Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

АТФ - зависимые протеазы и шапероны как эффективные регуляторы экспрессии генов lux-оперона Aliivibrio fischeri

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "АТФ - зависимые протеазы и шапероны как эффективные регуляторы экспрессии генов lux-оперона Aliivibrio fischeri"

На правах рукописи

004611936

МЕЛЬКИНА ОЛЬГА ЕВГЕНЬЕВНА

АТФ - ЗАВИСИМЫЕ ПРОТЕАЗЫ И ШАПЕРОНЫ КАК ЭФФЕКТИВНЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ ЭКСПРЕСИИ ГЕНОВ /ых-ОПЕРОНА

АНтЬпо Аьскеп

03.02.07 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 1 ноя 2010

Москва-2010

004611936

Работа выполнена в лаборатории генетики бактерий ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИ генетика»).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук И.В. Мапухов

ФГУП «ГосНИИ генетика»

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор И.А. Хмель

Институт молекулярной генетики РАН

доктор биологических наук, профессор В.А. Лившиц

Научно-исследовательский институт «Аджмномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»)

Ведущая организация:

Международный биотехнологический центр Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Защита состоится « 2010 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета

Д 217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г.Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИ генетика». Автореферат разослан «-М » октября 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук л Т.Л. Воюшина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Системы регуляции экспрессии генов типа "Quorum Sensing" (QS) у бактерий определяют тесную связь процесса транскрипции с плотностью популяции, - экспрессия группы генов начинается лишь при достижении популяцией бактерий определенной (критической) концентрации. Сам термин QS был впервые введен в обиход в 1994 г Greenberg Е.Р. с сотр. (Fuqua W.C., Winans S.C. and Greenberg E 1994). Однако феномен типа QS был обнаружен значительно раньше (в 1970-е гг) у морских бактерий Aliivibrio (ранее Vibrio) fischeri для группы /га-генов, ответственных за биолюминесценцию клеток (Nealson & Hastings, 1979). По названию ключевых регуляторных генов /ux-оперона A. fischeri luxl и /¡¿xR в последствие подобные системы относили к механизму регуляции типа "luxl-luxR" (Meighen Е.Л.,\99\).

В настоящее время QS регуляция обнаружена у большого числа видов как грам-положительных, так и грам-отрицательных бактерий и показано, что QS системы играют ключевую роль во взаимодействии бактерий с высшими организмами, в регуляции вирулентности бактерий, формировании биопленок, регуляции экспрессии генов, связанных с синтезом различных экзоферментов, токсинов, антибиотиков и других вторичных метаболитов, конъюгации и др.

Особенно велика роль QS систем в регуляции процессов взаимодействия патогенных бактерий с эукариотическим организмом - хозяином. Инфекционный процесс непосредственно связан с достижением популяцией патогенных бактерий критической плотности и соответственно с синхронным синтезом факторов вирулентности.

QS система также регулирует экспрессию генов, участвующих в формировании биопленки, которая является существенным фактором патогенности, так как при этом значительно повышается устойчивость бактерий к антибактериальным препаратам и защитному действию иммунной системы хозяина Поэтому использование блокаторов QS системы в настоящее время рассматривается как новая перспективная стратегия антимикробной терапии.

Представляет особый интерес определить связь систем QS с основными энергозависимыми системами в клетке, а именно, с АТФ-зависимыми протеазами и шаперонами, которые осуществляют деградацию денатурированных и ошибочно синтезированных белков (протеазы) и проводят фолдинг и рефолдинг белков (шапероны).

Известно, что АТФ-зависимые протеазы и шапероны также играют важную роль в ряде регуляторных каскадов, например, при переходе клеток в стационарную фазу, при "тепловом шоке" и др. (Gottesman S., 1999; Weihart D. et al, 2003; Tomoyasu Т. et al, 2001). В

настоящей работе на модели /ux-оперона морских бактерий A. fischeri проведено изучение роли АТФ-зависимых протеаз и шаперонов в качестве модуляторов QS системы.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена поиску генов в хромосоме бактерий Escherichia coli, белки-продукты которых влияют на эффективность действия системы регуляции типа QS. В качестве модельной системы QS используется lux-оперон (/uxRICDABEG) морских светящихся бактерий A. fischeri. Предполагалось исследовать влияние белков-шаперонов и АТФ-зависимых протеаз на активность белков-регуляторов системы QS и ферментов люцифсраз, гены которых (/¡«АВ) входят в состав lux-оперона. В работе решались следующие задачи:

1. Исследование влияния и механизма действия шаперонинов GroEL/GroES (семейство Hsp60) на фолдинг белка LuxR и его делетированных форм.

2. Исследование влияния и механизма действия протеазы Lon на активность белка LuxR и его делетированных форм. Проведение сравнительного анализа влияния Lon-протеазы на экспрессию генов /ux-оперона A. fischeri в специально сконструированных модельных системах, в состав которых входят как плазмида с генами /ux-оперона, так и плазмиды с фрагментами ДНК, кодирующими полный LuxR или его С-домен.

3. Изучение механизма защитного действия белков - шаперонов семейства HsplOO при термоинактивации белков в клетке. Получение данных о влиянии белков -шаперонов семейства С1р нарефолдинг белков.

Научная новизна. Впервые показано, что основную регуляторную функцию в белке LuxR несет N - домен (162 аминокислотных остатка), являющийся мишенью для Lon-протеазы и определяющий контакт полипептида с шапероном GroEL, необходимого для сборки нативной структуры LuxR. Впервые показано, что при DnaK-DnaJ-GrpE-зависимом рефолдинге денатурированных белков в клетках Е. coli значительное влияние на скорость и уровень рефолдинга оказывают малые шапероны IbpA и особенно IbpB, а также шаперон ClpA, принадлежащий семейству HsplOO.

Практическая значимость. Основные результаты работы могут быть использованы на практике: применение плазмиды с генами ibpAB при суперпродукции гетерологичных белков в бактериальных клетках Е. coli для повышения их растворимости; использование генов, кодирующих АТФ-зависимые протеазы, для ингибирования систем QS и, как следствие, дм снижения активности вирулентных генов у патогенных бактерий.

Структура работы. Диссертация изложена на 95 листах машинописного текста, включая 30 рисунков и 4 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка используемой литературы. Список литературы включает 120 работ отечественных и зарубежных авторов.

Апробация работы. Материалы исследования по теме диссертации опубликованы в четырех статьях и представлены на III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» в 2007 г., на международной школе - конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.Е.Лобашова, в 2007 г., на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров в 2009 г. Диссертационная работа была апробирована на семинаре секции «Генетика» Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 15 сентября 2010 года.

Содержание работы

У морских бактерий Aliivibrio fischeri экспрессия /юг-генов регулируется системой "LuxI-LuxR", которая определяет интенсивность биолюминесценции растущих клеток в зависимости от плотности популяции ("quorum sensing"): отсутствие свечения при малых концентрациях клеток и резкое усиление свечения при достижении популяцией критической плотности, ¿цх-оперон A. fischeri (/urRICDABEG) состоит из гена IwcR с промотором РI, и генов /uxICDABEG с промотором Рг. Гены luxI и luxR кодируют регуляторные белки Luxl и LuxR соответственно. Ацилсинтаза Luxl осуществляет синтез аутоиндуктора (АИ-1), ацильного производного лакгона L-гомосерина, который играет ключевую роль в "общении" бактерий, так как свободно диффундирует через клеточные мембраны. Белок LuxR - активатор транскрипции генов /uxICDABEG. Связываясь с АИ, белок LuxR приобретает способность образовывать комплекс с lux- боксом, представляющим собой инвертированный повтор из 20 п.н. в области промотора Рг, и активировать транскрипцию генов luxICDABE.

Система QS самодостаточна, т.е. она не нуждается в дополнительных факторах для своего проявления. Однако ряд данных указывает на то, что в клетке существуют белки, которые способны моделировать активность данной системы. Мы их называем внутриклеточными факторами. К ним относятся протеазы и шапероны.

Для определения влияния внутриклеточных факторов на регуляцию системы QS применялись различные методы исследования.

1. .Методы исследования

Бактериальные штаммы и плазмиды. Использованные в работе баетериальные штаммы и плазмиды, а также их генетические характеристики представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

Штаммы Характиристика Источник

SG20250 AlacU169 araD flbB relA clpA+, S.Gottesman (США)

SG22099 c!pA::kan (остальные маркеры как у SG20250) -II-

SG22163 malP::lacV -II-

SG22186 Alan rcshr.kan (остальные маркеры как у SG22163) -II-

АВ1157 F' thr-\ 1еиВ6proA2 his-4 argE3 thi-1 lacYl galK2 яга-14 xyl-5 mtl-i tsx-33 rpsL31 supE44 вкпм

AB 1899 F' lonAl (остальные маркеры как у ABl 157) вкпм

NKU3 clpPr.cat (остальные маркеры как у ABl 157) N.E.Murray (Англия)

NK114 clpX::kan (остальные маркеры как у AB 1157) -//-

SKB178 F" galE sup gro' ИМГ РАН

OFB111 groE673 Glyl73Asp337 (остальные маркеры как у SKB178) -II-

TG-1 thi-1 supE44 hsdAS Aflac-proAB) [F traD36proAB* lacf lacZAMI5] вкпм

MG1655 F" ilvG reb-50 rph-l вкпм

BW25113 rmB3äIacX4787 hadR5I14 A(araBAD)567 A(rhaBAD)568 rph-l C.B. Машко (Kelo-collection)

JW3664 ibpAr.kan (остальные маркеры как у BW25113) -//-

JW3663 ibpB::kan (остальные маркеры как у BW25113) -II-

JW0013 dnaKr.kan (остальные маркеры как у BW25113) -II-

Плазмиды

pFl вектор pBR322 со встроенным по ßamHI-сайту полным 1их-опероном A. fischeri (ItixRluxICDABE);Apr наша лаборатория

pF2 вектор pUC19 со встроенными генами luxAB A. fischeri под lac промотором; Арг -//-

pGEX-LuxR pGEX-KG вектор со встроенным по Ват\ II/EcoRI-сайтам геном luxR A. fischerï, Арг -II-

pVFRl вектор pDEW201 с встроенной кассетой luxCDABE Photorhabdus luminescent в качестве генов-репортеров и фрагментом ДНК A. fischeri, содержащим ген luxR под промотором Р| и регуляторную область с правым промотором Рг и /ux-боксом; Ар' даняая работа

pLuxR вектор pUC19 со встроенным по ßamHL/fcoRI-сайтам геном luxR A. fischeri под lac промотором; Арг данная работа

pLuxRÄN вектор pTZ57R содержит 5 - делегированный фрагмент гена luxR под lac промотором; Арг данная работа

pGEX-LuxRAN вектор рСЕХ-Кв содержит 5 - делегированный фрагмент гена 1ихК: Арг данная работа

pGEX-LuxRAC вектор рСЕХ-Кй содержит 3 - делегированный фрагмент гена /шгй; Арг данная работа

рОМ рАСУС184 со встроенным по ВатШ/Ыги! - сайтам генами 1их1АВСОЕО А. Пзскеп под правым промотором Рг, а также 1их-боксом (без 1ихК)\ Сшг данная работа

pGipE-lux вектор рОЕ1Л'201 содержит под промотором Рсте кассету генов /ихСОАВЕ, выделенных из генома бактерий РкоШгЪаЬйт 1ит1пе$сепз\ Арг наша лаборатория

pOMibpAB вектор ргБЗЗ содержит гены ;йрАВ, расположенные под промотором Рщю-К Сш' данная работа

Манипуляции с ДНК. Трансдукцию бактериофагом PI проводили по стандартной методике (Миллер Дж.,1979). Выделение плазмидной ДНК, рестрикцию и лигирование фрагментов ДНК, трансформацию клеток Е. coli проводили согласно стандартным методам, изложенным в (Sambrook et al., 1989).

Полимеразная цепная реакция. ПЦР проводили на приборе «Терцик» (ДНК-технология, Россия). Температурный режим подбирали с учетом длины амплифицированного фрагмента, длины и состава используемых праймеров. Выделение и очистку ПЦР продуктов проводили с использованием набора DNA extraction kit (Fermentas, Литва).

Выделение и очистка белков с помощью аффинной хроматографии. Клетки £. coli TGI, содержащие плазмиды pGEX-LuxR, pGEX-LuxRAN или pGEX- LuxRAC, растили в среде LB с ампициллином. При достижении средней стадии экспоненциальной фазы в среду добавляли индуктор изопропил-р-И-тиогалактопиранозид (ИПТГ) и продолжали инкубировать 2-3 ч при 37°С. Затем клетки инкубировали еще 12 ч при 18°С. Клетки осаждали центрифугированием и переводили в охлажденный lxPBS (140 мМ NaCI, 2.7mM KCl, ЮшМ Na2HP04, 1.8 KH2P04 ,pH 7.3) с добавлением 0,5% тритон X-100. Клетки лизировали при помощи ультразвуковой дезинтеграции, лизат центрифугировали при 18.000g 20 мин на холоду. Супернатант дважды пропускали через колонку с глутатион-агарозой. После адсорбции колонку промывали lxPBS, освобождаясь от несвязавшихся белков. Химерные белки GST-LuxR, GST-NTD и GST-CTD элюировали раствором восстановленного глутатиона. Белковые фракции анализировали при помощи электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (0.1% додецилсульфат натрия - SDS) согласно Лэммли (Laemmli U. К., 1970).

Измерение экспрессии генов /«jdCDABEG A. fischeri в клетках Е. coli Экспрессию /шг-генов контролировали, измеряя интенсивность биолюминесценции клеток. Измерение интенсивности биолюминесценции суспензии клеток проводили с помощью люминометра "Биотокс-7" и микропланшетного люмннометра LM-01T (Immunotech) при комнатной температуре. При оценке люциферазной активности в бактериях Е. coli (pF2) к 200 мкл суспензии клеток добавляли 2 мкл я-деканаля (6,8 мкМ) и через 30 сек -1 мин измеряли интенсивность биолюминесценции.

Термоинакгивация и рефоддипг люциферазы. Кинетику и уровень рефолдинга термоинактивированных люцифераз измеряли in vivo в клетках Е. coli, содержащих гибридную плазмиду pF2 с генами luxAB. Бактерии росли при 28°С с аэрацией до ранней экспоненциальной фазы (OD = 0.2-0.3), а затем при 42°С в течение 30 мин без перемешивания для индукции белков «теплового шока». После этого для ингибирования синтеза белка к суспензии клеток добавляли хлорамфеникол (167 мкг/мл) и выдерживали на водяной бане при повышенной температуре (46°С) для инактивации люциферазы. Рефолдинг люцифераз проводили при комнатной температуре. Через определенные интервалы времени отбирали пробу суспензии клеток (200 мкл) и сразу после добавления n-деканаля (субстрат люциферазной реакции) измеряли интенсивность биолюминесценции.

2. Роль шаперонина GroEL и кошаперонина GroES в регуляции экспрессии генов /ux-оперона А. fischeri в клетках Я coli

Ранее было показано, что клетки Е. coli , мугагпше по генам groEL и groES, содержащие плазмиду с полным /кг-опероном А. fischeri, характеризуются значительно сниженным уровнем биолюминесценции (Dolan & Greenberg,1992). Влияние мутаций в гене groEL на экспрессию /ux-оперона А. fischeri ограничивается геном luxR и его продуктом белком-акгивагором LuxR. Этот вывод следует из данных, полученных с помощью сконструированной плазмиды pVFRl. В плазмиде pVFRl клонирован ген luxR совместно с регуляторной областью Imг-оперона с промоторами Р/ и Р, А. fischeri, а вместо генов /«xICDABE A. fischeri встроена кассета с генами luxCDABE Photorhabdus luminescens, кодирующими термостабильную люциферазу. Транскрипция правого промотора Рг и, соответственно, синтез люциферазы инициируется введением в среду молекул АИ.

На Рис.1 представлены данные эксперимента. Как видим, значительное снижение интенсивности биолюминесценции имеет место в клетках штамма OFB11 lgroEL673,

содержащих плазмиду рУЬ'К]. Т.к. структурные гены /гаСОАВЕ Р. Ыттгксет, клонированные в плазмиде рис, показывают одинаковую интенсивность люминесценции в штаммах ЗКВ178 '¿го* и ОИВ111£гоЕ1_673 (данные не представлены), то, следовательно, в случае плазмиды рУРЯ! влияние шаперонина ОгоЕЬ имеет место на белок ЬихК.

Рисунок. 1. Зависимость интенсивности биолюминесценции клеток Я. coli SKB178 gro* и OFВ111

groEL673 от времени инкубации при 22°С. Клетки ночной культуры инокулировали с начальной OD = 0.01 и растили в среде LB с ампициллином (100 мкт/мл) с аэрацией при 28°С до OD = 0,4-0,5. Затем инкубировали 30 мин при 42°С для инактивации белка LuxR. После добавления аутоиндуктора (конечная концентрация 5-10"8 М), продолжали инкубацию без перемешивания при 22°С. Через определенные интервалы времени отбирали пробы по 200 мкл и измеряли интенсивность биолюминесценции. Штаммы содержали атазмиду pVFRl: (□)- SKB 178 gro*-(в) - OFB11 lgroEL673.

Белок LuxR состоит из двух доменов: С- концевой домен (88 аминокислотных остатков) определяет контакт белка с /га-боксом в ДНК (ДНК - связывающий домен), а N-концевой домен (162 аминокислотных остатков) отвечает за связывание с АИ.

Так как LuxR состоит из двух доменов с различными функциями, было проведено сравнительное исследование влияния шаперонина GroEL на эффективность действия цельного LuxR и его С-домена в качестве активаторов транскрипции генов /шюперона А. fischeri в клетках Е. coli. Для этой цели использовались сконструированные гибридные плазмиды pLuxR или pLuxRÄN. На рис. 2 приведены кривые зависимости интенсивности биолюминесценции от времени инкубации клеток Е. coli SKB178 gro+ и OFB111, содержащих плазмиду рОМ (с генами taCDABEG) и плазмиду pLuxR (продуцирует полноразмерный белок LuxR) или pLuxRÄN (продуцирует С - домен белка LuxR).

Как видно из Рис.2, наличие в клетках Е. coli SKB 178 gro+(pOM) дополнительной плазмиды pLuxR или pLuxRÄN приводит к резкому увеличению интенсивности

биолюминесценции в связи с активацией транскрипции генов /ихГСОАВЕ с промотора Ря. Мутация £тоЕЬ673 резко снижает интенсивность биолюминесценции в бактериях, содержащих плазмиду рЬихЯ (определяет синтез цельного ЬихЯ). Однако, если в качестве активатора транскрипции используется С - домен белка ЬихЯ (плазмида рЬихКДЫ), то мутация ¿гоЕЬ673 не влияет на экспрессию генов /цхЮОАВЕ.

Рисунок 2. Влияния шаперонина GroEL на эффективность действия цельного LuxR и его С-домена в качестве активаторов транскрипции генов /ги-опсрона A. fischeri. Отдельные колонии клеток, выросших на агаризованной среде при 37°С, переводили в L-бульон и дважды отмывали центрифугированием. Затем клетки ресуспендировали в 200 мкл L-бульона и измеряли биолюминесценцию. (•)SKB178gro+(pLuxRAN, рОМ), (*)OFBl 1 l¿voEL673(pLuxRAN, рОМ), (A)SKB178gro+(pLuxR, рОМ), (□)OFBl 1 ] groEL673(pLuxR, рОМ), (■)SKB178gro+ (рОМ), (♦)OFB 11 lgroEL673 (рОМ).

Таким образом, в опытах ln vivo было показано, что шаперонин GroEL не требуется для фоддинга С-концевого домена белка LuxR. Предполагается, что шаперонин GroEL специфически связывается с N-концевым доменом белка LuxR.

3. Аффинная очистка белка LuxR, его С - и N - доменов. Электрофоретическое разделение в полиакриламидном геле белка LuxR, его С - и N - доменов

Для прямой проверки связывания GroEL с N-концевым доменом LuxR были сконструированы генетические конструкции, определяющие синтез химерных белков: GST-LuxR (глутатион трансфераза (GST), которая трансляционно слита с полноразмерным LuxR), GST-A(163-250)LuxR (GST, трансляционно слитая с N-концевого доменом белка LuxR (GST-NTD)) и GST-Д (2-162)LuxR (GST, трансляционно слитая с С-

100000

О 10 20 30 40 50 60 70

t, мин

концевым доменом белка ЬихЯ (ОБТ-СТО)). Плазмиды получили названия рОБТ- ЬихК, рОБТ-ЫТО и рОБТ-СТО. Данная система позволяет проводить эффективную аффинную очистку на колонке с глутатион-агарозой. Полученные белковые фракции разделяли при помощи электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в присутствии БОБ.

На Рис. 3 представлены данные вОБ - электорофореза полученных белковых фракций. Как видно из рисунка, при аффинной очистке вместе с полноразмерным белком ОЗТ-ЬихЯ и его Т^-доменом (С5Т-ЫТО) выделяется дополнительная полоса в 60 ГОа. Однако, при аффинной очистке С - домена белка ЬихК. (ОБТ-СТО) эта полоса отсутствует.

Рисунок 3. SDS-электрофорез в полиакриламидном геле (12%) белковой фракции, полученной в результате аффинной хроматографии на колонке с глутатион-агарозой. Белковую фракцию выделяли из клеток штаммов Я coli TG-1, содержащих pGST-CTD (дорожка 1), pGST-LuxR (дорожка 2) и pGST-NTD (дорожка 3). На дорожках 1 и 3 так же присутствует полоса глицерол - киназы (56,2 кДа), а на дорожке 1 и 2 полоса элонгационного фактора EF-Tu (43,3 кДа) (согласно масс-спектрометрическому анализу эти полосы соответствуют глицерол -киназе и элонгационному фактору EF-Tu). Эти белки сопровождают GST белок при мягких условиях отмывки.

Масс-спектрометрический анализ показал, что белок, выделенный из полосы 60 кДа, по составу и распределению пептидных фингерпринтов согласно базе данных SWISS-PROT является шаперонином GroEL (Табл. 2).

Таблица 2. Результаты фингерпринт-анапиза* пептидов, полученных энзиматическим

(трипсин) расщеплением белков, элюированных из акриламидного геля после ЭОЗ-__электрофореза.

Белковые полосы** Белок сравнения Число совпадающих петидов -10*Log(P)***

54,8 Юа 2-я дорожка GST-LuxR 15 144

57,6 ГОа 2-я дорожка GroEL 15 264

57,6 ГОа 3-я дорожка GroEL 15 242

36,4 ГОа 1 -я дорожка GST-CTD 14 183

45 ГОа 3-я дорожка GST-NTD 16 178

* Сравнение пептидных масс по базе данных NCBlnr при помощи поисковой программы Mascoi

(www.matrixscience.com).

** Данные SDS-электрорфореза (Рис. 3).

*** Значимость совпадения с белком сравнения определяется как -10*Log(P) где Р - вероятность случайности совпадения. При -10*Log(P) > 72 совпадение считается неслучайным (р < 0,05)

Таким образом, было показано, что в условиях ш vivo GroEL шаперонин связывается с полноразмерным LuxR и его N-доменом, но не связывается с С-доменом LuxR. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что N-концевой домен LuxR белка является мишенью для GroEL шаперонина при фолдйнге. Можно сделать предположение, что GroEL шаперонин необходим для фоддинга только N-концевого домена белка LuxR.

4. Компенсация gro мутации высокими концентрациями аутоиндуктора

На рис. 4 приведена зависимость максимальной интенсивности биолюминесценции клеток SKB178 gro* и OFBlllgroEL673, содержащих плазмиду pVFRl от концентрации АИ. Клетки ночной культуры инокулировали с начальной OD = 0.01 и растили в среде LB с ампициллином (100 мкг/мл) с аэрацией при 28°С до экспоненциальной фазы (OD = 0,40,5). Затем инкубировали 30 мин при 42°С и после добавления различных концентраций АИ, - М-(З-оксогексаноил) лактон L-гомосерина, («Сигма»), продолжали инкубацию без перемешивания при 22°С. Через определенные интервалы времени отбирали пробы по 200 мкл и измеряли интенсивность биолюминесценции. Максимальная интенсивность биолюминесценции наблюдается через 60 мин.

Рисунок 4. Зависимость максимальной интенсивности биолюминесценции клеток 5КВ178 ¿го* и ОРВ11 1£гоЫ.673 от концентрации АИ.

(0)-5КВ178гго*(р\та1); (М)-ОРВ11 \grdEh673 (р\ТК 1).

Как видно на Рис.4, если минимальная (пороговая) концентрация АИ в случае штамма 8КВ178 ¡?о+ равняется около 10" 9 М, то для мутантного штамма ОРВ111^оЕЕ673 пороговая концентрация АИ составляет около 10'7М. Таким образом,

дефект в мутантном гене grc¡EL673 в определенной степени можно компенсировать при добавлении в среду высоких концентраций АИ.

5. Роль АТФ-зависимых протеаз Lon и ClpXP в регуляции экспрессии генов lux-оперона А. fischen в клетках Е coli.

Другими дополнительными факторами, влияющими на экспрессию /¡¿х-генов А. fischen, являются АТФ-зависимые протеазы. В отличие от шаперонииов GroEL/ES, АТФ-зависимая протеазы Lon и ClpXP участвуют в негативном контроле экспрессии lux-оперона. На Рис.5 приведены кривые зависимости интенсивности биолюминесценции (1) от OD суспензии клеток Е. coli ABl 157 Inn' clp*, NK113 clpV::cat, NK114 clpX:kan и AB1899 lonAl, содержащих гибридную плазмиду pFl с /ux-опероном A.fischeri.

О 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75

Рисунок 5. Влияние мутаций в генах clpX, clpP. lon на экспрессию генов /шс-оперона А. fischen в клетках Е. coli; зависимость интенсивности биолюминесценции (I) от отической плотное™ (OD). Бактерии росли при 30°С на L-среде с 1,7% агаром. Ночную культуру инокулировали в жидкую LB и растили при 30°С с аэрацией. Экспрессию /шг-генов контролировали, измеряя интенсивность биолюминесценции клеток. Все используемые штаммы содержали плазмиду pFl с /ги-опероном А. fischeri.

(*) - ABl 157 hn'clp t (■)-КК113фР.со/, (À) - NK114 cipX::kan, (♦)- AB 1899 lon AI.

Как видим, клетки штамма AB 1899, мутантные по гену lonA, люминесцируют на несколько порядков ярче по сравнению с клетками штамма ABl 157 clp+ Ion* при всех значениях OD. Повышенный уровень интенсивности биолюминесценции характерен и для бактерий NK113 и NKU4, мутантных по генам clpP и clpX, однако, он несколько ниже, чем для штамма АВ1899 lonAl.

Ранее было показано, что мишенью для протеазы Lon является активатор транскрипции белок LuxR (Манухов И.В. и др., 2006). Соответственно, повышенное содержание LuxR в бактериях, мугантных по гену Ion, определяет как более раннее открытие правого промотора Pr (АВ1899 - OD около 0.4 - 0.5; ABl 157 - OD около 0.9 -1.0), так и высокий уровень экспрессии генов lux-оперона, что фиксируется по превышению интенсивности биолюминесценции клеток AB 1899 примерно на четыре порядка по сравнению с таковой для бактерий штамма ABl 157 (Рис.5).

На основании данных, представленных на Рис.5, можно заключить, что, помимо Lon-протеазы, в негативной регуляции экспрессии генов ÍMX-оперона участвует также протеаза ClpXP, однако ее вклад в данный эффект значительно ниже. Начало экспрессии /иг-генов в клетках штаммов NKU3 и NK114 фиксируется при более высоком значении OD около 0.6 - 0.7, а усиление интенсивности биолюминесценции не превышает двух порядков по сравнению с таковой для бактерий штамма AB 1157 (Рис.5).

Было проведено сравнительное исследование влияния Lon-протеазы на эффективность действия цельного LuxR и его С-домена в качестве активаторов транскрипции генов /ш:-оперона А. ßscheri в клетках Е. coli.

Для оценки действия Lon - протеазы на LuxR и его С-домен гибридные плазмиды pLuxR или pLuxRAN были введены в клетки штаммов Е. coli SG22163 maIP::laclq и SG22186 maíP::lac¡qA!on, содержащие плазмиду рОМ. Бактерии росли при 30°С на L-среде с 1,7% агаром. Ночную культуру инокулировали в жидкую LB и растили при 30°С с аэрацией до OD 0.2-0.3. Далее к суспензии клеток добавляли ИПТГ (0 - минут) для индукции транскрипции с lac промотора и, соответственно, синтеза белков LuxR или его С-домена, а для активации LuxR добавляли в среду АИ (для проявления активности С-домена АИ не требуется). После этого клетки продолжали инкубировать при комнатной температуре без перемешивания с измерением интенсивности биолюминесценции через определенные интервалы времени. На Рис.6 представлены результаты этого эксперимента.

Как видим на Рис. 6а, интенсивность биолюминесценции клеток SG22186 Alón (pLuxR, рОМ) быстро нарастает уже в течение первых 15 мин с момента добавления ИПТГ и АИ, что указывает на наличие в клетках в момент начала индукции (0-минут) количества молекул LuxR, достаточного для активации Рг промотора /цх-оперона. Однако, в клетках штамма SG22163 Ion+ (pLuxR, рОМ) индукция транскрипции генов lux-оперона начинается лишь через 70 мин после добавления ИПТГ (0,1-1,0 мМ) и АИ (10" 7М), что объясняется деградацией белка LuxR протеазой Lon.

а)

б)

1000

10000

0 15 30 45 60 75 90 105 t, мин

1000

- 100

30 60 90 120 150 180 t, мин

Рисунок 6. Влияние Lon - протеазы на активность LuxR и его С - концевого домена как индукторов экспрессии генов lux-onepoHaA-fischeri. Зависимость интенсивности биолюминесценции (I, отн.ед.) клеток штаммов SG22163 Ion*- и SG22186 Alón, содержащих плазмиды pLuxR и рОМ(а) или pLuxRAN и рОМ(б), от времени инкубации при комнатной температуре. Начало инкубации (0-минут) определяется добавлением к опытным образцам ИПТГ (0,1 мМ) и АИ (10"7М).

(•) SG221861Поп (pLuxR, рОМ) (+ИПТГ.+АИ), (♦) SG22186 Alón (pLuxR, рОМ) (-ИПТГ,-АИ), (A) SG22163 lort- (pLuxR, рОМ) (+ИПТГ,+АИ), (X) SG22163 /оп+ (pLuxR, рОМ) (-ИПТГ.-АИ).

(О) SG22186 Alon (pLuxRAN, рОМ) (+ИПТГ), (0) SG22186 Alón (pLuxRAN, рОМ) (-ИПТГ), (A)SG22163 loiH- (pLuxRAN, рОМ) (+ИПТГ), (*) SG22163 (on+ (pLuxRÄN, рОМ) (-ИПТГ).

Иная картина имеет место, если в клетки введена плазмида pLuxRAN, кодирующая С-домен белка LuxR (Рис. 66). Как видим, как в клетках SG22163 lon+ (pLuxRAN, рОМ), так и SG22186 Ahn (pLuxRAN, рОМ) экспрессия /их-генов стартует через 100 мин с момента добавления ИПТГ (0,1-1,0 мМ). Следовательно, лишь цельный белок LuxR, но не его С-домен, является мишенью для Lon- протеазы.

На основании данных, представленных в настоящей работе, можно предложить следующую схему формирования активной формы LuxR, положительного регулятора (активатора) транскрипции генов fe-оперона А. flscheri (Рис.7). На первой стадии в результате синтеза на рибосоме образуется структура с полностью сформированным С-доменом и слабо упакованным («рыхлым») N-доменом (форма LuxR*). На второй стадии N-домен LuxR* контактирует с шаперонином GroEL, что обеспечивает последующий процесс фолдинга белка, завершаемый формированием компактной структурой N-домена (форма LuxR**). Белок LuxR** еще не способен активировать транскрипцию /ггх-генов, так как N-домен частично закрывает С-домен, блокируя формирование комплекса С-домена с /га-боксом. На третьей стадии N-домен белка LuxR** образует комплекс с молекулой АИ (3-0=6HSL), что обеспечивает мономерам белка формировать активный

димср (ЬихЯ-АИ)2, в котором 1Ч-домены обеспечивают контакт мономеров, а открытые С-домены формируют комплекс с 1их-боксом.

Необходимо отметить, что Ы-домен белка ЬихЯ** характеризуется очень низкой константой диссоциации при комплексировании с АИ: пороговая концентрация АИ, при которой активируется экспрессия 1их-генов, порядка 10"9М (что соответствует примерно 34 молекулам АИ в расчете на объем бактериальной клетки).

Как показано в настоящей работе, белок в форме ЬихЯ* (образующийся непосредственно после синтеза на рибосоме) также способен формировать комплекс с АИ с последующей димеризацией ЬихЯ. Однако, в этом случае константа диссоциации для процесса комплексообразования примерно на два порядка выше: пороговая концентрация АИ равна примерно Ю'7М, что соответствует уже 300-400 молекулам АИ в расчете на клетку. Эта цифра слишком велика и не дает клетке возможности провести нормальную ОБ -регуляцию транскрипции генов, так как активация генов будет происходить лишь при очень высоких плотностях популяции. Поэтому можно считать роль системы шаперонинов ОгоЕЬ/ЕЗ ключевой в системах регуляции типа 05.

Рисунок 7. Предполагаемая схема взаимодействия полипептидной цепи ЬихЛ с шаперонином ОгоЕЬ и аутоиндуктором (АИ) во время синтеза на рибосоме и формирования нативной

структуры.

ЬихЛ* - форма белка непосредственно после синтеза на рибосоме,

ЬихЯ** - форма белка в результате прохождения полипептида через систему шаперонинов ОгоЕЬ/ЕБ.

(ЬихК-АЩ; - активная димерная форма белка Ьих1? в комплексе с АИ.

7. Изучение механизма защитного действия бактериальных шаперонов семейства HsplOO при термоинактивации белков в клетке.

Следующая часть диссертационной работы посвящена изучению влияния шаперонов непосредственно на экспрессию структурных генов /их-оперона А. ßscheri, а именно на структурные гены luxAB, определяющие синтез а - и ß - субъединиц бактериальной люциферазы.

Ранее было показано, что шаперонин GroEL и АТФ - зависимые протеазы Lon и ClpXP не влияют напрямую на активность бактериальной люциферазы. Основная группа шаперонов, принимающая непосредственное участие в процессах фолдинга и рефолдинга белков в клетках Escherichia coli - это семейство Hsp70 (DnaK-DnaJ-GrpE). В частности система шаперонов DnaK-DnaJ-GrpE (DnaKJE) ведет процесс рефолдинга термоинактивированной бактериальной люииферазы А. ßscheri. Без этой системы шаперонов процесс восстановления термоинактивированной люциферазы невозможен, поэтому далее мы всегда будем иметь в виду только DnaKJE - зависимый рефолдинг.

Однако помимо шаперонов DnaKJE в процессе рефолдинга и дезагрегации белковых агрегатов в бактериальной клетке принимает участие целый ряд других белков -шаперонов. В работе (Wickner S.et al., 1994) было показано, что присутствие белка ClpA в смеси с ферментом in vitro в момент тсрмоинактивации позволяет проводить эффективный рефолдинг этого фермента при последующем добавлении к смеси шаперонов DnaKJE. Авторы предположили, что ClpA защищает фермент от агрегации. В работе (Dougan D.A. et al., 2002) с помощью метода светорассеяния in vitro на модели термоинактивированных ферментов MDH и светлячковой люциферазы было продемонстрировано, Что шаперон ClpA активно участвует в АТФ - зависимой дезагрегации агрегированных форм белков. Однако, относительно участия ClpA in vivo в дезагрегации и рефолдинге денатурированных белков в клетках Е. coli экспериментальные данные отсутствуют.

Для оценки влияния шаперона ClpA на рефолдинг бактериальной люциферазы in vivo нами была использована плазмида pF2, в которой гены luxAB, определяющие синтез бактериальной люциферазы A.fischeri, расположены под промотором Рь*. Бактерии росли при 30° с аэрацией до OD = 0,4-0,5 с последующей инкубацией при 42°С 30 мин для индукции белков отеплового шока». Затем к суспензии клеток для ингибирования синтеза белка добавляли хлорамфеникол (167 мкг/мл), и культуру переносили в водяную баню при температуре (46°С) для инактивации люциферазы. Рефолдинг термоинактивированной люциферазы проводили при комнатной температуре.

а) б)

Рисунок 8. Влияние мутации clpA::kan на кинетику и уровень DnaKJE-зависимого рефолдинга термоинактивированной люциферазы А. fischeri. Кинетика рефолдинга люциферазы А. fischeri в клетках Е. coli MG1655 clpA*(a) и MG1655 clpAv.kan (б) при различной длительности инкубации клеток при 46°С. По оси ординат отложена активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс отложено время рефолдинга люциферазы при 25°С.

Продолжительность инкубации при 46°С: (А)- 5 мин, (Д) - 15 мин, (О)- 30 мин, (•)- 60 мин.

На Рис. 8 приведены кинетические кривые ренатурации люциферазы А. fischeri (в %% от исходного уровня) в зависимости от времени рефолдинга при 25С при различной длительности инактивации фермента при 46°С. В клетках Е. coli MGI 655 dnalC clpA* рефолдинг практически полный (до 80-90% от исходного уровня) после 5-10 мин инактивации. При пролонгировании процесса термоинактивации (30 мин и более) уровень рефолдинга лишь несколько снижается (Рис. 8а). Иная картина наблюдается в случае мутантного штамма MG1655 clpAv.kan. Как видно из данных, представленных на Рис. 86, уровень рефолдинга несколько ниже уже при небольших временах термоинактивации (5 мин), и он быстро спадает практически до фонового уровня при увеличении времени при 46°С более 30 мин.

По-видимому, недостача шаперона ClpA наблюдается только при пролонгированной термоинактивации люциферазы, когда образуются более крупные агрегаты, для дезагрегации которых и необходим шаперон ClpA.

Помимо шаперонов DnaKJE и шаперона ClpA в процессе рефолдинга белковых агрегатов в бактериальной клетке принимают участие малые белки - шапероны IbpA и IbpB (принадлежащие семейству АТФ-независимых шаперонов sHsp). Как показано в ряде работ, шапероны IbpA и IbpB образуют комплексы с белковыми агрегатами, что приводит к ускорению процесса дезагрегации, причем, в процессе рефолдинга, как

такового, шапероны IbpAB не участвуют (Laskowska Е., et al.,1996; Kuczynska-Wisnik D., et al.,2002; Mogk A., et al.,2003). Согласно данным, полученным в опытах in vitro, наличие IbpAB в смеси с белком-субстратом защищает белки от термоденатурации, снижая уровень агрегации, что фиксируется методом светорассеяния (Mogk A., et al.,2003).

Для оценки влияния шаперонов IbpAB на рефолдинг бактериальной люциферазы in vivo использовали плазмиду pF2. Термоинакгивацию и рефолдинг люциферазы проводили согласно описанной выше методике.

а) б)

Рисунок 9. Влияние мутаций в генах ibpk и ¡6рВ на кинетику и уровень DnaKJE-зависимого рефолдинга термоинактивированной люциферазы А. flscheri. Кинетика рефолдинга люциферазы А. fischen после инкубации клеток 5 мин (а) и 60 мин (б) при 46°С. По оси ординат отложена активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс отложено время рефолдинга люциферазы при 25°С. Все штаммы содержали плазмиду pF2. (♦) - BW25113 ibpk* ibpB*dnaK* (Ш) - JW3664 ibpA::kan, (А) - JW3663 ibpB::kan, (+)-JW0013 dnaK::kan.

На Рис. 9 приведены кинетические кривые зависимости уровня рефолдинга (ренатурации) люциферазы А. fischeri (в % % от исходного уровня) от времени инкубации при температуре 25°С. Отметим, что в клетках мутантного штамма JW0013 dnaK::kan рефолдинг белка полностью отсутствует. В клетках Е. coli BW25113 dnaYJ ibpAB* имеет место быстрый и практически полный рефолдинг, до 80-90% от исходного уровня, если время термоинактивации при 46°С пять мин (Рис. 9а). При термоинактиващш в течение 60 мин при 46°С уровень рефолдинга снижается примерно в два раза (Рис. 96).

Иная картина наблюдается в случае мутантных штаммов JW3663 ibpB::kan и JW3664 ibpkv.kan. Как видно из данных, представленных на Рис. 9, наблюдается замедление

процесса рефолдинга, а также снижение уровня рефолдинга, что особенно проявляется при 60 - минутной термоинаетивации. Имеет место также различие в способности вести рефолдинг люциферазы у мутантных штаммов: в штамме ^3663 «'ЬрВ::кап замедление скорости и снижение уровня рефолдинга выражены значительно сильнее, чем в штамме Ж36641ЬрА::кап.

Введение в мутантные клетки ШЗббЗ /ЬрВ::кап и JW3664 ¡ЬрА::кап плазмиды рОМ1ЬрАВ (вектор р2833, содержащий гены ¡ЬрАВ под промотором Ршясм) практически полностью компенсирует дефекты генома и даже усиливает процессы рефолдинга выше уровня, наблюдаемого в диком штамме, что, по-видимому, определяется копийностью плазмиды (Рис. 10).

а) б)

Рисунок 10. Влияние плазмиды pOMibpAB на кинетику и уровень DnaKJE - зависимого рефолдинга термоинактивированной люциферазы А. flscheri. Кинетика рефолдинга А. flscheri после 60 мин инкубации клеток при температуре 46°С в Е. coli JW3664 ibpA::kan (а) и JW3663 ¡ЬрВ::кап (б). По оси ординат отложена активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс - время рефолдинга люциферазы при 25°С. (♦) - BW25113 ibpA' ibpB*dnaK*(pF2), (■) - JW3664 ibpAr.kan (pF2), (А) - JW3664 ibpAr.kan (pF2, pOMibpAB), (*)- JW3663 ibpB::kan (pF2), (•) - JW3663 ibpB::kan (pF2, pOMibpAB).

Представляло интерес сравнить влияние шаперонов IbpAB и ClpA на DnaKJE-зависимый рефолдинг денатурированных белков и оценить возможность компенсировать недостачу шаперона ClpA малыми шаперонами IbpAB,

На Рис. 11 приведены кинетические кривые ренатурации люциферазы А. flscheri (в %% от исходного уровня) в зависимости от времени инкубации при температуре 25°С в клетках Е. coli MG1655 с//)А+и MG1655 clpA::kan.

Как видим, при длительной термоинактивации при 46°С (60 мин) уровень рефолдинга люциферазы в мугантном штамме Мй1655 с1рА::кап значительно снижен по сравнению с таковым в штамме М01655 с!рА*. Этот результат соответствует ранее полученным данным о важности шаперона С1рА в процессе рефолдинга белков при пролонгированной инкубации клеток при высокой температуре.

Рисунок 11. Влияние плазмиды pOMibpAB на кинетику и уровень DnaKJE - зависимого

рефолдинга термоинактивированной люциферазы Л. flscheri в клетках MG1655 clpA* и MG1655

clpA::kan после 60 мин инкубации клеток при температуре 46°С. По оси ординат отложена

активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс - время рефолдинга

люциферазы при 25°С.

(♦) - MG1655 c//>A+(pF2);

(■) - MG 1655 c//?A::fam(pF2);

(А) - MG1655 clpAr.kan (pF2, pOMibpAB).

Можно было предположить, что при сходных эффектах (защита белков-субстратов от агрегации) ClpA и IbpAB, фиксируемых в опытах in vitro (Laskowska Е., et al . l 996; Kuczynska-Wisnik D., et al.,2002; Mogk A., et al.,2003), малые шапероны IbpAB способны компенсировать дефект клетки по гену с/рА. Однако, как это представлено на Рис. 11, наличие в мушпных по гену clpA бактериях Е. coli MG1655 clpA:.kan плазмиды pOMibpAB не повысило эффективность процесса рефолдинга длительно термоинактивированной люциферазы. Можно предположить, что шапероны IbpAB и ClpA действуют на разных этапах процессов дезагрегации и репатурации белков и независимо друт от друга.

100

О 5 10 15 20 25 30 35 t, мин

выводы

1. Показано, что шаперонин GroEL системы GroEL/ES необходим для фолдинга цельного LuxR, но не его С-домена;

2. Показано, что АТФ-зависимые протеазы Lon и ClpXP осуществляют протеолитический контроль экспрессии генов /«х-оперона Aliivibrio fischeri в клетках Escherichia coli;

3. Показано, что мишенью для протеазы Lon является цельный LuxR, а не его С-домен;

4. Показано участие шаперонаС1рА (семейство HsplOO) в рефолдинге термоинакгивированной люциферазы при пролонгированной термоинактивации;

5. Показано, что мутации в генах ibpA и ibpB снижают скорость и уровень рефолдинга, причем недостаток шаперона1ЬрВ сказывается сильнее, чем недостаток шаперона IbpA;

6. Показано, что повышенное содержание белков IbpA и IbpB, компенсируя дефекты в генах ibpA и ibpB, не компенсирует дефекты в гене clpA.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1) Котова В. Ю., Манухов И. В., Мелькина О. Е., Завилыельский Г. Б. Мутация clpA:kan в гене, кодирующем шаперон семейства HsplOO, значительно снижает эффективность DnaK-зависимого рефолдинга белков в бактериях Escherichia coliН Молекулярная биология 2008, т. 42, №6, с.1018-1022.

2) О. Е. Мелькина, И. В. Манухов, Г. Б. Завилыельский. С - домен LuxR, активатора транскрипции /цх-оперона Vibrio fischeri, не является мишенью для Ion - протеазы. // Молекулярная биология 2010, т. 44, № 3, с.515-519.

3) О. Е. Мелькина, И. В. Манухов, Г. Б. Завилыельский. Протеолитический контроль экспрессии генов /их- оперона Vibrio fischeri в клетках Escherichia cot ¿//Генетика 2010, Т.46, №8, с.1050-1056.

4) Иуа V. Manukhov, Ol'ga Е. Melkina, Ignatii I. Goryanin, Ancha V. Baranova, and Gennadii B. Zavilgelsky. The N-terminal domain of the Aliivibrio fischeri LuxR is a target of the GroEL chaperonin. II Journal of Bacteriology 2010, V192,20, P5549-5551.

Материалы конференций:

1) Мелькина О. Е.. Манухов И. В., Завилыельский Г. Б. GroEL шаперон необходим для фолдинга N-концевого домена LuxR - активатора транскрипции lwc-oперона Vibrio fischeri. Материалы III Российского симпозиума «Белки и пептиды», Пущино, 2007, с.83.

2) Мелькина О. Е.. Горянин И.И. GroEL шаперон необходим для фолдинга N-концевого домена LuxR - активатора транскрипции /кх-оперона Vibrio fischeri. Материалы V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва, 2009, с.71.

Подписано в печать: 12.10.2010

Заказ № 4274 Тираж - 90 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мелькина, Ольга Евгеньевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИИ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Цели и задачи

Научная новизна и практическая значимость работы

Структура работы

Апробация работы

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Quorum Sensing системы

1.1. LuxI/LuxR-зависимая регуляция биолюминесценции у морских бактерий A. fischeri

1.2. Ацил-Ь-гомосерин лактоны (AHL) и их взаимодействие с LuxRподобными белками

1.3. Внутриклеточные факторы регуляции экспрессии генов, входящих в регулоны систем QS

Глава 2. АТФ-зависимые протеазы и шапероны

2.1. Молекулярные шапероны бишаперонной системы DnaKJE-ClpB

2.2. Шаперонины GroEL/GroES

2.3. Участие малых белков-шаперонов и шаперона ClpA в процессах дезагрегации и рефолдинга белков

2.4. АТФ-зависимые протеазы

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Материалы и методы исследования

3.1. Бактериальные штаммы и плазмиды

3.2. Генно-инженерные методы

3.3. Конструирование плазмид

3.4. Выделение и очистка химерных белков

3.5. Измерение экспрессии генов /torlCDABEG A. fischeri в клетках coli

3.6. Термоинактивация и рефолдинг люциферазы

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 46

Глава 4. Исследование влияния и*механизма действия*шаперонина

GroEE на фолдинг- белкаЬихЫ и его делетированных форм 46'

4.1. Ролыиаперонина GroEL и кошаперонина GroES-в регуляции экспрессии генов livc-onepouaA.fîscheri в клетках Е. coli

4l2i Аффинная очистка белка LuxR; его С - и N - доменов

Электрофоретическое разделение в полиакриламидном геле белка LuxR, его С - и N - доменов*

4.3*. Компенсация gro мутации высокимиконцентрациями аутоиндуктора

Глава1 5: Роль АТФ-зависимых протеаз Lon и» GlpXP в регуляции экспрессии генов /шс-оперона A.fischeri в клетках^. coli

5.1'. Протеолитический контроль регуляции экспрессии генов /ш:-оперона

A. fischeri в клетках Е. coli

5.2. Защитное действие АИ против протеаз Lon и ClpXP

5;3. Исследование влияния и механизма действия протеазы Lon на активность белка LuxR и его делетированных форм

5.4. Сравнение цельного LuxR и его С-домена по эффективности действиям качестве активатора транскрипции /шг-оперона A.fischeri

Глава 6. Изучение механизма защитного действия бактериальных шаперонов при термоинактивации белков* в клетке

6.1. Изучение механизма защитного действия бактериальных шаперонов семейства HsplOO при термоинактивации бактериальной люциферазы А. fischeri в клетках Е. coli

6.2. Влияние мутации в гене clpA на индукцию белков «теплового шока»

6.3. Влияние шаперонов IbpAB на DnaK-зависимый рефолдинг бактериальной люциферазы A. fischeri в клетках Е. coli

Введение Диссертация по биологии, на тему "АТФ - зависимые протеазы и шапероны как эффективные регуляторы экспрессии генов lux-оперона Aliivibrio fischeri"

Актуальность проблемы. Системы регуляции экспрессии генов- типа "Quorum Sensing" (QS) у бактерий определяют тесную связь процесса транскрипции с плотностью популяции, - экспрессия группы генов начинается^ лишь при достижении популяцией бактерий определенной (критической) концентрации. Сам термин QS был впервые введен-в обиход в 1994 г Greenberg Е.Р. с сотр. (Fuqua W.C., et al., 1994). Однако феномен типа QS был обнаружен значительно раньше (в 1970-е гг) у морских бактерий Aliivibrio (ранее Vibrio) fischeri для группы /гаг-генов, ответственных за биолюминесценцию клеток (Nealson & Hastings, 1979). По названию ключевых генов /г/х-оперона A. fischeri livcl и luxR в последствие подобные системы относили к механизму регуляции типа LuxI/LuxR (Meighen Е.А., 1991).

В настоящее время QS регуляция обнаружена у большого числа видов как грам-положительных, так и грам-отрицательных бактерий и показано, что QS системы играют ключевую роль во взаимодействии бактерий с высшими организмами, в регуляции вирулентности бактерий, формировании биопленок, регуляции экспрессии генов, связанных с синтезом различных экзоферментов, токсинов, антибиотиков и других вторичных метаболитов, конъюгации и др.

Особенно велика роль QS систем в регуляции процессов взаимодействия патогенных бактерий с эукариотическим организмом - хозяином. Инфекционный процесс непосредственно связан с достижением популяцией патогенных бактерий критической плотности и соответственно с синхронным синтезом факторов вирулентности.

QS система также регулирует экспрессию генов, участвующих в формировании биопленки, которая является существенным фактором патогенности, так как при этом значительно повышается устойчивость бактерий к антибактериальным препаратам и защитному действию иммунной системы хозяина. Поэтому использование блокаторов QS системы в настоящее время рассматривается как новая перспективная стратегия антимикробной терапии.

Представляет особый интерес определить связь систем QS с основными* энергозависимыми системами в клетке, а именно, с АТФ-зависимыми протеазами и шаперонами, которые осуществляют деградацию денатурированных и ошибочно синтезированных белков (протеазы) ж проводят фолдинг и рефолдинг белков (шапероны).

Известно, что АТФ-зависимые протеазы и* шапероны также играют важную роль в ряде регуляторных каскадов, например, при переходе клеток, в стационарную фазу, при<"тепловом -шоке" и др. (Gottesman S., 1999; Weihart D. et al, 2003; TomoyasuT. et al, 2001). В настоящей работе на модели /их-оперона морских бактерий A. fischeri проведено изучение роли АТФ-зависимых протеаз и шаперонов в качестве модуляторов QS системы.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена поиску генов в хромосоме бактерий Escherichia coli, белки-продукты которых влияют на эффективность действия системы регуляции типа-QS. В'качестве модельной системы QS используется /шг-оперон- (/mxRICDABEG) морских светящихся бактерий A. fischeri. Предполагалось исследовать влияние белков-шаперонов и АТФ-зависимых протеаз на активность, белков-регуляторов, системы QS и ферментов люцифераз, гены которых (/шАВ) входят в состав /ш;-оперона. В работе решались следующие задачи:

1. Исследование влияниями механизма действия шаперонинов GroEL/GroES (семейство Hsp60) на фолдинг белка LuxR и его делетированных форм.

2. Исследование влияния и механизма действия протеазы Lon на активность белка LuxR и его делетированных форм. Проведение сравнительного анализа влияния Ьоп-протеазы на1 экспрессию генов lux-оперона A. fischeri в специально сконструированных модельных системах, в состав которых входят как плазмида с генами /их-оперона, так и плазмиды с фрагментами ДНК, кодирующими полный LuxR или его С-домен.

3. Изучение механизма защитного действия белков - шаперонов семейства HsplOO и малых белков - шаперонов при термоинактивации белков в клетке. Получение данных о влиянии- белков - шаперонов семейства С1р на рефолдинг белков.

Научная новизна. Впервые показано, что основную регуляторную функцию в белке LuxR несет N — домен (162 аминокислотных остатка), являющийся мишенью для Ьоп-протеазы и определяющий контакт полипептида с шапероном GroEL, необходимого для сборки нативной структуры LuxR. Впервые показано, что при DnaK-DnaJ-GrpE-зависимом рефолдинге денатурированных белков в клетках Е. coli значительное влияние на скорость и уровень рефолдинга оказывают малые шапероны- IbpA и особенно IbpB, а также шаперон ClpA, принадлежащий семейству HsplOO.

Практическая значимость. Основные результаты работы могут быть использованы на' практике: применение плазмиды с генами ibpAb при суперпродукции гетерологичных белков в бактериальных клетках Е. coli для повышения их растворимости; использование генов, кодирующих АТФ-зависимые протеазы, для ингибйрования систем QS и, как следствие, для снижения активности вирулентных генов у патогенных бактерий.

Структура работы. Диссертация изложена на 95 листах машинописного текста, включая 30 рисунков и 4 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка используемой литературы. Список литературы включает 125 работ отечественных и зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Мелькина, Ольга Евгеньевна

выводы

1 Показано, что шаперонин GroEL системы GroEL/ES необходим для фолдинга цельного LuxR, но не его С-домена;

2 Показано, что АТФ-зависимые протеазы Lon и ClpXP осуществляют протеолитический контроль экспрессии генов /шс-оперона Aliivibrio fischeri в клетках Escherichia coli;

3 Показано, что мишенью для протеазы Lon является цельный LuxR, а не его С-домен;

4 Показано участие шаперона ClpA (семейство HsplOO) в рефолдинге термоинактивированной люциферазы при пролонгированной термоинактивации;

5 Показано, что мутации в генах ibpA и ibpB снижают скорость и уровень рефолдинга, причем недостаток шаперона IbpB сказывается сильнее, чем недостаток шаперона IbpA;

6 Показано, что повышенное содержание белков IbpA и IbpB, компенсируя дефекты в генах ibpA и ibpB, не компенсирует дефекты в гене clpA.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Регуляторный белок LuxR состоит из двух доменов. N - домен (162 аминокислотных остатка) ответственен за связывание с АИ, а С - домена (88 аминокислотных остатков) ответствен за связывание с ДНК. В настоящей работе впервые показано, что действие шаперонинов GroEL/GroES и АТФ -зависимой протеазы Lon ограничивается N-доменом. В то время как С -домен резистентен к действию Lon протеазы, а его фолдинг не зависит от активности GroEL/GroES шаперонинов. Показано также, что в отсутствии GroEL/GroES шаперонинов высокие концентрации АИ (примерно в 100 раз выше нормы) обеспечивают правильную сборку белка LuxR. При связывании АИ с LuxR комплекс LuxR-АИ становится резистентным к действию протеаз. Настоящие результаты свидетельствуют, что у LuxR-подобных регуляторов собственно регуляторную функцию осуществляет N -домен, который «чувствует» не только наличие в среде специфических АИ, но также и определенные стрессовые воздействия как, например, «тепловой шок», переход клетки в стационарную фазу и др.

В настоящей работе впервые показано влияние шаперона С1рА (семейство НврКЮ) на РпаКШ зависимый рефолдинг термоинактивированных люцифераз. Показано, что влияние С1рА имеет место лишь при пролонгированном инкубировании клеток при высокой температуре, т.е. при условии формирования в клетке крупных белковых агрегатов. Малые шапероны 1ЬрАВ (семейство БШр) также участвуют в БпаЮЕ - зависимом рефолдинге люцифераз, однако в отличие от шаперона С1рА их действие проявляется и при малых временах термоинактивации. Показано, что наличие в клетке избытка шаперонов 1ЬрАВ не компенсирует недостачу шаперона С1рА. Предполагается, что шапероны 1ЬрАВ и С1рА действуют на разных этапах процессов дезагрегации и ренатурации белков и независимо друг от друга.

Результаты нашего исследования подтверждают гипотезу о регуляторной роли шаперонинов ОгоЕЬЛлгоЕЗ и АТФ - зависимых протеаз Ьоп и С1рХР в экспрессии генов С^Б системы типа Ьих1/Ьих11, в то время как шапероны С1рА, 1ЬрАВ и БпаКШ, необходимы для дезагрегации и рефолдинга термоденатурированных структурных белков /шс-оперона А. Азскеп.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мелькина, Ольга Евгеньевна, Москва

1. Atkinson S., Throup J.P., Stewart G.S., Williams P. 1999. A hierarchical quorum-sensing system in Yersinia pseudotuberculosis is involved in the regulation of motility and clumping. Mol Microbiol. 33, 1267-77.

2. Ahmer B.M., van Reeuwijk J., Timmers C.D., Valentine P.J., Heffron F. 1998. Salmonella typhimurium encodes an SdiA homolog, a putative quorum sensor of the LuxR family, that regulates genes on the virulence plasmid // J. Bacteriol. 180, 1185-1193.

3. Baldwin T.O., Christopher J.A., Raushel F.M:, Sincjair J.F., Ziegler M.M., Fisher A.J., Rayment I. 1995. Structure of bacterial luciferase. // Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 798-809.

4. Bairoch A., Apweiler R. 2000. The SWISS-PROT protein sequence database and its supplement TrEMBL 2000. // Nucleic Acids Res. 28, 45-48.

5. Bansal K., Yang K., Nistala G.J., Gennis R.B., Bhalerao K.D. 2010. A positive feedback-based gene circuit to increase the production of a membrane protein. // J Biol Eng. May 25; 4:6.

6. Bauer W.D., Robinson J.B. 2002. Disruption of bacterial quorum sensing by other organisms. // Curr Opin Biotechnol. 13, 234-7.

7. Ben-Zvi A.P., Goloubinoff P. 2001. Review: mechanism of disaggregation and refolding of stable protein aggregates by molecular chaperones. // J. Struct Biol. 135,84-93.

8. Bertani I., Rampioni G., Leoni L., Venturi L. 2007. The Pseudomonas putida Lon protease is involved in N-acyl homoserine lactone quorum sensing regulation II BMC Microbiology. 7, 71-79.

9. Bukau B., Horwich A. 1. 1998. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. I/Cell. 92, 351-366.

10. Campbell J., Lin Q., Geske G.D., Blackwell H.E. 2009. New and unexpected insights into the modulation of LuxR-type quorum sensing by cyclic ¿peptides.//ACS Chem Biol. 4, 1051-1059.

11. Chatterjee J., Meighen E.A. 1995. Biotechnical applications of bacterial bioluminescence (lux) genes. // Photochem. Photobiol. 62, 641-650.

12. Chai Y., Winans S.C. 2004. Site-directed mutagenesis of a LuxR-type quorum-sensing transcription factor: alteration of autoinducer specificity. // Mol Microbiol. 51, 765-76.

13. Chandu D., Nandi D. 2004. Comparative genomics and functional roles of the ATP-dependent proteases Lon and Clp during cytosolic protein degradation. // Res. Microbiol. 155,710-719

14. Cohn D.H., Ogden R.C., Abelson J.N., Baldwin T.O., Nealson K.H., Simon M.I., Mileham A.J. 1983. Cloning of the Vibrio harveyi luciferase genes: use of a synthetic oligonucleotide probe. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 120-123.

15. Cyr D.M., Langer T., Douglas M.G. 1994. DnaJ-like proteins molecular chaperones and specific regulators of Hsp70. //Trends Biochem. Sci. 19, 176181.

16. Davies D.G., Parsek M.R., Pearson J.P., Iglewski B.H., Costerton J.W., Greenberg E.P. 1998. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm // Science. 280, 295-298.

17. Diamant S., Ben-Zvi A.P., Bukau B., Goloubinoff P. 2000. Size-dependent disaggregation of stable protein aggregates by the DnaK chaperone machinery. HJ. Biol. Chem. 275, 21107-21113.

18. Dougan D.A., Reid B.G., Horwich A.L., Bukau B. 2002. ClpS, a substrate modulator of the ClpAP machine. //Mol. Cell. 9, 673-683.

19. Dougan D.A., Mogk A., Bukau B. 2002. Protein folding and degradation in bacteria: to degrade or not to degrade? That is the question. // Cell. Mol Life Sci. 59, 1607-1616

20. Dunlap P.V., Greenberg E.P. 1988. Control of Vibrio fischeri lux gene transcription by a cyclic AMP receptor protein-luxR protein regulatory circuit. H J. Bacteriol. 170, 4040-4046.

21. Eberhard A. 1972. Inhibition and activation »of bacterial luciferase synthesis. // J: Bacteriol 109,1101-1105.

22. Eberhardi A., Burlingame A.L., Eberhard C., Kenyon G.L., Nealson K.H., Oppenheimer N.J.1981. Structural identification of autoinducer of Photobacterium fischeri luciferase // Biochemistry. 20, 2444-2449.

23. Egland K.A., Greenberg E.P. 1999. Quorum1 sensing in Vibrio fischeri: elements of the luxl promoter. Il Mol. Microbiol 31,1197-1204.

24. Egland K.A., Greenberg E.P. 2000. Conversion of the Vibrio fischeri transcriptional activator, LuxR, to a repressor. // J. Bacteriol 182, 805-811.

25. Engebrecht J., Nealson K., Silverman M. 1983. Bacterial bioluminescence: isolation and genetic analysis of functions from Vibrio fischeri II Cell 32,. 773781. '

26. Fuqua W.C., Greenberg E.P: 1998. Self perception in bacteria: quorum sensing with acylated homoserine lactones. // Curr. Opin. Microbiol 1, 183-189.

27. Fuqua C., Parsek M.R., Grenberg E.P. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing. 2001. // Annu. Rev. Genet. 35, 439-468

28. Fuqua W.C., Winans S.C. 1994. A LuxR-LuxI type regulatory system activates Agrobacterium Ti plasmid conjugal transfer in the presence of a plant tumor metabolite. II J. Bacteriol 176, 2796-2808.

29. Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E.P. 1994. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators. // J. Bacteriol 176, 269-275.

30. Fuqua C., Winans S.C., Greenberg E.P. 1996. Census and consensus in bacterial ecosystems: the LuxR-LuxI family of quorum-sensing transcriptional regulators. // Annu. Rev. Microbiol 50, 727-751.

31. Garcia-Lara J., Shang L.H., Rothfield L.I. 1996. An extracellular factor regulates expression of sdiA, a transcriptional activator of cell division genes in Escherichia coli. II J. Bacteriol. 178, 2742-2748.

32. Georgopoulos C.P., Hendrix R.W., Casjens S.R., Kaiser A.D. 1973. Host participation in bacteriophage lambda head assembly. // J. Mol. Biol. 76, 43-60.

33. Givskov M, de Nys R, Manefield M, Gram L, Maximilien R, Eberl L, Molin S, Steinberg PD, Kjelleberg S. 1996. Eukaryotic interference with, homoserine lactone-mediatedprokaryotic signalling. // J Bacteriol. 178, 6618-22.

34. Glessner A., Smith E.S., Iglewski B.H., Robinson J.P. 1999. Roles of Pseudomonas aeruginosa las and rhl quorum-sensing systems in control of twitching motility. // J. Bacteriol. 181, 1623-1629.

35. Goloubinoff P., Mogk A., Ben-Zvi A.P., Tomoyasu T., Bukau B. 1999. Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. UProc: Natl. Acad. Sei. USA. 96, 1373213737.

36. Gottesman S., Roche E., Zhou Y., Sauer R.T. 1998. The ClpXP and ClpAP proteases degrade proteins with carboxy-terminal peptide tails added by the SsrA-tagging system. // Gen. Dev. 12, 1338-1347

37. Gottesman S. 1999. Regulation by proteolysis: developmental switches. // Curr. Opin Microbiol. 2, 142-147.

38. Han M-J., Yoon S.S., Lee S.Y. 2001. Proteomic analysis of metabolically engineered Escherichia coli producing poly (3-hydroxybutyrate). // J. Bacteriol. 183,301-308.

39. Hartl F.U. 1996. Molecular chaperones in cellular protein folding. I ¡Nature. 381,571-570.

40. HoldenM.T., Swift S., Williams P. 2000. New signal molecules on the quorum-sensing block // Trends Microbiol. 8, 101-103.

41. Horwich A.L., Apetri A.C., Fenton W.A. 2009 The GroEL/GroES cis cavity as a passive anti-aggregation device. // FEBS Lett. 583, 2654-2662.

42. Hoskins J.R., Pak M., Maurizi M.R., Wickner S. 1998. The role of the ClpA chaperone in,proteolysis by ClpAP. UProc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 1213512140.

43. Hoskins J.R., Singh S.K., Maurizi M.R., Wickner S. 2000. Protein binding'and unfolding by the chaperone ClpA and degradation by the protease ClpAP. UProc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 8892-8897.

44. Hoskins J.R., Yanagihara K., Mizuuchi K., Wickner S. 2002. ClpAP and ClpXP degrade proteins with tags located in the interior of the primary sequence. UProc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 11037-11042.

45. Ishikawa T., Maurizi M.R., Steven A.C. 2004. The N-terminal substrate-binding domain of ClpA unfoldase is highly mobile and extends axially from the distal surface of ClpAP protease. IIJ. Struct. Biol. 146, 180-188.

46. Jenal U., Hengge-Aronis R. 2003. Regulation by proteolysis in bacterial cells. // Curr. Opin. Microbiol. 6, 163-172.

47. Kaplan H.B., Greenberg E.P. 1985. Diffusion of autoinducer is involved in regulation of the Vibrio fischeri luminescence system. // J. Bacteriol. 163, 12101214.

48. Kiratisin P., Tucker K.D., Passador L. 2002. LasR, a transcriptional activator of Pseudomonas aeruginosa virulence genes, functions as a multimer. // J Bacteriol. 184,4912-9.

49. Koch Bl, Liljefors T., Persson T.*, Nielsen J.1, Kjelleberg S., Givskov M. 2005. The LuxR receptor: the sites of interaction with quorum-sensing signals and. inhibitors. II Microbiology. 151, 3589-602.

50. Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head" of bacteriophage T4'. Nature. 227:680-685.

51. Langer T., Pfeifer G., Martin J., Baumeister W., Hartl F.-U. 1992. Chaperonin-mediated protein folding GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein-substrate within its central cavity. I/EMBO J. 11, 4757-4765.

52. Laskowska E., Wawzynow A'., Taylor A. 1996. IbpA and" IbpB, the new heat-shock proteins, bind to endogenous Escherichia coli proteins aggregated intracellularly by heat shock. IIBiochimie. 78, 117-122.

53. Luo Z.Q., Su S., Farrand S.K. 2003. In situ activation of the quorum-sensing transcription factor TraR by cognate and noncognate acyl-homoserine lactone ligands: kinetics and consequences. 11J Bacteriol. 185, 5665-72.

54. Lutz R., Bujard H. 1997. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/Ii-l2 regulatory elements. // Nucleic Acids Research. 25, 1203-1210.

55. Makovets S., Titheradge A J., Murray N.E. 1998. ClpX and ClpP are essential for the efficient acquisition of genes specifying type IA and IB restriction systems. // Mol. Microbiol. 28, 25-35

56. Mandel M., Higa A. 1970. Calcium dependent bacteriophage DNA infection. // J.Mol.Biol. 53, 154-162.

57. Maniatis T., Fritsh F., Sambrook J. 1989. Molecular cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press.

58. Manefield M., Rasmussen T.B., Henzter M., Andersen J.B., Steinberg P., Kjelleberg S., Givskov M. 2002. Halogenated fiiranones inhibit quorum sensing through accelerated LuxR turnover. // Microbiology. 148, 1119-27.

59. Marketon M.M., Gronquist M.R., Eberhard A., Gonzales J.E. 2002. Characterization of the Sinorhizobium meliloti sinR/sinl locus and the production of novel N-acyl homoserine lactone. // J. Bacteriol. 184, 5686-5695.

60. Mayer M.P., Bukau B. 1998. Hsp70 chaperone systems: diversity of cellular functions and mechanism of action. UBiol. Chem. 379, 261-268.

61. McKnight S.L., Iglewski B.H., Pesci E.C. 2000. The Pseudomonas quinolone signal regulates rhl quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa. II J. Bacteriol. 182, 2702-2708.

62. Medina G., Juarez K., Valderrama В., Soberon-Chavez G. 2003. Mechanism of Pseudomonas aeruginosa RhlR transcriptional regulation of the rhlAB promoter. II J. Bacteriol. 185, 5976-5983.

63. Meighen E.A. 1991.Molecular biology of bacterial bioluminescence. I I Microbiol. Rev. 55, 123-142.

64. Миллер Дж. 1979. Эксперименты в молекулярной генетике. Мир.

65. Miller S.T., Xavier К.В., Campagna S.R., Taga M.E., Semmelhack M.F., Bassler B.L., Hughson F.M. 2004. Salmonella typhimurium recognizes a chemically distinct form of the bacterial quorum-sensing signal AI-2. // Mol. Cell. 15, 677-687.

66. Minogue T.D, Wehland-von Trebra M, Bernhard F, von Bodman S.B. 2002. The autoregulatory role of EsaR, a quorum-sensing regulator in Pantoea stewartii ssp. stewartii: evidence for a repressor function. // Mol Microbiol. 44, 1625-35.

67. Mogk A., Deuerling E., Vorderwwulbecke S., Yierling E., Bukau B. 2003. Small heat shock proteins, ClpB and the DnaK system form a functional trade in reversing protein aggregation. I I Molecular Microbiol. 50, 585-595.

68. Mogk A., Tomoyasa Т., Goloubinoff P., Rudiger S., Roder D., Langen H., Bukau B. 1999. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins:prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. HEMBO J. 18, 6934-6949.

69. Nasser W., Reverchon S. 2006. New insights into the regulatory mechanisms of the LuxR family of quorum sensing regulators. // Anal Bioanal Chem. 387, 381-390

70. Nealson K.H., Piatt T., Hastings J.W. 1970. Cellular control of the synthesis and activity of the bacterial luminescent system. // J. Bacteriol. 104, 313-322.

71. Nicoll W.S., Boshoff A., Ludewig M.' H., Hennessy F., Jung M., Blatch G. 2006. Approaches tothe isolation and characterization of molecular chaperones. //Protein Expression and Purification. 46, 1-15.

72. Ortega J., Lee H.S., Maurizi M.R., Steven A.C. 2004. ClpA and ClpX ATPases bind simultaneously to opposite ends of ClpP peptidase to form active hybrid complexes. HJ. Struct. Biol. 146, 217-226.

73. Parsek M.R., Greenberg E.P. 2000. Acyl-homoserine lactone quorum sensing in gram*- negative bacteria: a signaling mechanism involved in associations with higher organisms. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 8789-8791.

74. Patterson S.D., Aebersold R 1995. Mass-spectrometric approaches for the identification of gel-separated proteins. // Electrophoresis. 16, 1791—1814.

75. Pearson J.P., Gray K.M., Passador L., Tucker K.D., Eberhard A., Iglewski B.H., Greenberg E.P. 1994. Structure of the autoinducer required for expression of Pseudomonas aeruginosa virulence genes // Proc. Natl. Ac. Sci USA. 91, 197200.

76. Pearson J.P., Passador L., Iglewski B.H., Greenberg E.P. 1995. A second N-acylhomoserine lactone signal produced by Pseudomonas aeruginosa. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 1490-1494.

77. Pesci E.C., Iglewski B.H. 1997. The chain of command in Pseudomonas quorum sensing. // Trends Microbiol. 5, 132-135.

78. Pesci E.C., Milbank J.B., Pearson J.P., McKnight S., Kende A.S., Greenberg E.P., Iglewski B.H. 1999. Quinolone signaling in the cell-to-cell communicationsystem of Pseudomonas aeruginosa II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 1122911234.

79. Prakash S., Matouschek A. 2004. Protein unfolding in the cell. //Trends in Biochem. Sci. 29, 593-600.

80. Qin N., Callahan S.M., Dunlap P.V., Stevens A.M. 2007. Analysis of LuxR regulon gene expression during Quorum Sensing in Vibrio fischeri. II J. Bacteriol. 189,4127-2134.

81. Raviol H, Sadish H, Rodriguez F, Mayer MP, Bukau B. 2006. Chaperone network in the yeast cytosol: HspllO is revealed as an Hsp70 nucleotide exchange factor. UEMBOJ. 25, 2510 2518.

82. Ruby E.C., McFall-Ngai M.J. 1992. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. // J. Bacteriol. 174, 4865-4870.

83. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors 11 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5463-5468.

84. Schuster M., Lostroh C.P., Ogi T., Greenberg E.P. 2003. Identification, timing, and signal specificity of Pseudomonas aeruginosa quorum-controlled genes: a transcriptome analysis. // J Bacteriol. 185, 2066-79.

85. Shah I.M, Wolf R.E. 2006. Inhibition of Lon-dependent degradation of the Escerichia coli transcription activator SoxS by interaction with 'soxbox' DNA or RNA polymirase. // Molecular. Microbiology. 60, 199-208.

86. Singh S.K., Grimaud R., Hoskins J.R., Wickner S., Maurizi M.R. 2000. Unfolding and internalization of proteins by the ATP-dependent proteases ClpXP and ClpAP. IIPNAS USA. 97, 8898-8903.

87. Sitnikov D.M., Schineller J.B., Baldwin T.O. 1996. Control of cell division in Escherichia coli: regulation of transcription of ftsQA involves both rpoS and SdiA-mediated autoinduction. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 336-341.

88. Smith R.S., Iglewski B.H. 2003. P. aeruginosa quorum-sensing systems and virulence. // Curr Opin Microbiol. 6, 56-60.

89. Smith R.S., Guyomarc'h S., Mandel T., Reinhardt D., Kuhlemeier C., Prusinkiewicz P. 2006. A plausible model of phyllotaxis. // Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1301-6.

90. Stewart G.S. 1997. Challenging food microbiology from a molecular perspective. II Microbiology. 143, 2099-2108.

91. Surette M.G., Miller M., Bassler B. 1999. Quorum sensing in Escherichia coli, Salmonella typhimuium, and Vibrio harveyi: A new family, of genes responsible for autoinducer production. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 1639-1644.

92. Swift S., Stewart G.S., Williams P. 1996. The inner workings of a quorum sensing signal generator. // Trends Microbiol. 4, 463-466.

93. Tatsuta T., Joo D.M., Calendar R., Akiyama Y., Ogura T. 2000. Evidence for an active role of the DnaK chaperone system in the degradation of a .11 FEBS Lett. 478, 271-275.

94. Tomoyasu T., Mogk A., Langen H., Goloubinoff P., Bukau B. 2001. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in Escherichia coli cytosol. // Molecular. Microbiol. 40, 397-413.

95. Tu S.-C., Mager H.L. 1995. Biochemistry of bacterial bioiuminescence. // Photochem. Photobiol. 62, 615-624.

96. Ulitzur S. 1998. H-NS controls the transcription of three promoters of Vibrio fischeri lux cloned in Escherichia coli. II J. Biolumin. Chemilumin. 13, 185-188.

97. Ulitzur S. 1999 // Microbial Ecology and Infectious Disease / Ed. Rosenberg E. Washington: American Society for Microbiology, P. 123-132.

98. Ulitzur S., Dunlop P. 1995.Regulatory circuitry controlling luminescence autoinduction in Vibrio fischeri.!I Photochem. Photobiol. 62, 625-632.

99. Urbanowski M.L., Lostroh C.P., Greenberg E.P. 2004. Reversible acyl-homoserine lactone binding to purified Vibrio fischeri LuxR protein. // J. Bacteriol. 186,631-7.

100. Vannini A., Volpari C., Gargioli C., Muraglia E., Cortese R., De Francesco R., Neddermann P., Marco S.D. 2002. The crystal structure of the quorum1 sensing protein TraR bound to its autoinducer and target'DNA. // EMBO J: 2; 21, 4393401.

101. Weber-Ban E.-U., Reid B.G., Miranker A.D., Horwich A.L. 1999. Global unfolding of substrate protein by the HsplOO chaperone ClpA. /'/Nature. 401, 90-93.

102. Weichart D., Querfurth N., Dreger M:, Hengge-Aronis R. 2003. Global role for ClpP-containing proteases in stationary-phase adaptation of Escherichia coli. H J. Bacteriol. 185, 115-125.

103. Weissman J.S., Hohl C., Kovalenko O., Kashi Y., Chen S., Braig K., Saibil H.R., Fenton W.A., Horwich A.L. 1995. Mechanism of GroEL action: productive release of polypeptide from a sequestered position under GroES. I/Cell. 83, 577-587.

104. Whiteley M., Lee K.M., Greenberg E.P. 1999. Identification of genes controlled by quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96,13904-13909.

105. Whitehead N.A., Barnard A.M., Slater H., Simpson N.J., Salmond G.P.et al., 2001 G.P. 2001. Quorrum-sensing in Gram-negative bacteria. // FEMS Microbiol. Rev. 25, 365-404.

106. Whitehead N.A., Byers J.T., Commander P., Corbett M.J., Coulthurst S.J., Everson L., Harris A.K., Pemberton C.L., Simpson N.J., Slater H., Smith D.S.,

107. Welch M., Williamson N., Salmond G.P. 2002. The regulation of virulence-in phytopathogenic Erwinia species: quorum sensing, antibiotics and ecological considerations. // Antonie Van Leeuwenhoek. 81,223-31.

108. Wickner S., Gottesman S., Skowyra D., Hoskins J., McKenney K., Maurizi M.R. 1994. A' molecular chaperone, ClpA, functions like DnaK and DnaJ. UProc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 12218-12222.

109. Zhu J., Beaber J.W., Moré M.I., Fuqua C., Eberhard A., Winans S.G. 1998. Analogs of the autoinducer 3-oxooctanoyl-homoserine lactone strongly inhibit activity of the TraR protein of Agrobacterium tumefaciens. II J Bacteriol. 180, 5398-405.

110. Zhu J., Winans S.C. 1999. Autoinducer binding by the quorum-sensing regulator TraR increases affinity for target promoters in vitro and decreases TraR turnover rates in whole cells. // Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4832-7.

111. Zhu J., Winans S. C. 2001. The quorum-sensing transcriptional regulator TraR requires its cognate signaling ligand for protein folding, protease resistance, and dimerixation II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 1507-1512.

112. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. 1994. Lon-протеаза участвует в регуляции транскрипции /юс-оперона Vibrio fischeri. II Генетика. 30, 337341.

113. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. 1997. Роль Ьа-протеазы в негативном контроле экспрессии lux CD ABE генов Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli.H Молекуляр. биология. 31, 945-949.

114. Manukhov I.V., Eroshnikov G.E., Vyssokikh M.Y., Zavilgelsky G.B. 1999. Folding and refolding of thermolabile and thermostable bacterial luciferases: the role of DnaKJ heatOshock proteins. IIFEBS Lett. 448, 265-268.

115. Хмель И.А., Метлицкая А.З. 2006. Quorum sensing регуляция эксарессии генов перспективная модель для создания лекарств против патогенных бактерий. // Молекуляр. биология. 40, 195 - 211.1. Благодарности :

116. C.B. Машко (ЗАО «АГРИ», Москва) за предоставление штаммов BW25113, JW3664, JW3663 и JW0013;

117. С.З. Миндлин (ИМГ РАН, Москва) за предоставление штаммов серии gro мутантов;

118. S. Gottesman (США) за предоставление штаммов SG20250, SG22099, SG22163 и SG22186;

119. N.E. Murray (Англия) за предоставление штаммов NK113 и NK114; Т.К. Van Dyk (США) за предоставление плазмиды pDEW201.