Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние иммобилизации антител и пероксидазных конъюгатов на их реакции

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние иммобилизации антител и пероксидазных конъюгатов на их реакции"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

П ~ Г> л и

( 1 'Л Ои На правах рукописи

УДК 616.089.22 + 616.097 + 577.152.193 + 577.112.85

ТАРУН Екатерина Ибанобна

Влияние иммобилизации антител и пероксидазных конъюгатов на их. реакции

03.00.04 — биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степепи кандидата химических наук

Минск - 1993

Работа выполнена в лаборатории прикладной энзимопогии №статута биоорганической химии Академии наук Беларуси

Научные руководители: доктор химических наук, профессор Д. И. МЕТЕЛИЦА . кандидат биолотлческих наук М. И. САВЕНКОВА

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В. Н. КАЛШОВ, кандидат химических наук, старший научный сотрудник О.В. СВИРИДОВ.

Ведущая организация:

Институт фотобиологии Академии наук Беларуси, г. Минск. Защита состоится

в " " часов на

заседании специализированного совета Д 006.22.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии АН Беларуси по адресу: 220141, Минск, Академгородок, ул.Жодинская, 5/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии АН Беларуси.

Автореферат разослан " 1903 г.

Ученый секретарь

Специализированного совета. ^

кандидат химических наук — Н.М.Литвинко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одной га важных проблем современной биохимии и иммунохимии является изучение кинетики и механизма взаимодействия антигенов с антителами. Одним из перспективных подходов изучения реакции антиген-антитело является метод твердофазного иммуноферментного анализа. С помощью этого метода может быть определена среднечисловая равновесная константа диссоциации комплекса антигена с поликлональными антителами (Kd) и рассчитаны константы скорости реакции антиген-антитело (к).

Знание равновесных и кинетических параметров взаимодействия антиген-антитело необходимо для создания чувствительных тест-систем иммуноферментного определения различных антигенов. Большой практический интерес представляет иммуноферментный анализ строфантина К ССТР)- сердечного гликозида, используемого в кардиологии для лечения сердечной недостаточности. Созданные ранее иммунофэрментные тест-системы строфантина не удовлетворяют в достаточной мере современным требованиям клинической практики. В связи с этим остается актуальной разработка экспрессного и чувствительного твердофазного июуноферментного анализа (Ш>А) строфантина.

Важной задачей является подбор формованных твердых матриц, на основе которых кохно было бы создать удобные иммунные и аффинные сорбенты, позволяющие достигать высокой чувствительности иммуноферментного определения.

Очевидно, что иммобилизованные на иммуносорбентах антитела меняот свои свойства. Поэтому крайне необходимо изучать иммуно-химические характеристики антител, ковалентно связанных с различными полчмерными носителями, и сравнивать их со свойствами антител в растворю.

Диссертационная работа выполнялась в соответствии с плановой темой ИБОХ АН Беларуси "Разработать научные основы иммуноферментного анализа для микроопределения сердечных гликозидов и других антигенов и создать иммуноферментные системы для определения сердечных гликозидов и прогестерона" (номер гос. регистрации 01860068356) и Государственными научно-техническими программами "Новейшие методы биоинженерии" и "Здоровье".

Цель работы. Целью работы было изучение реакции вэшпго-действия строфантина и его пероксидазного конъюгата со споци-

фичннми антителами в растворе и ковалентно связанными с различными полимерными носителями.

Положения, выносимые на защиту: количественная характеристика сорбционных свойств полисти-рольнод пробирок и полиамидных мембран и определение емкости химически активированных полистирольных шариков и модифицированных полиамидных мембран по отношению к г шуноглобулинам;

- получение и характеристика аффинных и иммунных сорбентов на основе этих матриц для их использования в иммуноферыентном анализе строфантина;

определение кинетических и равновесных параметров взаимодействия строфантина со специфичными антителами в растворе методом твердофазного иммуноферментного анализа;

- получение кинетических и равновесных характеристик взаимодействия строфантина и его пероксидазного конъюгата со специфичными антителами против строфантина, ковалентно связанными с активированными полистирольными шариками и модифицированными полиамидными мембоанами;

- разработка иммуноферментных тест-систем для определения строфантина на основе различных иммунных и аффинных сорбентов.

Научная новизна. В работе использованы модифицированные полимерные носители - активированные полиамидные мембраны и по-листирольные шарики и количественно охарактеризованы и" сорб-ционные свойства. Разработан способ получения имнуносорбента на основе активированных полиамидных мембран и _нтител против СТР. Использование полученных сорбентов позволило определить равновесные и кинетические параметры взаимодействия антигена с антителами, ковалентно связанными с активированными полимерными носителями. Проведено сравнение свойств иммобилизованных и растворенных антител. С использованием активированных носителей разработано 7 иммуноферментных тест-систем для определения строфантина.

Практическая значимость работы. Разработанные аналитические тест-системы для определения строфантина с использованием различных формованных полимерных носителей могут стать основой серийного производства наборов реагентов для иммуноферментного определения этого гликозида в биологических жидкостях. Отдельные компоненты разработанных тест-систем могут быть

использованы для ИМ других антигенов.

ИФА строфантина с использованием активированных полисти-рольных шариков и иммобилизованных на них вторых антител выбран для практического использования в клинической практике с целью мониторинга СТР при гликозидотерапии кардиологических больных. Оформлена вся научно-техническая документация на набор реактивов "ИФА-Строфантин-ПХ" для определения СТР в сыворотке крови.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены и представлены на 14-ом Менделеев-дом съезде по общей и прикладной химии (Ташкент, 1989), на 7-ой Ыеждународной конференции молодых ученых по органической химии и биохимии (Варна, 1990), на 2-ой Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва, 19эо), на 7-ом Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Носква, 19Э1).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5

статей, тезисы б докладов и получено авторское свидетельство СССР N 1789929.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из

введения, обзора литературы (I глава), экспериментальной части (4 главы) , выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена ка 162 страницах, включая 7 таблиц и 36 рисунков. Библиография - 131 название. В диссертации имеется приложение: 1 Шедико-технические требования к набору реактивов, утвержденные Мин. здравоохранения РБ; 2)Инструкция по применению набора реактивов для иммуноферментного определения строфантина в сыворотке крови человека; з)Технические условия на компоненты набора реактивов для иммуноферментного определения строфантина в сыворотке крови человека с использованием антигена, меченного пероксидазой, и иммуносорбента, содержащего антивидовые антитела.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ

Антисыворотку к строфантину получали иммунизацией кроликов конъвгатом бычьего сывороточного альбумина со строфантином (БСА-СТР). Очистку иммуноглобулинов проводили сульфатаммонийныи фракционированием. Аффинную очистку антител проводили, используя АН-агарозу с иммобилизованным на ней СТР.

Конъюгат пероксидаэы с иммуноглобулинами igG сыворотки крови человека (ПХ-igG) получали метаперйодатным способом (Nakane р.к., 1974). Соотношение (IKl/Iigo) « lti.

Конъюгат пероксидаэы о бараньими антителами, специфичными к igG кролика, <ПХ-ПАт) был предоставлен канд.биол.наук Карасевой Е.И. (ИБОХ АНБ.Минск). Мольное соотношение 1ПХ)>ШАт1 в конъюгате составляло 1«1.

Конъюгат пероксидаэы со строфантином (ПХ-СТР» содержал 3 молекулы строфантина на одну молекулу фермента.

Адсорбционные свойства полистирольных пробирок изучали, выдерживая конъюгат ПХ-igG в пробирках при разных температурах в течение различного времени. Аффинные и иммунные сорбенты на основе полистирольных пробирок СПСП-БСА-СТР, ГГП-АНТИ-СТР-1, -II и -III) получены путем их обработки глутаровым альдегидом (ГА). БСА и конъюгатами БСА со строфантином, а также полиэтиленимином.

Адсорбционные свойства полиамидных мембран (пленочные мембраны МИФИЛ типа "Х'апрон ПА-6" с диаметром пор 0,5 мкы) изучали, выдерживая их в растворе конъюгата ПХ-igG при разных температурах в течение различного времени. Количество адсорбированного на мембранах конъюгата ПХ-igG определяли 2-мя способами: 1 - по ходу адсорбции конъюгата отбирали аликвоты и определяли в них ферментативную активность несорбирс энного конъюгата; 2 - после сорбции конъюгата контактный раствор сливали, мембраны помещали в реакционную смесь и определяли ферментативную активность сорбированного на них конъюгата.

Иммуносорбенты на основе модифицированных полиамидных мембран и ковалентно связанных с ними антител против . строфантина С ПАЫ-АНТИ-СГР-I и -II) получали 2-мя способами. В первом случае окисленные металерйодатом натрия иммуноглобулины взаимодействовали с аминогруппами, находящимися на поверхности мембран. Во втором случае амминогруппы. находящиеся на поверхности мембран, взаимодействовали о ГА, а затем о иммуноглобулинами. Количество связавшегося о мембранами белка определяли методом Лоури.

Имнуносорбент на основе модифицированных полиамидных мембран и вторых антител (ПАМ-ПАт) получали также активируя мембраны ' ГА. '

Аффинный сорбент на основе активированных полистарольных шариков (производства фирмы "ШФИЛ", Минск) - ПСШ-БСА-СТР - получали, выдерживая шарики в растворе БСА в бикарбонатном буфере с рН 9,5, а затем помещали их в раствор строфантина,окисленного метаперйодатом.

Иммунные сорбенты на основе активированных полистарольных шариков (ПСШ-АНТИ-СГР и ПСШ-ПАт) получали, выдерживая шарики в растворах антител, специфичных к строфантину, и вторых антител в бикарбонатном буфере с рН 9,5. Количество связавшегося с шариками белка определяли методом Лоури. 1 шарик связывал о,011 мг антител или 9,73 ыкг/ м2.

Иммуноферментныэ анализы строфантина проводили, используя аффинный сорбент ПСП-БСА-СТР, иммунные сорбенты ПСП-АНТИ-СТР-1. -II и -III. ПАМ-АШП-СТР-1, ПШ-НАт и ГШ-НАт.

Для характеристики .взаимодействия растворенных антител со ртрофантином применяли метод твердофазного ИФА, используя аффинный сорбент ПСШ-БСА-СТР.

Для характеристики взаимодействия строфантина с антителами, иммобилизованными на ПАМ и ГШ, использовали иммунные сорбенты ПАЫ-АНТИ-СТР-11 и ПСШ-АНГИ-СТР.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ИШ5ИЛИЗАДОЯ ПЕРОКСИДАЗНЫХ К0НЫЭГАТ0В И АНТИТЕЛ НА

ПОЛИМЕРНЫХ НОСИТЕЛЯХ

Иммобилизация ПХ-1до на полистарольных пробирках.

Адсорбция конъюгата при температур» 20° проходит довольно быстро и уже через 2о мин достигаются максимальные значения количества адсорбированного конъюгата, составляющие 15 нЫ. Площадь сорбирующей геометрической поверхности ХЯ составляла 4,76 см .

При температурах 16, 20, 25, зо, 35 и 40° изучены зависимости концентрации адсорбированного на ПСП-1 (производства "Гамма" (ВНР)) и ПСП-2 (производства завода "Термопласт*Ч Минск)) конъюгата от его начальной концентрации в 0,1 и фосфатном буфере с рН 7,8. Во всех случаях характер зависимостей концентрации адсорбированного белка 1РВ1 от концентрации конъюгата в контактном растворе 1Р1 хорошо соответствует изотерме Лэнгмвра. Все полученные зависимости I рв 1 от 1Р1 проанализированы в рамках самой простой схемы.Предполагается, что при адсорбции конъюгата

образуетс: его комплекс с центрами связывания Г1СП-1 и ПСП-2 в соотношении 1:1, а сам процесс адсорбции является равновесным и подчиняется уравнению (1):

р + 0 , > РО (1),

где Р- - белок, О - активный центр адсорбента,ро - комплекс адсорбированного белка с активным центром. Изотерма адсорбции Лэнгыюра описывает связь концентрации пдсорбированного белка с его концентрацией в контактном растворе в виде гиперболической функции:

,р ). 'Ри'макс. (2)<

в к ♦ (р ]

где Iрц'макс>- максимальная концентрация адсорбированного белка,а к - константа диссоциации комплекса рй, измеряемая в М.

Зависимости к и '^'иакс от обратноЛ температуры показали,что оба параметра адсорбции обнаруживает тенденцию к увеличению с ростом температуры. Для адсорбента ПСП-1 можно оценить величину теплоты адсорбции и "активационный"* барьер для еличины 1РЕ(1мако (табл.2).

Температурный ход величин к и IрЕ1цак0 для двух адсорбентов отличается: для ПСП-2 не наблюдается линейной зависимости логарифмов этих величин от обратной температуры, что можно объяснить разной технологией изготовления пробирок из разного полистирола.

Иммобилизация ПХ-ХдС на полиамидных мембранах МНИЛ.

Процесс адсорбции конъюгата мембранами . происходит относительно медленно, так как максимальная концентрация сорбированного белка при 20° достигается через 90 мин. При температурах 11-40° изучены зависимости концентрации адсорбированного на мембранах конъюгата от его начальной концентрации в о,1 Ы фосфатном буфере с рН 6,6.

Зависимости концентрации адсорбированного белка Iр01 от его содержания в контактном растворе 1Р1 подчиняются уравнению Лэнгмюра.

При различных температурах в интервале и-4о°определены значения 1РгЛ,-„л > а также константы диссоциации комплексов р*

Ь МаКС»

- к1 (из данных, полученных по измерению ферментативной активности несорбированного конъюгата» и к2 (из данных, полученных измерением ферментативной активности

адсорбированного на мембранах конъюгата). Количественные характеристики адсорбции конъюгата мембранами представлены в таблице 1, из которой следует, что значения 1Рв'макс и константы диссоциации растут с температурой, что характерно для гидрофобных взаимодействий. Меньшие значения величины к2 по сравнение с к^ объясняются тем. что при адсорбции конъюгат теряет часть своей активности.

Таблица 1.

Количественные характеристики адсорбции конъюгата ПХ-1<эс на мембранах "МЖШ" при разных температурах.

Ы°С) '"в'макс.* 1°У'и кгх 10У,М к2х 109,Ы

11 3,30 а,!>о 1,54

25 7,69 47,60 6,10

30 9,10 52,60 8,70

36 16,70 55,60 8,93

40 25,00 66,70 9,98

Сравнение сорбционных свойств полимерных матриц. В табл.2 сравнены количественные характеристики адсорбции конъюгата ПХ-ТдС на полистирольных пробирках, нитроцеллюлозных мембранах и полиамидных мембранах "Ш4ИЛ". Из полученных данных следует, что мембраны "ШФИЯ" сорбируют белок в 17,2 раза больше , чем полистирольнке матрицы, и в 1,45 раза.больше, чем нитроцеллюлозные мембраны.

Обращает на себя внимание совпадение энергетических параметров, характеризующих адсорбцию ПХ-1дс на двух типах адсорбентов - полистирольных пробирках и полиамидных мембранах. Такое совпадение подтверждает одинаковую гидрофобную природу взаимодействия конъюгата с обеими полимерными матрицами.

Ковзлентное связывание АНТИ-СТР с активированными полиамидными мембранами. Нами разработан способ получения имму-носорбента на основе полиамидного носителя, включающий стадию перйодатного окисления антител к строфантину с последующим восстановлением образовавшихся конъюгатов с носителем боргидридом натрия, отличающийся тем, что полиамидные пленочные мембраны МИФИЛ из ' капрона с размером пор 0,2-0,4 мкм предварительно обрабатывали модифицирующей смесью триэтилентетрамина, дизтил-амино-2,3-эпоксипропана и ди-(2,Э-эпоксипропнлового) эфира в воде в весовом соотношении с сорбентом 1:2:2:). Модификация

-а-

мембран позволяет ввести в шх свободные аминогруппы.

Таблица 2

Количественные характеристики адсорбции коньюгатов иммуноглобулинов 1дс, человека с пероксидазой на полистирольных пробирках, нитроцеллюлозных мембранах и полиамидных мембранах.

Тип адсорбента Адсорбировано конъю-гата Геометр, площадь на одну молекулу (xiop, см Теплота адсорбции, ккал/Моль ''Актив аци-онный" барьер адсорбции, ккал/Моль

10"11Х , моль/см Ю12х моле s кул/см

Лолисти- рольные пробирки 0,09 0,54 16,5 21,0±1,0 11,0+1,5

Нитроцеллюлоз ные • мембраны с диам.пор 0,5-0,7МКМ 1,06 6,40 1,56 - -

Полиамидные мембраны 1,54 9,27 1,08 20,2+1,5 12,Oil,5

Ковалентное связывание антител с модифицированными полиамидными мембранами позволяет достичь плотности посадки антител, равной 107Д мкг/см2, в то время как физическая сорбция антител, меченных пероксидазой, на немодифицированных полиамидных мембранах с тем же диаметром пор позволяет сорбировать только 2,9 мкг/см2. т.е. модифицирование полиамидных мембран увеличивает их емкость по отношению к иммуноглобулинам в 36 раз. Эта разница еще больше при сравнении данного иммуносорбента с полистирольн ыми пробирками, максимальная емкость которых равна 0,17 мкг/см2.

Ковалентное связывание конъсгата БСА-СТР о активированными полистирольными шариками. Необходимую концентрацию БСА брали, исходя из известных данных о емкости полистирольных шариков по отношение к белку.

Оптимальная концентрация СТР была подобрана следующим образом. Готовили несколько аффинных сорбентов с разним содержанием СТР в контактном растворе) Ю~3» io~4jio~5)io~6jio~ и. Затем для каждого из полученных аффинных сорбентов изучали зависимость связывания АНТИ-СТР с сорбентом от разведения АНТИ-СТР в присутствии to~6M свободного СТР в растворе (серия В> и без

него (серия В0>. В результате был выбран аффинный сорбент, для которого разница между значениями В и В0 была максимальной.

Изучение сорбционных свойств полистирольных пробирок, полиамидных мембран и способности к ковалентному связывании белков о активированными полистирольными шариками и модифицированными полиамидными мембранами позволило получить формованные аффинные и иммунные сорбенты, которые в дальнейшем были использованы нами в иммуноферкентном анализе строфантина.

РАВНОВЕСНЫЕ И КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

СТРОФАНТИНА И ЕГО ПЕРОКСИДАЗНЫХ КОНЪЮГАТОВ С РАСТВОРЕННЬШ

И ИШЭБИЛИЗОВАННЫШ СПЕЦИФИЧЕСКИМИ АНТИТЕЛАШ.

Взаимодействие антиген-антитело в растворе. Для характеристики реакции растворенных антител со строфантином применяли схему I из трех стадий:

1. АНТИ-СТР ♦ СТР -» (АНТИ-СТР i СТР1 (в растворе)

2. АНТИ-СТР ♦ ПСЛ-БСА-СТР -- (ПСШ-БСА-СТР > АНТИ-СТР 1

(в осадке)

3. IПСШ-БСА-СТР: АНТИ-СТР 1 + ПХ-ПАт —» IПСШ-БСА-СТР: АНТИ-СТР: ¡ПХ-IIAt) (иммобилизованный иммунный комплекс)

Корректность характеристики взаимодействия СТР с АНТИ-СТР в растворе и на твердой матрице зависит от правильного выбора концентрации реагентов и времени их взаимодействия.

При фиксированном разведении АНТИ-СТР (liiooo) реакция с аффинным сорбентом ПСШ-БСА-СТР заканчивается (достигает равновесия) в течение 90-120 мин. Оптимальная концентрация конъюгата ПХ-IIAt при его взаимодействии с иммунокомплексом - 25 нМ.

Было выбрало время реакций АНТИ-СТР с ПСШ-БСА-СТР и иммунного комплекса (ПСШ-БСА-СТР : АНТИ-СТР1 о конъюгатом ПХ-IIAt, равное 20 мин. в связи i тем, что более продолжительное проведение обеих стадий процесса приводит к сдвигу равновесной- реакции взаимодействия антигена с антителом в растворе и, таким образом, искажает получаемую с помощь» непрямого elisa информацию. В условиях строго фиксированного времени второй и третьей стадий взаимодействия АНТИ-СТР с иммобилизованным антигеном (схема 1). равного 20 мин. и при концентрации конъвгата ПХ-IIAt (25 нШ. построена зависимость оптической плотности продукта пероксидазной реакции от концентрации АНТИ-СТР. представленной как обратное разведение.

Нехду л492 и концентрацией АНТИ-СТР сохраняется линейная связь до разведения сыворотки в 500 раз. В дальнейшей работе, как правило, использовали разведение АНТИ-СТР в 1000 раз. Из данной ,*радуировочной зависимости находили концентрации АНТИ-СТР в растворе, зная а492 для соответствующего иммунного комплекса на сорбенте.

Изучена кинетика изменения активности иммунных комплексов (в единицах оптической плотности продукта реакции), соответствующая убывающей концентрации АНТИ-СТР в растворе в присутствии свободного СТР в начальной концентрации 5 нМ. Равновесная концентрация АНТИ-СТР достигается через 20 мин, после чего наблюдается увеличение содержания АНТИ-СТР в растворе, связанное со сдвигом равновесия при взаимодействии антигена с антителами. Используя градуировочную зависимость меаду а492 и концентрацией АНТИ-СТР , можно для каждого момента времени вычислить значеьия с - концентрации АНТИ-СТР в растворе, cß- концентрацию АНТИ-СТР после достижения равновесия (то есть для 2л мин реакции) и с - концентраций антител, связавшихся с иммобилизованным антигеном в отсутствие свободного СТР. Из зависимости "int(с -се>/со) - время" может быть вычислена эффективная константа скорости первого порядка убыли антител из раствора. Делением этой величины на начальную концентрацию растворенного антигена (5 нШ получаем кс ютанту скорости взаимодействия СТР о АНТИ-СТР.

Для определения среднечисловой константы диссоциации комплексов строфантина о антителами в растворе получена зависимость активности иммунных комплексов на сорбенте ПСШ-БСА-СГР от концентрации СТР в растворе. Из трансформации этой зависимости в координатах "ао/ао- а) - l/cCTPl" по методу (Ким Б.Б. ,19691 вычислена константа диссоциации иммунного комплекса (рис.1) Обратная величина ка дает значение константы ассоциации антител со строфантином. Таким образом, используя непрямой метод elisa, небольшим числом экспериментов можно определить равновесные и кинетические параметры взаимодействия СТР с АНТИ-СТР (табл. 3).

Взаимодействие антигена с антителами на полистирольных

шариках. Для характеристики взаимодействия строфантина с антителами,иммобилизованными на ГЕШ. использовали схему II из двух стадий:

Ао

Ae-A

РисЛ.Зависимость Ао/(Ао~ А) от обратной концентрации строфантина, где Ао~ активность ишунных комплексов в отсутствие СТР и А - активность иммунных комплексов при разных концентрациях СТР

1, ПСШ-АНТИ-СТР ♦ СТР -» 1ПСШ-АНТИ-СТР ; СГР1

2. ПСТ-АНТИ-СТР ♦ ПХ-СТР -► I ПСШ-АНТИ-СТР : ПХ-СТР1

Из зависимости в координатах Сгатчарда "(в/и) - в" (scatchard с.,19491 определяли значение константы ассоциации иммобилизованных антител с конъюгатом ПХ-СТР.

Iii кинетических кривых изменения каталитической активности иммунных комплексов на сорбенте и растворенного конъюгата ПХ-СТР в процессе его взаимодействия с иммуносорбентом ПСШ-АНТИ-СТР можно для каждого момента времени вычислить значения концентраций связавшегося с сорбентом конгюгата «в» и свободного конъюгата (и». Зная эти концентрации, можно представить кинетическую кривую расходования конъюгата ПХ-СТР при его взаимодействии с иммуносорбентом в виде ее полулогарифмической анаморфозы в координатах "inttce-c)/ce) -время" , где се~ концентрация ПХ-СТР, связавшегося с сорбентом при достижении равновесия, и с - концентрация ПХ-СТР, связавшегося с сорбентом в определенное время. Была получена эффективная константа скорости расходования конгюгата Ьдфф.. Зная исходную концентрацию конъюгата (5 нЮ, можно получить абсолютное значение константы скорости взаимодействия ПХ-СТР с иммуносорбентом ПСШ-АНТИ-СТР - к1. Изпользуя значения ка и легко вычислить константу скорости k.j- k]/Ka«

Мз серии экспериментов по влиянию свободного СТР в разных концентрациях на активность иммунных комплексов на сорбенте ПСШ-АНТИ-СТР построена зависимость в координатах "л /СА - А) -1/1СТР1", из которой определена среднечисловая константа диссоциации комплексов СПСШ-АНГИ-СТР :. СТР1. Ш зависимости Сютчарда в координатах "<в/и> - в" вычисляли константу ассоциации СТР о иммуносорбентом ПСШ-АНТИ-СГР.

Взаимодействие антигена о антителами на полиамидных мембранах. Изучение взаимодействия конъюгата ПХ-СТР и свободного СТР с иммуносорбентом ШМ-АНГИ-СТР-П проводили по той же схеме, что и с сорбентом ПСШ-АНТИ-СТР, изменив некоторые временные и концентрационные параметры.

Все полученные равновесные и кинетические параметры при взаимодействии СТР и его коныогата ПХ-СТР со специфическими антителами в растворе и в иммобилизованном состоянии на двух типах матриц (ПСШ и ПАЮ для сравнения сведены в табл.3.

В первую очередь необходимо обсудить соответствие констант ассоциации, определенных экспериментально методом Скзтчарда , и вычисленных из констант диссоциации к^, определенных с использованием метода твердофазного ИФА. Во всех случаях константы довольно близки между собой. Учитывая среднечисловой характер к^ и ошибки в определении ка по Скэтчарду, полученное соответствие констант можно считать удовлетворительным.

Обсуждая кинетические параметры, следует отметить, что значения к1 хорошо соответствуют реальной природе реагирующих частиц и условий их реакций: действительно, максимальная коасганта скорости получена для взаимодействия СТР с антителами в растворе ; константы скорости взаимодействия конъюгата ПХ-СТР с иммуиосорбентами ниже соответствующих значений констант скорости взаимодействия немеченного СТР с теми же иммунными сорбентами; близки меаду собой константы скорости взаимодействия СТР с обоими иымуносорбентаыи ; в неплохом соответствии находятся также константы скорости взаимодействия ПХ-СТР с обоими иммуносорбентами (табл.3).

Следует отметить, что сродство конъюгата ПХ-СТР к обоим нммуносорбентаы сук|ественно вкше, чем сродство С1Р к тем же сорбентам. Это объясняется поливалентностью конъюгата ПХ-СТР. котормй чаще всего содержит 3 молекулы СТР на одну молекулу

фермента, а также возможной ролью гидрофобных взаимодействий ферментной метки с иммунным сорбентом, которая исклечается в случае немеченногс СТР.

Полученные нами значения констант скорости диссоциации иммунных комплексов СТР и его конъюгата также хорошо отражают природу этих комплексов и их окружения. Максимальное значение получено для константы скорости диссоциации иммунного комплекса СТР с АНТИ-СТР в растворе. Иммунные комплексы СТР и особенно его конъюгатов с пероксидазой на сорбентах диссоциируют с суще твенно более низкими скоростями (табл.з), чем в буферном растворе, что отражает их большую устойчивость и соответствует более высоким значениям ка этих комплексов на иммуносорбентах.

Таблица 3.

Равновесные и кинетические параметры взаимодействия строфантина и его пероксидазного конъюгата со специфическими антителами в растворе и иммобилизованном состоянии на полистирольпых шариках и полиамидных мембранах.

С.тгема ю"9к a' lohml m~5kj, lO^kj

и U'1 с"1 u-V1 о"1

АНТИ-СТР: 1Л Р в " растворе 10,60 0,94* 72,60 14,52 15,40

ПСШ-АНТИ-СТР: ПХ-СТР 1,87х (5 3il,6) 7,62 1,52 0,28

ПСШ-АНТИ-СТР: СТРХХ 12,75 (1 lto, 4) ; о ,78 ' - - -

ШШ-АНТИ-СТР: СТРХХХ 2,65 (4 010,6 ) ; 3 ,77х 24, 60 4,92 1,12

ПАМ-АНШ-СГР: ПХ-СТР 1,78* (5 6«1,0) 3,51 0,35 0,06

ПАЫ-АНТИ-СТР:

рррХХХХ 5,60 (1 0i0,2) ; 1 ,79х - - -

ПАМ-АНТИ-СТР: СТР х х х 7,80 (0 9 + 0,1 ) ; 1 ,28х 18,30 3,66 4,16

* - значения Kj или к вычисленные из К^~или к^, соответственно хх - в; мя реакции ПХ-СТР -1ч

ххх - время реакции ПХ-СТР - 20 мин хххх - время реакции ПХ-СТР -2 ч.

Очень существс шо, что время проведения одной ira стадий процесса взаимодействия антигена с антителами - реакции конъюгата ПХ-СТР с иммуносорбентами - сказывается на значениях экспериментально определяемых констант ка и Различие

констант особенно заметно для комплекса 1ПП-МГП1-СГР : CTPI,

где оно составляет 4-5 раз, и менее существенно для иммунокомплекса [ПАМ-АНТИ-СТР-П : СТР] (го-зох). Уменьшение продолжительности взаимодействия конъюгата ГК-СТР с антителами в растворе или на твердой матрице спосо<5ствует снижению сдвига равновесия в процессе образования иммунокомплексов. Поэтому более корректными являются те значения констант Кп и к^, которые получены в экспериментах, где выявление иммунокомт пенсов конъюгатом ГК-СТР проводится в кинетическом режиме (т.е. в течение го мин, а не одного-двух часов).

Проведенная работа показала необходимость тщательной оптимизации условий взаимодействия СТР с иммунным сорбентом, а также корректность метода твердофазного иммуноферментного анализа для получения количественных характеристик процесса взаимодействия антигенов с поликлоналъными антителами.

ИЧМУНОФЕРЫЕНТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРОФАНТИНА В БУФЕРНОМ РАСТВОРЕ И СЫВОРОТКЕ КРОБИ. И?А стро^ячтина с использованием полистиролъных пробирок, несущих антитела. В данном разделе дана сравнительная характеристика способов определения СТР с применением полисти-рольных матриц (пробирок), обработанных разными способами -глутаровым альдегидом, бычьим сывсхэточныы альбумином, конъюга-тами БСА-СТР, а также полиэтиленимином и разными комбинациями перечисленных агентог.

Для предотвращения неспецифического взаимодействия белковых компонентов тест-систем с твердой матрицей пробирки обрабатывали БСА и о.оэх Твином го.

Оптимальное разведение АНТИ-СТР - 1;гоо. Найдено оптимальное время взаимодействия полистирольной патрицы, обработанной о.гх-ннм ГА, с АНТИ-СТР , которое составило 4 ч, а также оптимальное время взаимодействия АНТИ-СТР с ПХ-СТР (10 ни), которое составило 16 ч.

Для проведения ИФА строфантина использовали две различные схемы анализа. В соответствие с первой схемой применяется аффинный сорбент ПСП-БСА-СТР. Была построена калибровочная зависимость в координатах "оптическая плотность иммунных комплексов С л) - логарифм концентрации строфантина в пробе". Использованная схема анализа позволяет определить строфантин в интервале концентраций 10"в-10-3М.

Вторая схема ИФА представляет собой конкурентный способ твердофазного определения СТР с иммобилизованными антителами. Анализ по второй \.леме обеспечивает определение СТР в интервале концентраций ю*°-]о~3М.

Лучшим оказался анализ с использованием иммуносорбента ПСП-АНТИ-СТР-1II, т. к. предварительная обработка пробирок полиэтиленимином позволила сократить время анализа до 4 ч.

ИФА строфантина с использованием специфичных к строфантину антител. иммобилизованных на активированных полна;,шдных мембранах ЩФИЛ. При проведении ИФА с использованием данных мембран для уменьшения неспецифической сорбции пероксидазных конъюгатов использовали одноразовую промывку о,5* раствором Тритона Х-юо в течение 1,5 ч.

Оптимальное время взаимодействия конъюгата ПХ-СТР с антителами на сорбенте - г ч. Получены калибровочные зависимости для ИФА строфантина в интервале его к. ''ентраций ю~9-ю~6М. Предложенный метод имеет высокую чув<л ^ительность, хорошую сходимость и воспроизводимость. Продолжительность анализа составляет около з ч.

ИФА строфантина с использованием вторых антител, иммобилизованных на активированных полиамидных мембранах МММ. При разработке ИФА специфичные к

строфантину антитела использовали в вид'- иммуноглобулиновой фракции антисыворотки и после аффинной счистки.

Для сравнения осажденных сульфатом аммония и аффинноочищенных антител определяли константы их ассоциации с коньюгатом Ш-СТР (ю"10-10 М) по методу Скэтчарда, равные 7,5хю10 и 7.0ХЮ9 Ы"1 соответственно, т.е. сродство антител к антигену после аффинной очистки снизилось на порядок.

При совместной инкубации иммуносорбента и ПХ-СТР в присутствии 0,5* Тритона Х-юо и последующей промывки сорбента раствором Тритона Х-юо <о,1х> неспецифическая сорбция снижается на эвх.

Равновесная • онцентрация иммунокомплексов на сорбенте достигается в течение 1 ч. Определены оптимальные разведения иммуноглобулиновой фракции - в 24оо раз и очищенных антител - в 1500 раз.

Из калибровочных зависимостей (рис.г) ридно, "то качество

анализа улучшается в присутствии неспецифической сыворотки

взаимодействием белков сыворотки с вакантными местами иммуносорбента, что предотвращает неспецифическое связывание 0 матрицей других белков анализата (ПХ-СТР, АНТИ-СТН и, таким образом, улучшает определение строфантина.

Разработанный наш №>А строфантина продолжается около 5 час. Метод позволяет определять концентрации строфантина в сыворотке крови в интервале Ю~9-10~бЫ.

ПФА строфантина с использованием вторых антител, иммобилизованных на активированных полистирольных шариках. Равновесная концентрация иммунокомплекса при оптимальном разведении АНТИ-СТР в 2000 раз достигается за 40-60

Рис. ¿2. калиоровочные зависимости для определения с использованием иммунного сорбента ПАМ-ПАт и иммуноглобулиновой фракции антисыворотки: I- определение в среде ЗФР, содержащего 0,5% Тритона Х-100} 2- определение л присутствии 20% неспецифической сыворотки и 0,5% Тритона Х-100; 3- определение в присутствии нест, ..'цинической сыворотки.

Рис. 3. Калибровочная зависимость для иммуноферментного определения СГР в сыворотке крови человека с использованием иммунного сорбента ПСШ-Г1Ат.

¡^специфическое связывание вторых антител с ГШ снимали использованием при синтезе иммуносорбента ПСШ-ПАт раствора, который содержал оптимальные концентрации мягких детергентов -Тритона Х-юо и дезоксихолата натрия. Неспецифическое взаимодействие первых антител АНТИ-ОТР с иммуносорбентом

крови. Это объясняется благоприятным для анализа

0.5 О А 0,3 0,2 0,1

мин

ПСШ-ПАт снимали проведением этого процесса в среде ЗФР, содержавшего оптимальную концентрацию Тритона Х-юо С г, 5*). В таких же условиях проводили выявление иымунокомллексов на сорбенте при их реакции с ПХ-СТР.

На рис.3 показана типичная калибровочная зависимость для иммуноферментного определения строфантина в интервале его концентраций 10"9-ю"5М. Предложенный нами метод определения СТР отличается высокой чувствительностью. хоропей сходимостью и воспроизводимость*> /результатов. Анализ длится около 2,5 час.

ВЫВОДЫ

1. Получены количественные сорбционные характеристики полистирольных пробирок и полиамидных мембран по отношению к конъюгату иммуноглобулина Где человека с пероксидазой. Определены максимальные концентрации адсорбированного на носителях конъюгата иммуноглобулинов с пероксидазой и константы диссоциации его комплексов с данными адсорбентами в интервале температур 16-40°.

2. На основе полистирольных пробирок и сорбированных на них конгюгатов БСА-строфантин и антител, специфичных к строфантину, получен аффинный сорбент и иммуносорбенты, использованные в иммуноферментном анализе строфантина.

3. Разработан способ получения иммуносорбента для ИФА строфантина на с-'нове модифицированных полиамидных мембран с введенными в них свободными аминогруппами и ковалентно иммобилизованных на матрице антител против строфантина. Способ защищен авторским свидетельством.

4. Получены иммунные сорбенты с высокой емкостью на основе модифицированных полиамидных мембран и активированных полистирольных шариков и ковалентно связанных о ними вторых (антивидовых) антител, использованные для ИФА строфантина.

На основе активированных полистирольных шариков и ковалентно связанного с ними конъюгата БСА-строфантин получен аффинный сорбент, использованный в твердофазном иммуноферментном анализе.

5. Методом твердофазного ИФА изучено взаимодействие строфантина и его пероксидазного конъюгата со специфичными антителами в растворе и после их ковалентной иммобилизации на

активированных полистирольных шариках и кодифицированных полиамидных мембранах. Получены константы диссоциации комплексов строфантина с растворенными и иммобилизованными антителами (к(1>, сопоставленные с константами ассоциации Ка, вычисленными по методу Скэтчарда.

6. Методом твердофазного ИФА определены константы скорости взаимодействия строфантина и его пероксидазного конъюгата с растворенными и иммобилизованными на полимерных материалах специфичными антителами.

7. Проведено сравнение иммунореактивности растворенных и ковалентно связаннн.. с полимерными носителями антител против строфантина.

8. Разработано 7 иммуноферментных тест-систем для определения строфантина с использованием формованных полимерных носителей антител - полистирольных пробирок, модифицированных полиамидных мембран и активированных полистирольных шариков.

О. Метод ИФА с использованием активированных полистирольных шариков и иммобилизованных на них вторых (антивидовнх) антител позволяет определить ю-9- ю~5М строфантина в сыворотке крови человека и отличается экспрессностью и удобством. На его основе создан набор реактивов "ИФА-строфантин-ПХ" для определения строфантина и подготовлена соответствующая научно-техническая документация.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Тарун Е. И., Савенкова Ы. И., Метелица Д. И. Адсорбционные свой ства полистирольных матриц по отношению к иммуноглобулинам человека /УЖурн. прикл. химли. 1989, Т. 62, N 10, С. 2293-2297.

2. Тарун Е. И., Савенкова М. И. Иммуноферментные аналитические системы для определения строфантина с применением пероксида-зы и полистирольных матриц // Тез. докл. 14 Уендел. съезда по общ. и прикл. химии. Ташкент, 1989, С. 494.

3. Тарун ЕЛ!.. Савенкова li.lL, Метелица Д. И. Иммуноферментные ' аналитические системы для определения строфантина с применением пероксидазы и полистирольных матриц //Хим. - фарм. журн., 1990, Т.24, N I. С. 81-84.

4. Тарун Е.И., Савенкова 11.И., Метелица Д.И.. Артамонов В.А., Баран Г.Ы. Адсорбционные свойства мембран "МЙШ" по

отношению к иммуноглобулинам человека //Яурн.прикл. химии, 1990, Т.63, N II, С.2209-2215.

5. Tarun E.I., Savenkova M. I. The comparison of human IgO agsorption on polymer solid matrices used In enzyme immunosorbent assays //7 Internat. conference of young sclent, on organic and biological chemistry, Varna, 1990, P.115.

for strrvphanthin К determination using varius immunosorbents and affinity carriers //7 Internet, confer, of young scient. on organic and biological chemistry, Varna, 1990, P.122.

7. Тарун E. И., Савенкова IL И., Метелица Д. И. Разработка и сравнение ИФА-систем для определения строфантиана К с использованием иммунных и аффинных сорбентов //Тез. докл. II Всесоюз. конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов", Москва, 1990, С.130.

8. Тарун Е.И., Савенкова U. И. Разработка и сравнение ИФА-систем для определения строфантина К с использованием иммунных и аффинных сорбентов //Тез. докл. 7 Всесоюз.симпозиума "Инженерная знзимология", Москва, 1091. С.131.

9. Тарун Е. И., Савенкова И. И., 11етелица Д. И. Определение строфантина К иммуноферментным методом с использованием антител, иммобилизог шных на полиамидных мембранах //Яурн. аналит.химии. 1992, Т.47. Вып.2. С.372-378.

10. Тарун Е. И., '"•авенкова М. И., Метелица Д. И. Определение строфантина К иммуноферментным методом с использованием антител, иммобилизованных на активированных полистирольных шариках //Журн.анал.химии, 1993, Т.48. N I, С. 145-149.

11.Tarun E.I., Savenkova М.I., Motelitza D.I. The interaction of solubilized and immobilized specific antibodies with strophantin К and its peroxidase conjugate //Sixth European congress on biotechnology.Firenze, 13-17 June 1993. Abstract books. V.4.P.TB 321.

12.Метелица Д.И., Савенкова Ы.И., Тарун Е.И., Артамонов В.А., Грачек В. И., Демко Н. В. Способ получения иммуносорбента для иммуноферментного анализа строфантина К //Авт.свид. СССР N 1789929. МКИ G 01 N 33/535, С 08 J 7/12.

и