Структура lux-оперонов и механизмы регуляции типа "Quorum Sensing" у морских бактерий

Манухов, Илья Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура lux-оперонов и механизмы регуляции типа "Quorum Sensing" у морских бактерий
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Структура lux-оперонов и механизмы регуляции типа "Quorum Sensing" у морских бактерий"

МАНУХОВ Илья Владимирович

СТРУКТУРА LUX-ОПЕРОНОВ И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЩИИ ТИПА «QUORUM SENSING» У МОРСКИХ БАКТЕРИЙ.

(»3.02.07-Генетика)

-8 ДЕК 2011

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2011

005006628

Работа выполнена в лаборатории генетики бактерий ФГУП Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика»)

Научный консультант

доктор биологических наук, профессор ФГУП «ГосНИИгенетика»

Завильгельский Геннадий Борисович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор НИИ ФХБ им А. Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова

Богачёв Александр Валерьевич

Доктор биологических наук, профессор ЗАО «Научно-Исследовательский институт Аджиномото-Генетика»

Лившиц Виталий Аркадьевич

Доктор биологических наук, профессор Учреждение Российской Академии Наук Институт Белка РАН

Колб Вячеслав Адамович.

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН

Защита диссертации состоится "¿ЬО " г. в 14 часов на заседании

Диссертационного совета Д 217.013.оГЗри Федеральном Государственном Унитарном предприятии «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИгенетика») по адресу 117545, Москва, 1-ый Дорожный ггроезд, дом 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика»

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного Совета

кандидат химических наук, доцент

Воюшина Т.Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

£их-оперон морских бактерий Aliivibrio fischeri в настоящее время принято считать модельным в исследованиях QS систем, а по обозначению белка LuxR, регулятора lux-оперона было определено семейство LuxR-гомологичных белков - регуляторов QS систем первого типа. В настоящее время остаются открытыми ряд вопросов об эволюционном происхождении феномена биолюминесценции бактерий, а также о механизмах стабилизирующего отбора /шг-оперонов у свободноживущих видов бактерий. Продолжаются поиски новых регуляторных QS систем у бактерий и исследования факторов, модулирующих QS ответ бактерий в зависимости от состояния клетки. Актуальна также проблема молекулярной биологии и биофизики - фолдинг и рефолдинг белков и роль белков - шаперонов в этих процессах. В диссертационной работе для этой цели впервые используются различающиеся по термостабилыюсти, но гомологичные по аминокислотной последовательности бактериальные люциферазы психрофильных и мезофилышх морских люминесцирующих бактерий.

Кодируемые генами бактериальных /ых-оперонов люциферазы в настоящее время широко используются в работах по молекулярной генетике (гены - репортеры), при биохимических анализах, в генно-инженерных работах (селекция) и ряде других. Большое распространение приобрели работы по экологическому мониторингу, тестированию токсикантов в пищевых продуктах, а также разработке и тестированию новых

медицинских препаратов с помощью цельноклеточных биосенсоров, которые основаны на транскрипционных слияниях генов бактериальных люиифераз с индуцируемыми стрессовыми промоторами.

Цель п задачи исследований.

Целью данной работы являлось изучение механизмов регуляции /их-оперонов морских люминесцирующих мезофильных и психрофильных бактерий, а также исследование роли шаперопов в фолдинге и рефолдинге термолабильных белков на модели различающихся по термостабильности бактериальных люцифераз.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи.

Изолировать штаммы психрофильных люминесцирующих бактерий,

Определить видовую принадлежность изолированных штаммов.

Клонировать и секвенировать /их-опероны бактерий, характеризующихся различным температурным оптимумом роста.

Провести сравнение механизмов регуляции /мх-оперонов психрофильных и мезофильных бактерий рода Aliivibrio.

Определить влияние на активность регуляторного белка LuxR АТФ-зависимых шаперопов и протеаз.

Исследовать роль N- и С-концевых доменов белка LuxR при взаимодействии с шапероном GroEL/ES и протеазой Lon.

Исследовать in vivo воздействие различных шаперонов на рефолдинг белков, различающихся по термостабильности на модели гомологичных бактериальных люцифераз, изолированных из люминесцирующих бактерий, характеризующихся различным температурным оптимумом роста.

Сконструировать и показать эффективность применения /шг-биосенсоров, созданных на основе штаммов Е .coli, содержащих гибридные плазмиды с генами бактериальных люцифераз в качестве репортёрных, расположенных под контролем различных индуцируемых (стрессовых) промоторов.

Научная новизна работы.

Впервые определена структура /их-оперона у психрофильных светящихся морских бактерий. В отличие от /шг-оперонов мезофильных морских бактерий, содержащих в своём составе одну копию гена htxR, в /их-оперонах психрофильных бактерий содержится две копии гена luxR, причём белки LuxRl и LuxR2 различаются как по аминокислотной последовательности, так и по активности по отношению к регулируемому ими промотору.

Показано, что криптическая люминесценция патогенных морских бактерий АИШЬпо $а1топШс1а (бактерии люминесцируют лишь при добавлении в среду субстрата люциферазы длшшоцепочечного альдегида) связана с дефектом в гене 1ихР, кодирующем одну из субъединиц редуктазы.

Впервые показано, что АТФ-зависимая протеаза Ьоп участвует в негативной регуляции систем (ЗБ у морских бактерий. Доказано, что шаперонин ОгоЕ17Е8 участвует в сборке нативной формы белка ЬихИ.

Впервые показано, что основную регуляторную функцию в белке ЬихЯ несет N -домен (162 аминокислотных остатка), являющийся мишенью для Ьоп-протеазы и определяющий контакт полипептида с шаперонином ОгоЕЬ, необходимым для сборки нативной структуры ЬихК.

Впервые для анализа работы шаперонов были использованы в качестве модели бактериальные люциферазы, гомологичные по аминокислотной последовательности, но значительно различающиеся по термостабилыюсти.

Показано впервые, что рефолдингтермоинактивированных бактериальных люцифераз происходит в клетке с участием шаперонов семейства Н5р70 (ОпаЮЕ), НэрЮО (С1рА, С1рВ) и малых шаперонов зНзр (1ЬрАВ).

Показано, что термостабильные люциферазы характеризуются сравнительно низким уровнем ОпаЮЕ-зависимого рефолдинга в отличие от термочувствительных люцифераз, которые восстанавливают активность после термоинактивации практически до 100%.

Сконструированы новые формы /цх-биосенсоров, отличающиеся по основным параметрам (пороговая чувствительность и амплитуда ответа) от аналогов ка-биосенсоров, полученных зарубежными фирмами. С помощью данных биосенсоров впервые был исследован механизм токсического действия на клетку 1,1-диметилгидразина (компонент ракетного топлива) и наночастиц диоксида титана. Показано, что основная роль в токсическом действии этих агентов связана с образующимися активными формами кислорода (перекись водорода и супероксид-анион).

Практическая значимость исследования.

Практически значимым результатом работ по изучению люцифераз, различающихся по термостабильности, явилось создание высокочувствительных специфических /юг-биосенсоров. Использование транскрипционных слияний стрессовых и других индуцируемых промоторов с генами бактериальных люцифераз в качестве репортерных позволило создать набор биосенсоров, специфически реагирующих на различные токсиканты и другие биологически активные вещества. Данные биосенсоры в

настоящее время применяются для работ по экологическому мониторингу, тестированию медицинских препаратов и для изучения механизмов воздействия на клетку различных токсикантов.

Полученные в работе данные о влиянии шаперонов и протеаз на активность белка LuxR могут быть использованы для создания более чувствительных биосенсоров для детекции аутоиндукторов первого типа. А также бактериальные люциферазы в настоящее время используются в качестве модели для изучения механизмов рефолдинга денатурированных белков.

Апробация работы.

Материалы работы были представлены и обсуждались на 16-м Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (16th ISBC April 19-23,2010, Lyon, France), 111 съезде Биохимического общества РАН (Санкт-Петербург, 2001), Объединенном Съезде генетиков и селекционеров России, посвященном 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина, и Пятом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС с 21 по 28 июня 2009 г. Москва), конференции европейского биохимического общества (FEBS-IUBMB-2005 Conference in Budapest, Hungary). Диссертационная работа была апробирована на секции «Генетика микроорганизмов» Диссертационного совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 24 мая 2011 г. Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 23 статьи в ведущих рецензируемых журналах, определённых ВАК.

Структура диссертации.

Диссертационная работа включает 6 глав, 151 страницу, 58 рисунков и 4 таблицы. В работе использовано 208 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы Бактериальные шталшы и плазмиды. Е. coli К. 12 TG-l; Е. coli MC 1061; Е. coli AB 1899 - получены из коллекции ВКПМ ГосНИИгенетика; SKB178; OFB111 g/-oEL673;g/-oEL97; groES::Tn\0- Georgopoulos С.Р. et al.,1973; MG 1655 и PK202 - от Элизабет Крэйг (США); Е. coli SG20250 и Е. coli SG20100 clpB~ получены от S.Gottesman (США). Е. coli BW25113, JW3663 ibpBv.kan и JW3664 ibpKv.kan получены от Машко С.В. (Keio-collection). Штаммы А.ßscheri М}-1 и МГУ-6 - получены от А. П. Зарубиной (кафедра микробиологии МГУ им М. В. Ломоносова). Штаммы А. logei: BMI и ВМ2 изолированы из кишечника керчака Myoxocephalus scorpius (акватория Белого моря); KChl и КСН2, изолированы из кишечника керчака Myoxocephalus polyacanthocephalus и корюшки Osmerus rnordax dentex, соответственно (Камчатка, акватории Охотского и Берингова морей).

Векторы-. pUC19, pUC18, pUC12, pACYC184, pBluescript II KS, pGEX-KG, pBR322 получены из коллекции ВКПМ ГосНИИгенетика; pDEW201 - получен от Т.К. Van Dyk.

Плазмиды: pFl (получена в 1991 г. Г.Б.Завильгельским и Т.А. Черновой) состоит из вектора pBR322 и ßamHI-фрагмента хромосомы А.ßscheri с полным /ш:-оперопом.

рАС16 содержит в векторе pACYC184 ЛаотН1-фрагмент хромосомы A.flscheri с полным /шг-опероном.

pVFRl (вектор pDEW201, содержащий luxR ген и регуляторную область lux-оперона А. ßscheri) является биосенсорной плазмидой: /mCDABE гены Photorhabdus luminescens (термостабильная люцифераза) транскрибируются в присутствии аутоиндуктора N-3-оксогексаноил-лактон L-гомосерина.

pSV16 аналогична pVFRl, но содержит luxKl ген и регуляторную область lux-оперопаЛ. logei KChl.

pSV17 аналогична pSV16, но содержит liixRl ген и регуляторную область lux-оперона штамма KCh2.

pMVl аналогична pSV16, но содержит /uxRl ген и регуляторную область lux-оперона A. logei KChl.

pMV2 - ген luxR2 штамма KCh 1 клонирован в векторе pACYC 184. Плазмиды pSV10,4 и pSV20 содержат фрагменты ДНК с полными /ia-оперонами штаммов A. logei BMI и A. logei KChl соответственно, встроенные в вектор pTZ57R.

pSV18 - luxCD гены A. logei клонированы в вектор pTZ57R под контролем Р1ас промотора.

pS V19 — тоже что и pSV18, но - haCD гены из A. salmonicida pBRIon - веюор pBR322, содержит ген lonA - протеазы Lon (от Старковой E.H.). pGroEL/GroES - вектор pACYC184 с генами groEL/ES под собственным промотором (получена от Грагерова А.).

pGEX-KG вектор со встроенным по ВатШ/ЕсоК\-сш[ш геном luxR A. ßscheri; Арг. вектор pGEX-KG содержит 5 - делегированный фрагмент гена luxR; Арг. вектор pGEX-KG содержит 3 - делегированный фрагмент гена luxR\ Ар'.

pOMibpAB - вектор pZS33 содержит гены ibpAB, расположенные под промотором РйсЮ-ьСтг

pAIkA-lux - ДНК-фрагмент, содержащий промотор PalkA и регуляторный участок, был получен при помощи ПЦР из генома Е. coli К12 MG1655 и встроен в беспромоторный мультикопийный вектор pDEW201.

pRecA-Iux - аналогична pAIkA-lux, но содержит промотор гена гесА. pKatG-lux - аналогична pAIkA-lux, но содержит промотор гена каЮ. pSoxS-lux - аналогична pAIkA-lux, но содержит промотор гена soxS. pArsR-lux - аналогична pAIkA-lux, но содержит промотор гена arsR (любезно предоставлена Расторгуевым С.М.).

Среды и условия роста бактерий. Морские светящиеся бактерии растили на среде SWTm, содержащей (%, в./об.): 0.5 триптона, 0.25 дрожжевого экстракта, 1.5 морской соли и 0.3 глицерина. Клетки растили при 15°С.

Бактерии Е. coli растили в бульоне Луриа-Бертани (LB). Агаризованные среды готовили с 1.5% агаром.

Выделение и очистка хромосомной и плазмиднойДНК, клонирование и рестрищионный анализ проводили стандартными методами согласно (Sambrook J. et а! 2001). Определение нуклеотидной последовательности проводили методом Сэнгера (Sanger et al. 1977).

Выделение и очистка белков и электрофорез в полиакрилалшдном геле. Выделение белков проводили, используя рекомбинантные плазмиды, полученные на основе вектора pGEX-KG. Синтезируемые белки в этом варианте клонирования соединены чувствительным к тромбину линкером с глутатион -трансферазой. Очистка белков проводилась с помощью аффинной хроматографии на глутатион - агарозе, сорбирующей только GST - содержащие белки, с последующей элюцией раствором восстановленного глугатиона. Контроль за выделением белка осуществляли в 10%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Биолюминесценцию клеток измеряли на планшетном люминометре LMA01 ("Весктап") или на высокочувствительном кюветном люминометре «Биотокс7М».

Результаты.

Сравнительный анализ "Quorum Sensing" систем у психрофильных и мезофилышх светящихся морских бактерий.

Впервые lux-оперон A.fischeri был изолирован и клонирован в клетках Е. coli и детально анализирован в работе (Engebrecht J. el al., 1983). На рис.1 приведена структура /гк-оперона A.fischeri /¡uRICDABEG. Оперон состоит из двух частей: lux R с промотором Pi и /iaICDABEG с промотором Pr. (Meighen Е.А., 1991). Структурные гены lux AB определяют синтез а - и ß - субъединиц люциферазы. Гены /uxCDE определяют синтез трех-субъедииичной редуктазы жирной кислоты (fatty acid reductase), ведущей восстановление жирной кислоты до альдегида (тетрадеканаль), являющегося субстратом люциферазы. Ген luxG определяет синтез т.н. "probably" флавин-редуктазы, которая, по всей видимости, не активна (Meighen Е.А., 1991; Tu S.-C., and Mager Н., 1995).

Рисунок 1. Схема регуляции /»х-оперона A.fischeri.

Гены luxI и luxR являются регуляторными. Белок ¿nxl-ацил-синтаза, ведущая синтез ацильного производного гомосеринлактона (N-AHL), Ы-(З-оксогексаноил) лактон L-гомосерина (OHHL). Впервые структура N-AHL была определена в 1981 году (Eberhard А.,. 1981.). Впоследствии все аутоиндукторы - класса ацильных производных лактона L-гомосерина получили название аутоиндукторов первого типа (АИ). Низкомолекулярные химические вещества, относящиеся к классу ацильных производных лактона L-

гомосерина (N-AHL), свободно диффундируют через клеточные мембраны и обеспечивают условия, при которых клетка способна реагировать на изменение внутриклеточной концентрации этих веществ и соответственно включать или выключать те или иные группы генов. Одним из основных результатов настоящей работы является доказательство, что в сборке нативной формы белка LuxR участвуют шаперонин GroEL/ES и протеазы Lon. Эти белки модуляторы внесены в схему, представленную на рисунке 1.

На рис. 2 представлены структуры Ла-оперонов бактерий A.fischeri (AF) (GenBank AF170104), А. logei(AL) - согласно данным секвенирования 11 т.п.н. фрагментов, содержащих /ia-опероны штаммов ВМ1 и KChl (GenBank HQ450520), и Asalmonicida (AS) (GenBank AF452135).

