Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание комплексов включений циклодекстринов на основе бета-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Создание комплексов включений циклодекстринов на основе бета-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы"
На правах рукописи
ШАГИНА СВЕТЛАНА ЕВГЕНЬЕВНА
СОЗДАНИЕ КОМПЛЕКСОВ ВКЛЮЧЕНИЙ ЦИКЛОДЕКСТРИНОВ НА ОСНОВЕ БЕТА-СПЕЦИФИЧНОЙ ЦИКЛОДЕКСТРИНГЛЮКАНОТРАНСФЕРАЗЫ
Специальность 03.00.04 - Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук
I <'2459
Москва-2008
003172459
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении
высшего профессионального образования «Московский Государственный Университет пищевых производств»
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор
[Грачева Ирина Михайловна 1
кандидат технических наук, профессор
Войно Людмила Ильинична Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор
Карпенко Дмитрий Валерьевич, кандидат технических наук, Ефременко Елена Николаевна
Ведущая организация: Научно-технический Центр «Лекарство и биотехнология»
со
Защита состоится: « 24 » июня 2008 г. в ^^ ч в ауд 229 , корп А на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212 148 07 при ГОУ ВПО «Московский Государственный Университет пищевых производств» по адресу. 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д 11
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУПП Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенных печатью учреждения, просим направлять по адресу 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д 11, МГУПП, ученому секретарю Совета Д 212 148 07.
Автореферат разослан » мая 2008 г.
Ученый секретарь Совета, д т.н, проф.
Богатырева Т Г
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Важное место среди веществ, способных выступить в качестве хозяина комплекса типа «хозяин-гость» занимают циклодекстрины (ЦЦ) Этим свойством циклодекстрины обладают благодаря своему строению- их молекулы имеют гидрофильную внешнюю поверхность и сквозную гидрофобную полость, по своим размерам сопоставимую с величиной многих органических и неорганических соединений ЦД связывают молекулу «гостя» главным образом путем, так называемых, гидрофобных взаимодействий
ЦЦ являются продуктами биохимической трансформации крахмала при помощи специальных ферментов, называемых циклодекстринглюкано-трансферазами (ЦП-азами) Семейство ЦД включает в себя три основных продукта а-ЦД, р-ЦД и у-ЦД, макрокольца которых состоят из шести, семи и восьми остатков глюкопиранозы соответственно В продуктах конверсии всегда присутствуют и ЦД большего размера Из реакционной смеси могут быть выделены молекулы циклических Сахаров, имеющие девять, десять, одиннадцать и более звеньев глюкозы в цикле, обозначаемые буквами латинского алфавита 5-, е-, ^-ЦД, но практического интереса эти продукты не представляют
Использование ЦД при обогащении пищевых продуктов витаминами и другими биологически активными веществами направлено в первую очередь на повышение качества получаемых продуктов и их функциональности При образовании комплексов с ЦД уменьшается окисление витаминов, эфирных масел Ряд витаминов в виде комплексов с ЦД становятся более стабильными, устойчивыми, проявляют лучшую биодоступность Стабилизирующий эффект сказывается и на процессе фоторазложения витаминов Благодаря этому ЦД широко используются в медицинской, фармацевтической, косметической, пищевой промышленностях, сельском хозяйстве и других областях
На мировом рынке в производстве ЦД, их производных и комплексов включения с различными веществами лидерство принадлежит фирмам из Японии, США, Китаю и Венгрии В России проводились исследования в этом направлении в 80-х годах, однако рентабельные технологии разработаны не были
Таким образом, исследования, связанные с поиском активного продуцента Р-ЦГТ-азы, получением ферментного препарата на основе нового штамма, ЦД и
комплексов включения ЦД с нерастворимыми в воде витаминами, являются актуальными для пищевой промышленности нашей страны
Цель и задачи исследования. Основные цели диссертационной работы состояли в поиске нового активного продуцента Р-ЦГТ-азы для получения очищенного ферментного препарата со степенью очистки Г10Х и последующего синтеза Р-ЦЦ для создания комплексов включения Р-ЦЦ с витаминами
Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:
- скрининг микроорганизмов-продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания, и коллекционных культур с целью отбора штамма, обладающего преимущественно Р-ЦГТ-азной активностью;
- идентификация нового штамма-продуцента Р-ЦГТ-азы на основании изучения совокупности его морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик;
получение на основе нового продуцента ферментного препарата Р-ЦГТ-азы ПОХ для синтеза Р-ЦЦ,
синтез новых производных Р-ЦЦ на основе поливинилового спирта и кремнезема,
разработка технологии получения комплекса включения витамина Е с р-ЦД, определение оптимальных молярных соотношений компонентов комплекса и его анализ,
разработка технологии получения комплекса включения витамина Вг с р-ЦЦ, определение оптимальных молярных соотношений компонентов комплекса и его анализ.
апробация полученных комплексов в опытном производстве кондитерских изделий
Научная новизна работы Проведен направленный скрининг микроорганизмов, обладающих р-ЦГТ-азной активностью, выделенных из различных видов почв и растительных объектов Из 60 выделенных изолятов 8 новых штаммов обладали высокой Р-ЦГТ-азной активностью (не менее 4,5 ед/см3) и специфичностью фермента по отношению к синтезу Р-ЦЦ (не менее 60%) Для исследований отобран штамм-продуцент Р-ЦГТ-азы с максимальной активностью фермента Р-ЦГТ-азы (6,7 ед/см3) и высокой бета-специфичностью ЦГТ-азы (79,13%) На основании
4
изучения совокупности морфологических, кулыуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры новый штамм, продуцирующий ß-ЦГТ-азу, идентифицирован как Bacillus circulans 16b
Впервые разработаны и экспериментально обоснованы условия синтеза производных ß-ЦД на основе поливинилового спирта (ПВС) и кремнезема (иммобилизованного ß-ЦД) Предложено и реализовано использование данных сорбентов для удаления холестерина из водных или водно-органических растворов
Разработаны условия получения комплексов включения ß-ЦЦ с витаминами Е и В2 на основе молекулярных моделей и анализа физических методов обработки, изучены их свойства, позволившие обосновать возможность их применения в технологии кондитерских изделий Экспериментально установлено, что комплексы могут быть получены с молярным содержанием витаминов и ß-ЦД 1 1 Оптимальным стехиометрическим соотношением компонентов в комплексе витамин Е: ß-ЦД является 1 "3, для комплекса витамин В2 ß-ЦД 1 2 моль/моль Впервые термическим методом анализа подтверждено образование комплексов между ß-ЦД и витаминами Е и В2 Флуориметрическим методом подтверждено образование комплексов витамина В2 с ß-ЦД
Выявлено положительное влияние процесса комплексообразования с ß-ЦЦ на устойчивость витаминов к воздействию света и кислорода воздуха Установлено, что комплексообразование витаминов с ß-ЦД позволяет повысить их растворимость в воде. Для витамина Е растворимость в воде при комнатной температуре в виде комплекса включения 25,9 мг/100 см3, для витамина В2 - 81 мг/100 см3, увеличившись более чем в 6 раз по сравнению с чистым витамином
Практическая значимость работы. В результате направленного скрининга продуцентов ЦГТ-аз, пополнена коллекция культур микроорганизмов кафедры «Биотехнология» МГУПП На основе нового штамма-продуцента ß-ЦГТ-азы Bacillus circulans 16b в лабораторных условиях осуществлена наработка опытной партии ферментного препарата ß-ЦГТ-азы, проведен синтез ß-ЦЦ из картофельного крахмала с использованием выделенного фермента Получены опытные партии комплексов включения витаминов Е и В2 с ß-ЦД с молярным содержанием компонентов от 1 -5 до 1 1 Разработаны проекты Технических Условий, составлены акты об изготовлении опытных партий этих комплексов
В лабораторных условиях кафедры «Технология кондитерского производства» МГУПП изготовлены кондитерские изделия (сахарная помадка и мармелад) с добавлением комплексов витаминов Е и В2 с (3-ЦД Применяемые комплексы не оказывают негативного влияния на форму, структуру и консистенцию данных кондитерских изделий, не влияют на вкус и аромат продукции, при этом повышают пищевую ценность получаемых продуктов, обогащая их витаминами Результаты проведенной работы подтверждены актом лабораторных испытаний
«Способ получения иммобилизованного бета-циклодекстрина» защищен патентом РФ №2295539 от 20 03.2007 Синтезированные новые производные Р-ЦД на основе ПВС и кремнезема могут быть рекомендованы для удаления холестерина из различных пищевых продуктов
Апробация работы. Основные положения работы докладывались на международных конференциях и симпозиумах на Третьем международном симпозиуме «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК» (Москва, 2006), на V Международной научно-технической конференции «Технологии и продукты здорового питания» (Москва, 2007), на V юбилейной школе-конференции с международным участием «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2007)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 1 патент РФ, где отражены основные положения диссертации.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 204 источника, и 6 приложений Работа изложена на 186 страницах машинописного текста, включает 23 таблицы и 44 рисунка
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В литературном обзоре освещена история исследования ЦД и развития их производства в мире Рассмотрены строение и свойства ЦД и ЦГТ-аз, технологии их получения, приведены примеры использования ЦД в пищевой и фармацевтической промышленностях, медицине и химических процессах, биотехнологии Рассмотрены методы получения комплексов различных веществ с ЦД, влияние хими-
ческих модификаций на свойства ЦЦ Описаны строение и свойства витаминов Е и В2, их биологическая активность.
В ходе анализа данных научно-технической литературы выявлены аспекты, которые позволили сформулировать цели и задачи настоящего исследования 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 3.1. Материалы и методы исследований Образцы почвы для скрининга. В качестве природных источников новых изолятов бактерий использовали растительные и почвенные образцы, отобранные из разных районов средней полосы
Скрининг микроорганизмов - продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания, проводили по методу, разработанному сотрудниками Института биологии Уфимского научного центра РАН (Терехова Е. Я, 1999), с введением некоторых модификаций
Изучение морфологических и физнолого-биохимнческнх характеристик выделенных культур проводили, руководствуясь методикой идентификации аэробных спорообразующих микроорганизмов (Т Deak, Eva Timar, 1988)
Определение последовательностей гена 16S рРНК было получено методом ПЦР, проводимым на ДНК-амплификаторе MasterCycler Personal («Eppendorf», Germany)
Измерение активности ß-ЦГТ-азы проводили спектрофотометрически -модифицированным фенолфталеиновым методом (Усанов Н Г, 2004)
ВЭЖХ-анализ продуктов ферментативной конверсии крахмалов проводили на колонке «SEPARON-NH2» (размер - 4,6x250 мм, скорость подачи элюента 0,8 см3/мин, элюент - 60% водный ацетонитрил) в Центре «Биоинженерия» РАН
Содержание витаминов в комплексах определяли спектрофотометриче-ским (UV-Visible спектрофотометр Agilent 8453, Agilent Technologies) и флуори-метрическим методами (мультиканальный флуориметр ALA-1/4, Biosan)
Термический анализ комплексов проводили на термоанализаторе ТА -4000 (модуль ТГ - 50) (Mettler Toledo START' System, Швейцария) в интервале температур 20-600 °С. Кривые потери массы были рассчитаны при помощи программного обеспечения START® на базе Белорусского Государственного технологического университета
Исследования проводились не менее чем в трех повторностях Обработку результатов экспериментов проводили с применением программы Origin 7 5 Pro 3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.2.1. Скрининг ЦГТ-активных микроорганизмов из природных мест обитания
В процессе работы из 30 почвенных и 20 растительных образцов было выделено 60 изолятов культур микроорганизмов, осуществляющих деструкцию крахмала Все изоляты после глубинного культивирования были проанализированы на Р-ЦГТ-азную активность фенолфталеиновым методом В результате проведенного скрининга для дальнейших исследований было отобрано 27 р-ЦГТ-активных штаммов Проведя их сравнение, отобрано 8 культур, обладающих достаточно высокой внеклеточной ферментативной активностью Р-ЦГТ-азы (4,6-6,7 ед /см3 КЖ) Далее отобранные 8 штаммов были проанализированы на ЦГТ-специфичность с помощью ВЭЖХ Результаты тестирования данных бактериальных культур представлены в табл 1
Таблица 1
Р-циклизующая активность и специфичность внеклеточных ЦГТ-аз 8 штаммов бактериальных культур, отобранных в результате скрининга
Условное обозначение отобранных бактериальных культур Средняя активность Р-ЦГТазыв КЖ,(ед/см3) Содержание а-, Р- и у-ЦД в продуктах трансформации крахмала, %
а-ЦД Р-ЦД у-ЦД
111 4,9 15,04 68,84 16,12
2й 5,9 6,30 73,01 20,69
4{ 4,6 27,47 60,63 11,90
7е 6,0 10,46 74,40 15,14
10(1 4,7 8,20 65,73 26,07
15с 4,9 8,47 68,06 23,47
16Ь 6,7 0,00 79,13 20,87
24а 6,4 6,46 80,21 13,34
Культуральные жидкости отобранных 8 штаммов при трансформации крахмала показали каталитическую активность преимущественно Р-ЦГТ-аз Наиболее продуктивным оказался штамм 16Ь с активностью Р-ЦГТ-азы 6,7 едУсм3 и содержанием Р-ЦД в реакционной смеси 79,13%. Этот штамм был выбран для дальнейших исследований
3.2.2. Исследование фенотипических признаков и идентификация штамма 1бЬ
продуцента ß-ЦГТ-азы
Исследование любого микроорганизма проводят, изучая его морфологические, культуральные и физиолого-биохимические признаки Это дает возможность провести идентификацию микроорганизма и установить его таксономическое положение
Изучение морфологических и культуральных признаков штамма 16Ь показало, что выделенный при скрининге штамм 16Ь принадлежит к аэробным спорооб-разующим бактериям, образующим эллиптические эндоспоры, раздувающие клетку терминально, субтерминально или центрально Через 24 часа инкубации при 38°С обнаруживаются подвижные грамположительные папочки размером (0,5-0,75 мкм) * (1,5-4,0 мкм) На плотной среде К1 (г/дм3 крахмал картофельный - 10, пептон - 3, дрожжевой экстракт - 3, кукурузный экстракт - 3, агар - 16) бактерии формируют круглые колонии с фестончатым краем, диаметром от 0,5 мм до 2 мм, поверхность колоний гладкая, слегка бугристая к краям, с полупрозрачной, блестящей мучнистой структурой Цвет колоний белый с желтоватым оттенком, профиль изогнутый, структура колоний однородная, край волнистый, четко сформированный рост по «штриху».
