Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие микроорганизмов с полиамидным волокном в процессе биомодификации

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие микроорганизмов с полиамидным волокном в процессе биомодификации"

На правах рукописи

^ .л

КОРИН ИРИНА МИХАЙЛОВНА

Взаимодействие микроорганизмов с полиамидным волокном в процессе биомодификации

03.00.23-биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва- 1998.

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии биологического факультета Гродненского государственного университета имени Я. Купалы и в Отделе проблем ресурсосбережения Национальной академии наук Беларуси

Научные руководители - доктор биологических наук, профессор Воскобоев Александр Иванович, кандидат химических наук, доцент Бурдь Василий Николаевич

Научный консультант- д.ф.-т.н., профессор, академик Свириденок Анатолий Иванович

Официальные оппоненты: Доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович

Кандидат биологических наук Горнова Ирина Борисовна

Ведущая организация - Московская государственная текстильная Академия (кафедра технологии химических волокон)

Защита состоится" 1998 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д.053.34.13 в Росийском химико-технологическом университете им. Д.И.Менделеева по адресу: 125047 г.Москва, Миусская пл., д.9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РХТУ им. Д.И.Менделеева.

Автореферат разослан _

1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д.053.34.13

к.б.н. е' И.И.Гусева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. В настоящее время для республики наиболее важным является создание научного фундамента новых ресурсосберегающих наукоемких технологий. В нашей республике развита промышленность химических волокон и тканей, имеются все увеличивающиеся потребности в новых материалах. Основным направлением технического прогресса в промышленности химических волокон в настоящее время является не только разработка новых типов волокнообра-зующих полимеров, предназначенных для производства многотоннажных химических волокон, в первую очередь синтетических, но и модификация известных химических волокон, вырабатываемых в промышленных масштабах. Модификация этих волокон придает им новые, заранее заданные свойства, улучшает качество и расширяет области их применения.

При создании новых композиционных материалов регулирование взаимодействия компонентов осуществляют различными методами, например, путем механического, плазмохимического, радиационного воздействия. Наиболее распространен способ обработки волокон веществами, имеющими химическое сродство к волокну и связующему. Однако подбор таких веществ сложен, а синтез новых соединений с необходимыми свойствами зачастую осуществить не удается, применение других методов связано со значительными технологическими и экологическими ограничениями. Особенно трудно достичь эффекта при модификации современных высокопрочных органических волокон.

Существенно новые возможности в регулировании межфазного взаимодействия в системе матрица - волокно открыл метод биохимической модификации с помощью микроорганизмов, позволяющий управлять в достаточно широких пределах физико-химическими свойствами и структурой макромолекул поверхностных слоев полимерных компонентов.

Систематические исследования волокон крупнотоннажного производства, в частности полиамидных (ПА) волокон, не проводились. В то же время имеется необходимость в улучшении свойств ПА-волокон, что стимулировало проведение исследований, описанных в настоящей диссертационной работе.

Анализ публикаций, посвященных воздействию микроорганизмов на химические волокна, позволяет сделать вывод, что в настоящее время преобладает представление о микробиологической деструкции как о негативном процессе и практически отсутствуют идеи какого-либо ее использования.

Исследование особенностей взаимодействия микроорганизмов с полиамидными волокнами в процессе биомодификации необходимо не только для всестороннего изучения механизмов направленного биохимического воздействия, что позволит подобрать максимально эффективные режимы и условия обработки полиамидных волокон, но и для более детального изучения самых ранних этапов биодеструкции, для прогнозирования состояния биологической устойчивости по-

лиамида в соответствующих условиях эксплуатации, для определения конкретных путей защиты волокон от повреждения микроорганизмами.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Работа по теме диссертации была начата в 1991 году. Исследования, вошедшие в данную работу, были выполнены в Отделе проблем ресурсосбережения НАНБ, на кафедре биохимии и биотехнологии Гродненского государственного университета им. Я. Купалы, Институте биохимии НАНБ г. Гродно, Институте механики металлополи-мерных систем НАНБ (г. Гомель), Институте микробиологии НАНБ (г. Минск), Институте физики НАНБ (г. Минск), Институте микробиологии Чешской академии наук (г. Прага). Работа выполнялась в течение 1991-1992 г.г. как часть плановой темы ОПР НАНБ; с 1992 по 1994 г. как проект Фонда фундаментальных исследований (проект №Т4-017).

Настоящая работа была также частично поддержана Международной Со-росовской Программой образования в области точных наук.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось, во-первых, изучение влияния микроорганизмов на химическую структуру и физико-механические характеристики полиамидных волокон и, во-вторых, исследование реакции микроорганизмов на присутствие волокон в среде.

Выполнение поставленной цели потребовало решения следующих задач:

1. Разработать методику биомодификации полиамидных волокон.

2. Определить виды микроорганизмов, оказывающих наибольшее влияние на изменение физико-химических свойств полиамидных волокон.

3. Изучить особенности взаимодействия микроорганизмов с поверхностью полиамидного волокна во время биомодификации и их влияние на структуру и свойства полиамидного волокна в процессе биомодификации.

4. Исследовать влияние присутствия полиамидного волокна на физиолого-биохимические особенности микроорганизмов.

5. Изучить различия в реакции микроорганизмов на низкомолекулярные вещества, вымываемые в среду из волокон, твердую поверхность и химическую структуру волокна.

6. Изучить особенности микроорганизмов, адаптированных к полиамидному волокну.

Научная новизна полученных результатов. Разработана методика биомодификации полиамидных волокон, позволяющая существенно улучшить их физико-механические параметры. Выявлены перспективные в данном направлении штаммы микроорганизмов.

Комплексное исследование воздействия различных видов бактерий и грибов на полиамидные волокна позволило выявить основные элементы механизма биомодификации. Показано, что биообработка волокон приводит к образованию более однородных и более развитых поверхностей с мелкой фибриллоподобной структурой, которые обладают преимуществом в формировании большей площа-

ди адгезионного контакта. Выявлены центры на полиамиде, по которым бактерии могут селективно взаимодействовать с волокном.

Установлено отсутствие строгой зависимости мелоду протеолитической и эфиролитической активностями микроорганизмов и способностью к биомодификации полиамидного волокна.

Изучены особенности микроорганизмов, адаптированных к волокну путем многократных пересевов.

Исследована способность микроорганизмов к индуцированному синтезу эк-зо- и эндопротеинов в ответ на присутствие в среде волокна. Показаны различия в реакции на наличие в среде низкомолекулярных веществ, вымываемых из волокон, химически инертную твердую поверхность волокна и химическую структуру нитей.

Практическая значимость полученных результатов. Биохимическая модификация полимеров микроорганизмами является новым перспективным направлением в области создания композиционных материалов на основе полимерных волокон. В результате выполнения исследований по теме диссертации были найдены виды бактерий и разработаны режимы биообработки, позволяющие на 20% увеличить прочность волокна, в 1.5-2 раза повысить адгезию волокон к полимерным связующим и в 1,5-1,8 раз снизить термоусадку полиамидного корда.

Экономическая значимость полученных результатов. Для промышленности выбор метода модификации определяется экономическими факторами. При этом учитываются: стоимость реагентов и растворителей, их токсичность, эффективность и длительность процесса, энергетические затраты. Необходимо учитывать также стоимость уничтожения отходов или побочных продуктов производства, экологичнссть процесса. Метод биохимической модификации не требует дорогостоящих реактивов, энергетических затрат, и является экологически чистым.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Выбор микроорганизмов, способных улучшать физико-механические параметры полиамидного волокна в процессе биомодификации.

2. Результаты исследования воздействия микроорганизмов на микротопографию поверхности полиамидных волокон.

3. Результаты изучения структуры и физико-механических характеристик биориодифицированных полиамидных волокон.

4. Анализ биомодифицирующего воздействия штаммов с протеолитической, эфиролитической и пероксидазной активностями, а также микробных метаболитов на волокно.

5. Анализ особенностей реагирования микроорганизмов на присутствие в среде волокон с различной химической структурой, низкомолекулярных соединений, твердую поверхность волокна.

6. Результаты изучения особенностей адаптированных штаммов к полиамидному волокну.

Личный вклад соискателя. Соискатель разработала методику биомодифицирования применительно к полиамидному волокну. Его был проведен скрининг 31 вида микроорганизмов, выявлены наиболее перспективные для биомодификации. Проведена адаптация штаммов к полиамиду, и изучены их особенности, а также анализ реагирования микроорганизмов на присутствие в среде волокна.

Соискатель являлась ответственным исполнителем проекта T4-Q17 Фонда Фундаментальных Исследований Республики Беларусь. Она осуществила выбор методов исследования, получила, обобщила и обосновала экспериментальные данные диссертационной работы.

Апробация работы. Основные результаты доложены и обсуждены:

- на областной конференции молодых ученых. Гродненский государственный Мединститут (Гродно, 1993);

- на ежегодной конференции VAAM "Bioengineering" (Германия, 1993);

- ежегодно с 1993 г. по 1995 г. на Апрельской научной конференции биологического факультета Гродненского госуниверситета;

- на ежегодной конференции VAAM "Bioengineering" (Германия, Ганновер,

1994);

на Международной научно-технической конференции "Ресурсосберегающие и экологически чистые технологии" (Гродно, 1994);

- на Международном симпозиуме по адгезии (Япония, Йокогама, 1994);

- на ежегодной конференции немецкого микробиологического общества VAAM "Biospectrum" (Германия, Штутгард, 1995);

- на Международной конференции "Fall meeting materials research society" (США, Бостон, 1996).

Опубликованность результатов. Основные материалы диссертации опубликованы в 10 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация содержит 123 страницы машинописного текста, включая 30 рисунков, 22 таблицы, список литературы 103 наименований. Работа включает: введение, общую характеристику работы, обзор литературы, главу материалы и методы, 5 глаз собственных исследований, выводы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Дан краткий анализ работ по модификации полимерных волокон. Рассмотрены проблемы и актуальность исследования, приведена краткая аннотация работы.

Обзор литературы. Литературный и патентный обзор отражает состояние вопроса в области избранной темы и обобщен в соответствии с намеченной целью в разделах:

1. Физико-химические свойства полиамидных волокон;

2. Модифицирование химических волокон;

3. Микробиологическая деструкция полиамидных волокон;

4. Взаимодействие микроорганизмов с полиамидным волокном в процессе биодеструкции;

5. Биомодификация полиамидных волокон.

На основании анализа известных литературных и патентных данных сделан вывод о малоисследованных аспектах проблемы, уточнены цели и задачи, методика исследования.

Материалы и методы. Модификации подвергались ПКА-волокна, лромыш-ленно выпускаемые ПО "Химволокно" (г. Гродно).

Изучалось биомодифицирующее воздействие 19 видов микроорганизмов из коллекции кафедры экологии ГрГУ, 11 видов из коллекции Института микробиологии НАНБ.

Биомодификация проводилась различными видами микроорганизмов в жидкой среде в конических 250 мл колбах на термостатируемой качалке при 28-30°С.

Протеолитическую активность определяли модифицированным методом Ансона.

Для определения эфиролитической активности использовали спектрофо-тометрический метод. В качестве субстрата использовали раствор ароматических эфиров карбоновых кислот различной молекулярной структуры в ацетоне.

Пероксидазную активность определяли спектрофотометрическим методом. В качестве субстрата использовали монохлордимедон.

Для получения клеточного экстракта микробные клетки подвергали ультразвуковому дезинтегрированию.

Препарат белков культуральной жидкости получали методами концентрирования в декстране либо высаливанием сульфатом аммония с последующим диализом.

Разделение белков проводили с помощью одномерного гель-электрофореза в трис-глициновом буфере (рН-8,6) в 5% концентрирующем и 10% или 12% разделяющем полиакриламидных гелях. Концентрацию белков в пробе определяли по методу Брэдфорда.

же отсутствие биомодифицирующего воздействия у микроорганизмов сточных вод химпроизводства и микрофлоры активного ила из отстойников цехов по производству капролактама.

Исследование микрогеометрии поверхности и физико-механических свойств модифицированных волокон.

Исследование поверхности биомодифицированных волокон методами оптической и электронной микроскопии показало отсутствие каких-либо повреждений у всех образцов. Коэффициент деструкции биообработанных волокон был равен нулю.

Методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) были получены изображения топографии поверхности исходных волокон и волокон подвергшихся биохимической модификации. Визуальные оценки результатов АСМ-изображ'ений показали локально более пологую поверхность для исходных волокон. На общем пологом фоне наблюдались многочисленные достаточно крупные образования. Модифицированная поверхность имела более мелкодетальную фоновую структуру с отдельными выступами пикового характера (рис. 1 ).

Для АСМ-изображений были найдены следующие геометрические параметры: отношение полной площади поверхности к номинальной, наиболее вероятный угол наклона, максимальный угол наклона, максимальная высота рельефа, среднеквадратичное отклонение высоты рельефа, коэффициент анизотропии. Получено, что наиболее вероятный локальный угол наклона модифицированных поверхностей в 2-3 раза больше, чем исходных и, как следствие, для них больше

полная площадь поверхности. Среднеквадратическое отклонение высоты топо-

»

графии однородных участков исходных поверхностей на 30-40% ниже, чем для модифицированных. Коэффициент анизотропии для модифицированных поверхностей увеличился с 0,12 до 0,5.

Для прогнозирования прочности адгезионного сцепления на границе волокно-матрица в связи с изменением топографии волокна в результате биохимической модификации было использовано компьютерное моделирование контакта. При рассмотрении модели вязкого затекания было показано, что топография модифицированной поверхности обладает преимуществом в формировании большей площади адгезионного контакта.

Результаты физико-механических испытаний полиамидных волокон представлены в табл. 1, 2. Видно, что отдельные, модифицированные бактериями волокна показали возрастание прочности на 6-23%. После воздействия грибов во многих случаях отмечалось понижение прочности, что, очевидно, связано с большей активностью грибов по сравнению с бактериями. Отдельные микроорганизмы способны повышать адгезию к полиэтилену низкого давления (ПЭНД) более, чем на 50% и корда к резине на 13%.

Показано, что у всех модифицированных образцов, независимо от вида микроорганизмов, использованных для биообработки, снижается термоусадка на 40%.

б

Рис. 1. Атомно-силовые изображения поверхности полиамидного волокна: а) исходной; б) после биомодификации

Таблица 1

Физико-механические свойства волокон, биомодифицированных бактериями

Микроорганизмы Физико-механические свойства Адгезия к ПЭНД, т. МПа ±Дт

прочность, ГПа относительное удлинение, %

Контрольный образец 1.52 16.0 13.10+0.69

Bacillus mesentericus 1.64 18.2 16.05+0.71

Bacillus subtilis 1.78 18.9 13.10±0.59

Bacillus cereus 1.79 17.7 20.29+0.92

Bacillus megaterium 1.68 18.2 12.05.t1.15

Pseudomonas sp. 1.62 19.3 14.97+0.78

Brevibacterium linnens 1.61 17.4 17.09+0.90

Таблица 2

Физико-механические свойства волокон, биомодифицирован^ыхд1^ами___

Микроорганизмы

Контрольный ооразец_

Penicilium roseo-purpureum

Penicilium lanosum

Aspergillus oryzae

Penicilium venuceum

Penicilium citrinum

Физико-механические свойства

прочность, ГПа

относительное

удлинение,

%

1.91

1.91

20.0

1.95

1.87

1.89

1.67

17.5

18.0

17.0

Адгезия к

ПЭНД, т, МПа +Л-

11.63±0.74

11.78-0.86

16.25x1.27

12.47±0.71

19.0

16.5

15 83+0.92

11.32+0.90

Изучение химических свойств поверхности и структуры волокна после биомодификации.

По данным рентгено-структурного анализа модификация с помощью микроорганизмов влияет на молекулярную структуру полиамидного волокна. Степень этого влияния различна для разных видов микроорганизмов, но в большинстве случаев приводит к увеличению степени молекулярного упорядочения.

Методом ИК-спектроскопии показано, что упорядочение структуры полимера происходит преимущественно из-за увеличения содержания а-формы за счет снижения у-формы в структуре образцов.

Методом ЭПР было установлено, что в результате обработки полиамидных волокон бактериями наблюдается усиление ЗПР-сигнала. Усиление ЭПР сигнала бактерий при иммобилизации их на полиамиде означает активацию биохимиче-

ских процессов в клетке. Связываясь на полиамидных волокнах, бактерии способны включать в процесс своего метаболизма атомы или группы атомов, принадлежащих к полиамиду.

Для выяснения возможного механизма взаимодействия микроорганизмов с полиамидным волокном метили полиамидные волокна, контрольные и модифицированные бактериями, парамагнитной меткой, реагирующей с амино- и карбонильными группами вещества и изучали их ЭПР спектры. Из сравнительного анализа ЭПР и ИК-слектров исходных и модифицированных волокон сделан вывод о том, что на полиамиде имеется два реакционно-способных центра, отличающихся по силе связывания парамагнитной метки. Одним из них (С^ является азот амид-ной связи в молекуле полиамида, другим (Сг) могут быть карбонильная группа, либо атом углерода полиамидной цепи. Модификация полиамида Pseudomonas sp. приводит к блокированию центра С-., модификация бактериями Brevibacterium Tinnens и Brevibacterium flavurn, Sarcina sp. и Erwinia sp. к блокированию центра C2, где метка связана менее прочно. Этих центров примерно в два раза больше, чем центров Сь

Сопоставительный анализ полученных Фурье спектров комбинационного рассеяния исходных и модифицированных волокон позволил обнаружить их существенное различие в области низких частот 80-150 см~1. Было показано, что биомодификация полиамидных волокон происходит прежде всего за счет изменения межмолекулярных взаимодействий в волокне. Это может быть одним из основных элементов механизма изменения адгезионных и других свойств после биообработки.

Биомодифицирующее действие штаммов с протеолитической, эфиро-литической и пероксидазной активностями и их метаболитов

Полиамидные волокна были модифицированы штаммами мицелиальных грибов, являющимися продуцентами протеолитических и эфиролитических ферментов.

Результаты исследований представлены в таблицах 3, 4, из которых видно, что на полной питательной среде с добавлением полиамида наибольшей эфиролитической (как специфической, так и неспецифической) активностью обладает Aspergillus varians, а наибольшей протеолитической - Aspergillus carbonarius и Penicilium spiculisporum. Причем, Penicilium spiculisporum отличался не только наиболее высокой внеклеточной протеолитической активностью, но и клеточносвязанной. Однако только Aspergillus microcephalus, Fusarium gibbosum, Aspergillus awamori, Aspergillus ustus увеличивают адгезию полиамидного волокна к полиэтилену на 33%, 50%, 25%, 20%, соответственно. В отношении повышения адгезии волокна к резине активными оказались Fusarium gibbosum, Aspergillus spiculisporum, Aspergillus awamori, Aspergillus ustus (табл. 5).

Биомодификация волокна проводилась параллельно культурой микромице-тов и ферментными препаратами кислых протеиназ из штаммов Aspergillus foetidus и Aspergillus carbonarius.

Таблица 3

Микромицеты Неспецифическая эс-теразная активность, ед/мл Специфическая эс-теразная активность, ед/мл

внеклеточная внутриклеточная внеклеточная внутриклеточная

Aspergillus carbonarius, эстеразный штамм 0.041 0.005 0 0

Aspergillus varians 0.500 0.130 0.050 следы

Pénicillium jensenii 0.006 0.020 0 0

Fusarium gibbosum 0.008 0 0 0

Aspergillus microcephalus 0 0 0 0

Aspergillus humuii 0.029 0 0.015 0

Aspergillus ustus 0.010 0 0 0

Aspergillus spiculisporum 0 0 0 0

Aspergillus awamori 0.006 0.006 0 0

Aspergillus carbonarius, протеазный штамм 0 0 0 0

Aspergillus foetidus 0 0 0 0

Таблица 4

Адгезия ПА-волокон

Грибы pH Протеолитическая ак- Адгезия ПА-волокон,

конеч тивность, ед/мл модифицированных

ный

внекле- клеточно- грибами к ПЭНД, т, МПа

точная связанная ±Дт

Aspergillus awamori 5.2 1352 100 15.13 + 1.10

Aspergillus carbonarius 5.4 2100 0 12.60+0.69 !

Aspergillus microcephalus 5.6 696 0 16.57+1.64

Aspergillus ustus 6.8 1168 0 14.51+0.80

Aspergillus varians 6.2 1980 0 12.42±0.86

Fusarium gibbosum 5.9 112 0 18.05±2.21

Pénicillium humuii 6.1 336 0 13.50+0.89

Pénicillium jensenii 5.6 106 0 12.66+0.82

Pénicillium spiculisporum 5.9 1916 556 12.48+0.82

Прим.: адгезия контрольного ПА-волокна к ПЭНД составила 12.10 ±0.73 Мпа.

Таблица 5

Адгезия волокна, модифицированного микроорганизмами, к резине

Микроорганизм Адгезия к резине, МПа

Контрольный образец 14.7

Aspergillus carbonarius (эстеразный штамм) 15.1

Pénicillium jensenii 14.G

Aspergillus varians 14.1

Aspergillus foetidus 9.7

Aspergillus microcephalus 13.6

Aspergillus carbonarius 12.6

Pénicillium humuli 11.9

Fusarium gibbosum 17.0

Aspergillus awamori 16.2

Aspergillus spiculisporum 17.2

Aspergillus ustus 18.0

Aspergillus oryzae 17.2

Bifidobacterium sp.6 суток 15.9

Bifidobacterium sp. 10 суток 18.4

В конце культивирования pH среды составила 2.2 - 2.3. Активность ферментных препаратов была приблизительно одинаковой и составила 1800 ед/мл -из Aspergillus foetidus и 1600 ед/мл - из Aspergillus carbonarius. Результаты физико-механических испытаний показали выраженную тенденцию к увеличению адгезии после воздействия культур микромицетов и ферментного препарата из Aspergillus foetidus (табл. 6).

Таблица 6

Физико-механические свойства волокон, биомодифицированных грибами и фер-

ментными препаратами

Вид обработки • Активность кислой протеиназы, ед/мл Прочность, ГПа Адгезия к ПЭНД, т±Дт, МПа

внеклеточная клеточ-носвязан-ная

Контроль 2.31 12.01+0.46

Культура Aspergillus , carbonarius 260 20 2.32 12.88+0.67

Фермент Aspergillus carbonarius - - 2.32 12.28±0.54

Культура Aspergillus foetidus 28000 260 2.32 12.48±0.94

Фермент Aspergillus foetidus - - 2.32 12.66±0.74

Примечание: эстеразной активности не обнаружено.

Полиамидные волокна обрабатывались Bifidobacterium sp. в динамике роста популяции. Было показано, что активность роста и кислотообразования достигают максимума на 2-е сутки и в последующем остаются неизменными. Причем рН среды с волокном составил 4.95, тогда как в контроле рН - 7.05. Уже на 2-е сутки наблюдалось увеличение адгезии к полиэтилену на 20%. Адгезия к резине модифицированного волокна также значительно возрастала по сравнению с контрольным и достигала максимума на 10-е сутки (табл. 5).

Биомодификация полиамидного волокна проводилась культурой Serratia marcescens W250 в процессе роста, сырым бесклеточным экстрактом и частично очищенным препаратом внутриклеточного фермента галопероксидазы. Из табл. 7 видно, что штамм Serratia marcescens W250 оказывает модифицирующее действие на ПА-волокно, а обработка сырым бесклеточным экстрактом и очищенной галопероксидазой является даже более эффективной по сравнению с живой культурой.

Таблица 7

Влияние модификации с помощью Serratia marcescens на адгезию ПКА-волокна

Вид обработки Активность галопероксидазы, ед/мл Адгезия к ПЭНД, т, МПа ±Дт

Контрольное волокно - 12.10±0.73

Serratia на питательной среде - 15.69±1.06

Serratia на "голодной" среде - 13.37±0.Э8 '

Экстракт клеток 0.248+0.01 16.27+0.89

Очищенная пероксидаза 234±25 16.30±0.88

Анализ ИК-спектров модифицированных образцов в области частот валентных колебаний NH-групп показал, что биообработка приводит к изменению колебаний свободных NH-групп, что в свою очередь приводит к изменениям существующей в исходном образце системы водородных связей с участием NH-групп и в итоге - адгезионных свойств полимера.

Изучение влияния полиамидного волокна на особенности физиолого-биохимических процессов микроорганизмов.

Изучалось изменение активности внеклеточных и клеточных протеаз и эс-тераз Bacillus subtilis и Pénicillium citrinum в ответ на внесение в среду полиамидного волокна. В случае Bacillus subtilis была охарактеризована активность ферментов на полной питательной среде - мясо-пептонном бульоне и на минимальной среде, где в качестве основного источника углерода использовался полимер.

Общая протеиназная активность Bacillus subtilis, выращенном на мясо-пептонном бульоне в стандартных условиях составила: 460 ед/мл, 180 ед/мл, 160 ед/мл - через 1, 2, 3 суток соответственно. На 10-е сутки она снизилась до 40 ед/мл. Эстеразной активности не было обнаружено. При внесении полиамида в среду внеклеточная протеиназная активность на 2-е сутки составила 600 ед/мл, и 200 ед/мл к концу экспозиции на 10-е сутки. Клеточносвязанная протеиназная активность появлялась только на 4-е сутки. Эстеразная активность была зафиксирована в культуральной жидкости в течение 2-6 суток. Суспензии клеток также обладали следовой эфиролитической активностью в течение всего времени экспозиции.

У Bacillus subtilis, выращенного на минимальной среде с полиамидом, протеиназная активность была зафиксирована только на 4-е сутки. Причем, активность кислой протеиназы к концу экспозиции снижалась, а щелочной протеиназы -увеличивалась и достигала максимума на 10-е сутки - внеклеточная и 8-е сутки -клеточносвязанная. Эстеразной активности в данном случае не было зафиксировано.

У Pénicillium citrinum активность кислой протеиназы при внесении в среду полиамидного волокна появлялась на 4-е сутки и достигала максимума на 10-е сутки. Щелочная протеиназная активность была зафиксирована только на 8-е сутки - клеточносвязанная и 10-е сутки - внеклеточная. В течение 8-10 суток наблюдалось также наличие следовых количеств внутриклеточной эфиролитической активности.

Был проведен сравнительный анализ всего спектра белков, продуцируемых клеткой, методом электрофореза в SDS-полиакриламидном геле. Из анализа электрофореграмм белков, синтезируемых Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus в динамике культивирования сделан вывод об усилении синтеза экзо- и эндопротеинов, вызванном полиамидным волокном.

Для изучения особенностей реакции микроорганизмов на наличие в среде разных типов волокон, Bacillus cereus культивировалось на МПБ, содержащем: полиамидное волокно, модификация которого изучалась; полиэфирное волокно, как волокно с иной химической структурой; стекловолокно, как инертное волокно для микроорганизмов, но имеющее одинаковые с полиамидным волокном физико-механические параметры и обладающее высоким адгезивным потенциалом для бактерий: вытяжку низкомолекулярных веществ, но без присутствия волокна.

Сравнение электрофореграмм белков исходной культуры и культуры, выращенной на среде с различными добавками, показало, что все типы волокна, а также низкомолекулярные вещества вызывают изменения в синтезе протеинов, как внутри-, так и внеклеточных.

Показано влияние различных типов волокон на особенности роста бактерий. Так, внесение полиамидного волокна не значительно увеличивает лаг-фазу, тогда как наличие только низкомолекулярных веществ сокращает начальную фазу

роста по сравнению с контрольным образцом. Внесение полиэфирного волокна увеличивает лаг-фазу.

Было выполнено исследование особенностей штаммов Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus mesentericus, адаптированных к полиамиду, путем многократных пересевов этих культур на питательную среду, содержащую полиамидное волокно.

При анализе кривых роста исходных и адаптированных штаммов видно, что музейные штаммы реагируют на внесение полиамидного волокна увеличением продолжительности лаг-фазы. В случае адаптированных штаммов продолжительность лаг-фазы остается постоянной, как в случае роста на мясо-пептонном бульоне без волокна, так и с волокном.

На электрофореграммах белков адаптированных культур видно появление новых полос, а также увеличение интенсивности некоторых полос, имеющихся и в контрольных образцах, что свидетельствует об изменениях в синтезе белка в процессе адаптации к полиамиду.

Для контроля чистоты культуры в ходе многочисленных пересевов и выявления возможных изменений генома был использован метод полимеразной цепной реакции (PCR) ДНК.

Анализ электрофореграмм продуктов амплификации ДНК разных видов Bacillus со случайно выбранными праймерами показал, что различные виды Bacillus могут быть легко отличимы друг от друга по вариациям в наборе полос. Тогда как набор полос в исходной культуре и культуре, адаптированных к волокну остается неизменным. Это свидетельсвует о чистоте культур и об отсутствии каких-либо крупных перестроек в геноме исследуемых бактерий в ходе многократных пересевов.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что кратковременное воздействие микроорганизмов на поверхность полиамидного волокна оказывает биомодифицирующее влияние, что позволяет на 20% увеличить прочность волокна, в 1,5-2 раза повысить адгезию волокон к полимерным связующим и в 1,5-1,8 раз снизить термоусадку полиамидного корда. В результате скриннинга 31 штамма микроорганизмов были найдены наиболее эффективные для биомодификации, которыми явились Penicilium lano-sum, Penicilium venuceum, Bacillus cereus, Bacillus mesentericus, Fusarium gibbo-sum, Aspergillus awamori, Aspergillus ustus, Bifidobacterium sp., Serratia marcescens W250.

2. Корреляции между протеазной и эстеразной активностями штаммов и повышением адгезии модифицированного волокна не обнаружено, что указывает на то, что в процессе биомодификации участвуют различные группы ферментов и другие клеточные метаболиты. Показано, что галопероксидаза из Serratia marcescens W250 оказывает выраженное биомодифицирующее влияние на полиамид-

ное волокно. Как штамм Serratia marcescens W250, так и продуцируемый им фермент представляются весьма интересными для использования при создании новых технологий биомодификации полиамидного волокна.

3. Установлено, что присутствие в среде полиамидного волокна влияет на изменение протеазной и эстеразной активностей микроорганизмов, как внеклеточной, так и кпеточносвязанной, а также особенности роста бактерий. Зафиксировано усиление синтеза внутри- и внеклеточных протеинов полиамидным волокном. Обнаружены различия в реакции микроорганизмов на присутствие в среде разных типов волокон. Показано, что адаптация к полиамидному волокну влияет на рост бактерий и ведет к изменениям в синтезе белков. Методом PCR анализа подтверждена чистота адаптированных культур и показано отсутствие каких-либо крупных перестроек в геноме адаптированных бактерий.

4. Методом атомно-силовой микроскопии показано, что биообработка волокон приводит к образованию более однородных и более развитых поверхностей с мелкой фибриллоподобной структурой. С помощью компьютерного моделирования обнаружено, что топография модифицированной поверхности обладает преимуществом в формировании большей площади адгезионного контакта. Увеличение адгезии волокон к полиэтилену и к резине подтверждено физико-механическими испытаниями.

5. Данные рентгено-структурного анализа свидетельствуют об увеличении степени молекулярного упорядочения у модифицированных образцов полиамидных волокон. С помощью ИК-спектроскопии показано, что упорядочение структуры полимера происходит благодаря увеличению содержания а-формы в структуре образцов за счет уменьшения содержания у-формы. Эти изменения наблюдаются в разной степени в зависимости от условий модификации.

6. Методами ЭПР и ИК-спектроскопии показано, что воздействие микроорганизмов на полиамидное волокно может осуществляться по двум центрам. Одним из них является азот амидной связи в молекуле полиамида, другим могут быть карбонильная группа, либо атом углерода полиамидной цепи. Обнаружена селективность действия различных бактерий в отношении этих центров.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. I.M. РынкевЫ, В.М. Бурдзь. А6 уплыве 61яхшчнай апрацоук! на уласц1васц1 паверхж ПКА-валакна //Тез. докл. конф. - 1993. - с. 102.

2. Sviridenok A.I., Rinkevich I.M., Burd V.N. Effect of microbiological treatment on the surface of polycaproamide fibre // Bioengineering. - №2. - 1993. - p. 51.

3. Модифицирование поверхности полиамидных волокон при бактериальном воздействии / А.И.Свириденок, И.М.Ринкевич, А.Н.Арцукевич. // Доклады АН Беларуси. - Т. 38. - №6. - с. 52-56.

4. Sviridenok A.I, Rinkevich I.M., Burd V.N. The study of the interaction microorganisms with the surface of polycaproamide fibre // Bioengineering.- №2. -1994.-p. 116.

5. Влияние модификации с помощью микроорганизмов на физико-механические свойства ПКА-волскна / Свириденок А.И., Мешков В.В., Ринкевич И.М. // Доклады АНБ. - 1995. - Т. 39. - №4. - с. 113-116.

6. Влияние биохимической обработки на изменение степени молекулярного упорядочения в полимерных волокнах / Лиопо В.А., Война В.В., Ринкевич И.М. И Becui АНБ. - 1995. - №2. - с. 32-37.

7. Атомно-силовое исследование поверхности биомодифицированного волокна / Свириденок А.И., Свекло И.Ф., Чижик С.А., Ринкевич И.М. // Доклады АНБ. - 1995.-Т. 39. - №6. - с. 60-63.

8. Sviridenok A.I., Rinkevich I.M., Burd V.N., Novik G.I , Astopovich N.I. Influence of Serratia, Bifidobacterium and Bacillus on the polycaproamide fibres // Biospectrum. -№3. - 1995. - p. 65.

9. Свириденок А.И., Ринкевич И.М., Воскобоев А.И., Бурдь В Н., Мешков В.В. Ресурсосберегающая технология: биомодификация полиамидного волокна И Ресурсосберегающие и экологически чистые технологии: Тез. докл. конф. - Гродно, 1994. - с. 155.

10. Rinkevich I.M., Sviridenok A.I., Sveklo I.F. Investigation of the polyamide surface structure after biomodification // Fall meeting materials research society: Abst. book. - 1996. - p. 660.

РЕЗЮМЕ

Корин Ирина Михайловна

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПОЛИАМИДНЫМ ВОЛОКНОМ В ПРОЦЕССЕ БИОМОДИФИКАЦИИ

Ключевые слова: полиамид, микроорганизмы, биомодификация, поверхность, свойства, прочность, адгезия, протеазы, галопероксидаза, бактерии, адаптация, протеины, ДНК.

Объект исследования: полиамидные волокна, биомодифицированные микроорганизмами.

Цель работы: исследование изменений структуры и физико-механических характеристик' биомодифицированных волокон и воздействия волокон на физиолого-биохимические особенности микроорганизмов.

Методы исследования и аппаратура: основные методы биотехнологии, включая методики выделения и очистки протеинов, определения ферментативных активностей, метод одномерного ЗОЭ-гельэлектрофореза, полимерная цепная реакция ДНК. Оптическая, электронная и атомно-силовая микроскопия, рентгено-структурный анализ, ЭПР, ИК-спектроскопия.

Разработана методика биомодификации полиамидных волокон, позволяющая существенно улучшить их физико-механические параметры. Выявлены перспективные в данном направлении штаммы микроорганизмов.

Комплексное исследование воздействия различных видов бактерий и грибов на полиамидные волокна позволило выявить основные элементы механизма биомодификации. Показано, что биообработка волокон приводит к образованию более однородных и более развитых поверхностей с мелкой фибриллоподобной структурой, которые обладают преимуществом в формировании большей площади адгезионного контакта. Выявлены центры на полиамиде, по которым бактерии могут селективно взаимодействовать с волокном.

Найдены виды бактерий и разработаны режимы биообработки, позволяющие на 20% увеличить прочность волокна, в 1,5-2 раза повысить адгезию волокон к полимерным связующим и в 1,5-1,8 раз снизить термоусадку полиамидного корда.

Установлено отсутствие строгой зависимости между протеолитической и эфиролитической активностями микроорганизмов и способностью к биомодификации полиамидного волокна.

Изучены особенности бактерий, адаптированных к волокну путем многократных пересевов. Исследована способность микроорганизмов к индуцированному синтезу экзо- и эндопротеинов в ответ на присутствие в среде волокна. Показаны различия в реакции бактерий на наличие в среде низкомолекулярных веществ, вымываемых из волокон, химически инертную твердую поверхность волокна и химическую структуру нитей.

RESUME

Corin Irina

THE STUDY OF MICROORGANISMS INTERACTION WITH POLYAMIDE FIBRES DURING BIOMODIFICATION

Key words: polyamide, microorganisms, biomodification, surface, properties, strength, adhesion, proteases, haloperoxidases, bacteria, adoptation, proteins, DNA.

Object of investigation: biomoditied polyamide fibres.

Aim of investigation: investigation of the biomodified polyamide fibres structure and physical and mechanical properties. The study of the influence of the polyamide fibres on the phisiological and biochemical descriptions of microorganisms.

Methods of investigation and devices: basic methods of biotechnology, including methods of isolation and purification proteins, measurement of enzymes activities: SDS-gel electroforeses, PCR. Optic, electron and atomic-force microscopy, X-ray analyses, ESR, IR-spectroscopy,

Method of biomodification of polyamide fibers, enabling to improve the physical and mechanical properties of the fibres, is elaborated. The most efficient strains of microorganisms were choosen.

The complex investigation of the influence of various bacteria and fungi on the polyamide fibres made it pcssib le to out the basic elements of the biomodification mechanisms. It was shown that biotreatment of the polyamide fibres leads to the formation of more homogeneuos and more developed surfaces which have agvantages in the adhesional contact forming. The centeres, on which bacteria can selectively interact with fibre, were revealed.

Bacterial strains and biotreatment conditions, enabling to increase the fibre strength on 15-20%, improve the adhesion to the polyethylene in 1,5-2 times and to lower the thermoshrinkage of the polyamide fibers in 1,5-1,8 times, were found out.

It was shown that there is no any dependens between proteolitic and etherolitic activities of microorganisms and their abilyty to biomodification.

The particular features of the bacteria adopted to polyamide by means of multiply inoculations, were studed. The difference in the bacteria responce on the substances with low molecular weight, washed out from the polyamide, chemical structure of fibres and chemical inert solid surface has been shown.

Подписано е печать 19.06.1998. Бумага офсетная №1. Формат 60x84/16. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0.

Тираж 100 жз. Заказ __

Отпечатано на технике издательского отдела Гродненского государственного университета имени Янки Купалы 230023 г. Гродно, ул. Ожешко, 22