PL PR

AF < luxR j—j—| luxt/ПчхС > luxD~)j luxA )j luxB)T luxE luxG )-

Рисунок 2. Структуры /шг-оперонов A.fischeri (AF), A. logei, штаммы Kehl и BMI (AL), и A. salmonicida (AS)

Сравнение структуры fe-оперона штаммов BMI и KChl со структурами lux-оперонов бактерий A.fischeri и А. salmonicida показывает полное сходство структур lux-оперонов A. logei и А. salmonicida и значительные отличия структур этих /шг-оперонов со структурой /га-оперона A. fischeri. В структуре /ux-оперонов A. logei и A. salmonicida отсутствует ген luxI перед геном luxС, но непосредственно за геном luxG расположен фрагмент с генами luxXil -luxl. Кроме того, спейсер между первым геном luxR 1 и промотором Prl значительно превышает таковой у A.fischeri (более 500 н.п. против 200 н.п.). Отметим, что патогенные для лососей бактерии А. salmonicida занимают отличную от А. fischeri и A. logei экологическую нишу и не люминесцируют в природных условиях.

Для изучения QS системы психрофильных бактерий A. logei, были сконструированы гибридные плазмиды, содержащие регуляторные области /их-оперона штамма KChl: ген luxR\, lux-box и промотор Prl (pMVl) и ген luxR2, lux-боке и промотор

Prä (pSV16) (рис. 3), слитые с генами luxCDABE, кодирующими термостабильную люциферазу Photorhabdus luminescens. Для сравнения чувствительности к АИ регуляторных областей психрофильных бактерий А. logei с мезофильными использовалась плазмида pVFRl, содержащая регуляторную область /идг-оперона А. fischen. Для конструирования был использован вектор pDEW201, содержащий lux-кассету luxCDABE Р. luminescens, полилинкер для клонирования промотора и четыре терминатора транскрипции для снижения фонового протекания клонированных промоторов.

pVFRl

pSV16

pSV17

A.fischeri

Pl Pr

P. lumincsccm

luxR (-j-pIlluxC | luxDl luxAl IuxB|

luxE>—

A. lo^ci КС hl P. luminescens

Pl Pr2

luxKj )-|-j—I luxC | luxDl luxAl luxB | luxE^H—

Л. logei Kch2

Pl Pr2 )uxR2 b

P. luminescens

jluxCl luxDl luxAl luxBl luxE)

A. togei KCh I

Л lutiiinesccns

pMVl

Pl Prl I

J^üjp.uxC I luxDl luxAl luxBiluxE)

Рисунок 3. Структура транскрипционных слияний регуляторных областей /их-оперонов А. fischen и А. logei. Данные плазмиды являются биосенсорными: taCDABE гены Р. luminescens (термостабильная люцифераза) транскрибируются только в присутствии АИ.

pVFRl - luxR ген и регуляторная область /шг-оперонаA.fischeri; pSV16 - luxKL ген и регуляторная область /¡«-оперона А. logei KChl; pSV17 - /mxR2 ген и регуляторная область /шг-оперона Л. logei штамма KCh2. pMVl - luxR\ ген и регуляторная область /их-оперона А logei KChl.

Сравнение чувствительности к АИ штаммов Е. coli, содержащих биосенсорные плазмиды с генами, кодирующими белки LuxRl и LuxR2 (плазмиды pMVl и pSVlö), показало, что амплитуда ответа биосенсора с LuxR2 на добавление АИ значительно ниже, чем амплитуда ответа у биосенсора с LuxRl.

-♦-SV16 SV167 -*— SV166 -*—SV165

Рисунок 4. Зависимость интенсивности биолюминесценции (7) от времени инкубации (мин) клеток Е. coli MG 1655 с гибридными плазмидами (А) pSV16 и (Б) pMVl при добавлении различных концентраций АИ в среду (сверху в низ: О, 10"'М, 10""М и 10' ~М). Инкубация клеток и измерение интенсивности биолюминесценции проводились при комнатной температуре.

-lu*R2 -fischen -luxR1 iuxR2

1E-11 1E-1Q 1E-09 1E-08 1E-07 0,000001 0,00001 0,0001 Концентрация АИ, М

Рисунок 5. Зависимость активации Рг промоторов lux оперонов A.fischeri и А. logei (luxR2 и luxRl) от концентрации АИ в среде. Ночную культуру клеток Е. coli с плазмидами pVFRl (fischen), pSV16 (luxR2 - синие ромбики), pSV17 (luxR2 - голубые крестики) и pMVl (IuxRl) инокулировали с начальной 00 = 0.01 и растили в среде LB с ампициллином (100 мкг/мл) с аэрацией при до средней логарифмической фазы (OD = 0,4-0,5). Затем инкубировали 30 мин при 42°С и после добавления различных концентраций АИ продолжали инкубацию без перемешивания при 22°С. Через час инкубации измеряли интенсивность биолюминесценции.

Данные рисунков 4 и 5 свидетельствуют о том, что активация основного Prl промотора, с которого транскрибируются структурные гены luxCDABEG А. logei с помощью белка LuxRl. возможна лишь при высоких концентрациях АИ, весьма редко

возникающих в природных условиях. При этом активация белком LuxR2 промотора Рг2, с которого считывается luxl ген, кодирующий синтетазу АИ, характеризуется высокой амплитудой ответа на появление АИ в среде, а также способностью к активации, начиная с концентраций АИ 10"9М. Для проверки возможности активации промотора Prl белком LuxR2 штамм Е. coli с биосенсорной плазмидой pMVl, содержащей luxR\ с основным Prl промотором, был трансформирован совместимой плазмидой pMV2 (на основе orí р 15) с геном luxR2 под собственным промотором (рис. 6). Оказалось, что промотор Prl активируется как LuxRl так и LuxR2, причём чувствительность к АИ и амплитуда ответа промотора Prl определяется в основном белком LuxR2 (рис. 7).

Pl Prl

pMVl —<_luxRl hj-j—HluxC I luxDl luxAl luxBl luxE>-

pMV2 -< íuxrTT)—

Рисунок 6. Целевые конструкции в плазмидах pMVl и pMV2, используемые для проверки эффекта комплементации активности Prl промотора lux оперона A. logei в присутствии гена luxRl.

100000

10000

О 50 100 150

Время, мин

—luxR2 —•—luxR2+AH —4— !uxR1 -х— luxRI+АИ -ж— luxR2 +luxR1 —luxR2 +luxR1+AH

Рисунок 7. Комплементация активности Рг промотора lux оперона A. logei (luxR 1) в присутствии гена luxR2. Зависимость люминесценции клеток Я coli МС1061 с плазмидами pSV16, pMVl или комбинацией плазмид pMVl и pMV2 от времени инкубации с АИ 10"7М и в отсутствие АИ. luxR2 - pSV16

luxRl -pMVl

luxR2+ luxR 1 - pMV 1 и pMV2

Сравнительный шиши lux-оперонов A. salmonicida и Л. logei.

В работах (Fidopiastis Р.М et al 1999; Nelson E.J. et al 2007) было показано, что A. salmonicida является криптически люминесцирующим видом бактерий светится лишь при добавлении в среду субстрата люциферазной реакции я-деканаля. Авторы предположили, что этот феномен определяется структурой to-оперона: в результате транскрипции гена h«R2 появляется антисенс РНК, критически снижающая транскрипцию белка LuxE. Внастоящей работе показано, что структура lia-оперона A. logei практически идентична структуре A. salmonicida (см рис. 2). Однако при этом показано, что бактерии A. logei ярко светят в условиях QS. Поэтому гипотеза авторов о снижении эффективности транскрипции гена luxE антисенс-РНК гена hixRl была поставлена под сомнение. Проведённый анализ нуклеотидных последовательностей lux-оперонов показал наличие делеции размером 17 н.п. в начале гена luxDA. salmonicida (по сравнению с luxD A.fischeri). Эта делеция затрагивает АТГ кодон гена luxD (рис. 8), в результате белкок LuxD укорочен с N-конца на 47 аминокислотах остатка новый. Как видим делеция размером 6 н.п. в начале гена luxD A. logei не затрагивает АТГ кодон и сохраняет рамку считывания luxD гена.

Stop luxC Start luxD AF and AL

al ксhi as af

al kchl as af

Рисунок 8. Сравнение нуклеотидной последовательности между luxC и luxD генами в A.fischeri (AF), A. logei (AL KChl) и A. salmonicida (AS). Идентичные нуклеотиды отмечены серым цветом. ATG-и stop- кодоны подчёркнуты.

Для проверки гипотезы о том, что причиной критической люминесценции патогенных микроорганизмов A. salmonicida является деффект в гене hixD, были сконструированы плазмиды pSV18 и pSV19, в которых luxCD гены из A. logei и A. salmonicida соответственно были клонированы в вектор pTZ57R под контроем Plac промотора. Данными плазмидами был трансформирован штамм Е. coli МС1061, в котором находилась плазмида pF6 (orí pi5), содержащая гены hixABE из A.fischeri.

1С" Л таДТАГ-:" ?ггу ттьтдга-- -- .•льчгтаг 11ГЛ

1с" j тягд} г а-'г-----------------%1,'t ml'mt uaacaa: . fij

LC^-TAGÍ L — tíi „ • 'MifíATe ^(irK^jb.mii-.Kj'-ift. А;А

• ^ IlMSM •ií-í,^-!]! "-"It 1 , nA» *■, I t "rf.'^.f'f,''

тс/г"а,-,„'-г1с'лг.%т ^т- it.i'Cí'nTfl ""rf.vIK:

Start luxD AS

аттддаьйй^АтлмАСз&ттсгё

aítaaaaaasaa1.\aatacgattctg.ot^

Оказалось, что при инкубации клеток при пониженной температуре 15-18°С (гены /шгСД взятые из психрофильных бактерий, кодируют чувствительные к повышению температуры более 20(>С белки) недостаток в и-деканале восполнялся наличием в клетке каСй генов из А. 1о%е1, но не /шсСО генов из А. ¡Ытоп1с1с!а (рис. 9). Следовательно, причиной критической люминесценции патогенных микроорганизмов А. ш1тотс '!(1а является деффект в гене 1ихО.

-p5v18

-psv18+dec

- psv19

-psv19*dec

-pf6

-pF6+dec

10 ............................................................................................................................

о 100 200 300 400 500

Time, min

Рисунок 9. Комплементация генов luxABE A.fischeri генами luxCD из A. logei KChl и A. salmonicida. Клетки E. coli TGI с гибридными плазмидами растили до OD 0,2 при 37°С с качанием, затем инкубировали при температуре 16°С и измеряли люминесценцию. Кружки - Е. coli TG 1 (pF6), Треугольники - Е. coli TG 1 (pF6, pS V18), Квадраты - E. coli TG1 (pF6, pSV19). Полые знаки- без добавления n-деканаля, заполненные- с добавлением. Плазмиды: pF6 - luxABE гены A. fischeri на orí р15, pSV18 — luxCD гены A. logei KChl, pSV19 - luxCD гены A. salmonicida KChl.

Итоги сравнительного анализа "quorum sensing" систем и структуры lux-оперонов у психрофильных и мезофилышх светящихся морских бактерий.

• Проведено сравнение QS систем /их-оперонов психрофильных бактерий A. logei и A. salmonicida и мезофильных бактерий A.fischeri.

• В структуре /их-оперонов A. logei и A. salmonicida отсутствует ген lux! перед геном luxC, но непосредственно за геном luxG расположен второй регуляторный локус с генами luxR2 -luxl.

• Показано, что LuxRl A. logei на несколько порядков менее чувствительный к

аутоиндуктору, по сравнению с LuxR2.

• Показано, что причиной криптической люминесценции патогенных микроорганизмов А. salmonicida является деффект в гене luxD.

Влияние шапероиов и протеаз па QS систему lux-оперона А. ßsclteri

На рис. 10 приведены кривые зависимости интенсивности биолюминесценции (/) от концентрации (OD) клеток Е. coli SKB178 gro+ и мутантных по генам groEL и groES, содержащих гибридную плазмиду pFl с генами luxRICDABE V.fischeri. Клетки росли в среде LB при 28°С. В клетках, мутантных по генам groEL и groES интенсивность биолюминесценции значительно снижена. Введение в клетки мутантного штамма groE97 гибридной плазмиды pGroEL/GroES приводит к восстановлению интенсивности биолюминесценции (рис.10, кривая +pGroEL/ES), - превышение интенсивности биолюминесценции по сравнению с биолюминесценцией клеток groE+определяется дозой гена. Следовательно, GroEL/GroES необходим для эффективной экспрессии генов lux-оперона V.fischeri.

I, отн. ед.

Рисунок 10. Зависимость интенсивности биолюминесценции клеток Е. соИ от 00. Клетки (все используемые штаммы содержали плазмиду рИ1 с /шг-опероном А./асЛег!) инокулировали при начальной 00=0,01 и растили в среде ЬВ с ампициллином (100 мкг/мл), в варианте +рОгоЕ5Ь с ампициллином и тетрациклином (15 мкг/мл) с аэрацией при 28 С.

\VT-SKB178g«/

groEL' - три мутантных варианта: groEL673; groEL97 и groES:'.TnlO рйгоЕЬ5 - groEL97 с плазмидой рОгоЕиСгоЕБ

В отличие от GroEL/GroES, АТР-зависимая сериновая протеаза Lon участвует в негативном контроле экспрессии lux-оперона. АТФ - зависимая сериновая Lon - протеаза играет важную роль в деградации неправильных и короткоживущих белков в клетке (Gottesman S., 1999; Wickner S. et al, 1999). Нами показано, что Lon - протеаза £ coli участвует в негативной регуляции транскрипции /их-опсроча A. fischeri, осуществляя протеолиз белка LuxR. Интенсивность биолюминесценции клеток мутантного штамма AB 1899 превышает примерно натри порядка таковую для ABl 157 (рис.11, кривые WT и Ion'). Введение плазмиды pBRlon с полноразмерным геном lonA, кодирующим активную Lon - протеазу, в клетки AB 1899 (рАС 16) полностью снимает эффект мутации Ion 1 (рис.11, кривая +pLon). Более того, лаг-период в кривой индукции люминесценции у AB 1899 (рАС16, pBRlon) заметно увеличен по сравнению с таковым у штамма ABl 157 (рАС16), что может быть объяснено увеличением числа копий гена lonA в клетках с плазмидой pBRlon.

Рисунок 11. Зависимость интенсивности биолюминесценции клеток Е. coli от OD. Клетки инокулировали при начальной OD=0,01 и растили в среде LB с хлорамфениколом (25 мкг/мл), в варианте +pLon с хлорамфениколом и ампициллином (100 мкг/мл) с аэрацией при 28 С. Ion -АВ1899/о«Л1 (рАС16) WT-ABl 157 Ion* (рАС16) +pLon - AB 1899 lon А1 (p АС 16, pBRlon)

Для получения белка LuxR in vitro была сконструирована гибридная плазмида на базе вектора pGEX-KG, несущая трансляционное слияние 5'-конца гена liixR с геном gst, кодирующим глутатион-8-трансферазу (GST, мол. масса 26 кД). В результате аффинной очистки химерного белка GST-LuxR на колонке с глутатион-сефарозой с последующей детекцией изолированных белков методом масс-спектрометрии пептидов после трипсинолиза было показано, что GST-LuxR белок сопровождается при выделении GroEL белком (рис. 12). При выделении из мутантного штамма OFB111 groEL673 белок GST-LuxR сопровождался помимо полипептида GroEL также белком Lon. Полученные данные прямо доказывают, что GST-LuxR эффективно связывается с белками GroEL и Lon.

kDa

гШтшт. ^-

ШШШ 45

Рисунок 12. SDS-электрофорез в полиакриламидном геле (12%) белковой фракции клеток Е. coli (pGEX-LuxR), полученной в результате аффинной хроматографии на колонке с глутатион-агарозой. Дорожки:

1 -Е. coliOFBlllgroEL673;

2-Е. coli groEL97;

3-Е. coli SK.B178 gro+\

4-белки-маркеры.

Отметим, что согласно данным, представленным на рисунке 12, белок GroEL выделяется вместе с химерным белком GST-LuxR не только из клеток дикого типа, но и из мутантных по гену gro клеток. По-видимому, использованные в настоящей работе gro мутанты, выделенные С.Р. Georgopoulos и соавт. (Georgopoulos С.Р., et al.,1973) и относящиеся к группе миссенс-мутантов с одиночными аминокислотными заменами, не теряют способности связывать белки-мишени, но не могут вести их правильную сборку (фолдинг).

Белок LuxR состоит из двух доменов: С - концевой домен (88 аминокислотных остатков) определяет контакт белка с lux-боксом в ДНК (ДНК - связывающий домен), а N-концевой домен (162 аминокислотных остатков) отвечает за связывание с АИ.

groEL673 groEL97 WT

Так как LuxR состоит из двух доменов с различными функциями, было проведено сравнительное исследование влияния шаперонина GroEL на эффективность действия цельного LuxR и его С-домена в качестве активаторов транскрипции генов /шг-оперона A.fischeri в клетках Е. coli. Для этой цели использовались сконструированные гибридные ллазмиды pGST-LuxR (GST слит с полноразмерным белком LuxR) или pGST-CTD (GST слит с С-концевым доменом белка LuxR) (рис, 13). Полученные конструкции характеризуются тем, что GST не мешает активности как полноразмерного LuxR (активирует промотор в АИ зависимой манере), так и С-концевого домена белка LuxR (открывает промотор независимо от концентрации АИ).

На рисунке 14 приведены кривые зависимости интенсивности биолюминесценции от времени инкубации клеток coli SKB178 gro+ и OFB111 groEL673, содержащих плазмиду рОМ (содержит гены toCDABEG, промотором Рг, но без гена liixR) и плазмиду pGST-LuxR (GST слит с полноразмерным белком LuxR) или плазмиду pGST-CTD (продуцирует GST слитый с С - доменом белка LuxR). В такой комбинации отсутствует эффект положительной обратной связи, которая возникает при экспрессии с промотора Рг гена htxl, что позволяет прямо оценивать влияние мутаций в генах, кодирующих шапероны и протеазы, на активность LuxR и его делетированных форм.

GST

LuxR

СВЯЧЫ1МШ1« с ЛИ связывание с ДИК

162 аминокислотных (лGST }- \ у дин KCl ocrai ка CTD

сктывийие с ДИК

NTD

Рисунок 13. Структура конструкций химерных белков: GST-luxR (белок LuxR с глутатион-трансферазой), GST- CTD (С-концевой домен LuxR с глутатион-трансферазой) и GST-NTD (N-концевой домен LuxR с глутатион-трансферазой).

Как видно из рисунка 14, наличие в клетках Е. coli SKB 178 g/"o'(pOM) дополнительной плазмиды pGST-LuxR или pGST-CTD приводит к резкому увеличению интенсивности биолюминесценции в связи с активацией транскрипции генов tolCDABE с промотора Рг. Мутация groEL673 резко снижает интенсивность биолюминесценции в бактериях, содержащих плазмиду pGST-LuxR. Однако, если в качестве активатора

транскрипции используется С-домен белка ЬихЯ (плазмида рСБТ-СГО),то мутация §гаЕЬ673 не влияет на экспрессию генов /ю:1СОАВЕ. Данные, представленные на рисунке 14, указывают на то, что активность С - концевого домена белка Ьих!1 не зависит от шаперонинабгоЕЬ/ЕВ. Предполагается, что шапсронин ОгоЕЬ/ЕБ необходим для правильной сборки концевого домена.

-»— ОгоЕ1_673 ЬихИ

\АЯ ЬихИ —*— СгоЕ1_673 С-домен —*— \ЛЯ С-домен

100000

10000

к 1000

1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 Время, мин

Рисунок 14. Влияние шаперонина СгоЕЬ на эффективность действия цельного ЬихЯ и его С-домена в качестве активаторов транскрипции генов /ах-оперона Л. Уисйе/-/.

Отдельные колонии клеток, выросших на агаризованной среде при 37°С, переводили в Ь-бульон и дважды отмывали центрифугированием, добавляли АИ 10"бМ. Затем клетки ресуспендировали в 200 мкл ЬВ и измеряли биолюминесценцию. £/-оЕЬ673 рЬихК - ОРВ111 £гоЕЬ673(рО$Т-ЬихК, рОМ), \¥Т ЬихК - 8КВ178 ^о+СрЬихЯ, рОМ),

groEhЫЪ С-домен - ОРВ111 £/-0ЕЬ673(р08Т-СТ0, рОМ), WT С-домен - 5КВ178 £гс+(р08Т-СТО, рОМ)

Для проверки этой гипотезы использовали гибридные плазмиды, кодирующие химерные белки ОЭТ-ЫТО (М-концевой домен, слитый с ОЭТ), ОЭТ-СТО и ОБТ-ЬихИ (рис. 13). Была проведена очистка этих химерных белков с целью выяснить, с какими из них связывается ОгоЕЬ при выделении с помощью аффинной хроматографии.

На рисунке 15 представлены данные ЗОБ - электорофореза белковых фракций в 12% полиакриламидном геле. Белки СЗТ-ЬихЯ и СБТ-СТО и вБТ-ЫТО выделены с помощью аффинной хроматографии на колонке с глутатион агарозой. Как видно из рисунка 15, при аффинной очистке вместе с полноразмерным белком СЗТ-ЬихЯ и его Ы-доменом (ОЗТ-ЫТО) выделяется дополнительный белок (полоса в 60 кДа). Однако, при аффинной очистке С - домена белка ЬихЯ (ОБТ-СТО) эта полоса отсутствует.

Масс-спектрометрический анализ показал, что белок, выделенный из полосы 60 кДа, по составу и распределению пептидных фингерпрннтов согласно базе данных 3\¥185-РЯОТ является шаперонином вгоЕЬ.

GroEL GST-LuxR

GST-NTD GST-CTD

Рисунок 15. SDS-электрофорез в полиакриламидном геле (12%) белковой фракции, полученной в результате аффинной хроматографии на колонке с глутатион-агарозой. Белковую фракцию выделяли из клеток штаммов Е. coli TG-1 содержащих: pGST-CTD (дорожка 1), pGST-LuxR (дорожка 2) и pGST-NTD (дорожка 3) На дорожках 1 и 3 так же присутствует полоса глицерол - киназы (56,2 кДа), а на дорожке I и 2 полоса элонгационного фактора EF-Tu (43,3 кДа) (согласно масс-спектрометрическому анализу эти полосы соответствуют глицерол - киназе и элонгационному фактору EF-Tu). Эти белки сопровождают GST белок при мягких условиях отмывки.

Таким образом, было показано, что в условиях in vivo GroEL шаперонии связывается с полноразмерным LuxR и его N-доменом, но не связывается с С-доменом LuxR. Полученные данные доказывают, что N-концевой домен LuxR белка является мишенью для GroEL шаперонина при фолдинге. Можно сделать предположение, что GroEL шаперонин необходим для фолдинга только N-концевого домена белка LuxR. Достоверно показано, что С-концевой домен LuxR белка (88 аминокислот) не требует GroEL/ES шаперонин для фолдинга.

Для оценки действия Lon протеазы на LuxR и его С-домен гибридные плазмиды pGST-LuxR или pGST-CTD были введены в клетки штаммов Е. coli ABl 157 и Е. coli АВ1899 lonA. Штаммы также содержали сенсорную плазмиду рОМ, позволяющую оценивать активность LuxR in vivo.

1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73 Время, мин

Рисунок 16. Зависимость интенсивности биолюминесценции (1, отн.ед.) клеток штаммов ABl 157 lon+ и АВ1899 lonA, содержащих плазмиды pGST-LuxR и рОМ или pGST-CTD и рОМ, от времени инкубации. Отдельные колонии клеток, выросших на агаризованной среде при 37(,С, переводили в LB и дважды отмывали центрифугированием, добавляли АИ 10"7М. Затем клетки ресуспендировали в 200 мкл L-бульона и измеряли биолюминесценцию при комнатной температуре. WT LuxR - ABl 157 (pGST-LuxR, рОМ) Ion" LuxR - AB 1899 lonA (pGST-LuxR, рОМ) WTC-домен -AB 1157 (pGST-CTD, pOM) Ion С-домен - AB 1899 lonA (pGST-CTD, pOM)

Как видим, на рисунке 16, интенсивность биолюминесценции клеток ABl 899 lonA (pGST-LuxR, рОМ) быстро нарастает уже в течение первых 15 мин с момента добавления АИ, что указывает на наличие в клетках в момент начала индукции (0-минут) достаточного для активации Рг промотора /юг-оперона количества молекул LuxR. В тоже время, в клетках штамма ABl 157 (pGST-LuxR, рОМ) индукция транскрипции генов lux-оперона начинается лишь через 70 мин после добавления АИ (10"7М), что объясняется деградацией белка LuxR протеазой Lon и подтверждает данные, приведённые для полного /tir-оперона A.fischeri на рисунке 10. В варианте, когда в клетки введена плазмида pGST-CTD, кодирующая С-домен белка LuxR, экспрессия te-генов, расположенных на плазмиде рОМ, не зависит от добавления АИ и наличия в клетках активной Lon протеазы. Следовательно, лишь цельный белок LuxR, но не его С-домен, является мишенью для Lon протеазы.

Для протеазы ClpXP также показано участие в негативной регуляции QS системы A.fischeri. Мутации по генам clpP и clpX снижают активационный барьер для

срабатывания QS системы A.ßscheri, хотя и с меньшей эффективностью, по сравнению с мутацией в гене lonA.

Итоги исследования роли шаперопов и протет в регуляции QS системы lux-оперона A. fischeri.

• Lon протеаза участвует в негативной регуляции экспрессии генов lux-оперона А. fischeri, снижая активность белка LuxR.

• Показано, что шаперопин GroEL/ES необходим для сборки нативного белка LuxR

• Показано, что химерный белок GST-LuxR при выделении эффективно связывается с белками GroEL и Lon

• Показано, что лишь цельный белок LuxR, но не его С-домен, является мишенью для Lon протеазы.

• Совокупность данных in vivo и соочистка белка GroEL с LuxR и его делетированными формами доказывают, что N-концевой домен белка LuxR является мишенью для GroEL шаперонина при фолдинге.

Исследование активности шаперопов с помощью бактериальных люцифераз.

Для формирования нативной структуры белковой молекулы как в процессе синтеза на рибосомах (фолдинг), так и при ренатурации денатурированных полипептидов (рефолдинг) требуется участие специальных белков-шаперонов. В настоящее время в бактериях Е, coli детально изучены четыре семейства шаперопов: Hsp60 (GroELS), Hsp70 (DnaK-DnaJ-GrpE), HsplOO (ClpA, ClpB) и малые шаперопы sHsp (IbpAB) (Bukau В., Horwich A.L., 1998; Hartl F.-U., 1996; Ellis R.J. and Hartl F.U., 1999), Мы впервые применили для анализа работы шаперонов в качестве модели бактериальные люциферазы, гомологичные по аминокислотной последовательности, но значительно различающиеся по термостабильности.

Для этой цели были клонированы гены /нх-оперонов luxAB, кодирующих две субъединицы люциферазы, из геномов различных люминесцирующих бактерий А. fischeri, Photobacterium phosphoreum, Vibrio harveyi и P. luminescens. Анализ термоинактивации и рефолдинга люцифераз проведен как in vitro с использованием очищенных препаратов ферментов, так и in vivo в бактериальных клетках Е. coli, как дикого типа, так и несущих мутации по генам, кодирующим белки-шапероны.

Рисунок 17. Кинетика термоинактивации бактериальных люцифераз in vivo. А. -Люциферазы P. phosphoreum (1) и A.fischeri (2), температура инактивации 36°С; Б. -люциферазы A.fischer (1) i, V. harveyi (2) и P. luminescens (3), температура инактивации 43,5°С. По оси ординат указана активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс - время термоинактивации.

На рисунке 17 показана кинетика термоинактивации in vitro четырёх бактериальных люцифераз. Гены люцифераз были клонированы в клетках Е. coli из бактерий, различающихся по своему температурному оптимуму роста. Как видно из рисунка, наиболее термочувствительной оказалась люцифераза Р. phosphoreum, что соответствует самому низкому температурному оптимуму роста психрофильных бактерий данного вида. Далее по возрастанию темостабилыюсти следуют люциферазы A. ßscheri, V. harveyi и Р. luminescens.

Данные по DnaKJE-зависимому рефолдингу тероминактивированных люцифераз in vivo представлены на рисунке 18. Наиболее полный рефолдинг (до 100 % от начальной активности) демонстрируют термочувствительные люциферазы. У более термостабильных люцифераз V. harveyi и Р. luminescens восстановление активности достигает лишь 10-15%. Причём самая термостабильная люцифераза из Р. luminescens обладает самым слабым рефолдингом. Эти данные совпадают с экспериментом, представленным на рисунке 20, где сравнивается эффективность рефолдинга (скорость и уровень) люцифераз из А. ßscheri и Р. luminescens в зависимости от времени инактивации люциферазы.

Активность. ск

ЮОг

"О

10"'

Ю-' т

Ю-3

ю-:г-гт-*-'" У » *

0510 20 40 60 90 05 И Время, мин

0510 20 40 60 90

Рисунок 18. Кинетика рефолдингатермоинактивированных люцифераз в клетках Е.соН. а-Люциферазы Р. р!юзр1югеит (круги) и А./исЬег! (треугольники); б - V. Иап/еу! (круги) и Р. ¡иттезсет (треугольники). Светлые символы - рефолдинг в клетках штамма Мй 1644, темные символы в клетках штамма РК202 Дс/паК}. По оси ординат указана активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс - время выдерживания образца при температуре, оптимальной для данного вида люциферазы (20°С - Р. ркозрИогеит, 25°С - А. /¡зсИеп, 28(,С - У. кагуеуи 34°С - Р. Ыттезсет).

С увеличением времени термоинактивации увеличивается количество необратимых белковых агрегатов в клетке, что приводит к уменьшению уровня и скорости рефолдинга термоинактивированных люцифераз. Однако наиболее круциально этот процесс идет у термостабильных люцифераз: через 40-50 минут инактивации на 46°С рефолдинг не детектируется. В отличие от термостабильной люциферазы Р. ¡иттезсет термолабильная люциферазаЛ.уЬс/геп при тех же условиях инактивации сохраняет способность к рефолдингу и восстанавливает до 10% изначальной активности.

Кроме того на рисунках 18 и 19 представлены данные экспериментов по влиянию мутации в генах по шаперонам семейств Нзр70 (ОпаЫЕ) и ШрЮО (С1рВ). Показано, что мутация по гену с!паК полностью снимает способность люцифераз к рефолдингу, а мутация по гену вспомогательного шаперона С1рВ, который по данным т \itro помогает комплексу ОпаК1Е дезагригировать белки, снижает рефолдинг до нескольких процентов от изначальной активности.

Активность, %

Время, мин

Рисунок 19. Кинетика рефолдингатермоииактивированной люциферазы A.fischeri в клетках Е. coli SG20250 clpB* (1) и CG22100 clpB" (2). По оси ординат отложена активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс - время инкубации образца при 25 С.

Рисунок 20. Зависимость рефолдингатероинактивированных на 46°С люцифераз А. fischeri (А) и P. luminescens (В) от времени инкубации клеток при 221>С (о) - 15 мин инактивации(») - 30 минут инактивации, (Д) - 1 час инактивации. (С) - зависимость эффективности рефолдинга люциферазы A.fischeri (•) и P. luminescens (о) от времени инкубации клеток при 46°С

Белок семейства HSP100- ClpA был описан в экспериментах in vitro как шаперон, защищающий белки от агрегации. Однако данных in vivo получить не удавалось. Применение бактериальных люцифераз для исследования данного шаперона позволило

показать, что С1рА участвует в рефолдинге более крупных белковых агрегатов, образующихся при длительной термоинактивации (рис. 21).

t, мин

Рисунок 21. Зависимость уровня рефолдинга люциферазы A. fischeri от времени инкубации различных штаммов Е. coli MG1655 с плазмидой pF2 при 46 С. Штаммы: (Д) - MG1655 фА+, (•) - MG1655 clpP:cat, (О) - MG1655 clpAv.kan.

Согласно данным, полученным в опытах in vitro, наличие lbpAB в смеси с белком-субстратом защищает белки от термоденатурации, снижая уровень агрегации, что фиксируется методом светорассеяния (Mogk А., et а!.,2003). В нашей работе впервые было показано, что малые шапероны lbpAB оказывают влияние на рефолдинг термоинактивированных люцифераз также, как и белок семейства HsplOO ClpA, при пролонгированной инкубации на 46°С (рис. 22 и 23). Однако комплементировать недостаток ClpA белками lbpAB в клетке не удаётся. Клонированные на плазмиде гены ibpAB усиливают рефолдинг люцифераз при продолжительной (60 мин) термоинактивации до значений, превосходящих контрольные в штамме дикого типа (рис. 23), но не могут восстановить хоть сколько-нибудь значимо рефолдинг, сниженный в мутанте по гену clpA (рис. 24).

t, мин

Рисунок 22. Влияние мутаций в гене ibpB на кинетику и уровень DnaKJE-зависимого рефолдинга термоинактивированной люциферазы A.fischeri. Кинетика рефолдинга люциферазы A.fischeri после инкубации клеток 60 мин при 46°С. По оси ординат отложена активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс отложено время рефолдинга люциферазы при 25°С. (♦) - BW25113 ibpA' ibp& £/;?aK+(pF2), (*) - JW3663 ibpB::kan (pF2), (•) - JW3663 ibpbr.kan (pF2, pOMibpAB).

Время инактивации, мин

—♦— WT —■— ibpA —Л—pibpAB

Рисунок 23. Зависимость уровня рефолдинга люциферазы A.fischeri от времени инкубации различных штаммов Е. coli MG 1655 с плазмидой pF2 при 46°С.

Штаммы: \VT-BW25113 ¡ЬрА' ¡ЬрВ' с1паК\р¥2), ibpB"-JW3663 ¡ЬрВ::кап (рР2), рШрАВ-JW3663 /.ЬрВг.кап (рР2, рОМИзрАВ).

Ъ мин

Рисунок 24. Влияние плазмиды рОМйрАВ на кинетику и уровень ОпаЮЕ -зависимого рефолдинга термоинактивированной люциферазы А. АясИег! в клетках МС1655 с1рА:.кап после 60 мин инкубации клеток при температуре 46°С. По оси ординат отложена активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс -время рефолдинга люциферазы при 25 С. (♦)-М01655фА+(рР2); (■) - Мв1655 с1рА:.кап(х>¥2)\ (А) - М01655 с1рА.:кап (рР2,р01У№рАВ).

Итоги исследований шаперонов с помощью бактериальных люцифераз.

• Применение для анализа работы шаперонов в качестве модели бактериальных

люцифераз, гомологичных по аминокислотной последовательности, но значительно различающихся по термостабильности, оказалось весьма перспективным и в настоящее время принято во многих лабораториях мира.

• Показано, что рефолдинг термоинактивированных бактериальных люцифераз, являющихся гетеродимерами, происходит в клетке с участием шаперонов семейства Нэр70 (ОпаКШ), НэрЮО (С1рА, С1рВ) и малых шаперонов эНзрР (1ЬрАВ).

• Показано, что термостабильные люциферазы характеризуются сравнительно низким уровнем ОпаЮЕ-зависимого рефолдинга в отличие от термолабильных люцифераз, которые восстанавливают активность после термоинактивации практически до 100%.

Биосенсоры: применение Iих-биосенсоров для детекции токсических агентов, антибиотиков, аутоиндукторов и других биологически активных веществ.

Проведённые в процессе выполнения диссератационной работы исследования, (в частности, клонирование набора генов, кодирующих люциферазы, и индуцируемых

стрессовых промоторов) позволили сконструировать специфические, высокочувствительные /кх-биосенсоры. Выполнен ряд договоров и контрактов хозяйственного назначения по темам, связанным с экологией, определением механизмов токсического воздействия веществ на бактериальную клетку, тестированием разрабатывающихся медицинских препаратов (доклиника) и др.

Ьих-биосенсоры широко используются в работах по генетической инженерии и биотехнологии, а также для мониторинга окружающей среды. Ьих-биосенсор - это бактериальная клетка, содержащая гибридную плазмиду, в состав которой встроены два основных элемента: регуляторный участок (промотор и оператор и, при необходимости, ген регулятор) и ген (гены)-репортер (рис. 25). В качестве генов-репортеров используются гены /цхСОАВЕ, кодирующие люциферазу и редуктазу. В качестве регуляторных элементов используются различные индуцируемые промоторы, сформированные в процессе эволюции и специфически реагирующие на наличие в среде определенного вида химического вещества. Данная группа биосенсоров характеризуется как специфичностью, так и высокой чувствительностью, что определяется особенностью взаимодействия белка - рецептора (репрессора или активатора транскрипции) с химическим веществом.

■ : тч, : А*ЗГ> Д,-«А /VISS

• • ] »--л • ьлгк.Г)\-. :ичг

+ *(*vpi». *. *

I/mkV

NaAs0o

с Ars,?

СШС iuxD hxA Jo.vB kixE

hv 490 hm lö

T 0 10 10 10" 1Ö 10 10 10

[C], M

Рисунок 25. Схема специфического lux-биосенсора, сконструированного с применением репортерных генов luxCDABE, индуцируемого промотора ParsR и регуляторного arsR гена, реагирующего ионы мышьяка. Приведена зависимость интенсивности биолюминесценции биосенсора Е. coli (pArsR-lux) от концентрации ионов мышьяка (NaAsCh). Пунктиром обзначена кривая инактивации люминесценции контрольных клеток, в которых гены luxCDABE находятся под контролем конститутивного промотора.

Сконструированы новые формы lux-биосенсоров, отличающиеся по основным параметрам (пороговая чувствительность и амплитуда ответа) от аналогов lux-

биосенсоров, полученных зарубежными фирмами. В таблице приведены основные характеристики 1их-биосенсоров, применяющихся для детекции токсикантов, экологического мониторинга и определения механизмов токсического воздействия на клетку. Пример временной зависимости активации люминесценции биосенсора Е.соН М01655 рА1кА-1их в ответ па добавление токсиканта (А,-метил-Л,'-нитро-Л-нптрозогуанидина) приведён на рисунке 25.

Таблица. Основные характеристики lux-биосенсоров

Биосснсор Exolr. Токсический агент Промо тор Амплитуд а ответа Пороговая концентрация fmí M1II1

pArsR-lux Ав, БЬ arsR 500 Ю-" М А$ 30

pMerR-lux Hg,Cd merR 500 30

pCopA-lux Си, А§ сорА 20-Cu 30-Ag 5x10'' М Си; 2Х10'7М Ag 20 7

pTetR-lux тетрациклин tetA 1000 0.5 нг/мл 30

pColD-lux ДНК -повреждающие агенты: УФ, митомицнн С, 4-НХО cda 1000 МИТОМИЦИН С 25

pAlkA-lux Алкилирующие агенты: МННГ, ММС, нитрозо-мочевина alkA 300 ю-8м МННГ 20

plbpA-lux этанол, температура, пентахлорфенол ibpA 100 0,3% этанол 10 мг/л пентахлорфено л 20 10 15

pFabA-lux трнтон Х-100, фенол и его производные JabA 3 0,2 мг/л тритон Х-100 30

pKatG-Iux Н202 katG 100 10"°М Н202 7

pSoxS-lux супероксид-анион soxS 100 ю-6м паракват 15

Рисунок 26. Клетки Е. coli MC 1061 (pAlkA-lux) выращивали до ранней логарифмической фазы, добавляли к аликвогам (по 200 мкл) А'-метил-А<,'-нитро-А'-нитрозогуанидина до конечных концентраций 5, 1,0,1,и 0,01 мкг/мл. Измеряли люминесценцию образцов в течение 2 часов. На графике показана зависимость люминесценции образцов от времени инкубации.

С помощью подобных биосенсоров впервые был исследован механизм токсического действия на клетку 1,1-диметилгидразина (компонент ракетного топлива) (НДМГ) и наночастиц диоксида титана. Показано, что основная роль в токсическом действии этих агентов связана с образующимися активными формами кислорода (перекись водорода и суперокид-анион).

а.

Рисунок 27. Зависимость интенсивности люминесценции клеток биосенсора Е. coli MG1655 pKatG-lux от времени инкубации (А) и от концентрации (В) в среде 1,1 диметилгидразина (НДМГ). (•) - контроль (о)- + НДМГЗ мМ (□) - + перекись водорода 0,5 мМ (■) - + каталаза, + НДМГ 3 мМ

На рисунках 27 и 28 представлены данные, свидетельствующие о том. что основное генотоксическое действие НДМГ на бактериальную клетку связано с образованием активных форм кислорода в процессе восстановления атмосферного кислорода. Добавление каталазы в икубационную среду полностью снимает как окислительный стресс (рис. 27 (А)), так и SOS -ответ бактериальных клеток (рис. 28)

Время, [мин]

Рисунок 28. Кинетика индукции (усиления) биолюминесценции биосенсора Е. coli MG 1655 (pRecA-lux) в зависимости от времени инкубации с НДМГ (концентрация НДМГ = 5 мкМ). (•) - контроль (о) - НДМГ 3 мМ (□) - перекись водорода 0,5 мМ (■) - каталаза, + НДМГ 3 мМ (Д) - митомицин С 10°М

Однако токсическое действие НДМГ на живую клетку не ограничивается воздействием активных форм кислорода, возникающих в процессе окисления НДМГ в аэробных условиях. В процессе окисления возникают промежуточные формы окисленного НДМГ, в том числе, нитрозодиметиламин, который является апкилирующим агентом для ДНК. На рисунке 29 представлены данные по активации промотора PalkA как-чистым НДМГ, так и продуктами его окисления, возникающими при обработке перекисью водорода. Показано, что чистый, не окисленный НДМГ, не обладает алкилирующим действием на ДНК. Восстановление атмосферного кислорода НДМГ с образованием перекиси водорода достаточно, чтобы возник SOS-ответ клетки, в первые, часы инкубации в растворе с НДМГ (рис 28). В случае если происходит более глубокое

окисление НДМГ в присутствии экзогенно добавленной перекиси водорода, возникают продукты окисления, которые были охарактеризованы как при помощи биосенсоров так и на хроматомасс-спектрометре. Показано, что продукты окисления НДМГ перекисью водорода обладают высокой алкилирующей способностью и вызывают активацию Р^ промотора (рис. 29). Максимальная амплитуда ответа биосенсора наблюдается в случае, когда концентрации НДМГ и перекиси водорода эквимолярны. Перекись водорода не вызывает индукцию Ра)кА промотора, так как не может являться алкилирующим агентом, и РаЛсА не индуцируется окислительным стрессом, однако в случае больших концентраций Н^От избыток перекиси водорода приводит к гибели клеток, уменьшая наблюдаемую биолюминесценцию.

100 150

Время, мин.

♦ Контроль

♦ 20м моль

Юм моль

7,5м моль

5м моль

2,5м моль

♦ 1м моль

0,5м моль

— Оммоль

Рисунок 29. Зависимость люминесценции Е. coli МС1061 (pAlkA-lux) от времени инкубации в присутствии несимметричного диметилгидразина (НДМГ) и перекиси водорода.

К клеткам Е. coli MC 1061 pAlkA-lux добавляли НДМГ 7,5 мМ и различные концентрации окислителя - перекиси водорода (20; 10; 7.5; 5; 2.5; 1; 0.5 мМ). Измеряли люминисценцию образцов в течение 4 часов.

Итоги прикладных исследований диссертационной таботы.

• Сконструированы lux-биосенсоры, отличающиеся высокой чувствительностью чувствительность и амплитудой ответа, при этом специфично реагирующие на различные классы токсических и биологически активных веществ.

• С помощью lux-биосенсоров впервые был исследован механизм токсического действия на клетку 1,1-диметилгидразина (компонент ракетного топлива) и

наночастиц диоксида титана. Показано, что основная роль в токсическом действии этих агентов связана с образующимися активными формами кислорода (перекись водорода и суперокид-анион).

Обсуждение

Анализ биолюминесцептных, биохимических и генетических характеристик психрофилышх светящихся бактерий штаммов BMI, ВМ2, KChI и KCh2 рода Aliivibrio (изоляты акваторий Белого, Берингова и Охотского морей) показал, что эти штаммы принадлежат виду A. logei. Отметим, что в акваториях Белого, Охотского и Берингова морен бактерии данного вида изолированы впервые. Фенотипически бактерии вида A. logei очень близки бактериям вида A.ßscheri, однако, в отличие от бактерий A.ßscheri являются ярко выраженными психрофилами, так как растут при 4°С и не растут при 30°С, что первоначально и послужило выделению этих бактерий в отдельный вид (Bang S.S., et а1 1978). На близость видов A. logei и A. flscheri указывает также тот факт, что сравнительно часто бактерии этих видов находят в качестве совместных симбионтов в фотофорах кальмаров рода Sepiola (Fidopiastis P.M. et al 1998.). Однако наиболее близкий генетически A. logei является не светящийся, патогенный для промыслового атлантического лосося вид A. salmonicida. На основе сравнения фенотипических характеристик и данных секвенирования (филогенетические исследования проводились по пяти «домашним» генам, 16S рРНК и IwcAB), можно предположить, что эволюционно близкие виды A. logei и A. salmonicida, заняв разные экологические ниши, приобрели заметные различия в фенотипах (в том числе потеря способности к люминесценции A. salmonicida). И наоборот, сходство фенотипических признаков A. logei и A.ßscheri возникло в результате существования этих видов в сходных экологических нишах. При этом сохраняется главное отличие (разные температурные оптимумы роста), позволяющее избегать конкуренции бактериям A. logei и A.ßscheri.

Основное отличие QS систем психрофильных штаммов по сравнению с мезофильными заключается в наличии двух luxR регуляторных генов. Филогенетический анализ штаммов A. logei показывает, что спейсерная часть между геном luxRI и последовательностью Шайна-Дальгарно luxC гена подвержена высокой скорости перестроек ДНК (гомология между различными штаммами составляет около 75-85 %), в тоже время последовательности обоих генов luxR (как и струетурных генов всего оперона) практически идентичны (гомология 98-100%). Тот факт, что дупликация гена luxR подвержена стабилизирующему отбору (как правило, при возникновении дупликаций

одна из копий гена быстро теряется или перестает экспрессироваться) в /ю>оперонах психрофильных бактерий свидетельствует о необходимости обоих генов для штатной работы QS системы. Предполагается, что наличие двух регуляторных генов в /ых-оперонах психрофильных бактерий может быть связано с необходимостью активировать QS в условиях низких температур.

Исследования шаперонина CroEUES и протеазы Lon как модуляторов QS A.flscheri позволяют предположить следующую последовательность событий получения нативной формы белка LuxR. На первой стадии в результате синтеза на рибосоме образуется структура с полностью сформированным С-доменом и слабо упакованным («рыхлым») N-доменом белка LuxR. На второй стадии N-домен LuxR контактирует с шаперонином GroEL/ES, что обеспечивает последующий процесс фолдинга белка, завершаемый формированием компактной структурой N-домена белка LuxR. Или контактирует с Lon-протеазой, в случае если по какой-то причине не может связаться с GroEL/ES и подвергается протеолизу. Такой белок LuxR еще не способен активировать транскрипцию /га-генов, так как N-домен частично закрывает С-домен, блокируя формирование комплекса С-домена с /га-боксом. На третьей стадии N-домен белка LuxR образует комплекс с молекулой АИ, что обеспечивает мономерам белка способность к формированию активного димера (LuxR-AH)2, в котором N-домены обеспечивают контакт мономеров между собой и с а-субъединиц РНК-полимеразы, а открытые С-домены формируют комплекс с /¡«-боксом. Такой комплекс (LuxR-AH)2 уже резистентен к действию Lon протеазы.

Необходимо отметить, что N-домен белка LuxR характеризуется очень низкой константой диссоциации при комплексировании с АИ: пороговая концентрация АИ, при которой активируется экспрессия /шг-генов, составляет порядка 10"9М (что соответствует примерно 3-4 молекулам АИ в расчете на объем бактериальной клетки).

В настоящей работе показано, дефицит GroEL может быть скомпенсирован высокой концентрацией АИ (10"7М против концентрации 10-9М характерной для штамма gro+). Однако концентрации АИ порядка Ю"7М имеют место лишь при полном открытии системы QS. Следовательно, в природных условиях нормальный процесс формирования нативной формы LuxR происходит двухэтапно: в начале с участием шаперонина groEL, а затем молекулы АИ. Поэтому можно считать роль шаперонинов GroEL/ES и протеазы Lon ключевой в регуляции QS систем первого типа.

Результаты этого раздела позволяют предположить неслучайное возникновение механизма протеолитического контроля и шаперонного ОТК для N-концевого регуляторного домена белка LuxR, который, по-видимому, критичен для оценки целого

ряда параметров, в том числе стрессового состояния клетки. Позднее зарубежными авторами были получены данные об участии Lon протеазы и шаперонов HspöO в регуляции QS у ряда других бактерий (Bertani I el al 2007; Pinto UM and Winans SC 2009).

Применение для анализа работы шаперонов в качестве модели бактериальных люцифераз, гомологичных по аминокислотной последовательности, но значительно различающихся по термостабильности, оказалось весьма перспективным и в настоящее время принято во многих лабораториях мира. С помощью этого метода в настоящей работе было показано, что рефолдинг термоинактивированных бактериальных люцифераз, являющихся гетеродимерами, происходит в клетке с участием шаперонов семейства Hsp70 (DnafCJE), HsplOO (ClpA, ClpB) и малых шаперонов sHspP (IbpAB).

Показано также, что термостабильные люциферазы характеризуются сравнительно низким уровнем DnaKJE-зависимого рефолдинга в отличие от термолабильных люцифераз, которые восстанавливают активность после термоинактивации практически до 100%. Можно предположить, что более протяжённое гидрофобное ядро термостабильной люциферазы P. luminescens определяет термодинамическую выгоду от взаимодействия с подобными белками (самоассоциация и формирование агрегатов) по сравнению с взаимодействием с белками - шаперонами DnaKJE. В случае термолабилыюй люциферазы A.ßscheri, по-видимому, денатурированным молекулам выгоднее взаимодействовать с белками -шаперонами, что и обеспечивает высокий уровень рефолдинга даже при длительном выдерживании бактерий при высокой температуре (46°С).

Сконструированные в ходе выполнения диссертационной работы 1их-биосенсоры на основе Ых- генов и специфически регулируемых промоторов применимы для экологического мониторинга, а также для выполнения специальных задач (детекция токсичного компонента ракетного горючего - 1,1-диметилгидразнна (гептила) и его производных, детекция диоксина и его производных в пищевой промышленности, антибиотиков - в молочной промышленности, тяжелых металлов и металлоидов - при экологическом мониторинге и детекции OB и др.)

Полученные экспериментально данные по оценке чувствительности сконструированных биосенсоров при действии на бактериальные клетки контрольными химическими препаратами показали, что lux-биосенсоры характеризуются высокой чувствительностью и одновременно специфичностью. Сконструированные lux-биосенсоры по характеру ответа на действие токсических веществ можно разбить на две группы; 1) высоко специфичные биосенсоры, реагирующие на очень ограниченный круг химических веществ. К ним относятся биосенсоры с промоторами PtetR, ParsR, PmerR,

РккИ, РкаЮ, РзохБ. В механизме работы этих биосенсоров задействованы белки-репрессоры или активаторы транскрипции генов, инактивиругощиеся при реакции с химическими веществами строго определенной природы, например, только с ионами мышьяка, ртути, антибиотика тетрациклина, перекиси водорода, супероксид-анион-радикапа, или активируемые при специфическом комплексировании с химическим соединением, как, например. ЬихК-АИ-1;

и 2) биосенсоры, реагирующие на более широкий спектр химических веществ, но также с достаточно высокой степенью избирательности. К ним относятся биосенсоры с промоторами РгесА, РгроЕ, PgrpE,PcolD, РГаЬА. Эти биосенсоры «отвечают» на действие более широких по химическим свойствам групп токсических веществ. Например, только на агенты, повреждающие ДНК, или только на агенты, повреждающие белки, или только на агенты, повреждающие мембраны клетки.

Обе группы 1их-биосенсоров имеют свои области применения. Например, важно дифференцировать на какие компоненты клетки действует токсикант, содержащийся в среде - на генетический аппарат (ДНК) или на белки. В этом случае необходимо использовать для детекции биосенсоры с промоторами РсоЮ, РгесА, РгроЕ, Р§грЕ. Если же стоит задача - уточнить природу ОВ в среде или наличие тяжелого металла, то необходимо использовать узко специфические биосенсоры с промоторами типа РсорА, РатаЯ, РтегК.

Выводы

1. Впервые определена структура Лиг-оперона у психрофильных светящихся морских бактерий. В отличие от /их-оперонов мезофильных морских бактерий, содержащих в своем составе одну копию гена 1гаЛ, в Л/дг-оперонах психрофильных бактерий содержится две копии гена ¡ихК, причем белки ЬихШ н ЬихЯ2 различаются как по аминокслотной последовательности, так и по активности по отношению к регулируемому ими промотору.

2. Показано, что криптическая люминесценция патогенных морских бактерий АНтЬпо ьа1тотс1с1а (бактерии люмикесцируют лишь при добавлении в среду субстрата люциферазы длинноцепочечного альдегида) связана с дефектом в гене 1ихД кодирующем одну из субъединиц редуктазы.

3. Показано, что АТФ-зависимая протеаза Ьоп участвует в негативной регуляции систем ОБ у морских бактерий. Доказано, что шаперонин ОгоЕЬ/ЕЭ участвует в сборке нативной формы белка ЬихЯ.

4. Основную регуляторную функцию в белке ЬихЛ несет N - домен (162 аминокислотных остатка), являющийся мишенью для Ьоп-протеазы и определяющий контакт полипептида с шаперонином бшЕЕ, необходимым для сборки нативной структуры ЬихЯ.

5. Впервые для анализа работы шаперонов были использованы в качестве модели бактериальные люциферазы, гомологичные по аминокислотной последовательности, но значительно различающиеся по термостабильности.

6. Рефолдинг термоинактивированных бактериальных люцифераз происходит в клетке с участием шаперонов семейства №р70 (ЭпаК^Е), НэрЮО (С!рА, С1рВ) и малых шаперонов бНбр (1ЬрАВ).

7. Термостабильные люциферазы характеризуются сравнительно низким уровнем ОпаЮЕ-зависимого рефолдинга в отличие от термочувствительных люцифераз, которые восстанавливают активность после термоинактивации практически до 100%.

8. Сконструированы новые формы 1их-биосенсоров, отличающиеся по основным параметрам (пороговая чувствительность и амплитуда ответа) от аналогов 1их-биосенсоров, полученных зарубежными фирмами. С помощью данных биосенсоров впервые был исследован механизм токсического действия на клетку 1,1-дпметилгидразина (компонент ракетного топлива) и наночастиц диоксида титана. Показано, что основная роль в токсическом действии этих агентов связана с образующимися активными формами кислорода (перекись водорода и суперокид-анион).

Список публикаций.

1) Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. "Ouorum sensing", или как бактерии "разговаривают" друг с другом. // Мол. Биол. 2001 Т. 35 №2. С. 268-277.

2) Г. Б. Завильгельский, В. Ю. Котова, M. M. Мажуль, И. В. Манухов Роль шаперонов Hsp70 (DnaK-DnaJ-GrpE) и HsplOO (ClpA и ClpB) в рефолдинге и повышенной термостабильности бактериальных люцифераз в клетках Escherichia coli. // Биохимия 2002 67(9):986-92„

3) Г. Б. Завильгельский, А. П. Зарубина, И. В. Манухов Определение и сравнительный анализ нуклеотидной последовательности ¿юс-оперона Photorhabdus luminescens, штамм ZM1. ERIC - элементы как предполагаемые «горячие» точки рекомбинации. // Молекулярная биология 2002 36(5):792-804.,

4) Завильгельский, В. Ю. Котова, И. В. Манухов. Влияние регуляторных белков RcsA и RcsB на экспрессию /их-опреона Vibrio fischeri в Escherichia coli. // Молекулярная биология 2003 37(4):704-11.

5) Г.Б. Завильгельский, В. Ю. Котова, М. М. Мажуль, И. В. Манухов. Влияние белков семейства С1р на DnaK-зависимый рефолдинг бактериальных люцифераз. // Молекулярная биология 2004 38(3):507-14.

6) . Manukhov IV. Mamaeva DV, Rastorguev SM, Faleev NG, Morozova EA, Demidkina TV, Zavilgelsky GB. A gene encoding L-methionine gamma-lyase is present in Enterobacteriaceae family genomes: identification and characterization of Citrobacter freundii L-methionine gamma-lyase. //J Bacteriol. 2005 187(11):3889-93

7) И. В. Манухов, В.Ю. Котова, Г.Б. Завильгельский. Роль шаперонов GroEL/GroES и протеазы Lon в регуляции экспрессии /их-оперона Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli. II Молекулярная биология 2006 40(2); 277-83.

8) Манухов И. В.. Мамаева Д. В., Морозова Е. А., Расторгуев С. М., Фалеев Н. Г., Демидкина Т. В., Завильгельский Г. Б. L-метнонин-гамма-лиаза. // Биохимия 2006 71(4); 842-851.Citrobacter freundii: клонирование гена и кинетические параметры фермента.

9) И. В. Манухов, В.Ю. Котова, Г.Б. Завильгельский. Внутриклеточные факторы регуляции экспрессии /ых-оперона Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli. И Микробиология 2006 75(4): 525-31.

10) Zavilgelsky G.B., Kotova V.Yu., and Manukhov l.V. Action of asymmetric 1,1-dimethylhydrazine on bacterial cells is determined by hydrogen peroxide. II Mutation Research. 2007 634(l-2):172-6.

11) И. В. Манухов. В. 10. Котова, Д. Г. Мальдов, А. В. Ильичев, А. П. Бельков, Г. Б. Завильгельский. Индукция окислительного стресса и SOS-ответа в бактериях Escherichia coli растительными экстрактами: роль гидроперекисей и эффект синергизма при совместном действии с цисплатиной. // Микробиология 2008 Т.77, № 5, с. 1-8.

12) Манухов И. В.. Балабанов В.П., Котова В.10., Хрулыюва С.А., Мелькина О.Е., Крайнов А.А., Пустовойт К.С., Кречетов П.П., Королёва Т.В., Шатров Т.Я., Чалкин С.Ф., Завильгельекип Г. Б. Использование Lux-биосенсоров для детекции НДМГ в почве. // Двойные технологии 2008 44(3): с. 50-56

13) В.Ю. Котова, И. В. Манухов. О. Е. Мелькина, Г.Б. Завильгельский. Мутация cIpA::kan в гене, кодирующем шаперои семейства HsplOO, уменьшает эффективность DnaK-зависимого рефолдинга белков в клетках Escherichia coli. II Молекулярная биология 2008 42(5); 1018-22.

14) Манухов И. В., Котова В.Ю., Завильгельский Г. Б. Lux-биосенсоры для детекции SOS-ответа, теплового шока и окислительного стресса. // Биотехнология 2009, №6, С. 16-25.

15) С.А. Хрульнова, И.В. Манухов. А. П. Зарубина, Г. Б. Завильгельский. Aliivibrio logei, штамм KChl (изолят Камчатка): биохимические и люминесцентные характеристики, клонирование /их-оперона. // Микробиология. 2010, №. 79, С 349-355.

16) О. Е. Мелькина, И. В. Манухов. Г. Б. Завильгельский. Протеолитический контроль экспрессии генов /шг-оперона Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli. Il Генетика 2010, том 46, № 8, с. 1-6.

17) О. Е. Мелькина, И. В. Манухов. Г. Б. Завильгельский. С - домен LuxR, активатора транскрипции /шг-оперона Vibrio fischeri, не является мишенью для Lon -протеазы. // Молекулярная биология 2010 т.44 № 3 С. 1-5.

18) llva V. Manukhov. Ol'ga Е. Melkina, Ignatii I. Goryanin, Ancha V. Baranova, and Gennadii B. Zavilgelsky. The N-terminal domain of the Aliivibrio fischeri LuxR is a target oftheGroELchaperonin. //Journal of Bacteriology2010, Vol. 192, No. 20p. 549-51.

19) В.Ю. Котова И.В. Манухов Г.Б. Завильгельский, Использование специфических индуцируемых Lux-биосенсоров для определения механизма токсичности наночастиц. // Нанотехника 2010, №4(24) С.35-38

20) S. A. Khrul'nova, I. V. Manukhov. А. P. Zarubina, and G. В. Zavilgelsky. Aliivibrio logei strain KChl (a isolate of Kamchatka): biochemical and luminescence characteristics, structure features of the lux-operon. //Luminescence 2010; 25: 191

21) Г.Б. Завильгельский, В.Ю. Котова, И.В. Манухов, Напочастицы диоксида титана (ТЮ2) индуцируют в бактериях стрессовые реакции, фиксируемые специфическими lux-биосенсорами. // Российские Нанотехнологии 2011, т 6 №5-6 С. 401405.

22) Manukhov IV. Khrul'nova SA, Baranova A, Zavilgelsky GB. Comparative analysis of the lux operons in Aliivibrio logei KChl (Kamchatka isolate) and Aliivibrio salmonicida. IIJ Bacteriol. 2011 193(15):3998-4001.

23) С. А. Хрулыюва, И. В. Манухов. Г. Б. Завильгельский. "Quorum sensing" регуляция экспрессии /ш:-генов и структура /их-оперона у морских бактерий Aliivibrio logei, // Генетика. 2011, том 47, № 12, с. 1596-1603.

Подписано в печать: 17.10.2011

Заказ № 6055 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.auloreferat.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Манухов, Илья Владимирович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. Актуальность темы

2. Цели и задачи

3. Научная новизна

4. Практическая значимость работы

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Психрофильные и мезофильные светящиеся морские бактерии.

1.1. Филогения морских светящихся микроорганизмов

1.2. Особенности психрофилъных бактерий.

1.3. Перспективы применения психрофилъных микроорганизмов в биотехнологии.

2. Quorum Sensing системы

2.1. LuxI/LuxR-зависимая регуляция биолюминесценции у морских бактерий A. fischeri ■ . .

2.2. Аутоиндукторы первого типа и их взаимодействие с LuxRподобными белками

2.3. Внутриклеточные факторы регуляции экспрессии генов, входящих врегулоны систем "Quorum Sensing".

3. Белки шапероны и АТФ-зависимые протеазы.

3.1. Молекулярные шапероны би-шаперонной системы DnaKJE

3.2. Шаперон GroEL/GroES (HSP60).

3.3. Малые белки-шапероны IbpA/IbpB (sHSP) и шапероны ClpA

HSP100).

3.4. АТФ-зависимые протеазы

3.5 Триггер-фактор

4. «Холодовой шок» мезофильных и психрофильных бактерий.

3.5. Белки «холодового шока» мезофильных бактерий.

3.6. Белки «холодового шока» психрофильных бактерий.

3.7. Перспективы применения белков «холодового шока».

5. Биосенсоры, основанные на индуцируемых промоторах и генах бактериальных люцифераз в качестверепортёрных.

5.1. Целъноклеточные бактериальные биосенсоры.

5.2. Ьих-биосенсоры.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Бактериальные штаммы и плазмиды

2. Среды и условия роста бактерий

3. Выделение и очистка хромосомной и плазмидной ДНК, клонирование ирестрикционный анализ.

4. Определение нуклеотидной последовательности

5. Выделение и очистка белков и электрофорез в полиакриламидном геле.

6. Масс-спектрометрический анализ пептидов.

7. Термоинактивация и рефолдинг люциферазы

8. Ферменты и химические вещества.

9. УФ-облучение

10. УФ-облучение суспензии бактерий в присутствии наночастиц диоксида титана.

11. Измерение степени окислительного стресса, «теплового шока» и БОБ-ответа.

12. Измерение биолюминесценции клеток

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Ьих-опероны психрофильных и мезофильных светящихся бактерий.

L1. Изоляция психрофилъных люминесцирующш штаммов и идентификация видовой принадлежности.

1.2. Сравнительный анализ "Quorum Sensing" систем Aliivibrio logei и

Aliivibrio fis chéri.

1.3. Сравнительный анализ lux-оперонов A. salmonicida и A. logei.

1.4. Особенности организации lux-оперона Photorhabdus luminescens

2. Влияние шаперонов и протеаз на "Quorum Sensing" систему регуляции экспрессии генов lux-оперона A. fischeri.

2.1 Влияние шаперона GroEL/ES и протеазы Lon на «Quorum Sensing» систему регуляции экспрессии генов lux-оперона A. fischeri.

2.2. Дефицит шаперона GroEL/ES компенсируется высокими концентрациями аутоиндуктора.

2.3. Исследование влияния шаперона GroEL/ES протеазы Lon на активность белка LuxR и его делетированных форм.

2.4. Участие протеазы ClpXP в негативной регуляции QS системы

A. fischeri, защитное действие аутоиндуктора от протеаз ClpXP и

3. Определение активности шаперонов с помощью бактериальных люцифераз.

3.1. Определение активности бишаперонной системы DnaKJE-ClpB; обратная корреляция активности бишаперонной системы с терморезистентностью люцифераз.

3.2. Влияние шаперона ClpA на DnaK-зависимый рефолдинг бактериальной люциферазы A. fischeri в клетках Е. coli

3.4. Влияние шаперонов IbpAB на DnaK-зависимый рефолдинг бактериальной люциферазы А. fischeri в клетках Е. coli

3.5. TF-зависимый рефолдинг в клетках Е. coli.

4. Биосенсоры: применение 1их-биосенсоров для детекции токсических агентов, антибиотиков, аутоиндукторов и других биологически активных веществ.

4.1 Общая схема конструирования и определения основных параметров 1их-биосенсоров.

4.2. Токсическое действие НДМГ на клетку определяется алкилирующими продуктами окисления и перекисью водорода, появляющейся в результате восстановления атмосферного кислорода.

4.3. Исследование действия спиртовых экстрактов из лекарственных растений на бактерии.

4.4. Определение механизма токсического воздействия наночастиц диоксидов металлов на бактериальные клетки.

ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ биолюминесцентных, биохимических и генетических характеристик психрофильных светящихся бактерий.

2. Исследования шаперона GroEL/ES и протеазы Lon как модуляторов QS А. fischen.

3. Применение для анализа работы шаперонов в качестве модели бактериальных люцифераз.

4. Сконструированные в ходе выполнения диссертационной работы 1их-биосенсоры на основе lux- генов и специфически регулируемых промоторов применимы для экологического мониторинга, а также для выполнения специальных задач.

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура lux-оперонов и механизмы регуляции типа "Quorum Sensing" у морских бактерий"

Актуальность темы.

В последние 15 лет достигнут значительный прогресс в понимании механизмов регуляции генов по принципу «Quorum Sensing» (QS). QS -система регуляции экспрессии генов в ответ на увеличение плотности популяции клеток. Различные виды бактерий используют QS для скоординированного ответа, согласованного с локальной плотностью их популяции. Системы регуляции генов типа QS играют ключевую роль во взаимодействии бактерий с высшими организмами, животными и растениями, как при патогенезе, так и при симбиозе. Впервые феномен регуляции генов по типу QS был обнаружен в 1970-е годы у морских бактерий Aliivibrio (ранее Vibrio) fischeri для группы /мх-генов, ответственных за биолюминесценцию клеток (Nealson & Hastings, 1979). Однако термин QS был впервые введен в обиход значительно позже в 1994 г Greenberg Е.Р. с сотр. (Fuqua W.C., et al 1994). В результате активного изучения было обнаружено, что феномен QS широко распространён среди бактерий. Оказалось, что ряд генов, определяющих вирулентность патогенных микроорганизмов и устойчивость к лекарственным препаратам, регулируется по принципу QS, что имеет особое значение для медицины и поэтому вызывает высокий интерес научного сообщества к данной проблеме. ш>оперон морских бактерий Aliivibrio fischeri в настоящее время принято считать модельным в исследованиях QS систем, а по обозначению белка LuxR, регулятора /шг-оперона было определено семейство LuxR-гомологичных белков - регуляторов QS систем первого типа. В настоящее время остаются открытыми ряд вопросов об эволюционном происхождении феномена биолюминесценции бактерий, а также о механизмах стабилизирующего отбора /ш>оперонов у свободноживущих видов бактерий. Продолжаются поиски новых регуляторных QS систем у бактерий и исследования факторов, модулирующих ответ бактерий в зависимости от состояния клетки. Актуальна также проблема молекулярной биологии и биофизики - фолдинг и рефолдинг белков и роль белков-шаперонов в этих процессах. В диссертационной работе для этой цели впервые используются различающиеся по термостабильности, но гомологичные по аминокислотной последовательности бактериальные люциферазы психрофильных и мезофильных морских люминесцирующих бактерий.

Кодируемые генами бактериальных /ш;-оперонов люциферазы в настоящее время широко используются в работах по молекулярной генетике (гены-репортеры), при биохимических анализах, в генно-инженерных работах (селекция) и ряде других. Большое распространение приобрели работы по экологическому мониторингу, тестированию токсикантов в пищевых продуктах, а также разработке и тестированию новых медицинских препаратов с помощью цельноклеточных биосенсоров, которые основаны на транскрипционных слияниях генов бактериальных люцифераз с индуцируемыми стрессовыми промоторами.

Цель и задачи исследований.

Целью данной работы являлось изучение механизмов регуляции 1га-оперонов морских люминесцирующих мезофильных и психрофильных бактерий, а также исследование роли шаперонов в фолдинге и рефолдинге термолабильных белков на модели различающихся по термостабильности бактериальных люцифераз.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.

Изолировать штаммы психрофильных люминесцирующих бактерий.

Определить видовую принадлежность изолированных штаммов.

Клонировать и секвенировать /га-опероны бактерий, характеризующихся различным температурным оптимумом роста.

Провести сравнение механизмов регуляции /ш:-оперонов психрофильных и мезофильных бактерий рода АИшЬпо.

Определить влияние на активность регуляторного белка LuxR АТФ-зависимых шаперонов и протеаз.

Исследовать роль N- и С-концевых доменов белка LuxR при взаимодействии с шапероном GroEL/ES и протеазой Lon.

Прикладной задачей исследования было конструирование и демонстрация эффективности применения /ш:-биосенсоров, созданных на основе штаммов Е .coli, содержащих гибридные плазмиды с генами бактериальных люцифераз в качестве репортёрных, расположенных под контролем различных индуцируемых (стрессовых) промоторов.

Научная новизна работы.

Впервые определена структура /ггх-оперона у психрофильных светящихся морских бактерий. В отличие от /ш>оперонов мезофильных морских бактерий, содержащих в своём составе одну копию гена IwcR, в lux-оперонах психрофильных бактерий содержится две копии гена luxR, причём белки LuxRl и LuxR2 различаются как по аминокислотной последовательности, так и по активности по отношению к регулируемому ими промотору.

Показано, что криптическая люминесценция патогенных морских бактерий Aliivibrio salmonicida (бактерии люминесцируют лишь при добавлении в среду субстрата люциферазы длинноцепочечного альдегида) связана с дефектом в гене luxD, кодирующем одну из субъединиц редуктазы.

Впервые показано, что АТФ-зависимая протеаза Lon участвует в негативной регуляции систем QS у морских бактерий. Доказано, что шаперон GroEL/ES участвует в сборке нативной формы белка LuxR.

Впервые показано, что основную регуляторную функцию в белке ЬихЯ несет N - домен (162 аминокислотных остатка), являющийся мишенью для Ьоп-протеазы и определяющий контакт полипептида с шапероном ОгоЕЬ, необходимым для сборки нативной структуры ЬихЯ.

Показано впервые, что рефолдинг термоинактивированных бактериальных люцифераз происходит в клетке с участием шаперонов семейства Нзр70 (БпаКХЕ), НБрЮО (С1рА, С1рВ) и малых шаперонов бНбр (1ЬрАВ).

Сконструированы новые формы /ш;-биосенсоров, отличающиеся по основным параметрам (пороговая чувствительность и амплитуда ответа) от аналогов /ш;-биосенсоров, полученных зарубежными фирмами. С помощью данных биосенсоров впервые был исследован механизм токсического действия на клетку 1,1-диметилгидразина (компонент ракетного топлива) и наночастиц диоксида титана. Показано, что основная роль в токсическом действии этих агентов связана с образующимися активными формами кислорода (перекись водорода и супероксид-анион).

Практическая значимость исследования.

Практически значимым результатом работ по изучению люцифераз, различающихся по термостабильности, явилось создание высокочувствительных специфических /шобиосенсоров. Использование транскрипционных слияний стрессовых и других индуцируемых промоторов с генами бактериальных люцифераз в качестве репортерных позволило и создать набор биосенсоров, специфически реагирующих на различные токсиканты и другие биологически активные вещества. Данные биосенсоры в настоящее время применяются для работ по экологическому мониторингу, тестированию медицинских препаратов и для изучения механизмов воздействия на клетку различных токсикантов.

Полученные в работе данные о влиянии шаперонов и протеаз на активность белка ЬихЯ могут быть использованы для создания более чувствительных биосенсоров для детекции аутоиндукторов первого типа. А также бактериальные люциферазы в настоящее время используются в качестве модели для изучения механизмов рефолдинга денатурированных белков.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Манухов, Илья Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Впервые определена структура /¿¿х-оперона у психрофильных светящихся морских бактерий. В отличие от /ш;-оперонов мезофильных морских бактерий, содержащих в своём составе одну копию гена 1ихК, в 1их-оперонах психрофильных бактерий содержится две копии гена 1ихК, причём белки ЬихЮ и ЬихЯ2 различаются как по аминокслотной последовательности, так и по активности по отношению к регулируемому ими промотору.

2. Показано, что криптическая люминесценция патогенных морских бактерий АНтЪпо 8а1тотс1йа (бактерии люминесцируют лишь при добавлении в среду субстрата люциферазы длинноцепочечного альдегида) связана с дефектом в гене 1ихО, кодирующем одну из субъединиц редуктазы.

3. Показано, что АТФ-зависимая протеаза Ьоп участвует в негативной регуляции систем у морских бактерий. Доказано, что шаперонин ОгоЕЬ/ЕБ участвует в сборке нативной формы белка ЬихЯ.

4. Основную регуляторную функцию в белке ЬихЯ несет N - домен (162 аминокислотных остатка), являющийся мишенью для Ьоп-протеазы и определяющий контакт полипептида с шаперонином ОгоЕЬ, необходимым для сборки нативной структуры ЬихЯ.

6. Рефолдинг термоинактивированных бактериальных люцифераз происходит в клетке с участием шаперонов семейства Нзр70 (ЭпаЮЕ), ШрЮО (С1рА, С1рВ) и малых шаперонов БШр (ШрАВ).

7. Термостабильные люциферазы характеризуются сравнительно низким уровнем ЭпаЮЕ-зависимого рефолдинга в отличие от термочувствительных люцифераз, которые восстанавливают активность после термоинактивации практически до 100%.

8. Сконструирован ряд новых 1их-биосенсоров, превосходящих по основным параметрам (пороговая чувствительность и амплитуда ответа) аналогов 1их-биосенсоров, полученных зарубежными фирмами. С помощью данных биосенсоров впервые был исследован механизм токсического действия на клетку 1,1-диметилгидразина (компонент ракетного топлива) и наночастиц диоксида титана. Показано, что основная роль в токсическом действии этих агентов связана с образующимися активными формами кислорода (перекись водорода и супероксид-анион).

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Манухов, Илья Владимирович, Москва

1. Ahmer В.М., van Reeuwijk J., Timmers C.D., Valentine P.J., Heffron F. 1998. Salmonella typhimurium encodes an SdiA homolog, a putative quorum sensor of the LuxR family, that regulates genes on the virulence plasmid // J. Bacteriol. 180, 1185-1193.

2. Atkinson S., Throup J.P., Stewart G.S., Williams P. 1999. A hierarchical quorum-sensing system in Yersinia pseudotuberculosis is involved in the regulation of motility and clumping // Mol Microbiol 33, 1267-77.

3. Ast J.C., Urbanczyk H.U., Dunlap P.V. 2009. Multi-gene analysis reveals previously unrecognized phylogenetic diversity in Aliivibrio II Syst. Applied. Microbiol. 32, 379-386.

4. Bairoch A., Apweiler R. 2000.- The SWISS-PROT protein sequence database and its supplement TrEMBL 2000. // Nucleic Acids Res. 28, 45-48.

5. Baldwin Т.О., Christopher J.A., Raushel F.M., Sincjair J.F., Ziegler M.M., Fisher A.J., Rayment I. 1995. Structure of bacterial luciferase // Curr. Opin. Struct. Biol., 5, 798-809.

6. Bang S.S., Baumann P., Nealson K.H. 1978. Phenotypic characterization of Photobacterium logei (sp. nov.), a species related to P. fischeri II Curr. Microbiol. 1,285-288.

7. Bansal K., Yang K., Nistala G.J., Gennis R.B., Bhalerao K.D. 2010. A positive feedback-based gene circuit to increase the production of a membrane protein // J Biol Eng. May 25, 4:6.

8. Bauer W.D., Robinson J.B. 2002. Disruption of bacterial quorum sensing by other organisms // Curr Opin Biotechnol. 13, 234-7.

9. Ben-Zvi A.P., Goloubinoff P. 2001. Review: mechanism of disaggregation and refolding of stable protein aggregates by molecular chaperones. // J. Struct Biol. 135, 84-93.

10. Bertani I., Rampioni G., Leoni L., Venturi L. 2007. The Pseudomonas putida Lon protease is involved in N-acyl homoserine lactone quorum sensing regulation // BMC Microbiology. 7, 71-79.

11. Bukau B., Horwich A. 1. 1998. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. I/Cell. 92, 351-366.

12. Bowman J.B. Margesin. R., Schinner F., Marx J.C. And Gerday C. (eds) Genomic analysis of psichrophilic procaryotes. In: Psichrophiles, from Biodiversity to Biotechnologt. 2008. Berlin Heidelberg: Spinger-Verlag, 265284

13. Campbell J., Lin Q., Geske G.D., Blackwell H.E. 2009. New and unexpected insights into the modulation of LuxR-type quorum sensing by cyclic dipeptidesJ! ACS Chem Biol. 4, 1051-1059.

14. Casanueva A., Tuffin M., Cary C., Cowan D.A. 2010. Molecular adaptations to psychrophily: the impact of'omic' technologies // Trends Microbiol. 18, 374381

15. Cavicchioli R., Charlton T., Ertan H., Omar S.M., Siddiqui K.S., Williams T.J. 2011. Biotechnological uses of enzymes from psychrophiles // Microb Biotechnol. Jul, 4(4), 449-60.

16. Chai Y., Winans S.C. 2004. Site-directed mutagenesis of a LuxR-type quorum-sensing transcription factor: alteration of autoinducer specificity. // Mol Microbiol. 51, 765-76.

17. Chandu D., Nandi D. 2004. Comparative genomics and functional roles of the ATP-dependent proteases Lon and Clp during cytosolic protein degradation. II Res. Microbiol 155, 710-719

18. Chatterjee J., Meighen E.A. 1995. Biotechnical applications of bacterial bioluminescence (lux) genes // Photochem. Photobiol. 62, 641-650.

19. Cohn D.H., Ogden R.C., Abelson J.N., Baldwin T.O., Nealson K.H., Simon M.I., Mileham A.J. 1983. Cloning of the Vibrio harveyi luciferase genes: use of a synthetic oligonucleotide probe II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 120-123.

20. Colepicolo P, Cho KW, Poinar GO, Hastings JW. 1989. Growth and luminescence of the bacterium Xenorhabdus luminescens from a human wound. // Appl Environ Microbiol. 55(10):2601-6.

21. Cyr D.M., Langer T., Douglas M.G. 1994. DnaJ-like proteins molecular chaperones and specific regulators of Hsp70. I/Trends Biochem. Sci. 19, 176181.

22. Davies D.G., Parsek M.R., Pearson J.P., Iglewski B.H., Costerton J.W., Greenberg E.P. 1998T The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm // Science. 280, 295-298.

23. D'Amico S., Collins T., Marx J.C., Feller G., Gerday C. 2006. Psychrophilic microorganisms: challenges for life IIEMBO Rep. 7, 385-389.

24. Deming J.W. 2002. Psychrophiles and Polar Regions // Curr. Opin Microbiol. 5, 301-309.

25. Diamant S., Ben-Zvi A.P., Bukau B., Goloubinoff P. 2000. Size-dependent disaggregation of stable protein aggregates by the DnaK chaperone machinery. IIJ. Biol. Chem. 275, 21107-21113.

26. Dougan D.A., Reid B.G., Horwich A.L., Bukau B. 2002. ClpS, a substrate modulator of the ClpAP. machine. IIMol. Cell. 9, 673-683.

27. Dougan D.A., Mogk A., Bukau B. 2002. Protein folding and degradation in bacteria: to degrade or not to degrade? That is the question. // Cell. Mol Life Sci. 59, 1607-1616

28. Dunlap P.V., Greenberg E.P. 1988. Control of Vibrio fischeri lux gene transcription by a cyclic AMP receptor protein-/wx/? protein regulatory circuit // J. Bacteriol. 170, 4040-4046.

