Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетика и механизм ограниченного ферментативного гидролиза белков и термодинамические свойства его продуктов в системах белок-вода и белок-вода-полисахарид

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Кинетика и механизм ограниченного ферментативного гидролиза белков и термодинамические свойства его продуктов в системах белок-вода и белок-вода-полисахарид"

РГ Б ОД

- 8 МАЙ

Государственный Комитет Российской Федерации по высшему образованно

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ПИ1ЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ

На правах рукописи

Богомолов Андрей Артемьевич

УДК 577.152.34.

ХИНКТИКА И МЕХАНИЗМ ОГРАНИЧЕННОГО ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА БЕЛКОВ И ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЕГО ПРОДУКТОВ В СИСТЕМАХ БЕЛОК-ВОДА И БВЛОК-ВОДА-ПОЛИСАХАРИД

03.00.04 - биохимии

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1893

Работа выполнена на кафедре биохимии, пищевой химии и технологии ВМС Московской Государственной Академии прикладной биотехнологии и в лаборатории структурирования пищевых систем Института пищевых веществ Российской Академии иаук.

Научный руководитель - действительный член АЕН РФ,

доктор химических наук, профессор Розанцев Эдуард Григорьевич.

Научный консультант - научный сотрудник ИПВ РАИ,

Дэниленко Анатолий Николаевич.

Официальные оппоненты - д.б.н., профессор Попов Михаил

Петрович - к.х.н., с.н.с. Воробьев Михаил Михайлович

Ведущая организация - .Щ7} кафедра энвимологии

Защита состоится " " ¿¿/ч&Аг*?" 1893 г. ь часов на

заседании Специализированного Совета К.063151.08 по биологическим наукам Московской Государственной Академии Пищевых Производств (адрес - 1250В0, Москва, Волоколамское шоссе 11).

С диссертацией молно ознакомиться в библиотеке Академии. Автореферат разослан "_" __ 1893 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

Т.Г.Генералова ,

ПЩЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЛКПТЫ-

»«туяннт-тк npr>««cwvi Переработка смесей биополимеров (белков и полисахаридов) в пищевые продукты производится в разных фазовых состояниях. Фазовое состояние системы определяется термодинамической совместимостью компонентов. В зависимости от состояния исходной системы получают продукты с различными свойствами [Толстогузов.В.Б.,1987]. Управление фазовым состоянием систем и их составом является определяющим для получения продуктов с заданными свойствами. Один из путей регулирования состояния и состава фаз состоит в ограниченном ферментативном гидролизе (ОФГ) макрокомпонентов смесевых систем, в частности белков.

Игвестно, что белки могут гидролизоваться Ферментами по двум механизмам кооперативному (оле-Ьу-оле) и некооперативному.

{zipper}. В первом случае, ОФГ может быть использован для получения гидролизатов белка, а во втором - для модификации бечка (изменения Физико-химических свойств макрокомпонента).

Основной акцент в представленнной работе сделан на изучение термодинамических . свойств Продуктов ОФГ белка, определяющих его отношение как к растворителю, так и его способность к взаимодействию с другими компонентами раствора.

В настоящее время в литературе практически отсутствуют данные о термодинамических свойствах продуктов ОФГ белков.' В то хе время, ОФГ является одним из главных метаболических процессов происходящих в живых клетках и широко используемый в пищевых технологиях. ^Научная и практическая важность нашего исследования термодинамических свойств и состава продуктов ОФГ обусловлена необходимостью прогнозирования их способности к взаимодействию (комплексообразование. Фазовое расслоение) с ■ другими макронолекулярными компонентами системы. Направление' данного исследования -также позволяет получать информацию о структуре биополимеров.

Цежь работы - исследовать кинетику и механизм ОФГ, а также термодинамические свойства продуктов ОФГ белков в двух- и трехкомпонентных системах:

Вяучняя нппичил и прдгтии-»г»яи цпишнпч. pafiriTu:

I'. Показано, что гидролиз легумина кормовых бобов <Vicia faba L.) трипсином реализуется по смешанному типу. На начальных этапах механизм гидролиза предпочтительно носит некооперативный характер, а на более поздних - кооперативный характер. Смешанный тип гидролиза .был характерен как для двухкомпонентной (легумин-вода), так и для трехкомпонентной (легумин-вода-фиколл) систем.

2. Ферментативное отщепление от молекулы легумина пептидов расположенных в неупорядоченных областях молекулы белка приводит к возрастанию удельной энтальпии денатурации остаточного (модифицированного) легумина, что является свидетельством дестабияизуруищего влияния неупорядоченных областей на структурные доменны белка.

3. Определены термодинамические параметры взаимодействия легумина и ферментативно модифицированного легумина в разбавленных растворах системы белок-вода-фиколл с ее компонентами. Полученные термодинамические данные о свойствах разбавленных растворов позволяют предсказать фазовые состояния исследованных систем. Предсказано, что система легумин-вода-фиколл при определенных концентрациях макрокомпонентов двухфазна, а система модифицированный легумин-вода-фиколл однофазна, во всем диапазоне концентраций макрокомпонентов.

4. Гидролиз рибулозо-1,5бисфосфаткарбоксилазы (РБФК) (Hedicago sativa Z.) трипсином и собственной протеазой реализуется по кооперативному механизму. Механизм гидролиза FB4>K в системах белок-вода, и белок-вода-пектин одинаков.

5. Показано, что константа скорости гидролиза РБФК в двухфазной системе, по-сравнению с однофазной - возрастает, так как ингибирующий эффект Фермента пептидами снимается, за счет их переноса из белковой в полисахаридиую фазу (более высокое термодинамическое сродство пептидов к полиегхаридной фазе)..

6. Образование водорастворимых комплексов бедка с пектином приводит к снижению константы скорости' гидролиза (первого порядка) за счет уменьшения количества пептидных связей доступных ферментагивной атаке.

7. Результаты исследования облегчают получение гидролизатов белков с заданными Функциональными свойствами.

дпрг>кяция ря fin-ru Материалы диссертации докладывались на Всесоюзных конференциях "Химические превращения шщерых полимеров" (1991 Светлогорск), и "Итоги и перспективы использования природных и синтетических ВМС в производстве пищи" (1991 Суздаль), а также на 4-ом Международном симпозиуме nu пищевым белкам "Взаимосвязь структуры и свойств" (1892 Берлин).

пук»м«яции По материалам диссертации опубликовано 7 работ, 2 работы находятся в печати. ( 4 тезиса и 3 статьи, 1 статья и 1 тезисы в печати).

Г!тру»туря и пКтду рякпти Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (объекты и методы исследования,- результаты и их обсуждение), выводов и списка литературы (99 наименований). Работа изложена на 85 страницах, содержит 13 рисунков и 4 таблицы. В обзоре литературы изложены основные представлбния о кинетике и механизме ферментативного гидролиза белков в двух- и трехкомпонентных системах, а также термодинамических свойствах последних.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Легумин кормовых бобов - типичный представитель класса легуминов - запасных белков бобовых и масличных культур выделяли из семян ( Vicia faba L.) сорта "Орловский" по известной методике [Даниленко А.Н. с соавт.,1986] о использованием поинципа избирательной термической денатурации • примесных белков. Гомогенность препарата . по данным ВЭЖХ составила 95%.

Рибулозо-1,5-бисфосфаткар6оксилазу (РБФК) Е.4.1 1.за

выделяли из листьев люцерны (fiedicago sativa L.) сорта "Вега" по методике tfoguchi.H.et al.,1978], основанной на дробном осаждении белха из сока листьев сульфатом аммония (NH4)2S04 с последующей хроматографической очисткой. Гомогенность препарата белка по данным скоростноь седиментации составила 91%.

Для гидролиза балка применяли препарат трипсина "Spofa" (Чехословакия) 0.26 ед/гч Гидролиз 20%-ных растворов легумина проводили прй 25°С в На-фосфатном буфере (рИ 7.6) с ионной силой 0.1 при различных значениях E/S. Гидролиз РВФК проводили при концентрации- белка в. системах 0.5-1.5Х, температуре 37°С в Na-фосфатном буфере (рН 7.8); ионная сила 0.01 и 0.1; Фермент субстратном отношении (E/S) = 1/50.

Скорость гидролиза белков определяли методом

высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭХХ) на хроматографе "ßilson" (Франция). Обработку хроматограмм проводили при помощи интегратора Фирмы "Gilson" (Франция).

Контроль амнннного азота на- всех стадиях реакции ОФГ системы РБФК-вода-пектин» осуществляли колориметрически по методу fAdler Hissen J., 1878J, с 2,4,6-тринитробензолсульфокислотой (ТНБС). Предварительно, суспензию макрокомпонентов двухфазной системы РБФК-вода-пектин центрифугировали при 4000g в течение 2Q мин для разделения на Фазы белка и полисахарида.

Препаративное выделение нативных и частично гидролизованнш: белков (высокомолекулярный компонент продуктов гидролиза), для микрокалориметрических исследований осуществляли методом гель-хроматографии.

Микрокалориметрические исследования Белковых растворов выполняли на дифференциальном адиабатном сканирующем микрокалориметре ДАСМ-1 (НПО "Биоприбор" РАН, Пуцино, Россия) в интервале температур 10-100<=С при скорости сканирования 2 С/мин и избыточном давлении 1 бар.

Фазовое состояние системы белок-вода-полисахарнд

контролировалось методами центрифугирования и микроскопии. Б случае системы легумин-фиколл, условие устойчивости к диффузии контролировалось методом светорассеивания.

В работе использовали ступенчатую систему электрофореза, по Лэммли, для характеристики продуктов ферментативного гидролиза белков. .

Концентрацию белков в растворах определяли микробиуретовым методом с использованием калибровочной кривой построенной для БСА (Минск, Белорусия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЙ.

1. Кннртикл н мпханкян фермпнтлтиннпгп гндрщаяя Врлкпп п . дпухкомппнпнпшх сиптвкдх SaiflK-ВПДД.

1.1. Кинетика и механизм гидролиза легумина из кормовых-бобов и РБФК из листьев лрцерны трипсином.

Мо/М+

0.3

10" в, с-1

о О-О-"

300

г, мин

. 100

200

Г,мин

200 7>ин

Рис.1. Зависимость относительного изменения содержания белка от времени гидролиза трипсином, для легумина 0.1 II фосфатный буфер рН 7.6, Ь-2Ь"С. (а-г); для рибулозо-1,ббисфосфаткарбоксижазы 0.01 И фосфатный буфер рН 7.6, 1~37°С <д). Весовое фермент субстратное отношение (Е/8): а)1/1000; Ь)1/200; 8)1/100; г)1/40; д)1/50. Со -начальная весовая концентрация легумина и Се - весовая концентрация модифицированного легумина при вренеии I: Ко и И» -молекулярные массы соответственно.

я

И

Л. шсс ц

5

Ъ'

ШН

жа

5Н2

«¿3

ь

ЭВЯЙ

ьхз

Рис. 2. Схема электрофореза в денатурирующих условиях, по Дэмнли: натйвного штрек А и модифицированного яегумина трипсином - штреки (К'Д), при В/3=1/200 (а) а 1/40 (6). Продолжительность гидролиза: Б-1 мин., В-10 мин., Г-1 ч., Д-24 ч.

На рис.1 приведены зависимости лог£рифма относительного изменения массового- количества РБФК и легумина (Р/Р') от времени гидролиза трипсином. Для легумина зависимость Ln Р/Р' от времени, на начальном этапе гидролиза (50 мин) нелинейна, поскольку в этом случае механизм гидролиза, по-видимому, некооперативный, и определяется последовательностью реакций с бистро убывающими константами 1Bupley,J.А,,1967]. На бол&е поздних этапа* гидролиза легумина, зависимость линелизуется, что может свидетельствовать о кооперативном характере механизма гидролиза белка. Характерным признаком некооперативного механизма гидролиза является наличие в гидролизата промежуточных продуктов. Данные ДДС-Na электрофореза (рис.2) свидетельствуют о том, что они в гидролизате легумина присутствуют. Однако, массовая концентрация легумина в процессе гидролиза снижается быстрее, чем его молярная концентрация, особенно на начальном этапе (рис.3). Это свидетельствует о смешанном характере гидролиза, причем на начальном этапе гидролиз легумина предпочтительно идет по некооперативному механизму, а на более поздуих - по кооперативному механизму. Это дает основание полагать, что изменение условий проведения гидролиза, например, соотношения E/S может приводить к перераспределению констант скоростей ферментативной реакции протекающих по кооперативному и некооперативному механизмам. Или другими словами получению продуктов с различными физико-химическими свойствами.

Рис. 3. Изменение молекулярной массы белков в процессе гидролиза трипсином по данным хроматографии (колонка

TSK-C-400Q SWG, скорость элюции 0.5 мл/мин, 0.1 М фосфатный буфер, pH 7.S): 1) легумина E/S=l/200; 2) РБФК E/S=l/50.'

К мин

Приведение на рисЛ(а-г) зависимости логарифма относительного уменьшения содержания белка в гидролизате от времена гидролиза при различных значениях E/S (1/1000, 1/200, 1/100, 1/40) свидетельствуют, что после определенного времени гидролиза эти зависимости динелизуются и имеют различный наклон, т.ё. различные константы гидролиза. 'Константы гидролиза (к) при различных B/S отношениях приведаны на рис.1. Видно, что к при E/S =1/40 на порядок выве, чем при других E/S соотношениях или другими словами не пропорциональна возрастанию концентрации Е. Эго может свидетельствовать о перераспределении коНстант скоростей гидролиза по некооперативному и кооперативному механизмам. Подтверждением этого положения могут служить электрофоретические исследования полученны:: гидролизатов при соотношениях E/S=l/40 и 1/?00 при одинаковой степени гидролиза (рис.2). Действительно, из этих данных следует, что состав гидролизатов различается, что подтверждает выше сделанное предложение.

Расскотрии данные по гидролизу РБФК. Зависимость In Р/Р' для данного белка линейка на всём протяжении гидролиза, что позволяет отнести гидролиз белка к 'реакциям первого -порядка. На этсм основании можно считать, что РБФК гидролизуется по кооперативному механизму. Этот вывод коррелирует с данными ДДС-h'a электрофореза гидролизатов РБФЯ, так как в процессе гидролиза РБФК на всех стадиях процесса отсутствуют npoiэжуточные продукты.

Таким образом, гидролиз легумина реализуется по смешанному типу включающему кооперативный и некооперативный механизмы, а РБФК исключительно по кооперативному механизму.

1.2. Взаимосвязь механизма ферментативного гидролиза и термодинамических .свойств продуктов гидролиза со структурной организацией белков.

•Яэгумин и РБФК относятся к белкам имеющим сложную четвертичную структуру. Легумин кормовых боСов состоит из 12 полипептидных цепей - 6-cf (больших) и B-J) (малых) [Pliets.P.et el., 1987], причем часть (~1/3) cf- полипептидных цепей легумина слабо структурирована и, по-видимому, не входит в состав доменов, а как бы одевает в "шубу" два домена, образованных большой и малой полипептидиыми цепями. Можно полагать, что на начальном этепе гидролизуются пептидные связи полипептидных цепей легумина

входящие в достав "шубы", ввиду их большей-доступности атаке Фермента, по этой причине гидролиз легуиина изначально идет предпочтительно по некооперативной схеме (рис.1). В результате гидролиза происходит модификация легумина. Мбдифицированный легумин (мол.м. 326 кД) имеет более низкую удельную парциальную теплоемкость по-сравнению с нативным (1.41ЦЭ.ОЗ и 1.60£0.03 Д*/(г*К) соответственно), что свидетельствует а возрастании компактности модифицированного белка [Рг1уа1о*,Р.У. 19791. Эти данные, а также данные обзора 1РНе1г,Р. еЬ а1.# 19871 о, структурной организации легуминов семян и сведения о пептидном составе продуктов их ограниченного прогеолиза £Вутов с соавт. 1985Г), дают основание считать, что пептиды отщепляемые от молекулы легумина не входят в сс.;тав структурных доменов, а образуют неупорядоченные структуры - "шубу". После удаления "шубы" с молекул легумина, домены белка становятся доступными ферменту вследствие чего молекулы начинают гидролизоваться по кооперативному механизму (рис.1).

Данные по термодинамическим свойствам нативного и модифицированного легучина подтверждают вышеприведенные рассуждения (таб.1). Из таблицы видно, что модификация легумина не сопровождается изменением количества и размера кооперативных единиц или доменов белка. Более того,, модифицированный легумин имеет более высокую удельную энтальпию денатурации по-сравнению с нативным, что свидетельствует о дестабилизирующем влиянии неупорядоченных структур на домены белка.

Таблица 1.Термодинамические параметр» денатурации нативных и

гидролизованных белков: легумин и РБФК(£/£ ^ -|/»0<а0 г д.)

Время гидролиза Температура денатурации, К Энтальпия денатурации, Дж/г Молекулярная масса, кД Количество кооп.единиц переходаН->Р

легумин РЕФК легумин РБЯК легумин РБФК легумин РБФК

0 мин 10 пин 3 ч 350 ' 341 350 341 350 341 17.4 .18.8 22.9 18.8 29.2 18.3 360 500 330 500 326 500 12 16 12 16 , 12 16

Р отличие от легумина РБФК состоит из 8 больших и 8 малых субъединиц СНо^исЫ.Н.еС а1., 19791. Большая и малая субъадинкцы образуют два структурных домена, однако не на уровне субъединиц, как у легумина,а на уровне димера .ввиду сильных взаимодействий

А Б В Г А Е Ж

55 к0

1<1кВ

-92 кО

- 66,7 кй -45 кО

- 29 кО

- 21 кО

-12,5кО

- <у5кР

-

01 ш а £ а к м

т я а и а я а -

б

Б

Рис.4." Схемы электрофореза в денатурирующих условиях по Лэммли: ндтивных белков - штреки А и подвергнутых гидролизу - штреки Б-Е а) для системы РБФК-вода, б) для системы РЕФК-вола-пектин в условиях 1ЮмплексобраэораН!1я, в) для системы РЕФК-вода-пектин ь условиях жидко-фазового расслоения макромолекул (двухфазности). Продолжительность гидролиза Б - 2 мин, В - 10 мин, Г - 1 час, Д -2 ч., Е - С ч .*- метчик.

и

между домекзми СВгэпЗеп,С.Н.е1 а!., 198С]. По "этой причине дикер является единой кооперативной системой и поэтому молекулы РЕФК гидролиэуются по кооперативному механизму (рис.Хд).

Полагают, что механизм ферментативного гидролиза белков , п основном определяется структурой белка-субстрата, а не специфичностью фермента. Действительно, для легуминов семян это утвеждение справедливо [БЬиЪоу.А.О.е! а1.,1987]. Наши данные по гидролизу РБФК трипсином и протеазой выделенной из сока листьев люцерны подтверждают это утверждение. Было показано, что РБФК. гидролизуется указанным ферментом по кооперативному механизму.

2. Еищугигя и_мехянигж фрцжкнтдтипнпгп ГИДРОЛИЗА-билкпи в

2.1. Кинетика и механизм гидролиза РБФК из листьев люцерны трипсином в условиях комп.'ексообразовакия и жидко-Фазового расслоения системы РБФК-вода-пектин.

Данные ДДС-На электрофореза, гидролизатов бёлка в двух- и трехкомпонентной системах РБФК-вода и РБФК-вода-пектин (рис.4), свидетельствуют о неизменности кооперативного •«еханизма гидролиза, ввиду неизменности расположения белковых' полос, соответствующих субъединицам нативного белка. Рис.5. Скорость гидролиза РБФК

трипсином (Е/5-1/50) в систе- _________________

мах: 1)белок-вода; 2) белок-вода-пектин в условиях фазового расслоения (0.1 М На-фос-фатный буфер рН 7.6, 1=37°С весовое соотношение белог/пек-тин 1.5/0.7 (концентрация бел-^р ка 2.5*) 3) белок-вода-пектин' в условиях комплексообразова-« ния (0.01 Н Ка-фосфаткый 6/фер — рН 7.1, £=37°С, весовое соотношение белок/пектин - 1/2). Со, Се, и Соо - концентрации эминного азота, соответственно з негидрслизованной РБФК, ис-сл»дуемсм гидролизате и а продукте- полного гидролиза (6 н НО при 110°С в течение 24ч.).

006

сЬ

I

J

001

♦ .ЧАС

На рис.5 приведена зависимость скорости Ферментативного . гидро'лиза от времени: (1) - в системе РБФК-вода; (ЗЛ - в системе .РБФК-вода-пектин в условиях комплексообразования и (2) - в системе РБФК-вода-пектин в условиях фазового расслоения .макромолекул (здесь и далее под комплексообразованием понимается образование водорастворимых интерполимерных комплексов белок-полисахарид). Видно, что константы скоростей гидролиза белка в исследуемых системах различаются. Константа скорости гидролиза в системе РБФК-вода-пектин (кЗ) в условиях компдексообраэования макрокомпонентов по-сравнению с к1 снихается, по видимому, .за счет уменьшения количества пептидных связей доступных ферментативной атаке.

Возрастание константы скорости гидролиза белка в системе "РБФК-вода-пектин в условиях двухфазности, по-видимому, связано со снятием икгибирующего эффекта фермента продуктами гидролиза за счет их переноса из белковсй Фазы в Фазу полисахарида. Действительно (таб.2) в процессе гидролиза белка, фаза полисахарида обогащается аминным азотом. Другими словами, пептиды образующиеся в результате гидролиза из белковой Фазы мигрируют в Фазу полисахарида за счет их более высокого термодинамического сродства к фазе полисахарида.

Таблица 2. Данные о распределении белка и пептидов (продуктов тидролиза) в процессе гидролиза РБФК в полисахаридной и белковой

Фаза.

Время процесса иин Концентрация М-коицов в смеси, мМоль Концентрация. Н-концов в фазе полисахарида в % от общего количества в смеси Концентр, белка в' фазе полисахарида в * от начального

и и, 4» ■¿й.й 11Ш

10 1,15 85,7 93,8

60 1,ез 86,3 90,2

1201 3,46 97,5 86,0

180 5.4Б 83,1 60,3

2.2. Термодинамические свойства нативного и ферментативно модифицированного легумина в системе *егумии ¿ода-фиколл.

Известно, что термодинамические свойства макрокомпонентов системы белок-вода -полисахарид определяют, фазовое состоянии [Толстогуэов.В.Б. 19873.

Термодинамические характеристики смесей легумина нативного и модифицированного с фиколлом приведены в табз.З. Наиболее общей экспериментально определяемой термодинамической характеристикой' разбавленных растворов полимеров служит второй вириальный коэффициент - параметр, пропорциональный избыточному химическому потенциалу растворителя при данной концентрации растворенного вещества ССоврег,И.0.& T.C.Laurent, 1978J. В системах растворите!ь/1/-полимер/2/-полймер/4/ взаимодействие полимерных компонентов может быть охарактеризовано составляющей второго вириального коэффициента Аз«.

Таблица 3-Термодинамические параметры взаимодействия легумина с

Полимер Мм , кД A^t, Ю-4*мэ* »кг-г Ä12 И Al-4, ♦ кг-« Al3*Al4 Ая«г

Нативный дегумин 360 4 »¿0.49 -3.3±2.3 -1. 5±.0.7

Кодифицированный 310 3.7±.0.37 6.2±D.9 5.0±1.2

Фиколл 530 — lltl.l -

25°С; растворитель - фосфатный буфер, рН 7.2 с ионной силой 0.01, содержащий 0.1 М НаС1.

Модификация легумина приводит к некоторому возрастанию его сродства к фиколлу, о чем свидетельствует уменьшение параметра А24, однако, взаимодействие пол: меров в растворе довольно слабо. Так, присутствие второго полимерного компонента че сказывается на коэффициенте седиментации, а также площади седнмонтацнонного пика как легумина (нативного и модифицированного), так и фиколла. Не наблюдается и образование в трехкомпонентних системах новых пиков, которые указывали бы на возникновение устойчивых комплексов полимер-полимер.

Оценка с помощью условия устойчивости к диФФгзии (А12*Ак/А24г > 1) смосей легумина и фиколла (табл.3) показывает.

что в случав нативного белка система при определенных концентрациях макрокомпонентов может расслаиваться на две фазы, причем основная причина несовместимости заключается в

самоассоциации легумина (отрицательное значение параметра А13). Соответственно при фазовом разделении нативный легумин и Фиколл будут концентрироваться в различных фазах. Для системы модифицированный легумин-Фиколл условие устойчивости к диффузии выполняется, и можно ожидать, что система будет однофазной во всем диапазоне концентраций компонентов. Экспериментальные данные для концентрированных систем подтверждают прогнозы, сделанные на основании оценки термодинамических свойств разбавленных растворов.

Одна из возможных рричин возрастания совместимости с Фиколлом легумина при его модификации мохет заключаться в снижении самоассоциации вследствие возрастания отрицательного заряда белковой макромолекулы. Такого рода изменения характерны при Ферментативной модификации легуминов семян [До Нгок Лань и др., 19851.

Рывпдн

1. Показано, что гидролиз рибулозо-1,Ьбисфосфаткарбокси'лазы (РБФК) идет по кооперативному механизму, а легумина по смешанному типу включающему как кооперативный, так и некооперативный механизмы. Замена фермента одной специфичности на другую не оказывает влияние на механизм гидролиза белка. Это согласуется с выводом, что механизм гидролиза - определяется структурной организацией молекулы РЕ-ФК.

2. Модифицированный легумин имеет более низкую удельную парциальную теплоемкость, чем нативный. Это свидетельствует о более, высокой компактности модифицированного легумина по-сравнению с нативным, что связано с отщеплением от последнего пептидов неупорядоченных областей молекулы белка.

3. Установлено, что отщепление от молекулы легумина пепхидоь расположенных в неупорядоченных областях молекулы белка приводит к возрастанию удельной энтальпии остаточного (модифицированного) легумина при неизменном количестве и размерах кооперативной одиницы или докснов белка. Это свидетельствует о

дестабилизурующем действии неупорядоченных областей на домены белка.

4. Изменение Фермент/субстратного соотношения приводит не только к изменению кинетических параметров гидролиза легумина, но и к изменению соотношения констант скоростей реакций осуществляющихся по кооперативному и некооперативному механизмам.

5. Оценка с помоиью условия термодинамической устойчивости к диффузии смесей легумина и фиколла, в разбавленных растворах показывает, что в случае нативного белка система при определенных концентрациях макрокомпонентов может расслаиваться на две фазы за счет( самоассоциации легумина. Б тоже • время система модифицированный легумин-фиколл должна быть однофазной во всем диапазоне концентраций макрокомпонентов, за счет Электростатических сил отталкивания между молекулами белка. Экспериментальные данные для концентрированных систем подтверждают прогнозы сделанные на основании оценки термодинамических свойств разбавленных растворов.

•в. При гидролизе РБФК в двухфазной системе РБФХ-вода-пектин происходит возрастание константы скорости реакции по-сравнению с системой РБФК-вода за счет переноса пептидов - ингибиторов Ферментативной реакции, в фазу полисахарида.

Пп млтвпяд.я» диггяртдцми ппуКшижпвяии гч«дУ»чия ряКпти;

1. Danilenko,А.И., Dmitrochenko,А.Р., Braudo.E.E., Bogonolov.A.А. and E.G.Rozancev: Restricted Enzymatic Hydrolysis of Legunin of Broad Beans (Vicia Faba L.) by tripsin in Concentrated Solutions. Control of Hydrolysis Process at the Expense of Change Of EnzymeSubstrat Ratio. Die Hahrung 37(1993)1,46-52.

2. Danilenko,A.H., Braudo.E.E. end n.A.Bogomolov: Regulation of Functional ' Properties of Protein Preparation . through their Limited Proteolysis. Lecture at the 4-th Symposium on Food Proteins. Structure Functionality Relationships. Reinhardsbrunn, FS Germany, October 5-8, 1992. Abstract of Papers,. p.17.

3. Даниленко.А.Н., Браудо.Е.Е., Антонов,». A., Толстоryзов,В.Б., Богомолои,А.А. и Э.Г.Розанцев: Выделение и характеристика протеинаэы серинового типа, участвующей в процессе автолиза

белков листьев люцерны. Химичеспревращения пищевых полимеров. Тезисы доклада. Светлогорск 21-23 апреля 1991. с.137.

4. Богомолов,A.A., Розанцев Э.Г., Даниленко.А.Н., Днитроченко, •А.П., Браудо.Е.Е. и Ю.А.Антонов: Механизм . гидролиза

рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы протеиназ^й серинового типа листьев люцерны. Итоги и перспективы использования природных и синтетических• ВМС в производстве пищи. Тезисы доклада. Суздаль 37-22 ноября 1991. с.45.

5. Богомолов,А.А., Даниленко.А.Н. и В.П.Юрьев: Взаимосвязь механизмов ферментативного гидролиза легумина кормовых бобов (Viols Faba L.) и РБФК листьев люцерны (Hedicago Sativa L) с ил структурной организацией. Биофизика 38(1993)2,233-239.

6. Даниленко.А.Н., Дмитроченко, А.П., Браудо.Е.Е., Богомолов,А.А. -и Э.Г.Розанцев: Зависимость процесса гидролиза легумина кормовых

бобов (Vicia faba L.) от соотношения фермент/субстрат. Прикладная биохимия и микробиология. 29(1993)3,69-76.

7. Даниленко.А.Н., Дмитроченко, А.П., Браудо.Е.Е., Богомолов,А.А. и Э.Г.Розанцев: Управление процессом гидролиза легумина кормовых бобов трипсином за счет изменения фермент-субстратного отношения. Итоги и перспективы использования природных и синтетических ВМС в производстве пищи. Тезисы доклада. Суздаль 17-22 ноября 1931. с.62.

8. Богомолов,A.A., Даниленко.А.Н., Юрьев,В.П. и Ю.А.Антонов-Кинетика и механизм гидролиза рибулозо-1, Ьбисфосфатг.арбоксилазы листьев люцерны (Medicafio Sativa L.) трипсином в условиях комплексообраэования и Фазового расслоения системы белок-вода-пектин. Молекулярная биология (в печати). ^