Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Психрофильные морские светящиеся бактерии Aliivibrio logei: структура lux-оперона и регуляция типа "Quorum sensing"

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Психрофильные морские светящиеся бактерии Aliivibrio logei: структура lux-оперона и регуляция типа "Quorum sensing""

005001590

На правах.рукописи

V?

Yy

ХРУЛЬНОВА СВЕТЛАНА АЛЕКСЕЕВНА

Психрофильные морские светящиеся бактерии Aliivibrio logei: структура /tix-оперона и регуляция типа «Quorum sensing»

03.02.07-Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О НОЯ 2011

Москва-2011

005001590

Работа выполнена в лаборатории генетики бактерий ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИгенетика»),

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Манухов Илья Владимирович

ФГУП «ГосНИИгенетика»

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Хмель Инесса Александровна

Институт молекулярной генетики РАН

доктор биологических наук, профессор Миронов Александр Сергеевич

ФГУП «ГосНИИгенетика»

Ведущая организация:

Учреждение РАН Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Защита состоится <<^о> ¿АЛ 2011 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г.Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика». Автореферат разослан октября 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук

Т.Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В настоящее время представляет интерес исследование обширного семейства психрофильных бактерий. Оптимальная температура роста для психрофильных бактерий 10-15°С. Психрофилыше бактерии способны расти при 4°С, но не растут при температуре выше 30°С, в отличие от мезофильных бактерий, которые не растут при 4°С и растут при 30°С и выше. Среда обитания психрофильных бактерий, как правило, холодные воды морей Арктики и Антарктики.

В настоящей работе в качестве психрофильных бактерий используются морские светящиеся бактерии вида Aliivibrio logei. Бактерии данного вида были нами изолированы в акваториях Белого, Охотского и Берингова морей.

Психрофильпые бактерии вида A. logei уникальны, так как помимо основных свойств, характерных для психрофилов, они содержат в своем геноме гены /г/х-оперона, определяющие способность бактерий люмннесцировать. Предполагается, что регуляция экспрессии te-генов определяется системой типа "Quorum Sensing"(QS), являющейся основной регуляторной системой для многих мезофильных бактерий, в том числе патогенных для человека, животных и растений.

QS- система регуляции, определяет экспрессию группы генов в ответ на увеличение плотности популяции клеток. Различные виды бактерий используют QS для скоординированного ответа, согласованного с плотностью их популяции. Системы регуляции генов типа QS играют ключевую роль во взаимодействии бактерий с высшими организмами, животными и растениями, как при патогенезе, так и при симбиозе. Впервые феномен регуляции генов по типу QS был обнаружен в 1970-е годы у морских бактерий Aliivibrio (ранее Vibrio) fischeri для группы /га-генов, ответственных за биолюминесценцию клеток (Nealson & Hastings, 1979). Однако термин QS был впервые введен в обиход значительно позже, в 1994 г (Fuqua W.C., et al 1994).

¿tuc-оперон морских бактерий A.fischeri является базовым в исследованиях QS систем, а по обозначению белка LuxR, активатора транскрипции генов /га-оперона, было определено семейство LuxR-гомологичных белков - регуляторов QS систем первого типа. В настоящее время остаются открытыми ряд вопросов: 1) об эволюционном происхождении феномена биолюминесценции бактерий; 2) о механизмах стабилизирующего отбора /ых-оперонов у свободноживущих видов бактерий. Продолжаются поиски новых вариантов QS систем у бактерий, а также исследования факторов, модулирующих QS ответ бактерий в зависимости от состояния клетки.

В настоящей работе проведено исследование регуляции экспрессии /га-генов у изолированных штаммов А. logei. Впервые показано, что экспрессия /га-тенов у этих бактерий осуществляется системой QS.

Кодируемые генами бактериальных /ux-оперонов люциферазы в настоящее время широко используются в работах по молекулярной генетике (гены - репортеры), при биохимических анализах, в генно-инженерных работах (селекция) и ряде других. Большое распространение приобрели работы по экологическому мониторингу, тестированию токсических веществ в окружающей среде и в пищевых продуктах, а также разработке и тестированию новых медицинских препаратов с помощью цельноклеточных биосенсоров, которые основаны на транскрипционных слияниях генов бактериальных люцифераз с индуцируемыми стрессовыми промоторами.

Цель и задачи исследований.

Целью данной работы являлось изучение структуры /их-оперопа и механизмов регуляции экспрессии генов /ta-оперонов морских люминесцирующих психрофильных бактерий А. logei.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

■ Изолировать штаммы психрофильных люминесцирующих бактерий,

■ Определить видовую принадлежность изолированных штаммов.

■ Клонировать и секвенировать /их-опероны бактерий.

■ Провести сравнение механизмов регуляции экспрессии /цх-оперонов

психрофильных и мезофильных бактерий рода Aliivibrio.

■ Проверить влияние генов «холодового шока» на экспрессию /мх-генов А. logei в

клетках Е. coli

Научная новизна работы.

Анализ видовой принадлежности люминесцирующих штаммов бактерий изолированных в акваториях северных морей, показал широкое распространение морских психрофильных бактерий вида А. logei в акватории северных морей (Белое, Охотское, Берингово моря).

Впервые определена структура /их-оперона у психрофильных светящихся морских бактерий А. logei. В отличие от /их-оперонов мезофильных морских бактерий, содержащих в своём составе одну копию гена luxR, в /их-оперонах психрофильных бактерий содержится две копии гена luxR, причём белки LuxRl и LuxR2 различаются как

по аминокислотной последовательности, так и по активности по отношению к регулируемому ими промотору.

Доказано, что криптическая люминесценция патогенных для лососевых рыб морских бактерий Aliixibrio salmonicida (бактерии люминссцируют лишь при добавлении в среду субстрата люинферазы длинноцепочечного альдегида) связана с дефектом в гене luxD, кодирующем одну из субъединиц редуктазы.

Показано, что для эффективной экспрессии luxCD генов А. logei в клетках Е. coli необходим ген «холодового шока» cspA, отвечающий за синтез РНК-шаперопа.

Практическая значимость исследования.

Практически значимым результатом работ по изучению люцифераз, различающихся по термостабильности, явилось создание высокочувствительных lux-биосенсоров для определения интегральной токсичности. В работе впервые было проведено сравнение различающихся по термостабильности люцифераз из /¡¿х-оперонов морских светящихся бактерий Photobacterium leiognallü, А. logei KChl и наземных энтомопатогенных бактерий Photorhabdus luminescens ZM1 с точки зрения возможностей определения общей (интегральной) токсичности.

Использование транскрипционных слияний индуцируемых промоторов (чувствительных к аутоиндукторам (АИ) первого типа) психрофильных бактерий, с генами термостабильных бактериальных люцифераз, в качестве репортерных, позволило создать высокочувствительные, специфически реагирующие на АИ первого типа биосенсоры. Данные биосенсоры в настоящее время применяются для работ по экологическому мониторингу, определению интегральной токсичности наноматериалов. Разрабатываются методики диагностики инфекций, обладающих системами регуляции типа QS в биологических образцах, и в образцах, собранных с потенциально-инфекционных поверхностей, в частности, с медицинского оборудования, посуды и других потенциальных распространителях внутрибольничных инфекций.

Структура работы.

Диссертация изложена на листах машинописного текста, включая рисунков \\£ таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка используемой литературы. Список литературы включает VZO работ отечественных и зарубежных авторов.

Апробация работы.

Материалы исследования по теме диссертации докладывались на Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» в 2008 г, на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров в 2009 г, на XVII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2010» в 2010г, на 16-м Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции в 20 Юг, Лион, Франция.

Диссертационная работа была апробирована на семинаре секции «Генетика микроорганизмов» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 06 октября 2011 г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано четыре печатные работы в ведущих рецензируемых журналах, определенных ВАК.

Содержание работы

1. Идентификация нсихрофильных морских светящихся бактерий, изолированных в акваториях Белого, Охотского и Берингова морей.

В ходе данной работы были изолированы штаммы морских психрофильных светящихся бактерий: два штамма (BMI, ВМ2) в акватории Белого моря в районе Ругозерской губы, один штамм (KChl) в акватории Охотского моря (западное побережье Камчатки) и один штамм (KCh2) в акватории Берингова моря в районе оз. Калагирь (восточное побережье Камчатки). Для идентификации данных штаммов до вида проводили биохимическое тестирование и секвенироваиие вариабельного участка гена 16S рРНК. Изолированные штаммы фенотипически очень близки бактериям вида A.fischeri, однако, в отличие от бактерии A.fischeri, являются ярко выраженными психрофилами.

В таб. 1 приведены данные по оптимальной температуре роста и биохимическим параметрам (способность к декарбоксилированию лизина, восстановлению нитрата, ферментации D-галактозы и мальтозы) исследуемых штаммов, а также контрольных штаммов A.fischeri MJ-1, МГУ-6, А. logei АТСС29851 и А. salmonicida NC1MB2262T. Все исследуемые штаммы являются психрофильными, т.к. способны к росту при 4°С. Биохимические характеристики исследуемых штаммов совпадают с таковыми штаммов А. ßscheri и отличаются от таковых штамма А. salmonicida NCIMB2262T

Таблица 1. Температурная зависимость роста и биохимические характеристики изолированных и контрольных штаммов рода А1т1Ьпо.

KChl KCh2 ВМ1 ВМ2. А. logei ATCC29851 А.ßscheri ММ А ßscheri МГУ-6 A.salmonicida NCIMB2262T

рост при:

4°С + + + + + - - +

30°С - - - - - + + -

декарбоксилирование + + + + + + + -

лизина

восстановление нитрата + + + + + + + -

ферментация:

О-галактозы + + + + + + +

мальтозы + + + + + + + *

Проведён мульти-генный анализ штаммов BMI, ВМ2, KChl, KCh2 с использованием пяти локусов (рутН, gyrB, rpoA, gapA и гесА), области hixAB и 16S рРНК, пуклеотидные последовательности которых сравнивались с гомологичными

последовательностями стандартных (реферексных) штаммов А. logei АТСС29851, А./исИег! АТСС77441 и А. $а1тотас1а МС1МВ2265Т. ПЦР-амплификацию и секвенирование генов проводили с помощью праймеров, указанных в таб. 2.

Таблица 2. Прайадеры, использованные в работе, для мулыи-генного анализа.

ген название праймера последовательность праймера 5'—>3'

gapA gapAforl AAGAGCGCAATGATATTGAAGTTG

gapArevl TAGCATCGAATACTGAAGTTTGAG

gyrB 22fVf GAAGTTATCATGACGGTACTTC

1240rVf AGCGTACGAATGTGAGAACC

gyrB557f CAACGHGATGGTGGTACNCACTTAG

gyrB670r CCTTCACGNGCATCATCACCAGASG

pyrH pyrH-04-FW ATGASNACBAAYCCWAAACC

PBPRB2966R GAATCGGCATTTTATGGTCACG

гесА recAforfisc TCAAATTGAAAAACAATTTGGTAAAGG

xecArevfisc ATCTTATCACCATTGTAGCTGTACC

гроА rpoA-01-F ATGCAGGGTTCTGTDACAG

rpoA-03-R GHGGCCARTTTTCHARRCGC

16S рРНК REV16S salm AGCCGGTTTTGTTTCTGCCCTC

Dirl6S salm CAACCTTGGCAATCTGTGTGAACA

Luxl6SD CGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATG

Luxl5SR TGCAGCCCACTCCCATGGTGTGAC

Сравнение результатов секвенирования и дифференциациию до вида проводили с помощью BLAST (http://blast.ncbi-nlm.nih.goW)- Для построения филогенетических деревьев использовали программу MEGA4.0. Филогенетические деревья строились по методу Neighbor-Joining. На рис. 1А представлено филогенетическое дерево, основанное на определении нуклеотидной последовательности четырех локусов, области luxAB и 16S рРНК гена. Как видно, все четыре исследуемых штамма принадлежат к виду A. logei. Однако необходимо отметить, что при введении в систему мульти-генного анализа последовательности пятого локуса (гена гесА) штамм ВМ2 выпадает из кластера A. logei (рис. 1Б). Наличие больших отличий в последовательности гена гесА у разных штаммов A. logei указывает на возможность горизонтального (межвидового) переноса данного гена и необходимость проведения биохимического тестирования при определении видовой принадлежности штаммов рода Aliivibrio.

4;

5«

88

-А.ЮаЫВМ А. /оое/АТСС 29935 ■Л. /эдеКОи 1А йзде/ВКа

- А КСИ2

А. ШпоЫсШ А ТСС 4393»

— Л, йсЛег/АТСС 7744

7;г А. /ода КСЫ е5| А, /еж/АТСС 29985 103 йдаВМ

-А. (изо/КС(-2

-А. $о/«кмгскй АТСС 43839

-А./05Г«"ВШ

-А. ЙСЛОТ АТСС 7744

Рисунок I. Филогенетическое дерево исследуемых штаммов, составленное: А) на основе нуклеотидных последовательностей: четырех локусов (ругН, £угВ, гроА, £арЛ), области 1ихАВ и 165 рРНК гена, Б) на основе нуклеотидных последовательностей: пяти локусов (ругН, %угВ, гроА, gapA и гесА) области 1ихАВ и 165 рРНК гена.

В данной работе также проведен анализ чувствительности к антибиотикам изолированных штаммов. Чувствительность к антибиотикам обычно рассматривается как вспомогательный признак в систематике бактерий, а их антибиотикограммы можно использовать в таксономии видов бактерий, позволяющие судить о фенотипическом сходстве. Хранящиеся в нашей коллекции бактерии Л.АзсЪеп и изолят А. 1о$е1 КСЫ имеют, в основном, сходный характерный профиль специфической устойчивости к антибиотикам, хотя отмечены и некоторые отличия. Штамм А. 1о^е1 КСЫ устойчив к аминогликозидным антибиотикам (стрептомицину, неомицину, мономицину) • и слабо чувствителен к канамицину и гентамицину, в отличие от бактерий А.}\5сЫг1, которые более чувствительны ко многим антибиотикам этого класса.

Анализ биолюминесцентных, биохимических характеристик, а также мульти-генный анализ психрофильных светящихся бактерий штаммов BMI, ВМ2, KChl, KCh2 рода показали, что эти штаммы принадлежат виду А. logei. Отметим, что в акваториях Белою, Охотского и Берингова морей бактерии данного вида изолированы впервые.

2. Анализ системы QS регуляции экспрессии /их-генов А. logei

Бактерии A.fischeri обладают системой QS регуляции, что позволяет давать скоординированный ответ, согласованный с плотностью их популяции. Изолированные штаммы фенотипически очень похожи на бактерии A.fischeri, поэтому мы предположили возможность существования QS регуляции и у бактерий А. logei.

Для детекции системы QS в штаммах BMI, ВМ2, KChl, KCh2 использовали следующую методику.

Чтобы зафиксировать наличие гена, кодирующего белок LuxR, активатор транскрипции lux-оперона, в среду с бактериями А. logei (штаммы BMI, ВМ2, KChl, KCh2), выросшими до ранней экспоненциальной фазы (OD = 0,2) при 16°С, вносили АИ и продолжали инкубацию клеток с аэрацией, измеряя через определенные интервалы времени интенсивность биолюминесценции клеточной суспензии. На рис. ЗА представлены зависимости интенсивности биолюминесценции клеток четырёх штаммов А. logei от времени инкубации (с момента добавления АИ). Как видим, в присутствии АИ бактерии через некоторое время начинают люминесцировать, в то время как контрольные клетки (без добавления АИ) остаются несветящимися. Контрольные образцы не люмимесцируют до тех пор, пока не достигнут OD = 0,6-0,8, при которой накопление собственного АИ станет достаточным для активации QS системы.

Чтобы зафиксировать биосинтез АИ клетками А. logei, мы использовали сконструированный ранее /их-биосенсор, специфически реагирующий на АИ: клетки штамма E.coli MC 1061, содержащие гибридную плазмиду pVFRl с генами luxR и luxCDABE. Клетки этого /цх-биосенсора начинают люминесцировать лишь при наличии в среде соответствующего АИ. Как видно из рис. ЗБ, данный /их-биосенсор начинает люминесцировать как при добавлении в среду N-3-оксо-гексаноил-лактона L-гомосерина, являющегося специфическим АИ для A.fischeri (контроль), так и надосадочной жидкости, полученной в результате центрифугирования суспензии клеток исследуемых штаммов А. logei, выросших до стационарной фазы и характеризующихся высоким уровнем биолюминесценции.

50 100 150 200 260 300 350 1 0 5 10 15 20 25 30 35

Время, мин ! Время, мин

Рис. 3. А) Зависимость интенсивности биолюминесценции клеток четырёх штаммов А. logei от времени (с момента добавления АИ Ю"6М) при температуре инкубации 16°С: 1 - KChl, 2 - KChl с добавлением АИ, 3 - KCh2, 4 - KCh2 с добавлением АИ, 5 - ВМ1, 6 - ВМ1 с добавлением АИ, 7 -ВМ2, 8 - ВМ2 с добавлением АИ.

Б) Зависимость интенсивности биолюминесценции клеток Е. coli MC 1061 (pVFRl) от времени инкубации с момента добавления надосадочной жидкости (получена в результате центрифугирования и фильтрования через 0.22 мкм стационарной культуры исследуемых штаммов). Клетки Е. coli росли при 37°С до OD 0,3-0,4, после добавления надосадочной жидкости образцы инкубировали при 30°С без перемешивания. 1 - без добавления АИ (контроль), 2 с добавлением АИ, 10~6 М (контроль), 3-е добавлением надосадочной жидкости от KChl, 4-е добавлением надосадочной жидкости от KCh2, 5 - с добавлением надосадочной жидкости от ВМ1, 6-е добавлением надосадочной жидкости от ВМ2.

Отметим, что различие последовательностей в области /га-бокса и промотора, а также в генах luxR у KChl, KCh2 и A.fischeri не влияет на эффективность действия АИ при индукции экспрессии /мх-генов. На рис. 4 приведены зависимости интенсивности биолюминесценции бактерий Е. coli МС1061, содержащих плазмиды pVFRl (регуляторная область /ш>оперона A.fischeri), pSV16 (регуляторная область /wx-оперона KChl) и pSV17 (регуляторная область lux-оперона KCh2) от времени инкубации. Как видим, время и амплитуда индукции экспрессии генов /мх-оперонов A.fischeri (pVFRl), А. logei, штаммы KChl и KCh2 (pSV16 и pSV17 соответственно) при добавлении АИ в концентрации 10 М практически совпадают.

О 10 20 30 40

Врсмя, мин

Рисунок 4. Зависимость интенсивности люминесценции от времени инкубации клеток £', coli MC 1061, содержащих гибридные шшмвды pSVlö (кривые 1 и 2), pSV17 (кривые 3 и 4) и pVFRl (кривые 5 и 6). Кривые с номерами 1, 3 и 5 - с добавлением АИ 1СГ6М, кривые 2, 4 и 6 - без добавления АИ. Клетки инкубировали при температуре 22°С

Анализ последовательностей, гомологичных генам luxR и lux/ в /их-оперонах штаммов KChl, KCh2, BMI и ВМ2 в совокупности со способностью клеток А. logei к активации биолюминесценции при добавлении в среду АИ (рис 3) доказывает наличие в геноме А. logei генов luxR и luxl, кодирующих активные белки LuxR и Luxl, ответственные за QS регуляцию.

3. Структура и нуклеотидная последовательность /их-оперона А. logei.

На рис. 5 представлены структуры /ux-оперонов штаммов ВМ1 и KChl (последовательность /мх-оперона GenBank: HQ450520.1), полученные согласно данным секвенирования клонированных фрагментов ДНК, размер которых 11 -тпн (плазмиды pSV20 и pSV10.4). Сравнение /их-оперонов этих штаммов с lux-оперонами бактерий видов А. fischen и А. salmonicidci показывает полное сходство структур /¡¿х-оперонов А. logei и А. salmonicida и значительные отличия структур этих /ux-оперонов от структуры ha-оперона А. fischeri. В отличие от /«х-оперона A.fischeri в /га-опероне А. logei присутствуют два гена luxR, ответственных за

синтез регуляторного белка LuxR (LuxRl и LuxR2).

Также в структуре /¡¿х-оперонаА logei после первого гена luxRl отсутствует ген luxl,

ответственный за синтез регуляторного белка Luxl. Но непосредственно за геном luxG расположен фрагмент с генами luxR2-luxL

Pl. PR

At < liKR t-j-jT 1 uxl^TüxC luxD ЛихА luxB)f luxE)jlu.4G)-

PL PR. pl PR 2

PL Pfv p, m

BMl -<~ПЖГ] -j-j-1 luxC >j luxD) lax A )f~kixB^ luxE)fïïixGX'"^ H4fiüx

Рисунок 5. Структура /ux-оперонов штаммов A. logei KChl (KChl), A. logei BMI (BMI) and A. fischen (AF). Гены luxA и IlixB кодируют а- и ß-субъединицы люциферазы, гены IttxC luxD и lux!', кодируют субъединицы редуктазы; luxR кодирует активатор транскрипции LuxR, luxl кодирует синтетазу, ответственную за синтез АИ.

В нуклеотидной последовательности регуляторной области, содержащей lux-бокс и промотор Pr to-onepoHOB A. logei KChl, A. logei BMI, и A.fischeri, имеет место значительное отличие последовательности A. logei от таковой A.fischeri. Отметим, что в последовательностях A. logei KChl, A. logei BMI, а также A. logei ВМ2, A. logei KCh2, вскоре после кодона-инициатора ATG (начальный кодон белка Luxl) расположен стоп-кодон ТАА, блокирующий трансляцию полипептида Luxl в кчетках этих штаммов (рис.6).

lux-box -10

AF AAGCAce^GGAaCG^SCAtíSÍTT-ACGCAAGAAAATGGTTTGTi» ffiASTCGAATAAA

KChl RI GATACTCÎGÏAAAGTTATACi ШёгТТ-ACCTAAATAATTACCCTGCia Ü2.ÖTTTTCTAAA

KChl R? TCATTCCTGTAATATTGTACi \SGTTATAAGGAGGAAATTTGCCTGCf|î CTÄGTCAGTTAAA

BMI RI GAT AC TCTGTAAAGTTATAC? \GGTTT-ACCTAAATAATTACCCTGC|| S.ÎA<3TTTTCÎAAA

BMI R2 T '"--■■"■. : ^SfTATAAGGAGGAAATTTGCCTGClg ITAGÏCAGTTAAA

RBS luxl stop

af cg—caâggoaggttggtîff^ctataatgataaaaaaatcggattttttggcaattccat

kchl ri ata—a0s^scagagtg1®acaatg—act^Jaaagtaggttataaatattctccatc

KChl r2 agattasabsgggtcagg^^acaataatgataagaaaatccgagtttactactattccta

bml ri ata--aggaagcagagtg#1sacaatg--act^aaagtaggttataaatattctccatc

bml r2 agattaäagggggtcaggÄacaataatgataagaaaatccgagtttactactattccta

Рисунок 6. Нуклеогидные последовательности регуляторных областей /ыл-оперонов штаммов A. logei KChl, A. logei BMI и A. ftscheri (AF R1) Идентичные нуклеотиды отмечены серым цветом. Lux-box, -10, RBS, ATG-кодоны и stop-кодоны подчеркнуты.

4. Сравнительный анализ структур /u.v-оперонов A. logei и A. salmonicida: природа криптической люминесценции у бактерии A. salmonicida.

Сравнение нуклеотидной последовательности lux-оперона A. logei высоко гомологична таковой ha-оперона А. salmonicida. Как и у А. salmonicida, в структуре lux-оперона у A. logei отсутствует ген luxl перед геном luxC, но непосредственно за геном luxG расположен фрагмент с генами lwxR2~luxl (рис.7).

AL

PL

-< luxRll

PRI

PL PR2

luxC yiüxP^I luxA )|~TüxB)j KixE)|luxG >~

PL

PRI

PL PR2

H luxe >/1йШУ~1ихА)) IuxB)j 1цхЕ)| >~

AS -< luxRT

Рисунок 7. Структуры7ш>оперонов .4. logei, штаммы Kehl и BMI (AL), и A. salnwnicida (AS)

Однако, в отличие от бактерий А. \ogei бактерии А. $а\тотс1<1а характеризуются критической люминесценцией, т.е. не светят в нормальном состоянии, а начинают светить лишь при добавлении в среду субстрата люциферазы.

Мы предположили, что разница в требовании и-деканаля для индукции биолюминесценции у бактерий КСЫ А. logei и А. заЬпопкШа в основном определяется дефектом в гене 1ихВ у А. ¡аЫопШЛа (рис.8). Как видим, у А. $а\тотс\с1а в области между генами 1ихС и 1ихО делегировано 11 нуклеотидов, в том числе нуклеотиды А и Т из кодона-инициатора АТС гена 1ихС. В результате в белке ЬихЭ делегированы первые 47 а.о., так как новый кодон-инициатор АТС расположен лишь через 141 нуклеотид. У бактерий КСЫ подобная делеция отсутствует и имеет место синтез полноценного белка ЬихЭ.

Stop iuxC Start luxD AF and AL

AI, ■■■--•.■ ^AA -■■■■-■ ■.'■.■;■■:'■■■! ATG-..... ---¡Л'- i Г 1Г 'Si ,' ..

AS 7 - •-"--.....— - .

AF . JG : ' 1

AL КС ---' ГГТК SS4 a TT S^tT?~> TT &>3> "та

АГ '. ...■..■■■■■..■.'■

Start luxD AS

AL КС 1 К7-.ШiA&AS Л ÄAJAC "VTI "TS .ГТ"' T"Ti~ ,711 ~ j I SC^IKÄYXMIIT ÄS

AF ' - .......:.-.■ '

Рисунок 8. Сравнение нуклеотидной последовательности между 1ихС и 1их!) генами в А. /нсЬеп (АГ), А ( А[. КСЫ) и А. $а]топ1с1с1а (АЗ). Идентичные нуклеотиды отмечены серым цветом. АТО-и БЮр-

кодоны подчёркнуты.

Было проведено сравнение активностей белков ЬихО А. $а1тотс1с1а и КСЫ. Для этой цели фрагменты ДНК с генами ЫхСй А. 8а1тотас!а и КСЫ были встроены в вектор

р1)С 19 под 1ас-промотор. Затем гибридные плазмиды были введены в штамм Е. соИ. содержащий плазмиду рР6 (вектор рАСУС184 с генами ¡ихЛВЕ А./мскеп).

Рисунок 9. Комплементация генов luxABE А. fischen генами luxCD из Л. logei KChl и А. salmonicida. Клетки Е. coli TG-I с гибридными плазмиаами растили до OD 0,2 при 37°С с качанием, затем инкубировали при температуре 16°С и измеряли люминесценцию. Кружки - Е. coliTG-l (pF6), Треугольники - Е. colilG-l (pF6, pSV18), Квадраты - Е. coli TG-1 (pF6, pSV19). Полые знаки - без добавления n-деканаля, заполненные - с добавлением. Плазмиды; pF6 - luxABE гены А. fischen на ori р15, pSV18 -luxCD гены А. logei KChl, pSV19 - luxCD гены A. salmonicida.

На рис. 9 представлены результаты данного эксперимента. Если клетки Е. coli (pF6) в качестве вспомогательной плазмиды содержали плазмиду pSVIS (с генами luxCD KChl), то наблюдается высокий уровень биолюминесценции, не требующий добавления экзогенного и-деканаля. Если же в клетках Е. coli (pF6) в качестве вспомогательной плазмиды содержится pSV19 (с генами luxCD А. salmonicida), то свечение клеток имеет место лишь после добавления в среду гс-деканаля. Таким образом, можно сделать вывод, что белок LuxD KChl активен, в то время как белок LuxD А. salmonicida неактивен или слабо активен.

Следует отметить, что в данных экспериментах экспрессия liixCD генов А. logei в клетках £. coli наблюдается только при температуре инкубации 10-15°С. Подобная температура является оптимальной для роста психрофильных бактерий А. logei, однако клетки Е. coli не растут при температуре ниже 20°С, хотя и синтезируют ряд белков холодового шока. Была проведена оценка влияния белков холодового шока на экспрессию liixCD генов А. logei в клетках Е. coli.

5. Влияние мутации AcspA на экспрессию luxCD генов A. logei в клетках Е. coli.

Для проверки влияния генов холодового шока на экспрессию luxCD генов A. logei в клетках Е. coli было решено использовать мутацию в гене cspA, ответственном за синтез основного белка РНК-шаперона холодового шока.

Для определения влияния мутации AcspA на экспрессию luxCD генов A. logei в клетках Е. coli культуры Е. coli MG 1655 и E.coli MG 1655 AcspA, содержащие плазмиды pF6 и pSV!8, растили при 30°С до OD = 0.2-0.3, затем переносили на 15°С и инкубировали в течение нескольких часов. 1000000

100000

4

V I

е 10000

5 J Z

I

« 1000 £ i S

г

^ 100

10

О 50 60 90 120 ISO 180 210 240 270 1200 Время, мин

Рисунок 10. Влияние мутации AcspA на экспрессию luxCD генов А. logei в клетках Е. coli. Кружки -coli iMG1655 (pSV18), треугольники - Е. coli MG 1655 AcspA (pSV18), Заполненные знаки - бея добавления /;-деканаля, полые - с добавлением. Плазмида pSVIS - luxCD гены А. logei KCh 1, pF6 -ЫхАВЕ гены А. fiseheri.

Как видно на рис.10 в штамме дикого типа E.coli MG1655, содержащем вспомогательную плазмиду pSV18 (с генами luxCD KChl), имеет место высокое свечение без добавления экзогенного я-деканаля в то время как в клетках штамма-муганта Е. coli MG 1655 по гену cspA, ответственному за синтез главного РНК-шаперона в клетках Е. coli, уровень биолюминесценции ниже и поднимается при инкубации на 15°С на несколько часов позже, чем в штамме дикого типа. Следовательно, можно сделать вывод, что для экспрессии генов luxCD А. logei необходимы холодовой шаперон CspA.

6. ¿i/.v-биосенсоры для определения интегральной токсичности и детекции АИ в среде.

В работе впервые было проведено сравнение различающихся по термостабильности люцифераз из /¡¿х-оперонов морских светящихся бактерий Р. leiognathi. А. logei KChl и

наземных энтомопатогенных бактерий Р. luminescens ZM1 с точки зрения возможностей определения общей (интегральной токсичности). Для этого в штамм Е. coli вводились плазмиды, содержащие гены to-оперонов Р. leiognathi, Р. luminescens и А. logei. Полученные клетки являются целыюклеточными биосенсорами. Интегральную токсичность соединений с помощью подобных биосенсоров определяют по падению биолюминесценции. Известно, что падение биолюминесценции коррелирует с падением титра клеток. Проводилось сравнение биосенсоров с генами люцнфераз из Р. leiognathi, Р. luminescens и А. logei по чувствительности к токсикантам различной природы. Рекомендовано использовать штамм Е. coli МС1061 с плазмидой pSV2, кодирующей гены люциферазы из А. logei для определения токсичности соединений, денатурирующих клеточные белки (Нормативно-методическое обеспечение и средства контроля содержания наночастиц на объектах производственной сферы (ГК № 01.648.12.3010)). На рисунке 11 приведен пример определения токсичности этанола биосенсорами, содержащими люциферазы из Р. leiognathi, Р. luminescens и А. logei.

Рисунок 11. Зависимость интенсивности биолюминесценции клеток Е. coli МС1061 с плазмидами pLeol (с генами люциферазы из Р. leiognathi), рХеп7 (с генами люциферазы из Р. luminescens) и pSV2 (с генами люциферазы из А. logei) от времени инкубации в присутствии этанола (8%).

Ночную культуру растили на 37°С с аэрацией, засевали в пробирки 1/50 V и подращивали при 22°С без аэрации до C)D=0,2. Далее разливали по виалам и после добавления этанола измеряли биолюминесценцию при комнатной температуре в течение

30 мин. Сравнение кинетики падения биолюминесценции биосенсоров с люциферазой из бактерий Р. luminescens, А. logei и Р. leiognathi показывает, что кинетические характеристики данных биосенсоров в целом совпадают. Однако сравнение амплитуды падения люминесценции для различных токсикантов на вышеуказанных биосенсорах, приведённое на рисунке 11, показывает большую чувствительность /ux-биосенсора на основе люциферазы А. logei к токсическим агентам, повреждающим белки клетки. Как видим, в течение 30 минут добавление этанола снижает биолюминесценцию штамма, содержащего lux-гены из А. logei, примерно на два порядка, в то время как люминесценция штамма с /ых-генами Р. leiognathi снижается лишь в 20, а с /ux-генами из Р. luminescens в 7 раз.

Для определения АИ в среде были использованы плазмиды, содержащие гены luxCDABE из Р. luminescens и регуляторную область с геном luxR в одном случае из A.fischeri (pVFR), в другом из А. logei (pSV16). Данные плазмиды вводились в клетки Е. coli MG 165 5, вследствие чего штамм становился чувствительными к добавлению АИ в среду.

Рисунок 12. Зависимость уровня биолюминесценции биосенсоров от концентрации АИ при выдерживании культур в течение 30 мин с момента добавления АИ. pVFR - клетки E.coli MG1655, содержащие плазмиду с регуляторной областью из A.fischeri, pSVtö - клетки E.coli MG1655, содержащие плазмиду с регуляторной областью из А logei.

Ночную культуру растили на 37°С с аэрацией. Затем засевали в пробирки 1/100 V и подращивали при 37°С с аэрации до OD=0,2. Далее разливали по виалам и после добавления АИ измеряли биолюминесценцию при комнатной температуре в течение 30 мин. На рисунке 12 представлены данные зависимости уровня биолюминесценции биосенсоров E.coli MG1655 pVFR и E.coli MG1655 pSV16 от концентрации АИ в среде (30

мин после добавления). Как видим, биосенсор, содержащий регуляторную область и ген luxR из исихрофильных бактерий A. logei, характеризуется более высокой амплитудой ответа к малым концентрациям АИ (10'9-10-10М) по сравнению с биосенсором, содержащим регуляторную область из мезофильных бактерий A.fischeri.

Обсуждение результатов

Анализ биолюминесцентных, биохимических характеристик, а также мульти-генный анализ психрофильных светящихся бактерий штаммов BMI, ВМ2, KChl, KCh2 рода Alimbrio (изоляты акваторий Белого, Берингова и Охотского морей) показали, что эти штаммы принадлежат виду А. logei. Отметим, что в акваториях Белого, Охотского и Берингова морей бактерии данного вида изолированы впервые.

Фенотнпически бактерии вида/4, logei очень близки бактериям вида A.fischeri, однако, в отличие от бактерий A.fischeri, являются ярко выраженными психрофилами, так как растут при 4°С и не растут при 30°С, что первоначально и послужило выделению этих бактерии в отдельный вид. При исследовании регуляции экспрессии /гот-генов у изолированных штаммов A. logei было показано, что экспрессия lux-генов у этих бактерий осуществляется системой QS первого типа как и у бактерий A.fischeri. Стоит отметить, что в структуре /шг-оперона A. logei присутствуют две копии гена luxR в отличие от lux-оперона A.fischeri, в котором присутствует только один ген luxR, ответственный за синтез белка LuxR, активатора транскрипции генов Лочшерона. При сравнении нуклеотидных последовательностей в области /их-бокса и промотора, а также в генах luxR у A. logei и A.fischeri было выявлено различие, которое не влияло на эффективность действия АИ при индукции экспрессии /их-генов.

К группе психрофильных, растущих при 4°С, морских бактерий относятся также бактерии вида A. salmonicida. Бактерии этого вида привлекают особое внимание исследователей, так как являются патогенными для промыслового атлантического лосося. Длительное время эти бактерии относили к группе несветящихся, и, следовательно, не имеющих в составе генома генов, кодирующих люциферазу. Однако, в работе (Ruby, et.al 1997) было показано, что люциферазные гены luxAB в клетках данного вида присутствуют, так как при добавлении в среду субстрата люцифсразы алифатического альдегида суспензия бактерий сильно люминесцировала. В ходе работы показано, что структура /шг-оперона в геномах бактерий штаммов A. logei практически идентична (за исключением небольших модификаций в нуклеотидной последовательности) структуре /их-оперона A. salmonicida. Однако, бактерии вида A. logei, как и A.fischeri, в норме ярко люминесцируют, в то время как патогенные бактерии вида A. salmonicida относятся к

группе криптически люминеецирующих бактерий, т.е. светящихся лишь при добавлении к клеткам субстрата люциферазы алифатического альдегида.

В работе (Ruby, et.al 1997) высказано предположение о природе критической люминесценции A. salmonicida. Оно заключается в том, что в транскрипционной модели с правонаправленной транскрипцией от гена luxC к гену luxE синтезируется антисмысловая мРНК по отношению к гену luxR2. И наоборот, левонаправленная транскрипция гена luxR2 продуцирует антисмысловую мРНК по отношению к гену luxE. По нашим данным, такое расположение генов luxE-luxR2 играет роль в способности бактерий A. salmonicida люминесцировать, но не является главной причиной криптической люминесценции. Основную роль в данном процессе играет дефект в гене luxD /их-оперона A. salmonicida, ответственного за синтез одной из субъединиц редуктазы жирной кислоты.

Как известно, для нормальной экспрессии генов психрофильных бактерий требуются РНК-шапероны, необходимые для раскрутки мРНК, которая при низких температурах образует множество биспиральных участков, запрещающих ей инициировать трансляцию. У бактерий Е. coli также имеются гены «холодового шока». Эти гены открываются при 15°С. В ходе работы показано, что главный РНК-шаперон Е. coli CspA необходим для трансляции генов lux-оперона психрофильных бактерий А. löget.

Результаты данной работы позволили получить высокочувствительные специфические /tix-биосенсоры, основанные как на определении интегральной токсичности образцов, так и на специфической детекции биологически активных молекул. В работе впервые было проведено сравнение термостабилыюсти люцифераз из 1их-оперонов морских светящихся бактерий P. leiognathi, A. logei KChl и наземных энтомопатогенных бактерий P. luminescens ZM1. Более высокая чувствительность биосенсора, основанного на генах A. logei к агентам, повреждающим клеточные белки, определяется высокой чувствительностью к денатурирующим агентам люциферазы из A. logei. Чувствительность биосенсора, основанного на генах A. logei, к токсическим агентам другой природы сходна с чувствительностью стандартных биосенсорных штаммов, применяемых для определения токсичности соединений по снижению люминесценции.

Использование транскрипционных слияний индуцируемых промоторов (чувствительных к аутоиндукторам первого типа) психрофильных бактерий, с генами термостабильных бактериальных люцифераз из Р. luminescens, в качестве репортерных, позволило создать высокочувствительный биосенсор, специфически реагирующий на аутоиндукторы первого типа Данные биосенсоры характеризуется более высокой

амплитудой ответа при добавлении малых концентраций АИ по сравнению с биосенсором, содержащим регуляторную область из мезофильных бактерий А./¡5сЬег1.

В настоящее время полученные биосенсорнке штаммы применяются в работах по экологическому мониторингу и определению интегральной токсичности наноматериалов. Разрабатываются методики диагностики инфекционных бактерий, обладающих системами регуляции типа <28.

ВЫВОДЫ:

1. Показано широкое распространение морских психрофильных бактерий вида А. logei в акватории северных морей (Белое, Охотское, Берингово моря);

2. Определена структура /ta-оперонаЛ. logei (штаммы Kehl и ВМ1);

3. Показано наличие системы типа QS первого типа у бактерий А. logei;

4. Показано, что различие последовательностей в области /их-бокса и промотора, а также в генах luxR у А. logei и A.fischeri не влияет на эффективность действия АИ при индукции экспрессии lux-генов;

5. Показано, что природа криптической люминесценции А. sahnonicida обусловлена дефектом в гене luxD.

6. Показано, что РНК-шалерон CspA необходим для трансляции генов /их-оперона психрофильных бактерий А. logei.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Манухов И.В., Балабанов В.П., Котова В.Ю., Хрульнова С.А.. Мелькина O.E., Крайнов A.A., Пустовойт К.С., Кречетов П.П., Королёва Т.В., Шатров Т.Я., Чалкин С.Ф., Завильгельский Г. Б. Использование /кх-биосенсоров для детекции НДМГ в почве. // Двойные технологии 2008,44(3): с. 50-56

2. Хрульнова СЛ.. Манухов И.В., Зарубина А.П., Завилыельский Г.Б. Aliivibrio logei, штамм KChl (изолят Камчатка): биохимические и люминесцентные характеристики, клонирование Л/х-оперона. // Микробиология. 2010, №. 79, С 349-355.

3. Manukhov IV, Khrul'nova SA. Baranova A, Zavilgelsky GB. Comparative analysis of the lux opérons in Aliivibrio logei KChl (Kamchatka isolate) and Aliivibrio salmonicida. II J Bacteriol. 2011, 193(15):3998-4001.

4. Хрульнова C.A.. Манухов И.В., Завилыельский Г.Б. "QUORUM SENSING" регуляция экспрессии lux-генов и структура lux-оперона у морских бактерий Aliivibrio logei. //Генетика2011, т.47, с. 1596-1603.

Материалы конференций:

1. Хрульнова С.А.. Манухов И.В., Завилыельский Г.Б. Характеристика нового биолюминесцентного штамма рода Vibrio. Материалы международной школы-конференции «генетика микроорганизмов и биотехнология», Пушино, 2008, с. 181.

2. Хрульнова С.А.. Манухов И.В., Зарубина А.П. Структура /ux-оперона и основные характеристики нового штамма светящихся морских бактерий рода Aliivibrio. Материалы V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва, 2009, С.56.

3. Khrul'nova S.A., Manukhov I.V., Zambina A. P., and Zavilgelsky G. B. Aliivibrio logei strain KChl (a isolate of Kamchatka): biochemical and luminescence characteristics, structure features of the lux-operon. //Luminescence 2010; 25: 191

4. Хрульнова C.A. Aliivibrio logei, штамм KChl (изолят Камчатка): биохимические и люминесцентные характеристики, клонирование /их-оперона. Материалы XVII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2010», Москва, 2010г, с.189

Подписано в печать:

17.10.2011

Заказ № 6053 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хрульнова, Светлана Алексеевна

Список используемых сокращений.стр.

ВВЕДЕНИЕ.стр.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.стр.

1.1. Психрофильные светящиеся морские бактерии. Белки «холодового шока».стр.

1.2. Системы типа "Quorum Sensing".стр.

1.2.1. LuxI/LuxR -зависимая регуляция биолюминесценции у морских бактерий.стр.

1.2.2. Ацил-Ь-гомосерин лактоны (AHL) и их взаимодействие с LuxR-подобными белками.стр.

1.2.3. Внутриклеточные факторы регуляции экспрессии генов, входящих в опероны систем QS.стр.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.стр.

2.1 Бактериальные штаммы и плазмиды.стр.

2.2.Среды и условия культивирования.стр.

2.3. Генно-инженерные методы.стр.

2.3.1. Препараты ферментов.стр.

2.3.2. Химические реагенты.стр.

2.3.3. Методы работы с бактериями.стр.

2.3.4. Манипуляции с ДНК.стр.

2.3.5. Полимеразная цепная реакция.стр.

2.3.6. Определение нуклеотидной последовательности.стр.

2.3.7. Мульти-генный анализ.стр.

2.3.8. Измерение интенсивности биолюминесценции.стр.

2.4. Биохимическое тестирование.стр.

2.5. Измерение антибиотикограмм.стр.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.стр.

3.1. Идентификация психрофильных морских светящихся бактерий, изолированных в акваториях Белого, Охотского и Берингова морей., стр.

3.1.1. Определение рода по гену 16S рРНК и биохимические характеристики изолированных штаммов.стр.

3.1.2. Мультигенный анализ.стр.

3.1.3. Чувствительность к антибиотикам.стр.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Психрофильные морские светящиеся бактерии Aliivibrio logei: структура lux-оперона и регуляция типа "Quorum sensing""

Актуальность темы.

В настоящее время представляет интерес исследование обширного семейства психрофильных бактерий. Оптимальная температура роста для психрофильных бактерий 10-15°С. Психрофильные бактерии способны расти при 4°С, но не растут при температуре выше 30°С, в отличие от мезофильных бактерий, которые не растут при 4°С и растут при 30°С и выше. Среда обитания психрофильных бактерий, как правило, холодные воды морей Арктики и Антарктики.

В настоящей работе в качестве психрофильных бактерий используются морские светящиеся бактерии вида Aliivibrio logei. Бактерии данного вида были нами изолированы в акваториях Белого, Охотского и Берингова морей.

Психрофильные бактерии вида A. logei уникальны, так как помимо основных свойств, характерных для психрофилов, они содержат в своем геноме гены /wx-оперона, определяющие способность бактерий люминесцировать. Предполагается, что регуляция экспрессии /иг-генов определяется системой типа "Quorum Sensing"(QS), являющейся основной регуляторной системой для многих мезофильных бактерий, в том числе патогенных для человека, животных и растений.

QS- система регуляции, определяет экспрессию группы генов в ответ на увеличение плотности популяции клеток. Различные виды бактерий используют QS для скоординированного ответа, согласованного с плотностью их популяции. Системы регуляции генов типа QS играют ключевую роль во взаимодействии бактерий с высшими организмами, животными и растениями, как при патогенезе, так и при симбиозе. Впервые феномен регуляции генов по типу QS был обнаружен в 1970-е годы у морских бактерий Aliivibrio (ранее Vibrio) fischeri для группы. /ш;-генов, ответственных за биолюминесценцию клеток (Nealson & Hastings, 1979). Однако термин QS был впервые введен в обиход значительно позже, в 1994 г (Fuqua W.C., et al 1994).

Хюс-оперон морских бактерий A.fischeri является базовым в исследованиях QS систем, а по обозначению белка LuxR, активатора транскрипции генов /ш:-оперона, было определено семейство LuxR-гомологичных белков - регуляторов QS систем первого типа. В настоящее время остаются открытыми ряд вопросов: 1) об эволюционном происхождении феномена биолюминесценции бактерий; 2) о механизмах стабилизирующего отбора /их-оперонов у свободноживущих видов бактерий. Продолжаются поиски новых вариантов QS систем у бактерий, а также исследования факторов, модулирующих QS ответ бактерий в зависимости от состояния клетки.

В настоящей работе проведено исследование регуляции экспрессии lux— генов у изолированных штаммов А. logei. Впервые показано; что экспрессия /их-генов у этих бактерий осуществляется системой QS.

Кодируемые генами, бактериальных /ш;-оперонов люциферазы в настоящее время широко используются в работах по молекулярной генетике (гены - репортеры), при биохимических анализах, в генно-инженерных работах (селекция) и ряде других. Большое распространение приобрели работы по экологическому мониторингу, тестированию токсических веществ,в. окружающей среде и в пищевых продуктах, а также разработке и тестированию новых медицинских препаратов с помощью цельноклеточных биосенсоров, которые основаны на транскрипционных слияниях генов бактериальных люцифераз с индуцируемыми стрессовыми промоторами.

Цель и задачи исследований.

Целью- данной работы являлось изучение структуры /шс-оперона и механизмов регуляции экспрессии генов /ш>оперонов морских люминесцирующих психрофильных бактерий А. logei.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: Изолировать штаммы психрофильных люминесцирующих бактерий,

Определить видовую принадлежность изолированных штаммов.

Клонировать и секвенировать /шг-опероны бактерий.

Провести сравнение механизмов регуляции экспрессии /шг-оперонов психрофильных и мезофильных бактерий рода Aliivibrio.

Проверить влияние генов «холодового шока» на экспрессию /гаг-генов

А. logei в клетках Е. coli

Научная новизна работы.

Анализ видовой принадлежности люминесцирующих штаммов бактерий изолированных в акваториях северных морей, показал широкое распространение морских психрофильных бактерий вида А. logei в акватории северных морей (Белое, Охотское, Берингово моря).

Впервые определена структура lux-оперона у психрофильных светящихся морских бактерий А. logei. В отличие от /их-оперонов мезофильных морских бактерий, содержащих в своём составе одну копию гена luxR, в /ш:-оперонах психрофильных бактерий содержится две копии гена IwcR, причём белки LuxRl и LuxR2 различаются как по аминокислотной последовательности, так и по активности по отношению к регулируемому ими промотору.

Доказано, что криптическая люминесценция патогенных для лососевых рыб морских бактерий Aliivibrio salmonicida (бактерии люминесцируют лишь при добавлении в среду субстрата люциферазы длинноцепочечного альдегида) связана с дефектом в гене luxD, кодирующем одну из субъединиц редуктазы.

Показано, что для эффективной экспрессии IwcCD генов А. logei в клетках Е. coli необходим ген «холодового шока» cspA, отвечающий за синтез РНК-шаперона.

Практическая значимость исследования.

Практически значимым результатом работ по изучению люцифераз, различающихся по термостабильности, явилось создание высокочувствительных /ш:-биосенсоров для определения интегральной 7 токсичности. В работе впервые было проведено сравнение различающихся по термостабильности люцифераз из /шг-оперонов морских светящихся бактерий РНоШЬаМегтт 1ею^аМ, А. logei КСЫ и наземных энтомопатогенных бактерий Рко1огкаЪс1ш 1итте$сет 2Ш\ с точки зрения возможностей определения общей (интегральной) токсичности.

Использование транскрипционных слияний индуцируемых промоторов (чувствительных к аутоиндукторам (АИ) первого типа) психрофильных бактерий, с генами термостабильных бактериальных люцифераз, в качестве репортерных, позволило создать высокочувствительные, специфически реагирующие на АИ первого типа биосенсоры. Данные биосенсоры в настоящее время применяются для работ по экологическому мониторингу, определению интегральной токсичности наноматериалов. Разрабатываются методики диагностики инфекций, обладающих системами регуляции-типа в биологических образцах, и в образцах, собранных с потенциально-инфекционных поверхностей, в частности, с медицинского оборудования, посуды и других потенциальных распространителях внутрибольничных инфекций.

Апробация работы.

Материалы исследования по теме диссертации докладывались на Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» в 2008 г, на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров в 2009 г, на XVII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2010» в 20 Юг, на 16-м Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции в 20 Юг, Лион, Франция.

Диссертационная работа была апробирована на семинаре секции «Генетика микроорганизмов» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 06 октября 2011 г

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Хрульнова, Светлана Алексеевна

ВЫВОДЫ:

1. Показано широкое распространение морских психрофильных бактерий вида А. logei в акватории северных морей (Белое, Охотское, Берингово моря);

2. Определена структура /wx-оперона А. logei (штаммы Kehl и BMI);

3. Показано наличие системы типа QS первого типа у бактерий А. logei;

4. Показано, что различие последовательностей в области lux-бокса и промотора, а также в генах IwcR у А. logei и A.fischeri не влияет на эффективность действия АИ при индукции экспрессии /ш>генов;

5. Показано, что природа криптической люминесценции А. salmonicida обусловлена дефектом в гене IwcD.

6. Показано, что РНК-шаперон CspA необходим для трансляции генов /ш>оперона психрофильных бактерий А. logei.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хрульнова, Светлана Алексеевна, Москва

1. Ahmer В.М., van Reeuwijk J., Timmers C.D., Valentine P.J., Heffron F. 1998. Salmonella typhimurium encodes an SdiA homolog, a putative quorum sensor of the LuxR family, that regulates genes on the virulence plasmid // J. Bacteriol. 180, 1185-1193.

2. Atkinson S., Throup J.P., Stewart G.S., Williams P. 1999. A hierarchical quorum-sensing system in Yersinia pseudotuberculosis is involved in the regulation of motility and clumping // Mol Microbiol 33, 1267-77.

3. Ast J.C., Urbanczyk H.U., Dunlap P.V. 2009. Multi-gene analysis reveals previously unrecognized phylogenetic diversity in Aliivibrio II Syst. Applied. Microbiol 32, 379-386.

4. Awano N., Xu С., Ke H., • Inoue K., Inouye M., Phadtare S. 2007. Complementation analysis of the cold-sensitive phenotype of the Escherichia coli csdA deletion strain // J Bacteriol 189(16): 5808-15.

5. Baldwin Т.О., Christopher J.A., Raushel F.M., Sincjair J.F., Ziegler M.M., Fisher A.J., Rayment I. 1995. Structure of bacterial luciferase // Curr. Opin. Struct. Biol, 5, 798-809.

6. Bowman J.B. 2008. Genomic analysis of psichrophilic procaryotes. In: Psichrophiles, from Biodiversity to Biotechnologt. Margesin. R., Schinner F., Marx J.C. And Gerday C. (eds). Berlin Heidelberg: Spinger-Verlag, 265-284

7. Bang S.S., Baumann P., Nealson K.H. 1978. Phenotypic characterization of Photobacterium logei (sp. nov.), a species related to P. fischeri II Curr. Microbiol 1, 285-288.

8. Bansal K., Yang K., Nistala G.J., Gennis.R.B., Bhalerao K.D. 2010. A positive feedback-based gene circuit to increase the production of a membrane protein // J Biol Eng. May 25, 4:6.

9. Bauer W.D., Robinson J.B. 2002. Disruption of bacterial quorum sensing by other organisms // Curr Opin Biotechnol. 13, 234-7.

10. Beaz-Hidalgo R., Doce A., Balboa S., Barja J.L. and. Romalde J.L. 2010.

11. Aliivibrio Jinisterrensis sp. nov., isolated from Manila clam, Ruditapes66philippinarum and emended description of the genus Aliivibrio II International Journal of Systematic and Microbiology, 60, 223-228.

12. Campbell J., Lin Q., Geske G.D., Blackwell H.E. 2009. New and unexpected insights into the modulation of LuxR-type quorum sensing by cyclic dipeptides.// ACS Chem Biol 4, 1051-1059:

13. Casanueva A., Tuffin M., Cary C., Cowan D.A. 2010. Molecular adaptations to psychrophily: the impact of'omic' technologies // Trends Microbiol. 18, 374-381

14. Cavicchioli R., Charlton T., Ertan H., Omar S.M., Siddiqui K.S., Williams T.J. 2011. Biotechnological uses of enzymes from psychrophiles// Microb Biotechnol. Jul, 4(4), 449-60.

15. Chatterjee J., Meighen E.A. 1995. Biotechnical applications of bacterial bioluminescence (lux) genes // Photochem. Photobiol. 62, 641-650.

16. Cohn D.H., Ogden R.C., Abelson J.N., Baldwin T.O., Nealson K.H., Simon M.I., Mileham A.J. 19831 Cloning of the Vibrio harveyi luciferase genes: use of a synthetic oligonucleotide probe // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 80, 120-123.

17. Davies D.G., Parsek M.R., Pearson J.P., Iglewski B.H., Costerton J.W., Greenberg E.P. 1998. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm // Science. 280, 295-298.

18. Deming J.W. 2002. Psychrophiles and Polar Regions // Curr. Opin Microbiol. 5, 301-309.

19. DAmico S., Collins T., Marx J.C., Feller G., Gerday C. 2006. Psychrophilic microorganisms: challenges for life IIEMBO Rep. 7, 385-389.

20. Dunlap P.V., Greenberg E.P. 1988. Control of Vibrio fischeri lux gene transcription by a cyclic AMP receptor protein-/«xR protein regulatory circuit // J. Bacteriol. 170,4040-4046.

21. Eberhard A. 1972. Inhibition and activation of bacterial luciferase synthesis. // J. Bacteriol. 109, 1101-1105.

22. Eberhard A., Burlingame A.L., Eberhard C., Kenyon G.L., Nealson K.H., Oppenheimer N.J. 1981. Structural identification of autoinducer of Photobacterium fischeri luciferase // Biochemistry. 20, 2444-2449.

23. Egidius E., Wiik R., Andersen K., Hoff K.A., Hjeltnes E. 1986. Vibrio salmonicida sp. nov., a new fish pathogen I I Int. J. Syst. Bacteriol. 36, 518-520.

24. Enger O., Husevag B., Goksoyr J. 1989. Presence of the fish pathogen Vibrio salmonicida in fish farm sediments // Appl. Environ. Microbiol. 55, 2815-2818.

25. Egland K.A., Greenberg E.P. 1999. Quorum sensing in Vibrio fischeri: elements of the luxl promoter // Mol. Microbiol. 31, 1197-1204.

26. Egland K.A., Greenberg E.P. 2000. Conversion of the Vibrio fischeri transcriptional activator, LuxR, to a repressor. // J. Bacteriol. 182, 805-811.

27. Enger O., Husevag B., Goksoyr J. 1991. Seasonal variation in presence of Vibrio salmonicida and total bacterial counts in Norwegian fish-farm water // Can. J. Microbiol. 37, 618-623.

28. Engebrecht J., Nealson K., Silverman M. 1983. Bacterial* bioluminescence: isolation and genetic analysis of functions from Vibrio fischeri II Cell. 32, 773-781.

29. Fang L., Jiang W., Bae W., Inouye M: 1997. Promoter-independent cold-shock induction of cspA and its derepression at 37 degrees C by mRNA stabilization // Mol Microbiol.'Jan; 23(2), 355-364.

30. Feller G., Gerday C. 2003. Microbiol. Psychrophilic enzymes: hot topics in cold adaptation II Nat.Rev. 1, 200-208.

31. Fidopiastis P.M., Sorum H., and Ruby E.G. 1999. Criptic luminescence in the cold-water fish pathogen Vibrio salmonicida II Arch. Microbiol. 171, 205-209.

32. Fidopiastis P.M., von Boletzky S., Ruby E.G. 1998. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola II J. Bacteriol. 180, 59-64.

33. Fuqua W.C., Winans S.C. 1994. A LuxR-LuxI type regulatory system activates Agrobacterium Ti plasmid conjugal transfer in the presence of a plant tumor metabolite II J. Bacteriol. 176, 2796-2808.

34. Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E.P. 1994. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators // J. Bacteriol. 176, 269-275.

35. Fuqua C., Winans S.C., Greenberg E.P. 1996. Census and consensus in bacterial ecosystems: the LuxR-LuxI family of quorum-sensing transcriptional regulators // Annu. Rev. Microbiol. 50, 727-751.

36. Fuqua W.C., Greenberg E.P. 1998. Self perception in bacteria: quorum sensing with acylated homoserine lactones // Curr. Opin. Microbiol. 1, 183-189.

37. Fuqua C., Parsek M.R., Grenberg E.P. 2001. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing // Annu. Rev. Genet, 35, 439-468.

38. Garcia-Lara J., Shang L.H., Rothfield L.I. 1996: An extracellular factor regulates expression of sdiA, a transcriptional activator of cell- division genes in Escherichia coli II J. Bacteriol. 178, 2742-2748.

39. Givskov M., de Nys R., Manefield M., Gram L., Maximilien R., EberFL., Molin S., Steinberg P.D., Kjelleberg S. 1996. Eukaryotic interference with homoserine lactone-mediated prokaryotic signalling // J Bacteriol. 178, 6618-22;

40. Glessner A., Smith E.S., Iglewski B.H., Robinson J.P. 1999. Roles of Pseudomonas aeruginosa las and rhl quorum-sensing systems in, control of twitching motility // J. Bacteriol. 181, 1623-1629.

41. Hankins J.S., Denroche H., Mackie G.A. 2010. Interactions of the RNA-binding protein Hfq with cspA mRNA, encoding the major cold shock protein // J. Bacteriol. 192(10), 2482-90.

42. Holden M.T., Ram Chhabra S., de Nys R., Stead P., Bainton N.J., Hill P.J., Manefield M., Kumar N., Labatte M:, England D:, Rice S., Givskov M., Salmond69

43. G.P., Stewaet G.S., Bycroft B.W., Kjelleberg S., Williams P. 1999. Quorum-sensing cross talk: isolation and chemical characterization of cyclic dipeptides from Pseudomonas aeruginosa and other gram-negative bacteria // Mol. Microbiol. 33, 1254-1266.

44. Holden M.T., Swift S., Williams P. 2000. New signal molecules on the quorum-sensing block // Trends Microbiol. 8, 101-103.

45. Jiang W., Hou Y., Inouye M. 1997. CspA, the major cold-shock protein of Escherichia coli, is an RNA chaperone // J Biol Chem. 3, 272(1), 196-202.

46. Jones B.W., Maruyama A., Ouverney C.C., Nishiguchi M.K. 2007. Spatial and temporal distribution of the Vibrionaceae in coastal waters of Hawaii, Australia, and France // Microb ecol. 54(2), 314-23.

47. Jung Y.H., Yi J.Y., Jung H.J., Lee H.K., Naicker M.C., Uh J.H., Jo I.S., Jung E.J., Im H. 2010. Overexpression of cold shock protein A of Psychromonas arctica КОРЮ 22215 confers cold-resistance И Protein J. 29(2), 136-42.

48. Kaplan H.B., Greenberg E.P. 1985. Diffusion of autoinducer is involved in regulation of the Vibrio fischeri luminescence system // J. Bacterioh 163, 12101214.

49. Koch В., Liljefors Т., Persson Т., Nielsen J., Kjelleberg S., Givskov M. 2005. The LuxR receptor: the sites of interaction with quorum-sensing signals and inhibitors //Microbiology. 151, 3589-602.

50. Kuts V.Y. and Ismailov A.D. 2009. Physiological and Emission Characteristics of the Luminescent Bacterium Photobacterium phosphoreum from the White See // Microbiology, 78, №5, 554-558.

51. Manefield M., Rasmussen T.B., Henzter M., Andersen J.B., Steinberg P., Kjelleberg S., Givskov M. 2002. Halogenated furanones inhibit quorum sensing through accelerated LuxR turnover // Microbiology. 148, 1119-27.

52. Maniatis Т., Fritsch F., Sambrook J. 1989. Molecular cloning: A laboratory Manual // Cold Spring Harbor. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press.

53. Manukhov I.V., Melkina O.E., Goryanin I.I., Baranova A.V., Zavilgelsky G.B. 2010. The N-terminal domain of Aliivibrio fischeri LuxR is a target of the GroEL chaperonin // JBacteriol. 192(20), 5549-51.

54. Marketon M.M., Gronquist M.R., Eberhard A., Gonzales J.E. 2002. Characterization of the Sinorhizobium meliloti sinR/sinl locus and the production of novel N-acyl homoserine lactone // J. Bacteriol. 184, 5686-5695.

55. McKnight S.L., Iglewski B.H., Pesci E.C. 2000. The Pseudomonas quinolone signal regulates rhl quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. 182, 2702-2708.

56. Meighen E.A. 1991. Molecular biology of bacterial bioluminescence // Microbiol. Rev. 55, 123-142.

57. Minogue T.D., Wehland-von Trebra M., Bernhard F., von Bodman S.B. 2002. The autoregulatory role of EsaR, a quorum-sensing regulator in Pantoea stewartii ssp. stewartii: evidence for a repressor function // Mol Microbiol. 44, 1625-1635.

58. Nealson K.H., Piatt T., Hastings J.W. 1970. Cellular control of the synthesis and activity of the bacterial luminescent system // J. Bacteriol. 104, 313-322.

59. Nealson K.H., Hastings J.W. 2006. Quorum sensing on a global scale: massive numbers of bioluminescent bacteria make milky seas // Appl Environ Microbiol. 72(4), 2295-2297.

60. Nelson E.J., Tunsjo H.S., Fidopiastis P.M., Sorum H., Ruby E.G. 2007. A novel lux operon in the cryptically bioluminescent fish pathogen Vibrio salmonicida is associated with virulence // Appl. Environ. Microbiol. 73, 1825-1833.

61. Nicolaus B., Kambourova M., Oner E.T. 2010. Exopolysaccharides from extremophiles: from fundamentals to biotechnology // Environ Technol. 31(10), 1145-1158.

62. Parry B.R. and Shain D. 2011. Manipulations of AMP metabolic genes increase growth rate and cold tolerance in Escherichia coli: implications for psychrophilic evolution I I Mol Biol. Evol. 28, 2139-2145.

63. Parsek M.R., Greenberg E.P. 2000. Acyl-homoserine lactone quorum sensing in gram negative bacteria: a signaling mechanism involved in associations with higher organisms // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 97, 8789-8791.

64. Pearson J.P., Gray K.M., Passador L., Tucker K.D., Eberhard A., Iglewski B.H., Greenberg E.P. 1994. Structure of the autoinducer • required for expression of Pseudomonas aeruginosa virulence genes II Proc. Natl. Ac. Sei USA. 91, 197-200.

65. Pearson J.P., Passador L., Iglewski B.H., Greenberg E.P. 1995. A second N-acylhomoserine lactone signal produced by Pseudomonas aeruginosa II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 92, 1490-1494.

66. Pesci E.C., Iglewski B.H. 1997. The chain of command in Pseudomonas quorum sensing // Trends Microbiol. 5, 132-135.

67. Pesci E.C., Milbank J.B., Pearson J.P., McKnight S., Kende A.S., Greenberg E.P., Iglewski B.H. 1999. Quinolone signaling in the cell-to-cell communication system of Pseudomonas aeruginosa II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 96, 1122911234.

68. Phadtare S. 2004. Recent developments in bacterial cold-shock response // Curr. Issues Mol. Biol. 6, 125-136.

69. Phadtare S., Inouye M. 2004. Genome-wide transcriptional analysis of the cold shock response in wild-type and cold-sensitive, quadruple-csp-deletion strains of Escherichia coli II JBacteriol. 186(20), 7007-7014.

70. Piette F., Struvay C., Feller G. The protein folding challenge in psychrophiles: facts and current issues. II Environ. Microbiol. 2011. V. 13, P. 1924-1933.

71. Qin N., Callahan S.M., Dunlap P.V., Stevens A.M. 2007. Analysis of LuxR regulon gene expression during Quorum Sensing in Vibrio fischeri II J. Bacteriol. 189,4127-2134

72. Relina L.I., Gulevsky A.K. 2003. A possible role of molecular chaperones in cold adaptation // Cryo Letters. 24(4), 203-212.

73. Robin S., Togashi D.M., Ryder A.G., Wall J.G. 2009. Trigger factor from the psychrophilic bacterium Psychrobacter frigidicola is a monomeric chaperone // J. Bacteriol. 191, 1162-1168.

74. Ruby E.C., McFall-Ngai M.J. 1992. A squid that glows in the night: development of an-animal-bacterial mutualism//,/ Bacteriol 174, 4865-4870.

75. Saitou N. & Nei M. 1987. The neighbor-joining method: a new method' for reconstructing phylogenetic trees // Mol Biol Evol 4, 406-425.

76. Sambrook J., Fritsch F., and Maniatis T. Molecular, cloning: a laboratory manual. 2nd ed // Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor.

77. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 74, 5463-5468.

78. Schuster M., Lostroh C.P., Ogi T., Greenberg E.P. 2003. Identification, timing, and signal specificity of Pseudomonas aeruginosa quorum-controlled genes: a transcriptome analysis II J. Bacteriol 185, 2066-2079.

79. Siddiqui K.S., Cavicchioli R. 2006. Cold-adapted enzymes // Annu. Rev. Biochem. 75, 403-433.

80. Sitnikov D.M., Schineller J.B., Baldwin T.O. 1996. Control of cell division in Escherichia coli: regulation of transcription of ftsQA involves both rpoS and SdiA-mediated autoinduction // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 93, 336-341.

81. Smith R.S., Iglewski B.H. 2003: P. aeruginosa quorum-sensing systems and virulence // Curr Opin Microbiol 6, 56-60.

82. Stewart G.S. 1997. Challenging food microbiology from a molecular perspective II Microbiology. 143,2099-2108.

83. Tamura K., Dudley, J;,. Nei M. & Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. // Mol Biol Evol 24, 1596-1599.

84. Tosco A., Birolo L., Madonna S., Lolli G., Sannia G., Marino G. 2003. GroEL from the psychrophilic bacterium Pseudoalteromonas haloplanktis TAG 125: molecular characterization and gene cloning // Extremophiles. 7(1); 17-28.

85. Tu S.-C., Mager H.L. 1995. Biochemistry of bacterial bioluminescence // Photochem. Photobiol. 62, 615-624.

86. Uli J.H., Jung Y.H., Lee Y.K., Lee H.K., Im H. 2010. Rescue of a cold-sensitive mutant at low temperatures by cold shock proteins from Polaribacter irgensii KOPRI 22228 // J. Microbiol. 48(6), 798-802.

87. Ulitzur S., Dunlop P. 1995. Regulatory circuitry controlling luminescence autoinduction in Vibrio fischeri II Photochem: Photobiol. 62, 625-632.

88. Ulitzur S. 1999 // Microbial Ecology and Infectious Disease / Ed. Rosenberg E. Washington: American Society for Microbiology, P. 123-132.

89. Ulitzur S. 1998. H-NS controls the transcription of three promoters of Vibrio fischeri. lux cloned in Escherichia coli U J. Biolumin. Chemilumin. 13, 185-188.

90. Urbanczyk H., Ast J.C., Kaeding A.J., Oliver J.D. and Dunlap P.V. 2008. Phylogenetic Analysis of the Incidence of lux Gene Horizontal Transfer in Vibrionaceae II Journal of Bacteriology, 3494-3 504.

91. Van Dyk T. and Rosson R.A. 1998. Photorhabdus luminescens luxCDABE promoter probe vectors // R.A. LaRossa (ed.), Methods in Molecular Biology, 102, 85-95.

92. Wagner V.E., Bushnell D., Passador L., Brooks A.I., Iglewski B.H. 2003. Microarray analysis of Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing regulons: effects of growth phase and environment // JBacteriol. 185, 2080-2095.

93. Whitehead N.A., Barnard A.M., Slater H., Simpson N.J., Salmond G.P.et al., 2001. Quorrum-sensing in Gram-negative bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 25, 365-404.

94. Whiteley M., Lee K.M., Greenberg E.P. 1999. Identification of genes controlled by quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 13904-13909.

95. Xia B., Ke H., Inouye M. 2001. Acquirement of cold sensitivity by quadruple deletion of the cspA family and its suppression by PNPase SI domain in Escherichia colil! Mol. Microbiol. 40, 179-188.

96. Yang Q., Han Y., Zhang X.H. 2011. Detection of quorum sensing signal molecules in the family Vibrionaceae IIJAppl Microbiol. 110(6), 1438L1448.

97. Yoshimune K., Galkin A., Kulakova L., Yoshimura T., Esaki N. 2005. Cold-active DnaK of an Antarctic psychrotroph Shewanella sp. Ac 10 supporting the growth of dnaK-null mutant of Escherichia coli at cold temperatures // Extremophiles. 9(2), 145-150.

98. Zhu J., Beaber J.W., Moré M.I., Fuqua C., Eberhard A., Winans S.C. 1998. Analogs of the autoinducer 3-oxooctanoyl-homoserine lactone strongly inhibit activity of the TraR protein of Agrobacterium tumefaciens II J Bacterio/. 180, 5398-5405.

99. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. 1994. Lon-протеаза участвует в регуляции транскрипции /ш:-оперона Vibrio fischeri И Генетика 30, 337-341.

100. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. 1997. Роль Ьа-протеазы в негативном контроле экспрессии luxCDABE генов Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli II Молекуляр. биологи. 31, 945-949.

101. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. 2001. Quorum sensing, или как бактерии разговаривают друг с другом // Молекулярная биология 35, 268-277.

102. Манухов И.В., Котова В.Ю., Завильгельский Г.Б. 2006. Внутриклеточные факторы регуляции экспрессии /ш:-оперона Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli II Микробиология 75, 525-531.

103. Мелькина О. Е., Манухов И. В., Завильгельский Г. Б. 2010. С домен LuxR, активатора транскрипции /ш:-оперона Vibrio fischeri, не является мишенью для Ion - протеазы // Молекулярная биология 44, № 3, 515-519.

104. Мелькина О. Е., Манухов И. В., Завильгельский Г. Б. 2010. Протеолитический контроль экспрессии генов lux- оперона Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli //Генетика 46, №8, 1050-1056.

105. Методы общей бактериологии: Пер. с англ./Под ред. Ф. Герхардта и др. — М.: Мир, 1983. —536 с.

106. Примакова Г.А., Воробьева Т.И., Медведева С.Е., Фиш A.M. 1981. Особенности морфологии и ультраструктуры психрофильных светящихся бактерий // Микробиология 50, 487-493.

107. Хмель И.А., Метлицкая А.З. 2006. Quorum sensing регуляция эксарессии генов перспективная модель для создания лекарств против патогенных бактерий // Молекуляр. биология. 40, 195 - 211.