29. Eberhard A. 1972. Inhibition and activation of bacterial luciferase synthesis. // J. Bacteriol. 109,1101-1105.

30. Eberhard A., Burlingame A.L., Eberhard C., Kenyon G.L., Nealson K.H., Oppenheimer N.J. 1981. Structural identification of autoinducer of Photobacterium fischeri luciferase // Biochemistry. 20, 2444-2449.

31. Egidius E., Wiik R., • Andersen K,, Hoff K.A., Hjeltnes E. 1986. Vibrio salmonicida sp. nov., a new fish pathogen II Int. J. Syst. Bacteriol. 36, 518-520.

32. Enger O., Husevag B., Goksoyr J. 1989. Presence of the fish pathogen Vibrio salmonicida in fish farm sediments // Appl. Environ. Microbiol. 55, 2815-2818.

33. Egland K.A., Greenberg E.P. 1999. Quorum sensing in Vibrio fischeri: elements of the luxl promoter // Mol. Microbiol. 31,1197-1204.

34. Egland K.A., Greenberg E.P. 2000. Conversion of the Vibrio fischeri transcriptional activator, LuxR, to a repressor. // J. Bacteriol. 182, 805-811.

35. Enger O., Husevag B., Goksoyr J. 1991. Seasonal variation in presence of Vibrio salmonicida and. total bacterial counts in Norwegian fish-farm water // Can. J. Microbiol. 37, 618-623.

36. Engebrecht J., Nealson K., Silverman M. 1983. Bacterial bioluminescence: isolation and genetic analysis of functions from Vibrio fischeri II Cell. 32, 773781.

37. Fang L., Jiang W., Bae W., Inouye M. 1997. Promoter-independent cold-shock induction of cspA and its derepression at 37 degrees C by mRNA stabilization // Mol Microbiol. Jan; 23(2), 355-364.

38. Fayet O., Ziegelhoffer T., Georgopoulos C., 1989. The groES and groEL heat shock gene products of Escherichia coli are essential for bacterial growth at all temperatures. IIJ. Bacteriol. 171, 1379-1385.

39. Feller G., Gerday C. 2003. Microbiol. Psychrophilic enzymes: hot topics in cold adaptation II Nat.Rev. 1, 200-208.

40. Ferbitz L, Maier T, Patzelt H, Bukau B, Deuerling E, Ban N. Trigger factor in complex with the ribosome forms a molecular cradle for nascent proteins. Nature. 2004 Sep 30;431(7008):590-6.

41. Fidopiastis P.M., Sorum H., and Ruby E.G. 1999. Criptic luminescence in the cold-water fish pathogen Vibrio salmonicida II Arch. Microbiol. 171, 205209.

42. Fidopiastis P.M., von Boletzky S., Ruby E.G. 1998. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola II J. Bacteriol. 180,59-64.

43. Forst S, Dowds B, Boemare N, Stackebrandt E. 1997. Xenorhabdus and Photorhabdus spp.: bugs that kill bugs. // Annu Rev Microbiol.;51:47-72.

44. Forst S, Nealson K. 1996. Molecular biology of the symbiotic-pathogenic bacteria Xenorhabdus spp. and Photorhabdus spp.// Microbiol Rev. 60(1):21-43.

45. Frackman S, Anhalt M, Nealson KH. 1990. Cloning, organization, and expression of the bioluminescence genes of Xenorhabdus luminescens. // J Bacteriol 172(10):5767-73.

46. Fuqua W.C., Winans S.C. 1994. A LuxR-LuxI type regulatory system activates Agrobacterium Ti plasmid conjugal transfer in the presence of a plant tumor metabolite // J. Bacteriol. 176, 2796-2808.

47. Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E.P. 1994. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators // J. Bacteriol. 176,269-275.

48. Fuqua C., Winans S.C., Greenberg E.P. 1996. Census and consensus in bacterial ecosystems: the LuxR-LuxI family of quorum-sensing transcriptional regulators // Annu. Rev. Microbiol. 50, 727-751.

49. Fuqua W.C., Greenberg E.P. 1998. Self perception in bacteria: quorum sensing with acylated homoserine lactones // Curr. Opin. Microbiol. 1, 183189.

50. Fuqua C., Parsek M.R., Grenberg E.P. 2001. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing // Annu. Rev. Genet. 35, 439-468.

51. Gaitanaris GA, Vysokanov A, Hung SC, Gottesman ME, Gragerov A. Successive action of Escherichia coli chaperones in vivo. // Mol Microbiol. 1994 Dec;14(5):861-9.

52. Galluzzi L., Karp M. Whole cell strategies based on lux genes for high throughput applications toward new antimicrobials // Comb. Chem. High Throughput Screen. 2006. V. 9. P. 501-514.

53. Garcia-Lara J., Shang L.H., Rothfield L.I. 1996. An extracellular factor regulates expression of sdiA, a transcriptional activator of cell division genes in Escherichia coli II J. Bacteriol. 178, 2742-2748.

54. Gaudu P, Moon N, Weiss B. 1997. Regulation of the soxRS oxidative stress regulon. Reversible oxidation of the Fe-S centers of SoxR in vivo. // J Biol Chem. 272(8):5082-6.

55. Georgopoulos C.P., Hendrix R.W., Casjens S.R., Kaiser A.D. 1973. Host participation in bacteriophage lambda head assembly. // J. Mol. Biol. 76, 43-60.

56. Givskov M., de Nys R., Manefield M., Gram L., Maximilien R., Eberl L., Molin S., Steinberg P.D., Kjelleberg S. 1996. Eukaryotic interference with homoserine lactone-mediated prokaryotic signalling // J Bacteriol. 178, 661822.

57. Glessner A., Smith E.S., Iglewski B.H., Robinson J.P. 1999. Roles of Pseudomonas aeruginosa las and rhl quorum-sensing systems in control of twitching motility // J. Bacteriol. 181, 1623-1629.

58. Goloubinoff P., Mogk A., Ben-Zvi A.P., Tomoyasu T., Bukau B. 1999. Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. UProc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 1373213737.

59. Gottesman S., Roche E., Zhou Y., Sauer R.T. 1998. The ClpXP and ClpAP proteases degrade proteins with carboxy-terminal peptide tails added by the SsrA-tagging system. // Gen. Dev. 12, 1338-1347

60. Gottesman S. 1999. Regulation by proteolysis: developmental switches. // Curr. Opin Microbiol. 2, 142-147.

61. Gragerov AI, Martin ES, Krupenko MA, Kashlev MV, Nikiforov VG. Protein aggregation and inclusion body formation in Escherichia coli rpoH mutant defective in heat shock protein induction. // FEBS Lett. 1991 Oct 21;291(2):222-4.

62. Gragerov A, Nudler E, Komissarova N, Gaitanaris GA, Gottesman ME, Nikiforov V. Cooperation of GroEL/GroES and DnaK/DnaJ heat shock proteins in preventing protein misfolding in Escherichia coli. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Nov 1;89(21): 10341-4.

63. Gu M.B., Mitchell R.J., Kim B.C. Whole cell-based biosensors for environmental biomonitoring and application // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004. V. 87. P. 268-305.

64. Hankins J.S., Denroche H., Mackie G.A. 2010. Interactions of the RNA-binding protein Hfq with cspA mRNA, encoding the major cold shock protein // J. Bacteriol. 192(10), 2482-90.

65. Han M-J., Yoon S.S., Lee S.Y. 2001. Proteomic analysis of metabolically engineered Escherichia coli producing poly (3-hydroxybutyrate). // J. Bacteriol. 183,301-308.

66. Hartl F.U. 1996. Molecular chaperones in cellular protein folding. //Nature. 381,571-570.

67. Harwood C. S., Bang S.S., Baumann P., and Nealson K.H. 1980. Photobacterium logei sp. nov., nom. rev., Beneckea nereida sp. nov., nom. rev. and Beneckea gasogenes sp. nov., nom. rev. // Int. J. Syst. Bacteriol. 30, 655.

68. Holden M.T., Swift S., Williams P. 2000. New signal molecules on the quorum-sensing block // Trends Microbiol 8, 101-103.

69. Horwich A.L., Apetri A.C., Fenton W.A. 2009 The GroEL/GroES eis cavity as a passive anti-aggregation device. // FEBSLett. 583, 2654-2662.

70. Hoskins J.R., Pak M., Maurizi M.R., Wickner S. 1998. The role of the ClpA chaperone in proteolysis by ClpAP. UProc. Natl. Acad. Sei. USA. 95, 1213512140.

71. Hoskins J.R., Singh S.K., Maurizi M.R., Wickner S. 2000. Protein binding and unfolding by the chaperone ClpA and degradation by the protease ClpAP. UProc. Natl Acad. Sei. USA. 97, 8892-8897

72. Hoskins J.R., Yanagihara K., Mizuuchi K., Wickner S. 2002. ClpAP and ClpXP degrade proteins with tags located in the interior of the primary sequence. UProc. Natl. Acad. Sei. USA. 99, 11037-11042.

73. Ishikawa T., Maurizi M.R., Steven A.C. 2004. The N-terminal substrate-binding domain of ClpA unfoldase is highly mobile and extends axially from the distal surface of ClpAP protease. UJ. Struct. Biol. 146, 180-188.

74. Jenal U., Hengge-Aronis R. 2003. Regulation by proteolysis in bacterial cells. // Curr. Opin. Microbiol. 6, 163-172.

75. Jiang W., Hou Y., Inouye M. 1997. CspA, the major cold-shock protein of Escherichia coli, is an RNA chaperone // J Biol Chem. 3, 272(1), 196-202.

76. Jones B.W., Maruyama A., Ouverney C.C., Nishiguchi M.K. 2007. Spatial and temporal distribution of the Vibrionaceae in coastal waters of Hawaii, Australia, and France // Microb ecol. 54(2), 314-23.

77. Jung Y.H., Yi J.Y., Jung HJ., Lee H.K., Naicker M.C., Uh J.H, Jo I.S., Jung E.J., Im H. 2010. Overexpression of cold shock protein A of Psychromonas arctica KOPRI 22215 confers cold-resistance // Protein J. 29(2), 136-42.

78. Kang P.-J., Craig E.A. 1990. Identification and characterization of a new Escherichia coli gene that is a dosage-dependent suppressor of a dnaK deletion mutation. II J. Bacteriol. 172. 2055-2064.

79. Kiratisin P., Tucker K.D., Passador L. 2002. LasR, a transcriptional activator of Pseudomonas aeruginosa virulence genes, functions as a multimer. // J Bacteriol. 184,4912-9.

80. Koch B., Liljefors T., Persson T., Nielsen J., Kjelleberg S., Givskov M. 2005. The LuxR receptor: the sites of interaction with quorum-sensing signals and inhibitors // Microbiology. 151,3 589-602.

81. Kuts V.V. and Ismailov A.D. 2009. Physiological and Emission Characteristics of the Luminescent Bacterium Photobacterium phosphoreum from the White See II Microbiology, 78, №5, 554-558.

82. Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227:680-685.

83. Langer T., Pfeifer G., Martin J., Baumeister W., Hartl F.-U. 1992. Chaperonin-mediated protein folding GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. IIEMBOJ. 11,4757-4765.

84. Laskowska E., Wawzynow A., Taylor A. 1996. IbpA and IbpB, the new heat-shock proteins, bind to endogenous Escherichia coli proteins aggregated intracellularly by heat shock. HBiochimie. 78, 117-122.

85. Leontieva 0,V., Dementieva E.I., and Ugarova NN (1999). in: Bioluminescence and Chemiluminescence: Perspectives for 21st Century (Roda A., Pazzagli M., Kricka L.G., and Stanley P.E., eds.). John Wiley & Soon., Chichester, pp. 420-424

86. Lesley S.A., Graziano J., Cho C.Y., Knuth M.W., Klock H. E. Gene expression response to misfolded protein as a screen for soluble recombinant protein// Protein Engineering. 2002. - V. 15.-P. 153-160.

87. Lu C., Albano C.R., Bentley W.E., Rao G. Quantitative and kinetic study of oxidative stress regulons using green fluorescent protein // Biotechnol. Bioengineering. 2005. - V. 89. - P. 574-587.

88. Luo Z.Q., Su S., Farrand S.K. 2003. In situ activation of the quorum-sensing transcription factor TraR by cognate and noncognate acyl-homoserine lactone ligands: kinetics and consequences. // JBacteriol. 185, 5665-72.

89. Lutz R., Bujard H. 1997. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/Ii-l2 regulatory elements. // Nucleic Acids Research. 25, 1203-1210.

90. Makovets S., Titheradge A.J., Murray N.E. 1998. ClpX and ClpP are essential for the efficient acquisition of genes specifying type IA and IB restriction systems. // Mol. Microbiol. 28, 25-35

91. Mandel M., Higa A, 1970. Calcium dependent bacteriophage DNA infection. // J.Mol.Biol. 53, 154-162.

92. Manefield M., Rasmussen T.B., Henzter M., Andersen J.B., Steinberg P., Kjelleberg S., Givskov M. 2002. Halogenated furanones inhibit quorum sensing through accelerated LuxR turnover // Microbiology. 148, 1119-27.

93. Maniatis T., Fritsch F., Sambrook J. 1989. Molecular cloning: A laboratory Manual // Cold Spring Harbor. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press.

94. Manukhov I.V., Eroshnikov G.E., Vyssokikh M.Y., Zavilgelsky G.B. 1999. Folding and refolding of thermolabile and thermostable bacterial luciferases: the role of DnaKJ heatOshock proteins. HFEBS Lett. 448, 265-268.

95. Marketon M.M., Gronquist M.R., Eberhard A., Gonzales J.E. 2002. Characterization of the Sinorhizobium meliloti sinR/sinl locus and the production of novel N-acyl homoserine lactone II J. Bacteriol. 184, 5686-5695.

96. Martinez-Hackert E, Hendrickson WA. Promiscuous substrate recognition in folding and assembly activities of the trigger factor chaperone. Cell. 2009 Sep 4;138(5):923-34.

97. Mayer M.P., Bukau B. 1998. Hsp70 chaperone systems: diversity of cellular functions and mechanism of action. 11 Biol. Chem. 379, 261-268.

98. McKnight S.L., Iglewski B.H., Pesci E.C. 2000. The Pseudomonas quinolone signal regulates rhl quorum sensing' in Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. 182, 2702-2708.

99. Meighen E.A: 1991. Molecular biology of bacterial bioluminescence // Microbiol. Rev. 55, 123-142.

100. Meighen EA. 1994. Genetics of bacterial bioluminescence. // Annu Rev Genet. 28:117-39. Review.

101. Miller S.T., Xavier K.B., Campagna S.R., Taga M.E., Semmelhack M.F., Bassler B.L., Hughson F.M. 2004. Salmonella typhimurium recognizes a chemically distinct form of the bacterial quorum-sensing signal AI-2. // Mol. Cell. 15, 677-687.

102. Minogue T.D., Wehland-von Trebra M., Bernhard F., von Bodman S.B. 2002. The autoregulatory role of EsaR, a quorum-sensing regulator in Pantoeastewartii ssp. stewartii: evidence for a repressor function // Mol Microbiol. 44, 1625-1635.

103. Mogk A., Deuerling E., Vorderwwulbecke S., Vierling E., Bukau B. 2003. Small heat shock proteins, ClpB and the DnaK system form a functional trade in reversing protein aggregation. IIMolecular Microbiol. 50, 585-595.

104. Mogk A., Schlieker C., Friedrich K. L., Schonfeld H-J., Vierling E., Bukau B. 2003. Refolding of substrates bound to small Hsps relies on a disaggregation reaction mediated most efficiently by ClpB/DnaK. IIJ.Biol.Chem. 278, 3103331042.

105. Mogk A., Tomoyasa T., Goloubinoff P., Rudiger S., Roder D., Langen H., Bukau B. 1999. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. HEMBO J. 18, 6934-6949.

106. Nealson KH, Hastings JW. Bacterial bioluminescence: its control and ecological significance. //Microbiol Rev. 1979 Dec;43(4):496-518

107. Nealson K.H., Hastings J.W. 2006. Quorum sensing on a global scale: massive numbers of bioluminescent bacteria make milky seas // Appl Environ Microbiol. 72(4), 2295-2297.

108. Nealson K.H., Piatt T., Hastings J.W. 1970. Cellular control of the synthesis and activity of the bacterial luminescent system II J. Bacteriol. 104, 313-322.

109. Nelson E.J., Tunsjo H.S., Fidopiastis P.M., Sorum H., Ruby E.G. 2007. A novel lux operon in the cryptically bioluminescent fish pathogen Vibrio salmonicida is associated with virulence // Appl. Environ. Microbiol. 73, 18251833.

110. Ninoshiba T., Nishioka H. Rec-lex test for detecting SOS-inducing activity of environmental genotoxic substances // Mutation Research. 1991. V. 254. P. 71-77.

111. Nicolaus B., Kambourova M., Oner E.T. 2010. Exopolysaccharides from extremophiles: from fundamentals to biotechnology // Environ Technol. 31(10), 1145-1158.

112. Ortega J., Lee H.S., Maurizi M.R., Steven A.C. 2004. ClpA and ClpX ATPases bind simultaneously to opposite ends of ClpP peptidase to form active hybrid complexes. 11 J. Struct. Biol. 146, 217-226.

113. Parry B.R. and Shain D. 2011. Manipulations of AMP metabolic genes increase growth rate and cold tolerance in Escherichia coli: implications for psychrophilic evolution // Mol. Biol. Evol. 28, 2139-2145.

114. Parsek M.R., Greenberg E.P. 2000. Acyl-homoserine lactone quorum sensing in gram negative bacteria: a signaling mechanism involved in associations with higher organisms // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 8789-8791.

115. Patterson S.D., Aebersold R 1995. Mass-spectrometric approaches for the identification of gel-separated proteins. II Electrophoresis. 16, 1791—1814.

116. Pearson J.P., Gray K.M., Passador L., Tucker K.D., Eberhard A., Iglewski B.H., Greenberg E.P. 1994. Structure of the autoinducer required for expression of Pseudomonas aeruginosa virulence genes // Proc. Natl. Ac. Sci USA. 91, 197-200.

117. Pearson J.P., Passador L., Iglewski B.H., Greenberg E.P. 1995. A second N-acylhomoserine lactone signal produced by Pseudomonas aeruginosa II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92; 1490-1494.

118. Pesci E.C., Iglewski B.H. 1997. The chain of command in Pseudomonas quorum sensing // Trends Microbiol. 5, 132-135.

119. Pesci E.C., Milbank J.B., Pearson J.P., McKnight S., Kende A.S., Greenberg E.P., Iglewski B.H. 1999. Quinolone signaling in the cell-to-cell communication system of Pseudomonas aeruginosa II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 11229-11234.

120. Phadtare S. 2004. Recent developments in bacterial cold-shock response // Curr. Issues Mol. Biol. 6, 125-136.

121. Phadtare S., Inouye M. 2004. Genome-wide transcriptional analysis of the cold shock response in wild-type and cold-sensitive, quadruple-csp-deletion strains of Escherichia coli IIJBacteriol. 186(20), 7007-7014.

122. Piette F., Struvay C., Feller G. The protein folding challenge in psychrophiles: facts and,current issues. // Environ. Microbiol. 2011. V. 13, P. 1924-1933.

123. Prakash S., Matouschek A. 2004. Protein unfolding in the cell. I ¡Trends in Biochem. Sci. 29, 593-600.

124. Qin N., Callahan S.M., Dunlap P.V., Stevens A.M. 2007. Analysis of LuxR regulon gene expression during "Quorum Sensing in Vibrio fischeri II J. Bacteriol. 189,4127-2134

125. Raviol H, Sadish H, Rodriguez F, Mayer MP, Bukau B. 2006. Chaperone network in the yeast cytosol:. HspllO is revealed as an Hsp70 nucleotide exchange factor. IIEMBOJ. 25, 2510-2518.

126. Relina L.I., Gulevsky A.K. 2003. A possible role of molecular chaperones in cold adaptation // Cryo Letters. 24(4), 203-212.

127. Robin S., Togashi D.M., Ryder A.G., Wall J.G. 2009. Trigger factor from the psychrophilic bacterium Psychrobacter frigidicola is a monomeric chaperone // J. Bacteriol. 191, 1162-1168. .!

128. Ruby E.C., McFall-Ngai M.J. 1992. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism //J. Bacteriol. 174, 4865-4870.

129. Saitou N. & Nei M. 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol Biol Evol 4, 406-425.

130. Sambrook J., Fritsch F., and Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed // Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor.

131. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 74, 5463-5468.

132. Schaffitzel E, Rüdiger S, Bukau B, Deuerling E. Functional dissection of trigger factor and DnaK: interactions with nascent polypeptides and thermally denatured proteins. Biol Chem. 2001 Aug;382(8): 1235-43

133. Schuster M., Lostroh C.P., Ogi T., Greenberg E.P. 2003. Identification, timing, and signal specificity of Pseudomonas aeruginosa quorum-controlled genes: a transcriptome analysis II J. Bacteriol. 185, 2066-2079.

134. Shah I.M, Wolf R.E. 2006. Inhibition of Lon-dependent degradation of the Escerichia coli transcription activator SoxS by interaction with 'soxbox' DNA or RNA polymirase. II Molecular. Microbiology. 60, 199-208.

135. Siddiqui K.S., Cavicchioli R. 2006. Cold-adapted enzymes // Annu. Rev. Biochem. 75, 403-433.

136. Singh S.K., Grimaud R., Hoskins J.R., Wickner S., Maurizi M.R. 2000. Unfolding and internalization of proteins by the ATP-dependent proteases ClpXP and ClpAP. // PNAS USA. 97, 8898-8903.

137. Sitnikov D.M., Schineller J.B., Baldwin T.O. 1996. Control of cell division in Escherichia coli: regulation of transcription of ftsQA involves both rpoS and SdiA-mediated autoinduction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 336-341.

138. Smith R.S., Iglewski B.H. 2003. P. aeruginosa quorum-sensing systems and virulence // Curr Opin Microbiol. 6, 56-60.

139. Smith R.S., Guyomarc'h S., Mandel T., Reinhardt D., Kuhlemeier C., Prusinkiewicz P. 2006. A plausible model of phyllotaxis. // Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1301-6.

140. Starkova NN, Koroleva EP, Rumsh LD, Ginodman LM, Rotanova TV. 1998. Mutations in the proteolytic domain of Escherichia coli protease Lon impair the ATPase activity of the enzyme. // FEBS Lett. 422(2):218-20.

141. Stewart G.S. 1997. Challenging food microbiology from a molecular perspective II Microbiology. 143, 2099-2108.

142. Storz G., Imlay J.A. 1999. Oxidative stress II Curr. Opin. Microbiol. V. 2. P. 188-194.

143. Szittner R, Meighen E. 1990. Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium. // J Biol Chem. Sep 25;265(27):16581-7.

144. Tamura K., Dudley J., Nei M. & Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. // Mol Biol Evol 24, 1596-1599.

145. Tatsuta T., Joo D.M., Calendar R., Akiyama Y., Ogura T. 2000. Evidence for an active role of the DnaK chaperone system in the degradation of a .11 FEBS Lett. 478, 271-275.

146. Tchurikov N.A., Chistyakova L.G., Manukhov I.V., Zavilgelsky G.B., Chernov B.K., Golova Yu.B. 2000. Gene-specific silencing by expression of parallel complementary RNA in Escherichia coli II J. Biol. Chem. V.275. '34. P.26523-26529. 5

147. Tomoyasu T., Mogk A., Langen H., Goloubinoff P., Bukau B. 2001. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in Escherichia coli cytosol. II Molecular. Microbiol. 40, 397-413.

148. Tosco A., Birolo L., Madonna S., Lolli G., Sannia G., Marino G. 2003. GroEL from the psychrophilic bacterium Pseudoalteromonas haloplanktis TAC 125: molecular characterization and gene cloning // Extremophiles. 7(1), 17-28.

149. Tu S.-C., Mager H.L. 1995. Biochemistry of bacterial bioluminescence // Photochem. Photobiol. 62, 615-624.

150. Uh J.H., Jung Y.H., Lee Y.K., Lee H.K., Im H. 2010. Rescue of a cold-sensitive mutant at low temperatures by cold shock proteins from Polaribacter irgensii KOPRI 22228 II J. Microbiol. 48(6), 798-802.

151. Ulitzur S., Dunlop P. 1995. Regulatory circuitry controlling luminescence autoinduction in Vibrio fischeri II Photochem. Photobiol. 62, 625-632.

152. Ulitzur S., Matin A., Fraley C., Meighen E.A. 1997. H-NS protein represses transcription of the lux systems of Vibrio fischeri and other luminous bacteria cloned into Escherichia coli. // Curr. Microbiol. 35, 336-342.

153. Ulitzur S. 1999 //Microbial Ecology and Infectious Disease / Ed. Rosenberg E. Washington: American Society for Microbiology, P. 123-132.

154. Ulitzur S. 1998. H-NS controls the transcription of three promoters of Vibrio fischeri lux cloned in Escherichia coli II J. Biolumin. Chemilumin. 13, 185-188.

155. Ullers RS, Houben EN, Brunner J, Oudega B, Harms N, Luirink J. Sequence-specific interactions of nascent Escherichia coli polypeptides with trigger factor and signal recognition particle. J Biol Chem. 2006 May 19;281(20): 139994005.

156. Ullers RS, Luirink J, Harms N, Schwager F, Georgopoulos C, Genevaux P. SecB is a bona fide generalized chaperone in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA. 2004 May 18;101(20):7583-8

157. Urbanczyk H., Ast J.C., Kaeding A.J., Oliver J.D. and Dunlap P.V. 2008. Phylogenetic Analysis of the Incidence of lux Gene Horizontal Transfer in Vibrionaceae // Journal of Bacteriology, 3494-3504.

158. Van Dyk T. K., Majarian W.R., Konstantinov K.B., Young R.M., Dhurjati P.D., LaRossa E.A. Rapid and sensitive pollutant detection by induction of heat-shock gene bioluminescence gene fusion // Appl. Environ. Microbiol. -1994.-V. 60.-P. 1414-1420.

159. Van Dyk T. and Rosson R.A. R.A. LaRossa. 1998. Photorhabdus luminescens luxCDABE promoter probe vectors // Methods in Molecular Biology, 102, 85-95.

160. Vannini A., Volpari C., Gargioli C., Muraglia E., Cortese R., De Francesco R., Neddermann P., Marco S.D. 2002. The crystal structure of the quorum sensing protein TraR bound to its autoinducer and target DNA. // EMBO J. 2; 21,4393-401.

161. Vollmer A.C., Belkin S., Smulski D.R., Van Dyk T.K., LaRossa R.A. Detection of DNA damage by use of Escherichia coli carrying recA'::lux, uvrA'::lux, or alkA'::lux reporter plasmids // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 2566-2571. •

162. Wagner V.E., Bushnell D., Passador L., Brooks A.I., Iglewski B.H. 2003. Microarray analysis of Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing regulons: effects of growth phase and environment // JBacteriol. 185, 2080-2095.

163. Weber-Ban E.-U., Reid B.G., Miranker A.D., Horwich A.L. 1999. Global unfolding of substrate protein by the HsplOO chaperone ClpA. //Nature. 401, 90-93.

164. Weichart D., Querfurth N., Dreger M., Hengge-Aronis R. 2003. Global role for ClpP-containing proteases in stationary-phase adaptation of Escherichia coli. II J. Bacteriol. 185, 115-125.

165. Weissman J.S., Hohl C., Kovalenko O., Kashi Y., Chen S., Braig K., Saibil H.R., Fenton W.A., Horwich A.L. 1995. Mechanism of GroEL action: productive release of polypeptide from a sequestered position under GroES. 11 Cell 83, 577-587.

166. Whitehead N.A., Barnard A.M., Slater H., Simpson N.J., Salmond G.P.et al., 2001. Quorrum-sensing in Gram-negative bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 25, 365-404.

167. Whiteley M., Lee K.M., Greenberg E.P. 1999. Identification of genes controlled by quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 13904-13909.

168. Wickner S., Gottesman S., Skowyra D., Hoskins J., McKenney K., Maurizi M.R. 1994. A molecular chaperone, ClpA, functions like DnaK and DnaJ. 11 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 12218-12222.

169. Xia B., Ke H., Inouye M. 2001. Acquirement of cold sensitivity by quadruple deletion of the cspA family and its suppression by PNPase SI domain in Escherichia coli II Mol Microbiol 40, 179-188.

170. Xi L, Cho KW, Tu SC. 1991. Cloning and nucleotide sequences of lux genes and characterization of luciferase of Xenorhabdus luminescens from a human wound. // J Bacteriol. Feb; 173(4): 1399-405.

171. Yang Q., Han Y., Zhang X.H. 2011. Detection of quorum sensing signal molecules in the family Vibrionaceae II JAppl Microbiol. 110(6), 1438-1448.

172. Yoshimune K., Galkin A., Kulakova L., Yoshimura T., Esaki N. 2005. Cold-active DnaK of an Antarctic psychrotroph Shewanella sp. Ac 10 supporting the growth of dnaK-null mutant of Escherichia coli at cold temperatures // Extremophiles. 9(2), 145-150.

173. Zarubina A.P., Yudina T.P., Danilov V.S., Spiridonov S.F. 1996. // Russ. J. Nematodol. V. 4. P. 103.

174. Zheng M., Wang X., Templeton L. J., Smulski D.R., LaRossaR.A., Storz G. DNA microarray -mediated transcriptional profiling of Escherichia coli response to hydrogen peroxide// J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 4562-4570.

175. Zhu J., Beaber J.W., Moré M.I., Fuqua C., Eberhard A., Winans S.C. 1998. Analogs of the autoinducer 3-oxooctanoyl-homoserine lactone strongly inhibit activity of the TraR protein of Agrobacterium tumefaciens II J Bacteriol. 180, 5398-5405.

176. Zhu J., Winans S.C. 1999. Autoinducer binding by the quorum-sensing regulator TraR increases affinity for target promoters in vitro and decreases TraR turnover rates in whole cells. // Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4832-7.

177. Zhu J., Winans S. C. 2001. The quorum-sensing transcriptional regulator TraR requires its cognate signaling ligand for protein folding, protease resistance, and dimerixation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 1507-1512.

178. Zhu X, Zhao X, Burkholder WF, Gragerov A, Ogata CM, Gottesman ME, Hendrickson WA. Structural analysis of substrate binding by the molecular chaperone DnaK. // Science. 1996 Jun 14;272(5268):1606-14.

179. Манухов И.В., Дужий Д.Е., Завильгельский Г.Б. 1996. Клонирование генов lux А и lux В Vibrio harveyi и экспрессия биолюминесценции в клетках Escherichia coli и Bacillus subtilis. II Биотехнология (Biotekhnologia). N 1. С. 1-6.

180. Манухов И.В., Завильгельский Г.Б., Данилов B.C., Ерошников Т.Е., Зарубина А.П. 1999. Клонирование /шАВ генов термостабильной люциферазы Photorhabdus luminescens ZM1 в Escherichia coli К12. // Биотехнология. № 1. С. 40-43.

181. Методы общей бактериологии: Пер. с англ./Под ред. Ф. Герхардта и др. — М.: Мир, 1983. — 536 с.

182. Миллер Дж. 1979. Эксперименты в молекулярной генетике. Мир.

183. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. 1994. Ьоп-протеаза участвует в регуляции транскрипции /ш:-оперона Vibrio fischeri II Генетика 30, 337341.

184. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. 1997. Роль Ьа-протеазы в негативном контроле экспрессии luxCDABE генов Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli II Молекуляр. биологи. 31, 945-949.

185. Примакова Г.А., Воробьева Т.И., Медведева С.Е., Фиш А.М. 1981. Особенности морфологии и ультраструктуры психрофильных светящихся бактерий // Микробиология 50, 487-493.

186. Расторгуев С.М., Летучая Т.А. Холодий Г.Я., Миндлин С.З., Никифоров В.Г. Завильгельский Г.Б. Антирестрикционная активность металлорегуляторных белков ArsR и MerR. Молекулярная биология. 1999. 33(2):203-6

187. Хмель И.А., Метлицкая А.З. 2006. Quorum sensing регуляция экспрессии генов перспективная модель для создания лекарств против патогенных бактерий // Молекуляр. биология. 40, 195 - 211.

188. Чернова Т.А., Завильгельский Г.Б., 1991. Клонирование генов lux-регулона Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli. II Биотехнология. №3 стр 17-19.

189. В заключении хотелось бы выразить большую сердечную благодарность своему Учителю Геннадию Борисовичу Завильгельскому, без которого эта работа была бы невозможной.

Информация о работе

Манухов, Илья Владимирович
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.07

Диссертация

Структура lux-оперонов и механизмы регуляции типа "Quorum Sensing" у морских бактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы