Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка биотехнологии мальтозы и глюконата кальция на основе гидролиза крахмала

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка биотехнологии мальтозы и глюконата кальция на основе гидролиза крахмала"

СГБ Ой

ЮМ1М995

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ

' ВОРОНЕЖСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ - -На прявях рукописи

РУЛДЗЕ ИВЕРИ ДМИТРИЕВИЧ

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ МАЛЬТОЭЫ Й ГЖКОНАТА КАЛЫШЯ НА ОСНОВЕ ГИДРОЛИЗА КРАХМАЛА

Специальность : 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Воронеж -' 1995

Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии Воронежской государственной технологической академии

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук,

профессор Н. А. Жеребцов НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:' кандидат биологических наук,

доцент Р.П.Шуваева ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических . наук,

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Всероссийский научно-иссле-

на васеданиидиссертационного Совета Д 063.90.01. при Воронежской государственной технологической академии по адресу: £<94017, г.Воронеж, проспект Революции,- 19

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГТА.

ведущий научный сотрудник института почвоведения и

фотосинтеза РАН В.К.Гинс кандидат технических наук, доцент Е.Д.Фараджева .

довательский институт пищевой биотехнологии

Занята состоится '

часов■

Ученый секретарь . диссертационного 0 д. т.н..профессор

Автореферат разосл .095 года

В.с.григоров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБиШ Актуальность работы. Диссертация посвящена разработка технологии мальтовы (.реактивной) и фармакопейного глюконата каыьцня на основе гидролиза крахмала и связанного о ним уетода полудни« препарата гдюкоамштзы, обладающего высокой рН- и термостекЗиль-ностьга. высокая р11- и термостобильаогт! гшссздплоя: п:::.сл-:т вести гидролиз крахмгиа в относительно жестком режиме и дает соз-можность получить более высокий выхол глюкозы; предотвратить протекание нежелательных микробиологических процессов за счет расви тия вредной микрофлоры в обрабатываемой сроде.

В России мапьтозу производят для научно-исследовательских работ и микробиологической промышленности. Технология предусматривает получение мяльтоом методом осахаривания крахмаля г-уюдсл. однако данный М'П'од им^ет ряд нсдостатко»: используется нког'и! концентрация крахмала IV?,), технологический процесс осложняется образованием значительного количества глюкозы, декстринов и других побочных продуктов т сч°т присутствия солодовой о- тч^'К и рносимого с солодом балласт«.

Среди продуктов гидролиза крахмала, кроме мальтогн, ражную роль для человека играют глюкоза и некоторые соединения, получен-ныр ис глюкорн, в частности, глгжонат кявыриг, который ит.гль^у ется в пищевой и химической промышленности, . в медицине и ветеринарии. На предприятиях отечественной промышленности применяется технология глтконата кальций е ^пользованием раствор"« кри^тя^-лическои глпкоян. что неоправданно дорого и трудоемко. Во-п«* гот4', глюкова сама по себ° является дефицитным продуктом; во-вторых, получение глюкозы в кристаллах, высушивание, стандартизация, хранение, транспортировка, а затем вновь перевод глюкозы в раствор, по меньшей мере, нецелесообразно. Перспективным, с этой точки зрения, является применение непосредственно гидролизата крахмала

- г -

с высоким содержанием глюкозы, минуя стадию ее кристаллизации. Основным технологическим процессом в этом случае является гидролиз крахмала. Наиболее распространенный способ - это кислотный гидролиз с использованием в качестве катализатора минеральных кислот. К числу преимуществ этой технологии следует отнести дешевизну катализатора и большую скорость реакции в связи с применением высокой температуры процесса. Однако гидролйзаты загрязняются продуктами реверсии и термического разложения углеводов, в связи с чем выход глюкозы не превышает 90Х.

Применение амилаз благодаря направленности и специфичности их действия, позволяет устранить указанные недостатки при получении гидролизатов.

Работа является составной частью научных исследований кафедры биохимии и микробиологии, входящей в координационный план РАН.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы была разработка рациональной технологии получения мальтозы и гдюконата кальция на основе гидролиза крахмала. В соответствии с этим были определены следующие задачи:

- подобрать перспективный ферментный препарат, обеспечивающий высокий выход мальтозы при гидролизе крахмала;

- разработать перспективную технологию получения мальтозы;

-' выбрать активный продуцент глюк'-амилазы среди микромиЦе-

тов;

- исследовать процесс биосинтеза глюкоамилазы, найти рациональные условия биосинтеза глюкоамилазы при поверхностном культивировании;

-' разработать метод выделения препарата глюкоамилазы;

-исследовать ее важнейшие, физико-химические характеристики -рН- и термостабильность;

- определить рациональные условия ('^рментативного и кислот-

- я - -----

ного гидролиза крахмала до глюкозы-,

- использование ферментативного и кислотного гидролизатов в технологии глкжоната кальция.

Научная новизна диссертационной работы заключается в следующем:

- равработан метод выделения и очистки р- амилазы ячменного

солода;

- разработана биотехнология получения мальтозы с использованием бактериальной а-амилавы и препарата солодовой [»-амилазы;

- подобраны рациональные условия и состав питательной среды для- твердофазного культивирования (источника глюкоамилазы) термотолерантного микромицета А.аиатог! ВУД Т-Я;

- разработан способ получения препарата глтсксами.чагн и предложена схема очистки.

Проведено производственное испытание по получению ферментного препарате о-амилазы на Московском опытном заводе В1ШИ11БТ: по .пучен активный препарат. Получен положительный результат при проведении испытаний ферментативного способа получения мальтозы на Шосткинском заводе химических реактивов.

Разработаны рациональные методы кислотного и ферментативного гидролиза крахмала: получен глкжонат кальция, удовл^творяюсшй требованиям Государственной фармакопеи 10 выпуска. Технология глюконата кальция с использованием гидролизатов крахмала испытана на Курском комбинате лекарственных средств.

Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались в 10 сообщениях на международных, республиканских конференциях.

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 20 публикации.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 186 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литера-

туры, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждений, заключения, выводов, списка литературы (155 источников) и приложений. Иллюстрационный материал включает 25 рисунков, 18 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы и определены основные направления исследований.

В обзоре литературы дана характеристика продуцентов амилаз как растительного, так и микробного происхождения.. Приводятся данные об особенностях биосинтеза, выделении и очистки амилаз, физико-химических свойств ферментов, их использование в равлйчных отраслях народного хозяйства.

Отмечено, что в основе производства мальтозы в нашей стране положена малоперспективная технология, а именно: используется низкая концентрация крахмала, источником амилаз служит солод, загрязняющий гидролизаты. В производстве глюконата кальция ис-поль&уется дефицитная и дорогостоящая кристаллическая глюкоза, что экономически нецелесообразно. ,

Обоснованы цель и задачи исследований.

В экспериментальной части представлены материалы исследований, обоснован выбор основных показателей и факторов, обобщены и обсуждены результаты экспериментальных данных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований при получении ферментных препаратов В- амилазы и глюкоамилазы служили ячменный солод и чистая культура микромицета Aspergillus awamori ВУД Т-2, полученная из ВНИИ пищевой биотехнологии (г.Москва).

- о •

Культивирование гриба осуществлял» ТВЬрДОфааНЫМ МеТОДГЛ колоих емкостью 750 см"4, содержащих г среды по лоаду!»"•'• су^и массе. Выращивание осуществляли при температуре в гтч.л«*-

4 в ч.

Сырьем ¡1ля получения мши>то?ы и гадр^лиаатов глюкозы служил кулурувньт и картофельный крахмал высшего сорта (ГС*><' -""Л "Го я 1'с.ОТ 7699-78). Для предварительного раяжижения клеиетеризов&ннсго крахмыт исаилкновали препарат амилосубтилин Г10х (ОСТ М-П-УР).

При определении сбалансированного состава питательной среди и условий культивирования микромицета Л. аиатог! ВУД Т-;.:, а также при выборе рациональных режимов гидролиза картофельного крахмала до мальтозы и кукурузного - до глюкозы использовали полный торный эксперимент (Ш© 24 и 25) с применением центрамного кс.и-позиционного ротатабельного униформпланирования (Грачгн, ••

Статистическим анализ регрессионных уравнении проводили пи п^-т рамме, заложенной в матрицу планирования экспериментов осслит*. изорапному методу на ЭВМ 80100,25.

Гляжоашишвную активность определяли глшо&ооксилннним мет--» дом. ма единицу активности принимали такое количество фермента, ' которое, катализируя гидролиз крахмала при 30°С и рН 4,7 п т«-ь ни« ! мин, освобождает 1 мкмоль глюкоа».

Активности а-амилагы определяли методом ЬНЙИЛВТ (Рухлядева АЛ!. . Ы79). У а единицу активности й-амилазы принято тако« количество ферментов, которое при 30°0 и рН 4,7 в течение 1 ч ка->'чм:• вирует до декстринов раеличной молекулярной массу 1 г рпстрориу-го крахмала.

Для определенна ц-амилазной активности использолнли мегод дифференцированного определения активности а- и 8-амилаз в солоде (Пронин И.. 1953]. Осахаривающую активность р-амилязн определяли числом граммов растворимого крахмала, которое превращается в мальтозу в-амилазой .1 г солода (на сухой вес) в течение 1 ч при

30°С. •

Для выделения препаратов ферментов использовали осаждение органическими растворителями и фракционирование сульфатом аммония, ионообменную хромотографига к гельфильтраци» (Детерман, 1971). Злектрофоретические исследования фермента проводили по методу Дэвиса (Davis, 1964). Содержание глюкозы в гидролизатах определяли на приборе ПЛАГ-11. Количество мальтозы определяли по следующей формуле: М - (РВ - Г) • 2 • 0,95 , где РВ - количество ре-.Аудирующих веществ, Г - количество глюкозы. Общий азот определяли по Къельдалю , белок - по Лоури, глюконат кальция - методом комп-лексонометрического определения ионов кальция (Шарло-Г., 1965).

Опыты проводились в 3-4-кратном повторении, причем аналитические определения для каждой пробы осуществляли в 3 повторнос-тях. Обсуждаются только те результаты, которые были воспроизводимы в каждом опыте.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТА В-АМИЛАЗЫ ИЗ ЯЧМЕННОГО СОЛОДА И РАЗРАБОТКА РАЦИОНАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ ГИДРОЛИЗА КРАХМАЛА ДО МАЛЬТОЗЫ

Получение препарата й-амилазы. Препарат ß-амилазы из солодо-. вой. вытяжки'получен методом осаждения этиловым спиртом с предварительной инактивацией «-амилазы. Инактивацию «-амилазы осуществляли в течение 24 ч при pH 5,0 и температуре 30°С в присутствии оксалата аммония в 0,1 н концентрации. Установлено, что для осаждения D-амилазы из органических растворителей наиболее эффективен этиловый спирт в концентрации 70£ об., pH 4,7. Основные условия: соблюдение низких температур и быстрое центрифугирование, быхг 1 препарата составляет около 85 %, активность- 150 ед/г; оптимаг ные условия действия: температура 55°С, pH 5,0.

- Разработки рациональны* условий гидролиза крахмала до ыоль-тош. Принципиальная схема получения мальтозы такова: крахмал ~->

<* -аМИЛаза Й aMlUlaij

-----> декстрин» ----------D маньтоза » конечные я^котрини юг».

Существующая технологии мальтозы предусматривает июГольйовчни*

7%-ой крахмальной оусиишии, кл"йс ¡vp»iao8at!Hoft при iuu"0. В качестве осахаривающего препарата используется солодовое мслоио, н комплекс ферментов которого иходпт Р амилаза. Полученный гидролизах помимо мпльтоеы содержит значительное количество декстринов и глюкозы, а также балластные вещества,вносимые вместе с солодовым молоком. Эти примеси оказывают отрицательное влияние на качество и выход мальтозы.

Нами была предпринята попытка устранить эти недостатки. О этой целью мы провели работу по отыскании рационального еп<юи,а гидролиза KpfiXMtuia До мяльтокн. Исел^иованскь йлияние- рила фнкто-ров на процесс гидролива: рН среди, температурь1, концентрации фермента и субстрата, степень прна^цритоиыюго расщепления субстрата. В исследовании tic-п< с/и "•>-у.члк нолини Факторный акгцоримент

с центральным композиционном ротатабелышм униформпланиронани ем. Критерием опенки илнянин утих Факторов на процесс гидролиза крахмала препаратом ¡»-амилаэы в выбранных. пределах изменения служила степень гидролиза по мальтоз.

В результате стапютичеою обрпоотки дачм-рим^нтильних данных онла построена математическая модель процесса. Методом "ридж-анализа" определен рациональный режим гидролиза крахмала гг мальтозы: температура гияролигл я о пЛа мродлл.мп'^льное гь пр.-л верительной обработки крахмала л амнласеп щз расчета 0, Рол'г крахмала) 4U мин-, довироркя препарата it-амилазы ¡.'.iVa-t крнхмзлп, концентрация крахмала м .-(*-<■> и i г./ продолжительность гидролиза 4ч.

- « -

Таблица 1

Сравнительная характеристика гидролизатов крахмала

Опоеоб Содержание Содержание Степень Чистота

гидролиза мальтозы, % глюкозы, % гидролиза по гидроли

мальтозе, 7. затовД

Контроль ( по регламенту Шост-

кииского ЭХР} 11,8 4,2 75,0 87,3

Но разработанному

регламенту 15,6 0,3 94,0 91,5

Результаты апробации разработанной технологии мальтозы на Шосткинском заводе химических реактивов показали целесообразность внедрения этой технологии в производство (табл.1). Выход мальтозы по сравнению с используемым регламентом, увеличивается на Ж; в два раза сокращается время упаривания гидролизатов перед экстракцией мальтозы изопропанолом за счет увеличения начальной концентрации крахмала,степень чистоты возрастает на 4X.

ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТА ГЛЮКОАМИЛАЗЫ ИЗ МШРОМЩЕТА Дуре ^ 111 из амапюг! ВУД Т~8 И ИССУЩОВЛНИЕ ЕГО НЕКОТОРЫХ ФИЗИК0-ХИМИЧЕСКИХ евойотв

Подбор рациональных условий для твердофазного культивирования продуцента. Главным достоинством этого способа культивирования является высокий выход целевого продукта.

В качестве основных факторов, влияющих на биосинтез глюкоа-милазы, были выбраны температура культивирования, крахмалистость отрубей, влажность среды и продолжительность выращивания. Все эти факторы совместимы и некоррелированы между собой. Критерием оценки влияния каждого фактора на процесс биосинтеза грибом Л. пиатоН ВУД Т-Я служила активность глюкоамилазы в поверхностной культуре.

Методом множественной «^реляции было получено уравнение,

- У -г

адекватно описывающее процесс оиосинтеза глюкоамилази. Поиск условий максимального биосинтеза глюкоамилази при ограничениях на входные (интерьали варьирования) и выходной параметры, осуществляли по полученному уравнения градиентным методом. Рациональные соотношения параметров, оказывающих особое влияние на биосинтез глюкоамилази, оказались следующие: температура культивировании 36°С; продолжительность выращивания 50 ч; влажность питательной среды 67% и крахмалистоотъ отруоей 19%, глюкоамилазная активность при этом достигала максимальной величины 240 ед/г воздушно-сухой массы поверхностной культуры.

Выделение и очистка глюкоамилазы. Ферментный препарат глюкоамилазы получали из экстракта поверхностной культуры гриба методом осаждения органическими растворителями (этанолом, ацетоном, ивопропанолом), предварительно избавляясь от «амилазы и протеаз. Наиболее полное осаждение глюкоамилази наблюдалось при рН 5,0. Очевидно, к этому значению рН близка изоанектрическая точка глюкоамилазы. Концентрация растворителя существенно влияет не только на выход препарата, но и на степень очистки, 0 этой точки зрения наиболее эффективен этанол в концентрации 74,5 %. Получен очищен-, ный препарат глюкоамилазы с удельной активностью 384 ед/мг белка и степенью очистки 05%.

Некоторые физико-химические свойства глюкоамилазы. При гидролизе крахмала основными факторами являются температура и рН, влияющие на активность и стабильность глюкоамилазы. Установлены рН-оптимум 4,6 и оптимальная температура 07°с.

Опыты по кислотной инактивапии глк.коамильзы показали наибольшую стабильность фермента в интервале рН И,Г> - Ь,0. Через 1РО ч инкубации при тнмррчтурс J^pMt-ят сохранял активность При рН 3,5 на при рН 4,0 - йб.2%, при рН 4,5 - 99,5%, при

рН 5,0 - 97,4%.

Термическая инактивация глюкоамилазы исследовалась в интер-

сапе температур 30-70°С. Фермент проявлял достаточно высокую термостабильность в интервале температур 30-60°С. Сопоставление полученных данных с литературными по другим глюкоамилазам термотолерантных и мезофильных микромицетов позволило прийти к выводу, что глхжоамилаза А. амапог! ВУД Т-2 обладает высокой рН-термоста-

бИ^оНОСТЬЮ.

Таблица 2

Динамика термической инактивации глюкоамилазы А. аиатои ВУД Т-2 при рН 4,6

Время инкубации Активность глюкоамилазы в %. от максимальной при температуре, °С

30 40 50 60

12 72

99,9 99,0

99,2 95,5

96.5

79.6

84,5 35,5

Процесс кислотной и термической инактивации глюкоамилазы является типичной реакцией первого порядка и хорошо описывается уравнением:

К

2,303

где К - константа скорости инактивации, ч-1; Е0- исходная активность; Е - активность в момент времени т.

В табл.3 приведены данные кинетики инактивации глюкоамилазы А. аиатог1 ВУД Т-2.

Таблица й

Влияние температуры и рН на константу скорости инактивации ферменты

Температура

3,0

'30

ео

70

К-10?\ ч"1 при рН

3,Б

4,0

4,5

О

0,06 0,034 0,019 0,014 9,35 5,25 1,70 1,41 11№,94 601,91 480.53 387,83

0,03 0,09 3,01 76,77 633,45 2167,54

Из тмбл.З видно, что температура и рН являются тесно взаи-

о

а -

мосвязаниымн факщмеши интенсивности процессе* ннактньации. Поскольку инактивация была необратимой, определить ее истинные термодинамические параметры энтальпию ЛИ, свободную энергии АО, энтропию 6S - невозможно. Однако, воспольгонявшись toopitfft переход иого комплекса, ш определили вчжш'йшие пчрнм«т1>ц этого комплекса ДН', ДВ' и lYA* (табл.4;.

Таблица 4

Термодинамическая характеристика активированного комплекса процесса кинетики инактивации глюкоамилазы A. awamori ВУД Т-2

Температура С PH Eaic ДН* Д6" ДЗ"

кДж-моль"1 .1.-Л,.

30 - 60 3.0 141. 1 i10, , i UM .с

60 - 70 Э,0 ■100, \\ А г/ Г: 44 . .л -.4

30 - 60 4,0 1Я4, й 1:?1,У я, Ц ¡■-ft м

60 - 70 4,0 465, :ч 46?. ,5 :Ч i ш''! 1

эо - 60 6.0 1. ' i 187,6 6 пил

60 - 70 5,0 440, 1 !<h , 'У

30 - 60 6,0 185, 1 i'ji.i

60 - 70 6,0 *,!V ', S?4,9 ¿б! - i

Как видно из гаол. 4, инактивация : глюксамил- 13 U носит сл'

характер. По-видимому, ото онизано с тем, что н формировании белковой глобулы фермента принимает участие два типа в*ан>к>а~й<>?*1«А: гидрофобные и различные випи электростатических .'«я?-»»! 1 ; <••««- i>ri 3,0-6,0 и сравнительно невысоких температур (;-su-60oC) происходит разрушение слабых электростатических, по всей видимости, водород ных связей, которые играют незначительную роль г. фо^ироьишж белковой глобулы, и, таким cfifmcu, приводят к м-'к» »»ft тог*.!«* ка талитическои активности. Оо зтом свидетельствуют небольшие анач"-ния изменения энтропии Лй*. При температурах июн AS* резко возрастает; ато дает возможность предположить, что в формировании белковой глобулы фермента важный вк.язд вносят гидрофобные взаимодействия.

- т -

Идентификация функциональных групп активного центра глюкоа-милазы А. аиатюг! ВУД Т-й. Идентификация функциональных групп ферментов, принимающих участие в акте катализа, играет важную роль в расшифровке механизма катализа - одной из главных задач современной знзимологии. Важным критерием идентификации этих групп являются константа ионизации (рН) и теплота ионизации (йН").

Величину рК определяли, используя кинетическую зависимость активности фермента от рН при температурах 6 и 60°0 (рис.1). Профиль кривых активность - р!1 свидетельствует об участии в элементарном акте разрыва 1,4-глюкозидной связи в молекуле крахмала двух функциональных групп. Форма обеих ветвей кривой характерна для профиля кривой диссоциации ионногенных групп аминокислот.

При скорости расщепления субстрата ферментом, равной половине скорости в оптимуме рН, константа ионизации каталитически активной группы фермента численно равна концентрации водородных ионов среды (Жеребцов Н. А., №4). Исходя из этого омли определены рК1 и рК" для глюкоамилазы (рис. 1); они оказались равными 2,2 и 6,4 при 5°15 и '¿,Ь и Ь,7 при б0оС, что соответствует рК карбоксильной группы, вероятно, аспирагиновой или глутаминоьой кислоты и рК имидазольной гругшы гистидина (Диксон и УуоО, 1932). Это дает основания считать, что здесь мы имеем дело только с ионизацией каталитически активных групп - карбоксильной и имидазольной.

Рис.1 Влияние р!1 на активность глвкоамилазы А. аиатоП ВУД Т-? при температуре (°0): 1-5; 2-60; А - активность глюкоами-лазы, X от максимапьного

Наличие в активном центрг глюкоамплаьи 1\арооксильной и ими даьольной групп подтверждают найденные ними величины теплоты не иизации этих групп. Рассчитанные по уравнению Ьант-Геффа теоло-ш иониеации Функциональных групп оказались рнкншк л ли' ••кислой"

что соответствует теплотам ионизации такж^ гароиК'-и.чт.иой и дазольной групп.

Типичная реакции на имндазольную группу гисгидина является ее фотоокисление. Фотоокисление осуществляли при разных значениях рН в присутствии метиленового синего, играющего роль фотосенсиби-ливатора.

Фотоокисление приводит к разрыву гетероциклического -^г--гистидина и к инактивации фермента. Репудггнты опыт» • р«. •

«авали, что глюкоамилп.-'.п подвергалась нитеноиыкл» фотоиичктв:«-» пни, которая тагл^ г.ни(ч«)'1йТ1'д урчнн-ииги р-чгции ш-г-тг'- ¡гч .«л км.

ветви кривой 9,? кДж-миль 1 и дли "щелочной" - 22,6 кДж-моль

-1

Рис.2 Динамика фотоннактивашш ги--.:« !,;" • г ,.

гдадаппмилч.'щ г присутствии м* при фогиокисл^ни:: гди.к."!1М!!Л'>.ч<

.щцего При г": Л, и«« 1П»>г; ¡-.V); Т ." при •."■гМКг •

1 - Р'.П; 4,' I; .1 <1 Р'-РУР^ ¡'и^П

6 - с метилено-

внм синим и темноте; V - беа

метиленового синего на сгету,

- и -

Фотоокисление гдюкоамидазы в интервале рН 3,0-7,0 и температуре £0°С показано на рис.3. С уменьшением концентрации Н+-иоков в среде скорость фотоинактивации возрастает. Как видно на рис.3, точка пересечения прямых на кривой 1®К-г"(рН) находится при рН Б,6, соответствующей рК имидазольной группы гистиднна.

Итак, кинетические кривые активность - рН, величины рК, инактивация фермента фотоокислением о присутствии метиленового синего, величины теплоты ионизации достаточно убедительно свидетельствуют о том, что в каталитический центр глюкоамилазы А. аналог1 ВУД Т-2 входят карбоксильная И ямидазольная группы.

КИСЛОТНЫЙ И ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СПОСОБЫ ГИДРОЛИЗА КРАХМАЛА ДО ГЛКЕ06Ы п ПОЙУЧЕШЕ ГЛШОНАТА КАЛЬЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТИХ ГИДРОШАТОВ

Кислотный гидролиз крахмала. Гидролиз можно представить

н+ н+

в виде следующей принципиальной схемы: крахмал —> декстрины —> —> и-Д-глюкоза, где Н+-ионы выполняют функцию катализатора.

При кислотном гидролизе использовали взамен применяющейся в настоящее время соляной кислоты - серную, что было обусловлено спецификой технологии получения глюконата кальция.

Воспользовавшись методом математического моделирования и планирования эксперимента, ми провели оптимизацию условий процесса кислотного гидролиза крахмала с целью получения максимального выхода глюкозы.

Оптимальными параметрами для кислотного гидролиза крахмала . сказались: концентрация крахмала 00%, концентрация серной кислоты 0,8 - 1,0% к реакционной массе (рН 1,2-1,1), температура гидролиза 187°С, продолжительность процесса 90 мин. Степень гидролиза при этом была 91,5 %.

Ферментативный гидролиз. Гидролиз осуществлялся по следующей

- • "" ' 1Ь принципиальной схемь:

с* -.ШИЛа-а 1 ЛИНЯМИ».! „Л

крахмал -------------.---------- декстрины ------------------------ ц-Д-глтеооа

Для решения задачи по отысканию р.-лШК'Налыюги ¡-глимн ферментативного гидролиза крахмапа по глюкозы мм восиолозовались тем же методом, что и при кислотном гидролизе. В качеог-с 4*лкч'»ч,лв, Ели яющих на процесс гидролиы», гади шмтн кепцгшрмция крахмала, дозировка ц>срн?нт11ого препарата глюкоамилазы, температура гидролиза, продолжительность процесса, критерием оценки совокупного действия всех факторов служила степень гидролиза крахмала по глюкозе.

Оптимальными для ферментативного гидролиза крахмала оказались следующие соотношения параметров- квтьштрэди» крахмнчч ¿Сч. температура гидролиза по'-'С,дозировки щ^арзт;» глык.«чшшк-ы кея/г крахмала, ик'ЧЛЯ.чи-ге.«.»»--™ гидрглиг.а V 1. • г«»гнь гицр-;лиэа (крахмала по глю^>:>- при -лсм и о,-тиг^л I -л»,Ь К.

' 'опоотаьление ферментативного и кисл»>тиог-.> спосооок гидроли иа крахмала до глюкозы. На рис.4 представлена дишшка киолгтяого и ферментативного гпосопор гидроливп крахмала до глмю&ы при различных условиях. Сопоставление режимов кислотного и феомемтчтпг. него гидролиза крахмала дает осног-анп^ сделать следти"»« ние: КИСЛОТНЫЙ гидроли« 1М<"1' Ь Х-'-СТК.-М 'Ге'-ШерЦТурНОМ и кислотном режиме, что приводит к снижению выхода глюкозы в связи с ее разрушением. Ферментативный гидролиз идет в мягком :-!,;;■:■ >д глюкозы выше, гидролизат более т-окой ст-ш-ни чи.-т-ш. -чг- ои Оолее длит^/и.нып и требу-т тмючг.:"'!'.!!«« до^огчетоят^г^ прмчр ¡та глркоамнла-'.'и.

На рис.5 представлена <-х.»мч ■'{»•дп^лагл^мого механизма разрыва г.ниап'идной связи в молекул** крахмала под действием ионов водорода и глюкоамилазы.

По-видимому, причиной .+.00ТКИХ у-ЛОИИЙ ГИЯР0«1|:'а

крахмал» ягляетея односторонняя 'чл-чл-р'Сильная ат «ю ион ии, рол"

- 16 -

рода глюкоаидшх связей в молекуле крахмала.

сг,%

SO

40 20

é

1 /ё

WA •¿О"- s\

П S6 4S во

б

0 зо ео $а по mt.Mu»

а

Рис.4. Динамика гидролиза крахмала; а - под действием Н+-ионов при температуре (°0) и рН 1 - 100, 1,1; 2 - 100, 0,85; 3 - 12?, 0,85; 4 - 127, 1,1; Б -135, 1,1; 6 - 135, 0,86; 6 - глюкоамила-зой A. awamorl ВУД Т-2 при температуре (°С) 1 - 50; 2 - 60; 3 -65 (концентрация крахмала 20%; дозировка глюкоамилазы 2,0 ед/г

крахмала, рН 4,7).

ферментативный гидролиз крахмала идет но иному механизму. Как уже отмечалось, в механизме катализа глюкоамилазами важную, роль играют две ионогенные группы - карбоксильная и имидазольная. При рН-оптимуме для действия глюкоамилазы, равным' 4,7, эти группы находятся в виде нуклеофильно-электрофильной системы: ион карбок-силата - протонированиый имидазолий. В отличие от кислотного гидролиза при ферментативном гидролизе глюкозидная связь подвергается двусторонней атаке системой карбоксилат-имидазолий, что приводит к резкому снижению энергетического барьера при разрыве глюко-зидной связи, обусловливает мягкий режим гидролиза крахмала, исключающий распад глюкозы.

Воспользовавшись экспериментальными данными, (рис.4) нами была рассчитана энергия активации при кислотном и ферментативном ■ гидролизе крахмала. ,При ферментативном гидролизе она оказалась равной 32.7 кДж*моль~^, при кислотном 138,6 (рН 1,10) и 120,4 (рН

... - 17 -

п.ЯБ). Оти дминмз достаточно у""?дт»->лы>.> подтз'-р.гяг^-.т рааьинаемнр нами представления с механигме гидролиза кг>чхмчп.

-О

V Г

иг

-О

Н *_Н/-

ЧЧ-

Я- V-

' и®

> ЗУ

'—■но4

+ н

б)

н+ Им

ИНГ

•оХн «

Им

ь

да"

С00" Г-1Я

-О

Нч/-

1 +

НО

Им

Н «О Им н

Рис.5. Предполагаемый механизм р-гри^а '/1.1

М'ХЧ'.ТУЛО |;р'(ХМ'\Т1; 'I I!'1;! д. ,.|.„м И1

гттамиласий.

ССО"

-а. он

' ц «

Н+ Им

' А'Л'

! .ч*'!""; "'ИДЧ'Ч! ■ Г>!.

, !-• при гидрата:»^

Использование пролуктог.

лнза крахмала р . т"хн"логи11 получет •\я»ктрохимич«ягком т1'У">л<-> пр'мгч"'»-!"-

ЛП ло.лрпг'т.мо г-ПМ'"Ч°Ча 1-р :1 11 иц'!'""!" г ■

ролизатн.

Эксперименты п<"> ?«мпил крнотзллн'зчч""!! г.^^-.-н на граумач' вый гпдролнзат проводили ^ иг(!г>дм-<)<"»ш">м лабораторного ал^ктро

|1 '!":,рМ"!П''-!'П!!"!С!' • :'!1«Г'>

_> Л!скс'ната калмя'я , "з"

¡"И" ;»••»«( '•<■

.••(«• я на крахмальны^ гид-

лизера, плотность тока меняли от 1,4 до 2,0 А/дм3. Процесс электрохимического окисления осуществлялся в присутствии МаВг в две стадии:

1. Электрохимическая

ЯаВг * + Вг~

на катоде: 8НгО + -* + ЙОН" ; на аноде: 2Вг~ - 2е~ - Вгг. Образовавшиеся 0Н~-ионы реагируют с катионами На*" Ма+ + ОН" МаОН

Образовавшиеся МаОН и Вг вступают в реакцию: гНаОН + Вгг - МаВг + НаОЭг + НгО

2. Химическая.

Под действием МаОВг происходит окисление глюкозы до промежуточного продукта глюконо-б-лактона. В дальнейшем глюконо-б-лактон гидролизуется до глюконовой кислоты, которая, в свою очередь, вступает в реакцию с ОаСОз с образованием глюконата кальция. Д-глюкоза + НаОВг —> глюконо-б-лактон + ИаВг + Н^О; глюконо-б-лактон + Н-гО —* глюконовая кислота; глюконовая кислота + СаСОэ —> глюконат кальция ■+ СОг + НгО Электролиз проводили при температуре 40-45°С. В первые 30 мин силу тока поддерживали в пределах 8 А; по истечении этого времени силу тока поднимали до величины 11-12 А и она была постоянной до конца электролиза. После 6 ч от начала процесса электрохимического окисления глюкозы черев каждый час меняли полюса.

Полученные как кислотным, так и ферментативным способами гидролизаты крахмала с различным содержанием глюкозы. Обрабатывали активированным углем при Б0-65°С в течение 4 ч, затем отфильтровывали и использовали для приготовления электролита. Как видно из табл.5,б, наиболее рациональными оказались варианты с использованием гидролизата с начальным содержанием крахмала 20 X. Полу-, ченный глюконат кальция по всем показателям отвечает требованиям Государственной фармакопеи (10 издание).

Таблица 5

Характеристика гидролизата крахмала, полученного кислотным способом и оценка качества глюконата кальция

Показатели

гидролизата

Раствор

Гидролизат кристал.

| VЛЛГ.ОЙЫ

Исходная концентрация

крахмал*, % 5 16 20 25 35 Подержание глюкозы в

ГИдролиэате, г/дм3 54,1 157,7 204,4 233,3 265,2 200,0 Степень гидролиза

крахмала по глюкозе, % 97,4 94,6 92,0 84,0 68,2 Выход глюконата кальция

ПО глюкозе, X 0 28 55 48 43 55 Соответствие требованиям ГФ X ивд, нет нет да да да да

Таким образом, гидролизат крахмала исключает ислоль.охрани" дорогостоящей кристаллической глюкозы снижается трудоемкость сп^-соба, так как нет необходимости получить кристаллическую глюкозу. Результаты исследований апробированы в условиях производства на Курском комбинате лекарственных средств и дани положительны'? результаты.

Таблица 6

Характеристика гидролизата крахмала, полученного ферментатигянм способом к оценка качества глюконата кальция

Наименование показателей гидролиза

Исходная концентрация крахмала, X 5

Содержание глюкозы в гидролизате, г/дм1- 55,6 Степень гидролиза крахмала по глюкозе, % 100,0 Выход глюконата кальция по глюкозе, % О

Соответствие требованиям ГФ X йвд. нет

Раствор

Гидролизат кристал.

глюко?ы

15 20 25 35

166,2 217,8 270,8 371,4 200,0

99,7 98,0 97,5 95,5 -

30 56 51 52 55

нет да да да да

- ЙО -

в н вор

1. Установлено, что для получения препарата fl-амилазы с высокой активностью из органических растворителей наиболее эффективен этиловый спирт в концентрации 70% об, рН 4,?. Достигается полное удаление «--амилазы из препарата и-амилазы при рН 5,0 в присутствии аддендов, специфически связывающих Са2+-ионы.

2. Определен рационалыши режим гидролиза картофельного крахмала до мальтозы ферментными препаратами: концентрация крахмала 15%.; дозировка осахаривающего фермента ?.,0 ед и-амилазной актиьности на 1 г крахмала; температура 60°0; продолжительность 3-4 ч. Получена мяльтоьа с шсо):ой степенью чистоты.

3. С помощью математического планирования эксперимента получены рациональные условия максимального биосинтеза глюкоамилазы при твердофазном культивировании микромицета Л. awamorl ВУД Т--: температура культивирования 36°0; продолжительность выращивания 50 ч; влажность питательной среды - 6У,0Х и крахмалистость отрубей lâ/L.

• 4. Получен высокоактивный препарат глюкоамилазы с удельной активностью 384 ед/мг белка и степенью очистки 95. Максимальная активность фермента проявляется при pli 4,6 и температур« 67сС.

5. Глюкоамилаза A. awamori ВУД Т-2 обладает высокой термос-таоильностью в зоне рН 4,0 - 5,0. Инактивация фермента описывается уравнением реакций первого порядка. Значения рассчитанных теа-ме.цина;,,пческих параметров этого процесса позволяют предположит" , что в формировании белковой глобулы Фермента важную роль играет гидрофобные взаимодействия.

6. Найденные нами величины рК, теплоты ионизации, инаггича-шш глюкоамшшьи фотоокислением позволяют сделать выш. д, что в каталитический центр глюкоамилагы входит система карбокс ил - ir.i '-цы. ол

_ . . . - - - "21 -

7. Математические методы моделирования и планирования экспериментов позволили установить следующие рациональные режимы гидролиза: а) для кислотного-концентрация крахмала 20%; концентрация серной кислоты О,Я - 1,0 % к реакционной массе ( pH !,i - 1,2); температура гидролиза 127 °0; продолжительность гидролиза 90 мин; б) для ферментативного - концентрация нртоша 'го дозировка осахариваюирго фермента 2,0 »д/r крахмала; температура 60°С ; pH 4,5; продолжительность 48 часов. Степень гидролиза крахмала до глюкозы при кислотном способе 91,5 %;при ферментативном - 94,5 X.

8. Показано, что жесткий режим кислотного гидролиза крахмала связан с односторонней атакой Н4"-ионов на «-1,4- и «-1,6- глкжо-зидные связи; мягкий режим ферментативного гидролиза - с двухсторонней атакой этих свяаей системой карбоксил-имияааол активного центра гляжоаминазн, Рассчитанные значения энергий активаций подтверждают эту точку зрения.

9. Показана возможность и целесообразность замены кристаллической глюкозы на крахмальный гидролизат в соотев« электролита при электрохимическом способе получения глюконато качьция.

Список работ, опубликованных по теме диссертант:

1. Руалзе И.Д., Жеребцов H.A. Технология получения мя.льтозо-содержящего порлуфабриката / Механика сыпучих материалов: Тез. докл. Всесоюзной науч.конф., сентябрь 1991 г. -Одесса, 1991. -С.146.

2. Жеребцов Н. А., Шуваева Г.II., Руалп? И.Я., Ферментативный способ получения мальтозы / Научное обеспечение хранения и переработки Тез. докл. науч. конф..иоовящ. к 60-летию MTtffTff, октябрь 1991 г. - Москва, 1991. - часть 1, С.19

3. Zherebtsov N.A., Shuvaeva 6.Р. , Ruadz.e I.D., kadrik М. 1. Extraction separation of maltose from starch hydrolysate during crystalline maltose production / International organic substances solvent extraction conference. - Voronezh, September, 22-25, 1992,- Vol 2. - P.199-201

4. Яковлев A.H., -Григоров B.C., Руадзе И.Л. Влияние условий

культивирования и состава питательной среды на биосинтез амилав тёрмотолерантным мик'ромицетом / Биосинтез ферментов микроорганизмами: Тез. докл. науч. конф., октябрь 1993 г. - Москва, 1993. -С. 121

6. Шуваева Г.II., Руадзе И.Д., Жеребцов H.A. Микробные препараты в производстве Са-глюконата / Биосинтез ферментов микроорганизмами: Тез. докл. науч. конф., октябрь 1993 г. - Москва, 1993. - С.122

6. Жеребцов H.A., Шуваева Г.П., Руадзе И.Д. Получение глю-козных растворов из крахмала для производства глюконата кальция / Tea. докл. и сообщений XXXII научной внутривузовской конференции, май 1993 г. - Воронеж.- 1993, 0.10

7. Шуваева Г.П., Руадзе И.Д., Маягшкина Т.п. Влияние аминокислот на биосинтез глюкоамилазы микромицетами / Тез., докл. и сообщений XXX! 1 научной внутривузовской конференции, май 1993 г. ■• Воронеж.- 1993, 0.69

8. Руадзе И.Д., Жеребцов H.A., Дерканосова Н.М. Технология получения и использование глюконата кальция из крахмала / Проблемы ресурсосберегающих и природоохранных технологий и и оборудования для переработки и хранения сельскохозяйственного сырья: Tes. докл. Российской научно-практической конф. с международным участием,, август 1993 г. - Краснодар, - 1993.- 0. 8 - 9

9. Яковлев А.Н., Григоров В.С.,Руадзе И.Д. Получение патоки с высоким содержанием глюкозы / Проблемы ресурсосберегающих и природоохранных .технологий и и оборудования для переработки и хранения сельскохозяйственного сырья: Тез. докл. Российской научно-практической конф. с международным участием, август 1993 г. -Краснодар, - 1993.- С. 9-10

. 10. Жеребцов H.A., Руадзе И.Д., Шуваева Г.П., Сербулов Ю.С. Разработка режима кислотного гидролиза крахмала с целью получения кальция глюконата / Воронеж, технол. нн-т. - Воронеж, 1993. -Юс.- Деп. в ВИНИТИ 07.09.93, N 2399 - В93

11. Яковлев А.Н., Керебцов H.A., Григоров В.С.,Руадзе И.Д. Амилазы термотолерантного микромицета Aspergillus awamori ВУД Т-2, препаративное получение. - Биотехнология,- 19?4.- N 3.-С. 11-14

12. ЖереОцоЕ H.A., Руадзе И. Д., Дерканосова Н.М . Сербулов Ю.С., Макеева Е.В. Моделирование процесса культивирования микроорганизмов в жилкой ржаной яакваеке е внесением глгскгшата каль-

---------- 23 -

ция.- Вестник Российской Академии сельскохозяйственных наук.-1994.- N1,- С.63-65

13. Жеребцов H.A., Руадзе И.Д. Особенности кислотного и ферментативного гидролиза крахмала. - Известия ВУЗов пиврвяй технология,- 19Я4,- N 3-4,- О. 14-17

14. Жеребцов H.A., Дерканосова Н.М., Яковлев А.iL, Тертьгшая Т.Н., Руадзе И.Д. Ферментативный гидролив кукурузной муки.- Вестник Российской Академии сельскохозяйственных наук.- 1994,- N5 -O.Ö6-67

15. Руадзе И.Л-, Шуваева Г.П, Получение высокоочищенной глю-коамилазы / Тез. докл. XXX!I1 отчетной научной конференции за 1693 г. / Воронеж, технол. ин-т. - Воронеж, 1994.- С.142

16. Жеребцов H.A., Руадзе И.Д. К вопросу о механизме кислотного и ферментативного гидролиза крахмала / Тез. докл. XXXIII отчетной научной конференции за 1993 г. / Воронеж, технол. ин-т. -Воронеж, 1994.- 0.149

17. Руапзе И.Д., Жеребцов H.A., Шуваева Г.П. Сопоставление кислотного и ферментативного способов гидролиза крахмала / Тез. докл. XXXIV отчетной научной конференции за 1994 г. / Воронеж, гос. технол. акад. - Воронеж, 1994.- С.135

18. Руапзе И.Д., Шуваева Г.П. Разработка ферментативного способа получения мальтозы / Тез. докл. XXXIV отчетной научной конференции за 1994 г. / Воронеж, гос. технол. акад. - Воронеж, 1994,- С.136

19. Жеребцов H.A., Руадзе И.Д., Яковлев А.Н. О механизме кислотного И ферментативного гидролиза крахмала. [ Принято к печати в журнал "Прикладная биохимия и микробиология"].

20. Жеребцов H.A., Шуваева Г.П..Руадзе И.Д. Способ получения глюкойаТа кальция. Положительное решение Комитета Российской Федераций по патентам и товарным знакам по ваявке на изобретение N 93-029899 от 29.07.94.