадлежности люминесцентной системы бактерий.

Накопленный экспериментальный материал свидетельствует, что основными элементами, определяющими интенсивность свечения бактерий являются: процесс формирования длинноцепочечных алифатических альдегидов и эффективность транспорта электронов, поддерживающих пул восстановленного фпавина. Образование альдегидов связано с липидным обменом, люминесцентная электронтранспортная цепь представляет собой полиферментную систему, осуществляющую последовательный перенос электронов на кислород:

I ЛЮЩЫ -> ПРОДУКТЫ ЖВДГОГО ОБМЕНА -> СН3 (СН2 )пСНО, ( 6<п<18 )

ЛЮЦИФЕРАЗА—> СВЕТ

NAD(Р)-ЗАВИСИМЫЕ /» 0Р

II ДЕГИДРОГйНАЗЫ -> NAB(P )Н:РШ-0/РЕДУКТАЗА -> FMNH.-, й

Связь биолшинесценции с липидным обменом клетки обсувдаетея в некоторых работах (Meighen , "988 Byers «t al., 1988). По' представлению авторов, длинноцепочечные алифатические альдегида формируются как промежуточные продукты биосинтеза лапидов. "Утечка" определенной группы альдегидов на стадии образования ацилированшх интермедиатов обеспечивает люциферазу суостра-гами. Возможность формирования длинноцепочечных алифатических альдегидов другими путями практически не рассматривалась к литературе.

Высказанное в данной работе предположение о тесной связи между биолюминесцентной активностью бактериальной клетки и процессом перекисного окисления липидов (ПОЛ) основывается на ряде экспериментальных фактов. Большинство данных (Balakrishnan, Langerman, 1977; Neeman et. al., 1977; Nealson. Hae-tings, 1979) подтверждают мембранное происхождение бактериальной люциферазы. Наиболее четко это показано иммунологически с использованием меченых золотом антител (Angell et. al., 1989). По данным авторов, проводивших исследования яа двух видах бактерий vibrio fisheri и vibrio harveyi, подавляющая часть люциферазы ассоциирована с внутренней мембраной клетки и лишь в минорном количестве обнаруживается в цитоплазме.

Функционально бактериальная люцифераза является монооксигеназой, что само по себе уже предполагает прямую связь с мембранами, с другой стороны однозначно установлено, что процессы гидроксилирования, катализируемые моноксигеназами, как правило протекают совместно с процессом пероксидации.

В пользу взаимосвязи ПОЛ и свечения могут служить данные по жирнокислотному составу липидов светящихся бактерий. Характерной особенностью всех исследованных еидов светящихся бактерий является высокое содержание жирнокислотных остатков с ненасыщенными связями. Последнее обстоятельство говорит о легкой подверженности бактериальных липидов действию активированного кислорода. Кроме того, у Photobacterium leiognathy __ идентифицирована высокоактивная Cu-Zn-зависимая супероксиддисмутаза (Steffens et. al., 1983).

Результаты, полученные в последнее время (Berkoviohj 1989; Wieland et all, 1990) по биолюминесцентному анализу продуктов ПОЛ в маслах и липопротеинах низкой плотности, подтверждают гипотезу об образовании в процессе окисления в липидах соединений с параметрами субстратов люциферазы.

Ключевым аргументом в пользу взаимосвязи ПОЛ и свечения служат экспериментальные данные, показывающие, что основными конечными продуктами процесса окисления липидов являются алифатические .альдегиды, в том числе длинноцепочечные.

Предположение об участии липидов в структурно-функциональной организации люминесцентной электронтранспортной цепи выдвинуто, исходя из мембранного происхождения люциферазы и функциональной принадлежности к системам гидроксилирования гидрофобных соединений. На основании опытов с лизоцимом (Balakrishnan, Langerman, 1977) было высказано предположение, что бактериальная . люцифераза является гликолипидом. Косвенным указанием на наличие липидов в очищенных

препаратах люциферазы может служить чувствительность фермента к детергентам. Кроме того, для бактериальной люциферазы характерно присутствие в гомогенных препаратах прочно связанного гидрофобного субстрата (т.н."альдегидного фактора"), удаление которого без потери активности фермента невозможно, (Eley, Cormier, 1968; Cormier et al., 1968).

Проблема взаимодействия субстратов с люциферазой отличается особой актуальностью. В зависимости от структурных характеристик как альдегидных, так и флавиновых субстратов биолюминесцентная активность люциферазы может испытывать перепады в пределах нескольких порядков. Выяснение механизмов взаимодействия с люциферазой структурных изомеров альдегидов играет важную роль для уточнения элементарных стадий монооксигеназной реакции и установления структуры природного альдегидного субстрата. Кроме того, использование люциферазы в качестве биосенсора альдегидных феромонов требует детального анализа кинетических параметров реакции для каждого конкретного альдегидного компонента. Функциональная роль альдегидов в биолюминесцэнтном процессе в основном изучена на примере насыще.нных альдегидов. Взаимодействие ненасыщенных альдегидов исследовано в прикладном аспекте - при разработке систем анализа половых феромонов насекомых (Meigtien et al., 1982;1983; Grant et al., 1982).

Данные предпосылки составили основу экспериментов по детальному анализу эмиссионных и кинетических параметров биолюминесцентной < реакции люцифераз с использованием в качестве субстратов широкого круга алифатических альдегидов, различающихся структурными и конформационными параметрами.

В связи с важностью знания закономерностей взаимодействия альдегидных и флавиновых субстратов с ферментом в решении вопроса о числе и природе интермедиатов, энергизованных форм и эмиттеров в реакции бактериальной люциферазы представлялось необходимым проведение детального анализа кинетики распада возбужденного комплекса. В течении длительного времени затухание свечения описывалось кинетикой, соответствующей простому радиоактивному распаду. Было показано, что константа скорости затухания свечения не зависит от концентраций субстратов (FMN Hg, ROHO) И фермента (Hastings Gibson, 1963; Hastings et al., 1966). На основании этих результатов постулирован один тип эмиттера и однооборотность фермента.

Как следует из данных, представленных в литературе в последние годы, кинетика затухания биолюминесценции в реакции с высокоактивными альдегидами не подчиняется простому уравнению реакции первого порядка,

а носит сложный характер. Прежде всего это обнаружено и исследовано Матесоном и Ли (Matheson, Lee, 1983) при низких температурах. Авторами предложена схема с несколькими типами эмиттеров, способных ко взаимным превращениям.Ранее отклонения от кинетики реакции первого порядка отмечались и некоторыми другими авторами (Begvar, wu, 1981; shennon et al., 1978) при анализе кинетики в стандартных условиях, однако объяснения наблюдаемым фактам представлено не было.

В связи с вышеизложенным представлялось актуальным проведение детального анализа кинетики затухания в стандартных условиях, при температуре 22°С, с использованием в качестве субстратов алифатических альдегидов различной структуры, в широком диапазоне их концентраций.

Одной из актуальных задач современной биотехнологии является разработка научных основ использования ферментов для определения микроколичеств биологически активных веществ. Создание биолюминесцентных систем микроанализа крайне перспективно, поскольку спектр практического использования таких датчиков достаточно широк.

Выявленные особенности взаимодействия субстратов с бактериальной люциферазой, подбор специфичных для тех или иных задач микроанализа ферментных препаратов и штаммов бактерий, технологические закономерности функционирования сопряженных систем и анализ кинетики реакции, послужили основой разработки на основе бактериальной люциферазы и интактных клеток фотобактерий высокочувствительных систем биолюминесцентного микроанализа для практического применения в энтомологии, медицине, биотехнологии и охране окружающей среды.

Цели__и__задачи__исследований. В настоящей работе поставлены

следующие задачи:

- Выявить связь процессов перекисного окисления липидов с биолюминесценцией у светящихся бактерий.

- Исследовать возможность образования альдегидных субстратов бактериальной люциферазы в полиненасыщенных жирных кислотах, растительных и бактериальных липидах, при индукции перекисного окисления липидов ультрафиолетовой радиацией й ионами двухвалентного железа.

- Изучить образование длинноцепочечных алифатических альдегидов при гидролизе плазмалогенов и ферментативном окислении длинноцепочечных алифатических спиртов.

- Выяснить природу т.н. безальдегидного свечения.

- Рассмотреть возможное структурное участие фосфолипидов в формировании люминесцентной электронтранспортной цепи.

- Исследовать механизм взаимодействия предельных и непредельных

алифатических альдегидов различной химической структуры с бактериальной люциферазой.

Разработать на основе бактериальных люцифераз и клеток фотобактерий специфичные биосенсоры для микроанализа биологически активных соединений, в том числе: продуктов перекисного окисления липидов; половых фёромонов насекомых альдегидной и спиртовой природы в жидкой, газовой фазе и половых железах насекомых; ферментов плазмы крови; ксенобиотиков и токсичных агентов.

Поставленные в работе задачи объединены обидам предметом иследований. Этим предаетом являются биохимические основы функционирования биолюминесцентной системы бактерий in vivo и in • vitro, определяющие особенности трансформации энергии биологическими объектами и создающий возможности научно-практического использования данного явления.

Решение поставленных задач позволило получить ряд новых результатов.

Научная_новизнЕК Установление взаимосвязь мевду биолюминесцентной активностью и -интенсивностью ПОЛ in vivo в растущей культуре светящихся бактерий. Полученные данные расширяют представления о функциональной роли люминесцентной системы, как - системы гидроксилирования гидрофобных субстратов. Можно полагать, что люминесцентная система, окисляя липофильные алифатические альдегиды до кислот, поддерживает низкий уровень образуемых, в ходе окислительной деградации липидов токсичных продуктов, выполняя тем самым защитную функцию в клетке.

Однозначно показано, что образование альдегидных субстратов люциферазы происходит в самых разных липидных объектах, как при спонтанном, так и при индуцированном УФ-радиацией и ионами Fe+2 перекисном окислении липидов. Кроме того, в Оесклеточном экстракте фотобактерий идентифицированы специфические ферментные системы, способные в присутствии nad(f)h катализировать процесс пероксидации липидов. Подтверждено предположение, что данные ферментные системы непосредственно вовлечены в процесс образованием альдегидных субстратов люциферазы.

В качестве новых альтернативных путей .образования альдегидного субстрата показаны процессы образования альдегидных субстратов люциферазы при ферментативном окислении длинноцепочечных алифатических спиртов и при гидролизе плазмалогенов.

Различными экспериментальными подходами доказано непосредственное участие фосфолипидов в структурно-функциональной организации

люминесцентной электронтранспортной цепи. Бактериальные липиды выполняют "сопрягающую" функцию, поддерживая высокий . уровень восстановленного флавина. Одновременно получена дополнительная информация об организации альдегидсвязыванцего участка люциферазы. Показано непосредственное участие липидных структур в формировании гидрофобной зоны фермента. Наличие прочно-связанных. липидов, содержащих эндогенный "альдегидный фактор", дает объяснение феномену т.н. "безальдегидного свечения".

Исследование влияния конформации субстрата на эффективность генерации света люциферазой с использованием широкого круга предельных и непредельных алифатических альдегидов, различающихся длиной углеродного скелета, числом, положением и изомерией двойных связей, позволило установить два основных параметра, определяющих интенсивность биолюминесценции: гидрофобность альдегида и, определяемое структурными элементами молекулы, положение функциональной группы в альдегидсвязывающем участке активного центра фермента. При этом установлен факт крайне высокой эффективности моноеновых и диеновых изомеров альдегидов с 16 углеродными атомами. Последнее наблюдение носит принципиальный характер, поскольку ставит под сомнение предположение, что природным альдегидным субстратом фотобактерий является тетрадеканаль. Предполагается, что в роли природных субстратов люциферазы функционируют различные алифатические альдегиды, образуемые разными путями.

Впервые показано, что в стандартных условиях кинетика затухания биолюминесценции с различными альдегидами в качестве субстратов протекает по биэкспоненциальной зависимости. На основании этих результатов обосновано участие в процессе генерации света наряду с полностью восстановленными и радикальных форм флавина, что в свою очередь позволяет считать, что в условиях запуска реакции РШ н2 люцифераза способна совершать каталитический акт многократно, и-не может рассматриваться как однооборотный фермент.

Разработаны научные основы и технологические операции функционирования микроаналитических систем для определенных классов биологически активных соединений: длинноцепочечных альдегидов и спиртов в хидкой и газовой фазе, ферментов и метаболитов в биологических тканях, половых феромонов насекомых альдегидной и спиртовой природы, ксенобиотиков. В работе сформулированы принципиальные основы использования фотобактерий в качестве интегрального биотеста в контроле за экологическим состоянием окружающей среды.

На^тао-ПЕактическая_значимость_ЕаОоты. Практическую, значимость имеют сформулированные в работе новые принципы организации Сиосенсоров на основе бактериальных люцифераз, биолюминесцентных систем и интактных клеток фотобактерий.

Практическую значимость имеют разработанные в работе подходы к природе альдегид-зависимой реакции бактериальной люциферазы, заложенные в основу биолюминесцентного анализа половых феромонов насекомых. Благодаря высокой чувствительности, простоте, быстродействию "Данные системы микроанализа могут эффективно использоваться в решении многих вопросов химической коммуникации насекомых, в исследовании путей биосинтеза феромонов, в решении других задач биологических методов защиты растений. „

Соответственно практическую перспективность для биохимии, медицины, биотехнологии имеют разработанные принципы применения бактериальной люциферазы в анализе разнообразных биологически активных соединений, в первую очередь ферментов, уровень активности которых отражает патологические отклонения организма.

Несомненную практическую значимость ' исследованиям придает возможность использования бактериальной люциферазы в контроле за процессами перекисного окисления липидов. Преимущества данного подхода заключаются в простоте, экспрессности и чувствительности.

Биотест на основе светящихся бактерий может найти успешное применение в самых разных сферах экологии и биотехнологии, в том числе контроле за загрязнением окружающей среды промышленными отходами, стоками, в качестве первичного теста по токсичности фармакологических препаратов, в контроле за пищевыми продуктами и в решении ряда других - задач биомониторинга.

Результаты работы и разработанные методики используются в учебном процессе -кафедры микробиологии биологического факультета МГУ, в Тартусском университете, в производственном процессе НЩ "Биоавтоматика" (Нижний Новгород), СП "Биохиммак" (МГУ), НПО "Биолар" (Рига).

Междунаро д ном симпозиуме "Современные методы химической энзимологии" (Москва, 1979); Симпозиуме Европейского микробиологического общества (Финляндия, 1980); II Всесоюзной конференции _ "Современные проблемы биологии" (Тбилиси, 1980); Всесоюзном симпозиуме "Биохемилюминесценция" (Ивано-Франковск, 1981); II Всесоюзном симпозиуме "Современные проблемы биологии" (Лагодехи, 1981); III Всесоюзном симпозиуме "Теория и практика культивирования

микроорганизмов" (Киев, 1981); I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); Международном симпозиуме "Биолюминесценция и люминесцентные методы анализа" (Новосибирск, 1982); IV Всесоюзной конференции "Инженерная энзимология" (Киев, 1983); Всесоюзной конференции "Феромоны листоверток" (Тарту, 1984); Всесоюзном микробиологическом съезде (Алма-Ата, 1985); M Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии "Получение и применение биокатализаторов в народном хозяйстве и медицине" (Кабулети, 1985); Всесоюзном симпозиуме "Биолюминесценция и ее аналитическое применение" (Красноярск, 1985); Всесоюзном симпозиуме "Биохемилюминесценция в медицине и сельском хозяйстве" (Ташкент, 1986); v Международной конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1987); IV Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988); M Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (Флоренция, Италия 1988); vi Всесоюзной конференции "Методы ' получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, 1990); VII Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Москва, 1991); IV Всесоюзном симпозиуме по хеморецепции насекомых (Вильнюс, 1988); Международной конференции "Регуляция свободнорадикальных реакций", (Варна, 1989); Международном симпозиуме "Биохемилюминесценция" (Суздаль, 1989); Симпозиуме по, биолюминесценции и хемилюминесценции (Кембридж, Англия, 1990); IV конференции РФ " Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1992); Международной конференции по медицинской и экологической токсикологии (Москва, 1991).

Отрукт^ра_и_объем_£иссертации.-Диссертационная работа включает в себя следующие основные разделы: "Введение" (21 стр.), "Обзор литературы" (2 главы, 111 стр), "Материалы и методы исследований" (а стр.), "Результаты и их обсуждение" (4 главы, 164 стр.), "Заключение", "Выводы". Список литературы включает 403 работы. Общий объем диссертации 365 стр., в том числе 76 рис. и 17 таблиц.

Методачесгае_аспекты_работы.

Объектом исследования служили морские светящиеся бактерии: Vibrio (Beneckea) harveyi штамм MAV 392 (АТСС), И Vibrio (Photobaoterium) fisoheri H 6 (МГУ ), выделенный нами из акватории Черного моря.

Культивирование бактерий осуществлялось в соответствии с методиками, описанными в работах (Баранова и др., 1980; Исмаилов и др., i981, Гительзон и др., 1984). Аппаратура для культивирования -ферментационный комплекс "New Braunswick" (США). Бесклеточный экстракт получали методом ультразвуковой дезинтеграции .суспензии клеток на

- то -

дезинтеграторе УЗДИ-2Е, либо разрушением клеток на Х-прессе при температуре жидкого азота с последующим центрифугированием на "Beckman-J-2-21". Фракцию мембран бактерий получали ультрацентрифугированием на центрифуге "Beokman L5-65B". Выделение и очистку бактериальной люциферазы осуществляли методами препаративной биохимиии с использованием ионообменной хроматографии и гельфильтрации на различных носителях, согласно методикам, описанным в работах (Шумихин и др., 1980, Исмаилов'и др 1981), специально разработанным для получения ферментных препаратов со специфическими свойствами.

Экстракция липидов проводилась по методу Фолча (Poloh et ai., 1957).

Анализ продуктов перекисного окисления липидов осуществляли спектрофотометрически с использованием 2-тиобарбитуровой кислоты (Jagi, 1976). Для определения диеновых коньюгатов снимали спектры в ультрафиолетовой области 200-300 нм.

Жирнокислотный состав определяли методом газоиидкостной хроматографии на хроматографе Chrom. 5 (ЧСФР).

Потребление кислорода клетками определяли амперометрически с помощь» электрода Кларка на полярографе ДЗ 7Е (ЧСФР).

Спектральные исследования проводили на спектрофотометре Беокшап-26.

люминесценцию регистрировали на люминометре "1251-LKB-Waliac" (Швеция) или на хемилюминесценцентной установке в токовом режиме,имеющей систему термостатирования и перемешивания образца.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

I.ОБРАЗОВАНИЕ АЛЬДЕГИДНЫХ СУБСТРАТОВ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЛЮЦИФЕРАЗЫ ПРИ ПЕРЕКИСНОМ ОКИСЛЕНИИ ЛИПИДОВ.

¡Цирокая . субстратная специфичность фермента к алифатическим альдегидам • с одной стороны и структурное многообразие продуктов пероксидации с другой стороны, позволяют ожидать проявления би^люминесцентного ответа люциферазы на окислительные процессы, протекающие как неферментативным путем, так и ферментативно, в самы> разных типах липидов животного, растительного и микробногс происхождения, в том числе липидов из светящихся бактерий.

I.I. ОБРАЗОВАНИЕ АЛЬДЕГИДНОГО СУБСТРАТА БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЛЮЦИФЕРАЗЫ В ХОДЕ ИНДУЦИРОВАННОГО УФ-РАДИАЦИЕИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ.

Ультрафиолетовая радиация является классическим агентом, крайне эффективно промотирующим процесс свободнорадикального окисления липидов. Эксперименты по пероксидации этилоеого эфира линоленоЕой кислоты выполнены для выяснения возможности образования среди продуктов перекисного окисления, вызванного действием ультрафиолетовой радиации, соединений, способных функционировать в роли альдегидных субстратов люциферазы из v. harveyi. Одновременно предпринята попытка оценить корреляцию между параметрами свечения люциферазы и содержанием в данной кислоте окисленных продуктов, в том числе взаимодействующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (2-ТБК).соединений. На рис.1 представлена временная зависимость накопления ТБК-активных соединений с максимумом абсорбции при 533 нм., диеновых коныогатов с максимумом при 233 нм. и свечения системы с бактериальной люциферазой, лимитируемой по альдегиду. Непосредственно после начала облучения происходит спад всех трех параметров, после чего в течении 15 минут осуществляется накопление субстратов люциферазы, диеновых коныогатов и ТБК-активных соединений. Коэффициент _ корреляции между интенсивностью биолюминесцентного ответа и содержанием ТБК-активных соединений с максимумом поглощения при 533 нм. в данном временном диапазоне: г=0,97. Между содержанием диеновых коныогатов и биолюминесцентной активностью прямая корреляция отсутствует. При облучении свыше 15 минут начинается спад всех параметров, корреляция между анализируемыми ' продуктами нарушается. Сходная кинетика нарастания и спада свечения в близком временном диапазоне наблюдалась на бесклеточном экстракте Achromobaoter (Vibrio) fiBoheri (Strehler, Cormier, 1953). Нарастание свечения объяснялось распадом по действием УФ-радиации неустойчивых липидных предоественников альдегида. Спад свечения связывался с необратимой инактивацией ультрафиолетовым светом ферментных систем бесклеточного экстракта. Первая часть объяснения' согласуется с полученными в данной работе результатами, однако объяснение спада неприемлемо для неферментативной системы. Возможно ингибирование свечения при длительном облучении линоленовой кислоты связано с окислением при высоких температурах альдегидов до кислот или их димеризацией.

'/-/¿.К

I, °,«.(!) А 533(3), 233(3)

1, О.в.

1с и го бремя,мин

А 533(1)

I, о.в^г)

1,0.е.

в Б ю 1Б £0 га эо

бремя, мин.

время, шш

Кинетика накопления альдегидных сусбтратов люциферазы ^ьШС-активных соединений (2), диеновых коньюгатов (3) в ходе УФ-оОлучения линоленовой кислоты. Образование альдегидных субстратов в лишдах подсолнечника при У^облучении? м .Й9?8 образования альдегидных субстратов (I) и ТБК-активных соединений (2) в бактериальных липидах из у.Ьагуеу1 при введении РеБО в концентрациях ТОмкМ (I), 1мМ (2), 1,15мМ (3)

Наличие корреляции между интенсивностью перекисного окисления липидов и биолюминесценцией бактериальной люциферазы в реакции, лимитируемой по альдегиду, было использовано для анализа продуктов ПОЛ и альдегидных субстратов люциферазы в растительных липидах. Переокисление растительных липидов, также как и в> вышеизложенных экспериментах, обеспечивалось УФ-радиацией. Профиль кривой развития биолюминесценции сходен с профилем реакции на линоленовой кислоте (рис.2). Как и в предыдущих экспериментах, нарастание альдегидных продуктов протекает в пределах 20 минут облучения. При этом необлученная фракция содержит определенный уровень окисленных продуктов, способных стимулировать биолюминесцентную реакцию. Ингибирование люминесцентной реакции осуществляется при длительном, более 20 минут, воздействии. Корреляция с ТБК-анализом в данном временном диапазоне: г=0,9. Наличие хорошей корреляции между ТБК-методом и биолюминесцентным методом также отмечено в работе по биолюминесценетному анализу окисленных продуктов в липопротеинах низкой плотности (ffieland et all, 1990).

Суммарная фракция бактериальных липидов из V. harvöyi использовалась в качестве ключевого объекта исследований возможности образования под действием УФ-облучения альдегидных субстратов люциферазы. Временная зависимость образования ТБК-активных соединений (А533) и биолюминесцентной реакции люциферазы (lg) представлены на рис.3. Необлученные липиды содержат окисленные' продукты, способные взаимодействовать и с люциферазой, й с 2-ТБК. Непосредственно после начала УФ воздействия наблюдается кратковременное снижение обоих параметров: А53г и lQ , после чего в течении 20 минут монотонно нарастает количество активных продуктов. Синхронность поведения параметров нарушается при длительном (более 20 минут) воздействии облучением и температурой. Высокие концентрации липидов вызывают ингибирование биолюминесцентной реакции.

Резюмируя вышеизложенные результаты, можно полагать, что при одновременном действии ультрафиолетовой радиации и температуры в самых разных липидах, в том числе в липидах из светящихся бактерий, среди окисленных продуктов образуются соединения, способные стимулировать альдегид-зависимую реакцию бактериальной люциферазы. Конкретный механизм этого фотоиндуцированного процесса неясен (различные варианты представлены в работах (Esterbauer, 1982; Frankel, 1983) также как неясна структура этих соединений. Принципиальной важностью отличается факт хорошей корреляции между уровнем окисленности липидов по стандартному анализу с 2-ТБК и интенсивностью биолюминесценции системы

с люциферазой. Предположение ,■что образование альдегидного субстрата у фотобактерий может осуществляться не только в ходе восстановительной реакции из миристиновой кислоты' в присутствии nadph и атр , но и при окислительной деградации бактериальных липидов, подтверждается результатами опытов по фотоиндуцированному переокислению. Литературные данные, по эффекту ультрафиолетовой радиации на бесклеточный экстракт светящихся бактерий и Т.Н "kidney oortex faotor" (Strehler, Cormier, 1953; MoElroy, Green, 1955) также согласуются с этими выводами.

1.2.ОБРАЗОВАНИЕ АЛЬДЕГИДНОГО СУБСТРАТА ЛЩ1ФЕРАЗЫ В ХОДЕ ИНДУЦИРОВАННОГО ИОНАМИ Ре2+ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИГЩОВ ИЗ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИИ.

Хорошо известно, что ионы переменной валентности, и в частности ионы железа, являются промоторами неферментативного процесса перекисного окисления липидов. .В целях доказательства возможности образования альдегидного субстрата люциферазы, как продукта неферментативного перекисного окисления липидов, на бесклеточном экстракте бактерий v.harveyi поставлены эксперименты in vitro с индукцией ПОЛ ионами железа. Двухвалентное железо прямого воздействия на биолюминесцентную систему не оказывает, что позволяет реально контролировать по люминесцентной реакции процесс образования альдегидных субстратов.

Бактериальная люцифераза проявляет высокое сродство к алифатическим альдегидам - пороговая чувствительность биолюминесцентной реакции 10-1000 пкМ альдегида (в зависимости от структуры этого субстрата). Гидрофобные соединения, в том числе углеводороды, алифатические спирты, кетоны, кислоты и ряд других веществ ингибируют люциферазу с константами ингибирования 10-1000 мкМ. На этом основании можно предполагать, что образующиеся наряду с альдегидами неальдегидные продукты переокисления липидов в условиях инициирования Ре+2 не будут оказывать воздействия на биолюминесцентную активность, в то время как альдегидные продукты даже в очень низких концентрациях долщы стимулировать световую эмиссию.

На рис.4 представлена картина . биолюминесцентного ответа бесклеточного экстракта на введение различных концентраций железа. В реакционной -среде содержались в насыщающих концентрациях NADH и fmn, как субстраты биолюминесцентной системы, но отсутствовал экзогенный альдегид. Двухвалентное железо вызывает резкую стиму.юттот тоиашю

экстракта. Кривые развития и затухания свечения различаются при разных концентрациях железа: свыше I мМ кривая приобретает сложный характер. Кинетика хемилшинесцентного ответа микросом на введение Ре2+ характеризуется сходной картиной (Владимиров, Арчаков, 1972). Сложный профиль кинетической кривой объяснялся одновременным протеканием трех, идущих с разной скоростью процессов, в каждом из которых участвовует железо: инициирование свободнорадикального цепного процесса, распад гидроперекисей, обрыв цепей окисления. Повидимому аналогичные процессы протекают в бесклеточном экстракте при окислении бактериальных липидов двухвалентным железом. Экзогенный альдегид полностью снимает эффект железа. Результаты, представленные на рис.4, свидетельствуют, что ионы промотируют in vitro в бвсклвточном экстракте бактерий образование соединений, способных функционировать в роли альдегидных субстратов люциферазы.

Оценена корреляционная зависимость мевду двумя процессами, индуцируемыми в бесклеточном экстракте фотобактерий ионами железа: накоплением ТБК-активных продуктов с 1тах=533нм и величиной люминесцентного ответа, лимитируемого альдегидом. Коэффициент корреляции варьируется в различных экспериментиах от 0,96 до 0,98. Вместе с тем корреляция между скоростью образования ТБК-активных продуктов и альдегидного субстрата люциферазы при перекисном окислении общих бактериальных липидов не свидетельствует о том, что предавственником является один и тот же липидный компонент. Возможно, что эти соединения являются продуктами пероксидации различных групп липидов, окисление которых под действием индуктора протекает достаточно синхронно.

Прямым указанием на то, что стимулирующий эффект Feso^ связан с липидными структурами служат результаты экспериментов с использованием суммарной фракции липидов, выделенных из бактерий V. harveyi. Добавление бактериальных липидов, предварительно обработанных двухвалентным железом, в реакционную смесь с бактериальной люциферазой резко стимулировало биолюминесцентную активность, лимитируемую альдегидом.

Таким образом установлено, что бактериальные липиды из светящихся бактерий достаточно легко окисляются неферментативным путем и под действием ионов переменной валентности. Данный процесс приводит к. образованию среди продуктов окисления соединений, способных функционировать в роли субстратов люциферазы.

1.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ В БЕСКЛЕТОЧНОМ ЭКСТРАКТЕ V.HARVEYI ФЕРМЕНТАТИВНЫХ СИСТЕМ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ.

Исходя из того, что переокисление липидов может осуществлятся как неферментативным путем, так и ферментативно, в настоящей работе ставилась задача идентифицировать этот процесс в бесклеточном экстракте фотобактерий бактерий Vibrio harveyi.

Для выяснения возможности образования соединений с параметрами субстратов люциферазы ферментативным путем, в бесклеточный экстракт вводились специфические донорно-акцепторные системы, обычно используемые при индукции ПОЛ в микросомах и митохондриях, и ингибиторы оксигеназ.

Таблица I

Системы А 533, уел ед.

Контроль, эндогенная активность 100

NADH, 5 тм 480

NADFH, 5 тМ 330

NADH, S тМ + ПХМБ, 0,5 мМ 80

NADH, 5 тМ + ЭДТА, 0,5 мМ 80

NADH, 5 тМ, 100°С, 10 мин. 130

Наиболее эффективно процесс образования ТЬК-активных продуктов стимулируется восстановленными никотинамидными нуклеотидами, причем скорость реакции с наш в 2 раза выше, чем с ыабрн. Совместное добавление иаш и двухвалентного железа обеспечивает существенно больший уровень окисленных продуктов, чем просто ыащ. Дополнительным доказательством присутствия в бесклеточном экстракте V. 1гагуеу1 ферментных систем, участвующих в процессе перекисного окисления липидов,служат эксперименты с^ ингибиторами: БН-реагентом р-хлормеркуриобензоатом (ПХМБ) й хелатором металлов

.я'-этилендиаминтетрацетатом (ЭДТА), а также термоинактивация, реакции (Таблица I)

ПХМБ и ЭДТА эффективно подавляют НАШ-зависимую реакцию образования ТБК-активных продуктов, частично снижая даже уровень эндогенной активности. 10-минутная термоинактивация бесклеточного экстракта при ЮО°С приводит к падению активности на 70%.

Результаты исследований указывают на наличие в бесклеточном экстракте . фотобактерий Ыаб(Р)н-зависимых систем, способных катализировать перекисное окисление липидов.

Как известно, в фазе экспоненциального роста биолюминесцентной активности клетки индуцируется синтез целого ряда ферментных систем, в том числе люциферазы, редуктазы жирных кислот, альдегидцегидрогеназы и некоторых других ферментов (Meighen et all, 1981). Можно полагать, что ферментные системы, катализирующие перекисное окисление липидов у фотобактерий, также обладают индуцибельным синтезом. Предположительно это могут быть оксигеназы для которых как известно характерен как индуцибельный синтез, так и двойная функция: гидроксилирование и пероксидациия.

Соответственно процесс активации свечения in vivo в экспоненциальной фазе роста в значительной степени может регулироваться на уровне активности этих ферментных систем.

Представленные в настоящей главе данные по жирнокислотному •составу двух видов фотобактерий получены с учетом того, что сведения по данному Вопросу носят отрывочный, в некоторых случаях противоречивый характер, методические подходы различны. Специальных исследований по структуре ЖК у всех видов фотобактерий не проводилось, хотя очевидна важность данной информации для таксономических и экологических целей. Особую актуальность этим исследованиям придает то обстоятельство, что образование альдегидного субстрата прямо связано с липидным обменом.

1.4. ЖЙРНОКИСЛОТБШ СОСТАВ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИИ VIBRIO HARVEYI И VIBRIO PISCHERI

Таблица 2

Жирная кислота

Содержание в % Vibrio harveyi

14:0 14:1 15:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2

4,2 0,7 1,5 15,2 66,4

Vibrio íisoheri 5,4 064

10,5 1,0

10,7

27.7 0,4

16.8 31,3

Проведенный ГЖХ-анализ жирнокислотного состава фотобактерий показал (таблица 2), что жирные кислоты с ненасыщенными связями

составляют почти 80% от общего количества хирных кислот. Основной вклад (66%) у у. harveyi вносит пальмитолвиновая кислота, что согласуется с данными других работ. Эта же кислота составляет 28% у V. fisoheri, однако для данного штамма Характерно высокое процентное содержание олеиновой и линолевой кислот, на долю которых приходится 17 и 31% соответственно.

Величина критерия условной ненасыщенности (79% у v. harveyi и 115% у V. fisoheri) в основном определяется моноеновыми ЖК, содержание линолевой кислоты у данных итаммов существенно отличается, у более высокотемпературного штамма V. harveyi содержание диеновых ЖК существенно ниже. Принципиально, что миристиновая кислота находится в незначительном процентном соотношении к пальмитолеиновой кислоте.

Высокий уровень ненасшценности липидов фотобактерий указывает на достаточно большую вероятность окислительной деградации липидов под действием эндогенных индукторов реакции или в ходе спонтанного окисления, и могут служить косвенным подтвервдением предположения о переписном пути формирования альдегидного субстрата в клетке.

Литературные данные по. определенным показателям близки к полученным результатам. Преобладающим содержанием ненансыщенных жирных кислот характеризуется штамм 1IAV 334 V. harveyi (Веугв, 1988). Пальмитолеиновая кислота составляет более половины жирнокислотного состава Photobaoterium leiognathi (Калачева и др., 1981, 1985).

1.5. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В ПРОЦЕССЕ РОСТА И РАЗВИТИЯ 6И0ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ У 6АКТЕРИИ VIBRIO HARVEYI.

Исходя из представленных выше и литературных данных о путях и механизмах образования длинноцепочечных алифатических альдегидов в клетке фотобактерий и допуская возможность его образования в качестве продукта перекисного окисления липидов, можно было ожидать взаимосвязи между развитием люминесценции и интенсивностью ПОЛ in vivo в растущей периодической культуре бактерий. Решение поставленной задачи осуществлялось путем одновременного анализа биолюминесцентной активности и уровня ТБК-активных соединений в клетках фотобактерий в процессе культивирования на разных фазах роста.

Биолюминесцентная активность клетки (1/а660), где I интенсивность свечения клеточной суспензии, А660 - плотность биомассы, и интенсивность ПОЛ в бесклеточном экстракте (А^^/т), где -

поглощение комплексов с 2-ТБК, m - вес клеточной биомассы, изменяются по зависимости, близкой к экспоненциальной, в том же временном

диапазоне, где индуцируется свечение.Удельные скорости образования продуктов: световой эмиссии и МДА, рассчитанные как константы скорости реакции первого порядка в диапазоне 3-8 часов роста, где параметры подчиняются экспоненциальному закону, достаточно близки:

крхт,1/А660 = 0,4 ± 0,15 ч"1; к А533/т = 0,3 ± 0,1 Ч-1.

Рис.5. Биолюминесцентная активность клеток У.Ьагтеу1 (1/А6б0) на разных фазах роста (1)6 накопление в липидах, выделенных из этих клеток продуктов П0Л:А533/ш (2 ) (3)

А660 - плотность биомассы, т - вес липидов.

А.-ввО пт

Накопление продуктов пероксидации в липидных фракциях, выделенных из бактерий на разных фазах роста показано на рис.5. Количественный расчет показал, что за время экспоненциального нарастания свечения содержание ВДА возрастает с 0,1 до 0,5 нмоль/мг липида. В то же время очевидно, что результаты анализа отражают лишь определенную стационарную концентрацию этого продукта ПОЛ в липидной фракции и не могут рассматриваться в качестве строгого количественного критерия интенсивности ПОЛ в бактериальной клетке. Уровень пероксидации липидной фракции коррелирует с биолюминвсцентной активность» клеток с коэффициентом корреляции 0,9-0,97 для разных экспериментов. В липидах в УФ-диалазоне не проявляются диеновые коньюгаты, возможно за счет сильного поглощения соединений с одной двойной связью в близкой коротковолновой области, однако четно проявляется полоса поглощения при 270 нм, соответствулцая кетодиенам и альдегидам. Именно эта область поглощения претерпевает наиболее существенные изменения в процессе развития свечения у растущей культуры. Нарастание поглощения происходит в том же временном диапазоне, где индуцируется

биолюминесценция. Таким образом, биолюминесцентная активность бактериальной клетки in vivo развивается синхронно с процессом перекисного окисления бактериальных липидов.

Обобщая результаты экспериментов по анализу процессов перекисного . окисления липидов у светящихся бактерий in vivo и в модельных системах необходимо отметить некоторые принципиальные моменты.

Как отмечалось, биолюминесцентная система бактерий по своим структурно-функциональным свойствам аналогична монооксигеназным системам животных, растений, микроорганизмов (Hastings, Neaison, 1978). Характерной особенностью монооксигеназных систем является прямая связь между процессом гидроксилирования гидрофобных субстратов и пероксидацией структурированных липидов. В свою очередь пероксидация липидов сопровождается хемилюминесценцией.

С другой стороны однозначно установлено, что алифатические альдегиды являются одними из типичных продуктов ПОЛ. При этом в зависимости от химического строения жирнокислотного предшественника (длины углеродного скелета, числа и положения двойных связей), подвергапцегося пероксидации, варьируется механизм реакции и структура продуктов.

Как уже отмечалось, общим признаком фотобактерий является очень высокое процентное содержание ненасыщенных жирных кислот, основной вклад в который вносится пальмитолеиновой кислотой. На основании имеюигася в литературе данных по механизмам переокисления липидов близкой структуры с большой вероятностью можно ожидать образования среди продуктов алифатических альдегидов с длиной цепи более С^атомон. Широкая субстратная специфичность бактериальной люциферазы к нялнйенным и ненасыщенным альдегидам позволяет на основе уже установленных механизмов пероксидации моноеновых и диеновых жирных кислот с длиной цепи Cj6 - Cjg (вносящим основной вклад в жирнокислотный состав фотобактерий) предполагать появление среда них альдегидов, структура которых удовлетворяет требованиям субстратной специфичности люциферазы. Хотя конкретный механизм образования этих субстратов в бактериальной клетке in vivo не ясен, по аналогии с описанными реакциями ПОЛ можно рассматривать их образование теми же путями: распадом первичных и вторичных аллильных гидроперекисей, либо при рекомбинации радикалов.

Имеющиеся в литературе схемы биосинтеза и деградации длинноцепочечных алифатических альдегидов в клетках фотобактерий основывались в значительной степени на идентификации в бесклеточном экстракте ферментативных активностей, специфичных к длиноцепочечным

алифатическим молекулам, (редуктазной, альдегиддегидрогеназной, алкогольдегидрогеназной) и их совместной с люциферазой индуцибельности в процессе нарастания биолшинесцентной активности клетки (Meighen et all., 1981-, Вуегв et all., 1988). При этом целенаправлено исследовался только один путь образования альдегидов - редуктазный. Образование альдегидного субстрата в редуктазной реакции показано у бактерий F.phosphoreuiTi. В то же время в бесклеточном экстракте бактерий vibrio harveyi запуск редуктазной реакции не приводит к биолюминесценции.

Рассматриваемый новый "пероксидазный"' механизм образования альдегидного субстрата отличается тем, что позволяет исключить проблему высоких энергозатрат, характерных для редуктазного типа, и указывает на аналогию между хемилюминесцентными реакциями других биологических объектов и биолюминесценцией.

Обнаруженное в настоящей работе нарастание содержания окисленных продуктов ПОЛ в- бактериальной клетке в ходе развития клеточной популяции является достаточно важным наблюдением, поскольку затрагивает общие процессы клеточного метаболизма клеток, находящихся на разных стадиях роста. Не исключено, что накопление продуктов ПОЛ в клетке прямо или косвенно затрагивает и другие, не связанные непосредственно с люминесценцией, процессы метаболизма фотобактерий. Какова роль ферментативного и неферментативного процесса в метаболизме светящихся бактерий установить пока достаточно сложно , однако несомненно, что при этом может осуществляться образование альдегидных продуктов, среди которых присутствуют субстраты люциферазы.

1 Ш®'

RH ROOH ---> R ОНО

У////,

/I'" "/////// мембрана

NAD+ Г RCOOH, HgO, hv

NADH,H+ J v_ pyjj люцифераза N, ?:редуктапа

.Рис.6. Схема связи биолюминесценции и перекисного окисления липидов.

Пероксидазный путь образовыания альдегида свидетельствует в пользу ранее высказанных предположений (Neaison, Hastings, 1972, 1979; Hastings, 1986) о защитной функции люминесцентной системы в бактериальной клетке. Продукты ПОЛ, в первую очередь альдегиды, в виду их.токсичности для клетки должны поддерживаться на низком уровне, что ■ обеспечивается наряду с обычными "темновыми" ферментными системами и люминесцентной монооксигеназной системой.

II. литцы___В___СТтТУгар^УНЩ510НАЛЬНрИ____ОРГАНИЗАЦИИ

БИОЛЮЩЕСЦЕ™рИ_СИСТ^_БАКта™.

Структурное и функциональное сходство люминесцентной электронтранспортной цепи с цепями гидроксилирования микросом и Рв. putida заложено в основу предположения о "сопрягающей" функции фосфолипидов . в ферментном комплексе "нлБ(р)н-рш-редуктаза + люцифераза".

II.I.ДЕЙСТВИЕ Ф0СФ0ЛИПАЗ НА БИОЛШИНЕСЦЕНТНУЮ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИАЛЬНОМ ЛЮЦЕФЕРАЗЫ И NAD Н-ЗАВИСИМУЮ АКТИВНОСТЬ БИОЛШШЕСЦЕНТНОИ ФЕРМЕНТНОЙ СИСТЕМЫ.

Наиболее конкретным доказательством .структурно-функциональной роли липидного компонента в ферментативном процессе может служить чувствительность ферментной системы к специфическим липолитическим ферментам. Исходя из этого, в настоящей работе были поставлены задачи по выявлению возможной чувствительности люминесцентной системы к фосфолипазам А, С, Д ' и исследованию кинетических параметров биолюминэсцентной реакции в присутствии липолитических ферментов.^

фосфолипаза А проявляет свое действие сложным образом: свечение претерпевает кратковременную активацию с последующим медленным спадом активности. Два других типа фосфолипаз - С и D, с высокой скоростью подавляют nad Н-зависимую эмиссию непосредственно после- введения в реакционную смесь, хотя с фосфолипазой d наблюдается кратковременная вспышка.

На FMNHg-зависимую реакцию бактериальной люциферазы фосфолипаза А оказывает активирующее действие, ингибирование активности люциферазы не наблюдается даже при длительном (более I часа) проведении реакции. Фосфолипазы С и Д не оказывают воздействия на РМШ2-зависимую реакцию.

Поскольку фосфолипазы С и d неактивны в отношении непосредственно лвциферазной реакции (РМЫН2), но эффективно подавляет активность биолюминесцентной системы (nad Н), можно было полагать, что фосфолипазы в первую очередь действуют на цепь переноса электронов на этапе восстановления fmn. Действительно, инкубация биолюминесцентной системы с обоими типами фософлипаз: С и D, резко снижает скорость восстановления FHN (рис.7, кривая I) и одновременно увеличивает скорость свободного окисления NAD Н (рис.7-, кривая 2). По-видимому, действие фосфолипаз на биолюминесцентную систему аналогично "разобщяющему" эффекту фосфолипаз на электронтранспортные системы микросом или митохондрий.

Рис.7. Действие фосфолипазы С на nadh:fmn-оксидоредукт азную (I), и NADH-оксидазную активность (2) биолкминесцентной ферментной системы из V.íisoheri.

Опираясь на выводы работ, о необходимости фосфолипидов для люциферазы светляков (Духович и др. 1987, 1988), п исходя из полученных нами результатов, можно с достаточной вероятностью предполагать присутствие в минорном количестве в бактериальной люциферазе функционально необходимого лишдного компонента. Предполагается, что в состав люциферазы алифатический альдегид входит не в свободном виде, а в виде фосфолипидного остатка. Модельные опыты показали, что продукты гидролиза плазмалогена:

сн2-сн=снс14н29 chgoh

сно-со-с15н31 -----> сно-со-с15н31 + с15н31сно

CH20-C0-C15H31 CH20-C0-C15Н31

эффективно стимулируют люминесцентную реакцию в отсутствие экзогенного альдегида. Возможно in vivo данная реакция может контролироваться локальным изменением рК в гидрофобной зоне фермента. Результаты вышеизложенных модельных экспериментов с использованием продуктов гидролиза плазмалогена показывают новый, пока малоизученный путь формирования альдегидного субстрата у фотобактерий.

II.2. ФАЗОВЫЕ ПЕРЕХОДЫ "АЛЬДЕГИДНОГО ФАКТОРА" ЛЩИФЕРАЗ ИЗ VIBRIO HARVEYI И VIBRIO FISCHERI.

Механизм лшинесцентной реакции на эндогенном альдегидном субстрате (т.н. безальдегидное свечение) неизвестен, структура "альдегидного фактора" не установлена. ~ Экспериментальные факты позволяют предполагать, что "альдегидный фактор" связан с липидной фазой фермента. Одной из специфических особенностей монооксигеназ является наличие изломов в температурных зависимостях Аррениуса. В случае монооксигеназ изломы в интервале температур 0-40°С как правило связываются с фазовыми переходами фосфолипидов. Целью нижеследующих экспериментов являлось обнаружение конформационных изменений в бактериальных люциферазах и выяснение возможного участия в этом процессе лишдного компонента. Исследованы температурные зависимости люминесцентной реакции в диапазоне 2-27°С на эндогенном субстрате люцифераз, а также" в присутствии экзогенных альдегидов.

При анализе температурной зависимости констант скорости распада люцифераз из V. harveyi и V. íisoheri на эндогенном субстрате было обнаружено, что зависимости в координатах 1п кр/ ^ для обоих препаратов нелинейна. В диапазоне I3-I7°C (V. harveyi) и 9-13°С (V.íisoheri) в температурных зависимостях констант распада проявляются изломы, сопровождающие ся существенными изменениями активационных параметров реакции.Энергия активации (Е) меняется при переходе через точку излома на величину 20^4 ккал/моль на обоих ферментных препаратах.

Более четкая картина конформационных переходов получена при исследовании температурной зависимости максимальной скорости реакции люминесценции (Iq). Особенностью такого подхода является то, что концентрация эндогенного субстрата за время каталитического цикла практически не меняется, скорость реакции люминесценции пропорциоанльна каталитической константе и зависит только от концентрации фермент-субстратного комплекса: l=k"E^sj. При фиксированной концентрации люциферазы и в присутствии насыщающих концентраций FMNHg и о2 максимальная интенсивность эмиссии достигается практически мгновенно. При этом вклад неферментативной реакции аутоокисления FMNHg крайне незначителен. На рис.8 представлена в координатах Аррениуса зависимость максимальной скорости реакции люминесценции от температуры. В данном случае в температурной зависимости наблюдается резкий излом при 14-16°С и 9-11° (для люцифераз из V. harveyi и v. íisoheri соответственно), т.е. у

люциферазы из более низкотемпературного штамма точка излома на 4°С ниже.,

1/Т х 103

Рис.8. Зависимость максисмальной интенсивности свечения (I ) от

температуры в реакции люцифераз из у.1ш:пгеу1 (1), V. Песьем. (2) на эндогенном альдегидном субстрате.

Таким образом, детальный анализ температурной зависимости "безальдегидной" реакциипозволил идентифицировать изломы, указывающие на конформационные переходы в люциферазных препаратах. Как известно, нативные свойства монооксигеназ обеспечиваются неполярными углеводородными цепями, образующими жидкие гидрофобные области, взаимодействующие с белком. В рассмотренном случае . это скорее распространяется только на гидрофобную область фермента, содержащую эндогенный субстрат. Совокупность полученных результатов по температурной зависимости люминесценции в сочетании с опытами с фосфолипазами подтвердили предположение, что в основе температурных изломов лежат фазовые переходы фосфолипидного компонента люцифераз. Можно полагать, что фосфолипидный компонент определяет активную» конформацию альдегидсвязывающего участка люциферазы и одновременно служит матрицей для "альдегидного фактора".

Наличие в люциферазе матрицы с высоким уровнем гидрофобности позволяет объяснить постоянное присутствие в ферментных препаратах строго определенного количества "эндогенного субстрата", удаление

которого без потери активности крайне затруднено. Вместе с тем, несомненно, что этот субстрат рециклирует в темновом пути, о чем свидетельствует выход квантов при длительном проведении реакции.

Наблюдаемые температуры фазовых переходов существенно ниже характеристических температур плавления насыщенных альдегидов с длиной цепи более 10 углеродных атомов. Скорее всего, фосфолипидный компонент содержит ненасыщенные связи. Отсутствие до настоящего времени информации о структуре "альдегидного фактора", возможно связано с тем, что под этим соединением предполагался один из насыщенных альдегидов с 10-14 углеродными атомами.

III. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АЛИФАТИЧЕСКИХ АЛЬДЕГИДОВ С ЛЩИФЕРАЗАМИ

.FISCHERI.

Проблема регуляции биолюминесцентной активности бактериальной люциферазы in vitro на уровне структуры альдегидного субстрата отличается особой актуальностью. В зависимости от структурных характеристик этого субстрата биолюминесцентная активность люциферазы может изменяться в пределах нескольких порядков.

Подавляющее большинство исследований по взаимодействию альдегидных субстратов с ферментом основывалось на экспериментах с насыщенными альдегидами, сведения же о роли ненасыщенных альдегидов малочислены и неполны. В данной работе исследовалось взаимодействие широкого круга ненасыщенных альдегидов, отличающихся длиной цепи, количеством и положением двойных связей, их изомерией, - с люциферазами, выделенными из двух видов бактерий: v. harveyi и V. fischeri. Выбор ненасыщенных альдегидов продиктован не только научным интересом, но и практической значимостью, поскольку все исследованные соединения являются основными или минорными . компонентами половых феромонов насекомых, среди которых имеются такие вредители как хлопковая совка - Heliotis armigera, дубовый шелкопряд - Autheraea pernyi и другие.

В таблице 3 представлены кинетические параметры: максимальная скорость реакции IQ, константа Михаэлиса - К^, константа распада - к в реакции обоих люцифераз с различными альдегидами. Значения i в таблице приведены в процентах, причем за 100% принята максимальная скорость реакции с тетрадеканалем. Хотя, судя по литературным данным, тетрадеканаль не всегда считается наиболее эффективным субстратом люциферазной реакции, в наших опытах он обнаружил наибольшую

эффективность среди насыщеннх альдегидов. Этим и объясняется выбор его в качестве эталона эффективности.

Длина углеродного скелета ненасыщенных альдегидов оказалась весьма критичным признаком. Наибольшую эффективность проявляют соединенния, имеющие в скелете 16 атомов углерода. Структурные параметры молекул - число и положение двойных связей, их изомерия -вносят свой вклад в эффективность преобразования энергии.

Принципиальным является тот факт, что скорость реакции с ненасыщенными С16- альдегидами намного выше, чем с большинством насыщенных альдегидов. С другой стороны, (Е,г)-6,И-тетрадекадиеналь существенно уступает в эффективности своему насыщенному аналогу. Если в ряду насыщенных альдегидов активность возрастает с длиной цепи, достигая максимума у С^ и спадает у С16, то среди ненасыщенных соединений максимум приходится на структуры с 16 углеродными атомами и спадает у С18, причем по активности в люциферазной реакции многие ненасыщенные альдегиды с 16 угдеродами в скелете превосходят тетрадеканаль. Таблица 3

АЛЬДЕГИД

Vibrio harveyl

Vibrio flecharl

1°, отн.ед.

Km,

мкМ

к'-1

сек

lo, Km,

отн.ед. мкМ

К,

сек

-I

Деканаль

Додеканаль

(г)-э-додеценаль Тетрадеканаль (Е,Z)-6,11 -те традекадиеналь Гексадеканаль (Е)-9-гексадеце-

наль (г)-9-гексадеце-

наль (Е)-б-гексадеце-

наль (г)-б-гексадеце-

наль (2,Е)-6-11-гексадекадиеналь (E,Z)-6,11-гексадекадиеналь (Z,Z)-6,11-гексадекадиеналь (Z,Z)-9,11-гексадекадиеналь (z,z )-9,11 -октадекадиеналь (Z,Z,2)-9-11,15-октадекатриеналь

6+1 4-1

100±6 б±г

15-1 145-7 111¿3 61 ±7 254±5 107-6

150-7 . 33±2 18-3

0,02

12 0,08

0,025

0,017

0,01

0,025

0,016

0,02

0,06

0,02 0,06

0,03

0,035

0,037

0,025

0,028

0,035

12±1

11-2

3±2 100-4

3±2 19—3

112-3

200±6

32-2

187-13

71-7

68-6

90-4

18±2

29-2

0,1

25 0,15

0,08

0,035

0,08

0,05

0,07

0,05

0,08

0,048 0,14

0,09

0,07

0,08

0,21

Константы Шхаэтоа, в отличив от параметра максимальной скорости реакции, значительно меньше изменяются для разных альдегидов и их изомеров. Существенные изменения характерны для

(Е,z)-6,II-тетрадекадиеналя по сравнению с тетрадеканалем. Следует отметить, что кинетические параметры альдегид-зависимой реакции люциферазы существенно зависят от концентрации фермента.Несмотря на различное сродство люцифераз к альдегидам, проявляется зависимость между интенсивностью биолюминесценции и константой распада комплекса: с увеличением скорости реакции константа распада возрастает.

Полученные данные иллюстрируют различия в сродстве люцифераз к альдегидам различной структуры. Важно, что среди выбранных альдегидов, обе люциферазы проявляют максимальное сродство к тетрадеканалю в ряду насыщенных, и к Cjg моноеновым и диеновым альдегидам, - с положением двойной связи Cg и более, - среди ненасыщенных соединений. Следует отметить данные работ (Meighen et al., 1982), в которой получены близкие результаты для ненасыщенных альдегидов на люциферазе из р. phosphoreum.

Интенсивность свечения при росте длины цепи более С16 резко снижается, хотя сродство возрастает (Hastings, Neelson, 1977; Watanabe, Nakamura, 1976). По-видимому, связывание определяется гидрофобными свойствами молекулы субстрата, а эффективность в биолюминесцентной реакции - стерическим фактором, т.е. положением функциональной группы в альдегидсвязывапцем участке активного центра. Этим предположением можно объяснить тот факт, что изомеры ненасыщенных альдегидов с одинаковой длиной цепи различаются по эффективности - отмечена более высокая эффективность у цис-изомеров по сравнению с их транс-аналогами. Повидимому тем же объясняется влияние положения двойной связи в молекуле ненасыщенных альдегидов на интенсивность свечения.

Положение функциональной группы в активном центре играет ключевую роль, возможно, по отношению к SH-группе активного центра, которая обладает аномально высоким рК=9,4. Возможность образования тиополуацеталя при участии этой группы как одна из стадий оксигеназной реакции предполагается во многих работах и подтверждается вышеизложенными результатами:

I II

ESH + ИСЮ---> ESH — > Е - S - С = О

¿СЮ А

IV. КИНЕТИКА ЗАТУХАНИЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ПРИ ВЗАИМОДЕИСТВИИ РАЗЛИЧНЫХ АЛИ&АТИЧЕСКИГ" АЛЬДЕГИДОВ С бАКТЕРИАЛЬНОИ

ЛОДЮЕРАЗОИ.

В связи с важностью знания закономерностей взаимодействия альдегидного субстрата с ферментом в решении вопроса о числе и природе интермедиатов, энергизованных форм и эмиттеров в реакции бактериальной люциферазы представлялось необходимым проведение детального анализа кинетики распада возбужденного комплекса.

На рис.9 приведена кинетика затухания биолюминесценции в присутствии различных концентраций тетрадеканаля. Как следует из рисунка, затухание свечения протекает с ярко выраженным отклонением от кинетики реакции первого порядка. Отклонение проявляется двояко : во первых проявлением многофазности (в первом приближении бифазности). и, во вторых,явным изменением наклона кривых в полулогарифмических координатах в зависимости от использованной концентрации альдегида. Очевидно что процессы, протекающие по кинетике первого порядка в данных координатах должны описываться прямыми, наклон которых не зависит от концентрации реактантов.

100

i(t). %

Рис.9. Кинетика затухания биолюминесценции в реакции люциферазы ИЗ V.harveyi с различными концентрациями тетрадеканаля (М): 0(1), 5,39-Ю-Э(2), 2,7-Ю"8(3), 5,ЗЭ-10~8(4), 2,7-Ю"7 (5), 5,39-Ю~7(б), 5,39-Ю"6 (7).

Проявление в экспериментальных кривых , биолюминесценции бифазности позволило предположить, что каждая из фаз является отражением процесса, протекающего по экспоненциальной зависимости. В этом случае следовало ожидать, что кинетика затухания будет описываться суммой двух экспонент. Для комгаотерной обработки кривых использовали программу нелинейной регрессии.

Как показала проведенная статистическая обработка результатов, кинетика затухания биолюминесценции в реакции с тетрадеканалем с высоким коэффициентом корреляции (г=о,95) может быть аппроксимирована биэкспоненциальной зависимостью:

X С * ) = 1^ехр ( - к^ ) + 12 ( - к^ ),

где 1(1;) - текущее значение интенсивности биолюминесценции, выраженное для наглядности в процентах от I. 11 и 12 - вклад соответственно начальной и конечной экспонент в максимальную интенсивность свечения, также выраженной в процентах. к1 и к2 -константы скорости первого порядка соответственно для начальной и конечной фаз.

Расчет параметров, описывающих процесс затухания свечения, проведенный "в широком диапазоне концентраций альдегида, позволил выявить еще одно принципиальное отличие от кинетики реакции первого порядка, - концентрационную зависимость этих параметров.

Следует отметить весьма существенше различия в значениях начальной и конечной констант скорости, наблюдаемые при всех концентрациях альдегида, что находит свое отражение в ярко выраженой бифазности кинетики. Увеличении концентрации альдегида в диапазоне 5" 10"^ М - 5" Ю-® М сопровождается увеличением константы скорости затухания свечения для начальной (от 0,294 до 1,33 сек-1) и конечной (от 0,024 до 0,17 сек _1) фаз, так и вклада начальной экспоненты (от 22,7 до 96»), а также уменьшением (от 78,9 до 3,&%) вклада конечной экспоненты в максимальную интенсивность свечения 10. При высоких концентрациях альдегида • (бДЧСГ6!!!) максимальная интенсивность биолюминесценции 10 практически целиком обусловлена процессом, с которым связана начальная быстрая фаза затухания свечения. Из приведенных в таблице 4 данных видно, что с ростом концентрации тетрадеканаля меняется вклад начальной и конечной фаз в общую светосумму реакции. При насыщающих концентрациях альдегида вклад начальной фазы достигает 76,6%.

В реакции с деканалем бифазность процесса выражена существенно

менее отчетливо, чем с тетрадеканалем. Однако, как показал проведенный нами компьютерный анализ, в реакции с деканалем кривые затухания свечения также более адекватно описываются биэкспоненциальной зависимостью, чем простой экспонентой. В то время, как с изменением концентрации в диапазоне 7'Ю-7 - 4 "Ю-4 М константа скорости затухания биолюминесценции конечной фазы возрастает от 0,014 до 0,115 сек , остальные параметры процесса к1, 11, 10 остаются практически неизменными. Это приводит к тому, что с ростом концентрации альдегида вклад конечной фазы в общую светосумму падает, а начальной возрастает и при насыщающих концентрациях деканаля достигает почти 50%

Таблица 4

Вклад начальной и конечной фаз затухания свечения в общую светосумму реакции при различных концентрациях тетрадеканаля и деканаля.

Альдегид Концентрация Вклад начальной Вклад конечной М фазы, % фазы, %

С14 5,4-Ю"10 2,3 97,7

5,4 "Ю-9 4,1 95,9

2,7 "Ю-8 11,0 89,0

5,4 "Ю-8 13,5 86,5

2,7 "10=7 58,2 41,8

5,4 "Ю-7 69,6 30,4

5,4 "Ю-6 76,2 23,4

97,6 97,0 94,3 91 ,0 84,0 52,5

При использовании других альдегидов, в частности тридеканаля, нонаналя, именно биэкспоненциальная зависимость наиболее адекватно отражает характер наблюдаемых изменений интенсивности, хотя с нонаналем бифазность процесса менее выражена, в то время как с тридеканалем кинетика затухания проявляется столь же ярко, как и с

с10 7,3" Ю-7 2,4

3,7 10~б 3,0

7,3 МО-6 5,7

3,7 "10~5 9,0

7,3 -10=5 16,0

3,7 '10~5 47,5

тетрадеканалем. В реакции с тридеканалем имеется одно существенное отличие на заключительных этапах затухание свечения протекает с константой скорости, не зависящей от концентрации альдегида. Остальные параметры реакции при увеличении концентрации тридеканаля от 1,5 "Ю_8М до 1,5 "10~5М меняются значительно: вклад начальной фазы в максимальную интенсивность возрастает от 11,8 до 63Ж, соответствующая ей константа скорости возрастает от 0,175 до 0,343 сек вклад конечной экспоненты в величину 1д уменьшается от 89,4 до 38,5%. Иде одним отличием от тетрадеканаля является то, что с ростом концентрации тридеканаля вклад начальной фазы в общую светосумму хотя и возрастает, однако остается весьма незначительным, не более 12Ж.

Зависимость параметров кинетики затухания от концентрации других участников реакции; люциферазы и ЕШ показала следующее. В присутствии насыщающих концентраций тетрадеканаля (5,4"10~6М) кинетика завтухания свечения остается бифазной независимо от концентрации фермента, причем все параметры процесса при этом не меняются. В диапазоне концентраций рш н0 от Ю-7 до 5 " 10~5М константы скорости затухания свечения остаются постоянными. Последние два наблюдения совпадают с литературными данными (Нав^п^в et аг.,1966).

Таким, образом установлено, что при 22°С затухание биолюминесценции в- реакции с различными алифатическими альдегидами протекает в соответствии с биэкспоненциальной кинетикой, причем характер зависимости параметров кинетики от концентрации для каждого альдегида является специфическим.

Полученные результаты носят принципиальный ^характер, поскольку из анализа кинетики затухания сформированы основные постулаты по механизму преобразования энергии бактериальной люциферазой. Основополагающие схемы, опубликованные в 60-80-е годы, основывались на кинетике затухания, которая подчинялась простому экспоненциальному закону. Повидимому- основная причина заключалась в том, что кинетика затухания свечения в основном анализировалась при использовании в качестве субстрата деканаля, причем в достаточно узком диапазоне концентраций, что по нашему мнению могло внести определенную погрешность в экспериментальный материал и позволила апроксимировать кинетику первым порядком. Вышеприведенные данные показывают, что бифазность затухания в случае деканаля выражена значительно менее ярко, чем, например, с тетрадеканалем или тридеканалем. Основываясь на простой экспоненциальной кинетике постулированы принципиальные моменты об одном типе эмиттера, однооборотности фермента и природе промежуточных интермедиатов (Нав1;:шёв et а1., 1966)

Обнаруженная в наших экспериментах биэкспоненциальная кинетика затухания при температуре 22°С в определенной степени согласуется с описанной Матесоном и Ля триэкспоненциальной кинетикой, установленной в реакции с тетрадеканалем при низких температурах. Различия в числе фаз могут быть обусловлены как меньшим временным диапазоном измерения, так и различиями в условиях проведения эксперимента, прежде всего температурных. Отклонение затухания от кинетики реакции первого порядка позволяет рассматривать возможность формирования и разных типов эмиттерных молекул. Как известно, биолюминесценцию удается зарегистрировать не только в системе, содержащей полностью восстановленный флавин, но и в присутствии супероксид-аниона или гидроксил-радикала и семихинона флавина (presBwood, Hastings, 1979; Kurfurst et al.,1982; Watanabe et al., 1993), ДЛЯ которого характерна исключительная стабильность в связанном с люцифэразой состоянии. Все эти соединения не только не являются чем-то посторонни, но, напротив, обязательно образуются в ходе неферментативного окисления FMN н2 кислородом, и присутствуют в системе как в свободном, так и в связанном состоянии. Таким образом люминесцентная система в течении достаточно длительного времени содержит субстрат', представленный отличными от полностью восстановленного флавина формами. Присутствие всех этих форм в псф8р™ентативной системе содержащей флавин, перекись водорода И альдегид, установлено (Watanabe et al., 1993).

Предположительная последовательность реакций с участием радикальных форм флавина представлена ниже. В качестве эмиттера предполагается бирадикальный комплекс (Pugert, Miohelson6 1972¡Данилов, Егоров, 1981).

H20g + FMN —> PMNH'+HOg"

^ FMNH" > EFH ^¿>fEPHÍ!.OIГ'1->Гшri'!.OIГ■1* * вено I И JI L I J

а/глпшри/гиго)' ясно йсно * v

* RCOOH Е + Р + HgO + hv

Совокупность представленных в литературе и полученных данных дают основания считать, что начальная быстрая стадия (t:0-2o.; Q—>0,1; k1) определяется реакцией с использованием в качестве субстрата полностью восстановленного флавина, конечная, медленная стадия (t > 2о.; Q«0,1; ко), - при использовании радикальных форм флавина.

У.БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫИ АНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИИ.

Одной из актуальнйх задач современной биотехнологии является разработка научных основ использования ферментов для определения микроколичеств биологически активных веществ. Создание биолюминесцентных систем микроанализа крайне перспективно, поскольку спектр практического использования таких датчиков достаточно широк.

Выявленные особенности взаимодействия субстратов с бактериальной люциферазой, подбор специфичных для тех или иных задач микроанализа ферментных препаратов и штаммов бактерий, технологические .закономерности функционирования сопряженных систем и анализ кинетики 'реакции, послужили основой разработки на . основе бактериальной 'люциферазы и интактных клеток фотобактерий высокочувствительных систем биолюминесцентного микроанализа для практического применения в энтомологии, медицине, биотехнологии и охране окружающей среды.

Выявленные регуляторные элементы биолюминесцентного процесса, изученные закономерности взаимодействия субстратов с ферментом, принципы функционирования сопряженных систем и■особенности кинетики реакции, использованы в разработке высокочувствительных люминесцентных биосенсоров.

УЛ. СИСТЕМЫ БИОЛШИНЕСЦЕНГНОИ ДЕТЕКЦИИ ФЕРОМОНОВ НАСЕКОМЫХ АЛЬДЕГИДНОЙ И СПИРТОВОИ ПРИРОДЫ.

Современная интегрированная программа защиты растений от вредителей включает в качестве одного из важнейших разделов биологические методы, и в первую очередь применение феромонов насекомых. Широкую группу половых феромонов чешуекрылых Ьар1йс^ега и некоторых., видов жесткокрылых Са1ес^ега составляют ненасыщенные алифатические альдегиды. Структурно альдегиды-феромоны характеризуются дшвоЦ цвпн от 10 до 18 атомов углерода, наличием двойных связей в разных положениях и цис-транс изомерией.

. В применении к макроанализу половых фережшов насекомых разрабатывалась новая система детекции, уникальностью которой являлось использование в качестве детектора феромонов фермента - бактериальной люциферазы, для которое алифатические альдегиды с длиной цепи 6-18 атомов углерода являются субстратами, осуществлящими эффективную генерацию световой эмиссии.

Не меньшую группу, чем альдегидные феромоны у насекомых составляют феромоны спиртовой природы, функционируйте в одних случаях

как предшественники альдегидов, в других - непосредственно как основные и минорные компоненты. Основные технологические решения биолюминесцентной детекции альдегидных феромонов заложены и в основу анализа спиртовых соединений, однако в этом случае аналитическая система состоит не из одного фермента, а из двух: вспомогательного -алкогольдегидрогеназы и основного - люциферазы, первый из которых обеспечивает энзиматическое окисление спирта до соответствующего альдегида, второй, используя этот продукт в качестве субстрата, генерирует свет.

Разработка систем биолюминесцентной системы включает в себя комплексное решение целого ряда проблем: выбор ферментного препарата, оптимизацию физико-химических параметров и вспомогательных операций.

V.1.1.ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ БАКТЕРИАЛЬНОМ ЛЮЦИФЕРАЗЫ В КАЧЕСТВЕ БИОСЕНСОРОВ ФЕРОМОНОВ НАСЕКОМЫХ.

Выбор ферментного препарата на роль биосенсора альдегидов в первую очередь оценивается удельной активностью (не менее ГО^-Ю14 квант х сек-* х мг-1). Порог чувствительности и диапазон количественной оценки существенным образом зависит и от другого параметра - уровня эндогенной активности. Данные критерии использованы в качестве основных при получении аналитических препаратов ферментов из разных видов бактерий. Наиболее оптимальным препаратом на роль биосенсора феромонов насекомых признана высокоочищенная люцифераза из

V. 1гаг7еу:и

Количественный анализ альдегидов - феромонов показал, что величина биолкминесцентного ответа меняется линейно в логарифмических координатах с ростом концентрации в пределах 3-4,5 порядков с порогом чувствительности 10-100 пикограмм для разных соединений.

На рис.Ю представлена зависимость величины биолюминесцентной интенсивности люциферазы из V. Ьагуеу! от содержания в реакционной смеси г-Э-гексадеценаля. Близкие зависимости получены для г-П-гексадеценаля, гг-б, 11-гексадекадиеналя и других изомеров с 16 атомами углерода.

Концентрационная зависимость интенсивности эмиссии для каждого структурного изомера является основой количественного анализа альдегидных феромонов как при их идентификации в биологических тканях или в воздухе, так и в технологии промышленного синтеза препаративных форм и изготовления феромонных ловушек. Предел чувствительности ограничивается за счет фоновой эмиссии на эндогенном субстрате.

1,0.е.

100 -

10 -

1,0.0.

Рис.10

0,1 1,0

ъ-Э - гексадеценаль, пмоль.

- 0 у

- 9/

/ °

О у/

0 У /о

1 1 \ 1

Рис.II

12 3 4

экстракт желез Ди-ЬЬегаеа решу!, %.

РисЛО. Зависимость биолшинесцвнтного ответа люциферазы ( 1риин ) из

х МхчДр

У.Ьагтеу! от концентрации г-9-гексадеценаля.

Рис II. Зависимость свечения люциферазы из У.Ьагуеу! ( ) от

концентрации экстракта желез дубового шелкопряда А.ретоуз.. экстракт желез 20 самок принят за 100 %. ^

Эндогенный субстрат не выжигается в циклической реакции сопряженной системы с лактатдегидрогеназой. Незначительное снижение уровня эндогенной эмиссии было достигнуто на иммобилизованном на Сефарозе-4В препарате, однако при этом существенно снижалась удельная активность фермента.

В целях разработки эффективной системы детекции с использованием бактериальной люциферазы на феромоны спиртовой природы были подобраны и оптимизированы концентрации компонентов и условия проведения реакции в двух аналитических режимах:

- при лимитировании люминесцентной реакции по двум субстратам: NADH и альдегиду;

при лимитировании люминесценции только алифатическим альдегидом.

В качестве потенциальных биосенсоров были использованы два типа биолюминесцентных препаратов. Ферментный препарат из v. fisoheri представлял собой биферментный комплекс с оксидоредуктазной и люциферазной активностью с чувствительностью к NADH до 10~12 моль. Препарат высокоочищенной люциферазы из Y. harveyi характеризовался пороговой чувствительностью к С14 и Cjg-альдегидам до 5'10-14 моль.

Наибольшая эффективность детекции обеспечивалась системой с использованием в качестве биосенсора люциферазы из V. harveyi и дрожжевой алкогольдегидрогеназой в качестве вспомогательного фермента, при запуске реакции РЫШ2.

Значения пороговой чувствительности для насыщенных и ненасыщенных (С14-С16) алифатических спиртов - 10-100 пмоль. Концентрационные зависимости линейны в пределах трех порядков концентраций.. Установлено, что субстратная специфичность алкогольдегидрогеназы в значительно меньшей степени определяет порог чувствительности и общую скорость реакции сопряженной системы, чем сродство люциферазы к продуктам реакции АДГ- - альдегидам. Оптимум рН сопряженной системы -8,0.

V.1.2. БИОЛШШЕСЦЕНТНЫИ АНАЛИЗ ФЕРОМОНОВ В ПОЛОВЫХ ЖЕЛЕЗАХ НАСЕКОМЫХ.

Результаты биолюминесцентного анализа феромонов в половыхжелезах оказались в хорошем соответствии с ГЖХ-методом. Содержание феромонов в железах Autheraea pernyi, в контролируемых физиологических условиях составило от 0,56±1,4 до 4,7^5,6 нанограмм на железу .

На рис.11 представлен биолюминесцентный анализ феромонов в половых железах китайского дубового шелкопряда Autheraea pernyi.

Чувствительность метода позволяет ограничиться содержанием желез одной самки.

У.1.З.. РАЗРАБОТКА СИСТЕМ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА ФЕРОМОНОВ В АТМОСФЕРЕ.

Анализ половых феромонов насекомых непосредственно в газовой фазе играет крайне важную роль в контроле за состоянием феромонных ловушек и промышленных препаративных фор.'., и позволяет экспроссно регулировать поведение насекомых. К методам анализа феромонов в атмосфере предъявляются серьезные требования в связи с крайне низкой концентрацией и нестабильностью этих летучих веществ.

В разработке систем биолюминесцентной детекции феромонов в атмосфере с использованием бактериальной люциферазы в качестве основного принципа принята двуступенчатость операций: первая стадия -перевод гидрофобного вещества из газовой фазы в жидкую, вторая -количественная оценка содержания этого соединения в определенном объеме жидкости биолюминесцентным методом.

Выделение летучих веществ из газовой фазы осуществлялось адсорбцией на гидрофобном адсорбенте Парапак а (50-80 меш.), с последующей элюцией адсорбированного феромона этанолом, и низкотемпературной (-60°С) конденсацией феромона в замороженных ловушках, В качестве аналитического датчика использовалась люцифераза ИЗ V. Ьагуеул..

• Биолюминесцентный детектор успешно применен для оценки относительных скоростей испарения феромона хлопковой совки й-П-гексадеценаля из капсул ХС-1 при естественном процессе испарения в лабораторных условиях (22°С). Чувствительность метода позволяет анализировать относительную скорость испарения при содержании альдегида в носителе до 10 мкг на капсулу.

Метод конденсации гидрофобных соединений газовой фазы в замороженных ловушках отличается большей экономичностью и быстродействием по сравнению с системой адсорбции на гидрофобном адсорбенте.

7.2. БИОЛШИНЕСЦЕНГНЫИ АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ И ИЗОФЕРМЕНТОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА.

При ишемической болезни сердца, гепатите, различного рода мышечных дистрофиях в организме существенно меняется активность ряда ферментов. Лактатдегидрогеназа является одним из ключевых ферментов, уровень активности которого используется в клинической медицине в

1СГ1

г*

1,5 ~

1,0 -

0,5

10 плазма, %

Рис.13

100 200 300 фенол мг/л

Рис.13. Зависимость свечения биолюминесцентной ферментной системы из v.г1есьег1 от концентрации изоферментоа плазмы крови человека, плазма инкубировалась при 25е* (I), 56^ (2), 65° (3) в течении 30 минут. Рис.14. Биотест на основе интактных клеток У.:ьагуеу1. уровня тушения свечения от концентрации токсинов.

качестве важного диагностического.признака. Для определения активности НАБ-зависимых дегидрогеназ в плазме крови человека, в частности ЛДГ и изоферментов ДДГ, разработан биолкминесцентный метод анализа. В основе биолюминесцентного анализа ЛДГ заложен принцип формирования сопряженной ферментной системы:

При избытке лактата, nad, субстратов люциферазы, уровень интенсивности биолюминесценции будет служить индикатором активности ЛДГ. В роли аналитического датчика использована очищенная ферментная система из бактерий Vibrio fieoheri. Процедура получения препарата позволяла сохранить прочное сопряжение между nadh-гш-оксидоредуктазой и люциферазой, что, как известно, в первую очередь определяет порог чувствительности к nadh. Ферментный препарат характеризовался высокой стабильностью (потеря активности при хранении при -20°С составляла не более 10%), и достаточно высокой чувствительностью к nadh (Ю-9М). Биолюминесцентная активность хорошо коррелирует с результатами спектральных измерений (к=0,9-0,95), хотя по чувствительности превосходит спектральный метод на несколько порядков.

На рис.12 представлен биолкминесцентный анализ активности изоферментов ДДГ плазмы, полученных после проведения термоинактивации. Разработанная процедура биолзоминесцентного анализа применима для определения активности других NAD(Р)-зависимых дегидрогеназ. ' Анализ ферментов, коферментами которых не являются пиридиннуклеотиды может быть реализован с дополнительным введением вспомогательных ферментов. Принципиальную важность играет высокая чувствительность метода, позволяющая проводить комплексный анализ ферментативных активностей, в том числе изоферментную активность, в минимальном количестве биологического материала.

На основе светящихся бактерий разработан биосенсор для контроля за состоянием окружающей среды. Изучен механизм действия токсинов на эмиссионную активность клетки и на биолюминесцентную ферментную систему различными группами токсичных веществ, в том числе тяжелыми металлами, фенолами, пестицидами (рис.13). Ингибиторный эффект

V.3. БИОТЕСТ НА ОСНОВЕ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИИ

токсических веществ во многих случаях коррелирует с реакцией других биологических организмов и величина 50-ного тушения свечения - Х50 коррелирует с величиной ы>50. Экспрессность, высокая чувствительность, экономичность, широкий спектр анализируемых веществ являются основными преимуществами биотеста на основе фотобактерий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На различных уровнях структурной организации: клетка, биолюминесцентная ферментная система, люцифераза, - изучены процессы и факторы, осуществляющие формирование альдегидных субстратов бактериальной люциферазы, обеспечивающие пул восстановленного флавина и контролирующие эмиссионную активность люциферазы непосредственно на уровне взаимодействия субстратов с ферментом. У светящихся бактерий открыт и исследован новый процесс, протекание которого приводит к образованию соединений со структурой альдегидных субстратов бактериальной люциферазы, - горекисное окисление липидов. В результате параллельного исследования процессов образования альдегидных субстратов и перекисного окисления липидов в полиненасыщенных жирных кислотах, растительных липидах, липидах из светящихся бактерий, установлено, что во всех исследованных объектах окислительный процесс сопровождается образованием длинноцепочечных алифатических альдегидов, способных эффективно стимулировать биолюминесцентную реакцию.

Принципиальное значение имеют эксперименты по анализу этих процессов in vivo в растущей культуре светящихся бактерий. Наличие корреляция между биолюминесцентной активностью и интенсивностью ПОЛ. в клетках фотобактерий указывает на прямую связь этих процессов, осуществляемую через пул длинноцепочечных алифатических альдегидов.

Вместе с тем, пероксидазный механизм образования альдегидных субстратов в бактериальной клетке in vivo не исключает возможности образования длинноцепочечных альдегидов альтернативными путями, в частности в NADPH, АТР-зависимом редуктазном пути. Кроме этого процесса нельзя исключить возможности образования длинноцепочных алифатических альдегидов в темновых оксигеназных реакциях или в алкогольдегидрогеназной реакции, исследованной в данной работе. Стимуляция биолюминесценции продуктами гидролиза плазмалогена указывает, что подобный процесс также может служить источником альдегидных субстратов в клетках фотобактерий.

ЕН

И н

пероксидация\^

ч'он

гидроксилирование

иоон

ажоголь-ДГ

НС^ОН

(РМК Я,, 02)х

окисление н„0)

»ли *

альдегид-ДГ '

люцифераза'

световой путь исоон

темновой. путь

лссюн

ЕН, И Н

насыщенные и ненасыщенные предшественники

длинноцепочечных алифатических альдегидов (алканы, алкеш, жирные

(С6-СТд)алифатические альдегиды, ИСН^ОН - длинноцепочечные алифатические спирты, НСООН - жирные кислоты.

Рис.14. Схема основных путей образования и утилизации длинноцепочечных алифатических альдегидов в клетках светящихся бактерий.

На рис.14 представлена . общая схама предполагаемых путей образования альдегидных субстратов в клетках фотобактерий. Как видно из схемы образование альдегидного субстрата может протекать разными путями, в том числе при восстановлении соответствующей жирной кислоты, в ходе действия алкогольдегидрогеназы, при гидроксилировании алифатических предшественников оксигеназами, при пероксидации липидов. Логичного объяснения, отдающего предпочтение тому или иному процессу формирования нсно из представленных на схеме, нет. Серьезным аргументом, свидетельствующим о вовлеченности процессов перекисного окисления липидов в биолюминесцентный процесс служит высокая степень корреляции между ними.

Наряду с этим бактериальные липиды выполняют структурную функцию. В люминесцентной ферментной системе лияидные структуры обеспечивают "сопряжение" электронтранспортной цепи на этапе переноса электронов йежду Ш)(Р)Н:РШ-о/редуктазой и люциферазой и поддерживают восстановленное состояние флавинового .субстрата.- Необходимость высокоэффективного сопряжения цепи связана с высокой скоростью

кислоты, другие липидные компоненты), ЮОН гидроксилированные интермедиа™, ИСНО

гидроперекиси, Б ОН -длинноцепочечные

неферментативного аутоокисления fmhh2 кислородом (к = юс~1).

Результаты экспериментов с фосфолипазами в сочетании с опытами по анализу термодинамических параметров "безальдегидной реакции" позволяют объяснить Феномен т.н. "эндогенной эмиссии". Источником альдегидного субстрата в данном процессе служат прочно связанные липиди, содержащие эндогенный "альдегидный фактор". Повидимому липидный компоннт принимает участии в формировании гидрофобной зоны фермента.

Особую важность для выяснения механизма свечения играют данные по влиянию на люминесцентную активность люциферазы структурных и конформационных параметров альдегидного субстрата. Результаты подтверждают мнение других авторов (Holzman, Baldwin, 1982, 1983) о неупорядоченном связывании альдегида с люциферазой. Предполагаемое в ■ранних работах (Hastings et al., 1965; Hastings, 1968) упорядоченное связывании флавинового и альдегидного субстратов с образованием смешанного флавин-альдегид пероксида, - пероксиполуацеталя, . не подтверждаются полученными результатами. Повидимому в связывании альдегидных субстратов основную роль играет гидрофобность молекулы. Вместе с тем эксперименты с изомерами ненасыщенных альдегидов показывают, что существенный вклад вносят конформационные характеристики альдегида. Таким образом эффективность альдегидов в биолюминесцентном процессе определяется двумя параметрами: гидрофобностью молекулы и положением функциональной группы в активном центре фермента. Предположительно функциональная группа альдегида должна определенным образом ориентироваться относительно высокореактивной SH-группы, расположенной непосредственно в гидрофобной зоне фермента. Повидимому, связывание альдегида происходит в две последовательные стадии, как это предполагается в работе (Ти, Henkin, 1983): нековалентную (гидрофобное взаимодействие) и ковалентную (реакция- с SH-группой с образованием тиополуацеталя) (Nicoli et al., 1974). Химическая модификация SH-группы альдегидом приводит к изменению конформации в зоне связывания субстратов. Возможно, конформационные изменения играют существенную роль при формировании эмиттера (Hastings et all, 1965). Как показано в работе (AbouKhair et all., 1985), после прохождения каталитического цикла люцифераза находится в течении длительного времени в измененном конформационном состоянии, при этом резко меняется чувствительность фермента к алкилирущим агентам. Релаксация к основному конформационному состоянию протекает с полупериодом ~ ^Омин,

0°С. Вовлечение в процесс преобразования анергии люциферазой

- -

радикальных форм флавина позволяет объяснить природу длительной эмиссии в системе, не содержащей РЮШ2. С учетом того, что на всех стадиях биолюминесцентного процесса скорость-лимитирувдей стадией остается разрыв с-н связи, биэкспоненциальность кинетики затухания биолюминесценции указывает на формирование двух разных эмиттерных молекул в реакции, инициируемой полностью восстановленным флавином. Структурное различие эмиттеров может быть связано с участием разных форм флавина и кислорода. Как отмечено в с недавно опубликованной работе (Watanabe et al., 1993) возбузденный комплекс может образовываться в реакции нейтрального радикала флавина с супероксидным радикалом кислорода, а также с гидроксил-радикалом. В соответствии о полученными данными можно полагать,что радикальные формы флавина способны обеспечивтъ длительную эмиссию с низким выходом квантов при наличии в системе перекиси водорода. Результаты согласуются и с данными работ Ли с соавторами (Hatheson, Lee, 1983; Lee, 1985), полученными при низких температурах. Авторы предполагают формирования при низких температурах трех типов эмиттерных молекул.

На основании большого экспериментального материала установлено, что целая груша ненасыщенных альдегидов обладает большей эффективностью, чем тетрадеканаль, что в сочетании с результатами анализа хирнокислотного состава не позволяет считать тетрадеканаль природным альдегидным субстратом. Скорее всего эту функцию в клетке выполняют множество разных альдегидных молекул.

Совокупность полученных результатов подтверждает единство люминесцентной системы бактерий с монооксигеназными системами других объектов, функциональная особенность люминесцентной монооксигеназной системы заключается в высокой специфичности в отношении липофильных альдегидов. Бактериальная люминесцентная система поддерживает низкий уровень этих соединений в мембранах, выполняя тем самым защитную функцию. Одновременно избыточная энергия выделяется в виде светового потока.

Изученные закономерности функционирования биолюминесцентной системы бактерий in vivo и in títro использованы в качестве основы в разработке принципов применения биосенсоров на основе интактных клеток фотобактерий, биолюминесцентных ферментных комплексов и непосредственно бактериальных люцифераз, для анализа ферментов и метаболитов, половых феромонов насекомых, токсинов и других соединений. Отличительной особенностью биолюминесцентного микроанализа является высокая чувствительность, специфичность и быстродействие.

выводы

1.- Установлена взаимосвязь между процессом перекисного окисления липидов и биолюминесценцией у светящихся бактерий. Связь осуществляется через пул алифатических альдегидов - продуктов первого процесса и субстратов второго.

2. - Показано формирование альдегидных субстратов бактериальной люциферазы' при перекисном окислении полиненасыщенных жирных кислот, растительных липидов, липидов из светящихся бактерий. Образование этих соединений может осуществляться как неферментативным путем, так и ферментативно.

3. - У светящихся бактерий идентифицированы ферментные системы, способные катализировать процесс пероксидации бактериальных липидов.

4.- В качестве новых альтернативных путей формирования альдегидного субстрата показаны процессы образования альдегидных субстратов люциферазы при ферментативном окислении длинноцепочечных алифатических спиртов и при гидролизе плазмалогенов.

5.- Установлено участие липидного компонента в структурной организации биолюминесцентной ферментной системы. Липидный компонент обеспечивает "сопряжение" цепи переноса электронов между NAD (Р )н-РШ-оксидоредуктазой и люциферазой, поддерживая восстановленное состояние флавиного субстрата.

6.- Показано непосредственное вовлечение в процесс биолюминесценции радикальных форм флавина, обеспечивающих этсйто с низким выходом квантов. Предполагается формированиие разных типой эмиттеров в реакции с полностью восстановленным фдавином и радикальными формами флавина.

7.- Установлена ключевая роль структурных элементов молекулы альдегида: длины цепи, числа, положения и изомерии двойных связей на эффективность преобразования химической энергии в световую. В ряду исследованных ненасыщенных альдегидов наибольшей эффективностью в генерации квантов света обладает ряд изомеров с 16 углеродными атомами, в то время как среди насыщенных альдегидов наиболее активен тетрадеканаль. .

8.- Показано, что эффективность альдегидов в биолюминесцентном процессе определяется двумя основными критериями: степенью гидрофобности альдегидного субстрата и положением функциональной группы в активном центре фермента.

9.- Экспериментально подтверждено мембранное происхождение люминесцентной системы бактерий. Наиболее вероятно расположение

* <

люминесцентной ' электронтранспортной цепи на границе раздела фаз внутренней мембраны клетки.

10.- Обоснована защитная функция люциферазы. Можно полагать, что фермент предотвращает накопление липофильных альдегидов в клетке.

11.- Разработаны научно-практические основы применения бактериальной люциферазы и интактных клеток фотобактерий в качестве аналитических датчиков на различные биологически активные соединения, в том числе половые феромоны насекомых, ферменты плазмы крови человека, токсины. ■

• *

Список публикаций по теме диссертации.

1. Исмаилов А.Д., Л.И.Богуславский, Л.С.Ягукинский, В.П.Скулачев. Генерация потенциала на бислойных липидных мембранах в системе "NADH-FMN-Q6-02h. ДОКЛ. АН СССР, 1973, Т.210,N 3, С.709-712.

2. Исмаилов А.Д., Л.И.Богуславский, Л.С.Ягукинский. Генерация потенциала на бислойных липидных мембранах в системе "NADH-FMN-Qg-o2". Тез. докл. Биофизика мембран. Паланга, 1973, с.73.

3. Исмаилов А.Д., Л.И.Богуславский, Л.С.Ягукинский. Генерация потенциала на бислойных липидных мембранах, содержащих Fe+3 и убихинон при протекании окислительно-восстановительных реакций на границах раздела. Докл. АН СССР, 1974, т.216. N 3, с.674-677.

4. Boguslavßky L., L. Yaguzhinsky, A. Iemailov. Reaotion of mitiohondrial NADH-dehydrogenase coenzymes on bilayer lipid membranes Bioeleotroohemistry and Bioenergetios. 1974, v.4, p.155-165.

5. Yaguzhinsky Ъ., b.BoguslavBky, A. Ismailov. Potential generation on bilaer lipid membranes in the NADH-Plavinmononuoleotide-Ubiguinon-Og Bystem. Bioohim. Biophye. Aota., 1974, v.368, p.22-29-

6. Исмаилов А.Д., Данилов B.C., Егоров H.C. С0-связывапцие гемопротеиды люминесцентных бактерий. Цитохром Р-450., Докл. АН СССР, 1979,Т.249, N 2, С.482-485.

7. Исмаилов А.Д., Данилов B.C. Мембранная организация бактериальной люциферазы. Тез. II Всесоюзн. конф. "Современные проблемы биологии", Тбилиси, 1980, с.125.

8. Danilov Y.S., Iemailov A.D., Malkov Yu.A. PINS symposium on miorobial envelopes, Pinland, 1980, Ref. 104.

9. Баранова H.A., Исмаилов А.Д., Егоров Н.С., Данилов B.C. Цитохромы люминесцентных бактерий Photobaoterium fisoheri, их солюбилизация и связь со свечением. Микробиология, 1980, т.49, N 4, с.477-482

10. Исмаилов А.Д., Баранова H.A., Егоров Н.С.,. Данилов B.C. Электронтранспортная система люминесцентных бактерий Photobaoterium fisoheri., Микробиология, 1980, т.49, N 3, 0.379-383.

11. Исмаилов А.Д., Малков Ю.А., Данилов B.C., Егоров Н.С. Ингибиторный анализ электронтрансгортной люминесцентной цепи. Биохимия, 1981, Т.46, N I, с.40-46.

12. Исмаилов А.Д., Баранова H.A., Данилов B.C., Егоров Н.С. Ингибирование бактериальной люминесценции субстратами оксидаз смешанных функций.. Биохимия, 1981, т.46, N 2, с.234-238.

13. Данилов B.C., Исмаилов ¿.Д., Малков Ю.А., Егоров Н.С. Взаимодействие алифатического альдегида с цитохромом Р-450 в реакции бактериальной биолюминесценции. Биоорган, химия, 1981, т.1, с.68-73.

14.Данилов B.C., Исмаилов А.Д., Малков Ю.А., Егоров Н.С. Особенности периодического и непрерывного культивирования люминесцентных бактерий Photobaoterium fieoheri. Тез. III Всесоюзн. ковфер. "Теория и практика непрерывного культивирования микрорганизмов", Киев, Наукова думка, 1981, с.27.

15. Егоров Н.С., Данилов B.C., Баранова H.A., Исмаилов А.Д, Штамм Photobaoterium fieoheri - продуцент люциферазы. Авт. Свидетельство N 761554, 1981г.

16. Danilov У.S., Baranova N.A., Iomailov A.D. The oamphor effeot on baoterial biolumineeoenoe. Eur. J. Appl. miorobiol. Bioteohnol., 1982, v.14, p.125-131.

17. Исмаилов А.Д. Использование люминесцентной системы бактерий в анализе ферментов и метаболитов. Tes. I Всесоюзного биоСнзнч. съезда. Москва, 1982, т.4, с.46. 1

18. Данилов B.C., Беляева O.A., Исмаилов А.Д^, Егоров И.О. Способ определения активности НАД-зависимых дегидрогенаа плазмы крови. Авторск. свидетельство N 1043568, 1963г. *

19. Исмаилов А.Д., Данилов B.C., Егоров К.О. Исследование активности NAD-зависимых дегидрогеназ плазмы крови человека с использованием растворимой и иммобилизованной бактериальной люциферазы. Докл. АН СССР, 1983, т.270, N 5, с.1239-1242.

20. Исмаилов А.Д., Данилов B.C., Егоров Н.С. Исследование активности лактатдегидрогеназы и ее изоферыентов в сопряженной системе■ с бактериальной люциферазой. Вопр. мел. химии, J984, т.30, N 6, с.45-50. ■

21. Danilov V.S., Ianailov I.D., Baranova N,A. The Inhibition of baoterial bioluminesoenoe by xenobiotioe. Xenobiotioa, 1985, v.15, Я 4, p.271-276. . •

22. Исмаилов А.Д., Сахаров Г.Н., Данилов B.C., Ковалев Б.Г., Стрельский В.В., Егоров Н.С. Виолшинесцентный анализ феромонов насекомых альдегидной природы. Докл. АН СССР, 1985, т.281, н 4, с.990-993.

23. Исмаилов А.Д., Сахаров Г.Н., Данилов B.C. Бактериальная люцифераза в качестве биодетектора в технология синтеза и идентификации феромонов насекомых. Tes. Y Все сотового симпозиума по инженерной энзимологии. Кабулети, 1985, с.185.

24. Исмаилов А.Д., Ковалев Б.Г., Сахаров ГЛ., Стрельский В.В.,

» •

Данилов B.C., Егоров Н.С. Бактериальная люцифераза в качестве биодетектора феромонов насекомых. Биоорганическая химия, 1986, т.12, и 5, с.633-639.

25. Исмаилов А.Д., Ковалев Б.Г., Сахаров Г.Н., Стрельский В.В., Данилов B.C. Биолюминесцентный анализ ненасыщенных алифатических альдегидов - феромонов насекомых. В сб. "Феромоны листоверток -вредителей сельского и лесного хозяйства", Тарту, 1986, с.341-342.

26. Исмаилов А.Д., Бактериальная люцифераза в качестве бисенсора феромонов насекомых. Тез. Всесоюзн. конференц. "Еиохемилюминесценция в медицине и сельском хозяйстве", Ташкент, 1986.

27. Сахаров Г.Н., Исмаилов А.Д., Данилов B.C¿ Взаимодействие ненасыщенных алифатических альдегидов с бактериальной люциферазой. Тез. YII Всесоюзн. микроб, об-ва, 1985, т.2, с.132.

28. Сахаров Г.Н., Исмаилов А.Д., Ковалев Б.Г., Данилов B.C., Егоров Н.С.. Взаимодействие С14 и Cj6 ненасыщенных алифатических альдегидов с бактериальной люциферазой. Биохимия, 1986, т.51, N 9, с.1459-1464.

29. iBmailov A.D., Sobolev A.Yu., Danilov V.S. Complex biolumlnesoenoe decay kinetios in the in vitro, reaction of bacterial luoiferaBe with different aliphatio aldehydes. Abst. Y Int. Symp. on BiolumineBoenoe and ohemilumineBoenoe., Florence. Italy.,J. Biolumin. ohemilumin., 1988, v.2, N 4, p.216.

30. Исмаилов А.Д., Рахимов M.M., Данилов B.C. Участие фосфолипидов в структурной организации биолюминесцентной системы бактерий. Тез. докл. ГУ Всесоюзн. конфер. "Биосинтез ферментов микроорганизмами". Ташкент, 1988, с.189.

31 Сахаров Г.Н., Исмаилов А. Д. Применение бактериальной лвциферазы для оценки качества феромонных диспенсеров. Тез. докл. iy Всесоюзн. конфер. "Биосинтез ферментов микроорганизмами". Ташкент, 1988, с.254.

32. Сахаров Г.Н., Исмаилов А.Д., Данилов B.C. Экспресс-анализ скоростей испарения диспенсерами феромона хлопковой совки цис-И-гексадеценаля. Тез. докл. !Y Всесоюзн. симпоз. по хеморецепции насекомых. Вильнюс, 1988, с.45.

33. Сахаров Г.Н., Исмаилов А.Д., Данилов B.C. Температурные зависимости реакции бактериальной лвциферазы из Beneokea harveyi и Fhotobaoterium fischeri. Биохимия, 1988, т.53, N 6, с.891-898.

34. Киселева Е.Г., Исмаилов А.Д., Данилов B.C. Биолюминесцентный анализ микроколичеств длинноцепочечных алифатических спиртов феромонов насекомых. Тез. докл. iy Всесоюз. симпоз. по хеморецепции

насекомых. Вильнюс, 1988, с.32.

35. Киселева Е.Г., Исмаилов А.Д. Анализ этанола с использованием бактериальной люциферазы. Тез. докл. IY Всесоюзн. конфер. "Биосинтез ферментов микроорганизмами". Ташкент, 1988, с. 205.

36. Киселева Е.Г., Исмаилов А.Д., Данилов B.C. Способ определения количества высокомолекулярных спиртов в . растворе .Авторск. свидетельство N 1495382, 1989г.

37. Савов В., Исмаилов А.Д. Биохемилюминесценция - прикладные возможности в науке и технологии. Изд СО "Програмни продукта и системы". София, 1989, 42с.

38. Danilov Y., Ismailov A. Bacterial luoiferaee as a biosensor of biologioally aotive compaunds. In "Appliad biosensors", D. Wise ed., Boeton, 1989, p.39-78.

39. Iemailov A.D., Beriya L.V., Danilov V.S. The application of

bacterial luoiferase for stady oí Fe - -induced lipid peroxidation. Int. Qonf. Regul. Free Radioal Reaot. (Biomed aspects)., Vama-Sofia,

1989, p.129.

40. Соболев А.Д., Исмаилов А.Д., Данилов B.C. Отклонение от кинетики первого порядка при затухании биолюминесценции в реакции бактериальной люциферазы с тетрадеканалем". Докл. АН СССР, 1989, Т.305, N 5, c.I258-I26I.

41. Соболев A.D., исмаилов А.Д., Данилов B.C. Кинетика биолюминесценции в реакции бактериальной люциферазы с различными алифатическими альдегидами. Биохимия, 1989, т.54, N 2, с.2061-2065.

42. Исмаилов А.Д. Црименение бактериальной люциферазы в анализе длинноцепочечных алифатических спиртов и альдегидов в атмосфере. Тез. докл. Все е., конфер. "Метода, получения, анализа и применения ферментов"., Ормала, 1990, с.183.

43. Ismailov A.D., Sobolev A.Yu., Danilov V.S. Bioluminesoence decay KinetioB in the reaotion of bacterial luoiferase with different aldehydes. J. Biolumin. Chemilumin., 1990, v.5, N 3, p.213-217.

44. Берия Л.В., Исмаилов А.Д. Применение бактериальной люциферазы в экспресс анализе перекисного окисления липидов. Тез. докл. Всес. конферен. '.Метода получения, анализа и применения ферментов". Юрмала,

1990, с.184.

45. Ганшин В.М., Исмаилов А.Д., Данилов B.C. Действие фосфолипаз на биолюминесцентную активность люциферазы светляков и бактериальной люциферазы . Биохимия, 1990, т.55, N 2, с.285-292.

46. Данилов B.C., Ганшин В.М., Исмаилов А.Д., Зарубина А.П., Выпияч А.Н., Маркелова С.И., Соболев А.Ю. Биолюминесцентный

токсикологический тест "Эколюм". Тез. докл. yü Всесоюз. симпоз. по инженерной энзимолгии "Получение и применение биокатализаторов в народном хозяйстве и медицине". Москва, 1991, с.124.

47. Киселева Е.Г., Исмаилов А.Д., Данилов B.C. разработка систем Сиолюминесцентной детекции длинноцепочечных алифатических спиртов. Биотехнология, 1991, т.2, с.78-81.

48. Берия Л.И., Исмаилов А.Д., Данилов B.C. Перекисное окисление липидов в процессе роста и развития биолюминесценции у бактерий Vibrio harveyi. Микробиология, 1991, т.60, N I, с.77-83.

49. Берия Л.В., Исмаилов А.Д., Данилов B.C. Стимуляция биолюмиесцентной активности бактериальной люциферазы продуктами Ре+2-индуцированного перекисного окисления липидов .Биохимия, 1991, Т.56, С.477-486.

50. Исмаилов А.Д., Соболев А.Ю., Данилов B.C. Альдегид-зависимсые биолюминесцентные системы микроанализа .Тез. докл. Y11 Всесоюзн. симпозиума по инженерной энзимологии. Москва, I99Í, с.24-25.

51. Зарубина А.П., Выпияч А.Н., Маркелова С.И., Соболев А.Ю., Исмаилов А.Д., Данилов B.C. Разработка на основе люминесцентных бактерий систем экспресс-мониторинга состояния окружающей среды. Тез. докл. Y Венесоюз, конфер. РФ "Новые направления в биотехнологии". Пущино, 1992, с.154.

52. Исмаилов А.Д,, Берия Л.В., Данилов B.C. Образование альдегидного субстрата бактериальной люциферазы в ходе индуцированного ультрафиолетовым светом перекисного окисления липидов. Биохимия, 1994, т.59, n 4, с.519-524.

ЬЗ.Исмаилов А.Д., Берия Л.В., Данилов B.C. Ферментативный и неферментативный процессы перёкисного окисления липидов в бесклеточном экстракте Vibrio harveyi. Микробиология, 1994, т.63, N ЗБ, с.466-471.

Типография ордена "Знак Почата" издательства МГУ

119899.Москва.Ленинские горы Заказ Л ' Тираж экз.

Информация о работе

Исмаилов, Анвар Джураевич
доктора биологич. наук
Москва, 1995
ВАК 03.00.02

Автореферат

Бактериальная биолюминесценция: Механизмы образования и взаимодействия с люциферазой альдегидных и флавиновых субстратов - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы