Биотехнология получения циклодекстринов полифракционного состава на основе продуцента Paenibacillus ehimensis IB-739

Федорова, Полина Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биотехнология получения циклодекстринов полифракционного состава на основе продуцента Paenibacillus ehimensis IB-739
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биотехнология получения циклодекстринов полифракционного состава на основе продуцента Paenibacillus ehimensis IB-739"

На правах рукописи

ФЕДОРОВА ПОЛИНА ЮРЬЕВНА

БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИКЛОДЕКСТРИНОВ ПОЛИФРАКЦИОННОГО СОСТАВА НА ОСНОВЕ ПРОДУЦЕНТАРАЕШВАСШШ ЕНШЕЖК ІВ-739

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 ОЕЗ 2012

Уфа -2012

005008829

Работа выполнена в лаборатории прикладной микробиологии Учреждения Российской академии наук Института биологии Уфимского научного центра РАН (ИБ УНЦ РАН)

Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент

Усанов Николай Глебович

доктор биологических наук, профессор Мелентьев Александр Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Логинов Олег Николаевич

доктор химических наук, профессор Варламов Валерий Петрович

Ведущая организация: Государственное научное учреждение

Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук (г. Москва)

Защита диссертации состоится 17 февраля 2012 года в 14.00 часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.136.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, проспект Октября, д. 69.

Тел. (347) 235-62-47 E-mail: ib@anrb.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии Уфимского научного центра РАН, на официальном сайте http://vvTvw.amb.ru/inbio/sovet.html и на сайте ВАК Минобрнауки РФ.

Автореферат разослан 12 января 2012 г.

Ученый секретарь Объединенного диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

Р.В.Уразгильдин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Циклодекстрины (ЦД, циклические альфа-О-глюкопиранозиды), - перспективные биотехнологические продукты с высокой добавленной стоимостью, в основе технологии получения которых лежит энзиматическая трансформация крахмала микробным ферментом циклодекстринглюканотрансферазой (ЦГТазой, К.Ф.2.4.1.19).

Наиболее распространены и изучены альфа-, бета- и гамма-ЦД, различающиеся по количеству единиц a-D-глюкопнранозы в макрокольце, и соответственно, физическими и химическими свойствами.

Благодаря способности ЦД образовывать комплексы включения с разнообразными органическими и неорганическими соединениями, применение ЦЦ распространяется на такие непохожие отрасли, как пищевая промышленность, фармакология и косметика, органический синтез и нефтедобыча, сельское хозяйство и процессы защиты окружающей среды, биотехнологии и экологии (Singh et al., 2002; Biwer et al., 2002; Martin Del Valle, 2004; Szejtli, 2004; Li et al., 2007). Это обусловлено тем, что комплексообразование существенно изменяет физико-химические характеристики включенных молекул, придавая им новые, ранее не известные, полезные свойства.

В большинстве случаев для получения комплексов включения индивидуальных веществ с ЦЦ используют соответственно индивидуальные альфа-, бета- или гамма-ЦД. Однако, зачастую, например, для нужд пищевой, фармацевтической промышленности, требуется получить комплексы ЦЦ с веществами, состав которых не является гомогенным. Это могут быть вытяжки или экстракты растений, ароматические вещества природного происхождения и др. В этом случае использование индивидуальных ЦД не обеспечивает полноту включения всех компонентов системы и, тем самым, ограничивает потенциальные возможности получения инновационной продукции. В перечисленных случаях целесообразно использовать ЦД полифракционного состава, т.е. содержащие одновременно все три представителя гомологического ряда.

Для промышленного получения ЦД используются два принципиально разных подхода: %гетод неконтролируемой конверсии, в ходе которого в биохимический реактор вводятся лишь ЦГТаза и раствор крахмала, и контролируемый, когда в реакционную смесь добавляются еще и комплексообразователи (сольвенты) — органические или неорганические соединения, селективно реагирующие с одним из циклических сахаров с образованием нерастворимых или слаборастворимых комплексов включения, которые сдвигают равновесия реакции в сторону одного из целевых продуктов, в результате чего возрастает его выход (Abelyan, 2005). В ряде случаев выход ЦД возрастает, достигая 40-75% масс, по отношению к субстрату, но число подобных сольвентов, нашедших промышленное применение в производстве ЦД, ограничено.

Наиболее удачным вариантом технологии получения ЦД является сочетание специфичной ЦГТазы со специфичным комплексообразователем, который бы позволил осуществить конверсию крахмала с высоким выходом.

Применение комплексообразователей снимает проблему контаминации биореактора, упрощает технологию очистки продуктов конверсии из многокомпонентной реакционной смеси. В то же время, известные сольвентные технологии получения ЦД имеют ряд недостатков из-за токсичности комплексообразователей, сложности глубокой очистки ЦД от следовых количеств растворителей, их ограниченной доступности и высокой стоимости. В то же время, существует потребность в дешевых технических ЦД, в которых допускается наличие органических растворителей. В связи с этим поиск новых эффективных технологичных малотоксичных сольвентов для организации многотоннажного производства альфа-, бета- и гамма-ЦД остается нерешенной и актуальной проблемой до настоящего времени.

Цель исследования

Разработать методы ферментативной трансформации крахмала в циклодекстрины с применением бактериальной циклодекстринглюканотрансферазы и специфичного сольвента, обеспечивающих постоянство соотношения гомологов.

Задачи исследования

1. Провести тестирование коллекционных ЦГТ-активных культур для отбора штамма бактерий, секретирующего ЦГТазу широкой специфичности, катализирующую трансформацию крахмала в смесь трех гомологов ЦД.

2. Установить таксономическое положение штамма-продуцента и осуществить его идентификацию на основании совокупности морфологических, фи-зиолого-биохимических и филогенетических характеристик.

3. Разработать способы выделения, очистки исследуемой ЦГТазы и изучить физико-химические и каталитические свойства фермента.

4. Определить оптимальные параметры ферментативной конверсии крах-

мала исследуемой ЦГТазой для получения ЦД с постоянным соотношением гомологов в присутствии комплексообразователей. ■

5. Подобрать комплексообразователь и разработать технологию одновременного получения смеси альфа-, бета- и гамма-ЦД с высоким конверсионным выходом.

Научная новизна

Впервые обнаружен штамм вида РаешЬасШш еЫтет'хь 1В-739, секрети-рующий ЦГТазу широкой специфичности, инициирующую превращение крахмала до смесей пригодных для одновременного синтеза трех ТТЛ.

Определена полная последовательность гена 16Б рРНК Р. еЫтет'ю 1В-739, проведена реконструкция модели филогенетического древа и определено положение штамма в роду РаетЬасШш.

Изучены физико-химические и каталитические свойства ЦГТазы Р. еЫтетгх 1В-739. Максимальная каталитическая активность проявляется в интервале температур 40-45°С, оптимум рН=6,0, рН-стабильность в интервале

5,5-8,5, термостабильность - до 60°С. По данным электрофореза в присутствии SDS фермент имел молекулярную массу 75 кДа.

Исследованы различные комплексообразователи, в том числе используемые впервые, такие как бетулин, диметилсульфоксид, метил-трет-бутиловый эфир, коллоидная сера, кристаллическая сера, механо-активированная сера; комбинация сольвентов: Сера-МЭК, для проведения ферментативной конверсии крахмала в ЦЦ, которые могут быть применены в технологиях получения различных гомологов ЦД.

Разработана технология получения смеси ЦД полифракционного состава, основанная на использовании широкоспецифичной ЦГТазы P. ehimensis IB-739 и нового бинарного сольвента (Сера-МЭК) в качестве комплексообразователя.

Практическая значимость

Штамм-продуцент, секретирующий ЦГТазу широкой специфичности, идентифицирован как Paenibacillus ehimensis IB-739.

Полная последовательность генов 16S рРНК культуры депонирована в базе данных EMBL (European Molecular Biology Laboratory)/GenBank и доступна в сети Internet (http://vvvvw.ncbi.nlrn.nih.gov) под номером FN582329.

Подобраны условия подготовительной обработки крахмальных растворов высокой концентрации и определены оптимальные параметры ферментативной конверсии крахмала ЦГТазой P. ehimensis IB-739 для получения ЦД полифракционного состава: доза фермента 10,0 ед на 1,0 г субстрата, концентрация крахмала 5,0-15,0%, продолжительность процесса ферментолиза- 8-12 ч.

Предложено новое техническое решение для осуществления ферментативной трансформации крахмала в ЦД полифракционного состава, основанное на использовании бинарной системы комплексообразователей.

Показана принципиальная возможность и перспективность использования изученных комплексообразователей в технологиях получения альфа-, бета-и гамма-ЦД.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на ряде научных форумов: международной научно-практической конференции «Современная биотехнология: фундаментальные проблемы, инновационные проекты и бионанотехнология» (Брянск, 2010), Международной научной конференции «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010), VI Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010), XIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2011), XV Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011); Всероссийской научной конференции с международным участием «ЭКОБИОТЕХ-2011» и II Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Современные методы и подходы в биологии и экологии» (Уфа, 2011); VI Всероссийской научной Интернет-конференции «Интеграция науки и выс-

шего образования в области био- и органической химии и биотехнологии» (Уфа, 2011).

Конкурсная поддержка работы

Исследования поддержаны грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «Разработка технологии получения опытных образцов альфа-, бета- и гамма-циклодекстринов» (Государственный контракт № 8370/13979 от 29.04.2011 г.) по программе «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («У.М.Н.И.К.»).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 2 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикаций материалов кандидатских работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения результатов, выводов, приложений и списка цитируемой литературы, содержащего 194 ссылки. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка и 9 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизмы. В работе использовали штаммы продуцентов цикло-декстринглюканотрансфераз из коллекции лаборатории прикладной микробиологии Института биологии УНЦ РАН: Bacillus sp. IB-739, P. illinoisensis IB-1087, P. campinasensis IB-417, P. macerans IB-1053, идентифицированные no физиолого-биохимическим и филогенетическим признакам.

Среды, используемые для наработки образцов ЦГТазы.

Среда для Bacillus sp. IB-739 включала следующие компоненты, г/л: крахмал - 10,0; пептон - 4,0; дрожжевой экстракт - 5,0; КН2Р04 - 1,0; СаС03 -1,0; pH 7,0-7,2.

Среда для P. illinoisensis IB-1087 включала следующие компоненты, г/л: крахмал - 10,0; пептон - 5,0; дрожжевой экстракт - 5,0; К2НР04 - 2,0; NaH2P04 - 2,0; pH 7,2-7,4.

Среда для P. macerans IB-I4 включала следующие компоненты, г/л: крахмал — 10,0; пептон — 3,0; дрожжевой экстракт - 3,0; кукурузный экстракт - 3,0; КН2Р04- 2,0; (NH4)2S04 - 2,0; СаС03 - 1,0; pH 7,2-7,6.

Среда для P. campinasensis IB-417 включала следующие компоненты, г/л: крахмал - 10,0; пептон - 3,0; дрожжевой экстракт - 3,0; кукурузный экстракт -3,0; К2НР04 - 2,0; СаС03 - 2,0; Na2C03 - 0,8-1,0; pH 9,2-9,8.

Условия культивирования. Выращивание бактерий осуществляли в течение 68-72 часов при температуре 37-39°С и скорости перемешивания 180 мин'1 на воздушно-термостатируемых качалках типа УВМТ-12-250.

Таксономические исследования. Изучение морфологических и физио-лого-биохимических характеристик используемых культур, способных к секреции внеклеточных ЦГТаз, проводили руководствуясь общей стратегией

фенотипической дифференциации предложенной Gordon (1973) и описанной в руководствах: «Определитель бактерий Берджи» (1997), «Методы общей бактериологии» (Герхардт и др., 1984), «Идентификация почвенных бактерий рода Bacillus» (Скворцова, 1983).

Культуральные особенности микроорганизмов изучали на агаризо-ванных средах. Морфология клеток изучалась прямой микроскопией живых культур в динамике роста с использованием микроскопа «Leica DM 1000» (Германия).

Измерение ЦГТазной активности растворов и препаратов проводили модифицированным фенолфталеиновым методом (Усанов с соавт., 2007), используя для разбавления фермента 50 мМ ацетатный буфер pH 6,0-6,1, содержащий 10,0 мМ СаС12. За 1 единицу активности принимали количество ЦГТазы, катализирующее образование 1,0 мкМ Р-ЦЦ в течение 1 мин при 40°С.

Измерение вязкости растворов крахмала проводили с помощью цифрового ротационного вискозиметра Brookfild LSRV (США) в стеклянном реакторе объемом 400 мл, снабженном термостатирующей рубашкой. Температуру в рубашке поддерживали с помощью водного циркуляционного ультратермостата типа UH-4. Температуру в стакане фиксировали с помощью цифрового термометра с выносным датчиком («RST Sweden», Швеция).

Ферментация. Реакцию ферментативной конверсии картофельного крахмала в ЦЦ'проводили в периодическом режиме в стеклянном реакторе с рабочим объемом 160 мл, снабженном термостатирующей рубашкой и магнитным перемешивающим устройством. Реакцию проводили при температуре 45°С и скорости мешалки 300 мин1.

Количественное определение концентрации циклодекстринов. Определение продуктов трансформации крахмала под действием ЦГТазы осуществляли с помощью ВЭЖХ на колонке «SEPARON-NH2»-5mkm (3x150 мм), используя в качестве элюента смесь ацетонитрил - вода в объемном соотношении 63:37. Подачу растворителя осуществляли насосом высокого давления НРР-5001 со скоростью 0,7 мл/мин и рабочим давлением — 70-100 ати, в качестве детектора использовали рефрактометр RIDK-102. Регистрацию и оцифровку ана^ логового сигнала, последующую обработку хроматограмм проводили с помощью программно-вычислительного комплекса «Мультихром 1.59».

Статистическая обработка экспериментальных данных. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили стандартными методами дисперсионного и корреляционного анализа, выполнявшиеся с помощью программы Microcal Origin 7.5 Pro.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ * Выбор продуцента ЦГТазы

Фактором селекции для отбора продуцентов ЦГТаз служила их специфичность в отношении спектра ЦД, накапливающихся в продуктах конверсии крахмала. При действии ЦГТазы на крахмал в реакционной смеси одновременно образуются все три гомолога. В зависимости от того, какой из них доми-

нирует в продуктах конверсии, различают а-, р- и у-ЦГТазы, природа которых в свою очередь зависит от видовых генетических особенностей штамма-продуцента. Например, a- (Gawande and Patkar, 2001), (3- (Alves-Prado et al., 2007) и у-ЦГТазы (Kato and Horikosbi, 1986; Hirano et al., 2006).

Для изучения кинетических особенностей ЦГТаз бактерий коллекции Института биологии УНЦ РАН P. campinasensis IB-417, P. illinoisensis IB-1087, P. macerans IB-14 и Bacillus sp. IB-739 был применен собственный подход, основанный на определении безразмерных коэффициентов (Федорова, Усанов, 2011), являющихся отношениями молярных концентраций Киа=[р-ЦД]/[а-ЦД] и Кит=[Р-ЦД]/[у-ЦД] в продуктах суточной конверсии крахмала. На рисунке I представлены результаты сравнения каталитических свойств четырех изученных штаммов циклодекстриногенньгх бактерий. Как следует из графического представления, зависимости молярных соотношений Ки^р-ЦД^а-ЦД] и Киг=[Р-ЦД]/[у-ЦД] от величины стартового соотношения фермент/субстрат (Е/S) в двойных логарифмических координатах выражаются линейными функциями. Полученная информация позволяет сравнивать динамику накопления различных форм ЦД, а также ее зависимость от дозы внесенного фермента для разных типов ЦГТаз. Например, при использовании P-ЦГТазы алкалотолерант-ной P. campinasensis (А), накопление Р-ЦД относительно а-ЦД падает с увеличением относительной дозировки фермента и этот процесс сопровождается ростом отношения KUa. Учитывая, что фермент на ранних стадиях реакции (что адекватно низким удельным дозировкам ЦГТаз) катализируют преимущественное образование длинноцепочечных р- и у-ЦД, которые по мере накопления начинают изомеризоваться в а-ЦД, следует, что удельный выход у-ЦД также снижается по мере продолжения реакции. Схожими кинетическими особенностями обладает Р-ЦГТаза P. illinoisensis (Г).

ЦГТаза P. macerans (В) катализирует трансформацию крахмала иным образом: сначала в среде накапливается а-ЦД, который по мере увеличения соотношения Е/S трансформируется в Р-ЦД. Каталитическая «ретрансформация» аи у-ЦД в р- форму, по мере нарастания их концентраций в ходе реакции является типичной и хорошо известной особенностью ферментов данного типа (Patrick et al., 1995).

Для ЦГТазы Bacillus sp. IB-739 характерно образование относительно постоянных соотношений а-, р- и у-ЦД, мало зависящих от дозы внесенной ЦГТазы (Б), с достаточно стабильными коэффициентами KUa и KUy при различных соотношениях Е/S. Бактерии Bacillus sp. IB-739 секретируют ЦГТазу широкой специфичности, инициирующую превращение крахмала до смесей, пригодных для одновременного синтеза трех циклических декстринов.

Морфологическая и физиолого-биохимическая характеристика продуцента ЦГТазы

Культура аэробных спорообразующих бактерий Bacillus sp. IB-739 была выделена в 1987 году из почвенного образца серой лесной среднегумусной почвы Республики Башкортостан (Патент РФ № 1743019, 1994).

Я 101

з 10-

■6-

■&

В 10

-е-

•&

_ л

ед/гАСВ

____-л- ■

. -

ед I г АСВ

•&

МО

“б-

ед / г АСВ

ед/г АСВ

Рисунок 1. Зависимость выхода циклодекстринов от концентрации ЦГТаз, выделенных из бактерий различных видов в течение 24 ч трансформации 2,75% крахмала: А — P. campinasensis IB-417; Б — Bacillus sp. IB-739; В - P. macerans IB-14; Г - P. illinoisensis IB-1087. Кривые (1) и (2) обозначают величины безразмерных коэффициентов равных молярным отношениям [Р-ЦД]/[а-ЦД] и [Р-ЦД]/ [у-ЦЦ] в продуктах реакции соответственно.

Штамм Bacillus sp. IB-739 обладал выраженной ЦГТазной активностью, а по каталитическим свойствам фермент, резко отличался от аналогичного фермента P.macerans ВКМ В-506т (Егоров и др., 1988). Согласно физиологобиохимическому тестированию культура Bacillus sp. IB-739 была отнесена к фирмикутам, обладающим подвижностью, образующим эллиптические спорьг, раздувающие спорангий, и способным к росту при температурах до 50°С. Рост бактерий наблюдается в диапазоне pH 6,4-8,7 на средах с глюкозой, крахмалом, пептоном, дрожжевым экстрактом. Клетки обладают каталазной и оксидазной активностью, восстанавливают нитраты, не образуют ацетилметилкарбинол. На жидких средах с а-ЦД, р-ЦЦ, глюкозой, сахарозой, арабинозой, маннитом, глицерином и D-ксилозой развитие бактерий сопровождается подкислением без образования газа.

Филогенетическая характеристика продуцента ЦГТазы Согласно сумме фенотипических признаков, исследуемый штамм IB-739 был таксономически позиционирован как близкий к типовой культуре Paeniba-cillus ehimensis JCM 9907T (Kuroshima et al., 1996; Lee et al., 2004). По данным анализа последовательностей гена 16S рРНК построено филогенетическое древо. Филогенетические взаимоотношения исследуемого штамма с другими видами Paenibacillus, в том числе обладающими ЦГТазной активностью, представлены на рисунке 2. Обнаружено, что ближайшими родственными культурами изолята IB-739 оказались P. ehimensis КСТС 3748т (AY116665), P. ehimensis IB-G2P (FN582330), P. ehimensis HSCC 595 (АВ045101), P. elgii SD17 (AY090110) с гомологией генов 16S рРНК 98,7%; 99,4%; 99,1% и 97,6% соответственно. Как видно из представленного древа, культура IB-739 вписывается в кластер P. ehimensis, на основании чего с высокой долей вероятности может быть отнесена к представителям этого вида.

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под названием P. ehimensis ВКМ B-2680D.

Оптимизация состава питательной среды для культивирования продуцента ЦГТазы P. ehimensis IB-739 Известно, что большинство ЦГТаз эктрацеллюлярны. Однако, в случае культивирования P. ehimensis IB-739, процесс выделения ЦГТазы из КЖ осложнялся накоплением в ферментационной среде больших количеств микробных экзополисахаридов, обуславливающих повышенную вязкость КЖ. Для снижения накопления экстрацеллюлярных полисахаридов в КЖ, а также для устойчивого биосинтеза и увеличения активности ЦГТазы культурой P. ehimensis IB-739, была проведена оптимизация состава питательной среды, включающая варьирование таких параметров как содержание субстрата, источников азота различной природы, буферных компонентов, источников кальция. Эффект был достигнут при выращивании штамма в присутствии карбоната кальция в концентрации 1-2 г/л. Динамическая вязкость КЖ составила 55-75 сПа, в то время, как в варианте без использования карбоната кальция она достигала 1560-1640 сПа, и была приемлема для выделения ЦГТазы.

0.02 I------------1

74 100

100

P.ehimensis 1B-G2P P.ehimensis KCTC3748 P.ehimensis IB-739 P.ehimensis HSCC595T LP,elgii SD17

P.validus JCM-90

--P.naphthalenovorans strain PR-N1

---------P.alginoK ticus DSM5050T

-----------P.larvae DSM 3615

-P.chitinolyticus 15660T

100 <------------------P.chibensis NRRLB-142T

---------P. azoredusens DSM 13822T

100 j-------------------------P.pabuii US 132

I--------P.iliinoensis JCM9907T

10И j------------------------P.stefiifer IS1T

I-------------------------P. araminis RSA! 9T

---P.macerans 1AM 12467

---P. campinasensis JCM11200

-------P.polymyxa DSV136T

- P.alvei ЛТСС 6344T -------P.thiaminolyticus JCMS360T

-Bacillus subtils NCD01769

Рисунок 2. Филогенетическое древо, демонстрирующее возможное положение штамма Р. еЫте^э 1В-739 среди представителей рода РаетЬасШия.

Изучение динамики синтеза ЦГТазы Р. еЫтст'и 1В-739

Изучение динамики синтеза ЦГТазы культурой Р. еЫтепз15 1В-739 показало, что секреция ЦГТазы начиналась через 25-27 ч от начала культивирования с подъемом активности до ,.........................

максимального (и стабильного) в ^ I * Активность ЦГТазы, ед/мл | уровня 3,7-4,2 ед/мл после 48-55 ч (рис. 3). Микроскопирование проб КЖ показало, что процесс активного деления клеток к этому времени прекращается. Спорообразование культуры Р. еЫтет!8 1В-739 в ферментационной среде начиналось через 48 ч культивирования.

Этот процесс полностью завершался через 72 ч, когда в среде накапливалось максимальное количество ЦГТазы.

Обнаружено, что максимальное накопление ЦГТазы в жидкой

10 20 30 40 50 60 70 Время культивирования, ч

Рисунок 3. Динамика роста биомассы и синтеза ЦГТазы в ходе культивирования штамма Р. еЫтет'и 1В-739.

среде штаммом Р. еЫтет1$ 1В-739 происходит в период стационарной фазы роста и коррелирует с процессом перехода от вегетативной стадии роста к спорообразованию.

Очистка препарата ЦГТазы Р. еЫтепш 1В-739 В результате проведенной очистки конечный выход ЦГТазы составил -12% от начального, при удельной активности препарата —770 ед/мг белка и степени очистки 25,9Х. Общие результаты очистки ЦГТазы Р. еМте№1з IВ-739 представлены в таблице 1.

Таблица 1. Очистка ЦГТазы культуры Р. е/гітепяія 1В-739

Стадии очистки Объем, мл ЦГТаза Белок, мг Степень очистки Вы- ход, %

Ед. Ед/мг белка

Исходная культуральная жидкость 1200 ■л ґ\ґ\ о 29,2 68,4 і 100

Ультрафильтрация 300 1926 52,3 36,8 1,76 94,9

Сорбция на крахмале 105 803,2 181,3 4,43 6,11 39,6

Ионно-обменная хроматография 22 245,1 769,2 0,29 25,9 12,08

Методом электрофореза в денатурирующих условиях была продемонстрирована гомогенность полученной ЦГТазы, достаточная для изучения ее физико-химических и каталитических свойств (рис. 4).

По зависимости электрофоретической подвижности от молекулярной массы белковых молекул была определена молекулярная масса ЦГТазы культуры Р. еЫтет1$ 1В-739 равная 75 кДа.

Физико-химические свойства ЦГТазы Р. ehimensis 1В-739

Стандартными методами были определены температурный и pH оптиму-мы, температурная и pH стабильность очищенного препарата (рис. 5). Исследуемый фермент проявлял наибольшую циклизующую активность при температуре 40-45°С, величина которой существенно зависела от кислотности растворов с оптимумом рН=6,0, препарат был относительно устойчив в диапазоне pH 5,5-8,5, при температурах до 60°С. Добавление ионов кальция в виде СаС12 (в конечной концентрации 10 мМ) оказывало лишь незначительное стабилизирующее действие на изучаемый фермент.

к; и» А

гоо

116

66 4Ю*>

55 як

45 Ир

24 Ик

Рисунок 4. Электрофоре-грамма препарата ЦГТазы в 12%-ном ІТААГ в денатурирующих условиях. А - маркеры М.М.; Б - препарат ЦГТазы, после частичной

2 4 6 8 10 12 30 40 50 60 70 80

pH Температура, °С

Рисунок 5. Физико-химические свойства ЦГТазы Р. е/нтелга 1В-739: А - рН-оптимум, Б - оптимальная температура реакции образования циклодекстринов, В - рН-стабильность, Г - термостабильность (1 - без добавления Са2+и 2 - в присутствии 10 мМ СаС12).

Исходя из того, что ЦГТазы обладают аффинностью к субстрату, мы предположили, что наличие крахмала может оказывать стабилизирующее влияние на термостабильность. В связи с этим, в нашей работебыл использован метод определения термостабильности ЦГТазы в присутствии субстрата по динамике изменения динамической вязкости среды с помощью цифрового ротационного вискозиметра 1!гоокЛ1с1 ЬвЯУ при скорости вращения ротора 10 мин'1.

Снижение вязкости 10%-ного раствора крахмала при 70°С после внесения фер-фермента происходило в течение 56 мин (рис. 6). Из этого следует, что при 70°С фермент активно работает и присутствие субстрата (крахмала) оказывает стабилизирующее действие на фермент. Этот факт говорит о возможности проведения реакции трансформации крахмала в ЦД при более высокой, чем оптимальная, температуре, оказывая положительное влияние на реологические свойства ферментационной среды, без существенного снижения циклизующей активности ЦГТазы Р. еЫтеп.Ч15 1В-739. В технологическом плане это указывает на принципиальную возможность применения данного фермента для предварительного «ожижения» крахмального клейстера перед ферментативной трансформацией.

Ферментативная трансформация крахмала в циклодекстрины

В процессе конверсии крахмала происходит одновременное образование всех трех ЦД в различных соотношениях а-, р- и у-ЦД. Выход индивидуальных ЦД зависит от характера используемой ЦГТазы, ее количества, концентрации субстрата, физико-химических условий проведения ферментного катализа.

Влияние дозировки Фермента на накопление ТЩ

Определяющее значение для процесса ферментации имеет количество добавляемого фермента. Незначительный избыток фермента приводит к резкому снижению выхода ЦД, поскольку начинает преобладать реакция диспропор-ционирования с образованием линейных мальтоолигосахаридов. При низких концентрациях ЦГТазы количество образовавшихся ЦД также незначительное, что может быть объяснено тем, что за данный отрезок времени реакция не успевает полностью закончиться, т.е. при увеличении времени инкубации возможно достижение максимального выхода ЦЦ. Таким образом, для получения удовлетворительного выхода ЦД количество добавляемого фермента необходимо по возможности минимизировать (Абелян и др., 1991).

о 5

- 1

сЗ о

Гч

^ о. Внесение ЦГТазы

-До внесения ЦГТазы После внесения ЦГТазы

О 20 40 60 80 100 120

Время, МИН

Рисунок 6. Снижение вязкости 10%-ного раствора крахмала в присутствии ЦГТазы Р. е/гшгеш/х 1В-739.

Особенностью ЦГТазы

! Р. еЫтет1з Ш-739 является то, что I для этого фермента характерно образование относительно постоянных соотношений а-, (3- и у-ЦД, мало зависящих от дозы внесенной ЦГТазы.

Однако суммарный выход ЦД может зависеть от внесенной дозы фермента. Данные наших исследований свидетельствуют (рис. 7), что опти-1 мальными для трансформации крахмала в ЦД можно считать удельную 1 дозировку на уровне 8,0-10,0 ед на ) 1,0 г субстрата.

Влияние времени трансформации на выход ЦД

I Концентрация ЦД во время конверсии крахмала непрерывно меняется, и

содержание циклических олигосахаридов в реакционной смеси практически всегда проходит через максимум. При действии исследуемой ЦГТазы Р. еЫтет1$ 1В-739 на неожиженный 3%-ный картофельный крахмал при | удельной дозировке фермента 10,0 ед/г, происходило одновременное накопле-

| ние а-, Р- и у-ЦД, при этом реакция практически прекращалась через 10-12 ча-

сов. Суммарный выход циклических декстринов достигал 45-47% от использованного субстрата (рис. 8).

Известно, что циклические продукты, образовавшиеся в первый момент реакции, продолжают участвовать в ней, непрерывно трансформируясь друг в друга, причем этот процесс мо- I

жет происходить и В отсутствие крах- ,

мала (УПеЦ & а!., 1990; ваЬюш апс!

Рагк, 1992; Воуейо, 1992; Абелян,

1995). |

Для ЦГТазы Р. еЫтежв 1В-739 I

помимо трансформации крахмала в ЦД I

свойственны также реакции дециклизации и межмолекулярного трансгли- '

козилирования. При конверсии смеси, |

содержащей 5%-ный раствор Р-ЦД в 50 мМ ацетатном буфере (pH 6,0-6,1) и ЦГТазу Р. еЫтешя 1В-739 (в дозировке 10,0 ед на 1,0 г Р-ЦД), в продуктах реакции обнаруживаются три гомолога ЦД при соотношении а-, р-, у-форм I

равном 12,5: 83,6: 3,9 % масс. ,

о 50

І.40-1

Ф 30 о

5 20

- Выход альфа-ЦД, %

- Выход бета-ЦД, %

- Выход гамма-!ДД, %

- Общий выход ЦД, %

СО 0 2 4 6 8 1012 14 16 18 20 22 24 Время реакции, ч Рисунок 8. Влияние времени реакции на выход циклодекстринов. Концентрация ЦГТазы 10,0 ед на ! ,0 г субстрата.

50 дозо-20 10-і

- Выход альфа-ЦД, %

- Выход бега-ЦД, %

- Выход гамма-ЦД, %

- Общий выход ЦД, %

О 2 4 6 8 10 12

Доза фермента, ед/г крахмала

Рисунок 7. Влияние дозировки ЦГТазы Р. екітетіз 1В-739 на выход циклодекстринов.

Влияние концентрации субстрата на выход ПД Концентрация субстрата существенно влияет на выход ЦД в результате реакции циклизации. В процессе изменения стартовых концентраций неожи-

женного субстрата в диапазоне от ]

§30

1 20 ГГ

10-1

Ъ 0 ш

' Выход альфа-ЦД, %

- Выход бета-ЦД, %

- Выход гамма-ЦД. %

- Общий выход ЦД. %

10 12 14 16

до 15%, удельный выход суммы циклических продуктов снижался соответственно с 55% до 20% (рис. 9). Аналогичные результаты получены также для других типов ЦГТаз (Маке-la et al., 1988; Akimaru et al., 1991a; Bovetto et al., 1992; Abelyan et al., 1993; Абелян и др., 1994).

Выход ЦД выше при использовании неразжиженного (нативного) крахмала (Lee and Kim, 1991). Однако, в этом случае, достижимое содержание субстрата в биореакторе не может превышать 3-5%, из-за высокой вязкости клейстера. Снижение концентраций приводит к одновременному увеличению объемов реакторов и повышению финансовых затрат. Возрастают энергетические расходы на выпаривание больших количеств жидкости в процессе последующего выделения ЦД из реакционной смеси, снижаются экономические показатели. Использование высоких концентраций крахмала предполагает его предварительную обработку химическими, физическими или ферментными методами (Абелян и др., 1995а).

Наиболее распространенными являются ферментные методы обработки, например, крахмал гидролизующими ферментами, такими как пуллуланазы и изоамилазы, увеличивающими выход ЦД на 4-6% (Schmid, 1996: Rendleman, 1997). В то же время, для ожижения

Концентрация субстрата, %

Рисунок 9. Влияние концентрации субстрата на выход циклодекстринов. Концентрация ЦГТазы 10,0 ед на 1,0 г субстрата.

крахмала применяются ЦГТазы, используемые для трансформации крахмала (Lee and Kim, 1992; Slo-minska and Sobkowiak, 1997; Prowe and Antranikian, 2001).

Для изучения процессов ферментативной трансформации крахмала в ЦД, при дальнейших исследованиях, мы проводили предварительное ожижение субстрата, используя ферментативную обработку суспензий крахмала ЦГТазой P. ehimensis 1В-739. На рисунке 10 показан процесс изменения вязкости

100000,

юооо-

£ 1000

э 100

Концентрация картофельного крахмала:

—V- 10%

-*-15%

20 40 60 80 100 120 140 160 Время реакции, мин Рисунок 10. Снижение вязкости 10 и 15%-ных растворов крахмала в присутствии ЦГТазы Р. eh.imen.sis 1В-739.

10 и 15%-ных растворов крахмала с течением времени в присутствии ЦГТазы. При этом дозировка фермента равная 0,2 ед на 1,0 г крахмала обеспечивала снижение вязкости даже 15%-ного раствора картофельного крахмала до приемлемых значений 600-700 сПа.

Ферментативная конверсия крахмала с использованием органических и неорганических соединений

Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что, несмотря на все ранее обнаруженные положительные особенности ЦГТазы P. ehimensis IB-739 суммарный выход ЦД не превышает 50% и достигнуть технологически приемлемой степени конверсии субстрата без использования комплексообразо-вателей нам не удастся.

Известно, что селективность комплексообразователя сильно зависит от типа используемой ЦГТазы, что приводит к совершенно разным результатам, в одном случае повышая, в другом — подавляя реакцию циклизации (Blackwood and Bucke, 2000; Starnes, 2001). В то же время, выход и соотношение ЦД также меняются в зависимости от условий реакции, которые необходимо подобрать для каждого конкретного фермента.

В нашей работе, мы изучали влияние различных комгогексообразователей на процесс ферментативной конверсии картофельного крахмала (5%-ного раствора, предварительно ожиженного ЦГТазой P. ehimensis IB-739). Для этих целей в ферментационную среду добавляли исследуемое вещество в количестве, определяемом из стехиометрического соотношения комплексант: ЦД = 1:1, предполагая, что выход ЦД, составит не менее 50% от количества субстрата.

Результаты испытания ряда сольвентов в процессе ферментолиза и их влияния на суммарный выход ЦД, а также выход их индивидуальных форм представлены на рисунке 11. По этим данным, в контрольном варианте опыта, при суммарном выходе ЦД 61,3%, соотношение а-, р- и у-ЦД составило 28,0: 59,6: 12,4 % масс., что можно рассматривать в качестве равновесного состава продуктов реакции для данной ЦГТазы.

Большинство испытанных комплексообразователей существенно увеличивают суммарный выход ЦД: избирательно повышают выход Р-ЦД, но приводят к снижению доли а- и у-ЦД в конечном продукте.

При использовании элементной серы общий выход ЦД увеличивался незначительно - на 8-10%. Следует отметить, что при этом, соотношение а-: Р-: у-ЦД практически не изменялось по сравнению с результатами конверсии крахмала без добавления комплексообразователей и составило 28,1: 59,0: 12,9 % масс., что соответствует равновесному состоянию при выходе 67,8%.

Известно, что ЦД плохо подходят для получения комплексов с неорганическими соединениями (Szejtli, 1988). В отношении серы известно, что она образует комплекс включения с у-ЦД, в котором она представлена в аллотропной форме S8 (Патент РФ № 2321598, 2008). Получение комплексов включения ЦД с серой затрудняется ее чрезвычайно низкой растворимостью в водных средах. Возможно, невысокий выход ЦД при добавлении комплексообразователя

Вьіход циклодекстринов, %

^О'

ШШ Выход альфа-ЦЦ, % (ШИ Выход бета-ЦД, % |ЕЖ§] Выход гамма-ЦД, % ЛИШ Общий выход ЦД, %

Рисунок 11. Состав продуктов ферментативной конверсии крахмала при использовании различных комплексообра-зователей. Концентрация картофельного крахмала составляет 5,0%, дозировка ЦГТазы - 10,0 ед на 1,0 г субстрата.

может быть связан с недостаточной доступностью элементной серы для комплексообразования с ЦД в реакционных растворах.

С целью преодоления этой проблемы мы решили использовать различные формы серы, а именно коллоидную, полученную из гипосульфита натрия (Методические разработки..., 1999), и механо-активированную, полученную при ее механической обработке в дезинтеграторном устройстве. В другом варианте мы решили использовать раствор серы. Эмпирически был подобран растворитель для элементной серы - метилэтилкетон (МЭК), согласно предварительным испытаниям, не сдвигающий равновесие в сторону образования а- или Р-ЦД-Предварительно была определена растворимость серы в МЭК, составившая 5,24±0,2 мг/ мл.

В серии экспериментов была осуществлена ферментативная трансформация 10%-ного деполимеризованного картофельного крахмала ЦГТазой Р. еЫтет'м 1В-739 (в дозировке 10 ед на 1,0 г) в присутствии серы и ее раствора в МЭК (при стехиометрическом соотношении комплексант : ЦД = 1:1). В таблице 2 представлены полученные результаты.

Таблица 2. Состав продуктов ферментативной конверсии 10%-ного «ожижен-ного» картофельного крахмала при использовании различных форм серы в качестве комплексообразователей

Сольвент Общий выход ЦД, % Соотношение ЦД в реакционной смеси, % масс.

альфа- бета- гамма-

Без сольвента 36,07 30,9 57,1 12,1

Сера механо-активированная 44,22 27,6 69,3 3,1

Сера коллоидная 50,85 32,1 63,4 4,5

Сера в МЭК 65,01 29,0 65,8 5,2

Из представленных данных следует, что в варианте с сочетанием двух комплексообразователей (Сера+МЭК), степень конверсии 10%-ного картофельного крахмала повышается до 65-67%. Без использования комплексообразователей суммарный выход ЦЦ не превысил 36%. Существенного изменения соотношения а-, Р-, у-ЦД по сравнению с контролем не происходит и, таким образом, данная смесь комплексообразователей позволяет осуществить конверсию крахмала с более высоким выходом одновременно трех гомологов.

Разработка лабораторной технологии получения ЦД полифракцнонного состава

С применением сочетания широкоспецифичной ЦГТазы Р. еШтепзк 1В-739 и бинарного комплексообразователя была разработана лабораторная технология получения ЦД полифракцнонного состава, включающая следующие основные этапы (рис. 12):

Крахмал

і ИГ Га ;.! —N Ожижение и /1—1 Буферные

: Р- екіпгепхіх 1В-739 : . • - п7 клеистеризация \—| компоненты

. ^ ..

Элементная сера в Ферментативная И—І ТДГТаза :

: растворе МЭК и трансформация \і—( /'. гкітатк 1 В-739 |

н:

Продукты

Инактивация ЦГТазьг Р. екітетіз 1В-739

Глюк'оамйяаза

Гидролиз остаточного крахмала и линейных декстринов

~нпг

Дистилляция

ип

Фильтрация

иг

Сушка

ИИ

мэк

Сухая реакшонтаа смесь, содержащая альфа-, бета-, гамма- ИД

Рисунок 12. Схема получения смеси циклодекстринов.

1. Подготовка субстрата для ферментативной конверсии.

В качестве субстрата был использован 15%-ный картофельный крахмал. Оптимальная дозировка ЦГТазы Р. е/иотеяж Ю-739 для ожижения по предварительным экспериментам составила 0,2 ед на 1,0 г АСВ крахмала.

2. Ферментативная конверсия в присутствии бинарного комплексообра-зователя.

Дозировка ЦГТазы Р. еЫтет1$ 1В-739 для реакции циклизации составила 10,0 ед на 1,0 г крахмала.

Предварительно были подобраны оптимальная концентрация МЭК (5%

об./об.) и элементной серы (5%) в растворе МЭК для получения наибольшего выхода ЦД без существенного изменения соотношения между а-, р-, у-ЦД-

Основываясь на результатах исследования динамики конверсии крахмала, комплексообразователь следует вносить в первые несколько часов ведения ферментолиза, поскольку именно в это время отмечалась максимальная скорость накопления ЦД под действием ЦГТазьг.

Ферментативную конверсию проводили при температуре 45 С и pH 6,0, которые были выбраны исходя из особенностей применяемой для конверсии крахмала ЦГТазы штамма.

Время ведения процесса ограничили 24 часами, так как к этому сроку скорость конверсии крахмала в ЦД замедляется настолько, что дальнейшее ведение процесса нецелесообразно.

3. Выделение, разложение комплекса и получение ЦД.

Для освобождения конверсионной смеси от остаточного крахмала и линейных декстринов был проведен гидролиз реакционной смеси глюкоамилазой при 70°С в течение 10 ч, после предварительной инактивации ЦГТазы Р. еШтепв'и 1В-739 термообработкой при 100°С.

Дистилляция получаемой водной суспензии комплекса до объема 50% от первоначального и последующая фильтрация приводит к его разрушению и удалению МЭК и серы.

Таким образом, в лабораторных условиях продемонстрирована возможность получения ТТП полифракционного состава на основе технологии, включающей использование широкоспецифичной ЦГТазы Р. еЫтепв'ю 1В-739 и бинарной системы МЭК-Сера в качестве комплексообразователя при конверсии крахмала. Данная технология обеспечивает наличие в конечном продукте трех гомологов а-, Р-, у-ЦД, в соотношении соответствующем нативному, а именно 25,6:66,3: 8,1 % масс, с общим выходом циклодекстринов до -75%.

ВЫВОДЫ

1. На основании тестирования коллекционных культур выбран штамм, продуцирующий циклодекстринглюканотрансферазу широкой специфичности. Согласно физиолого-биохимическим, культурально-морфологическим характеристикам и последовательности гена 168 рРНК, штамм идентифицирован как РаетЬасШиь еЫтет(з 1В-739.

2. Изучены физико-химические и каталитические свойства ЦГТазы Р. е}итеин1.ч 1В-739. Максимальная каталитическая активность проявляется в интервале температур 40-45°С, оптимум рН=6,0, рН-стабильность в интервале

5,5-8,5, термостабилыюсть — до 60°С.

3. Подобраны условия предподготовки крахмальных растворов высокой концентрации для ферментолиза и определены оптимальные параметры ферментативной конверсии крахмала ферментом Р. еЫтет1х ГВ-739 для получения ЦД с постоянным соотношением гомологов (ЦД полифракционного

состава): концентрация крахмала 5,0-15,0%, доза фермента 10,0 ед на 1,0 г субстрата, продолжительность процесса ферментолиза - 8-12 ч.

4. Исследован процесс ферментативной конверсии крахмала с использованием комплексообразователей и разработан бинарный сольвент - МЭК-Сера, обеспечивающий выход ЦД не ниже 75%, при сохранении постоянного соотношения гомологов.

5. Разработана схема получения ЦД полифракционного состава, основанная на использовании широкоспецифичного фермента Р. еЫтепз1я 1В-739 и нового бинарного сольвента в качестве неспецифичного комплексообразовате-ля.

БЛАГОДАРНОСТИ

Свою искреннюю благодарность автор выражает д.б.н., профессору А.И. Мелентъеву за помощь при подготовке рукописи диссертации. Автор выражает глубокую признательность к.б.н. Е.А. Г ильвановой и к.б.н. Е.А. Щелчковой за постоянное внимание и помощь в работе. Автор искренне благодарит всех сотрудников лаборатории прикладной микробиологии ИБ УНЦ РАН за постоянную поддержку в процессе выполнения работы.

Особую признательность и благодарность автор выражает безвременно ушедшему из жизни первому научному руководителю к.б.н., доценту

H.Г. Усанову за идейное вдохновение, научно-методическое руководство и ценные советы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Федорова П.Ю., Гильванова Е.А., Усанов Н.Г. Сравнение кинетических

свойств различных циклодекстринглюканотрансфераз II Известия Самарского научного центра Российской академии наук.- 2011.- Т. 13, №5(3).-С. 203-206. '

2. Федорова П.Ю., Андресон Р.К., Алехин Е.К., Усанов Н.Г. Природные циклические олигосахариды — циклодекстрины в системах доставки лекарств // Башкирский медицинский вестник,- 2011.-№ 4,- С. 125-131.

3. Федорова П.Ю., Усанов Н.Г., Андресон Р.К., Гильванова Е.А. РаетЬасШиз еЫтепз'м ИБ-739 в биотехнологии утилизации нефтяных шламов // Вестник Оренбургского государственного университета- Спецвыпуск. Проблемы экологии Южного Урала,- 2009,- № 3.- С. 506-508.

4. Федорова П.Ю., Усанов Н.Г., Гильванова Е.А, Бактерии РаетЬасШгя еМ-тет'к - новый источник циклодекстринглюканотрансфераз // Материалы Международной научно-практической конференции «Совре-менная биотехнология: фундаментальные проблемы, инновационные проекты и бионанотехнология», 26 апреля - 8 мая 2010 года, г. Брянск / Изд-во: «Ладо-мир».-Брянск, 2010.-С. 124-129.

5. Усанов Н.Г., Федорова П.Ю., Гильванова Е.А., Егуткин Н.Л. Метил-трет-бутиловый эфир: новый комплексообразователь для биотехнологии р-циклодекстрина // Материалы Международной научной конференции

«Биотехнология начала III тысячелетия», 26 - 28 мая 2010 года, г. Саранск / Изд-во Мордов. ун-та, 2010.- С. 54-55.

6. Федорова П.Ю., Усанов Н.Г., Гильванова Е.А. Бактерии Paenibacillus ehi-mensis - новый продуцент циклодекстринглюканотрансферазы // Материалы VI Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», 25 - 27 октября 2010 года, г. Москва / Изд-во: ООО «МАКС пресс». - Москва, 2010 - С. 159-161.

7. Федорова П.Ю. Бактерии Paenibacillus ehimensis - источник циклодекст-ринглюканотрансфераз // XVIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых, ученых «Ломоносов-2011»; секция «Биология»; 11 -15 апреля 2011 года; Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет. - М.: МАКС Пресс, 2011,- С. 171.

8. Федорова П.Ю., Усанов Н.Г., Гильванова Е.А. Бактерии Paenibacillus ehimensis ~ новые циклодекстриногенные микроорганизмы // БИОЛОГИЯ -НАУКА XXI ВЕКА: 15-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых; секция «Биология и экология микроорганизмов», 18-22 апреля 2011 года, г. Пущипо - С. 347.

9. Gilvanova Е.А., Aktuganov G.E., Fedorova P.Y., Melentjev A.I., Usanov N.G. Paenibacillus ehimensis partial 16S rRNA gene, strain IB-739 // EMBL Nucleotide Sequence Database.- 2009. - Accession number FN582329.

Отпечатано с готового оригинал-макета в ООО «Типограф-У»

450098, г.Уфа, ул.Комсомольская, 2 Заказ №775, т.ЮО, 2012, Формат 60x90 1/16.

Уч. п.л. 1,5, уел. печ. а. 1,4 Бумага офсетная. Отпечатано методом ризографии.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федорова, Полина Юрьевна, Уфа

61 12-3/650

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ УФИМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАН

На правах рукописи

ФЕДОРОВА ПОЛИНА ЮРЬЕВНА

БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИКЛОДЕКСТРИНОВ ПОЛИФРАКЦИОННОГО СОСТАВА НА ОСНОВЕ ПРОДУЦЕНТА РАЕМВАС1ЫШ ЕНШЕЖШ 1В-739

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

кандидат биологических наук, доцент Н.Г. Усанов

доктор биологических наук, профессор А.И. Мелентьев

Уфа-2012

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

1.1. Введение 11

1.2. Биохимические трансформации, катализируемые ЦГТазой 11

1.3. Микроорганизмы - продуценты ЦГТазы 15

1.4. Структура и свойства циклодекстринов 23

1.5. Комплексообразование 25

1.6. Применение циклодекстринов 28

1.6.1. Пищевая промышленность 28

1.6.2. Фармацевтика 30

1.6.3. Косметическая промышленность 31

1.6.4. Защита окружающей среды 32

1.7. Производство циклодекстринов 33 1.7.1. Технологические этапы получения циклодекстринов 33

1.8. Заключение 36 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 37

2.1. Объекты исследований 3 7

2.2. Материалы и реагенты 37

2.3. Микробиологические методы 38

2.3.1. Среды для хранения и поддержания ЦГТ-активных культур 38

2.3.2. Жидкие питательные среды для наработки образцов ЦГТазы 39

2.3.3. Условия культивирования и инокуляции 40

2.3.4. Методы таксономических исследований 40

2.4. Методы биохимических исследований 41 2.4.1 Определение активности циклодекстринглюканотрансферазы 41

2.4.1.1. Модифицированный метод Тильден и Хадсона 41

2.4.1.2. Спектрофотометрический метод 41

2.4.2. Определение оптической плотности культуральной жидкости 42

2.4.3. Определение концентрации белка 43

2.4.4. Очистка циклодекстринглюканотрансферазы 43

2.4.4.1. Концентрирование методом ультрафильтрации 43

2.4.4.2. Метод крахмальной адсорбции 43

2.4.4.3. Метод ионно-обменной хроматографии 44

2.4.4.4. Электрофоретическое разделение в ПААГ 44

2.4.4.5. Определение молекулярной массы 44

2.4.5. Изучение физико-химических свойств препаратов ЦГТаз 45

2.4.5.1. Определение рН-оптимумов 45

2.4.5.2. Определение температурных оптимумов 45

2.4.5.3. Определение термостабильности 45

2.4.5.4. Изучение влияния ионов кальция на термостабильность 46

2.4.5.5. Определение рН-стабильности 46

2.5. Измерение вязкости 46

2.6. Определение концентрации циклодекстринов методом ВЭЖХ 46

2.7. Количественное измерение кинетических параметров ЦГТаз 47

2.8. Проведение процесса ферментативной конверсии 47

2.9. Математическая и статистическая обработка результатов экспериментов 48

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 49

3.1. Выбор продуцента ЦГТазы 49

3.2. Оптимизация состава питательной среды для культивирования продуцента ЦГТазы 55

3.3. Динамика синтеза ЦГТазы культурой Р. еЫтет18 1В-739 58

3.4. Очистка препарата ЦГТазы Р. еЫтетгя 1В-739 59

3.5. Физико-химические свойства ЦГТазы Р. еЫтетгя 1В-739 62

3.6. Ферментативная трансформация крахмала в циклодекстрины 65

3.6.1. Влияние дозировки фермента на накопление ЦД 65

3.6.2. Влияние времени трансформации на выход ЦД 66

3.6.3. Влияние концентрации субстрата на выход ЦД 68

3.6.4. Исследование условий предподготовки субстрата для конверсии крахмала в ЦД с максимально возможным выходом 69

3.6.5. Ферментативная конверсия крахмала с использованием органических и неорганических соединений 72

3.6.6. Влияние изопропилового спирта на выход ЦД 76

3.6.7. Подбор двухкомпонентных систем комплексообразователей 78 3.7. Разработка лабораторной технологии получения ЦД

полифракционного состава 82

3.7.1. Подготовка субстрата для ферментативной конверсии 82

3.7.2. Ферментативная конверсия в присутствии бинарного комплексообразователя 83

3.7.3. Выделение, разложение комплекса и получение ЦД 85 ВЫВОДЫ 88 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 89 ПРИЛОЖЕНИЕ 107

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВКМ - штамм Всероссийской коллекции микроорганизмов ДЭАЭ-сефароза - диэтиламиноэтил-сефароза

ИБ УНЦ РАН - Учреждение Российской академии наук Институт биологии

Уфимского научного центра РАН кДа - килодальтон, единица измерения атомной массы КЖ - культуральная жидкость МТБЭ - метил-трет-бутиловый эфир МЭК - метилэтилкетон ПААГ - полиакриламидный гель

сПа - сантипуаз, единица измерения динамической вязкости ЦГТаза - циклодекстринглюканострансфераза (КФ 2.4.1.19) ЦД - циклодекстрины

16S рРНК - ген кодирующий 16S рибосомной РНК АТСС - American Type Culture Collection, USA

DSZM - штамм Дрезденской коллекции микроорганизмов (Германия) EMBL - European Molecular Biology Laboratory

IB - штамм, находящийся в коллекции Института биологии УНЦ РАН

NCBI - National Center for Biotechnology Information, USA

SDS - додецилсульфат натрия

а-ЦД - Альфа-ЦД

ß-ЦД - Бета-ЦД

у-ЦД - Гамма-ЦД

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Циклодекстрины (ЦД, циклические альфа-Б-глюкопиранозиды) -перспективные биотехнологические продукты с высокой добавленной стоимостью, в основе технологии получения которых лежит энзиматическая трансформация крахмала микробным ферментом циклодекстринглюка-нотрансферазой (ЦГТазой, К.Ф.2.4.1.19).

Наиболее распространены и изучены альфа-, бета- и гамма-ЦД, различающиеся по количеству единиц a-D-глкжопиранозы в макрокольце, и соответственно физическими и химическими свойствами.

Благодаря способности ЦД образовывать комплексы включения с разнообразными органическими и неорганическими соединениями, применение ЦД распространяется на такие непохожие отрасли, как пищевая промышленность, фармакология и косметика, тонкий органический синтез и нефтедобыча, сельское хозяйство и процессы защиты окружающей среды, биотехнологии и экологии (Singh et al., 2002; Biwer et al., 2002; Martin Del Valle, 2004; Szejtli, 2004; Li et al., 2007). Это обусловлено тем, что комплексообразование существенно изменяет физико-химические характеристики включенных молекул, придавая им новые, ранее не известные, полезные свойства.

В большинстве случаев для получения комплексов включения индивидуальных веществ с ЦД используют соответственно индивидуальные а-, (3-или у-ЦД- Однако, зачастую, например, для нужд пищевой, фармацевтической промышленности, требуется получить комплексы ЦД с веществами, состав которых не является гомогенным. Это могут быть вытяжки или экстракты растений, ароматические вещества природного происхождения и др. В этом случае использование индивидуальных ЦД не обеспечивает полноту включения всех компонентов системы и, тем самым, ограничивает потенциальные возможности получения инновационной продукции. В перечисленных случаях целесообразно использовать ЦД полифракционного состава, т.е. содержащие одновременно все три формы ЦД.

Для промышленного получения ЦД используются два принципиально разных подхода: метод неконтролируемой конверсии, в ходе которого в биохимический реактор вводятся лишь ЦГТаза и раствор крахмала, и контролируемый, когда в реакционную смесь добавляются еще и комплексообразова-тели (сольвенты) - органические или неорганические соединения, селективно реагирующие с одним из циклических Сахаров с образованием нерастворимых или слаборастворимых комплексов включения, которые сдвигают равновесия реакции в сторону одного из целевых продуктов, в результате чего возрастает его выход (АЬе1уап, 2005). В ряде случаев выход ЦД возрастает, достигая 40-75% масс, по отношению к субстрату, но число подобных сольвентов, нашедших промышленное применение в производстве ЦД, ограничено. К известным сольвентам относится толуол, широко используемый в технологии получения (3-ЦД, деканол-1 и циклогексадека-8-ен-1-он, активизирующие накопление а- и у- гомологов ЦД соответственно (В}\уег е1 а1., 2002). Наиболее удачным вариантом технологии получения ЦД является сочетание специфичной ЦГТазы со специфичным комплексообразователем, который бы позволил осуществить конверсию крахмала с высоким выходом.

Применение сольвентов снимает проблему контаминации биореактора, упрощает технологию очистки продуктов конверсии из многокомпонентной реакционной смеси. Известные сольвентные технологии получения ЦД, с использованием рассмотренных реагентов, имеют ряд недостатков из-за токсичности комплексообразователей, сложности глубокой очистки ЦД от следовых количеств растворителей, их ограниченной доступности и высокой стоимости. В то же время, существует потребность в дешевых технических ЦД, в которых допускается наличие органических растворителей. В связи с этим задача поиска новых эффективных технологичных малотоксичных сольвентов для организации многотоннажного производства а-, (3- и у-ЦД остается нерешенной и актуальной проблемой до настоящего времени.

Цель исследования

Разработать методы ферментативной трансформации крахмала в цик-лодекстрины с применением бактериальной циклодекстринглюканотрансфе-разы и специфичного сольвента, обеспечивающих постоянство соотношения гомологов.

Задачи исследования

2. Установить таксономическое положение штамма-продуцента и осуществить его идентификацию на основании совокупности морфологических, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик.

4. Определить оптимальные параметры ферментативной конверсии крахмала исследуемой ЦГТазой для получения ЦД с постоянным соотношением гомологов в присутствии комплексообразователей.

Научная новизна

Впервые обнаружен штамм вида РаетЬасШт еЫтет1$ 1В-739, секрети-рующий ЦГТазу широкой специфичности, инициирующую превращение крахмала до смесей пригодных для одновременного синтеза трех ЦД.

Определена полная последовательность гена 168 рРНК Р. еЫтети 1В-739, проведена реконструкция модели филогенетического древа и определено положение штамма в роду РаетЬасШш.

Изучены физико-химические и каталитические свойства ЦГТазы Р. еМтет'м 1В-739. Максимальная каталитическая активность проявляется в интервале температур оптимум рН=6,0, рН-стабильность в интервале

Исследованы различные комплексообразователи, в том числе используемые впервые, такие как бетулин, диметилсульфоксид, метил-трет-бутиловый эфир, коллоидная сера, кристаллическая сера, механо-активированная сера; комбинация сольвентов: Сера-МЭК, для проведения ферментативной конверсии крахмала в ЦД, которые могут быть применены в технологиях получения различных гомологов ЦЦ.

Практическая значимость

Штамм-продуцент, секретирующий ЦГТазу широкой специфичности, идентифицирован как Paenibacillus ehimensis IB-739.

Полная последовательность генов 16S рРНК культуры депонирована в базе данных EMBL (European Molecular Biology Laboratory)/GenBank и доступна в сети Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) под номером FN582329.

Подобраны условия подготовительной обработки крахмальных растворов высокой концентрации и определены оптимальные параметры ферментативной конверсии крахмала ЦГТазой P. ehimensis IB-739 для получения ЦД полифракционного состава: концентрация крахмала 5,0-15,0%, доза фермента 10,0 ед на 1,0 г субстрата, продолжительность процесса ферментолиза -8-12 ч.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на ряде научных форумов: международной научно-практической конференции «Современная биотехнология: фундаментальные проблемы, инновационные проекты и бионанотехно-логия» (Брянск, 2010), Международной научной конференции «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010), VI Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010), XIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2011), XV Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011); Всероссийской научной конференции с международным участием «ЭКОБИОТЕХ-2011» и II Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Современные методы и подходы в биологии и экологии» (Уфа, 2011); VI Всероссийской научной Интернет-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии» (Уфа, 2011).

Конкурсная поддержка работы

Публикации

Структура и объем диссертации

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Введение

Циклодекстрины (ЦД) относятся к классу углеводов, точнее олигосахари-дов, получаемых ферментативным путем из крахмала. Инициаторами этого процесса является небольшая группа бактерий, синтезирующих специфический фермент циклодекстринглюканотрансферазу (ЦГТазу, КФ 2.4.1.19). ЦГТаза катализирует образование ЦД при внутримолекулярном трансгликозилирова-нии а-1,4-Б-глюканов, атакуя исключительно внешние связи нередуцирующих концов боковых цепей. Образующиеся макро-циклические олигосахаридные гомологи различаются по количеству единиц а-О-глюкопиранозы в кольце. Самыми известными из них являются а-, (3- и у-ЦД, состоящие соответственно из 6, 7 и 8 глюкозных единиц. Структурные формулы этих мальтоолиго-сахаридов представлены на рисунке 1.1.

Рисунок 1.1. Структурные формулы циклодекстринов.

1.2. Биохимические трансформации, катализируемые ЦГТазой

ЦГТазы катализируют несколько типов биохимических трансформаций, характер и интенсивность которых зависит от генетической разновидности фермента. Определяющими также являются физико-химические условия превращения, температура и рН, концентрация и природа субстрата (тип крахмала), концентрация ациклических продуктов в реакционной среде (глюкозы, мальтозы, мальтотриозы и др.). Несмотря на множественность проявлений своего воздействия, ЦГТазы обладают лишь одним активным

во

центром. Каталитическая «неразборчивость» воздействия объясняется спецификой молекулярного механизма акта трансгликозилирования, а также особенностями строения центра связывания фермента, обладающего широким сродством к самым разнообразным субстратам (Усанов, 2006).

Ферментативные процессы, катализируемые ЦГТазами, подразделяются на следующие типы реакций:

1. Внутримолекулярное трансгликозилирование (циклизация):

Крахмал —> ЦЦ + мальтоолигосахариды;

2. Межмолекулярное трансгликозилирование (диспропорционирование):

2 Мальтоза —> мальтотриоза + глюкоза, ЦД + акцепторы —> линейные мальтоолигосахариды, Крахмал + акцепторы —мальтоолигосахариды;

3. Гидролиз крахмала, мальтоолигосахаридов и ЦД:

Крахмал —> мальтоолигосахариды.

Все они в той или иной степени носят обратимый характер, и суммарная схема процессов, протекающих под воздействием ЦГТазы, весьма сложна (рисунок 1.2).

Рисунок 1.2. Сумма биохимических превращений, катализируемых ЦГТазами.

Из представленной схемы видно, что образование ЦД из высокомолекулярных природных полимеров, таких как крахмал, протекает одновременно по нескольким направлениям и сопровождается накоплением в реакционной смеси как циклических, так и ациклических продуктов. В целом, процесс конверсии крахмала сопровождается, сначала накоплением ЦД, а затем их распадом до сравнительно коротких линейных мальто-олигосахаридов. Степень конверсии исходного высокомолекулярного продукта в один из циклических компонентов невелика и зависит в основном от источника используемой для ферментативной конверсии ЦГТазы, а также физико-химических условий пре�

Информация о работе

Федорова, Полина Юрьевна
кандидата биологических наук
Уфа, 2012
ВАК 03.01.06

Диссертация

Биотехнология получения циклодекстринов полифракционного состава на основе продуцента Paenibacillus ehimensis IB-739 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы