Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Шапероны Hsp60, Hsp70, Hsp100, Триггер Фактор и протеаза Lon как эффективные модуляторы активности люцифераз и белков LuxR мезофильных и психрофильных морских бактерий

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Шапероны Hsp60, Hsp70, Hsp100, Триггер Фактор и протеаза Lon как эффективные модуляторы активности люцифераз и белков LuxR мезофильных и психрофильных морских бактерий"

\

/ На правах рукописи

Горяни[1 Игнатий Игоревич

Шапероны ШрбО, Нзр70, КЬрШО, Триггер Фактор и протеаза Ьоп как эффективные модуляторы активности люцифераз и белков ЬюсЯ мезофильных и психрофильных

морских бактерий

03.02.07 - Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 0 НОЯ 2014 005555680

Москва-2014

005555680

Работа выполнена в лаборатории генетики бактерий Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИ генетика»).

Научный руководитель:

доктор биологических наук Манухов Илья Владимирович

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» ведущий научный сотрудник

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Хмель Инесса Александровна

Институт молекулярной генетики РАН заведующий лабораторией

доктор биологических наук, профессор Доброе Евгений Николаевич

МГУ им. М. В. Ломоносову Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского ведущий научный сотрудник

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН

Защита состоится «/<? » ¡¿СЯЬрЗ- 2014 г. в 12°часов на заседании Диссертационного совета Д 217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, Я 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов», ЬПп://уу\у\у.еепе^каги/

Автореферат разослан « » Н0Я$р% 2014г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета г л-'/'/Л

кандидат химических наук ) Воюшина Татьяна Львовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

За последние годы достигнут значительный прогресс в понимании механизмов работы шаперонов и протеаз, необходимых для преодоления стрессовых воздействий на бактериальную клетку и правильной сборки белков.

В бактериальных клетках в процессе роста образуются неправильно собранные и денатурированные белки, количество которых значительно нарастает при стрессовых ситуациях, а также при суперпродукции гетерологичных белков. Важную роль в преодолении негативных последствий для клетки, возникающих в результате агрегации белков, играют шапероны семейств Hsp60, Hsp70, HsplOO, sHsp и АТФ-зависимые протеазы (Gragerov A I. et al., 1991; Hartl F.U., 1996; Tomoyasu T. et al., 2001). Сравнительно недавно была обнаружена шаперонная активность Триггер Фактора (ТФ), кодирующегося геном tig в геноме бактерий Escherichia coli (Liu С.Р. et al., 2005). В настоящее время продолжают оставаться актуальными исследования механизмов проведения шаперонами рефолдинга денатурированных белков, а также роли шаперонов и протеаз в регуляции экспрессии бактериальных генов, в частности, в регуляторных системах скоординированного ответа (Quorum Sensing, QS). В диссертационной работе для исследования механизмов работы шаперонов в качестве систем, восстанавливающих нативную структуру термоинактивированных белков, и определения роли шаперонов и протеаз в модуляции активности QS систем впервые в качестве модели используются белки, кодируемые генами /га-оперонов психрофильных бактерий. Проводится сравнение активности и специфичности шаперонов и протеаз при использовании в качестве субстратов термостабильных и термолабильных люцифераз и белков-регуляторов.

Необходимо отметить важную роль шаперонов в организме человека, так как нейродегенеративные болезни: болезни Альцгеймера, Паркинсона, Ха1Гтингтона, прионовые болезни - вызываются агрегацией различных групп белков с их конверсией в амилоидоподобпые надмолекулярные структуры (Saibil Н., 2013).

Цели и задачи

Целью данной работы было определение роли шаперонов и протеаз в регуляции транскрипции QS систем и в фолдинге и рефолдинге термолабильных люцифераз, гены которых входят в состав /мх-оперонов психрофильных бактерий Aliivibrio logei и мезофильных Aliivibrio fischen.

Для достижения данной цели были проведены исследования влияния АТФ-зависимых шаперонина GroHL/GroHS (семейство HspöO) и протеазы Lon на регуляцию экспрессии генов /¡«-оперонов морских люминесцирующих мезофильных и психрофильных бактерий, исследования участия шаперонов DnaKJE (семейство Hsp70) и ClpB (семейство HsplOO) в фолдинге и рефолдинге термолабильной люциферазы психрофильных бактерий A. logei, а так же исследования рефолдинга, проводимого шапероном ТФ, бактериальных люцифераз, характеризующихся разным уровнем термостабильности. В ходе исследований были поставлены и решены следующие задачи.

1. Определение участия шапероншЮв GroEL/GroES на фолдинг белков LuxRl и LuxR2 психрофильных бактерий A. logei.

2. Определение роли Lon протеазы в процессе деградации белков LuxRl и LuxR2 психрофильных бактерий A. logei.

3. Проведение сравнительного анализа влияния шаперонина GroEL/GroES и Lon протеазы на поддержание активных форм белков LuxRl и LuxR2, регулирующих

транскирипцию /шг-оперонов психрофильных бактерий A. logei, и LuxR мезофильных бактерий А. fischen.

4. Провести сравнительный анализ термостабильности и способности к рефолдингу люциферазы психрофильных бактерий А. Iogei в сравнении с люциферазой мезофильных бактерий A.fischeri, исследовать участие шаперонов в фолдинге и рефолдинге термолабильной люциферазы психрофильных бактерий A. logei.

5. Определение основных параметров ТФ - зависимого рефолдинга термоинактивированных люцифераз. Установление зависимости уровня рефолдинга различных по термостабильности люцифераз от концентрации ТФ и времени действия. Определение влияния шаперонов семейства HsplOO на ТФ-зависимый рефолдинг.

6. Изучение процесса рефолдинга, проводимого ТФ при использовании в качестве субстратов мономерных и димерных форм люцифераз.

7. Проведение сравнительного анализа основных характеристик шаперонной активности ТФ из мезофильных бактерий Е. coli и психрофильных бактерий Psychrobacíer frigidicola. Сравнение зависимости уровня рефолдинга термоинактивированных люцифераз от концентрации и от времени действия ТФ.

8. Изучение влияния ТФ мезофильных бактерий Е. coli и психрофильных бактерий P.frigidicola на жизнеспособность клеток Е. coli. Определение характера кривых ренатурации различных по термостабильности термоинактивированных люцифераз, проводимой ТФ из психрофильных бактерий P.frigidicola. Изучение рефолдинга мономерных и димерных форм люциферазы, проводимого ТФ из психрофильных бактерий.

9. Определение влияния шаперонов семейства HsplOO на рефолдинг, проводимый ТФ из психрофильных бактерий P.frigidicola.

Научная новизна

Впервые показано, что шаперонин GroEL/ES и АТФ-зависимая протеаза Lon участвуют в процессе формирования нативной формы и деградации активаторов транскрипции систем QS LuxR2 психрофильных бактерий А. logei и LuxR мезофильных бактерий A.fischeri. На активность LuxRl A. logei шаперонин GroEL/ES и протеаза Lon не влияют.

Проведено исследование термостабильносги и способности к рефолдингу бактериальной люциферазы A. logei, проведено сравнение с люциферазами из мезофильных бактерий.

Были определены основные параметры процесса рефолдинга термоинактивированных люцифераз проводимого шапероном Триггер Фактором из мезофильных бактерий Е. coli и психрофильных P.frigidicola in vivo в клетках Е. coli. Изучено влияние шаперона ClpB на ТФ - зависимый рефолдинг. Показано, что термостабильные люциферазы характеризуются сравнительно низким уровнем ТФ - зависимого (как и DnaKJE-зависимого) рефолдинга в отличие от термочувствительных люцифераз, которые восстанавливают активность после термоинактивации значительно полнее. Впервые получены данные о том, что рефолдинг мономерных форм люциферазы не проводится ТФ как из психрофильных, так и из мезофильных бактерий.

Теоретическая и практическая значимость работы

Гены /цх-оперонов, обеспечивающих биолюминесценцию морских и наземных светящихся бактерий, в настоящее время находят широкое применение в качестве генов-репортеров в работах по молекулярной генетике, при биохимических анализах, в генно-инженерных работах (селекция) и ряде других. Цельноклеточные биосенсоры,

использующие в качестве генов-репортеров гены luxAB, кодирующие бактериальные люциферазы, используют в работах по экологическому мониторингу, тестированию токсичных агентов в пищевых продуктах, а также в разработках и тестировании новых медицинских препаратов. Проведенное в диссертационной работе исследование о влиянии шаперонов и протеаз на активность активаторов транскрипции систем QS (белки LuxR, LuxRl и LuxR2) может быть использовано для увеличения чувствительности hix-биосенсоров.

Практической значимостью данных по изучению способности к восстановлешда активности после термоинактивации белков, различающихся по термостабильности, представленных в диссертационной работе, является создание разнообразных моделей, что дает возможность выбора наиболее подходящей из них для конкретной задачи изучения механизмов рефолдинга денатурированных белков.

В настоящее время шапероны находят широкое применение в области биотехнологии при конструировании штаммов для суперпродукции гетерологичных белков. Введение в клетку совместно двух плазмид, кодирующих белок-субстрат, и белки-шапероны, позволяет значительно повысить выход растворимых нативных форм белка-субстрата (Schultz et al., 2006; De Marco et al., 2007; De Marco, 2007; Nicoll et al„ 2006; Kolaj et al„ 2009; Doglia et al., 2014). Исследование активности АТФ - независимого шаперона ТФ имеет значение для повышения выхода нативных форм гетерологичных белков при создании продуцентов.

АТФ - зависимые протеазы могут использоваться в качестве ингибиторов систем QS, например, для снижения активности вирулентных генов у патогенных бактерий.

Предполагается провести поиск наиболее активных вариантов ТФ, которые будут использованы для исследования способности ТФ к дезагрегации амилоидоподобных надмолекулярных структур и последующем проведении доклинических испытаний препарата, содержащего шапероны, для терапии нейродегенеративных заболеваний.

Методология и методы исследования

Исследования влияния АТФ - зависимых шаперонина GroEL/GroES и протеазы Lon на регуляцию экспрессии генов /иг-оперонов морских люминесцирующих мезофильных и психрофильных бактерий A.fischeri и A. logei проводились методом сравнительного анализа зависимости интенсивности биолюминесценции клеток, содержащих биосенсорную плазмиду с исследуемым активатором транскрипции в штаммах дикого типа и штаммах Е. coli, мутантных по шаперонину GroELS или протеазе Lon, от концентрации добавленного индуктора и от времени инкубации.

Для сравнительного анализа термостабильности люцифераз из психрофильных бактерий A. logei и мезофильных бактерий A.fischeri проводилось измерение зависимости уровня биолюминесценции от времени термоинактивации в клетках Е. coli, содержащих делецию AdnaKJ. Сравнение способности к рефолдингу люцифераз проводилась in vivo в клетках дикого типа в результате измерения уровня рефолдинга в зависимости от времени инкубации.

Исследования рефолдинга термоинактивированных люцифераз, проводимого ТФ как из мезофильных бактерий Е. coli так и из психрофильных бактерий Р. frigidicola, проводились in vivo в штамме Е. coli, содержащем делению AdnaKJ при экспрессии генов ТФ с введенной в клетки плазмиды. В клетки вводилась также вторая плазмида, обеспечивающая экспрессию генов одной из бактериальных люцифераз. Концентрацию ТФ в клетки регулировали добавлением индуктора, специфического для данного промотора, под контролем которого находятся гены мезофильного или психрофильного ТФ.

В исследованиях DnaKJE - зависимого рефолдинга использовались либо штаммы Е. coli дикого типа с проведением предварительного «теплового шока» (для увеличения количества белков системы шаперонов DnaKJE-ClpB), либо штамм, содержащий делеции по генам dnaK и dnaJ, с введением плазмиды, обеспечивающей продукцию белков DnaKJE.

Данные о влиянии шаперона семейства HsplOO на ТФ - зависимый рефолдинг получены в результате сравнения зависимости максимального уровня рефолдинга от времени в клетках Е. coli дикого типа и мутантных по гену cIpB. Необходимо подчеркнуть, что в этих экспериментах «тепловой шок» для увеличения количества белков системы шаперонов DnaKJE-ClpB не проводился.

В опытах по изучению роли ТФ в рефолдинге термоинактивированных белков in vitro использовалась двухкомпонентная система (R+L), содержащая очищенную люциферазу Pholobacterium leiognathi.

Изучение влияние ТФ из мезофильных бактерий Е. coli и пеихрофильных бактерий P. frigidicola на жизнеспособность клеток Е. coli проводилось согласно размножению клеток Е. coli штамма, содержащего делецию AdnaKJ, при экспрессии гена tig, расположенного под контролем арабинозного промотора (araBAD), различными концентрациями L-арабинозы.

Положения, выносимые на защиту

1. Шаперонин GroELS и протеаза Lon участвуют в процессах контроля нативных форм (формирования и деградации) белка LuxR2 из пеихрофильных бактерий A. logei и белка LuxR из мезофильных бактерий A.fischeri, и не участвует в модуляции активности белка LuxRl A. logei.

2. Люцифераза из психрофильной бактерии A. logei характеризуется равной термостабильностью, но сниженным уровнем DnaKJE-зависимого рефолдинга по сравнению с люциферазой мезофильных бактерий A. fischeri.

3. Рефолдинг термоинактивированных люцифераз, проводимый шаперонами ТФ мезофильных бактерий Е. coli (ГФ/С) и пеихрофильных бактерий P. frigidicola (ТФ?/) примерно совпадает по скорости, уровню, эффекту повышения уровня в отсутствии шаперона ClpB, эффекту снижения эффективности при увеличении термостабильности используемой в качестве субстрата люциферазы и неспособности использования в качестве субстрата мономерных форм люцифераз, что значительно отличает его от DnaKJE - рефолдинга.

4. Повышение концентрации ТФ& в мугантном штамме Е. coli AdnaKJ приводит к снижению жизнеспособности и спаду уровня рефолдинга термоинактивированных люцифераз, однако с повышением концентрации ТФ/у максимальный уровень рефолдинга увеличивается и достигает плато.

Степень достоверности и апробация результатов

Материалы исследования по теме диссертации опубликованы в трех статьях и представлены на V и VI съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров в 2009 и 2014 г., соответственно. Диссертационная работа была апробирована на семинаре секции «Генетика микроорганизмов» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 16 марта 2014 г.

Структура работы

Диссертация изложена на 110 листах машинописного текста, включая 40 рисунков и 2 таблицы. Работа состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, включающей описание Материалов и Методов, изложения и обсуждения результатов, Заключения, Выводов и Списка цитируемой литературы (159 наименований).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Участие АТФ - зависимых шаперонов и протеаэ в экспрессии генов /их-оперонов психрофильных бактерий A. logei и мезофильных А. fisclieri. 1.1 Роль АТФ - зависимых шаперонов и npomeai в регуляции QS систем.

У морских люминесцирующих бактерий A.fischeri и A. logei экспрессия /юг-генов регулируется системой "LuxI-LuxR", которая определяет интенсивность биолюминесценции растущих клеток в зависимости от плотности популяции (Quorum Sensing)-, отсутствие свечения при малых концентрациях клеток и резкое усиление свечения при достижении популяцией критической плотности (Fuqua et al., 1994; Fuqua et al., 1996; Dunlap and Urbanczyk, 2013; Rosenberg et al., 2013). Принципиальным отличием психрофильных бактерий A. logei от мезофильных A.fischeri является наличие в /их-опероне двух копий регуляторного гена/ихЛ (toRl и/iaR2)(Manukhov et al., 2011; Хрульнова и др., 2011) (рис 1).

luxR р р luxl luxC luxD luxA luxB luxE luxG

Y_ji fL/ ..............\.........к .....j> _/j4

W i J > - >

AIHvibrio fischen

luxRl

\

luxC

f

luxD,

luxA

lux В

luxE

luxR2

........r-

\_.X

/ . _[. > y,

--\ ™—L ч y " —1 i

lux!

Aliivibrio logei (Kehl)

Рис 1. /га-опероны A.fischeri и A. logei KChl

Чувствительность к аушиндуктору (АИ) регуляторной области luxR/-P,i A. logei значительно ниже таковой регуляторных областей luxR2-Pri A. logei и UaR-P, A.fischeri, которые характеризуются примерно равной чувствительностью.

Было обнаружено, что при введении плазмиды, содержащей полный /шг-оперон A.fischeri, в Е. coli, мутантные по гену groEL, интенсивность биолюминесценции клеток значительно снижается (Adar et al., 1992; Dolan and Greenberg, 1992). Авторы предположили, что шаперонин GroEL/ES участвует в сборке (фолдинге) белка - активатора транскрипции LuxR.

В представленной диссертационной работе исследуется роль шаперонина GroEL/ES в фолдинге белков-регуляторов LuxRl и LuxR2 психрофильных бактерий A. logei и мезофильных A.fischeri. Показано, что отсутствие шаперонина GroEL не сказывается ни на времени начала нарастания, ни на максимальном значении биолюминесценции клеток, содержащих плазмиду с геном, кодирующим LuxRl. Следовательно, GroELS не участвует в процессе сборки (фолдинге) белка LuxRl.

На рис. 2 "А" приведены данные зависимости интенсивности биолюминесценции клеток SKB178 gro* и OFB1111 groEL673 от концентрации добавленного АИ. Штаммы содержали плазмиду pVFRl, в составе которой гейы luxCDABE Photorhabdus luminescens находятся под контролем промотора, активируемого белком LuxR A.fischeri.

3 £

I 100 i

í i

i

^

I "i

I !

Рис 2. Влияние шаперонина GroELS на фолдинг ("А") белка LuxR мезофильных бактерий A. fischeri (д) - SKB178 gro+(pVFRl); (О) - OFB111 lgroEL673 (pVFRl) и ("Б") белка LuxR2 психрофильных бактерий A. logei. (А) - SKB178 gro* (pSV16); (♦) - OFB1111 groEL6Ti

(pSV16).

Как видно из рис 2 "А", минимальная (пороговая) концентрация АИ, при которой происходит резкой увеличение биолюминесценции, в случае штамма SKB178 gro* равняется 10'9 М, в то время как для мутантного штамма OFB1111 groEL673 пороговая концентрация АИ равна 10'7 М. Снижение чувствительности к АИ в 100 раз в штамме с мутацией groEL673 объясняется уменьшением количества белка LuxR в нативной форме и, соответственно, способного готового связывать АИ, димеризоваться и взаимодействовать с промоторной областью. Как видим, уровень интенсивности биолюминесценции становится равным в gro* и groEL673 штамме при больших концентрациях добавляемого АИ. Следовательно, дефект groEL673 в определенной степени может быть компенсирован при добавлении в среду высоких концентраций АИ.

Исследование влияние шаперонина GroELS на активность белка LuxR2 A. logei в качестве активатора транскрипции также проводилось в штамме Е. coli мутантном по гену groEL в сравнении со штаммом gro*. На рис. 2 "Б" приведена зависимость интенсивности биолюминесценции клеток SKB178 gro* и OFB1111 groEL673 от концентрации добавленного АИ. Штаммы содержали плазмиду pSV16, в составе которой гены luxCDABE P. luminescens находятся под контролем промотора, активируемого белком LuxR2 промотора. Как и в случае с белком LuxR A.fischeri, наблюдается примерно 100-кратное увеличение пороговой концентрации АИ, требующегося для активации транскрипции белком LuxR2 A. logei, в штамме с мутацией groEL673. Добавление АИ высокой концентрации к клеткам E.coli OFB1111 groEL613 (pSV16) снижает, но, все же, полностью не нивелирует разницу в интенсивности биолюминесценции между штаммом с мутацией £raEL673 и штаммом gro*. По-видимому, белок LuxR2 из психрофильных бактерий A. logei менее стабилен, чем LuxR из мезофильных бактерий A.fischeri и, не успевая связаться с АИ, денатурирует быстрее или инактивируется уже после образования комплекса с АИ.

В работах (Завильгельский и Манухов, 1994; Завильгельский и Манухов, 1997) было показано, что протеаза Lon проводит деградацию белка-активатора LuxR и тем самым участвует в негативной регуляции системы QS Vibriofischeri (в настоящее время, Aliivibriofischeri). Позднее влияние протеазы Lon было определено для систем QS в бактериях Pseudomonas putida. и Agrobacterium tumefocicns. (Bertani et al., 2007; Zhu and Winans, 2001).

В диссертационной работе приведены данные о том, что отсутствие протеазы Lon не приводит ни к повышению уровня, ни к уменьшению времени начала нарастания

биолюминесценции в клетках с /шг-опероном, регулируемым исключительно LuxRl. В отличие от LuxR2 белок LuxRl не является мишенью для протеазы Lon.

Для сравнения действия протеазы Lon на активность белков LuxR из A.fischeri и LuxR2 из A. logei, использовали штаммы бактерий Е. coli АВ1157 lon* и АВ1899 Ion. В клетки этих штаммов были введены плазмиды, в которых гены luxCDABE P. luminescens находятся под контролем промотора, регулируемого белком LuxR A.fischeri (плазмида pVFRl) и под контролем промотора, регулируемого белком LuxR2 A. logei (плазмида pSVlö).

А. Б.

1000000 •

Рис 3. Влияние протеазы Lon на активность ("А") белка-активатора LuxR из A.fischeri. (й)-ABl 157Ion*', (о)-AB 1899Ion, штаммы содержалиплазмиду pVFRl; и активность ("Б") белка-активатора LuxR2 из A. loger, (A)-AB 1157 lon\ (•) - AB 1899 Ion штаммы содержали плазмиду pSV16.

В клетках Е. coli AB 1899 lon-I (pVFRl), наблюдается уменьшение, примерно в 10 раз, пороговой концентрации АИ приводящей к значительному активации транскрипции (рис. 3 "А"). Уменьшение пороговой концентрации и повышенная интенсивность биолюминесценции при малых концентрациях АИ в штамме 1оп-1 свидетельствует о том, что LuxR подвергается Lon-зависимому протеодизу. Кроме того, отметим, что добавление к клеткам высоких концентраций АИ оказывает защитное действие от деградации Lon протеазой.

Для исследования влияния протеазы Lón на эффективность работы активатора транскрипции LuxR2 из психрофильных бактерий A. logei, интенсивность биолюминесценции, которая обеспечивается наличием плазмиды pSVló, также измеряли в клетах Е. coli ABl 157 lon* и AB 1899 ion. Зависимость интенсивности биолюминесценции клеток культур ABl 157 (pSVlö) и АВ1899 (pSVló) от концентрации добавленного АИ представлена на рис. 3 "Б". Отсутствие протеазы Lon повышает чувствительность к АИ белка LuxR2 примерно на порядок. Помимо этого интенсивность биолюминесценции, при одинаковых концентрациях добавленного АИ, увеличивается примерно на порядок в клетках с дефективным геном Ion. Отметим, что в случае с белком LuxR2, защитное от деградации протеазой Lon действие добавленного АИ менее эффективно.

Приведённые данные свидетельствуют о том, что шаперонин GroEL является положительным модулятором активности экспрессии генов ta-оперона A. logei, в то время как протеаза Lon осуществляет негативную модуляцию активности. Белок LuxR2 -регулятор te-оперона A. logei является мишенью как для шаперонина GroEL, так и для протеазы Lon. Наличие в клетках большого количества АИ помогает восстановить

s

активность LuxR A.fischeri и активировать транскрипцию генов luxCDABE до того уровня, который фиксируется в присутствии шаперонина GroEL/GroES или в отсутствии протеазы Lon. Также имеет место защитное действие АИ с белком LuxR2 A. logei, однако полного восстановления эффективности транскрипции не происходит.

1.2. Влияние АТФ - зависимых шаперонов на активность белков-люцифераз, кодируемых структурными генами luxAB lux-опероное.

В 1999 г. бактериальные люциферазы были впервые использованы в качестве субстратов для изучения активности шаперонных систем (Manukhov et al., 1999). Было показано, что термоинактивированная люцифераза A.fischeri эффективно ренатурирует ш vivo (в клетках Е. coli) при непосредственном участии шаперонов системы DnaK-DnaJ-GrpE (DnaKJE). При исследовании эффективности действия шаперонов DnaKJE на субстратах -люциферазах, характеризующихся различной термостабильностью, было показано, что чем выше термостабильность люциферазы, тем менее эффективен процесс DnaKJE-зависимой ренатурации (Завильгельский и др., 2004).

В настоящей работе для анализа активности шаперонов были использованы люциферазы психрофильных бактерий A. logei. Аминокислотные последовательности белков A.fischeri и A. logei высоко гомологичны и при этом значительно отличаются от соответствующей аминокислотной последовательности люциферазы

Photobacterium phosphoreum. Скорость термоинактивации примерно равна для люцифераз бактерий A.fischeri и A. logei. (рис 4).

Однако люциферазы психрофильных бактерий A. logei и мезофильных бактерий A.fischeri характеризуются значительным отличием процессов DnaK - зависимого рефолдинга после термоинакгивации (рис 5).

Было предположено, что пониженная способность люциферазы A. logei ренатурировать с помощью шаперонов семейства DnaKJE-ClpB, возможно, определяется аминокислотными заменами в области С-терминальных альфа-спиралей (альфа-спирали 3 и 4), которые участвуют в формировании гетеродимера (альфа-бета). Эти аминокислотные замены могли приводить к ослаблению контакта в гетеродимере между мономерами, и распаду гетеродимера на мономеры при термоинактивации, что значительно снизило бы эффективность рефолдинга люциферазы, проводимого системой шаперонов DnaKJE-ClpB. Сравнивание аминокислот в позициях межсубъединичного контакта люцифераз показало, что все, кроме одной, вступающие в контакт аминокислоты люцифераз бактерий A.fischeri и A. logei либо идентичны, либо схожи по заряду и длине боковой цепи. Для проверки важности единственной аминокислотной замены в субъединице LuxB люциферазы A. logei, а, следовательно, и всего межсубъединичного контакта, в процессе рефолдинга люциферазы A. logei был сконструирован мутантный luxB ген, кодирующий ß-субъединицу люциферазы A. logei с заменой L48K. В полученном белке LuxB L48K все аминокислоты, участвующие в межъсубъединичном контакте совпадают с таковыми у люциферазы из A.fischeri.

На рис. 4 представлены кинетические кривые термоинктивации нативной люциферазы LuxAB A. logei и мутантной люциферазы А. logei LuxAB L48K, полученные при инкубации клеток при 33°С. Для сравнения приведены также кинетические кривые термоинактивации люциферазы мезофильных бактерий A.fischeri и люциферазы психрофильных бактерий Р. phosphoreum. Термоинакгивацию люцифераз проводили in vivo в клетках Е. coli К12 штамма РК202 AdnaKJ, содержащих гибридную плазмиду с генами luxAB (pF2, pSVABI, pPhol, pL48K).

Как видим, зависимость от времени термоинаетивации люцифераз A. logei, ее мутантного варианта и люциферазы A.fischeri практически идентична. Заметно даже

некоторое увеличение термостабильности для мутантного варианта ЬихАВ Ь48К. Это показывает, что мутация Ь48К как минимум не делает люциферазу А. logei более термочувствительной. Люцифераза Р. рИозркогеит инактивируется при 33°С значительно быстрее.

Рис. 4 .Инактивация мезофильной люциферазы А. fischen и психрофильной люциферазы A. logei, ее мутантного варианта и люциферазы Р. phosphoreum при 33° С. a - A. logei LuxAB L48K; я-A.ßscheri LuxAB; * - A. logei LuxAB; * - Р. phosphoreum LuxAB. Кинетику и уровень рефолдинга термоинактивированных люцифераз измеряли in vivo в клетках Е. coli К12 MG1655, содержащих гибридную плазмиду с генами lux А В (pF2, pSVABl, pPhol, pL48K) (рис. 5). Рефолдинг проводили при температуре 23°С.

а

100,0.0 -,

10,00

1,00

а

0,10

о

15

30

60

75

90

45

Время, мин

Рис.5 .Рефолдинг мезофильной люциферазы A.ßscheri и психрофильной люциферазы А. logei.B клетках Е. coli штамма MG1655. А- А. logei LuxAB L48K; ■ - A.ßscheri LuxAB; ♦ - A. logei LuxAB; • - Р. phosphoreum LuxAB. Все четыре люциферазы восстанавливают активность при действии шаперона DnaKJE. Однако люциферазы A.ßscheri и Р. phosphoreum ренатурируют значительно полнее (до 80-90% от исходного уровня), чем люцифераза А. logei и ее мутантный вариант, для которых, как правило, уровень рефолдинга едва достигает 10-15%.

Сниженная способность люциферазы A. logei к рефолдингу по сравнению с люциферазой A.fischeri, которая имеет высокую схожесть аминокислотных остатков в активном центре фермента, не определяется также и межсубъединичным взаимодействием.

Как правило, ферменты психрофильных бактерий характеризуются повышенной активностью по сравнению с ферментами мезофильных бактерий. Однако согласно данным настоящей работы, люцифераза психрофильных бактерий вида A. logei по своим параметрам близка люциферазе мезофильных бактерий A.fischeri, но не люциферазе психрофильных бактерий P. phosphoreum, а замена L48K приводит к повышению термостабильности люциферазы A. logei по сравнению с люциферазой A.fischeri.

2. Триггер Фактор - зависимый рефолдинг бактериальных люцнфераз. 2.1. Основные характеристики ТФ мезофильных бактерий Е. coll как шаперона осуществляющего рефолдинг термоинактивированных люцифераз.

Триггер Фактор (ТФ) - первый шаперон, взаимодействующий с вновь синтезируемой полипептидной цепью в момент ее выхода из рибосомы в цитоплазму. ТФ участвует в судьбе синтезируемых белков не только на рибосоме, но и в цитоплазме. В добавление к его роли в фолдинге белков de novo (вместе с DnaKJE и GroELS шаперонными системами), ТФ может связываться с нативными формами белков и стабилизировать их, осуществляя помощь в их кооперативной сборке (олигомеры, рибосомные субъединицы). Предполагается, что некоторые белки могут формировать нативную конформацию, находясь связанными с ТФ (Hoffmann et al., 2010). -

ТФ - зависимый рефолдинг термоинактивированной люциферазы проводили ш vivo в клетках Е. coli РК202 AdnaKH4 dksArkan, содержащих гибридные плазмиды с генами lux AB (pF2) и с геном lig (рТПб) (рис. 6). В плазмиде р'ГПб под контролем арабинозного промотора расположен ген tig, кодирующий ТФ из мезофильных бактерий Е. coli (ТФ&).

Время, мин

Рис. 6. Кинетика рефолдинга термоинактивированной люциферазы A.fischeri в клетках Escherichia coli РК202 AdnaKlU dkskr.kan: (♦) -PK202 (pF2); (.) - PK202 (pF2, рТПб); (ж) -PK202 (pF2, pKJE7).

В клетках PK202 Adna¥J\4 dksKr.kan в отсутствие плазмиды pTfl6 рефолдинг люциферазы практически отсутствует (не более 1%). Однако при наличии в клетках плазмиды рТПб, наблюдается эффективный рефолдинг (до 40% от исходного уровня). Для сравнения на рис. 6 представлена кинетическая кривая для DnaKJE - зависимого рефолдинга той же люциферазы (клетки Е. coli РК202 содержат вместо рТПб плазмиду pKJE7). Как видим, кинетические кривые ТФ£с - и DnaKJE - рефолдинга значительно различаются как по скорости восстановления нативной структуры белка (DnaKJE - рефолдинг осуществляется со значительно более высокой скоростью), так и по максимальному уровню рефолдинга (40% и 80-90% для ТФ£<: - и DnaKJE - рефолдинга, соответственно).

Как было показано ранее, с увеличением концентрации шаперонов DnaKJE уровень рефолдинга быстро нарастает с последующим выходом кривой на плато (Tomoyasu et al„ 1998) На рис. 7 представлена зависимость максимального уровня ТФ/.С - рефолдинга термоинакгивированной люциферазы A.flscheri от концентрации ангидротетрациклина -индуктора тетрациклинового промотора, под которым в плазмиде pG-Tf2 расположен ген tig, кодирующий ТФ£„.

Рис. 7. Зависимость максимального уровня ТФ£С - рефолдинга термоинактивированной люциферазы A. fischeri от концентрации ангидротетрациклина. По оси ординат отложена активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс - концентрация ангидротетрациклина (нг/мл).

Как видим, с увеличением в среде концентрации индуктора (и соответственно, концентрации ТФ в клетке) уровень рефолдинга быстро снижается практически до нуля.

Как было показано ранее, эффективность DnaKJE - рефолдинга снижается при увеличении термостабильности белка-люциферазы (Manukhov et al., 1999; Завильгельский и др., 2004). На рис. 8 приведены кривые ТФ& - рефолдинга различающихся по термостабильности люцифераз. Опыты проводили в штамме РК202, содержащем плазмиду рТПб совместно с одной из ниже перечисленных плазмид с генами /кхАВ, кодирующими люциферазы с различной термочувствительностью, pF2 (A. fischeri), pLeol (Р. leiognalhi), pKLux (Vibrio harveyí), pXen4 (P. luminescens). Согласно измерению констант скорости термоинактивации при 43,5°С люцифераза A. fischeri и Р. leiognathi термолабильнее люцифераз V. harveyi и Р. luminescens в 3,5 раза и в 15 раз, соответственно (Zavilgelsky et al., 2004).

BptMfl, мин

Рис. 8. Кинетика ТФ^ • рефолдинга термоинактивированных люцифераз в клетках Е. coli РК202 dnaKJIA dksA::kan (рТПб). (♦)- A. fischeri; (-)-Р. leiognathi; (а)-V. harveyi; (*)-

P. luminescens.

Наблюдается аналогичная закономерность, что и в случае ОпаИЕ-рефолдинга, т.е. с повышением термостабильности люциферазы уровень ТФ&- рефолдинга снижается, причем в варианте с наиболее термостабильной люциферазы Р. \uminescens уровень рефолдинга снижается практически до нуля.

Как известно, система ОпаЮЕ действует в клетке в комплексе с шапероном С1рВ (бишаперонная система ОпаЮЕ-С1рВ) (Оо1оиЫпо£Г е! а!., 1999). Проведена оценка влияния шаперона С1рВ на ОпаЮЕ ■ и ТФ£С - рефолдинг. Для этого кинетику и уровень рефолдинга термоинактивированной люциферазы определяли в клетках 5022100, мутантных по гену с1рВ (рис. 9, б). Как видим, в отличие от системы БпаЮЕ, которой шаперон С1рВ помогает проводить рефолдинг (90% при наличии белка С1рВ, 6% - в отсутствии белка С1рВ) (рис. 9, в), в случае ТФЕе - рефолдинга наличие в клетках шаперона С1рВ снижает уровень рефолдинга (рис. 9, а). В клетках, мутантных по гену с1рВ, максимальный уровень ТФ?С -рефолдинга составляет 55% (рис. 9, б), что примерно в 4 раза превышает уровень ТФ& -рефолдинга в клетках с/рВ* (15%).

Рис. 9. Кинетика рефолдинга термоинактивированной люциферазы A.fischeri в клетках Е. coli (pF2). (a) SG20250 dnaYJE* clpB+, светлые символы - клетки без плазмиды рТПб, темные символы - клетки содержат плазмиду рТПб; (б) SG22100 dnaKJ+ clpВ", светлые символы - клетки без плазмиды pTfl 6, темные символы - клетки содержат плазмиду рТПб; (в) светлые символы - рефолдинг в клетках штамма SG22100 dnaKJ+ clpB', темные символы

- рефолдинг в клетках штамма SG20250 dnaYJ* clpB+ (в данном варианте были использованы клетки, предварительно выдержанные при 42°С 30 мин без хлорамфеникола -предварительный «тепловой шок» для увеличения количества DnaKJE-ClpB в клетке).

Ранее в опытах in vitro было показано, что ТФес не проводит рефолдинг мономерной светлячковой люциферазы Photinus pyralis, предварительно обработанной 5 М мочевиной. Отметим, что шаперон DnaKJE, в отличие от ТФ Ее, проводит эффективный рефолдинг

in vitro как термоинактивированной, так и обработанной 5 М мочевиной светлячковой люциферазы (Svetlov et al., 2006; Goloubinoff et al., 1999). Было показано, что ТФ&, повышает эффективность in vitro ренатурации денатурированной в 5 М мочевине глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы, которая в растворе формирует гомотетрамер (Liu et at., 2005; Robin et al., 2009).

В опытах in vitro по определению участия ТФ& в рефолдинге термоинактивированных белков в настоящей работе (результаты получены в соавторстве с Мелькиной О.Е., Светловым М.С.) использовали двухкомпонентную систему (R+L), содержащую очищенную люциферазу P. leiognalhi (рис. 10).

|то]. мкм

Рис. 10. ТФйг- зависимый рефолдинг in vitro бактериальной люциферазы P. leiognalhi и светлячковой люциферазы Photinus pyralis как функция времени инкубации (а) и как функция концентрации ТФ (б). Ферментативная активность люциферазы отложена по оси

ординат и выражена в процентах от исходного уровня. 1 - Бактериальная люцифераза P. leiognalhi + ТФ& (6 мкМ), 2 - светлячковая люцифераза Photinus pyralis + ТФ& (6 мкМ), 3 - бактериальная люцифераза Р. leiognaíhi + БСА. Люциферазу инактивировали, инкубированием 5 мин. при 43°С.

В присутствии ТФ& наблюдается непрерывный процесс увеличения активности фермента, вплоть до 12-14% от исходного уровня через 60 мин инкубации при 23°С. Следовательно, ТФь активно участвует в процессе восстановления активности (рефолдинге) термоинактивированной гетеродимерной (aß) бактериальной люциферазы. Уровень рефолдинга люциферазы с увеличением концентрации ТФ^ увеличивается, достигая максимума при 8-кратном молярном избытке ТФ{-С над люциферазой (рис. 10, б). Однако ТФ& не способствует процессу рефолдинга in vitro термоинактивированной светлячковой люциферазы (рис. 10, а).

Кинетику DnaKJE- зависимого рефолдинга термоинактивированных люцифераз измеряли in vivo в клетках штамма Е. coli MG1655 tig::Kan', содержащих гибридные плазмиды pF2, pLeol или pLR. Плазмиды pF2 и pLeol содержат гены lux AB, кодирующие а и ß субъединицы бактериальных люцифераз A.ßscheri и Р. leiognaíhi под lac промотором, соответственно. Плазмида pLR содержит ген lue, кодирующий мономерную светлячковую люциферазу L. mingrelica. Измерение кинетики ТФ&. - зависимого рефолдинга термоинактивированных бактериальной и светлячковой люцифераз проводили in vivo в клетках штамма Е. coli РК202 dnaK\4 dría!\4 dks::Kan', содержащих плазмиду pTfl6 с геном tig, расположенным под araBAD промотором, а также одну из плазмид с генами luxAB (pF2, pLeol) или с геном lue (pLR).

Время, мин вРемя' мин

Рис. 11. DnaKJE - и ТФ& - зависимые процессы рефолдинга термоинаюивированных бактериальной и светлячковой люцифераз in vivo, а - DnaKJE - зависимый рефолдинг (Е. coli

MG1655 tig::кап)\ б-ТФ&-зависимый рефолдинг (Е. coli РК202 dnaKJH dks::karí). I -A.fischeri, 2-Р. leiognathi, 3-Е. mingrelica.

Как можно видеть из данных, представленных на рис.11, а, шаперон DnaKJE осуществляет примерно с равной и высокой (до 80-90% от исходного уровня) эффективностью рефолдинг как гетеродимерной бактериальной люциферазы, так и мономерной светлячковой люциферазы.

В отсутствие плазмиды рТПб рефолдинг люцифераз практически не происходит (не более 1% от исходного уровня) (рис. 11, б). В присутствии же плазмиды pTflö наблюдается значительный рефолдинг бактериальных гетеродимерных люцифераз A.fischeri и Р. leiognathi, достигающий 40% и 30% от исходного уровня, соответственно. Однако ТФа не способен проводить рефолдинг мономерной светлячковой люциферазы.

Так как светлячковая люцифераза имеет эукариотическое происхождение и значительно отличается по аминокислотной последовательности, пространственной структуре и ферментативной реакции от бактериальных люцифераз, то в следующей серии опытов нами были использованы гетеродимерная бактериальная люцифераза Vibrio harveyi (плазмида pKlux с генами luxAB) и специально сконструированная эта же люцифераза, но имеющая форму мономера (плазмида pT7-mut3). Данные по термоинактивации данных люцифераз в клетках Е. coli РК202 AdnaKJM dksKv.kan показывают, что по термочувствительности две формы люциферазы V. harveyi практически идентичны, также ранее было показано, что они имеют примерно равные уровни биолюминесценциии (Boylan et al., 1989).

Проведение DnaKJE - зависимого рефолдинга термоинактивированных люцифераз in vivo в клетках штамма Е. coli MG1655 í/g:Kanr, содержащих плазмиды pKlux или pT7-mut3, показало практически идентичные кинетику и уровень рефолдинга этих двух изоформ люциферазы V. harveyi (примерно 40% от исходного уровня) (рис. 12, а). На рис. 12, б представлены кинетические кривые ТФес - зависимого рефолдинга термоинактивированных изоформ люциферазы V. harveyi.

30 60 90 120 150 180 Время, мин

Рис. 12. DnaKJE - и ТФ& - зависимые процессы рефолдингатермоинактивированных бактериальной гетеродимерной (aß) и мономерной форм люциферазы V. harveyi in vivo, а -DnaKJE - зависимый рефолдинг (Е. coli MG1655 tig:.kan)\ б - ТФ£с - зависимый рефолдинг (£. coli РК202 с/лаКЛ4 dks::kan). 1 - pKlux, 2 - pT7-mut3.

Как видим, ТФ& способствует рефолдингу гетеродимерной люциферазы (до 20-25% от исходного уровня), и практически не эффективен в восстановлении активности мономерной формы этого же белка.

2.2. Сравнение активности ТФ из мезофильных бактерий Е. coli и психрофильных бактерий P.frigidicola.

Кинетику и уровень ТФ - зависимого рефолдинга термоинактивированных люцифераз измеряли в клетках Е. coli РК202 AdnaYJ 14 dksA.::kan, содержащих гибридные плазмиды с генами luxAB и с геном tig из мезофильных бактерий Е. coli (плазмида pTfl 6) или из психрофильных бактерий P.frigidicola (плазмида pl5aratighisPF). На рис. 13, а представлена зависимость уровня ТФ - рефолдинга термоинактивированной люциферазы A.fischeri от концентрации арабинозы, индуктора промотора araBAD. Плазмиды рТПб и pl5aratighisPF сконструированы на основе вектора pACYC184 и содержат гены tig мезофильных бактерий Е. coli и психрофильных бактерий P.frigidicola под контролем промотора araBAD, соответственно.

10 20 30 40 [L-арабиноза], мМ

Рис. 13 Зависимость максимального уровня ТФ - рефолдинга термоинактивированной люциферазы Р. leiognathi от концентрации арабинозы, использованной для индукции ("А"): А - ТФр/, ■ - ТФес. Рефолдинг термоинактивированной люциферазы Р. leiognathi в клетках Е. coli РК202 dnaKJ14 dksA::kan ("Б"), экспрессирующих ■ - ТФ& (pLeol, рТПб); А - ТФр/ (pLeol, pl5aratighisPF); • - без ТФ (контроль (pLeol).

При наличии в клетках РК202 ЛЛюКЛ4 dksKr.kan (pF2) плазмиды рТПб или pl5aratighisPF имеет место восстановление активности термоинакгивированной люциферазы, достигающее 20-30% от исходного уровня. Однако, наблюдаются значительные различия при сравнении уровней ТФес - и ТФ/у- рефолдинга в зависимости от их внутриклеточной концентрации. В варианте с плазмидой pl5aratighisPF с увеличением концентрации арабинозы и, соответственно, внутриклеточной концентрации шаперона ТФ/>/ уровень рефолдинга нарастает с последующим выходом кривой на плато. В варианте же с плазмидой рТПб с увеличением в среде концентрации индуктора (и, соответственно, концентрации ТФ/С в клетке) уровень рефолдинга люциферазы быстро снижается практически до нуля (рис. 13 "А").

На рис. 13 "Б" приведена зависимость степени ренатурации люциферазы А. fischen от времени инкубации клеток РК202, в которых экспрессируется ТФ& или ТФ/упри 23°С. При наличии в клетках плазмиды рТП 6 с геном tig Е. coli, кодирующим ТФгх (клетки Е. coli РК202 (рТПб, pF2), росли при 28°С до середины экспоненциальной фазы без арабинозы), наблюдается эффективный рефолдинг, достигающий в течение 120 мин. инкубации 25% от исходного уровня. Кинетическая кривая рефолдинга той же люциферазы, проводимого ТФ/у, получены при условии роста клеток Е. с oh РК202 (pl5aratighisPF, pF2) при 28°С до середины экспоненциальной фазы в присутствии 50 птМ арабинозы). Как видим, кинетические кривые ТФ& - и ТФ/./- зависимого рефолдинга практически не различаются как по скорости, так и по максимальному уровню рефолдинга.

Ранее было показано, что при суперпродукции ТФ& оказывает летальное действие на бактериальную клетку (Guthrie and Wickner, 1990; Genevaux et a!., 2004). На рис. 14 представлены кривые роста бактерий Е. coli РК202, содержащих плазмиды plSaratighisPF или рТПб, в зависимости от содержания арабинозы в среде.

О 1,5 3 4,5 6

Время, ч.

Рис. 14. Кривая роста клеток штамма Е. coli РК202 AdnaKJH, содержащих плазмиды, кодирующие ТФь; или ТФ/./В присутствии или отсутствии L-арабинозы в среде LB при 3D°C. Е. coli РК202 без плазмиды: о - без L-арабинозы; • - 50 мМ L-арабиноза. Е. coli, РК202 pTF16: □ - ТФбез L-арабиозы; ■ - ТФЛс, 50 мМ L-арабиноза. Е. coli РК202 pl5aratighisPF: д - ТФл/, без L-арабиозы; ж - ТФ/у, 50 мМ L-арабиноза. Как видим, в присутствии 50 шМ арабинозы наблюдается практически полное ингибирование роста бактерий с плазмидой рТПб, кодирующей ТФ&, в то время как рост

бактерий с плазмидой pl5aratighisPF, кодирующей ТФ/у, от концентрации арабинозы не зависит. ТФ£С в растворе формирует гомодимер, а ТФ/у остается мономерным при любой концентрации (Robin et al., 2009). Следовательно, можно придти к выводу, что именно димерная форма ТФ определяет как снижение шаперонной активности, так и токсическое действие на клетку, проявляющиеся у ТФ& при высоких концентрациях.

На рис. 15 приведены кинетические кривые ТФр/-зависимой ренатурации люцифераз, различающихся по термостабильности. Опыты проводили в штамме РК202, содержащем плазмиду pl5aratighisPF совместно с одной из ниже перечисленных плазмид с генами !югАВ, кодирующими люциферазы с различной термочувствительностью, pPhol (P. phosphoreum),

Время, мин.

Рис. 15. TFр/-зависимый рефолдингтермоинактивированных люцифераз в клетках Е. coli РК202 (pl5aratighisPF), содержащих одну из серии плазмид, кодирующих люциферазы различной термочувствительности: • -Р. phosphoreum (pPhol); я - Р. leiognathi (pLeol); ♦ -V. harveyi (pKlux); А - Р. luminescens (pXen4).

Как видно, для шаперонной активности ТФр/ характерна аналогичная закономерность, что и в случае ТФес, т.е. с повышением термостабильности люциферазы уровень рефолдинга снижается, причем в варианте с наиболее термолабильной люциферазой Р. phosphoreum уровень ТФр/- рефолдинга достигает 40-50%, а с наиболее термостабильной люциферазой Р. luminescens снижается примерно до 1%.

Для определения влияния четвертичной структуры белка-субстрата на способность ТФpf проводить рефолдинг нами были использованы гетеродимерная бактериальная люцифераза V. harveyi (плазмида pKlux с генами luxгАВ) и специально сконструированная эта же люцифераза, но имеющая форму мономера (плазмида pT7-mut3).

На рис. 16 представлены кинетические кривые ТФ/у-зависимого рефолдинга термоинактивированных изоформ люциферазы V. harveyi. Как видим, как ТФ& (формирующий в растворе димер) (рис 12, б), так и ТФ я/ (в растворе находится исключительно в форме мономера) способствуют рефолдингу лишь гетеродимерной формы люциферазы (до 15-20% от исходного уровня), и практически не эффективны в восстановлении активности мономерной формы этого же белка. L-арабиноза была добавлена к клеткам Е. coli РК202 dnaKJ14 dksA::kan (pKlux/pT7-mut3, pl5aratighisPF) в конечной концентрации 50 мМ.

20 40 60 80 100 120 Время рефолдинга, мин. Рис. 16. TFpf- зависимый рефолдинг термоинактивированной бактериальной гетеродимерной (aß) и мономерной форм люциферазы V. harveyi, проводимый в клетках Е. coli РК202. ■ - TFр/-зависимый рефолдинг гетеродимерной формы люциферазы V. harveyi,

о- TFp/" зависимый рефолдинг мономерной формы люциферазы V. harveyi. Шаперонная активность ТФ& увеличивается при отсутствии в клетках Е. coli белка ClpB. (рис. 9). Как видно из данных, представленных на рис. 17, подобная особенность характерна и для ТФ/у.

50

* 40

ГО

I | 30 5

-е-К

* 20 ш S

1 10

-{

0

0 15 30 45 60

Время, мин.

Рис. 17. Влияние шаперона ClpB на TF^/- зависимый рефолдинг термоинактивированной люциферазы P. leiognqthi. Ромбы - клетки Е. coli SG20250 dnaKfclpB4 (pLeol); треугольники - клетки Е. coli SG22100 dnaKJ*clpB/.kan (pLeol). Светлые символы - клетки без плазмиды pl5aratighisPF, темные символы - клетки содержат плазмиду р 1 SaratighisPF Измерение кинетики и уровня рефолдинга термоинактивированной люциферазы P. leiognathi в клетках Е coli SG22100, мутантных по гену clpB, показывает, что максимальный уровень ТФр; - зависимого рефолдинга составляет 40%, в то время как в штамме Е. coli SG20250 clpB* максимальный уровень рефолдинга не превышает 15%.

В штамме РК202 ¿tefrjaKJ14 dksA::kan, в хромосоме которого содержится активный ген tig, уровень ТФ - зависимого рефолдинга термоинактивированной люциферазы Л. fischeri составляет примерно 0,5-1,0%, что указывает на неспособность внутриклеточного ТФ вести эффективный рефолдинг. По-видимому, количества молекул ТФ, образующихся в норме в процессе синтеза, недостаточно, чтобы способствовать эффективному рефолдингу, так как большая часть ТФ формирует комплексы с рибосомами. При введений в клетку плазмиды с геном tig количество ТФ увеличивается, одновременно увеличивается и эффективность рефолдинга. Однако, что является характерным именно для ТФ&, при последующим

увеличении внутриклеточной концентрации ТФ& имеет место значительное снижение уровня рефолдинга, что принципиально отличает шаперон ТФ^ от шаперонов системы DnaKJE (при увеличении концентрации DnaKJE уровень рефолдинга достигает плато, и при дальнейшем увеличении концентрации не снижается (Tomoyasu et al., 1998). Необходимо отметить, что увеличение концентрации ТФ&. в клетках Е. coli примерно в четыре раза приводит к снижению их жизнеспособности и даже к гибели (Genevaux et al., 2004). Согласно представленным данным увеличение концентрации ТФ& в клетках штамма РК202 AdnaKJI4 dksA::kan сопровождается потерей жизнеспособности клеток одновременно с ослаблением рефолдинга. Можно предположить, что эти эффекты определяются особенностями четвертичной структуры ТФ£с. При небольших концентрациях ТФ& в цитоплазме находится в форме мономера и проявляет активность в качестве шаперона, т.е. формирует комплекс с денатурированным белком, а затем высвобождает этот белок в нативной форме. При повышении концентрации ТФгс образует димерную форму. В результате белки, связанные с ТФ^.., не способны высвободиться из комплекса, что приводит к снижению эффективности рефолдинга. Если же в этих условиях с ТФес формируют комплексы белки, участвующие в процессе деления клетки, то имеет место ингибирование роста клеток. Было показано, что при высокой концентрации ТФ& формирует комплекс с ключевым белком клеточного деления FtsZ (Genevaux et al., 2004). Проведенный в настоящей работе анализ шаперонной активности ТФ/>/, который в растворе содержится исключительно в форме мономера, показал отсутствие снижения эффективности рефолдинга с увеличением его внутриклеточной концентрации. Кроме того, с увеличением внутриклеточной концентрации ТФ^у- отсутствует и летальный эффект, характерный для ТФй;. Следовательно, можно придти к выводу, что именно димерная форма ТФ определяет его токсическое действие на клетку, имеющее место при высокой концентрации. Необходимо отметить, что по другим параметрам: 1) неспособность проводить рефолдинг мономерной формы люциферазы, 2) снижение эффективности рефолдинга при увеличении термостабильности белка-субстрата, 3) повышение эффективности рефолдинга в мугантном штамме Е. coli clpB' ТФй из мезофильных бактерий Е. coli и ТФр/ из психрофильных бактерий Р. frigidicola практически не различаются.

Рис.18. Схематическое представление участия ТФ в сборке белков в цитоплазме бактерии

Е. coli.

Как видно из схемы (рис 18), ТФ находится или в свободном состояния, или в комплексе с 50S субъединицей рибосомы. Синтезируемый белок формирует нативную форму или спонтанно (и затем с помощью шаперона DnaKJE и щаперонина GroELS), или с помощью ТФ. Свободный ТФ формирует комплексы с нативными белками в цитоплазме, предпочитая олигомерные формы белков и тем самым участвуя в сборке новых рибосом в клетке.

В бактериях Е. coli процессы дезагрегации и рефолдинга белков связаны с активностью АТФ-зависимой бишаперонной системы DnaKJE-ClpB. Шаперон CIpB не участвует непосредственно в рефолдинге субстрата, он лишь способствует дезагрегации белков, особенно эта помощь эффективна при дезагрегации крупных агрегатов, которые система DnaKJE самостоятельно не способна разрушить (Завильгельскийи др., 2004). Как следует из представленных данных, действие шаперона CIpB на систему DnaKJE и на шаперон ТФ противоположно. Если присутствие ClpB в клетке значительно увеличивает эффективность рефолдинга DnaKJE системы, то ТФ-рефолдинг снижается. Можно предположить, что шаперон ClpB конкурирует с ТФ за связь с субстратом, в отличие от шаперона DnaKJE, который действует в клетке в комплексе с шапероном ClpB (бишаперонная система DnaKJE-ClpB) (Goloubinoff et al„ 1999).

Термическая инактивация как бактериальных, так и светлячковой люцифераз ведет к открытой экспозиции гидрофобных эпитопов, с которыми специфически контактируют шапероны типа DnaKJE, что и определяет эффективный рефолдинг этих белков (Rudiger et al., 1997; Manukhov et al., 1999; Hesterkamp and Bukau, 1998). Неспособность или очень низкая эффективность рефолдинга, характерная для ТФ при использовании в качестве субстрата мономерных форм люцифераз, указывает на дополнительную и, по-видимому, важную роль пространственной, а точнее, четвертичной структуры белка-субстрата для успешного контакта с ТФ. Это предположение находит подтверждение в данных, представленных в работе (Martinez-Hackert and Hendrickson, 2009), в которой показано, что в цитоплазме бактерий ТФ находится в комплексе с различными олигоМерными белками и способствует стабилизации белков в димерной и олигомерной форме. Отметим также, что, как недавно было показано, ТФ не способствует фолдингу светлячковой люциферазы при ее синтезе (Hoffman et al., 2012).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ биолюминесцентных характеристик ¡ux-оперонов мезофильных и психрофильных бактерий в гетерологичной системе показал, что штаммы Е. coli с мутацией в гене, кодирующем шаперонины GroEL\GroES, характеризовались сниженным уровнем люминесценции по сравнению со штаммами дикого типа, и, наоборот, мутация по гену, кодирующему протеазу Lon, приводила к повышенному уровню биолюминесценции. Однако, несмотря на сходство в модуляции активности QS систем психрофильных A. logei и мезофильных A.ßscheri бактерий шаперошшами семейства Hsp60 и протеазой Lon, оказалось, что имеются существенные различия, связанные с наличием двух копий регуляторного гена luxR у психрофильных бактерий. В частности показано, что шаперонины GroEL\GroES и протеаза Lon не участвуют в модуляции активности белка LuxRl из психрофильных бактерий A. logei, в то же время, участвуют в контроле количеста и качества активных форм белка LuxR2. Белок LuxR из мезофильных бактерий A.ßscheri также подвержен влиянию шаперонинов GroEL\GroES и протеазы Loa В обоих случаях наблюдается эффект преодоления мутации за счет добавления АИ в больших концентрациях - увеличивается стабильность активаторов транскрипции. Однако в случае белка LuxR2 этот эффект преодолевается не полностью. По-видимому, белок LuxR2 из психрофильных бактерий A. logei менее стабилен, чем LuxR из мезофильных бактерий A.ßscheri и, не успевая связаться с АИ, деградирует быстрее или, уже связав АИ и образовав димерную форму, сильнее подвержен инактивации. Влияние шаперонинов GroEL\GroES и протеазы Lon на экспрессию /их-оперона A. logei связано с тем, что основную роль в активации экспрессии играет LuxR2, a LuxRl менее чувствителен к небольшим концентрациям АИ. На основе полученных данных можно сделать предположение, что LuxRl необходим для активации генов /шг-оперона в сложных стрессовых условиях, при которых LuxR2 не активен. Следует, однако, отметить, что в этом случае активация экспрессии генов /шг-оперона возможна лишь при высоких концентрациях АИ (10"5 - 10"6 М).

Исследование влияния шаперонов на активность структурных генов ¡их-оперона. Структурные гены /шг-оперона, кодирующие люциферазу из психрофильных бактерий A. logei гомологичны генам liixAB мезофильных бактерий A.ßscheri, а кодируемая этими генами люцифераза примерно равна по термостабильности люциферазе мезофильных бактерий A.ßscheri. Однако люцифераза A. logei имеет значительно сниженный по сравнению с люциферазой А. ßscheri уровень DnaKJE - зависимого рефолдинга. Поэтому при термоденатурации психрофильных люцифераз in vivo (в штаммах Е. coli dnaKJE') интенсивность биолюминесценции клеток спадает быстрее, чем при термоденатурации мезофильных люцифераз.

Рефолдинг термоинактивированных люцифераз проводимый ТФ мезофильных и психрофильных бактерий характеризуется примерно равными параметрами: скоростью реакции и максимальным уровнем рефолдинга. Однако по этим характеристикам ТФ -рефолдинг значительно уступает DnaKJE - рефолдингу. При увеличении концентрации психрофильного ТФ pf уровень рефолдинга термоинактивированных люцифераз увеличивается с выходом на плато. Напротив, повышение концентрации мезофильного ТФ/С приводит к резкому спаду максимального уровня рефолдинга, а появление в клетках мутантных по шаперонам Hsp70 (Е. coli AdnaKJ) большого количества ТФ& приводит к сильному снижению их жизнеспособности. Показано, что эффективность ТФ& - и ТФ/у-зависимого рефолдинга снижается при увеличении термостабильности используемой в качестве субстрата люциферазы. Этот результат согласуется с полученными ранее данными об эффективности DnaKJ - зависимого рефолдинга, и объясняется тем, что, по-видимому, у

более термостабильных белков более высокая способность образовывать необратимые агрегаты.

Отсутствие в клетках шаперона С1рВ (НэрЮО) повышает уровень рефолдинга проводимого как мезофильным так и психрофильным ТФ, в отличие от системы ОпаЮЕ, которой шаперон С1рВ помогает проводить рефолдинг (бишаперонная система ОпаЮЕ-С1рВ).

Показано, что ТФ& и ТФ/упроводят рефолдинг только гетеродимерных люцифераз. ТФ& и ТФне способны рефолдировать термоинактивированные мономерные формы: светлячковую и специально сконструированную, слитую из двух субъединиц, бактериальную люциферазу V. \iarveyi. Шаперон БпаЮЕ проводит рефолдинг как мономерной, так и димерной форм люцифераз с равной эффективностью.

Полученные данные о работе системы клеточных шаперонов суммированы на рис. 19.

ЗОв

Рис. 19. Схема участия шаперонов бактериальной клетки АТФ - зависимых: ОпаЮЕ, ОгоЕЬБ, С1рВ, НрЮ - и АТФ - независимых: ТФ и 1ЬрАВ - в фолдинге, рефолдинге и дезагрегации белков. 1 - вновь синтезированные полипептидные цепи взаимодействуют с ТФ, освобождаясь из рибосомального туннеля, остаются несвернугыми; 2 - часть подобных полипептидных цепей не требует участия шаперонов для спонтанного сворачивания в нативную конформацию; 3 - часть белков формируют нативную форму при участии шаперона №р70 (БпаК), с кофактором Нзр40 (Опа!) и фактором нуклеотидного обмена НэрЮ (ОгрЕ); 4 - спонтанное образование частично свернутой конформации; 5 - связывание с БпаЮЕ и переход в нативную форму; 6 - связь с ТФ для повторения цикла фолдинга, до тех пор пока нативное состояние не будет достигнуто; 7 — взаимодействие с ОгоЕЬ\Е8 для проведения полного фолдинга белка до нативной конформации; 8 - под воздействием теплового стресса происходит частичное разворачивание термолабильных белков, вызывающее экспозицию подверженных агрегации гидрофобных эпитопов; 9 - частично свернутый белок может агрегировать, при этом эНэр (1ЬрА, 1ЬрВ) действуют как «удерживатели» частично развернутых белков и перемещаются к шаперонам Нзр70 и ШрбО; 10 — дезагрегацию развернутых и агрегированных белков проводит НэрШО (С1рВ), действуя

совместно с Нзр70.

Рекомендации и перспективы дальнейшего исследования. В дальнейшем предполагается, используя полученные биосенсорные штаммы с люциферазой в качестве репортера, провести поиск наиболее активных вариантов ТФ. Планируется проведение исследований активности ТФ из A.logei и других психрофильных микроорганизмов. Полученные в диссертационной работе штаммы с высоким уровнем продукции ТФ планируется использовать для исследования способности ТФ к дезагрегации амилоидоподобных надмолекулярных структур.

Проведенное в диссертационной работе исследование о влиянии шаперонов и протеаз на активность активаторов транскрипции систем QS (белки LuxR, LuxRl и LuxR2) предполагается использовать для конструирования высокочувствительных к АИ lux-биосенсоров.

Перспективным представляется изучение механизмов рефолдинга денатурированных белков с применением разнообразных моделей биосенсорных штаммов, разработанных в ходе выполнения диссертационной работы. Выводы:

1. Шаперонины GroELAGroES и протеаза Lon не участвуют в модуляции активности белка LuxRl из психрофильных бактерий А. logei.

2. Шаперонины GroELS и протеаза Lon участвуют в контроле количеста и качества активных форм как белков LuxR2 из психрофильных бактерий А. logei, так и LuxR из мезофильных бактерий A.ßscheri. В обоих случаях наблюдается эффект добавления АИ в большой концентрации: увеличивается стабильность активаторов транскрипции (LuxR, LuxR2), и снижается эффект отсутствия шаперонина GroEL\GroES или присутствия протеазы Lon, однако в случае белка LuxR2 этот эффект не компенсируется полностью.

3. Люцифераза из психрофильной бактерии А. logei по термостабильности идентична люциферазе мезофильных бактерий A.ßscheri. Однако люцифераза А. logei характеризуется сниженным, по сравнению с люциферазой A.ßscheri, уровнем DnaKJE - зависимого рефолдинга.

4. Процессы восстановления нативной структуры (рефолдинг) термоинактивированных люцифераз с участием ТФ из мезофильных и психрофильных бактерий как по скорости реакции, так и по максимальному уровню рефолдинга практически идентичны. DnaKJE -рефолдинг термоинактивированных люцифераз осуществляется со значительно более высокой скоростью и достигает существенно более высокого уровня (до 90% от начального уровня).

5. С увеличением концентрации психрофильного ТФ (ТФpj) максимальный уровень рефолдинга термоинактивированных люцифераз вырастает и достигает плато. Повышение же концентрации мезофильного ТФ (ТФ&) приводит к резкому спаду максимального уровня рефолдинга.

6. В клетках Е. coli с мутацией AdnaKJ появление большого количества ТФ& приводит к снижению их жизнеспособности.

7. Эффективность ТФ& -и ТФ;./-зависимого рефолдинга термоинактивированных люцифераз снижается при увеличении термостабильности используемой в качестве субстрата люциферазы.

8. Отсутствие в клетках шаперона ClpB (HsplOO) повышает уровень рефолдинга, проводимого как мезофильным, так и психрофильным ТФ, в отличие от системы DnaKJE, которая формирует с шапероном ClpB эффективную бишаперонную систему.

9. ТФ как из мезофильных бактерий Е. coli так и из психрофильных бактерий Р.ßigidicola не проводит рефолдинг мономерных форм люцифераз.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Ilya V. Manukhov, Ol'ga Е. Melkina, Ignatii I. Goryanin, Ancha V. Baranova, and Gennadij В. Zavilgelsky. The N-terminal domain of the Aliivibrio fischeri LuxR is a target of the GroEL chaperonin. //Journal of Bacteriology.-2010.-V. 192.-№20.-P. 5549-5551.

О. E. Мелькина, И. И. Горянин, И. В. Манухов, Г..Б. Завильгельский. Триггер Фактор зависимый рефолдииг бактериальных люцифераз в клетках Escherichia coli: кинетика и эффективность рефолдинга, влияние бишаперонной системы DnaKJE-ClpB // Молекулярная Биология. -2013-Т. 47.-№3. - С. 492-497

Мелькина O.E., Горянин И.И., Манухов И.В., Баранова A.B., Колб В.А., Светлов М.С., Завильгельский Г.Б. Триггер Фактор осуществляет рефолдинг гетеродимерных, но не мономерных люцифераз //Биохимия. -2014. -Т. 79. -№ 1.-С. 79-86.

Мелькина О. Е., Горянин И.И. GroEL шаперон необходим для фолдинга N-концевого домена LuxR - активатора транскрипции /юс-оперона Vibrio fischeri. // Материалы V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. - Москва. - 2009. - С. 71.

Горянин И.И., Мелькина O.E., Манухов И.В., Завильгельский Г.Б. Сравнительный анализ активности Триггер Фактора из мезофильных и психрофильных бактерий в процессе ренатурацни люцифераз. // VI Съезд ВОГиС и ассоциированные генетические симпозиумы. -Новосибирск-2014. - С. 45.

Хрульнова С. А., Марышев И.В., Манухов КВ., Горянин И.И., Васильева А., Салихова А., Завильгельский Г.Б. Механизмы Quorum Sensing у психрофильных бактерий Aliivibrio logei: сравнительный анализ активности белков-регуляторов LuxRl и LuxR2. // VI Съезд ВОГиС и ассоциированные генетические симпозиумы. - Новосибирск. - 2014. - С. 178.

Подписано в печать:

24.10.2014

Заказ № 10326 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru