Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка нового подхода к иммуноферментному анализу фитовирусов на основе полиамидных мембран

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка нового подхода к иммуноферментному анализу фитовирусов на основе полиамидных мембран"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН Г~ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

■ ЗАЙТОБА Адшгя Закировна

РАЗРАБОТКА НОВОГО ПОДХОДА К УШШМШШШШ АНАЛИЗУ ФИТОЕИРУСОВ НА ОСНОВЕ, ЮЛШЩЩШ: МЕМБРАН

.Специальность - 03.00.23 -. Еаотехнолошя

АВТО Р Е-Ф Е ? А Т • диссертации на соискание ученой" степени кандидата' биологических наук

Ташкент! 392

Работа выполнена з лаборатории вирусологии Института микробиология АН ЕУз и научно-исследовательском.отделе биологического факультета Ташкентского государственного университета ' им. В .И -Женина. •

Научные руководители: доктор биологических наук,

про<|ессор МЛЛ.Рахимов

доктор биологических наук, профессор А.Х.Вахабов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор К.Д. Давранов

доктор биологических наук, профессор Ш.И.Салихов

' Ведущая организация: Московский государственный университет им. Н.З.Ломоносова

Защита состоится " /2 " />-,■? ^1992 г в _час.

на заседании специализированного совета Д.015.02.01 при Институте микробиологии АН ЕУз по адресу: 700128, Тапкект-128, ул. Абдуллы Кадирий , 7б.

С диссертацией цожно ознакомиться в библиотеке Института • микрооиолопи АН'РУз. • •

Автореферат разослан " /О " 1392 г.

Ученый секретарь . специализированного совета кандидат оиологических наук

С .М.Ходаибаёва

lAPAKIEHiCTm РАВОШ,

Актуальность проблемы. Иммуноферментный анализ (ИФА) является одним из наиболее активно развивающихся методических направлений современной биохимии и биотехнологии. Это обусловлено тем, что высокая чувствительность, с которой обнаруживается ферментативная метка, сочетается с уникальной специфичностью иммунохимической реакции, благодаря чему по-' являются неограниченные возможности детекции с помощью -ИФА самых разнообразных объектов.

Сказанное непосредственно относится.и к проблеме "без-" вирусного" растениеводства - одной'из центральных в современной вирусологии и биотехнологии. Эта проблема, как хорошо известно, требует для своего практического решения развития целого ряда фундаментальных исследований в области фитовирусо-логни, молекулярной биологии, иммунологии и биотехнологии.

Вместе с тем, на нынешнем этапе,.для разработки конкретных практических мер борьбы с вирусныш заболеваниями., необходима, преаде всего, своевременная эффективная диагностика возбудителя. В настоящее время фитовирусолагш уже имеет значительный арсенал методов для диагностики вирусных заболеваний, для анализа вирусов в разнообразных условиях. Однако существующие методы не полностью удовлетворяют современным- тре- ' бованиям практики и научных исследований вирусологической науки и требуют дальнеГяиего совераенствованзя.

Именно,поэтому тема данной работа является весьма актуальной. В качестве объекта исследования нами выбран вирус та-Зачной'мозаики (томатный штамм)¿' Это сделано по двум лричл-" згш:-во-первых; В1М:является одним-из-наиболее- изученных модальных объектов -в-шиговирусологки. Все известные методы ИФА, з основном,- разработаны для ВИД. Это позволяет сравнить новые гадходы с существушщки, а при необходимости - адаптировать эти метода и для других вирусов. Другая причина заключается з тем, что" томатный' птемм ВШ пироко распространен в Узбекио-сане и наносит значительный ущерб сельскому хозяйству респуб-гики.' В этом смысле, данная работа является продолжением ра-:-эе проводимых исследований этого вируса.

■ Иэлыо данной работы является разработка.нового подхода : ускоренной диагностике томатного штамма вируса табачной ко-

заики СТШ-Зил) -ш^юферменткш анализом.

В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие методические задачи:

подбор новых носителей- и подходящего способа ковалент-ноё иммобилизации на!них антител;

- разработка способа очистки вируса методом биоспедафи-ческой хроматографии и получение антисывороток;

- разработка способа очистки антител на сорбентах о иммобилизованным вирусом;

- выбор ферментной метки и разработка способов получения кагьюгатов, их биохимическая и иммунологическая характеристика, а также разработка способа очистки конъюгатов;. —

- разработка тест-системы для проведения ИФА и диагностики ТЙ-ВТМ.

Научная новизна. Впервые разработан отечественный дааг-носгякум для анализа томатного штамма вируса табачной мозаи-" ки на основе применения полиамидных мембран с ковалентко иммобилизованными антителами. Указанный подход может быть применен и для других вирусов растений, анвоишх, бактерий и друга; объектов,

Разработаны прлвшшжлш) новые способы очистки ТВМШ -

к аатнтел х нему методов оиосзэшчфз^еской хрокатограри.- Впер-Еые получена нпоохо&^хтэгвакз коиыогатн, обзадагаке фосфолк-вазЕ04Л «:тивяосгьв. ¿¿гз ях очксгкх зфездаис-й способ, ъклэча-кщ? 2 себя 'дзо^нуы споидегщ^эскуз хрока^ограсЕо.

цг'.г.кт-л.чосчал. значимость. Яредзюкен аоэн*г способ юпйуко-дгагиосткк*; с использование;.? гйщрояоряотых квидраи о козалек?-йо ан^ггелаж, на баьэ ртэчеотвенннх рс-г-

гвЖ'Ой прлйй}.оз {¡Ьхожтелыюе рашвте по заявке 54867991/14 1§ы>>. Способ •¿■ах использован душ выявления Т^-ММ в различных оор-гяках, зулитрнях рассеннях и семенах с целью 'установления раицрватог'о.;. 'ГЦг-.аТК в система зярус-растение-резерва-

расценке. Способ моявт быть применен при оиглкз кСло.п'ого 'и селекционного материала о/х культур г.л ус1го?'!ч.1Еос'п> к вирусным заболеваниям, использован для рактэ.': диагиоотнЕЕ вирун;ых болезней, что позволит своевременно аров-зстн защитные мероприятия и т.д.

Предложены новые"способы выделения и очистки: I) Ш-ВИЛ; ) антител к ТШ-ВТМ методом биоснещфической хроматографии к,С." СССР, «Й441521, 1988); 3) коныогатов - методом двойной коспецифической хроматографии. Способ очистки антител внед-зн для научной работы з лаборатории вирусологии Института икробиологиа АН РУз.

Публикации и апробация работы. По результатам диссерта-¡13 опубликовано 14 работ, получено авторское свидетельство • а "Способ очистки антител к вирусу табачной мозаики" U.C. ССР, M44I52I, 1988) и одно положительное решение на "Сно-об определения вируса табачной мозаики".

Материалы диссертации доложены на II Всесоюзной конферен-аи "Вирусы микроорганизмов и растений" (Ташкент, 1986); Науч-а-практическом совещании "Вирусология народному хозяйству" ."Спев, 1987) ; 1У республиканской научно-теоретической конфе-в'нции молодых ученых и специалистов"микробиологов "Биология-7льт2ЕЕрован2Я;к-биотехнология микроорганизмов" (Ташкент, -• 989); Всесоюзной конференции "Микробиологические -я биотекно-эгйческие основы интенсификации растениеводства'и кормопроиз-. одстза" (Алма-Ата, 1990); Республиканской научно-практичес-ой конференции "Актуальные проблемы комплексного изучения рзроды' л'хозяйства южных районов Узбекистана" (Карш,1991); зесоюзной конференции "Биотехнология: и биофизика микробных

опулшшй" (Алма-Ата, 1991). ' ~ ......■-• - . . . '

1

Структура и сбъе;.л работа." Диссертация состоит из ззеде-еm, обзора литературы, описания материалов л методов иссле-эвания, нзлонэнш результатов и их обсуждения, выводов, спис-а цитированной литературы и прилскенпл.

• Диссертация пэ'локеза на -¡чл. страницах машинописного текс-з, содеркет• у таблиц и рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Среди гетерогенных методов широкое распространение поду-ал "сэядвичи-2заркант ИФА в разных кодификациях. 3 настосцэе ремя играется стандартизований набор для анализа фатсвиру-эз, поставляемый из Швейцарии. Но, наряду с кесомкеншащ эстоинствами у "сэндв1гч"-варкакта на полисаироловых платах,

рядом зарубежных и отечественных авторов отмечены недостатк: которые побуди®! нас. разработать другой подход к иымунофер-ментному анализу фитовирусов. В связи с этим, презде всего, поставили целью заменить подистироловне платы другим отечес венным носителем и отказаться от адсорбции, как подхода для иммобилизации антител, заменив ее ковалентным связыванием. Во-вторых, вместо пероксидазы,- осуществить выбор другой ферментной матки и разработать простой метод получения конъюга-тов фермента с антителами.

I. Приготовление антисывороток и разработка способа очистки антител на сорбентах о иммобилизованным вирусом. Ввиду того, что для предотвращения неспецифических реакций I повышения чувствительности ИФА важное значение имеет качеста диагностических сывороток и использование антител высокой С1 пени очистки, то, приступая к нашим разработкам, мы постава задачу получить антисыворотку и выделить из,нее антитела в чистом виде. Для этого нами были проведены следующие исследо вания: а) иммунизация -животных и получение антисыворотки; ■б) получение иммобилизованного вируса; в) сорбция и десорбция антител с иммуносорбенха для их эффективной очистки.

Первоначально Дяя иммунизации использовали вирус, очищенный из зараженных ГиМВШ растений томата путем осаздения ПЭГом и гельфильтрашей. В дальнейшем в качестве антигена служил Тш-ВЕ;!, очищенный разработанным нами способом биоспе-дафической хроматографии. -

Объектом для иммунизации служили кролики и куры. Титр сыворотки кроликов, определенный по Ухтерлони,- составил 1:32 Титр сыворотки из кур варьировал в зависимости от способа иммунизации и составил 1:8 при подкокном введении антигена в область лопа-тка.

для очистки антител специально был синтезирован биоспе-щшический сорбент, основу которого составляли■полиамидные гранулы, полученные из-капрона. После активации полиамида путем -частичного гидролиза раствором соляной кислоты, к нему присоединяли Ковзлектную иммобилизацию вируса осущес-

твляли, используя для модификации бифункциональные агенты -глутаронай дыаладегвд или госсипол. При инкубации вируса с модифицированным полиамидом, часть его прочно связывается с

зителем за счет образования оснований Шаффа мевду альдеги-■.1 и аминогруппами носителя и белковых субъединиц ТШ-ВТМ по здущей схеме:

\щ + pc-(cH2l-ct°H да

зрон глутаровкй альдегид модифицированный

капрон •

эус- Ц- N=(CH2)¿-CH=N - вирус

иммуносорбент Количество связанного с полиамидом вируса составило ,0 мг на I г сорбента (или 48,2% от исходного, определяемого белку). Оставшиеся свободные альдегидные группы на носителе жировали моноэтаноламином. Оптимальной формой для пркготов-шя биоспецифического сорбента оказались полиамидные грану-с размером частиц от 140 до 250 мил.

' .Проведенными исследования:,1ш .было установлено, что кова-itho иммобилизованный вирус не терял своей способности сзя-;а?ъся с'антителами. При добавлении к с интезировакному ем-¡осорбенту антисыЕоротки,-иммобилизованный вирус специфики адсорбировал антитела.

Оптимальные, условия сорбции антител находили, варьируя !чения рН раствора, ионов кальция и этиленгликолк (рис.1), юималькая адсорбция протекала при рЫ 7,0 (28 мг белка на ■ сорбента). Сорбцию антител улучшало такке добавление в .убационнуЬ среду.этяленгликоля з"концентрации 5%, хотя <бшя суммарного бежа ири этом скнкается (рис. 16). Поло-ельное влияние на сорбшго специфических антител оказывали а кальция. .Линии преципитации, полученные с десорбирован-и антителами, были болео четкими и плотными, когда в просе -сорбции в цнкубапионную среду добазляли 10-30 idl хло-того калыпя (рис. 1з).

Десорбция антител с иммобилизованного вируса в значи-ьной степени зависяла от ионной силы раствора, значения и времени десорбции. Наибольшей серологической активностью адали фракции белка, элюированнке.при концентрации хлорпс-о калия в десорбирующем растворе1 от 1,0 до 1,5 М (рис.Хг). од антител составлял 5s4-7,0 мг oír сорбента. Такой г.е

Рис.1. Влияние различных факторов на сорбцию (а,б,в) и десорбцию (г,д,е) антител.

'Р - количество белка десорбированного с I г сорбента, мг.

Количество знаков "+" обозначает интенсивность линий преципитации, образуемых между антигеном и десорбированными антителами при различных условия»

выход наблюдался при повышении рН среды до 10,5-11,0 (7,8 мг с I г сорбента). Десорбция антител.с биоспецифического сорбента протекает медленно. Для максимальной элюши антител в десорбирующем растворе - 0,05 М трис буфере, рЦ 10,и с добавлением I М KGI, необходимо проводить инкубацию не менее 30 мин. .

Полученные результаты позволили найти оптимальные условия сорбции и десорбции специфических антител с иммуносорбен-та и была положены в основу препаративной очистки антител. . -По сравнении с известным методом получения антител к BTíú колоночной хроматографией на основе сефарозы, цри предлоЕен-ном способе очистки резко сокращается длительность процесса и увеличивается выход антител в 5 раз.

2. Очистка томатного штамма ВТМ методом биоспеци&ической хроматографии. Выявленные выше преимущества хроматографической очистки антител на сорбентах с иммобилизованным вирусом позволили нам надеязгься решить успешно и. обратную задачу: очистку ТШ-ВШ биоспецифической хроматографией, используя сорбенты с иммобилизованными антителами.

Синтез иммуносорбента осуществляли аналогично вышеописанному. Количество связанных антител на полиамиде ■ составило 74% от исходного. Дри добавлении к синтезированному биоспецифическому сорбенту частично очищенного препарата ТШ-ВШ в присутст-' еии сорбирующего буфера 40,05 М тркс-HGI, рН 7,0, 5% этилен-гликоля, 30 t¿l CsGIg) па нммуносорбенте оказалось связанным 27,2 мг вируса на -I г сорбента. .

йсслздовали влияние рН элкирунщего' раствора ir ионной- силы на эффективность десорбции вируса с кммупосорбента. Для связы-сацпя следов кальция к раствору добавляли 0,015 Ы ЭДТА. Анализ офздя алшрл прз дссорбцяи вируса - градиентом рН от 7,0 до 11,0 хазал, что какснмалышй выход вируса наступал при значениях рН ,5-11,0. эте фракции были инфекционными (5 некрозов на лист ик-каторного растешу^, но цри этом часть вирусных частиц оыл»

зргшена.______J___________ ______________ .__

- - В специальных ошкгая исследовали влияние изменения кснно?. ■илы элюанта на дзсеоциапго иммунного комплекса антлгэн-анти-ело. Показано, что при использовании для десорбции I М KGI в ,05 М тркс-IIGI буфере, рН 11,0 наблкщается высокий выход виру-а, но большинство вирусных частиц были деградированы (рис.2, рпвая о). Отношения оптических плотностей десорбнрованных

вил, 1,01-

0,5

0

;к - ■ г**1'г^7 I 2 .3 4

5 6

фракций Еируса при 260/280 нм дало несколько завышенные резул таты (1,3) по сравнению с нативным вирусом (1,2). Возможно, это результат влияния высокого значения рН и высокой концентр пии КС1 на вирусные частипы. В более мягких условиях для элю-ции вируса (КС1 - 0,2.1, рН 5,0) (.рис.2, кривая 2) наблюдался меньший выход вируса (46% от связанного), но вирусные частицы лучше сохраняли нативность (1,75-1,2) и высокую инфекционност С16-18 некрозов на лист МсоЬолсг д£иЬлою) . Результаты электронномикроскопического анализа показали отсутствие замет кых примесей.

Таким образом, на примере ТДР-ВИЛ показана возможность• по лучения очищенного препарата вируса методом биоспецифической хроматографии, и- в перспективе этот способ можно .применить да очистки других растительных вирусоЕ.

3. Подгучение. характеристика и очистка конъюгатов. Следу щей важной задачей было получение конъюгатов. Так как чувстви тельность ижднофермеяткого анализа во многом зависит от свой срермента, то Еыбор ферментной метки и введение его в состав а тител или антигена является одной из решающих задач.

В качестве ферментов мы использовали соосфолипазу и амила зу, которые показали ряд преимуществ при разработке ИФА стафи лококковых инфекшй перед другими ферментами, в том числе и п сравнению с широко используемой для ИФА - пероксидазой.

Первоначально выяснив, что простое смешивание антител с ферментом не оказывало отрицательного влияния на иммунологиче

ую и ферментативную активности, мн получили, конъюгат фосфо-нпазы ¿2 и с*-амилазы с антителах® к ТШ-ВИЛ методом перекрестной с:лш-ш: с помощью глутарового диальдегвда.

Известно, что использование.любых реагентов для образо-¡ания ковалентных связей мезду белками сопровождается возник-:овением внутримолекулярных сшивок, снижающих активность, контролируя концентрацию реагирующих компонентов, мозно умень-ить образование этих сшивок. Подбор оптимальных условий полу- • :ення качественных коныогатов обычно ведется эмпирически. В на-их разработках оптимальное соотношение антитела : фосфолипаза 2 и влияние ковалентной сшивки на сохранение антигенной и щрментативной активности мы устанавливали на основании сопос-авленкя калибровочных кривых, полученных с использованием онъюгатов, синтезированных з среде с разным количеством анти-ел и постоянной концентрацией других компонентов. В других пытах изменяли концентрацию глутарового альдегида. Установ-:ено, что наиболее Эффективное связывание молекул фрсфолипазн

2 и антител происходит при соотношении 1:5 или 1:7 и концентра-ди альдегида 0,01 мг/мл в инкубационной среде с объемом 5 мл. ри этом наблюдается сникение активности фермента, но в то ае ремя сохраняется довольно высокая его удельная активность 50-55$ от исходной). Так, определение активности титрсметри-еским методом можно было провести за 5-10 мин при концентра-

из белка з ячейке тптратора 0,1-0,2 мкг/ш. Эти соотношения омпонентов оказались оптимальными и для эффективного ксполь-ования полученных1 конь-агатов при осуществлении иммунофермент-ого анализа ТШ-ВТМ. Результаты тестирования н последующие ксперженты"свидетельствуют также, что при конъюгации анти-эл с ферментом антигенные детерминанты остаются доступными ля молзкул вируса.

Исходя из результатов многочисленных исследований физико-иглхгческзх параметров;, выявлено, что помимо снижения актквнос-

3 после связкванля с антителами меняются а другие свойства ермектзг так, меняется профиль кривой зависимости активноети т рН среди и значение рН оптимума фермента, фосфолипаза роявлязт свою активность в более узком диапазоне рН среда; с храненным максимумом при 8,5 (рис. За). Не паблвдается изме-

А/А мах

10 рН

30 40 50' .т-ра

Время, час

I 2 3 4 5 ¿Где

Рис.3. Изменение некоторых каталитических свойств фосфояи-пазы А^ при образовании конмгатов* фермента с антителами.

а-- рН-оптимум фермента, б - зависимость фосфолшаз-ной активности от температуры, в - тепловая инактивация при 50° (А) и 70° (В), г - субстратная зависимость,

соотношение тритона X—100: =2,5:1, 1 - конъюгпты (¿осо-олкпазы А, с антителами, £ - исходная ^оаролипаза

sниэ в значении температурного оптимума фермента (рас. 36). гсколько возрастает стабильность фермента (рис. Зв). Б одних тех-se условиях инкубации (50 и 70°С) фосфолипаза в сос-1ве конъюгата инактивируется медленнее. Максимальная актив-зсть нативного и коныогировавного фермента проявляется при энцентрацип лецитина в инкубационной среде '¿,22 Ш (рис. Зг). э мере увеличения или уменьшения концентрации субстрата ско-эсть ферментативной реакции снижается. Kmc видно из кривых, ависимость скорости реакции ст концентрации субстрата не wo-* эт быть предстаЗлена в координатах Лайнуивера-Берка.

Изменение физико-химических свойств се -амилазы при конъ-гаровании проявляется аналогичным образом. Сохраняется таксе ферментативная активность. Тан, иодометрическим методом ак-авность полученного конъюгата мокко было определить в тече-ие 10 глин при концентрации белка в инкубационной среде 1-3 кг/мл. Результаты иммунологической реакции методом двойной кффузии свидетельствуют а сохранении специфичности антител, вязанных с ' << -амилазой.

. На основании полученных результатов были определены остальные условия препаративного получения иммуноферментяш: • онъюгатов. После'диализа и центрифугирования (5 мин при ■ООО об/мин) ко'въюгаты хранили з лиофилизироЕанном состоянии.■ еред употреблением растворяли з 0,005 Н трис буфере;-рН 8,5. рк хранении в.буфере з заморояе;нном_видв стабильность конъю-атов сохранялась более года.

Такт образом, путем ков'алентного связывания антител к Ш-ВВЛ с фосфолипааой и <я -амилазой получены кснъегэты, об-адавадае"ферментакткой' актЕЗнасгьст'а способностью вступать иммунологическую реакцию с вирусом;

Примеси непрорезгировавших компонентов мешают лрактическо-у использовашзо иммузофэрмвнтнкх конъюгатов и снижают чувсг-ительность метода, и поэтому мы сделали попытку выделить оныогат г-з инкубационной среды методом двойной биоспелифичес-ой хроматографии. Для этого использовали пару биосшцифкчес-их сорбентов - один с иммобилизованным вирусом, проязляго^шл родство к антителам, другой - с нммобилизозащшм кефалином, роявлшкцш сродство к фосфолипазе Ag. Лнгацдн связывали с сл-акагедеВЕЛИ чамашама (100-250 ккм), покрыты?® полиамидом

(Доний и др., 1588). Это позволило существенно улучшать условия проведения хроматографического разделения в-колоночном режиме.

На. первом этапе раствор полученного коньюгата пропускала через колонку с иммобилизованным ТШ-ВШ со скоростью 2,5 ш/' Сорбцию коныогата -и последующую промывку осуществляли. 0,05 М трис-НС1 буфером, рН 7,0, содерайщшл Ъ% этиленгликоля и 30 мМ СаС12. Для десорбции использовали 0,05 М трис буфер с'градиентом рН от 5,0 до 10,5 и градиентом концентрации КС1 от 0,1 М до;1,0 М. Во всех фракциях,после десорбции, рН среды сразу нейтрализовали до 7,5.;Во фракциях с промывной жидкостью и элюагс определяли концентрации белка и активность фермента. На давж» этапе нам удалось очистить коньюгат от невстушинжх в реакцию фосфолипазы &2 и образований типа фермент-фермент (рис.4, кривая I, пик-Ш). Далее фосфолипазная активность проявлялась" во ■ фракциях, ,элшрованяых. 0,05 М. трис буфером, рН 5,0, содервазди 0,1 II КСГ(кривая I, пик I) и I М КС1, рН 10,5 (кривая Х,пик I Зти фракции обладали также серологической активностью.

Фракщпг, .содержащие большую часть элшрованного с колонка коньюгата, объединяли, даалнзовали против дистиллированной вод и. 0,1 М трис буфера, 8,0 и для "дальнейшей очистки подвергали. биоспегофкческой хроматографии на', колонке, заполненной сорбентом с иммобилизованным кефалвком» со скоростью 2,5 мл/час. Сорбцию коньюгата и промывку колонки проводили в.0,1 М-трис 'буфере, рН 8,0,: а элюяшэ - градиентом концентрации тритона --Х-100 о г 0,1 до в трио буфере рН 8,0. На этом, этапе коньюгат счистился от Еепрореагировавших молекул антител и конью-гатов типа антитело-антитело или конъюгатов, дефицитных по содержания антител (рис.4, кривая 2, пик Ш). При элюшш 1% трите ном Х-100 в 0,1 М трис буфере, рН 8,0 десорбируется фракция, содержащая коныогагы" (кривая 2, пек 17). Результаты показали, что эти фракции обладали фосфодипазной активностью и вступали в серологическую ре-Еицшо с вирусом. Общий выход коньюгата после диализа составил 20% от исходной смеси, взятой для очистки Аналогичные данные получены и при очистке коньюгата фосфо-липазы А^ с вирусом табачной мозаики. Только на первом этапе очистки использовали сор-бант с иммобилизованными антителами, -сл этом положения пиков согласится с высеописашшма данными.

- «с В--' -л-^—11 ■ у- о——о

-Й—-_&---:-.-Л. о—о

5 10 . 15 20 25

номера фракций .

Йга.4. Очистка коньюгатоз методам двойной аффинной хроматографии.

I - элюция конъюгата с- колонка с иммобилизованным вирусом при использовании градиента хлористого калия • и рН: I пик - элюция 0,1 М КС1 в трис-НС1 рИ 5,0; П пик - элюция I М КС1 в трис- НаОЫ, рН 10,5; а - промывка после адсорбции конъюгата, б - десорбция адсорбированного конъюгата и антител; 2 - элюция конъюгата с колонки с иммобилизованным кефалинсм при использовании градиента тритона Х-ЮО Ш.1-Ш з О.ГЛ триб-НС! буфере рН 8,0: Ш пик - неадсорбированная часть конъюгата в процессе сорбции; 1У пик - э.хсат, полученный при элюировании £% тритоном 1-100 з 0,1 ^ тряс-НС1 буфере рп 8,0; з - промывка неадсорбирозан-ного конъюгата иантитэл, г - десорбция с примененном градиента тритона ¿-100 СО, 1-1%).

В ходе дальнейшее опытов выявлено, что очистку.коньвга-тов можно проводить и в статическом режиме на сорбентах с полиамидными гранулами. Это упростило процедуру выделения и увеличило выход конъюгата. Процедура очистки коныогатов позволила значительно повысить чувствительность метода ИФА.

4. Иммобилизация антител на полиамидных мембранах. В ША-наиболее жеотки' условия налагаются на подбор носителя и способа иммобилизации антител на них. Это связано с тем, что качество, 'материалов, из которых изготовляется носитель, в конечном итоге, сказывается на надежности метода. При высокой чувствительности и специфичности ферментативной и иммунной"реакции дефекты и неоднородности этих материалов могут значительно влиять на конечные результаты.

Первоначально в качестве твердого носителя нами были использованы полиамидные пленки, полученные в лабораторных условиях путем растворения капроновой ткани в муравьиной кислоте и наслаиванием на стеклянную пластинку, а также капроновая ткань. Эти носители оказались непригодными именно из-за неоднородности поверхности пленок. Положительные данные были получены при использовании полиамидных микропористых мембран.

а) Акигзашя полиамидных мембран. Известно, что количество активны;-: функциональных групп на поверхности носителя зависит от условий ограниченного гидролиза соляной кислотой, а такге восстановления групп алюминийгвдридом лития. Количество активированных групп оценивали по реакции с 2,4,6-тринит-робензолсульфоновой кислотой (ШЕЯ). При активации мембран . 2,5-н-раствором соляной кислоты образуется наибольшее количество активированных аминогрупп (36,9 мкМ связанной ТЙВС), наблюдается более Эффективное связывание антител, повышается емкость носителя по белку (2,42 мг/г носителя), а при реакции -с субстратом отмечено максимальное значение скорости ферментативной реакций (14,2 мкВД/мин) при тестировании ТШ-ВЗЫ (2,5 нг

в пробе) (рис.5).

б) Модификация-полиамидных мембгян« Оптимальные условия модификации активированных мембран определяли после их обработки глутаровым диальдегвдои (от 1,0% до 3,0 %), с последующей иммобилизацией антител (35 мкг на пробу). Обработка 2 ¿5$-

У0 мкМ/шн

15

•10

Рис.5. Зависимость количества связанных антител (кривая I) и ферментативной активности (кривая 2) при тестировании ТШ-ВШ от концентрации соляной кислоты, взятой для ак- ' тивадии.'

1,5 2,0 2,5 3,0 концентрация Ы01, я

ш глутаровым даальдегидом увеличивает степень связывания ан-■ител. Изменение концентрации альдегида в инкубационной среде опровоздается снижением количества иммобилизованных антител. рис.6, кривые 2,3), Так как доминирующим фактором-при-иммо-■ялизации являются антитела, сохранившие способность взаимодействовать с антигеном, то для'выяснения этого факта осуществи в дальнейшем тестирование вируса на'модифицированных ыем-ранах (рис.6, кривые 1,4).

Рис.6. Зависимость емкости носителя (кривые 2,3) мг/г и скорости ферментативной

реакции (кривые 1,4) при тестировании вируса от концентрации гдутарового днальдегида.

1.3 - мембраны, активиро--" - ванные соляной кислотой;

2.4 - алетинийгидридом 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 лития.

концентрация" диальдегида,'%

Следует отметить, что модификация глута'роЕым альдегидом эмбран, обработанных алюпшийиедридом лития, повышает емкость зсктеля более значительно, при этом результаты тестировали занижены (рис.6, кривая 4).

в) Подбор количества иммобилизованных антител. Известно, го концентрация иммобилизованных антител - один из основных зраметров, определяющих чувствительность и длительность ана-зза. Концентрацию .иммобилизованных антител я вес мембран,

оптимальных для постановки ИМ вируса табачной мозаики, определяли эмпирически путем- связывания антител различной концентрации с мембранами разного веса и последующим тестированием. вируса (3 нг/мл). Из результатов исследований выявлено, ато. степень связывания антител с полиамидными•мембранами линейно зависит от их содержания в инкубационной среде и связана с массой, носителя. Например, на мембранах весом 19 мг максимально связывается I;Q5. мг белка или 180,9 мг/г носителя. Дальнейшее увеличение концентрации антител в среде вызывает снижение степени их связываниям носителем.

Аналогичная линейная зависимость существует меаду уровнем иммобилизованных антител и скоростью ферментативной реакции при тестировании вируса. Но при достижении определенной концентрации антител на поверхности мембран наблюдается снижение скорости реакции. Как известно, высокая плотность фиксации лиганда 'из-за стерических ограничений неблагоприятно отражается на реакциях антиген-антитело и, еозмокно, в Процессе тёс-тировсыкя крупные молекулы ТШ-ВШ связываются только с доступными для взаимодействия молекулами антител, остальные антитела остаются Ене сферы реакций. Лля выяснения этого обстоятельства, осуществили копировочное ■ тестирование очищенного препарата ТШ-ВШ в диапазоне концентраций от 30 мкг/мл до 0,003 нг/мл на мембранах одного веса (9,0 мг), но с разным количеством иммобилизованных антител (10-, 15, 125 мкг). В наших опытах наблюдаются одинаковые значения скорости ферментативной реакции во всем диапазоне концентрации тесидзуемого вируса, независимо от концентрации иммобилизованных антител. Выявлено, что для. тестирования вируса достаточно 10 мкг иммобилизованных антител. Хорошие результаты получены и на мембранах, где связано 5-8, мкг антител. На мембранах весом 2 и 3 мг вирус идентифицирует- ' ся в узкотл диапазоне концентраций от 0,03 нг/мл до 3,0 нг/мл. При более высоких 'концентрациях вируса наблюдается ингибиро-вание иммунологической реакции избытком вируса.

При тестировании ТШ-ВИЛ на мембранах весом 9-10 мг с использованием фосфолипазы,¿2 продукты ферментативной реакции идентифищ;руются в течение 5-10 мин, е то время, как продукты гидролитической деятельности .si-амилаза определяются только через 30-60 мин, а визуально по изменении интенсивности окрас-

1 - по истечении 2 час. На мембранах весом 3,5 мг изменение сраски можно наблюдать только до истечении 4 и более часов, на мембранах весом 19 мг через 15-20 мин инкубации ухе наб-одается изменение интенсивности окраски.

Таким образом, путем подбора соответствующих размеров змбран и концентраций иммобилизованных антител для различных иапазонов концентраций вируса, рами были оптимизированы усло-т тестирования ТШ-ВШ.

Стабильность иммобилизованных антител при хранении в 0,1 М оратном буфера, рН 9 сохранялась более.г'ода. После регенерата путем обработки трис буфером рН 10,5-11,0, мембраны моэто спользовать повторно. * .

Разработанный способ ковалентной иммобилизации антител к ирусу 'табачной мозаики на полиамидных мембранах можно реко-ювдовать и для разработки диагностикумов для анализа., других гарусов и антигенов.

5. Разработка тест-системы для диагностики томатного ггамма ВТМ. О использованием полученных реагентов и с учетом гайденннх условий нами разработан способ диагностики ТШ-ВШ.

ИдаувоферментныЯ диагностику^ включает: а) очищенный прё-харат вируса Сдля калибровочной кривой); б) полиамидные мем-5раны с иммобилизованными антителами; в) конъюгат антител и росфолипази ^ пли конъюгат антител с <*--амилазой; г) субстратную смесь: 10 мл смеси содержит 140' мМ К!аС1, 10 ыМ СаС, 5 мМ тритона Х-100, 0,5 мМ трис-НС1 буфера, рН 8,5, 2,22 мУ яичного лецитина или суммарных фосфолипидов из желтка яиц для массовых анализов. Субстратная среда для определения активности амилазы на мембранах: 0,5 мл 0,5?» крахмала в 0,1 И На- ацетатном буфере, рН 5,0. Как оптимальное условие для реакции взаимодействия иммобилизованных антител с -вирусом образца, использовали в процессе проведения анализа 0,05 М трис буфер, рН 7,0, содержаний 5% этиленгликоля и 30_г,£Д СаС12.

Процедура.проведения анализа проста, не требует специального оборудования и заключается в последовательном-погружена! мембран с иммобилизованными антителами в ряд растворов (рис.7).

Для тестирования вирусг в диапазоне концентраций 0,003-' 3,0 нг/мл оптимальная рабочая концентрация конъюгата (росфолипазы с антителами составляла 4 мкг/мл,для более высоких

VÖ

ж

33

mrßrnm

ЩДШШъ

S^P

Первая иммунная реакция

i

Промывка

Вторая иммунная реакция

Промывка

Ферментативная реакция

Рио.7. Схема проведения иммуноферментного.анализа по

приникну "сэндвича" с использованием полиамидной мембраны.

Q - антиген . —^ - антитела О- фермент ¿"«-субстрат

~ конъюгат антитело-^0рменг

значений - 8-10 мкг/мл.- .Активность фосфолипазы по скорости . реакции выражалась в микромолях жирных кислот, выделившихся за I мин в расчете на I г полиамида. Для построения калибровочной кривой был использован очищенный-препарат ТЖ-ВТМ в диапазоне концентраций от 0,003 до 30000 нг/мл, при этом активность коррелировала с концентрацией вируса. Нижнее значение концентрации вируса, которое можно было обнаружить этим методом составляло 0,03 нг/мл при использовании мембран весом 9-10 мг.

Суммируя вышеизложенное можно заключить, что наш разработан новый диагностику« для ИЗД табачного - штамма ВШ, который имеет ряд преимуществ по сравнению с импортным згзбором:-I) все компоненты и все операции осуществляются на базе отечественных, реагентов ж приборов; 2) замена адсорбционной иммобилизации антител ковалентным связыванием на стандартизованном носителе (полиамидные мембраны) позволила практически полностью предотвратить ошибки из-за десорбции антител в прот-цессе проведения анализа; 3) замена пероксидазы фосфолипазой &2, которая отсутствует в растениях, повысила надежность метода, т.к. завышение результатов за счет персксп^азы в анализируемых пробах в этом случае исключается.

ВЫВОДЫ

1. Получены высокоспепифяческие антисыворотки к ТШ-ВШ. Показана возможность использования кур в качестве объекта для иммунизации. Предложен способ выделения и очистки антител к ТШ-БТМ методом биоспецифической хроматографии, где в • качестве иммуносорбента использованы полиамидные гранулы, специальным образом полученные из капрона, с ковалентно иммобилизованным вирусом. Оптимизированы условия сорбции и десорбции антител на сорбенте и определен режим препаративного получения очищенных антител. Оптимальным для сорбции антител на иммукосорбент является 0,05 М трис-НС1 буфер, рН 7,0, содержащий 30 ьМ СаС^ и 5$ этиленгликоля, для депорбши - 0,05 а трис- ЫаОН буфер, рН 10,5, содержащий I М КС1. Ьыход антител составил 150-200 мг на 100 мл иммунной сыворотка. Очищенные антитела обладали иммунологической активностью.

2. Предложен способ выделения и очистки ТЩ-БЫ методом биоспецифической хроматографии. Для этой цели был синтезлро-

вак иммуносорбент, преде тавляюгций собой полиамидные гранулы . с ковалентно иммобилизованными антителами к ТШ-ВТМ. Оптимизированы условия десорбции связанного вируса изменением рН сре- ' ды и ионной силы раствора. Выделенный вирус сохранял натив-ность и инфекционнооть. •

3. Впервые для иммуноферментного анализа фитовирусов в качестве ферментной метки использованы фосфолипаза и ~ амилаза. Получены конъюгаты этих ферментов о антителами, изучены их физико-химические свойства и иммунологическая активность. Синтезированные конъюгаты обладали высокой каталитической и серологической активностью. Предложен способ очистки конъюгатов методом двойной аффинной хроматографии на основе двух иммуносорбентов: с иммобилизованным вирусом и иммобилизованным кефалином. В качестве носителя использованы силика-гелевые гранулы, покрытые полиамидом. Определены оптимальные условия сорбции и десорбции конъюгата с иммуносорбентов.~Очи-щекнык конъюгат сохраняет высокую ферментативную и иммунологическую активность.

4. Определены условия ковалентной иммобилизации антител на отечественных лолиамидных мембранах и условия тестирования томатного штамма ВТМ на их основе. Антитела, ковалентно иммобилизованные на мембранах, сохраняют свою специфичность.

5. Впервые разработан отечественный диагностику!,! для ана- . лиза томатного штамма В1М на основе полиамидных микропористых мембран с, ковалентно иммобилизованными антителами, на базе отечественных реагентов и приборов. Нижний предел определения вируса предложенным способом с использованием фосфолипазы составляет 0,03 нг/мл, с использованием <=<. -амилазы -0,3 нг/мл.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕЛЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Захабов А.Х., Залтова А.З., Закирова O.K., Ахмедаанов Р., Софьина Е.Я., ЯкубоЕ Й.Т., Рахимов М.М. Новые биоспеци-^ические сорбенты и их использование для очистки антител к вирусам // П Всесоюзная конференция "Вирусы микроорганизмов и растений", Ташкент, 1986.

2. Ьахабов АД., Заитова А.З., Закирова O.K., Ахыедаанов Р. Б^оолепифическая хроматография антител к вирусам растений //

!езисы докл. Научно-практического сове "Вирусология -

иродному хозяйству", 9-10 апреля, Киев, 1987.- С.22.

3. Вахабов АД., Заитова А.З., Ахмедаанов Р., Рахимов М.М. Зыделение томатного штамма вируса табачной мозаики и получете его иммобилизованной формы // Биолог, науки, 1988, Ш.-

!.14-18.

4. А.С. 3 I44I52I (СССР). Способ очистки антител к виру-¡у табачной мозаики /Вахабов АД., Заитова А.З., Ахмедаанов Р., Нахимов М.М./ВЩШГПЭ, 1988. ДСП. "

5. Вахабов АД., Закирова O.K., Заитова А.З., Рахимов МД. !заимодействие ВШ с иммобилизованными антителами // Узб.биол. сурн., 1988, #2.- С.10-12.

6. Вахабов АД., Якубов И.Т., Заитова А.З., Рахимов М.М. ¡ммуноферментный анализ ВИЛ с помощью фосфолипазной реакции // гзб.биол.журн. 1988, М. - С.5-7.

7. Вахабов АД., Заитова А.З., Закирова O.K., Рахимов М.М. 'чистка антител вируса" табачной мозаики методом биоспецифичес-:ой хроматографии // Биол. науки, 1988, №8. - С.26-29,

■ 8. Вахабов АД., Якубов И,Т., Заитова А,3., Рахимов М.М. Еолучение и свойства конъюгатов фосфолипазы к^ с вирусом та-ачной мозаики // Биол.науки, 1989, J62.- С.22-26,

9. Ташмухамедова Ш.С., Заитова А.З. Использование-амилазы ,ля разработки методов иммуноферментного анализа // Тезисы ;окл. 1У-республкканская научно-теоретическая конф. молодых ченых и специалистов-микробиологов' "Биология культивирования

биотехнология микроорганизмов", Ташкент, 1989, 61 с.

10. Заитова А.З., Вахабов АД., Ахмедаанов Р., Рахимов М.М. пособ определения вируса табачной мозаики /Положительное ре-ение по заявке is 4867991/14, 199и/.

11. Заитова А.З., Ташмухамедова Ш.С., Шдашез Ж., Ваха-ов АД.. Иммуно^ерментный анализ вируса табачной мозаики ТШ-ВШ) // Тезисы докл. Всесоюзная конференция "Микробиологи-еские и биотехнологические основы интенсификации растение-одства и кормопроизводства", Алма-Ата, I99U. - С.29.

12. Вахабов АД., Заитова А.З., Якубов И.Т., Рахимов !д.М. ммуноферментный анализ ВТМ, основанный на принципе "экрани-ования" // Биол.науки, I99U. .'¿10. - С.27-34.

13. Заитова А.З., Дех:санопа з.Н., Еахабов АД. .Рахимов М.Л. ззработка методов очистки вирусных антигенов, антител и но-

ых методов КФА // Тезисы докл. Республиканская научно-прак-

тическая конференция "Актуальные проблемы комплексного изу- ' чения природа и хозяйств южных районов Узбекистана", 20-26 мая, Карши, 1991. - С.81. •

14. Рахимов М.М., Бахабов А.Х., Якубов И.Т., Заитова А.З., Ташмухамедова Ш.С. ^ммуноферментный анализ вирусных антигенов //.'Тезисы докл. Всесоюзная конференция "Биотехнология и биофизика микробных популяций", Алма-Ата, 1991. - С.116.

ЛКЛЗ /V 23 . ТИРАЖ ЮО Экз Ташкент ГИП. ЙЗКОМГ«?РАЛЬ'Т

О<5с «? р&.я гор/м я - ? 2 .