Морфологические и культуральные признаки исследуемой культуры при сравнении ее с тест-культурой позволяют отнести ее к бактериям рода Bacillus
Для выявления видовой принадлежности изучались физиолого-биохимические признаки потребление углеводов и сахаро-спиртов, анаэробный рост, отрицательная реакция Фогес-Проскауэра, рост на синтетической питательной среде На основании полученных данных установлено, что исследуемый микроорганизм принадлежит к роду Bacillus, предположительно виду circulans
Для достоверности идентификации были изучены филогенетические особенности культуры Сиквенс 16S ribosomal RNA и проведенный поиск гомологичных последовательностей с построением филогенетического дерева показали, что выделенный нами штамм с точностью 96 % относится к роду Bacillus вида circulans
Таким образом, на основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик ис-
следуемой культуры, новый штамм 16Ь, продуцирующий преимущественно Р-ЦГТ-азу, идентифицирован как Baciîlus circulons
3.2.3. Биосинтез Р-ЦГТ-азы Bacillus circulans шт. 16b и Р-ЦД
В лабораторных условиях осуществлено культивирование выделенного нами штамма Bacillus circulons 16b на среде следующего состава, г/дм3 крахмал картофельный - 10,0, пептон ферментативный - 5,0, дрожжевой экстракт - 5,0, К2НРО4 - 2,0, NaH2P04 - 2,0, СаСОз - 0,4 (рН среды 7,5-7,8) Культивирование продуцента р-ЦГТ-азы Bacillus circulans 16b проводили в колбах объемом 750 см3 на качалоч-ной установке (п=270 об/мин) с использованием посевной дозы 5% при температуре культивирования 38±2°С в течение 48 ч Уровень р-ЦГТ-азной активности культуральной жидкости (КЖ) в ходе лабораторной ферментации составил 6,75 ед /см3 Полученную КЖ подвергали центрифугированию в течение 20 мин при 15000 об/мин Дальнейшее получение ферментного препарата Г10Х проводилось осаждением Р-ЦГТ-азы из КЖ 4-мя объемами этанола (75% об), отделением осадка центрифугированием и его лиофильным высушиванием Полученный ферментный препарат Р-ЦГТ-азы Г10Х обладал активностью 856,4 ед/г, выход препарата составил 4,5 г /дм3
Синтез р-ЦЦ проводили с использованием ферментного препарата Р-ЦГТ-азы Bacillus circulans шт. 16b Г10Х Процесс осуществляли в термостатированной емкости при 55 °С, рН=6,50±0,03 в течение 72 ч при концентрации субстрата 15% масс/объем Для биохимической трансформации использовали р-ЦГТ-азу Г10Х Bacillus circulans 16b в дозировке 6 едЦА/г крахмала. Выход кристаллического р-ЦД составил 63,1 г (выход целевого продукта - 28,1% от использованного субстрата)
3.2.4. Получение иммобилизованного сорбента Р-ЦД-поливиниловын спирт и
Р-ЦД-кремнезем
Циклодекстрины и их производные способны образовывать комплексы включения с холестерином Для выведения холестерина из молочных продуктов наиболее эффективно использовать р-ЦД в виде производных в нерастворимой форме, так как их можно легко удалить из реакционной смеси, регенерировать и использовать повторно
Для получения новых производных Р-ЦД нами были исследованы ПВС и кремнезем, подобраны условия проведения реакции (время, температура, соотношение компонентов в реакционной смеси) Синтез новых производных р-ЦД проводился через альдегидные группы
В результате проведенных исследований был получен сшитый сорбент р-ЦД-ПВС с содержанием р-ЦД 0,420 г/г ПВС и сорбент Р-ЦД-кремнезем с содержанием Р-ЦД 0,295 г/г кремнезема Наиболее благоприятными условиями для синтеза иммобилизованного сорбента Р-ЦД-ПВС являются, время ведения реакции 70 мин при 1=45-50 °С и соотношении Р-ЦД и ПВС-СНО по массе - 1,6 1,0, а для синтеза иммобилизованного сорбента Р-ЦД-кремнезем время ведения реакции 60 мин, 1= 48-53 °С и оптимальное соотношение Р-ЦД и кремнезема по массе 1,4 1,0
Сорбенты, полученные в результате сшивки ПВС или кремнезема полиальдегидными группами с Р-ЦД, исследовали на способность связывать холестерин О комплексообразующей способности синтезированных производных р-ЦД судили по снижению концентрации холестерина в водном растворе после внесения данных сорбентов Результаты проведенных исследований представлены на рис 1.
-Кремнезем -бета-ЦД-ПВС
-е-ПВС
—х— бета-ЦД-кремнезем
Рис 1 Динамика образования комплексов включения холестерина с сорбентами
Анализируя полученные данные по динамике образования комплексов включения холестерина с сорбентами, можно сделать вывод, что максимальное связывание холестерина с сорбентом и образование комплекса происходит уже через 1,5 часа Наилучшие результаты были получены для нового производного Р-ЦД-ПВС связывание 0,3 ммоль (0,11 г) холестерина с 1 г сорбента.
Таким образом, экспериментально показана возможность использования полученного сорбента Р-ЦД-ПВС для удаления холестерина из водных или водно-органических растворов
3.2.5. Получение комплексов включения витамина Е с Р-ЦД
Для изучения возможности создания комплекса (3-ЦД с альфа-токоферол ацетатом (витамином Е) использовали молекулярное моделирование комплекса в программе DS Viewer 6,0 Pro и программу Hyperchem 7.5 для оптимизации геометрии молекул.
Построенные молекулярные модели веществ (рис.2) подтверждают возможность образования комплекса между альфа-токоферол ацетатом и (3-ЦД. Пространственная «вытянутость» молекулы витамина Е не исключает образования комплексов «витамин Е:(3-ЦД» со стехиометрией как 1:1, так и 1:2, 1:3.
Рис.2. Возможные молекулярные модели комплекса альфа-токоферол ацетата с [3-ЦЦ: а) за счет проникновения хроманового кольца витамина в полость (3-ЦД, б) за счет проникновения изопреноидной боковой цепи витамина в полость (3-ЦД.
Для получения комплексов включения витамина Е с (3-ЦД использовались методы: соосаждения (ЦЦ растворяют в воде, молекула-гость добавляется при перемешивании, комплекс осаждается и отфильтровывается), соосаждения с использованием ультразвуковой обработки раствора и комплексообразование в пасте («растирание в пасте»).
Наилучшие результаты были получены при использовании метода получения комплексов «растирание в пасте». Смесь витамина Е и (3-ЦД увлажняли небольшим количеством воды и растирали в течение 2-3 ч с последующим высушиванием продукта в вакуум-сушильном шкафу при 1°=45±2°С. Процесс комплексообра-зования контролировали, используя микроскопирование комплексов: по отсутствию масляных включений - свободного витамина Е, и по исчезновению кристаллов (3-ЦД (смена на аморфоподобную массу).
а)
Установлено, что комплексы включения витамина Е с Р-ЦД могут быть получены при молярном соотношении компонентов в системе от 1.5 до 1 1 соответственно
Характеристика витамина Е в комплексе с Р-ЦД
Степень включения витамина Е в полость Р-ЦД оценивалась после центрифугирования (п=10000 об/мин) водных растворов комплексов с молярным соотношением витамин Е Р-ЦД, равным 1 1,1 2 и 1:3, и определения содержания витамина в растворе до и после центрифугирования (в осадке и надосадочной жидкости) спектрофотометрическим методом (1=285,5 нм) Результаты исследования представлены в табл 3
Таблица 3
Характеристика процесса комплексообразования витамина Е с Р-ЦД после
центрифугирования
Анализируемая проба в комплексе Содержание витамина Е, % в комплексах «витамин Е Р-ЦД» при соотношении компонентов
1 1 1 2 1 3
1 Исходный раствор 100 100 100
2 Центрифугат 23 9 5
3 Осадок 26 47 80
4 Свободный витамин Е 51 44 15
Исследования показали, что в препаратах комплекса с соотношением компонентов 1-1 и 1 2 витамина Е включается в полость ЦД менее чем 50%, тогда как в комплексе 1 3 около 85% витамина находится в виде стабильного комплекса включения
Изучение стабильности водных растворов комплексов
Одним из свойств ЦД является изменение физико-химических характеристик веществ в процессе комплексообразования, например увеличивается их растворимость Поэтому проверяли стабильность водных растворов полученных комплексов включения в течение 24 ч при 1=22±2 °С по остаточному содержанию витамина Е в растворе
Результаты исследования показали, что уже через 1-2 ч выдерживания концентрация витамина Е в растворе резко снижается за счет перехода его в осадок, но в течение последующих 22 ч практически не изменяется Для комплексов с соотношением компонентов 1 3, 1 3,8 и 1:5 через 24 ч содержание витамина Е в рас-
творах снизилось на 47,8,48,0 и 54,8% и составило 25,9, 21,7 и 10,8 мг/100 см3 соответственно
Таким образом, несмотря на то, что большая часть витамина уже через 1-2 ч переходит в осадок, небольшое количество витамина Е в виде комплекса включения с Р-ЦЦ все же переходит в водорастворимую форму
Хранение витамина Е и его комплексов включения с Р-ЦД Для выявления чувствительности витамина Е и его комплексов с Р-ЦЦ к свету и кислороду воздуха, образцы комплексов «витамин Е р-ЦЦ» и чистый витамин Е оставляли на 12 дней при комнатной температуре на свету По окончании хранения проводили снятие спектров экстрактов витамина Е из комплексов с Р-ЦД и чистого витамина при длинах волн 260-330 нм (максимум поглощения для БЬ-а-токоферол ацетата при Х=285,5 нм)
Из представленных спектрограмм (рис. 4) видно, что после хранения в течение 12 дней чистый витамин Е и комплекс включения «витамин Е р-ЦД» 1 1 не дают четкого пика
плекс витамина Е с р-ЦД 1 1; с) комплекс витамина Е с Р-ЦД 1 *2; (1) комплекс витамина Е с Р-ЦД 1 3, е) комплекс витамина Е с Р-ЦД1 5
Из рис 4 следует, что чистый витамин Е и витамин Е в комплексе 1 1 разрушаются, окисляясь под действием дневного света и кислорода воздуха Комплексы Р-ЦЦ и витамина Е в соотношениях 1'2, 1'3 и 1-5 дают четко выраженные пики, характерные для витамина Е, что свидетельствует о стойкости витамина в виде комплекса с р-ЦД к внешним факторам (кислороду и дневному свету)
Термический анализ комплексов витамин Е: Р-ЦД
Термический анализ - один из вариантов исследования веществ и материалов Варьируемый здесь параметр - температура, а измеряемыми величинами могут быть вес образца, выделяемое или поглощаемое им тепло, объем или линейные размеры образца и т д Термический анализ позволяет идентифицировать вещество, определить его химический и фазовый состав, а также получить информацию о его свойствах
В настоящих исследованиях термическому анализу на термоанализаторе ТА-4000 были подвергнуты три образца 1 - контроль (чистый р-ЦД), 2 и 3 - комплексы витамина Е с Р-ЦД в соотношении 1 5 и 1 3
На дифференциальной термогравиметрической кривой (Д11-кривой) чистого Р-ЦД (рис 5) можно выделить три зоны интенсивной потери массы в области температур «80 °С, 310 °С и 510 °С Первая зона отвечает потере воды, вторая - деструкции циклодекстринового кольца, третья - окислению продуктов, образовавшихся при деструкции циклодекстринового кольца Обращает на себя внимание наличие небольшого «плеча» на ДТГ-кривой чистого циклодекстрина в области 340-350 °С Это «плечо» исчезает на термограммах образцов - комплексов р-ЦД с витамином Е (рис. 6, 7), но появляется новое «плечо» в области 260-280 °С Интенсивность этого «плеча» увеличивается с ростом концентрации витамина Е в комплексе
Появление «плеча» на термограмме чистого циклодекстрина может быть обусловлено образованием термостабильных соединений - фрагментов деградации циклодекстринового кольца - вероятнее всего протекающим за счет радикальных
процессов Ингибитором этих радикальных процессов выступает витамин Е, поэтому на термограммах ДТГ-кривых (рис 6 и 7) это «плечо» практически отсутствует Появление «плеча» в области меньших температур у основного пика ДТГ на термограммах комплексов витамина Е с Р-ЦД вероятнее всего следует отнести к витамину Е, поскольку размер «плеча» увеличивается с ростом его концентрации
Е Р-ЦД с молярным соотношением Е Р-ЦЦ с молярным соотношением ком-компонентов 1 3 понентов 1 5
Проведенный расчет энергии активации реакции термоокислительной деструкции по методу Бройдо показал, что энергия активации для первого пика на термограммах падает с введением в ЦД витамина Е, составляя 50 кДж/моль для чистого р-ЦД, и 41 и 28 кДж/моль для комплексов с витамином, и свидетельствует о снижении не только содержания свободной воды, но и прочности водородных связей с гидроксильными группами циклодекстринов
Энергия активации реакции термоокислительной деструкции второго пика (292 кДж/моль для чистого р-ЦЦ, 168 и 185 кДж/моль для комплексов с витамином) говорит о том, что происходит изменение конформации циклодекстрина при образовании комплекса с витамином Е При малых концентрациях витамина Е энергия активации минимальна, а с ростом концентрации энергия активации начинает увеличиваться, что может свидетельствовать не только о конформацион-ных изменениях в структуре циклодекстринов в результате образования комплекса с витамином Е и об ингибировании радикальных реакций витамином Е.
Таким образом, на основании термического анализа соединений включения «витамин Е'Р-ЦД» и чистого ЦЦ можно сделать вывод об образовании комплекса между витамином Е и Р-ЦД. При включении в полость ЦД витамин Е не теряет своих антиокислительных свойств, приобретая устойчивость к воздействию света
и кислорода воздуха. Метод «растирание в пасте» эффективен дня получения порошкообразной формы витамина Е в виде комплекса включения с ß-ЦД. Такую форму витамина Е можно получить даже при молярном соотношении витамин Erß-ЦД 1:1, что соответствует содержанию витамина Е в комплексе 26%. Однако оптимальными соотношениями витамина Е:р-ЦД в комплексе являются 1:3 моль/моль и более.
3.2.6. Получение комплексов включения витамина В2 с ß-ЦД
Рибофлавин (витамин В2) относится к числу биологически активных веществ, входящих в состав медицинских, кормовых препаратов, и ряда пищевых продуктов. Использование данного витамина осложняется тем, что у него низкая растворимость в воде, неустойчивость к воздействию света и кислорода воздуха. Комплекс витамина В2 с ЦД способен устранить эти недостатки.
Существование комплекса витамина В2 с ß-ЦД возможно, исходя из пространственного строения витамина В2, гидрофобности и степени поляризации его отдельных частей. Наименее полярной (и наиболее гидрофобной) частью молекулы рибофлавина являются метальные группы изоаллоксазинового кольца - эта часть молекулы витамина является наиболее выгодной для образования комплекса с ß-ЦД (рис. 8, а). Часть изоаллоксазинового кольца, содержащая кислород, также способна на комплексообразование с циклодекстрином (рис. 8, б). Остаток D-рибита в молекуле рибофлавина является наиболее гидрофильной частью молекулы, и включение в гидрофобную полость ß-ЦД наименее вероятно.
I Рис. 8. Возможные молекулярные модели комплекса рибофлавина с Р-ЦД: а) рибофлавин: (3-ЦЦ, 1:1; б) рибофлавин: р-ЦД, 1:2.
Для получения стабильного комплекса Р-ЦД с витамином В2 и определения оптимального молярного соотношения компонентов при образовании данного
комплекса были приготовлены комплексы включения В2 р-ЦЦ с молярным соотношением компонентов от 1.1 до 1'5 с использованием 2-х методов, «растирание в пасте» и соосаждения с дополнительной обработкой растворов ультразвуком в течение 15 мин (использовали ультразвуковую установку ПСБ-1335-05 с рабочей частотой 35кГц) Оба метода оказались приемлемыми для получения комплексов витамина В2 с р-ЦД, но при небольших объемах работ предпочтительнее методика «растирание в пасте», т к выход комплекса при этом выше - 89-98%, а при осаждении 71-73%
Влажность полученных комплексов варьировала в пределах 7,55-11,40 % При увеличении количества включенного витамина В2 в полость Р-ЦЦ наблюдалась тенденция к уменьшению влажности готового комплекса после высушивания По-видимому, это связано с тем, что витамин В2, включаясь в полость Р-ЦЦ, вытесняет из нее кристаллическую воду, которая всегда присутствует в циклодексг-ринах (влажность чистого Р-ЦЦ 13-14%)
Изменение растворимости комплексов витамина В2 с Р-ЦЦ в зависимости от
температуры
Растворимость витамина В2 в воде невелика и составляет 0,12 мг/см3 при температуре 27 °С, 0,19 мг/см3 при 40 °С и 2,3 мг/см3при 100 °С Увеличение растворимости витамина В2 в комплексе с Р-ЦЦ имеет большое прикладное значение Экспериментальные данные по выявленной зависимости растворимости витамина В2, Р-ЦД и комплексов включения на их основе от температуры представлены на рис 9
11(растирание в пасте)
1 2(растирание в пасте)
1 5 (растирание в пасте)
1 2 (обработка ультразвуком)
1 5(обработка ультразвуком)
50 ГО
Температура, "С
Рис 9 Влияние температуры на растворимость р-ЦЦ, витамина В2 и комплексов Вг'Р-ЦД (1.1,1 2,1 5),
Растворимость комплексов В2 Р-ЦЦ возрастает при увеличении доли р-ЦЦ в комплексе от 1.1 до 1:5 моль/моль Комплексообразование витамина В2 с Р-ЦЦ увеличивает растворимость самого витамина более чем в 6 раз при комнатной температуре
Воздействие дневного света на витамин В2 и его комплексы с Р-ЦД
Под воздействием света, особенно прямого солнечного, витамин В2 переходит в свои неактивные формы (люмихром, люмифлавин), что ведет к изменениям в его спектре Водные растворы комплексов и чистого витамина В2 хранили в течение 14 дней на свету По окончании хранения проводили снятие спектров растворов витамина В2 (рис 10) и его комплексов с Р-ЦЦ при 220-500 нм
Рис 10 Спектры чистого витамина В2- а) свежий раствор витамина В2, б) раствор витамина В2 после хранения в течение 10 дней на свету.
При комплексообразовании витамина В2 с Р-ЦЦ в любом молярном соотношении В2 к Р-ЦЦ изменений в спектре витамина не происходит, следовательно, витамин в комплексе не подвергается или подвергается меньшему воздействию дневного света, тем самым сохраняя свою первоначальную форму и витаминные свойства (рис 11)
нения в течение 10 дней на свету а) витамин В2; остальные спектры относятся к комплексам В2 р-ЦЦ
Далее проводили экстракцию люмифлавина хлороформом из растворов, снимали спектры экстрактов Люмифлавин, в отличие от витамина В2, растворим в хлороформе, и по наличию спектров люмифлавина после экстракции исследуемых растворов хлороформом можно судить о степени разложении витамина (рис 12) При хранении полученных комплексов в течение 10 дней образуется небольшое количество люмифлавина, при этом для всех комплексов оно является приблизительно одинаковым, и по сравнению с чистым витамином В2 степень фоторазложения снижается более чем в 10 раз.
Рис 12. Спектры растворов после экстракции люмифлавина хлороформом а) витамин В2 (разведение пробы в 3 раза), остальные спектры относятся к комплексам
Образование люмифлавина при хранении витамина В2 в комплексе с (3-ЦД возможно связано с неполным включением рибофлавина в полость циклодекстри-на или включением в полость той части молекулы витамина, которая не отвечает за его окисление
Анализ процесса комплексообразования витамина В2 с Р-ЦЦ с помощью
Комплексообразование с ЦЦ может влиять на спектрофотометрические свойства вещества, в т.ч. и флуоресценцию, при этом интенсивность флуоресценции может как возрастать, так и затухать В нейтральных водных растворах рибофлавин флуоресцирует жёлто-зеленым светом (515-615 нм с максимумом при 530 нм). С целью анализа влияния Р-ЦД на флуоресценцию витамина В2 готовили водные растворы с одинаковой концентрацией рибофлавина, в которые вводили различные количества Р-ЦД, соответствующие определенным молярным соотношениям витамина и Р-ЦД (от 10.1 до 1.10), далее проводили определение интенсивности флуоресценции в растворах при А,=530 нм на мультиканальном
в2р-цд
флуориметрического метода
флуориметре Пик возрастания интенсивности флуоресценции соответствовал молярным соотношениям компонентов комплекса В2 Р-ЦЦ 1'2 или 2.3 (рис. 13)
20 л-
0 -1-,-,-1-г-
0 2 4 6 8 10 12
Концентрация бета-ЦЦ, моль/моль витамина В2
Рис 13 Влияние концентрации Р-ЦЦ на интенсивность флуоресценции витамина В2 в водных растворах
Таким образом, экспериментальные данные флуориметрического анализа водных растворов витамина В2 с различной концентрацией Р-ЦЦ так же могут являться подтверждением образования стабильных комплексов витамина В2 с Р-ЦЦ Термический анализ комплексов витамин В2: р-ЦД Используя термический метод анализа, были исследованы семь образцов чистый Р-ЦЦ, чистый витамин В2 и комплексы витамина В2 с Р-ЦЦ, полученные методами «растирания в пасте» и ультразвуковой обработки водных растворов, в возрастающей концентрации содержания витамина в комплексе от 1 5 до 1 1 моль/моль
На дифференциальной кривой чистого витамина В2 (рис. 14) можно выделить только две зоны интенсивной потери массы в области температур 296 °С и 523 °С, отсутствует пик, отвечающий потере воды. Первая зона отвечает деструкции самого витамина, вторая зона - окислению продуктов, образовавшихся при его деструкции
На дифференциальных кривых комплексов включения витамина В2 с Р-ЦЦ отсутствуют пики, соответствующие разрушению чистого витамина В2 и продуктов его термодеструкции (рис 15), что свидетельствует об образовании комплексов включения На ДТГ-кривых появляются новые пики в области температур 7582 °С (дегидратация комплекса), 305-310 °С (разрушение комплекса) и 490-510 °С (окисление продуктов деструкции комплексов)
Рис 14 ДТГ-кривая чистого витамина В2 Рис 15 д 11 -кривая комплекса витамин
В2 с Р-ЦД с молярным соотношением компонентов 1 1, полученного методом «растирание в пасте» Обращает на себя внимание зона деструкции самого комплекса в отличие от
зон деструкции как чистого р-ЦД (275-340 °С) (рис 5), так и чистого витамина В2 (280-320 °С) (рис. 14), разрушение комплексов начинается уже при 250-260 °С и заканчивается при 335-340 °С. Расширение температурного интервала у основного пика на Д11 -кривых комплексов включений витамина В2 с р-ЦД также свидетельствует о комплексообразовании, поскольку его увеличение происходит с ростом концентрации витамина В2 в комплексе Доказательством комплексообразования может служить отсутствие зоны интенсивной потери массы на Д11 -кривых комплексов, соответствующих окислению продуктов, образовавшихся при деструкции витамина В2 при =523 °С
Расчет энергии активации реакции термоокислительной деструкции по методу Бройдо показал, что энергия активации для первого пика на термограмме Р-Ц Д равна 59 кДж/моль Энергия активации первого пика на термограммах комплексов падает при увеличении концентрации витамина В2 и свидетельствует о том, что введение в Р-ЦД витамина В2 снижает прочность водородных связей гидроксиль-ных групп в молекуле циклодекстрина
Энергия активации реакции термоокислительной деструкции самого Р-ЦД составляет 317 кДж/моль, комплексообразование Р-ЦД с витамином В2 приводит к ее снижению, т е при образовании соединения включения с витамином В2 происходит изменение конформации самого циклодекстрина Самая низкая энергия активации характерна для комплекса витамин В2 р-Ц Д 1.2, полученного методом «растирания в пасте» (203 кДж/моль), что может быть обусловлено наиболее оп-
тимальной конформацией комплекса, молярным соотношением компонентов и выбранным методом получения комплекса.
Таким образом, термический анализ комплексов включения «витамин В2'Р-ЦЦ», чистого Р-ЦД и витамина В2 подтверждает образование комплекса между витамином В2 и Р-ЦД как при использовании метода ультразвуковой обработки водных растворов компонентов, так и метода «растирание в пасте» Причем получить комплекс возможно даже при молярном соотношении витамина В2 и Р-ЦД 1 1, их оптимальным соотношением в комплексе является 1 2 моль/моль.
3.2.7. Апробация полученных комплексов р-ЦД с витаминами при изготовлении кондитерских изделий Одним из направлений производства функциональных пищевых продуктов является обогащение их теми витаминами и минеральными веществами, дефицит которых наиболее распространен и опасен. Внесение витаминов в продукты осуществляют в количествах, соответствующих степени этого дефицита, т е 30-50 % средней суточной потребности на 100 г изделия Именно такой подход чаще всего используют при обогащении продуктов массового потребления, адресуемых самым широким слоям населения (мука, хлеб, молоко, напитки, кондитерские изделия и т. п). Одними из наиболее распространенных массовых сортов конфет являются помадные конфеты и мармелад
Для повышения пищевой ценности кондитерских изделий комплекс «витамин Е Р-ЦД, 1 5» вводился в рецептуру сахарной помадки, а комплекс «витамин В2-[3-ЦЦ, 1 3» в рецептуру желейного мармелада В этом случае содержание витамина Е в 100 г готового продукта составляло 50% от суточной нормы потребления витамина, а содержание витамина В2 составило 25% от суточной нормы потребления витамина.
Применяемые комплексы не требуют изменения технологического процесса, не оказывают негативного влияния на форму, структуру и консистенцию кондитерских изделий, не влияют на вкус и аромат продукции, вместе с тем повышают пищевую ценность продуктов, обогащая их витаминами
Характеристики сахарной помады и мармелада при хранении Анализ содержания витамина Е в сахарной помадке и витамина В2 в мармеладе проводили непосредственно после приготовления изделий и далее после хра-
нения в течение двух месяцев при комнатных условиях (t=22±2 °С, относительная влажность воздуха 60%)
Содержание витамина Е в помадке непосредственно после приготовления практически совпало с количеством витамина, внесенного с комплексом «витамин Е ß-ЦЦ» и составило 99,3 % от теоретически возможного, что говорит о равномерном распределении комплекса в помадной массе Содержание витамина Е по истечении двух месяцев составило 23,26 мг на 400 г изделия (96,3 % от теоретически возможного), что подтверждает стабильность витамина Е в сахарной помадке при хранении
Содержание витамина В2 в свежеприготовленном мармеладе составило 1,5 мг в 400 г продукта, что совпадает с внесенным количеством в рецептуру витамина с комплексом «витамин В2 ß-ЦЦ» По истечении срока хранения опытных образцов мармелада содержание витамина В2 было 1,47 мг на 400 г продукта (98,1 % от внесенного количества), что подтверждает стабильность витамина В2 в мармеладе при хранении
Выводы
1 Проведен скрининг микроорганизмов, выделенных из различных видов растительных и почвенных образцов, отобранных из разных районов средней полосы России В результате выделено 27 бактериальных штаммов с преимущественно ß-ЦГТ-азной активностью не менее 2 ед/см3 ОС Наиболее продуктивным по ß-ЦГТ-азе оказался штамм 16Ь с ß-ЦГТ-азной активностью 6,7 ед/см3 КЖ и ß-ЦГТ-специфичностью 79,13 %
2 На основании совокупности исследованных морфологических, культураль-ных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры новый продуцент ß-ЦГТ-азы идентифицирован как Bacillus circulans штамм 16b
3 На основе нового штамма по традиционным технологиям получен препарат ß-ЦГТ-азы Г10Х с выходом 4,5 г /дм3 (активность ß-ЦГТ-азы 856,4 ед/г) и ß-ЦЦ (выход целевого продукта составил 28% от использованного субстрата)
4 Впервые синтезированы иммобилизованные ß-ЦЦ на основе поливинилового спирта и кремнезема Показана эффективность данных сорбентов для удаления холестерина из водных или водно-органических растворов
5 Разработан новый метод получения порошкообразной стабильной формы витамина Е в виде комплекса включения с р-ЦЦ с молярным соотношением витамина Е к Р-ЦЦ от 1 2
6 Комплексообразование витамина Е с р-ЦД позволяет перевести витамин в водорастворимую форму Достигнутая максимальная растворимость витамина Е составила 25,9 мг/100 см3 воды для комплекса 1.3
7 Разработаны методы получения стабильных комплексов включения витамина В2 с Р-ЦЦ при их молярном соотношении 1 1,1.2 и 1 5 соответственно.
8 Установлено, что комплексообразование с Р-ЦЦ увеличивает растворимость витамина В2 в 6 раз по сравнению с чистым витамином, а так же повышает его устойчивость к воздействию дневного и ультрафиолетового света
9 Выявлена зависимость между увеличением количества включаемых витаминов Е и В2 и снижением конечной влажности комплексов, что также подтверждено термическим методом анализа
10 Введение в рецептуру кондитерских изделий - сахарной помады и мармелада - комплексов витамина Е и В2 с Р-ЦЦ не требует изменения технологических процессов, при этом повышая пищевую ценность продуктов, обогащая их витаминами
Список публикаций
1 Грачева И М, Комбарова С П, Шагина С.Е. «Циклодекстрины, их производные и комплексы включения» // Сборник докладов молодых ученых МГУПП Ш Юбилейная международная выставка-конференция «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» Часть I - М. МГУПП, 2005 - с. 123-127
2 Шагина С.Е., Банникова Г Е, Грачева И М, Иванова Л А., Варламов В П «Изучение возможности связывания холестерина хитозаном, сшитым окисленным Р-циклодекстрином». // Сборник докладов Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности, Щелково, 2006 -с 114-117
3 Шагина С.Е., Грачева И М, Комбарова С П., Варламов В П. «Производные Р-циклодекстрина на основе органических и неорганических сорбентов» // Сборник материалов IV международной конференции-выставки «Высокоэффективные
пищевые технологии, методы и средства для их реализации» Часть Ш - М МГУПП, 2006 - с 92-95
4 Шагина С.Е., Грачева ИМ «Комплексообразование ß-цшслодекстрина с жирорастворимым витамином» // Сборник материалов V юбилейной школы-конференции с международным участием «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» - М МГУПП, 2007 - с 225-229
5 Шагина С.Е., Комбарова С П, Терехова ЕЛ., Черепанова И С. «Получение комплексов включения ß-циклодекстрина с витаминами» // Сборник материалов V Международной научно-практической конференции «Технологии и продукты здорового питания» Часть 2 -М МГУПП, 2007 - с 380-385
6 Банникова Г Е , Шагина С.Е., Поляков К Ю, Варламов В.П, Грачева И М, Иванова Л А, Тихонов ВЕ «Способ получения иммобилизованного бета-циклодекстрина». Патент РФ на изобретение №2295539 от 20 03 2007 Бюл №8
7 Кузнецова О В , Шагина С.Е., Иванова ЛА «Разработка условий химико-ферментативной конверсии крахмала в альфа-циклодекстрины». // Хранение и переработка сельхозсырья, №1,2008 - с. 17-19
8 Шагина С.Е., Войно Л И «Поиск новых продуцентов ß-циклодекстринглюканотрансферазы». // Естественные и технические науки, №1 (33),2008.-с 318-320
9 Шагина С.Е., Войно ЛИ «Циклодекстрины и комплексы включения, их свойства и возможность использования». // Естественные и технические науки, №1 (33), 2008 - с 321-323
10 Шагина С.Е., Малахова Э А, Кузнецова О В, Шостак Л М, Леонтьев В Н., Варламов В П «Комплекс включения витамина Е с ß-циклодекстрином» // Хранение и переработка сельхозсырья, №3,2008. - с 53-56
Сокращения: ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ДТГ-кривая - дифференциальная термогравиметрическая кривая; КЖ - культуральная жидкость, ПВС - поливиниловый спирт, ЦА - циклодекстринглюканотрансфераз-ная активность; ЦГТ-аза - циклодекстринглюканотрансфераза; ЦД - циклодекст-рин
Заказ № 524. Объем 1 пл. Тираж 100 экз.
Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru
Содержание диссертации, кандидата технических наук, Шагина, Светлана Евгеньевна
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Циклодекстрины.
1.1.1. История открытия циклодекстринов
1.1.2. Строение циклодекстринов.
1.1.3. Физико-химические свойства циклодекстринов.
1.1.4. Биодоступпость и биологическое действие циклодекстринов.
1.2. Получение циклодекстринов.
1.2.1. Технологии получения ЦД.
1.2.2. Циклодекстриногенные бактерии - продуценты циклодекстринглюканотрансфераз.
1.2.3.Реакции, катализируемые циклодекстринглюканотрансферазой.
1.3. Применение циклодекстринов.
1.3.1. Применение циклодекстринов в пищевой промышленности.
1.3.2. Применение циклодекстринов в косметической промышленности.
1.3.3. Циклодекстрины как модели ферментов.
1.3.4. Применение циклодекстринов в медицинской, фармацевтической промышленности.
1.3.5. Применение циклодекстринов в химической промышленности.
1.3.6. Применение циклодекстринов в сельском хозяйстве.
1.3.7. Циклодекстрины и экологическая биотехнология.
1.3.8. Использование циклодекстринов для удаления холестерина из продуктов питания.
1.3.9. Комплексы включения Р-циклодекстрипа с витаминами.
1.4. Получение комплексов включения циклодекстринов.
1.4.1. Процесс комплексообразования с циклодекстринами.
1.4.2. Получение комплексов в водных растворах ЦД.
1.4.3. Влияние химической модификации на свойства циклодекстринов.
1.4.4. Нерастворимые полимеры на основе ЦД.
1.5. Витамины.
1.5.1. Витамин Е.
1.5.1.1. Строение витаминов группы Е.
1.5.1.2. Биологическая активность витаминов группы Е.
1.5.1.3. Физико-химические и химические свойства
ОЬ-а-токоферола ацетата.
1.5.2. Рибофлавин.
1.5.2.1. Строение рибофлавина и его производных.
1.5.2.2. Биологическая активность рибофлавина.
1.5.2.3. Физико-химические свойства витамина В2.
1.6. Подходы к реализации принципов обогащения пищевых продуктов.
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1.1. Материалы исследований.
2.1.2. Методы исследований.
2.1.2.1. Методы, используемые при скрининге
Р-ЦГТ-активных штаммов микроорганизмов.
2.1.2.1.1. Скрининг ЦГТ-активных микроорганизмов из природных мест обитания.
2.1.2.1.2. Метод выделения чистых культур микроорганизмов.
2.1.2.1.3. Определение морфологических признаков бактерий.
2.1.2.1.4. Определение физиолого-биохимических признаков.
2.1.2.1.4.1. Изучение способности утилизировать углеводы и сахаро-спирты.
2.1.2.1.4.2. Анализ на анаэробный рост и выделение кислоты.
2.1.2.1.4.3. Образование ацетилметилкарбинола реакция Фогес-Проскауэра).
2.1.2.1.4.4. Восстановление нитратов.
2.1.2.1.4.5. Рост на синтетической среде.
2.1.2.1.4.6. Рост на среде при концентрации №С1 7%.
2.1.2.1.4.7. Рост культуры при различных температурах.
2.1.2.1.5. Филогенетические особенности культуры.
2.1.2.1.6. Определение активности р-ЦГТ-азы фенолфталеиновым методом.
2.1.2.1.7. Определение циклодекстрипов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
2.1.2.1.8. Выращивание культуры микроорганизма в лабораторных условиях.
2.1.2.1.9. Выделение циклодекстринглюканотрансферазы из культуральпой жидкости органическим растворителем.
2.1.2.1.10. Получение лиофилизированных ферментных препаратов.
2.1.2.2. Методы, используемые при получении производных Р~ЦД.
2.1.2.2.1. Введение альдегидных групп в молекулы поливинилового спирта и кремнезема.
2.1.2.2.2. Определение альдегидных (СНО-)групп на сорбенте.
2.1.2.2.3. Подбор температурных условий реакции при синтезе производных р-ЦД с сорбентами.
2.1.2.2.4. Подбор оптимальных количеств Р-ЦД и сорбентов, участвующих в реакции синтеза производных.
2.1.2.2.5. Подбор времени проведения реакции синтеза производных р-ЦД.
2.1.2.2.6. Определение комплексообразующей способности синтезированных производных Р-ЦД с холестерином.
2.1.2.3. Методы, используемые при получении и анализе комплексов включения.:.
2.1.2.3.1. Методы синтеза комплексов включения.
2.1.2.3.2. Определение массовой доли а-токоферол ацетата в комплексе.
2.1.2.3.3. Определение массовой доли ß-ЦД в комплексе.
2.1.2.3.4. Определение стабильности водных растворов комплекса «витамин Е : ß-ЦД».
2.1.2.3.5. Контроль процесса комплексообразования методом центрифугирования.
2.1.2.3.6. Определение воздействия дневного света на витамин В2 и его комплексы с ß-ЦД.
2.1.2.3.7. Фотофлуориметрический метод анализа комплекса витамин В2ф-ЦД».
2.1.2.3.8. Определение растворимости комплексов в воде при разных температурах.
2.1.2.3.9. Термический анализ комплексов.
2.1.2.4. Приготовление конфет «Помадка витаминизированная» и мармелада желейного формового витаминизированного, оценка их качества с учетом весомости основных показателей.
2.1.2.5. Определение содержания сухих веществ.
2.1.2.6. Определение величины pH растворов.
2.1.2.7. Определение содержания влаги.
2.1.2.8. Определение восстанавливающих Сахаров.
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.
2.2.1. Скрининг микроорганизмов продуцентов ß-ЦГТ-азы.
2.2.2. Исследование фенотипических признаков и идентификация штамма 16Ь продуцента ß-ЦГТ-азы.
2.2.2.1. Морфологические и культуральные признаки штамма 16b.
2.2.2.2. Физиолого-биохимические признаки штамма
Bacillus sp. 16b продуцента ß-ЦГТ-азы.Ill
2.2.2.3. Филогенетические особенности культуры Bacillus circulans.
2.2.3. Биосинтез ß-ЦГТ-азы Bacillus circulans шт. 16bГ10Xиß-ЦД.
2.2.4. Разработка условий получения иммобилизованных сорбентов ß-ЦД-поливиниловый спирт и ß-ЦД-кремнезем.
2.2.4.1. Подбор температурных условий реакции при синтезе производных Р-ЦД с сорбентами.
2.2.4.2. Подбор оптимальных количеств (З-ЦД и сорбентов, участвующих в реакции синтеза производных.
2.2.4.3. Подбор времени проведения реакции синтеза производных Р-ЦД'.
2.2.4.4. Определение комплексообразующей способности синтезированных производных р-ЦД с холестерином'.
2.2.5. Получение комплексов включения витамина Е с Р-ЦД.
2.2.5.1. Выбор метода получения комплексов включения витамина Е с Р-ЦД.
2.2.5.2. Характеристика получаемых комплексов витамина Е с Р-ЦД.
2.2.5.3. Изучение стабильности водных растворов комплексов.
2.2.5.4. Определение растворимости комплекса.
2.2.5.5. Хранение витамина Е и комплексов.
2.2.5.6. Термический анализ комплексов витамин Е: Р-ЦД.
2.2.6. Получение комплексов включения витамина В2 с Р-ЦД.
2.2.6.1. Выбор метода получения комплексов включения витамина В2 с Р-ЦД.
2.2.6.2. Изменение растворимости комплексов витамина
В2 с р-ЦД в зависимости от температуры.
2.2.6.3. Воздействие дневного света на витамин В2 и его комплексы с Р-ЦД.
2.2.6.4. Анализ процесса комплексообразования витамина В с Р-ЦД с помощью флуориметрического метода.
2.2.6.5. Термический анализ комплексов витамин В2: Р-ЦД.
2.2.7. Апробация полученных комплексов Р-ЦД с витаминами при изготовлении кондитерских изделий.
2.2.7.1. Характеристики сахарной помады и мармелада при хранении.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание комплексов включений циклодекстринов на основе бета-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы"
Актуальность темы. Важное место среди веществ, способных выступить в качестве хозяина комплекса типа «хозяин-гость» занимают циклодекстрины (ЦД). Этим свойством циклодекстрины обладают благодаря своему строению: их молекулы имеют гидрофильную внешнюю поверхность и сквозную гидрофобную полость, по своим размерам сопоставимую с величиной многих органических и неорганических соединений. ЦД связывают молекулу «гостя» главным образом путем, так называемых, гидрофобных взаимодействий.
ЦД являются продуктами биохимической трансформации крахмала при помощи специальных ферментов, называемых циклодекстринглюкано-трансферазами (ЦГТ-азами). Семейство ЦД включает в себя три основных продукта: а-ЦД, Р-ЦД и у-ЦД, макрокольца которых состоят из шести, семи и восьми остатков глюкопиранозы соответственно. В продуктах конверсии всегда присутствуют и ЦД большего размера. Из реакционной смеси могут быть выделены молекулы циклических Сахаров, имеющие девять, десять, одиннадцать и более звеньев глюкозы в цикле, обозначаемые буквами латинского алфавита 5-, е-, С,-ЦД, но практического интереса эти продукты не представляют.
Использование ЦД при обогащении пищевых продуктов витаминами и другими биологически активными веществами направлено в первую очередь на повышение качества получаемых продуктов и их функциональности. При образовании комплексов с ЦД уменьшается окисление витаминов, эфирных масел. Ряд витаминов в виде комплексов с ЦД становятся более стабильными, устойчивыми, проявляют лучшую биодоступность. Стабилизирующий эффект сказывается и на процессе фоторазложения витаминов. Благодаря этому ЦД широко используются в медицинской, фармацевтической, косметической, пищевой промышлеиностях, сельском хозяйстве и других областях.
На мировом рынке в производстве ЦД, их производных и комплексов включения с различными веществами лидерство принадлежит фирмам из
Японии, США, Китаю и Венгрии. В России проводились исследования в этом направлении в 80-х годах, однако рентабельные технологии разработаны не были.
Таким образом, исследования, связанные с поиском активного продуцента |3-ЦГТ-азы, получением ферментного препарата на основе нового штамма, ЦД и комплексов включения ЦД с нерастворимыми в воде витаминами, являются актуальными для пищевой промышленности нашей страны.
Цель и задачи исследования. Основные цели диссертационной работы состояли в поиске нового активного продуцента (3-ЦГТ-азы для получения очищенного ферментного препарата со степенью очистки Г10Х и последующего синтеза (3-ЦД для создания комплексов включения (3-ЦД с витаминами.
Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:
- скрининг микроорганизмов-продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания, и коллекционных культур с целью отбора штамма, обладающего преимущественно [3-ЦГТ-азной активностью;
- идентификация нового штамма-продуцента (3-ЦГТ-азы на основании изучения совокупности его морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик;
- получение на основе нового продуцента ферментного препарата (3-ЦГТ-азы Г10Х для синтеза Р-ЦД;
- синтез новых производных Р-ЦД на основе поливинилового спирта и кремнезема;
- разработка технологии получения комплекса включения витамина Е с Р-ЦД, определение оптимальных молярных соотношений компонентов комплекса и его анализ;
- разработка технологии получения комплекса включения витамина В2 с Р-ЦД, определение оптимальных молярных соотношений компонентов комплекса и его анализ.
- апробация полученных комплексов в опытном производстве кондитерских изделий.
Научная новизна работы. Проведен направленный скрининг микроорганизмов, обладающих ß-ЦГТ-азной активностью, выделенных из различных видов почв и растительных объектов. Из 60 выделенных изолятов 8 новых штаммов обладали высокой ß-ЦГТ-азной активностью (не менее 4,5 ед/см ) и специфичностью фермента по отношению к синтезу ß-ЦД (не менее 60%). Для исследований отобран штамм-продуцент ß-ЦГТ-азы с максимальной активностью фермента ß-ЦГТ-азы (6,7 ед/см ) и высокой бета-специфичностью ЦГТ-азы (79,13%). На основании изучения совокупности морфологических, культур ал ьных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры новый штамм, продуцирующий ß-ЦГТ-азу, идентифицирован как Bacillus circulans 16b.
Впервые разработаны и экспериментально обоснованы условия синтеза производных ß-ЦД на основе поливинилового спирта (ПВС) и кремнезема (иммобилизованного ß-ЦД). Предложено и реализовано использование данных сорбентов для удаления холестерина из водных или водно-органических растворов.
Разработаны условия получения комплексов включения ß-ЦД с витаминами Е и В2 на основе молекулярных моделей и анализа физических методов обработки, изучены их свойства, позволившие обосновать возможность их применения в технологии кондитерских изделий. Экспериментально установлено, что комплексы могут быть получены с молярным содержанием витаминов и ß-ЦД 1:1. Оптимальным стехиометрическим соотношением компонентов в комплексе витамин Е: ß-ЦД является 1:3, для комплекса витамин В2: ß-ЦД 1:2 моль/моль. Впервые термическим методом анализа подтверждено образование комплексов между ß-ЦД и витаминами Е и В2. Флуориметрическим методом подтверждено образование комплексов витамина В2 с ß-ЦД.
Выявлено положительное влияние процесса комплексообразования с ß-ЦД на устойчивость витаминов к воздействию света и кислорода воздуха. Установлено, что комплексообразование витаминов с ß-ЦД позволяет повысить их растворимость в воде. Для витамина Е растворимость в воде при комнатной температуре в виде комплекса включения 25,9 мг/100 см3, для витамина В2 — 81
•7 мг/100 см , увеличившись более чем в 6 раз по сравнению с чистым витамином.
Практическая значимость работы. В результате направленного скрининга продуцентов ЦГТ-аз, пополнена коллекция культур микроорганизмов кафедры «Биотехнология» МГУПП. На основе нового штамма-продуцента ß-ЦГТ-азы Bacillus circulans 16b в лабораторных условиях осуществлена наработка опытной партии ферментного препарата ß-ЦГТ-азы, проведен синтез ß-ЦД из картофельного крахмала с использованием выделенного фермента. Получены опытные партии комплексов включения витаминов Е и Вз с ß-ЦД с молярным содержанием компонентов от 1:5 до 1:1. Разработаны проекты Технических Условий, составлены акты об изготовлении опытных партий этих комплексов.
В лабораторных условиях кафедры «Технология кондитерского производства» МГУПП изготовлены кондитерские изделия (сахарная помадка и мармелад) с добавлением комплексов витаминов Е и В2 с ß-ЦД. Применяемые комплексы не оказывают негативного влияния на форму, структуру и консистенцию данных кондитерских изделий, не влияют на вкус и аромат продукции, при этом повышают пищевую ценность получаемых продуктов, обогащая их витаминами. Результаты проведенной работы подтверждены актом лабораторных испытаний.
Способ получения иммобилизованного бета-циклодекстрина» защищен патентом РФ №2295539 от 20.03.2007. Синтезированные новые производные ß-ЦД на основе ПВС и кремнезема могут быть рекомендованы для удаления холестерина из различных пищевых продуктов.
Апробация работы. Основные положения работы докладывались на международных конференциях и симпозиумах: на Третьем международном симпозиуме «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК» (Москва, 2006); на V Международной научно-технической конференции «Технологии и продукты здорового питания» (Москва, 2007); на V юбилейной школе-конференции с международным участием «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 1 патент'РФ, где отражены основные положения диссертации.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 204 источника, и 6 приложений. Работа изложена на 185 страницах машинописного текста, включает 23 таблицы и 44 рисунка.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шагина, Светлана Евгеньевна
Выводы
1. Проведен скрининг микроорганизмов, выделенных из различных видов растительных и почвенных образцов, отобранных из разных районов средней полосы России. В результате выделено 27 бактериальных штаммов с преимущественно ß-ЦГТ-азной активностью не менее 2 ед/см КЖ. Наиболее продуктивным по ß-ЦГТ-азе оказался штамм 16Ь с ß-ЦГТ-азной активностью 6,7 ед/см3 КЖ и ß-ЦГТ-специфичностью 79,13 %.
2. На основании совокупности исследованных морфологических, культуральпых, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры новый продуцент ß-ЦГТ-азы идентифицирован как Bacillus circulans штамм 16b.
3. На основе нового штамма по традиционным технологиям получен препарат ß-ЦГТ-азы Г10Х с выходом 4,5 г /дм3 (активность ß-ЦГТ-азы 856,4 ед/г) и ß-ЦД (выход целевого продукта составил 28% от использованного субстрата).
4. Впервые синтезированы иммобилизованные ß-ЦД на основе поливинилового спирта и кремнезема. Показана эффективность данных сорбентов для удаления холестерина из водных или водно-органических растворов.
5. Разработан новый метод получения порошкообразной стабильной формы витамина Е в виде комплекса включения с ß-ЦД с молярным соотношением витамина Е к ß-ЦД от 1:2.
6. Комплексообразование витамина Е с ß-ЦД позволяет перевести витамин в водорастворимую форму. Достигнутая максимальная растворимость витамина Е составила 25,9 мг/100 см воды для комплекса 1:3.
7. Разработаны методы получения стабильных комплексов включения витамина В2 с ß-ЦД при их молярном соотношении 1:1, 1:2 и 1:5 соответственно.
8. Установлено, что комплексообразование с р-ЦД увеличивает растворимость витамина В2 в 6 раз по сравнению с чистым витамином, а так же повышает его устойчивость к воздействию дневного и ультрафиолетового света.
9. Выявлена зависимость между увеличением количества включаемых витаминов Е и В2 и снижением конечной влажности комплексов, что также подтверждено термическим методом анализа.
10. Введение в рецептуру кондитерских изделий - сахарной помады и мармелада — комплексов витамина Е и В2 с (3-ЦД не требует изменения технологических процессов, при этом повышая пищевую ценность продуктов, обогащая их витаминами.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Шагина, Светлана Евгеньевна, Москва
1. ГОСТ 12575-86 Сахар. Методы определения редуцирующих веществ.
2. ГОСТ 4570-93 Конфеты. Общие технические условия.
3. Абелян В.А. Циклодекстрины: Получение и применение. Ереван: Изд. Дом «Ван-Арьян», 2001.- 519 с.
4. Авторское свидетельство SU 18143313. Штамм бактерий Bacillus stearothermophilus продуцент циклодекстрипгликозилтрансферазы и способ получения альфа-циклодекстрина. Абелян В.А. и др., 1989.
5. Авторское свидетельство РФ 2244742. Метод выделения и селекции микроорганизмов-продуцентов циклодекстринглюканотрансфераз, штамм — продуцент Bacillus circulans В-65, 2005.
6. Беликов В.Г., Компанцева Е.В., Гаврилин М.В., Умнова Э.Ф. Изучение возможности использования ß-циклодекстрина для совершенствования процесса получения преднизолона. // Химико-фармацевтический журнал, Т.2, 1991.-с. 48-49.
7. Березовский В. М. Хромановые витамины: токоферолы (витамины группы Е). Химия витаминов. -М.: Пищепромиздат. 1959. с.с.295-315.
8. Березовский В.М. Химия витаминов. Изд. 2-е. — М.: 1973, 507 с.
9. Войно Л.И., Матреничева В.В. Методические указания к выполнению лабораторных работ по общей микробиологии. — М.: Издательский комплекс МГУПП, 2005. 46 с.
10. Ю.Вокк P.A., Пейпман Э.М. Биосинтез и применение циклодекстринглюканотрансферазы. // В. кн.: Биосинтез ферментов микроорганизмами. Тезисы докладов 4 всесоюзной конференции. — Ташкент, 1988.-е. 187-188.
11. П.Волкова Д. А. Получение и изучение свойств высокоочищенной циклодекстринглюканотрансферазы из Bacillus sp.1070. модифицированных ß-циклодекстринов и комплексов включения на их основе. дисс. на соиск. уч.ст. к.н. - М.: 2000. — 100 с.
12. Градова Н.Б., Бабусенко Е.С., Горнова И.Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии. М.: ДеЛи принт, 2004. - 144 с.
13. Н.Грачева И.М., Грачев Ю.П., Мосичев М.С. и др. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. - 240 с.
14. Грачева И.М., Иванова Л.А., Каптере В.М. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и биоэнергия. М.: Колос, 1992. -383 с.
15. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. М.: Элевар, 2000.-512 с.
16. Громов Б.В. Поведение бактерий. // Соросовский образовательный журнал, №6, 1997. с. 28-32.
17. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. Учебник для студ. Биол. специальностей вузов. 4-е изд., стер. - М.: Издательский центр «Академия», 2003. - 464 с.
18. Егоров Н.С., Кестнер А.И., Вокк P.A. История открытия циклодекстринов, свойства и области их применения. // Итоги науки и техники, сер. Микробиология. Т. 20. Ч. 1., 1987. с.с. 5-13, 26.
19. Иванова Л.А., Войно Л.И. Методические рекомендации к проведению лабораторных работ по технологии белковых препаратов, аминокислот и липидов. -М.: Издательский комплекс МГУПП, 1985. 42 с.
20. Иванова Л.А., Войно Л.И. и др. Методические рекомендации к проведению лабораторных работ по дисциплине «Технологиябиоконверсии растительного сырья». М.: Издательский комплекс МГУПП, 2002.-66 с.
21. Кестнер А.И., Пальм Т.Б. Применение циклодексринов в биотехнологии и пищевой промышленности. // Итоги науки и техники, сер. Микробиология. Т. 21. Ч. II., 1988. с. 128-134
22. Компанцева Е.В., Гаврилин М.В., Ботезат-Белый Ю.К., Умнова Э.Ф., Андроник И .Я. Исследование взаимодействия ß-циклодекстрина с кортексолоном. // Химико-фармацевтический журнал, Т.З, 1990. с. 8182
23. Кошелева Т. В. Разработка технологии ферментативного синтеза цикл о декстринов. Дис. канд. тех. Наук. - М.: 1991. - 160 с.
24. Крамер Ф. Соединения включения, пер. с немецкого. М.: Издательство иностранной литературы, 1958. — 169 с.
25. Кудряшов Б. А. Витамин Е и механизм его действия. Учен. Зап. МГУ. Вып. 32, 1940. -с.с. 39-44.
26. Кушакова Е. Е. Разработка технологии высокоочищенной цикподекстринглюканотрансферазы из Bacillus macerans 506. Дисс. канд. тех. Наук-М.: 1990.- 181 с.
27. Логинов О. Н. Физиолого-биохимические свойства, представителей вида Bacillus macerans продуцентов циклодекстринглюканотрапсфераз. — Дис.канд. биол, наук-Киев.: 1991. — 106 с.
28. О.Лурье И.С., Шаров А.И. Технохимический контроль сырья в кондитерском производстве: Справочник. М.: Издательство Колос, 2001.-352 с.31 .Маршалкин Г.А. Производство кондитерских изделий. -М.: Колос, 1994. -272 с.
29. Метод определения холестерина мембран эритроцитов. Кировский государственный медицинский институт. // Перспективные технологии и новые разработки. Омск.: Промышленная Сибирь, 2004. - с. 36-37.
30. Мякиньков А.Г. Циклодекстрины в качестве хлебопекарных улучшителей (Использование для коррекции свойств полуфабрикатов и готовых изделий из некачественного сырья). // Пищевая и перерабатывающая промышленность. Реферативный журнал, №1, 2000. с. 97.
31. Надиров Н. К. Токоферолы и их использование в медицине и сельском хозяйстве.-М.: Наука, 1991.-с.с. 10, 196.
32. Нечаев А.П., Траубенберг С.Е., Кочеткова A.A. и др. Под ред. Нечаева А.П. Пищевая химия. СПб.: ГИОРД, 2001. - 592 с.
33. Определитель бактерий Берджи/ под ред. Дж. Хоулта и др. 9-е изд. В 2-х томах. -М.: МИР, 1997.
34. Панова И.Г., Герасимов В.И., Гроховская Т.Е., Топчиева И.Н. Новые наноструктуры на основе блок-сополимеров. Комплексы включенияпроксанолов с ЦД. Доклады Академии Наук, том 347, №1, 1996. с.с. 6165.
35. Паппель К.Э., Дихтярев С.И., Сугробова Н.П. Особенности получения циклодекстринов и образование комплексов включения. // Итоги Науки и техники, сер. Микробиология, том 21,часть II, 1988. с.с. 74-79.
36. Патент Венгрия, № 174698, 1979.
37. Патент ВОИС №01/90335. Nouvelle cyclodextrine glucanotransferase, procede de production de celle-ciet procede de production de cyclodextrine au moyen de cette enzyme, 2001
38. Патент РФ №2042687. Способ получения дегидроаналогов стероидов, 1995.
39. Патент США №4317881. Yagi Y., Kouno К., Inui Т. Process for producing cyclidextrins. 1982.
40. Патент США № 6780624 B2. Glycosyl transferases for biosynthesis of oligosacchari-des, and genes encoding them, 2004.
41. Патент США № 6924136. Cyclodextrin glucanotransferase and its method of manufacture, 2005.
42. Патент Франция №5376537. Process for production of cyclodextrins/ Cami P.H.-27.12.1994.
43. Прокопчук H.P. Кинетический принцип прогнозирования зависимости механических свойств волокон и пленок от их химического строения и состава. Автореферат на соискание уч. степ. Доктора хим. наук. Киев, 1989.-34 с.
44. Пруцакова Е.А., Терехова Е.Я., Усанов Н.Г. "Измерение ферментативной активности ЦГТ-азы, К.Ф. 2.4.1.19. // Изучение и рациональное использование природных ресурсов. Тезисы докладов научной конференции. Уфа, 1991.-с. 108.
45. Райкис Б.Н., Пожарская В.О., Казиев А.Х. Общая микробиология с вирусологией и иммунологией (в графическом изображении). Учебное пособие. М.: Тонада — X, 2002. — 352 с.
46. Ребров В.Г., Громова O.A. Витамины и микроэлементы, М.: «Алев-В», 2003. - с.с.227-228.
47. Романов A.C., Краус С. Сорбционные свойства многокомпонентных смесей для производства мучных изделий. // Хлебопродукты, № 6, 2000. — с.с. 24-26.
48. Романов A.C., В.М.Кудинова, В.И.Брагинский, Е.А. Шерина, Д.Н.Бикбулатова. Влияние циклокара на реологические свойства кондитерского теста. // Хранение и переработка сельхозсырья. №6, 2001. -с. 28-31.
49. Терехова Е. Я. Выделение продуцентов бета-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы и получение ферментных препаратов на их основе. Дисс. канд. тех. наук. - Уфа.: 1999. - 110 с.
50. Топор Н.Д., Огородов Л.П., Мельчакова JI.B. Термический анализ минералов и неорганических соединений. М.: Изд-во МГУ, 1987.
51. Усанов Н.Г., Е.А. Гильванова, П.А. Елизарьев, Е.А. Пруцакова, А.И. Мелентьев. Усовершенствованный метод фотометрического определения активности бета-циклодекстрипглюканотрансферазы. // Прикладная биохимия и микробиология, Т. 43, №1, 2007. с.с. 118-124.
52. Усанов Н.Г., Логинов О.Н., Пруцакова Е.А., Терёхова Е.Я. Получение бета-ЦД из картофельного крахмала. // Тезисы докладов Всесоюзной конференции.-Черновцы, Т. 1, 1991.-е. 122.
53. Уэндландт У.У. Термические методы анализа. М.: Мир, 1978. - 526 с.
54. Фармацевтические композиции, содержащие гликопептидный антибиотик и циклодекстрин. 05.17-190.144П. // РЖ 190. Технология органических лекарственных веществ, ветеринарных препаратов и пестицидов, 2005. с. 17.
55. Хафизов Р. X., Надиров Н. К., Сакаева Р. Ф. Химия витамина Е и его биологических производных. // В кн.: Витамины. Киев: Наукова думка. Вып. 8., 1975.-с.с. 22-30.
56. Химические волокна. Текстильные материалы. Бумага. Кожа. Мех), 2005. с. 22.
57. Циклодекстрины и их комплексы включения с маслорастворимыми витаминами. 05.04-19Е.78. // РЖ 19Е. Природные органические соединения и их синтетические аналоги, 2005. с. 4.
58. Штейнман А. А. Цикл о декстрины/ ЖВХО им. Менделеева, 5, 1985. с. 34-38.
59. Экспериментальная витаминология, под ред. Островского Ю. М. — Минск.: Наука и техника, 1979. с.с. 18-57, 224-265.
60. Эль-Хаддад М., Грачева И.М., Грязнова С.В. // Прикладная биохимия и микробиология. Том. 10, № 3, 1974. с.с. 264-270.
61. Эммандзи К., Ямасути X., Эдо С. Водорастворимый антиоксидант. Патент Япония № 61288, 1986 (РЖ Химия. 1987. 4Н55П).
62. Ahn J., Kwak H.S. Optimizing cholesterol removal in cream using P-cyclodextrin and response surface methodology. // J.Food Sci., V.64., 1999. -p. 629-632.
63. Andersen G.H., Robbins F.M., Dominiques F.J. et al. The utilisation of Schardinger dextrins by the rat. // Toxicol. And Appl. Pharmacol. V.5., № 2., 1963.-p.p. 257-266.
64. Anslyn V. Eric, Dennis A. Dougherty. Modern Physical Organic Chemistry, University Science, 2005. ISBN 1-89138-931-9.
65. Baxter J. C., Robeson C. D., Taylor J. P., Lehman R. W. Natural a-, (3- and y-tocopherol and certain esters of physiological interest. // J. Amer. Chem. Soc. V. 65. №5. 1943.-p.p. 918-922.
66. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Volume 1: The Archaea and the Deeply Branching and Phototrophic Bacteria / George M. Garrity (Editor), David R. Boone (Editor)/ Springer; 2 edition, 2001. 721 p.
67. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2 (Parts А, В & С; Three-Volume Set) / George M. Garrity (Editor)/ Springer; 2 ed., 2005. 2816 p.
68. Bicchi C., D'Amato A., Rubiolo P. Cyclodextrin derivatives as chiral selection for direct gas chromatographic separation of enantiomers in the essential oil, aroma and flavoiur fields. // J. Chromatography A. May 28; 843 (1-2), 1999. -p.p. 99-121.
69. Bikadi Z., Ivanyi R., Szente L., Illisz I., Hazai E. Cyclodextrin complexes: chiral recognition and complexation behaviour. // Curr. Drug Discov. Technol. 4 (4), 2007.-p.p. 282-294.
70. Biwer A., Antranikian G., Fleinzle E. Enzymatic production of cyclodextrins. // Applied Microbiology and Biotechnology. Volume 59, Number 6, September 2002.-p.p. 609-617.
71. Boehler N., Riottot M., button C. Prevention of cholesterol gallstone formation in the hamster by b-cyclodextrin, a resistant carbohydrate. Atherosclerosis, Vol. 134, 1-2 (октябрь), 1997.-p. 325.
72. Bonsdorff-Nikander A., Karjalainen M., Rantancn J., Christiansen L., Yliruusi J. Physical stability of a microcrystalline beta-sitosterol suspension in oil.// Eur. J. Pharm. Sci. V. 19.,2003. p.p. 173-179.
73. Bovetto L.J., Backer D.P., Villette J.R. et. al. Cyclomaltodextrin Glycosyllransferase from Bacillus circulans E 192. // Biotechnol. Appl. Biochem, V. 15, 1992. p.p. 48-58.
74. Brian J. Spenser, William C. Purdy. Comparison of the separation of fat-soluble vitamins using p-cyclodextrins in high-performance liquid chromatography and micellar electrokinetic chromatography. // J. Chromatography A, 782, 1997. p.p. 227-235.
75. Buschmann. H.-J., Knittel D., Schollmeyer. E. New Textile Applications of Cyclodextrins. // Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, Vol.40, 2001,-p.p.169-172.
76. Cosmetics in Nanocups The Smallest Beauty Cases in the World Features. // Wacker-Chemie GmbH, Number 1, January 2004. - 11 p.
77. Cully J, Vollbrecht HR. US Patent 5292546, 4 March (1992).
78. P-Cyclodextrin KleptoseR. The new approach to molecular encapsulation. // Roquette, Freres (FR). Press releases 1994.
79. Deak T., Timar E. Simpfied identification of aerobic spore-formers in the investigations of foods. // International Journal of Food Microbiology. Vol. 6, 1988.-p.p. 115-125.
80. Dodziuk H., John Wiley & Sons. Cyclodextrins and Their Complexes: Chemistry, Analytical Methods, Applications. 2006, ISBN 3-52731-280-3.
81. Easton J. Christopher, Lincoln F. Stephen. Modified Cyclodextrins: Scaffolds and Templates for Supramolecular Chemistry. // World Scientific Publishing Company, 1999, ISBN 1-86094-144-3.
82. Enzymatic composition for improving the quality of bread and pastry doughs. Patent WO/2004/084638.
83. European Patent EP №1077675. Compositions for the treatment of acne, 2005.
84. FAO Nutrition Meetings Report, Series № 46A WHO/ Food ADD/ 70, 1987. -36 p.
85. Fenyvesi E., Balogh K., Siro I., Orgovanyi J., Senyi J. M., Otta K., Szente L. Permeability and release properties of cyclodextrin-containing poly(vinyl chloride) and polyethylene films. // J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem. 57, 2007.-p. 371-374.
86. Fenyvesi E., Ujhazy A., Szejtli J., Putter S., Gan T.G. Controlled release of drugs from CD polymers substituted with ionic groups. // J. Inclusion Phenom. Mol. Recognit. Chem., Vol. 25, 1996.-p.p. 185-189.
87. Fernandez-Perez V., de Castro M.D. Superheated water extraction of cholesterol from solid food. // Anal. Bioanal. Chem. V. 375., 2003. - p.p. 437-442.
88. French D. The Schardinger dextrins. // Adv. Carbohydr. Chem. № 12. 1957.-p.p. 189-267.
89. Freudenberg, K. Cramer F., Plienger H. // Ger. Patent No.895,769.
90. Fromming K.H., Weyermann Q. Increase of the in vivo solving speed using inclusion compounds with P-cyclodextrin. // Archiv der Pharmazie. V. 305, 1972.-p.p. 290-299.
91. Fujishima N., Kusaka K., Umino T., Urushinata T., Terumi K. Flour based foods containing highly branched cyclodextrins. // Japanese Patent JP 136,898, 2001.
92. Fujita K., Tahara T., Nagamura S., Imoto T. Et al. // J. Org. Chem., 52, №4, 1987.-p.p. 636-640.
93. Geiger G. Structurelle Eigen shaften und chemische modifïzierung von — Cyclodextrin. // Disser. Universität Stittgard. 1985. 311 p.
94. Gomis D.B., Fernandez M.P., Gutierrez Alvarez M.D. Simultaneous determination of fat-soluble vitamins and provitamins in milk by microcolumn liquid chromatography. // Journal of Chromatography A, 891, 1 (сентябрь 01), 2000.-p.p. 109-114.
95. Gruiz K., Fenyvesi É., Kriston E., Molnâr M., Horvâth B. Potential use of cyclodextrins in soil bioremediation. // J. Inclusion Phenom. Mol. Recognit. Chem., 25, 1996. p.p. 233-236.
96. Hagan R.D. Benefits of aerobic conditioning and diet for overweight adults. //Sports Med. . V. 5. 1988.-p.p. 144-155.
97. Hashimoto H., Hara K., Kuwahara N., Mikuni K., Kainuma K., Kobayashi S.: Jpn Kokai, 1985.
98. Harada A., Li J., Kamachi MM Nature. V. 356. 1992. p.p. 1332.
99. Hilgers L. A., Lejeune G., Nicolas I., Fochesato M. and Boon B. Sulfolipo-cyclodextrin in squalane-in-water as a novel and safe vaccine adjuvant. //Vaccine, Volume 17, Issue 3, February 1999. p.p. 219-228.
100. Horikoshi K., Nakamura N., Matzuzawa N., Yamamoto M. Industrial production of cyclodextrins. In: 1st International Symposium on Cyclodextrins, Budapest, 1981. -p.p.25-39.
101. Hsu Bih-Hsiung. Inclusion complexes of cyclodextrin with aromatic compounds and chiral amino acids. Masters Abstracts International, 39, 2001. p.p. 74.
102. Jiang Z., Mao L., Shen H., Li R. Adsorbed resin phase spectrophotometry determination of vanillin or/and its derivatives. Talanta, 47, 5 (декабрь 07), 1998. p.p. 1121-1127.
103. Jicsinszlcy L., Fenyvesi E., Hashimoto H., Ueno A. Cyclodextrin derivatives. // Compr. Supramol. Chem. Volume 3, 1996. p.p. 57-188.
104. Kaneko Т., Nalcamura N., Horikhoshi K. Spectrophotometry determination of cyclozation activity of (3-cyclodextrin forming cyclodextrin glucanotransferase. // Journal Japan Society Starch Science. 34, 1987. - p.p. 45-48.
105. Khan A.R., Forgo P., Stine K.J., D'Souza V.T. Metods for Selective Modifications of Cydodextrins. // Chem. Rev. V. 98. 1998. p.p.1977-1996.
106. Khramov A.N., Voevodin N.N., Balbyshev V.N., Mantz R.A. Sol-gel-derived corrosion-protective coatings with controllable release of incorporated organic corrosion inhibitors. Thin Solid Films. Vol. 483, Issues 1-2, 1 July 2005. -p.p. 191-196.
107. Kij ima, I.: Jpn Kokai, 1981.
108. Kilsdonk E.P.C., Johnson W.J., Rothblat G.H., Bangerter F.W. Cyclodextrin-mediated efflux of cellular cholesterol. Atherosclerosis, 115 (1995), (июнь), S100.
109. Kimura K., Takano T., Yamane K. Molecular cloning of the P-cyclodextrin synthetase gene from an alkalophilic Bacillus and its expression in Escherichia coli and Bacillus subtilis. // Appl. Microbiol. Biotechnol. — V.26, N 2. 1987 - p.p.149-153.
110. Kitahata S., Tsuyama N., Okada S. Purification and some properties of cyclodextrin glycosyltransferase from strain of Bacillus species. // Agr. Biol. Chem, v.38, N 2, 1974. p.p.387-393.
111. Kobayashi M., Yamashita K., Matukura K., Okumura J. // Jpn Kokai, 1981.
112. Koizumi K., Utamura T., Kuroyanagi T. Analyses of branched cyclodextrins by high performance liquid and yhin-layer chromatography. // J.Chromatogr. v.360, . 1986. p.p.397-406. ;
113. Kuroda Y., Hiroshige T., Ogoshi H. Epoxidation reaction catalyzed by cyclodextrin sandwiched porphyrin in aqueous buffer solution. // J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1990.
114. Kwak H.S., Jung C.S., Shim S,Y., Ahn J. Removel of cholesterol from Cheddar cheese by beta-cyclodextrin. // J. Agric. Food Chem. V. 50. 2002. - p.p. 7293-7298.
115. Lee D.K., Ahn J., Kwak H.S. Cholesterol Removal from Homogenized Milk with P-cyclodextrin. // J. Dairy Science. V. 82. - 1999. - p.p. 23272330.
116. Li Zh. y-Cyclodextrin: a review on enzymatic production and applications. // Applied Microbiology and Biotechnology. Volume 77, Number 2, 2007.-p.p. 245-255.
117. Liong M.T., Shah N.P. Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of Lactobacilli strains. // J. Dairy Sci. V. 88. 2005. - p.p. 55-66.
118. Luo W. Serum retinol analysis, and complex formation between retinyl acetate and beta-cyclodextrin. Dissertation Abstracts International, 54 (1994), 7, p. 3413.
119. Martin Del Valle E.M. Cyclodextrins and their uses: a review. // Process Biochemistry, V. 39, 2004. pp. 1033-1046.
120. Mayer H., Schudel E., Ruegg R, Isler O. Uber die Chemie des Vitamins E 6/ Mitteilung Die Totalsynthese der beiden Enantiomeren des a — Tocopherol — Hammetaboliten (SIMON Metaboliten). // Helv. Chim. Acta. V. 47. №1. 1964.-p.p. 229-234.
121. Molnar M., Leitgib L., Gruiz K., Fenyvesi E., Szaniszlô N., Szejtli J., Fava F. Enhanced biodégradation of transformer oil in soils with cyclodextrin from the laboratory to the field. // Biodégradation, vol.16, 2005. - p.p. 159168.
122. Nagai T. Cyclodextrin research in Japan. I. Int. Symp. on Cyclodextrins. Budapest, 1981.-p.p. 15-25.
123. Nakai Y., Yamamoto K., Terada K. et all. Crystallinity changes of a- and ß-cyclodextrins by grinding. // J. Pharm. Soc. Jpn. V. 105. № 6. 1985. p.p. 580-585.
124. Nakamura N., Horikoshi K. Characterization and some cultural conditions of a cyclodextrin glycosyltransferase-producing alcalophilic Bacillus species. //Agr. Biol. Chem., V. 40, N 4, 1976. p.p. 753-757.
125. Nevado J.J.B., Pulgarn J.A.M., Laguna M.A.G. Spectrofluorimetric study of the ß-cyclodextrin:vitamin K3 complex and determination of vitamin K3. Talanta, 53, 5 (январь 26), 2001. p.p. 951 - 959.
126. Nishijo J., Moriyama S., Shiota S. Interaction of Cholesterol with Cyclodextrin in Aqueous Solution. // Chem. Pharm. Bull. V. 51. - 2003. -p.p.1253-1257.
127. Nomoto M., Shew D.C., Chen S.J. et al. Cyclodextrin glucanotransferase from alkalophilic bacteria of Taiwan. // Agr. Biol. Chem., v.48, N 5, 1984. -p.p.1337-1338.
128. Noväk Cs., Ehen Zs., Fodor M., Jicsinszky L., Orgovänyi J. Application of combined thermoananlytical techniques in the investigation of cyclodextrin inclusion complexes. // Journal Thermal Analysis and Calorimetry, Vol. 84, 2006.-p. 693-701.
129. Paradossi G., Cavalieri F., Crescenzi V. 1H NMR relaxation study of a chitosan-cyclodextrin network. // Carbohydrate Res. V. 300. - 1997. - p.p. 77-84.
130. Penninga D., Strokopytov В., Rozeboom H.L. et al. Site-Directed Mutation in Tyrosine 195 of Cyclodextrin Glycosyltransferase from Bacilluscirculans strain 251 Affect Activity and Product Specifisity. // Biochemistry. V. 34, 1995. -p.p.3368-3376.
131. Phan T.N.T., Bacquet M., Morcellet M. The removal of organic pollutants from water using new silica-supported b-cyclodextrin derivatives. // Reactive and Functional Polymers, 52, 3 (сентябрь), 2002. p.p. 117-125.
132. Pierandrea Lo Nostro, Fratoni L., Baglioni P. Modification of a Cellulosic Fabric with ß-Cyclodextrin for Textile Finishing Applications. // Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 44, 1-4 (декабрь), 2002. p.p. 423-427.
133. Pishtiyski I. Characterization of Cyclodextrin Glucanotransferasei
134. Produced by Bacillus megaterium. // Applied Biochemistry and Biotechnology. * Volume 144, Number 3, March 2008. p.p. 263-272.
135. Ramakrishna S.V., Saswathi H., Sheela et al. Evaluation of solid,, slurry and submerged fermentations for the production of cyclodextrin glycosyltransferase by Bacillus cereus. // Enzyme Microb, Technol., V. 16, 1994. p.p. 441-444.
136. Rao K.R. et all. Artificial enzymes: Synthesis of imidazole substituted at C(2) of ß-cyclodextrin as an efficient enzyme model of chymotrypsin // J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1990.
137. Reed L. J. Biochemistry of lipoic acid. // Vitamins hormones .: Acad. Press. V. 20.1962.-p.p. 1-35.
138. Regiert M., Kupka M. Komplex aus ß- oder y-Cyclodextrin und a-Tocopherol. Deutsches Patent DE №10200657 AI, 24 Juli (2003).
139. Ronald Breslow. Artificial Enzymes. Wiley, 2005. 194 p.
140. Ronghua Y., Ke'an L., Kemin W., Fenglin Zh. Porphyrin assembly on beta-cyclodextrin for selective sensing and detection of a zinc ion based on thedual emission fluorescence ratio. I I Analytical Chemistry, 75, 3 (февраль 01), 2003.-p.p. 612.
141. Schlenk W., Sand D.M., Tillotson J.A. Stabilization of Autoxidizable Materials by Means of Inclusion. // J. Amer. Chem. Soc. V. 77. № 13. 1955. -p.p. 3587-3590.
142. Schmid G. Cyclodextrin glycosyltransferase production: yield enhancement by overexpression of cloned genes. // Trends Biotechnol. — V.7, N9. 1989.-p.p. 244-248.
143. Sumiyoshi Hideyuki, Oishi Manami. New Application Technology of Cyclodextrin (CD). Cyclodextrin Inclusion Plant Factor, and It's Application. // Technical Journal on Food Chemistry & Chemicals. VOL.15; № 6; 1999. -p.p. 99-105.
144. Suzuki M., Sato A. J. Nutr. Sci. Vitaminol. 31, № 2, 1985. p.p. 209223.
145. Szaniszlo N., Fenyvesi Ё., Balla J. Structure-stability- Study oft
146. Cyclodextrin Complexes with Selected Volatile Hydrocarbon Contaminants of Soils. // J. Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, Vol.'53, 2005. — p.p. 241-248.
147. Szente L., Harangi J., Greiner M., Mandel F. Cyclodextrins Found in Enzyme and Heat-Processed starch-Containing Food. // Chemistry & Biodiversity, Vol. 3, 2006. p.p. 1004-1014.
148. Szente L., Szejtli J. Cyclodextrins as food ingredients. // Trends in Food science & technology, Vol. 15, 2004. p.p. 137-142.
149. Szente L., Szejtli J. Cyclodextrins in pesticides. Compr. Supramol. Chem. Volume 3, 1996.-p.p. 503-514.
150. Szente L., Szejtli J., Szeman J., Kato L. Fatty acid-cyclodextrin complexes: properties and applications. // J. Inc. Phenom. Mol. Recogn. 16, 1993.-p.p. 339-354.
151. Szeman J., Csabai K., Kekesi K., Szente 1., Varga G. Novel stationary phases for high-performance liquid chromatography analysis of cyclodextrin derivatives. // Journal of Chromatography A, 1116, 2006. p.p. 76-82.
152. Szeman J., Ganzler K. Use of cyclodextrins and cyclodextrin derivatives in high-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis. // Journal of Chromatography A, 668, 1994. p.p. 509-517.
153. Szejtli J. Cyclodextrins and their inclusion complexes // Academiae Kiado: Budapest, Hungary, 1982. 296 p.
154. Szejtli J. Cyclodextrins: Applications. // Encyclopedia of Supramolecular Chemistry, Marcel Dekker, 2004. p.p. 405-413.
155. Szejtli J. Cyclodextrins In Drug Formulations: Part I. Parmaceutical Technology International, 3,1991. 15 p.
156. Szejtli J. Cyclodextrins In Drug Formulations: Part II. Pharmaceutical Technology International, 3, 1991. 16 p.
157. Szejtli J. Cyclodextrin technology. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1988.-450 p.
158. Szejtli J. Introduction and general overview of cyclodextrin chemistry. Chemical Reviews, V. 98, №5, 1998. p.p. 1747-1748.
159. Szejtli J. Medicinal applications of cyclodextrins. Medicinal Research Reviews, 14 (3), 1994. p.p. 353-386.
160. Szejtli J. Past, present, and future of cyclodextrin research. Pure Appl. Chem., Vol. 76, No. 10, 2004. p.p. 1825-1845.
161. Szejtli J. The cyclodextrins and their application in biotechnology. // Carbohydrate Polymers. 12, 1990.-375 p.
162. Szejtli J. The properties and potencial uses of cyclodextrin derivatives. // J. of Inclusion Phenomena and Molecular Recognition in Chem. 14, 1992. — p.p. 25-36.
163. Szejtli J. Utilization of Cyclodextrins in industrial products and processes. // J. Mater. Chem. V. 7. № 4. 1997. p.p. 575-587.
164. Szejtli J., Bolla-Pusztai E., Szabo P., Ferenczy T. // Parmazie. Bd 35, 1980.-p.p. 779-787.
165. Szejtli J., Szente L. Elimination of Bitter, Disgusting Tastes of Drugs and Foods by Cyclodextrins. // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, Vol. 61, 2005. p.p. 115-125.
166. Takeshita K, Urata T. Antimicrobial food preservatives containing cyclodextrin inclusion complexes. // Japanese Patent JP 29,054, 2001.
167. Terekhova I.V., Obukhova N.A. Calorimetric and spectroscopic study on the interaction of hydroxypropyl-a-cyclodextrin with ascorbic acid. // Mend. Commun. 2005.-p. 38.
168. Tilden E.B., Hudson C.S. J. Bacteriol. //43, №2, 1942. p.p. 527-544.
169. Toda J., Misaki M., Konno A., Wada T., Yasumatsu ;K. In The " International Flavor Conference, 1985.
170. Tonkova A. Bacterial cyclodextrin glucanotransferase. // Enzyme and Microbial Technology, vol. 22, 1998. p.p. 678-686.
171. United States Patent №5447920. Cosmetic composition containing inclusion product with hydroxyalkylated cyclodextrin, 1995.
172. United States Patent №5834445. Process for preparing decolorized carotenoid-cyclodextrin complexes, November 10, 1998.
173. United States Patent №5882565. Barrier material comprising a thermoplastic and a compatible cyclodextrin derivative, 1999.
174. United States Patent №5985296. Complexes of gamma-cyclodextrin and retinol or retinol derivatives, processes for their preparation and their use. March 20, 1998.
175. Van de Peer Y., Wachter R. // Comput. Appl. Biosci. V. 10. 1994. p.p. 569-570.
176. Wacker fine chemicals Presents: Tocopherol Complexes and Vegetarian Cysteine. Press releases. Shanghai, Oct 18, 2005.
177. Worthington Enzyme Manual. // New Tersey: Freehdc, 1972. p.p. 125 - 127.
178. Xiao Q. Tian, Michael F. Holick. Catalized yhermal isomerisation between previtamin D3 and vitamin D3 via P-cyclodextrin complexation. // J. Biol. Chem. V. 270, №15, 1995.-p.p. 8706-8711.
179. Xue-Mei W., C. Hong-Yuan. A spectroelectrochemical study of the interaction of riboflavin with b-cyclodextrin. // Spectrochimica Acta. Part A: Molecular Spectroscopy, 52, 5 (май), 1996. p.p. 599-605.
180. Zhenming D., Liu Xiuping, Zhang Guomei, Shuang Shaomin, Pan Jinghao. Study on vitamin КЗ-cyclodextrin inclusion complex and analytical application. // Spectrochimica Acta, Part A 59, 2003. p.p. 2073-2079.
181. Zhou L., B.D. Johnson, C. Miller, J.M. Wyvratt. Chiral capillary electrophoretic analysis of the enantiomeric purity of a pharmaceutical compound using sulfated b-cyclodextrin. // Journal of Chromatography A, 875, 1-2 (апрель 14), 2000. p.p. 389-401.
-
Шагина, Светлана Евгеньевна
-
кандидата технических наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 03.00.04
- Выделение продуцентов бета-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы и получение ферментных препаратов на их основе
- Биотехнология получения циклодекстринов полифракционного состава на основе продуцента Paenibacillus ehimensis IB-739
- Получение и изучение свойств высокоочищенной циклодекстринглюканотрансферазы из Bacillus sp. 1070, модифицированных β-циклодекстринов и комплексов включения на их основе
- Получение и изучение свойств высокоочищеннойциклодекстринглюканотрансферазы из Bacillus sp. 1070, модифицированных вета-циклодекстринов икомплексов включения на их основе.
- Современная микрокалориметрия в изучении биохимических реакций
