Состав, биологическая активность и роль экзогликанов бактерий Paenibacillus polymyxa во взаимодействиях с растениями

Трегубова, Кристина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Состав, биологическая активность и роль экзогликанов бактерий Paenibacillus polymyxa во взаимодействиях с растениями
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Состав, биологическая активность и роль экзогликанов бактерий Paenibacillus polymyxa во взаимодействиях с растениями"

004613308

' г

Трегубова Кристина Владимировна

СОСТАВ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И РОЛЬ ЭКЗОГЛИКАНОВ БАКТЕРИЙ РАЕШВА С1Ы Ш РОЬ УМУХА ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯХ С РАСТЕНИЯМИ

03.01.04 - биохимия 03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 НОН 2010

Саратов-2010

004613808

Работа выполнена в лаборатории биохимии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН)

Научные руководители: доктор биологических наук, професс«

Игнатов Владимир Владимирович

кандидат биологических наук Бгоренкова Ирина Владимировна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, професс«

Карпунина Лидия Владимировна

кандидат биологических наук, доцент Мельников Геннадий Васильевич

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-

исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита состоится «24» ноября 2010 г. в 14. 00 ч на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13). Факс (8452) 97 03 83.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат диссертации размещен на сайте http://www.ibppm.saratov.ru/obyav_dis.html

Автореферат разослан « » октября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ю^/г

доктор биологических наук, профессор В.Е. Никитина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Почвенные азотфиксирующие ризобактерии libacillus polymyxa, по старой классификации Bacillus polymyxa (Ash et al., 1993), 1улируют рост и развитие широкого круга растений благодаря формированию ективных ассоциативных отношений. Это связано со способностью этих роорганизмов к азотфиксации, фосфатмобилизации, продукции фитогормонов, 1биотиков (Mannanov and Sattarova, 2001), широкого спектра литических ментов, высокой адаптивностью к условиям существования, а также частым фужением их в ризосфере злаков (Lebuhn et al, 1997, da Mota et al., 2002; Lal and icchioni, 2009). Опытным путем доказано, что P. polymyxa, находясь в ассоциации астениями, могут увеличивать сопротивляемость растительного организма гическим и абиотическим стрессам (McSpadden, 2004; Selim et al., 2005; Timmusk et 2005). Ряд исследователей выдвигает на первый план в данных процессах :обность Р. polymyxa к эффективной колонизации и формированию биопленок *gag and Timmusk 2008; Timmusk et al., 2009). Показано, что некоторые штаммы олько колонизируют корневую поверхность (Bent et al., 2002), но и проникают грь корневых тканей (Shishido et al, 1999).

Бактерии P. polymyxa известны как активные продуценты кислых и гральных экзополисахаридов (ЭПС) (Пирог с соавт., 1985; Матора с соавт., 2; Hebbar et al, 1992; Lee et al., 1997; Jung et al, 2007), обладающих рядом кальных свойств, что объясняет разнообразие сфер возможного применения пых полимеров. Наряду с этим, экзогликанам Р. polymyxa отводится важная ь в формировании растительно-микробных ассоциаций (Hebbar et al, 1992; zate et al., 2000; Timmusk et al., 2005; Haggag, 2007). P. polymyxa широко ользуются как основные компоненты комплексных бактериальных удобрений, приводит к обогащению окружающей среды выделяемыми полисахаридами, юкт действия которых на организм человека и животных до сих пор не вполне

Поверхностная локализация внеклеточных полисахаридов (ВПС) придает им тства посредников во взаимодействии Р. polymyxa с другими микро- и роорганизмами. Кроме того, образуя на поверхности бактерий плотный слой, 3 могут экранировать расположенные под ними другие клеточные структуры и еделять иммунологические свойства бактерий (Васильев с соавт., 1984). ледованиями ряда ученых (Ермольева и Вайсберг, 1976; Розе с соавт., 1990; Jung et 2007; Chang et al, 2009; 2010) показано, что ЭПС P. polymyxa представляют собой логически активные вещества (БАВ), обладающие иммунотропным действием.

Несмотря на интенсивные исследования данных бактериальных исахаридов (ПС) и значительные успехи в выяснении их физиологической роли, потея до конца не выясненными свойства и химическая структура большого ктра ЭПС. Всестороннее изучение данных биополимеров позволит выявить (кциональные связи между строением экзогликанов и их биологической роль'ю! может способствовать более полному и глубокому пониманию молекулярных

основ межклеточных, межвидовых и межорганизменных взаимодействий. Эт свидетельствует о несомненной актуальности работ, направленных на изучени внеклеточных полисахаридов бактерий вида P. polymyxa.

В этой связи, цель данной работы состояла в выявлении особенностей состав . и свойств экзогликанов ряда штаммов P. polymyxa и оценке их роли в взаимодействии с корнями пшеницы.

Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

4. Провести сравнительное исследование продукции внеклеточны - полисахаридов рядом штаммов P. polymyxa.

2. Выделить суммарные препараты ЭПС бактерий P. polymyxa и провеет анализ их химического состава.

3. Провести качественную и количественную оценку способности бактерий 1 polymyxa к колонизации корнейпроростков пшеницы.

4. Оценить способность к формированию биопленок ряда штаммов 1 polymyxa, отличающихся по выходу и реологическим свойствам ЭПС.

5. Исследовать активность препаратов ЭПС P. polymyxa в отношени эукариотических клеток: растительных, иммунной системы животных и цельно крови человека.

Научная новизна работы. Установлено, что штамм P. polymyxa 146' характеризующийся наибольшим выходом ЭПС, более высокими значениям Кинематической вязкости культуральной жидкости и водных растворов ЭПС . оказался более активным в процессах колонизации корней проростков пшениць 4 индукции деформации корневых волосков, а также при формировании биопленок н абиотических поверхностях.

Впервые обнаружена способность ЭПС P. polymyxa вызывать различны морфологические изменения корневых волосков проростков пшеницы, являющиес одним- из наиболее ранних откликов растения на присутствие в окружающей сред бактерий.

Впервые показана перспективность применения твердофазног -иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием антител (Ат) на ЭПС дд количественной оценки колонизации ризобактериями P. polymyxa корней пшениць что может найти применение при тестировании природных изолятов бактерий.

Установлено, что ЭПС P. polymyxa 1465 способны к активации иммунны .клеток. Показано, что данные экзогликаны in vitro стимулируют фагоцита -бактериальных клеток и метаболические процессы в лейкоцитах мышей и человек Показано умеренное стимулирующее влияние исследуемых ЭПС на продукцщ ведущих провоспалительных цитокинов HJI-ip и ФНО-а фагоцитирующим . мононуклеарами человека.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты расширяю представления о составе и свойствах экзогликанов бактерий P. polymyxa, способствую пониманию роли ЭПС в формировании растительно-бактериальных взаимодействий.

Препараты ЭПС штаммов P. polymyxa, полученные в ходе ований, применяются в экспериментальной деятельности сотрудниками тории биохимии, иммунохимии ИБФРМ РАН, а также кафедры биохимии и 1ики СГУ.

Зыявленная биологическая активность ЭПС P. polymyxa 1465 в отношении пых клеток позволяет прогнозировать возможность использования культур Р. ха с целью получения гликополимеров, обладающих иммунотропным ием.

Полученные антитела на ЭПС P. polymyxa могут быть использованы в леских исследованиях при тестировании природных изолятов бактерий данного

Результаты диссертационной работы использованы при подготовке курсовых юмных работ студентами биологического факультета СГУ и в преподавании там биологического и химического факультетов СГУ курсов: «Основы огии» и «Химия и биохимия углеводов». Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Экзополисахариды P. polymyxa 1460, 1465, 92 являются полисахаридами, содержащими глюкозу, маннозу, галактозу, уроновые ы и аминосахариды. ЭПС P. polymyxa 1465 - нерегулярный по структуре, вленный гликополимер, основная цепь которого образована (1—>4)- и (1—>6)-ными остатками гексоз в пиранозной форме.

2. Внеклеточные полисахариды P. polymyxa играют существенную роль в :сах колонизации корней, деформации корневых волосков и при ровании биопленок на абиотических поверхностях.

3. Твердофазный ИФА с использованием антител, полученных на ЭПС Р. >ха, может применяться для количественной оценки колонизации данными истериями корней пшеницы.

4. Экзогликаны ризобактерий P. polymyxa 1465 in vitro стимулируют под бактериальных клеток макрофагами, активируют метаболические :сы в лейкоцитах человека и животных и умеренно воздействуют на щию провоспалительных цитокинов мононуклеарами человека. Апробация работы. Результаты исследований были представлены на ощих научных форумах: 10-ой Пущинской школе-конференции молодых х «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2006 г.); 3-ей и 4-ой згиональных конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия организмов и растений с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2006, 2008 [еждународной школе-конференции молодых ученых «Applied and fundamental s of responses, signaling and developmental process in the root-microbe systems» г-Петербург, Россия, 2007 г.); Международной научной конференции молодых х и студентов «Modern problems of Microbiology and biotechnology» (Одеса, на, 2007 г.); Всероссийской конференции с международным участием »ментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем», гов, Россия, 2007 г.); Международной научной конференции «Современное шие и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, vcb, 2008 г.); отчетной конференции ИБФРМ РАН (Саратов, Россия, 2008 г.);

Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, Россия, 2009 г.); Научно-практической конференции «Biologically active substances: Fundamental and Applied Problems» (Новый Свет, Крым, Украина, 2009 г.); Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения - 2009» (Саратов, Россия, 2009 г.); Н-ом Международном конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, Россия, 2009 г.).

Работа выполнена в лаборатории биохимии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов (ИБФРМ) РАН в соответствии с плановыми темами: «Структуры гликополимеров и их функции в растительно-микробных взаимодействиях» (№ гос. per. 0120.0403358, научный руководитель - зав. лаб. засл. деятель науки РФ, д.б.н. проф. Игнатов В.В.) и «Структурно-функциональные особенности поверхностных гликополимеров ризобактерий» (№ гос. per. 1200712165, научный руководитель - зав. лаб. засл. деятель науки РФ, д.б.н. проф. Игнатов В.В.).

Личный вклад соискателя. Представленные экспериментальные результаты получены лично автором и в совместной работе с сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН и кафедры биохимии и биофизики ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского». Моносахаридный состав ЭПС исследован совместно с сотрудниками лаборатории химии углеводов Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН (г. Москва) и лаборатории физико-химических методов исследования ИБФРМ РАН. Иммунохимические исследования ЭПС выполнены совместно с сотрудниками лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН. Исследования активности экзополисахаридов P. polymyxa в отношении индукции факторов неспецифической резистентности макроорганизма проведены совместно с сотрудниками кафедры биохимии и биофизики СГУ. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 26 работ в отечественных и зарубежных изданиях, из них 2 статьи в журналах из перечня, рекомендованного Высшей аттестационной комиссией Российской Федерации, и восемь статей в сборниках научных трудов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы, содержащего 262 источника, в том числе 169 зарубежных. Работа изложена на 131 странице, содержит 24 рисунка и 9 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

Глава посвящена описанию современного состояния исследований актерий P. polymyxa и механизмов стимулирующего воздействия их на шя. Особое внимание уделено структурно-функциональной характеристике данных бактерий, их важной роли в формировании растительно-микробных яаций и биологической активности в отношении иммунных клеток.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы исследования В работе были использованы штаммы бактерий вида P. polymyxa: 1465 (АТСС 1460 (АТСС 1041), 1459 (АТСС 842), полученные из Чешской коллекции юрганизмов (г. Брно), 88А (ЦМПМ В-4556), полученный из коллекции юрганизмов ИБФРМ РАН, и 92 (VNIISHM 92), выделенный Ю.М. ковской (ВНИИСХМ, г. С.-П., г. Пушкин) из корней пшеницы; а также эии других родов: A. lipoferum 59b (АТСС 29707), полученный из ВКМ (В, Sinorhyzobium meliloti Р-221 (ВКПМ В-9442), выделенный А.Ю. Муратовой РМ РАН, г. Саратов) с поверхности корней тростника южного, Е. coli DH5ct, енный из лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН и Е. coli Са53 ллекции Фридерика музея кафедры микробиологии и физиологии растений

Динамику роста, выход ЭПС и кинематическую вязкость (KB) 0.1 % растворов P. polymyxa определяли при выращивании бактерий в строго идентичных иях в течение 7 суток на жидкой питательной среде с глюкозой или сахарозой ipa с соавт., 1992). В качестве растительного объекта использовали семена й яровой пшеницы Triticum aestivum сорта Саратовская 29 репродукции 2006, гг., полученные из ВНИИСХ Юго-Востока г. Саратова. Семена стерилизовали ращивали в соответствии с рекомендациями, данными в работе (Yegorenkova et Ol).

Для выделения суммарных препаратов ЭПС использовали методику, денную в работе (Пирог с соавт., 1994). После процедуры очистки образцы одили в лиофильно высушенную форму с использованием устройства ШТОР 2К ES VirTis (США). KB культуральной жидкости (КЖ) и растворов определяли на капиллярном вискозиметре Оствальда типа ВПЖ-2 с енним диаметром капилляра 0.73 мм или 0.99 мм, термостатируемом в водяной при 20 °С с точностью ±1 °С. Содержание ЭПС в КЖ определяли весовым методом, количественное жание в препарах ЭПС углеводов — спектрофотометрически по реакции с юм и серной кислотой (Dubois et al., 1956), белка - по модифицированной щке Бредфорд (Скоупс, 1985), уроновых кислот - по методу Дише (Дише, и выражали в процентах к весу условно сухого вещества. Для гель-фильтрации [ьзовали колонки с Sepharose CL-4B, с Sephadex G-50. В качестве элюентов гняли раствор бикарбоната аммония (0.025М, pH 8.3) и пиридин-ацетатный (0.05М, рН4.1). Гель-фильтрацию применяли также для определения

молекулярных масс (Мм) ЭПС. Для этого колонки калибровали по декстранам с • известными Мм. Ионообменную хроматографию (ИОХ) выполняли на колонке с DEAE-Toyopearl 650М. Нейтральные и слабокислые компоненты элюировали буфером Трис-НС1 (0.01 M в 0.01 M NaCl, рН 7.2), кислые компоненты - раствором NaCl в том же буфере при непрерывном градиенте концентрации 0.01 М—1.0 М.

Нейтральные моносахариды, уроновые кислоты и аминосахариды идентифицировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) (Захарова и КоСенко, 1982). Количественное определение нейтральных моносахаридов проводили методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ,) в виде ацетатов полиолов (Слонекер, 1975) на хроматографе Hewlett-Packard 5890 (США) и на хроматографе GC-2010 (Shimadzu, Japan). Метилирование ПС проводили СН31 или CD3J в диметилсульфоксиде в присутствии метилсульфинилметанида (Hakomori, 1964) и анализировали методом ГЖХ - масс-спектрометрии (ГЖХ-МС) на ■ хроматографе Hewlett-Packard 5989А (США). Деградацию по Смиту осуществляли окислением ЭПС 0.1 M НЮ4 (72 ч при 20 °С). Электрофорез препаратов ЭПС в полиакрйламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия (ДСН) выполняли по -методу Хичкок и Браун (Hitchcock and Brown, 1983), визуализацию ЭПС осуществляли окрашиванием гелей красителем на основе азотнокислого серебра . (Tsai and Frasch, 1982). ИК-спектры ЭПС регистрировали на инфракрасном Фурье-спектрометре (Infralum FT-801). Образцы готовили путем прессования таблеток из КВг под давлением 7 т/см2.

Поликлональные Ат получали иммунизацией кроликов препаратом ЭПС Р. pofymyxa 1465, выращенных в присутствии глюкозы, с адъювантом Фрейнда и осаждали из антисывороток сульфатом аммония. Встречную двойную иммунодиффузию препаратов ЭПС с Ат проводили по стандартной методике (Ouchterlony and Nilsson, 1979). Для ИФА в качестве твердой фазы использовали полистироловые 96-ти луночные планшеты. В качестве субстратного реагента использовали орто-фенилдиамин с перекисью водорода. Измерения оптической плотности (А490) анализируемых образцов проводили на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01С (ЗАО ИЛИП, г. Санкт-Петербург, Россия) с последующей обработкой результатов с помощью программы ЛабАРМ (ЗАО ИЛИП, г. Санкт-Петербург, Россия). '

Исследование адсорбции бактерий P. pofymyxa на корнях проростков пшеницы проводили в соответствии с рекомендациями, данными в работе (Yegorenkova et al., 2001). Изучение деформаций корневых волосков пшеницы под действием ЭПС проводили, как описано Конновой с соавторами (1995). Световую микроскопию образцов корней выполняли на поляризационно-интерференционном микроскопе Биолар PI (Польша). Фотографии, видео-записи и их последующую обработку осуществляли с помощью цифровой камеры-окуляра SCOPETEK DCM35 (Китай). Количественное определение способности бактерий формировать биопленки на абиотических поверхностях (стекло, полистирол) проводили по методике, приведенной в работе (Ferrieres and Claxke, 2003). Измерения оптической плотности образцов (планшеты) при Х=570 нм осуществляли на иммуноферментном

заторе АИФ-Ц-01С или при Х=590 им (стеклянные пробирки) на рофотометре Specol 221 (Carl Zeiss, ГДР).

Для оценки биологической активности препаратов ЭПС по отношению к иотическим клеткам были исследованы ЭПС P. pofymyxa 1465 (ЭПС]465)> [енные при выращивании бактерий на средах с глюкозой (ЭПСГл) и сахарозой сах). в качестве препаратов сравнения - коммерческие ЛПС Е. coli 055:В5, 1гиозан, пирогенал и зимозан А. Спленоциты выделяли из селезенок мышей гандартной методике. Пролиферацию спленоцитов оценивали в реакции трансформации, основанной на включении 3Н-меченого тимидина в ДНК юцитов и выражали в импульсах за минуту (имп/мин) (Клаус, 1990). живность продукции N0 спленоцитами определяли методом Грисса по шению в инкубационной среде ионов N02 (Green et al., 1982). гонеальные макрофаги (ПМФ) получали из организма мышей-самцов по принятой методике и моделировали процесс фагоцитоза in vitro, в качестве та фагоцитоза использовали суточную культуру музейного штамма Е. coli из коллекции Фридерика. Активность фагоцитоза определяли через 1,2, 4, 6 и микроскопически и рассчитывали фагоцитарные индексы (ФИ) и индексы шенности фагоцитоза (ИЗФ).

Образование активных форм кислорода (АФК) в клетках крови человека шали методом хемилюминесценции на люминометре LKB-Wallac 1251 няндия), а также при постановке спектрофотометрического варианта теста ановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) на модели мышиных ПМФ. вность миелопероксидазы (МПО) в лизате ПМФ оценивали рофотометрически при 495 нм (Саидов и Пинегин, 1991). Для определения «ости кислой фосфатазы использовали коммерческий набор реактивов (водетва «Biozyme» (Россия). Содержание цитокинов (ИЛ-lß, ФНО-а) [еляли в цельной и разведенной в 10 раз гепаринизированной крови ноферментным методом с тест-системами на основе моноклональных антител шодства ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург).

Статистическую обработку данных всех экспериментов проводили по принятым методикам с использованием t-критерия Стьюдента (Рокицкий, i, а также с использованием пакета Microsoft Office Excell 2003.

Результаты исследований и их обсуждение

Сравнительное исследование продукции внеклеточных полисахаридов

штаммами P. pofymyxa В качестве объектов исследования были выбраны бактериальные штаммы ilymyxa: 1460, 1465 и 92. Это обусловлено тем, что P. pofymyxa 1460 и 1465 зляли высокие адгезивные свойства (Карпунина, 2002), а штамм 92 был лен из корней пшеницы. По литературным данным, для формирования ктивной ассоциации с растениями (Timmuck et al., 2005; Haggag, 2007) и в адгезии ж на различных субстратах (Sharma and Rao, 2003) большое значение имеет »бность бактерий к продукции ЭПС.

Для изучения способности к биосинтезу ЭПС на жидких средах мы провели периодическое культивирование ризобактерий Р. ро1утуха с оценкой динамики накопления биомассы, выхода ЭПС и вязкости КЖ и водных растворов ЭПС. Было показано, что максимальным накоплением ЭПС при культивировании как на глюкозе, так и на сахарозе характеризовался штамм Р. ро1утуха 1465 (рис. 1).

ЭПС, 15 г/л

24 ч 48 ч 72 ч 96 ч 7 сут

Ш 1465 сах Ш1465 гл 092 сах 092 гл Ш460сах И1460гл

Рис. 1. Динамика накопления ЭПС штаммами Р. ро1утуха при 7-и суточном культивировании на средах с глюкозой и сахарозой.

Штамм 1460 продемонстрировал низкий выход ЭПС на протяжении всей ферментации. Образование экзогликанов наблюдалось на всех фазах роста, однако накопление ЭПС отставало от роста культуры, максимум концентрации полимеров приходился на позднюю стационарную фазу роста, что указывает на несбалансированность роста культуры и синтеза ПС. Как показали наши исследования, концентрация ЭПС в среде к концу ферментации практически не снижалась. Таким образом, реутилизации собственного ЭПС бактериями Р. ро1утуха | в данных условиях не происходит. Известно, что источник углерода существенно влияет на синтез ЭПС. Наши исследования показали, что при смене источника углерода наиболее существенно меняются выход ЭПС и собственная вязкость водных растворов выделенных ПС. Так, продукция ПС всеми исследуемыми штаммами'значительно повышалась при выращивании их в присутствии сахарозы (рис. 1). Максимальным накоплением ЭПС (до 12.3 г/л) в данных условиях культивирования характеризовался штамм Р. ро1утуха 1465.

В процессе ферментации изучали кинематическую вязкость КЖ. Вязкость -часто наиболее важный критерий селекции ПС-продуцирующих бактерий. Исследования показали, что значения этого показателя зависели как от I индивидуальных особенностей штаммов, так и от фазы роста культуры. В целом, более высокая КВ была у штамма Р. ро1утуха 1465, после 72 ч роста она составила 8.25 мм2/с. Вязкость КЖ возрастала в процессе культивирования и достигала максимума к 3-4 суткам (для штаммов 1465 и 92), а для штамма 1460 значения КВ в течение ферментации практически не изменялись, оставаясь на уровне контрольных. Смена источника углерода повлияла и на кинематическую вязкость КЖ. Значения этого показателя на сахарозе были несколько более высокими для всех исследуемых нами штаммов, а также зависели как от индивидуальных особенностей штаммов, так

зы роста культуры. Наибольшей вязкостью КЖ характеризовалась а Р. ро1утуха 1465.

1а следующем этапе наших исследований из КЖ на разных этапах ирования (от 24 ч до 7 суток) осаждением ацетоном после отделения клеток выделены суммарные препараты ЭПС и проведено сравнительное вание КВ водных растворов данных ЭПС. Лиофильно высушенные ты ЭПС представляли собой белые волокнистые вещества, легко имые в воде. 0.1 % растворы ЭПС были гомогенными, прозрачными, ись стабильностью в течение нескольких суток. Установлено, что вязкость ов ПС, как и вязкость КЖ, и выход ЭПС, определялась штаммовой лежностью, возрастом культуры и составом среды (рис. 2).

N. 5

г,

мм /с ,

3 2 1 О

01465 гл ■ 1465 сах 092 гл 092 сах М1460гл □ 1460 сах

Кинематическая вязкость 0.1 % водных растворов ЭПС бактерий Р. ро1утуха на сроках культивирования при выращивании на средах с глюкозой и сахарозой. N -ическая вязкость.

:ыпей вязкостью растворов ЭПСГЛ характеризовался штамм Р. ро1утуха 1465, ::ыпей - штамм 1460. Значения собственной вязкости возрастали в течение грментации (для штаммов Р. ро1утуха 1465 и 92). Вязкость растворов ПС Р. ка 1460 практически не изменялась, оставаясь на уровне 1.35 мм2/с. Ранее мы мечали, что при росте культур на сахарозе существенно возрастал выход Однако все исследуемые штаммы в данных условиях характеризовались т значениями КВ водных растворов ПС, которые несущественно изменялись ше всей ферментации.

Таким образом, в результате сравнительного исследования продукции лканов ряда штаммов была установлена способность протестированных : ий к накоплению ЭПС на жидких питательных средах. Основываясь на ;нных результатах и принимая во внимание данные других исследователей, :; утверждать, что условия культивирования Р. ро1утуха существенно влияют : юцесс биосинтеза ЭПС и реологические свойства препаратов ПС, шляющиеся, вероятно, изменениями в составе синтезируемых ЭПС. Данный г необходимо учитывать при планировании и проведении экспериментов учению микробных ЭПС с заданными свойствами. Среди исследованных

Ж 1 1 1 1

1 ж1 Ш Щт

24 ч 48 ч 72 ч 96 ч 7 сут

штаммов выявлен штамм 1465, характеризующийся более высоким выходом ЭПС, наибольшими значениями вязкости КЖ и водных растворов ПС и являющийся, на наш взгляд, перспективным для дальнейшего детального изучения синтезируемых им ЭПС.

Выделение, очистка и исследование химического состава экзополисахаридов бактерий P. polymyxa

Для получения суммарных препаратов ЭПС КЖ после выращивания бактерий на средах с 3 % глюкозы или сахарозы разбавляли в 2-3 раза дистиллированной водой (для снижения вязкости). Клетки отделяли центрифугированием при 15000 об/мин в течение 30 мин, супернатант концентрировали в вакууме (40 °С) до первоначального объема, используя роторный испаритель, после чего ЭПС осаждали тремя объемами ацетона. Выпавший осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин, многократно промывали ацетоном, лиофильно высушивали и анализировали.

Посредством гель-хроматографии на колонке, калиброванной по декстранам, установлено, что препараты ЭПСГЛ исследуемых штаммов представлены смесью ПС с Мм от 7х104 до 2х106 Да, а для штаммов 1465 и 92 установлено значительное доминирование в ЭПС высокомолекулярных фракций (Мм 5><105-2х106 Да). На хромато грамме присутствовали небольшие пики, соответствующие фракциям с Мм 100200 кД и 20-70 кД. Профили элюции имели сходный вид для ЭПС штаммов 1465 и 92. ЭПС P. polymyxa 1460, напротив, характеризовался преобладанием низкомолекулярных фракций. ИОХ препаратов ЭПС выявила их гетерогенность по заряду. Как следует из представленных на рисунке ЗА данных (темная кривая), для штаммов 1465 и 92

490 нм 2

1 М NaCl

490 нм

Рис. 3. Результаты ИОХ на колонке (35x1.5 см) с DEAE-Toyopearl 650М препаратов ЭПС Р. polymyxa 1465 (А), 1460 (Б) при выращивании на средах с сахарозой (светлая кривая) и с глюкозой (темная кривая).

суммарные препараты ЭПСГл состояли из минорной (нейтральной) и основной (кислой) фракций. Профили элюции имели сходный вид для ЭПС штаммов 1465 и 92. ЭПСсах | характеризовался значительным преобладанием нейтральной фракции (светлая кривая),

ггворы ПС, как было показано нами ранее, при этом имели более низкую вязкость в нении с образцами ЭПСГл- Возрастанием в препаратах ЭПС доли нейтральной сции, характеризующейся меньшей Мм и вязкостью, и объяснялось столь гственное снижение KB растворов ЭПССах- В ЭПС)46о практически отсутствовала [ая фракция при культивировании на среде с глюкозой (темная кривая), что отличало шй штамм от других, протестированных нами (рис. ЗБ). И как было показано ранее, чм 1460 характеризовался низким выходом ЭПС и низкой вязкостью растворов I. Данные, полученные в результате электрофоретического разделения ЭПС >дом электрофореза в ПААГ с ДСН, подтвердили их гетерогенную природу, параты ЭПС при выращивании штаммов P. polymyxa на разных источниках углерода ш сходный электрофоретический профиль, характерный для ПС-содержащих {меров. Однако обнаруживались и отличия, которые, очевидно, являлись следствием :ого соотношения в тестируемых ЭПС молекул с определенным размером и трофоретической подвижностью. Таким образом, ЭПС изученных нами штаммов Р. туха представляют комплекс нескольких ПС, что хорошо согласуется с етцимися литературными данными по другим штаммам P. polymyxa (Пирог с г/и., 1985; Ткаченко и Севрюгина, 1989).

Колориметрическими методами установлено, что на долю углеводов в ЭПС ледуемых штаммов P. polymyxa приходилось 72-75 %, белков - 1.6-2.2 % от сы препарата. Методом ГЖХ ацетатов полиолов после полного кислотного ролиза ЭПС 1465 показано преобладание в них Man, Glc, Gal в соотношении сблизительно 2:2.5:1. Методами ТСХ и колориметрического определения ановлено наличие в образцах уроновых кислот в количестве 10-12 % от массы яарата. По данным, полученным с использованием ТСХ и аминокислотного лизатора, в состав исследуемых комплексов входит также галактозамин. Анализ ературных данных, касающихся моносахаридного состава ЭПС Р. polymyxa, юнстрирует существенную его зависимость не только от индивидуальных Ценностей культур, но и от условий культивирования. Подтверждением этого яется отмеченное нами изменение соотношения моносахаридов в ЭПС^саъ орый также как и ЭПСрл содержал в своем составе в качестве основных шонентов остатки Man, Glc, Gal, но в соотношении 1-0:16:1, и незначительное [ичество уроновых кислот. В ЭПС92 преобладали Man, Glc, Gal в соотношении :4:1, были выявлены также галактозамин, следовые количества Fue и уроновые шоты. В ЭПС1460 идентифицированы остатки углеводов Man, Glc, Gal в >тношении ~ 9:13:1, а также следовые количества Fue и Xyl.

ИК-Спектры ЭПС1465, ЭПС92 и ЭПСИ60 обнаружили большое сходство между ой. На ИК-спектрах препаратов присутствовали полосы поглощения, актерные для ПС. Максимумы поглощения свидетельствовали о наличии в [екулах ЭПС гидроксильных групп, групп NH, СН, СН2, С=0, С-О-С, а также как а-, и (J- гликозидных связей. Несмотря на сходство по общему профилю и положению овных характеристических полос, препараты ЭПСрл и ЭПССдх, имели и некоторые пичия, что свидетельствует о специфических особенностях в структуре их ЭПС. Так, тектрах ЭПСГЛ интенсивнее выражены полосы поглощения в области 885-890 см"1,

что может свидетельствовать о преобладании р-гликозидных связей (Жбанков, 1972; Гвоздяк с соавт., 1989). Дня определения характера замещения моносахаридных остатков препараты ЭПСМ65 были исследованы методом ГЖХ-масс-спектрометрии в виде частично метилированных ацетатов полиолов. В результате в реакционной смеси были найдены следующие продукты распада: 4-замещенная Hex, 6-замещенная Hex, 2,4-замещенная Hex, 3,4-замещенная Hex, 2,4,6-замещенная Hex в пиранозной форме. Наличие точек ветвления говорит о нелинейной структуре анализируемого ЭПС. Таким образом, на основании полученных результатов и учитывая данные, полученные методоми 'Н-ЯМР-спектроскопии и распада по Смиту, установлено, что ЭПС1465 является нерегулярным разветвленным гетерогликаном, в основной цепи которого присутствуют (1—>4)- и (1—>6)- связанные остатки гексоз в пиранозной форме.

Иммунохимическое исследование экзополисахаридов P. polymyxa Для оценки степени родства ЭПС1465 с ЭПС других штаммов данного вида мы использовали сравнительный иммунохимический анализ. Иммунизацией кроликов препаратом ЭПС^гл получены Ат. ЭПС1465Гл формировал с Ат две полосы

преципитации (рис. 4 а, б лунка 1), что

свидетельствовало о наличии в его составе двух различных фракций, отличающихся антигенными свойствами.

Проведенный анализ препаратов ЭПС ряда штаммов P. polymyxa выявил взаимодействие полученных Ат с ЭПС штаммов 1459, 1460, 92 и 88А при выращивании последних на глюкозе (рис. 4 а, б лунки 2, 3, 4, 5), при этом перекрестная реакция была отмечена только по одной из двух полос преци-питации, характерных для штамма 1465. Взаиморасположение полос, сформированных различными ЭПС, свидетельствовало о частичной идентичности их антигенных детерминант. В то же время, ЭПССдх не взаимодействовали с Ат. Исключение составлял ЭПС1465сах, формирующий с данными Ат одну слабую полосу преципитации (рис. 46 лунка 6). На основании полученных результатов можно сделать вывод об отсутствии выраженной штаммовой специфичности антигенных детерминант ЭПС в пределах вида Р. polymyxa. Для количественной оценки антигенных свойств ЭПС, выделенных из штаммов P. polymyxa 92, 1460, 1465, 1459 и 88А, выращенных на разных средах, применяли непрямой ИФА. Было установлено, что ЭПС штаммов 1465 и 92 среди сравниваемых препаратов наиболее близки между собой и имеют примерно одинаковое

Рис. 4. Результат сравнительного иммунохимического анализа препаратов ЭПСГЛ P. polymyxa: 1465 (I), 1460 (2), 92 (3), 1459 (4), 88А (5) и ЭПССАХ: 1465 (6), 1460 (7), 92 (8) - с Ат на ЭПС1465гл (Ат).

[чество общих антигенных детерминант в составе кислых фракций гаратов. В то время как с ЭПСмвогл Ат взаимодействовали очень слабо, а значения \ ЭПС1460сах были близки к контрольным, что находилось в хорошем согласии с ученными ранее результатами ИФА (рис. 4). Обобщая полученные результаты, но заключить, что Р. ро1утуха 1465 в периодической культуре продуцирует ЭПС, рогенные по Мм и заряду, при этом условия культивирования влияют на ношение фракций, реологические и антигенные свойства синтезируемых ЭПС.

Оценка способности бактерий Р.ро1утуха к колонизации корней проростков пшеницы и индукции деформаций корневых волосков

Для формирования эффективной растительно-бактериальной ассоциации :деляющее значение имеет способность бактерий к колонизации корней. На (ующем этапе работы мы оценивали колонизирующую способность разных штаммов Ыутуха. Инокулирование корней проростков пшеницы Саратовская 29 клетками ю1утуха 1465 и дальнейшие наблюдения с помощью световой микроскопии 1зали, что данные бактерии активно прикрепляются к корням растения с первых ут контакта. Выявлен неравномерный характер колонизации корневой зрхности: больше бактерий обнаруживалось около кончика корня, в зоне тгации и в местах соединения корневых волосков с поверхностью корня (рис. 5).

При длительном совместном инкубировании Р. ро1утуха формировали на поверхности корня многослойные клеточные скопления, погруженные в слизистый материал. Характер распределения прикрепившихся клеР. ро1утуха 1465 на корнях проростков пшеницы в целом согласуется с данными _ других штаммов Р. ро1утуха (Тштшск е/ а1., 2005; На^а& 2007).

По мнению ряда авторов (Бег^е et а1, 2000; Тшшшк е/ а1., 2005), ЭПС Р. туха играют существенную роль в формировании растительно-микробных лщаций. Для выявления различий Р. ро1утуха в их способности к адсорбции корнях пшеницы мы использовали штаммы Р. ро1утуха 1465 и 1460, существенно ичающиеся по выходу и реологическим свойствам ЭПС. Методом посева ведений гомогената корней на плотные среды установлено, что адсорбция бактерий мма 1465 на корнях достигала через 15 мин инкубации значения 2.8х 105 кл/см корня 1 концентрации клеток в инокуляте 2.5 х 108 кл/мл) и возрастала, составив через 24 ч :10б кл/см корня. При увеличении времени контакта число прикрепившихся клеток 'ественно не изменялось. Количество адсорбированных клеток Р. ро1утуха 1465 в 5 раз

с. 5. Микрофотографии клеток Р. ро1утуха 1465 на корнях пшеницы ратовская 29 (х 720).

превышало таковое для штамма 1460. Следует отметить, что бактерии Р. polymyxa 1465 характеризовались наибольшим выходом ЭПС, более высокими значениями вязкости КЖ и растворов ЭПС, о чем сообщалось ранее. Сравнение динамики прикрепления к корням пшеницы Саратовская 29 бактерий P. polymyxa 1465 и нескольких штаммов Azospirillum показало примерно одинаковую адсорбционную способность со штаммами A. brasilense SR75 и A. brasilense Sp245 на всем протяжении совместной инкубации. Важно отметить, что штамм A. brasilense SR75 был изолирован с корней пшеницы Саратовская 29, а бактерии A. brasilense Sp245 являются инвазивными для пшеницы.

По мнению некоторых исследователей (Baldani et al., 1983; Gaskins and Hubbell, 1979), образование деформаций корневых волосков проростков является одним из наиболее ранних откликов растения на присутствие в окружающей среде | бактерий и может служить количественным показателем отзывчивости растения на инокуляцию. Исследование деформаций корневых волосков под действием препаратов ЭПС ряда штаммов P. polymyxa проводили, применяя слайдовую технику Fahraeus. Обнаружено, что ЭПС P. polymyxa (125 мкг/мл) способны индуцировать различные деформации корневых волосков: разветвления разной длины, ветвления с равными по длине сегментами, изгибы, скручивания и др. (рис. 6). Достоверные эффекты в порядке убывания активности наблюдались для ЭПС штаммов 1465, 92, 88А, 1460 и 1459 (табл. 1).

Рис. 6. Деформации корневых волосков под действием ЭПС Р. ро1утуха (х 360).

Таблица 1

Деформации корневых волосков пшеницы, индуцированные ЭПС Р. ро1утуха

Штаммы P. polymyxa Кол-во деформаций в опытном образце, Д/см (число повторностей)* Кол-во деформаций в контроле, Д/см (число повторностей)* Уровень ! значимости ' Р

1465 26.13 ± 0.84 (92) 3.60 ±0.53 (39) <0.01

92 19.86 ±0.97 (75) 3.52 ±0.55 (48) <0.01

1459 5.26 ±0.56 (70) 2.72 ± 0.63 (28) <0.01

1460 6.82 ±0.76 (61) 1.00 ±0.44 (26) <0.01

88А 7.29 ± 0.77 (72) 2.09 ± 0.63 (28) <0.01

Примечание - * Доверительные интервалы даны для надежности 95 %.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что препараты ЭПС Р. ро!утуха вызывают ответную реакцию растений и, таким образом, могут быть вовлечены во взаимодействие данных бактерий с корнями растений.

Для исследования колонизации корней бактериями хорошую :пективу имеют подходы на основе ИФА. Для бактерий p. Azospirillum была тна высокая эффективность применения ИФА с Ат на ЛПС для оценки :обности азоспирилл к колонизации корней (Широков, 2008). Следующий этап [ей работы состоял в изучении возможности применения твердофазного ИФА ISA) с Ат на 3IICi46j для количественной оценки способности P. polymyxa к онизации корней. Тестируемыми образцами являлись гомогенаты корней :ницы, инокулированных P. polymyxa 1465. В качестве положительного контроля ользовали клетки P. polymyxa 1465, а в качестве отрицательных -нокулированные корни, а также бактерии других родов: A. lipoferum Sp59b, S. lloti P-221 и E. coli DH5ol В предварительных экспериментах была установлена окая специфичность выявления клеток P. polymyxa 1465 с помощью Ат на -1465 по сравнению с клетками бактерий других родов. Для выявления ЭПС-грминант P. polymyxa в составе гомогенатов корней были оптимизированы эвия проведения анализа и разработан соответствующий протокол. На основании /льтатов титрования антигена были выбраны оптимальные разведения проб для

проведения ИФА (рис. 7).

Параллельно проводили высевы разведений гомогенатов корней на агаризованную среду для подсчета КОЕ. Динамика выявления с помощью ИФА специфических бактериальных антигенных ЭПС-детерминант в составе образцов коррелировала с увеличением численности бактерий на корнях по результатам подсчета КОЕ, при этом ИФА позволял проанализировать большое количество образцов без предварительного высева на среды, что существенно сокращало сроки проведения эксперимента. Анализ полученных результатов позволил сделать заключение о

перспективности применения ИФА с Ат на ЭПС для количественной оценки колонизации P. polymyxa корней пшеницы.

Корни+бактерии, 15 мин контакта Корни+бактерии, 3 ч контакта Корни+бактерии, 24 ч контакта Неинокулированн ые корни Контроль (ФБС)

16 32 64 128 256 512 Разведение образцов

1024

7. Результаты ИФА гомогенатов корней ницы, инокулированных Р. ро1утуха 1465, г на ЭПС|4б5гл- В первой лунке содержится мкл антигена (гомогенатов корней трех ■ений в 1 мл ФБС).

Оценка способности к формированию биопленок ряда штаммов Р.ро1утуха, отличающихся по выходу и реологическим свойствам ЭПС Способность Р. ро1утуха к эффективной колонизации и формированию )пленок, по мнению ряда исследователей, имеет определяющее значение в ¡личении сопротивляемости растительного организма биотическим и ютическим стрессам (На§§а§, ТшггшБк, 2008; Типпи^к а а1, 2009).

АетоИЛИ А590

На следующем этапе исследования мы оценивали способность ряда штаммов Р. ро!утуха, к формированию биопленок на абиотических поверхностях. Предварительно осуществляли подбор условий инкубации для формирования биопленок клетками Р. ро1утуха при выращивании на средах с глюкозой или сахарозой. Было показано, что полноценные биопленки на стеклянных (пробирки, чашки Петри) и пластиковых (полистироловые планшеты) поверхностях образуются в статических условиях через 72-96 ч клетками штаммов 1465 и 92. Менее выраженные биопленки формировали Р. ро1утуха 1460. Результаты количественной оценки способности Р. ро1утуха к формированию биопленок, полученные с использованием окрашивания бактерий кристаллическим фиолетовым показали, что способность к закреплению на абиотических поверхностях снижалась в ряду штаммов Р.ро1утуха: 1465, 92, 1460 - как при культивировании на среде с глюкозой,

так и с сахарозой (рис. 8).

Таким образом, в результате проведенных исследований

установлено, что штамм Р. ро1утуха 1465, характеризующийся наибольшим выходом ЭПС, более высокими значениями

кинематической вязкости КЖ и водных растворов ЭПС, оказался более активным в процессах колонизации корней проростков пшеницы, индукции деформаций корневых волосков, а также при формировании биопленок на абиотических поверхностях.

-; Щ —

Ttfl и

1460

Ш полистирол (глюкоза) II стекло (глюкоза)

1465 92

□ полистирол (сахароза); 0 стекло (сахароза)

Рис. 8. Количественное определение способности штаммов Р. ро1утуха 92, 1460, 1465 к формированию биопленок на гидрофильных и гидрофобных поверхностях.

Исследование активности экзополисахаридов P.polymyxa в отношении индукции факторов неспецифической резистентности макроорганизма В настоящее время актуален поиск нетоксичных и доступных биополимеров, обладающих иммунотропным действием. Весьма перспективными в этом отношении являются ПС непатогенных микроорганизмов. Исследованиями ряда ученых показано, что ЭПС ряда штаммов P. polymyxa отличаются выраженной способностью влиять на иммунобиологическую реактивность организма (Jung et al, 2007; Chang et al., 2009; 2010).

В этой связи, заключительный этап нашей работы посвящен исследованию активности ЭПС1465, синтезируемых на средах с глюкозой и сахарозой, в отношении индукции факторов неспецифической резистентности макроорганизма. Установлено, что внесение ЭПС1465 в концентрации 1 мкг/мл в культуру перитонеальных макрофагов перед началом фагоцитоза приводило к увеличению количества активированных макрофагов. ФИ на всех этапах фагоцитоза Е. coli Са53 были выше по сравнению с контролем на 17-30 %, однако ИЗФ имели

щтельные значения при добавлении к макрофагам ЭПС 1455 в отличие от юля и продигиозана. ЭПС в интервале доз 0.01-10 мкг/мл не оказывали /лирующего влияния на продукцию АФК перитонеальными макрофагами, было 1ено ингибирующее действие ЭПССах на образование АФК при всех дозах ерно на 15-24 %, что может свидетельствовать об антиоксидантных свойствах :дуемых ПС. В то же время ЭПСГл незначительно активировал опероксидазу, обеспечивающую альтернативный механизм эродзависимого киллинга. Показано, что ЭПС1465 активировали кислую 1атазу на уровне продигиозана, в большей степени - ЭПСГЛ (в 1.8-2.0 раза по гению с контролем).

Установлена умеренная стимуляция ЭПС Р. ро1утуха продукции основных провоспали-тельных цитокинов ИЛ-10 и ФНО-а. ЭПСГЛ стимулировал продукцию ИЛ-1Р с 1 ч процесса фагоцитоза, концентрация Ш1-1р возрастала до 6 ч, а затем к 24 ч снижалась до уровня контрольных значений (рис. 9). В присутствии ЭПСсдх, напротив, содержание ИЛ-1 р начинало увеличиваться с 4 ч, с 6 ч существенно превышало контроль, а к 24 ч было максимальным. Индукцию синтеза ФНО-а на фоне действия ЭПС^ подали только на завершающих стадиях фагоцитоза, так к 24 ч содержание )-а в присутствии ЭПССах превышало в 10 раз контроль, составив 30 пг/мл.

Было показано, что стимуляция пролиферации спленоцитов препаратами -1465 была незначительной и не носила концентрационно-зависимого характера, 1ко значения в вариантах с ЭПС достоверно отличались от контрольных, симальное усиление синтеза ДНК в клетках (в 1.9 раз по сравнению с гролем) отмечалось для ЭПСсдх в концентрации 0.1 мкг/мл.

Полученные нами результаты достоверно свидетельствуют о том, что гараты ЭПС 1465 оказывают стимулирующее действие на неспецифический унитет, что открывает перспективу их дальнейшего изучения с целью )аботки на их основе препаратов, обладающих иммунотропным действием.

время, ч

энтроль Q ЭПС 1465гл Е ЭПС I465cax Я продигиозан j

:. 9. Индукция образования ИЛ-lß юнуклеарами периферической крови под действием 1 мкг/мл ЭПС Р. polymyxa 1465 в 1амике процесса фагоцитоза Е. coli Ca 53.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе данной работы установлено, что ЭПС, продуцируемые ризобактериями ро1утуха 1460, 1465, 92 в периодической культуре, являются ¡рополисахаридами, при этом условия культивирования существенно влияли на [•ношение фракций, реологические и антигенные свойства синтезируемых ЭПС. огликаны протестированных штаммов содержали преимущественно глюкозу,

маннозу, галактозу в разных соотношениях, для бактерий P. polymyxa 1465 и 92 установлено наличие уроновых кислот и аминосахаридов.

Показано, что P. polymyxa способны в большом количестве прикрепляться к корням пшеницы, а их ЭПС вызывать с разной интенсивностью многочисленные морфологические изменения корневых волосков. На основании того, что штамм .1465, характеризующийся наибольшим выходом ЭПС, более высокими значениями вязкости культуральной жидкости и водных растворов ЭПС, оказался более активным в процессах колонизации корней проростков - пшеницы, индукции деформации корневых волосков, а также при образовании биопленок, мы предполагаем, что ЭПС P. polymyxa вовлечены в процесс формирования растительно-микробных ассоциаций.

На изолированный препарат ЭПС1465, представляющий нерегулярный, разветвленный гетерогликан, имеющий (1—>4)- и (1—>6) структуру, получены поликлональные кроличьи Ат, с использованием которых обнаружено отсутствие выраженной штаммовой специфичности антигенных детерминант ЭПС в пределах вида P. polymyxa. Проведенные нами исследования позволили сделать заключение о перспективности применения твердофазного ИФА с использованием полученых Ат для количественной оценки колонизации бактериями P. polymyxa корней пшеницы.

Поскольку для ряда штаммов P. polymyxa показано, что синтезируемые ими экзогликаны являются активными стимуляторами защитных сил организма, мы исследовали активность ЭПС]465 (как наиболее перспективных среди исследованных нами) в отношении иммунных клеток. Показано, что данные ЭПС in vitro стимулируют фагоцитоз бактериальных клеток, активируют метаболические процессы в лейкоцитах человека и животных и умеренно воздействуют на продукцию основных провоспалительных цитокинов (ИЛ-1(3 и ФНО-а) мононуклеарами человека, что позволяет сделать предположение о возможности их использования в качестве иммуномодулирующих препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Проведено сравнительное исследование продукции и состава экзогликанов штаммов P. polymyxa 1460, 1465 и 92. Установлено, что выход экзополисахаридов, кинематическая вязкость культуральной жидкости и водных растворов полисахаридов определялись штаммовой принадлежностью, возрастом культуры и источником углерода. Обнаружено преобладание в препаратах ЭПСгл штаммов 1465 и 92 кислого компонента, что коррелировало с более высокой вязкостью растворов ЭПС. Среди исследованных выявлен штамм 1465, характеризующийся более высоким выходом ЭПС, наибольшими значениями вязкости среды и водных растворов полисахаридов.

использованием поликлональных антител на ЭПС1465 обнаружено утствие выраженной штаммовой специфичности антигенных детерминант ЭПС в делах вида P. polymyxa.

3. Показана более высокая адсорбционная способность штамма 1465 по внению со штаммом 1460 на всем протяжении совместной инкубации с корнями гницы. Продемонстрирована перспективность применения твердофазного луноферментного анализа с использованием поликлональных антител на лированный препарат ЭПС1465, для количественной оценки колонизации териями P. polymyxa корней.

4. Отмечена способность протестированных штаммов P. polymyxa к жированию биопленок на абиотических поверхностях. Способность к реплению на гидрофобной и гидрофильной поверхности снижалась в ряду immob P. polymyxa: 1465, 92, 1460, что, вероятно, определялось выходом и •логическими свойствами синтезируемых ими ЭПС.

5. Впервые обнаружена активность изолированных препаратов ЭПС Р. утуха в индукции различных морфологических изменений корневых волосков )ростков пшеницы, являющихся одним из наиболее ранних откликов растения на 1сутствие в окружающей среде бактерий. Наибольший эффект вызывали шсахариды штаммов 1465 и 92.

6. Установлено, что ЭПС P. polymyxa 1465 in vitro стимулировали процесс гоцитоза эшерихий макрофагами, не оказывали стимулирующего влияния на эдукцию активных форм кислорода лейкоцитами, в то же время ЭПСгл (начительно активировал миелопероксидазу. Показано, что ЭПС активировали :лую фосфатазу, в большей степени - ЭПСгл (в 1.8-2.0 раза), преимущественно мулировали образование ИЛ-lp и незначительно ФНО-а на завершающих цщях фагоцитоза.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

♦-публикация в изданиях из перечня ВАК

1. Трегубова К.В., Егоренкова И.В., Игнатов В.В. Образование экзогликанов ггериями Paenibacillus polymyxa на разных углеводных субстратах // Биология - наука XXI ;а: сборник тезисов / 10-я Пущинская школа конференция молодых ученых, Пущино, 17-21 )еля 2006. - Пущино, 2006. - С. 215-216.

2. Егоренкова И.В., Трегубова К.В., Игнатов В.В. Образование внеклеточных иисахаридов некоторыми штаммами Paenibacillus polymyxa И Микробные биотехнологии: )рник тезисов / Международная научная конференция, Одесса, 11-15 сентября 2006. -есса, 2006. - С. 55.

3. Егоренкова И.В., Трегубова К.В., Игнатов В.В. Характеристика экзогликанов чвенных ризобактерий Paenibacillus polymyxa 1465 // Стратегия взаимодействия кроорганизмов и растений с окружающей средой: сборник тезисов / 3-я Региональная :ола-конференция молодых ученых, Саратов, 10-12 октября 2006. - Саратов: Научная книга, 06.-С. 26.

4. Трегубова К.В., Егоренкова И.В., Игнатов В.В. Исследование внеклеточных лисахаридов, продуцируемых ризобакгериями Paenibacillus polymyxa II IX молодежная учная школа-конференция по органической химии: тезисы докладов / Всероссийская нференция, Москва, 11-15 декабря 2006. - Москва, 2006. - С. 74.

5. Tregubova K.V., Yegorenkova I.V., Ignatov V.V. Characterization of the extracellular 'vsaccharides of the rhizobacterium Paenibacillus polymyxa 1465 // Modern Problems of

Microbiology and Biotechnology / The young scientists' and students' international scientific conference, Odesa, 28-31 May 2007. - Odesa, 2007. - P. 22.

6. Tregubova K.V., Yegorenkova I.V., Ignatov V.V. Study of the exopolysaccharides produced by the rhizobacterium Paenibacillus polymyxa // The Third Baltic Sea Region Symposium and Postgraduate Course on Agro-Biotechnology Focused on Root-Microbe Systems, St. Petersburg, June 25-July 2,2007. - St. Petersburg, 2007. - P. 50.

7. Егоренкова И.В., Трегубова K.B., Игнатов B.B. Внеклеточные полисахариды ассоциативных бактерий Paenibacillus polymyxa: образование, химический состав, свойства // Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем / Всероссийская конференция с международным участием, Саратов, 25-27 сентября 2007. -Саратов, 2007. - С. 53.

8. Егоренкова И.В., Трегубова К.В., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Игнатов В.В. Состав и иммунохимическая характеристика экзополисахаридов ризобактерий Paenibacillus polymyxa 1465 // Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем / Всероссийская конференция с международным участием, Саратов, 25-27 сентября 2007-Саратов, 2007. - С. 61.

9. Трегубова К.В., Егоренкова И.В., Игнатов В.В. Индуцирование деформаций корневых волосков пшеницы экзогликанами ризобактерий Paenibacillus polymyxa // Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем / Всероссийская конференция с международным участием, Саратов, 25-27 сентября 2007. -Саратов, 2007. - С. 68.

10. Егоренкова И.В., Трегубова К.В., Игнатов В.В. Бактерии Paenibacillus polymyxa 1465 как продуценты высокомолекулярных экзополисахаридов // Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений / II Международная научная конференция, Казахстан, 10-13 октября 2007. - Алматы, 2007.- С. 65.

И. Трегубова К.В., Егоренкова И.В., Игнатов В.В. Экзополисахариды почвенных бактерий Paenibacillus polymyxa: состав и свойства // Биология - наука XXI века / 11-ая Международная Путинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007. - Пущино, 2007. - С. 48-49.

12. Егоренкова И.В., Трегубова К.В., Игнатов В.В. Особенности состава и свойства экзогликанов ризобактерий Paenibacillus polymyxa // Микроорганизмы и биосфера / Международная научная конференция, Москва, 19-20 ноября 2007 - Москва, 2007 - С. 44.

13. Трегубова К.В., Егоренкова И.В., Игнатов В.В. Внеклеточные полисахариды Paenibacillus polymyxa и их роль в растительно-бактериальных взаимодействиях // Актуальные аспекты современной микробиологии / III Международная молодежная школа-конференция, Москва, 22 - 23 ноября 2007. - Москва, 2007. - С. 116.

14. Егоренкова И.В., Трегубова К.В., Игнатов В.В. Экзополисахариды ассоциативных бактерий Paenibacillus polymyxa: физико-химические и биологические свойства // Проблемы биоэкологии и пути их решения (II Ржавитинские чтения) / Международная научная конференция, Саранск, 15-18 мая 2008 г. - Саранск, 2008. - С. 367369.

15. Трегубова К.В., Егоренкова И.В., Игнатов В.В. Ризобактерии Paenibacillus polymyxa и синтезируемые ими экзогликаны в процессах взаимодействия с растениями // Проблемы биоэкологии и пути их решения (II Ржавитинские чтения) / Международная научная конференция, Саранск, 15-18 мая 2008 г. - Саранск, 2008. - С. 463-464.

16. Егоренкова И.В., Трегубова КВ., Фомина A.A., Коннова С.А., Игнатов В.В. Образование, физико-химические характеристики и биологические свойства экзополисахаридов бактерий Paenibacillus polymyxa // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии / VI Международная конференция. Минск, 2-6 июня 2008. - Минск: Изд-во Логвинова, 2008. - Т. 1. - С. 321-323.

17. Трегубова К.В., Егоренкова И.В., Игнатов В.В. Взаимодействие продуцирующих высокомолекулярные ЭПС бактерий Paenibacillus polymyxa с корнями проростков пшеницы: адсорбция, деформации корневых волосков // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой / 4-я Региональная школа-конференция молодых ученых, Саратов, 14-16 октября 2008. - Саратов, 2008. - С. 53.

18. Егоренкова И.В., Трегубова К.В., Фомина A.A., Коннова СЛ., Игнатов . Биологическая активность экзогликанов ризобактерий Paenibacillus polymyxa 1465 в эшении корней растений и клеток теплокровных // Стратегия взаимодействия роорганизмов и растений с окружающей средой / 4-я Региональная школа-конференция одых ученых, Саратов, 14-16 октября 2008. - Саратов, 2008. - С. 67.

19. *Егоренкова И.В., Трегубова К.В., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Игнатов В.В. тав и иммунохимическая характеристика экзополисахаридов ризобактерий Paenibacillus туха 1465 //Микробиология. - 2008. - Т. 77, № 5. - С. 623-629.

20. Трегубова К.В., Егоренкова И.В., Игнатов В.В. Исследование состава (полисахаридов бактерий Paenibacillus polymyxa и их роли в формировании растительно-робных ассоциаций // Симбиоз Россия 2009 / II Всероссийский, с междунар. участием, гресс студентов и аспирантов, Пермь, 25-29 мая 2009. - Пермь, 2009. - С. 79-80.

21. Yegorenkova I.V., Fomina A.A., Tregubova K.V., Konnova S.A., Ignatov V.V. sical-chemical properties and biological activity of the exopolysaccharides of the rhizobacterium nibacillus polymyxa 1465 // Scientific Conference Biologically active substances: Fundamental Applied Problems. AR Crimea, Ukraine, May 25-30, 2009. - Киев, 2009. - P. 267-268.

22. Егоренкова И.В., Трегубова K.B., Игнатов В.В. Внеклеточные полисахариды в цессах взаимодействия азотфиксирующих ризобактерий Paenibacillus polymyxa с корнями :ницы // Вавиловские чтения - 2009 / Международная научно-практическая конференция, атов, 25-26 ноября 2009. - Саратов: Изд-во СГАУ, 2009. - С. 132-133.

23. Фомина A.A., Суркина А.К., Трегубова К.В. Бактериальные гликополимеры как :пективные модуляторы первичных иммунных реакций человека и животных // российская молодежная выставка-конкурс прикладных исследований, изобретений и оваций. Сборник материалов.- Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2009. - С. 86.

24. Егоренкова И.В., Трегубова К.В., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Игнатов В.В. онизация корней пшеницы бактериями Paenibacillus polymyxa 1465 - продуцентами окомолекулярных экзогликанов // Бюллетень МОИП. Отдел Биологический. - 2009. - Т. , вып. 2, прил. 1. - С. 46-47.

25. Трегубова К.В., Егоренкова И.В., Игнатов В.В. Формирование биопленок эбактериями Paenibacillus polymyxa - продуцентами внеклеточных полисахаридов // шетень МОИП. Отдел Биологический. - 2009. - Т. 114, вып. 3, прил. 1, ч. 3. - С. 232-234.

26. *Irina V. Yegorenkova, Kristina V. Tregubova, Larisa Yu. Matora, Gennady L. ygin, Vladimir V. Ignatov. Use of ELISA with Antiexopolysaccharide Antibodies to Evaluate îat-Root Colonization by the Rhizobacterium Paenibacillus polymyxa // Current Microbiology. -5.-V. 61, №5.-P. 376-380.

Подписано в печать 20.10.2010.

Отпечатано с готового оригинал - макета в ИБФРМ РАН 410049, Саратов, просп. Энтузиастов, 13

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Трегубова, Кристина Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Почвенные азотфиксирующие бактерии вида РаетЪасШт ро1утуха

1.1.1 Морфологические и физиологические особенности бактерий

1.1.2 Практическое использование бактерий Р. ро1утуха

1.1.3 Механизмы стимулирующего воздействия на растения

1.2 Основные этапы растительно-бактериального взаимодействия

1.2.1 Прикрепление бактерий Р. ро1утуха к корням растений

1.2.2 Образование биопленок

1.2.3 Деформации корневых волосков

1.3 Экзополисахариды ризобактерий Р. ро1утуха

1.3.1 Физико-химическая характеристика и свойства экзогликанов бактерий Р. ро1утуха

1.3.2 Практическое использование микробных полисахаридов

1.3.3 Иммунотропные свойства ЭПС

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования

2.2 Приборы и материалы

2.3 Методы выделения и исследования химического состава экзополисахаридов

2.3.1 Выделение экзополисахаридов Р. ро1утуха

2.3.2 Определение кинематической вязкости

2.3.3 Хроматографические методы

2.3.4 Колориметрическое определение состава углеводсодержащих полимеров

2.3.5 Электрофорез в полиакриламидном геле

2.3.6 ИК-спектроскопический анализ

2.3.7 Распад по Смиту

2.4 Методы исследования деформаций корневых волосков и способности Р. ро1утуха к колонизации корней и формированию биопленок

2.5 Иммунохимические методы исследования

2.5.1 Иммунизация животных и получение поликлональных кроличьих антител

2.5.2 Реакция агглютинации

2.5.3 Встречная двойная иммунодиффузия

2.5.4 Иммуноферментный анализ (ELISA) 47 2.6 Методы исследования иммуномодулирующего действия экзополисахаридов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Сравнительное исследование продукции внеклеточных полисахаридов штаммами Р. polymyxa

3.2 Выделение, очистка и исследование химического состава экзополисахаридов бактерий Р. polymyxa

3.3 Иммунохимическое исследование экзополисахаридов Р. polymyxa

3.4 Оценка способности бактерий Р. polymyxa к колонизации корней проростков пшеницы

3.4.1 Наблюдение колонизации корней пшеницы посредством световой микроскопии

3.4.2 Различия бактерий Р. polymyxa в способности к адсорбции на корнях и индукции деформаций корневых волосков

3.4.3 Количественная оценка колонизации Р. polymyxa 1465 корней пшеницы методом иммуноферментного анализа (ELISA)

3.5 Оценка способности к формированию биопленок ряда штаммов

Р. polymyxa, отличающихся по выходу и реологическим свойствам ЭПС

3.6 Исследование активности экзополисахаридов Р. polymyxa в отношении индукции факторов неспецифической резистентности макроорганизма

Введение Диссертация по биологии, на тему "Состав, биологическая активность и роль экзогликанов бактерий Paenibacillus polymyxa во взаимодействиях с растениями"

Актуальность проблемы. Почвенные азотфиксирующие ризобактерии Paenibacillus polymyxa стимулируют рост и развитие широкого круга растений благодаря формированию эффективных ассоциативных отношений. Это связано со способностью этих микроорганизмов к азотфиксации, фосфатмобилизации, продукции фитогормонов, антибиотиков (Mannanov and Sattarova, 2001), широкого спектра литических ферментов, высокой адаптивностью к условиям существования, а также частым обнаружением их в ризосфере злаков (Lebuhn et al., 1997, da Mota et al, 2002; Lal and Tabacchioni, 2009). Опытным путем доказано, что P. polymyxa, находясь в ассоциации с растениями, могут увеличивать сопротивляемость растительного организма биотическим и абиотическим стрессам (McSpadden, 2004; Selim et al, 2005; Timmusk et al., 2005). Ряд исследователей выдвигает на первый план в данных процессах способность Р. polymyxa к эффективной колонизации и формированию биопленок (Haggag and Timmusk 2008; Timmusk et al., 2009). Показано, что некоторые штаммы не только колонизируют корневую поверхность (Bent et al., 2002), но и проникают внутрь корневых тканей (Shishido et al., 1999).

Бактерии P. polymyxa известны как активные продуценты кислых и нейтральных экзополисахаридов (ЭПС) (Пирог с соавт., 1985; Матора с соавт., 1992; Hebbar et al., 1992; Lee et al, 1997; Jung et al., 2007), обладающих рядом уникальных свойств, что объясняет разнообразие сфер возможного применения данных полимеров. Наряду с этим, экзогликанам Р. polymyxa отводится важная роль в формировании растительно-микробных ассоциаций (Hebbar et al, 1992; Bezzate et al, 2000; Timmusk et al, 2005; Haggag, 2007). P. polymyxa широко используются как основные компоненты комплексных бактериальных удобрений, что приводит к обогащению окружающей среды выделяемыми полисахаридами (ПС), эффект действия которых на организм человека и животных до сих пор не вполне ясен.

Поверхностная локализация внеклеточных полисахаридов (ВПС) придает им свойства посредников во взаимодействии Р. polymyxa с другими микро- и макроорганизмами. Кроме того, образуя на поверхности бактерий плотный слой, ЭПС могут экранировать расположенные под ними другие клеточные структуры и определять иммунологические свойства бактерий (Васильев с соавт., 1984). Исследованиями ряда ученых (Ермольева и Вайсберг, 1976; Розе с соавт., 1990; Jung et al, 2007; Chang et al, 2009; 2010) показано, что ЭПС P. polymyxa представляют собой биологически активные вещества, обладающие иммунотропным действием.

Несмотря на интенсивные исследования данных бактериальных полисахаридов и значительные успехи в выяснении их физиологической роли, остаются до конца не выясненными свойства и химическая структура большого спектра ЭПС. Всестороннее изучение данных биополимеров позволит выявить функциональные связи между строением экзогликанов и их биологической ролью, что может способствовать более полному и глубокому пониманию молекулярных основ межклеточных, межвидовых и межорганизменных взаимодействий. Это свидетельствует о несомненной актуальности работ, направленных на изучение внеклеточных полисахаридов бактерий вида Р. ро1утуха.

В этой связи, цель данной работы состояла в выявлении особенностей состава и свойств экзогликанов ряда штаммов Р. ро1утуха и оценке их роли во взаимодействии с корнями пшеницы.

Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Провести сравнительное исследование продукции внеклеточных полисахаридов рядом штаммов Р. ро1утуха.

2. Выделить суммарные препараты ЭПС бактерий Р. ро1утуха и провести анализ их химического состава.

3. Провести качественную и количественную оценку способности бактерий Р. ро1утуха к колонизации корней проростков пшеницы.

4. Оценить способность к формированию биопленок ряда штаммов Р. ро1утуха, отличающихся по выходу и реологическим свойствам ЭПС.

5. Исследовать активность препаратов ЭПС Р. ро1утуха в отношении эукариотических клеток: растительных, иммунной системы животных и цельной крови человека.

Научная новизна работы.

Установлено, что штамм Р. ро1утуха 1465, характеризующийся наибольшим выходом ЭПС, более высокими значениями кинематической вязкости культуральной жидкости и водных растворов ЭПС, оказался более активным в процессах колонизации корней проростков пшеницы, индукции деформации корневых волосков, а также при формировании биопленок на абиотических поверхностях.

Впервые обнаружена способность ЭПС Р. ро1утуха вызывать различные морфологические изменения корневых волосков проростков пшеницы, являющиеся одним из наиболее ранних откликов растения на присутствие в окружающей среде бактерий.

Впервые показана перспективность применения твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием антител на ЭПС для количественной оценки колонизации ризобактериями Р. ро1утуха корней пшеницы, что может найти применение при тестировании природных изолятов бактерий.

Установлено, что ЭПС P. polymyxa 1465 способны к активации иммунных клеток. Показано, что данные экзогликаны in vitro стимулируют фагоцитоз бактериальных клеток и метаболические процессы в лейкоцитах мышей и человека. Показано умеренное стимулирующее влияние исследуемых ЭПС на продукцию ведущих провоспалительных цитокинов ИЛ-10 и ФНО-а фагоцитирующими мононуклеарами человека.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты расширяют представления о составе и свойствах экзогликанов бактерий P. polymyxa, способствуют пониманию роли ЭПС в формировании растительно-бактериальных взаимодействий.

Препараты ЭПС штаммов P. polymyxa, полученные в ходе исследований, применяются в экспериментальной деятельности сотрудниками лаборатории биохимии, иммунохимии ИБФРМ РАН, а также кафедры биохимии и биофизики СГУ.

Выявленная биологическая активность ЭПС P. polymyxa 1465 в отношении иммунных клеток позволяет прогнозировать возможность использования культур P. polymyxa с целью получения гликополимеров, обладающих иммунотропным действием.

Полученные антитела на ЭПС P. polymyxa могут быть использованы в экологических исследованиях при тестировании природных изолятов бактерий данного вида

Результаты диссертационной работы использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами биологического факультета СГУ и в преподавании студентам биологического и химического факультетов СГУ курсов: «Основы гликологии» и «Химия и биохимия углеводов».

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Экзополисахариды P. polymyxa 1460, 1465, 92 являются гетерополисахаридами, содержащими глюкозу, маннозу, галактозу, уроновые кислоты и аминосахариды. ЭПС P. polymyxa 1465 - нерегулярный по структуре, разветвленный гликополимер, основная цепь которого образована (1—>4)- и (1—>6)-связанными остатками гексоз в пиранозной форме.

2. Внеклеточные полисахариды P. polymyxa играют существенную роль в процессах колонизации корней, деформации корневых волосков и при формировании биопленок на абиотических поверхностях.

3. Твердофазный ИФА с использованием антител, полученных на ЭПС Р. polymyxa, может применяться для количественной оценки колонизации данными ризобактериями корней пшеницы.

4. Экзогликаны ризобактерий P. polymyxa 1465 in vitro стимулируют фагоцитоз бактериальных клеток, активируют метаболические процессы в лейкоцитах человека и животных и умеренно воздействуют на продукцию провоспалительных цитокинов мононуклеарами человека.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на следующих научных форумах: 10-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2006 г.); 3-ей и 4-ой Межрегиональных конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2006, 2008 гг.); Международной школе-конференции молодых ученых «Applied and fundamental aspects of responses, signaling and developmental process in the root-microbe systems» (Санкт-Петербург, Россия, 2007 г.); Международной научной конференции молодых ученых и студентов «Modern problems of Microbiology and biotechnology» (Одеса, Украина, 2007 г.); Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования сим биотических систем», (Саратов, Россия, 2007 г.); Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, Беларусь, 2008 г.); отчетной конференции ИБФРМ РАН (Саратов, Россия, 2008 г.); Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, Россия, 2009 г.); Научно-практической конференции «Biologically active substances: Fundamental and Applied Problems» (Новый Свет, Крым, Украина, 2009 г.); Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения - 2009» (Саратов, Россия, 2009 г.); Ii-ом Международном конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, Россия, 2009 г.).

ЭПС исследован совместно с сотрудниками лаборатории химии углеводов Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН (г. Москва) и лаборатории физико-химических методов исследования ИБФРМ РАН. Иммунохимические исследования ЭПС выполнены совместно с сотрудниками лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН. Исследования активности экзополисахаридов Р. ро1утуха в отношении индукции факторов неспецифической резистентности макроорганизма проведены совместно с сотрудниками кафедры биохимии и биофизики СГУ. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Трегубова, Кристина Владимировна

выводы

2. Показано, что ЭПС протестированных штаммов являются гетерогенными по молекулярной массе и заряду полисахаридами, в состав которых входят манноза, глюкоза, галактоза, уроновые кислоты и аминосахариды. ЭПС^ является нерегулярным по структуре, разветвленным гетерогликаном, основная цепь которого образована (1—>4)- и (1—>6)- связанными остатками гексоз. С использованием поликлональных антител на ЭПС1465 обнаружено отсутствие выраженной штаммовой специфичности антигенных детерминант ЭПС в пределах вида P. polymyxa.

3. Показана более высокая адсорбционная способность штамма 1465 по сравнению со штаммом 1460 на всем протяжении совместной инкубации с корнями пшеницы. Продемонстрирована перспективность применения твердофазного иммуноферментного анализа с использованием поликлональных антител на изолированный препарат ЭПС1465, для количественной оценки колонизации бактериями P. polymyxa корней.

4. Отмечена способность протестированных штаммов P. polymyxa к формированию биопленок на абиотических поверхностях. Способность к закреплению на гидрофобной и гидрофильной поверхности снижалась в ряду штаммов P. polymyxa: 1465, 92, 1460, что, вероятно, определялось выходом и реологическими свойствами синтезируемых ими ЭПС.

5. Впервые обнаружена активность изолированных препаратов ЭПС Р. polymyxa в индукции различных морфологических изменений корневых волосков проростков пшеницы, являющихся одним из наиболее ранних откликов растения на присутствие в окружающей среде бактерий. Наибольший эффект вызывали полисахариды штаммов 1465 и 92.

6. Установлено, что ЭПС P. polymyxa 1465 in vitro стимулировали процесс фагоцитоза эшерихий макрофагами, не оказывали стимулирующего влияния на продукцию активных форм кислорода лейкоцитами, в то же время ЭПСгл незначительно активировал миелопероксидазу. Показано, что ЭПС активировали кислую фосфатазу, в большей степени - ЭПСгл (в 1.8-2.0 раза), преимущественно стимулировали образование ИЛ-10 и незначительно ФНО-а на завершающих стадиях фагоцитоза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Почвенные азотфиксирующие бактерии Р. polymyxa стимулируют рост и развитие широкого круга растений и известны как активные продуценты экзополисахаридов. Они разнообразны по структуре и физико-химическим свойствам и в большинстве своем малотоксичны или нетоксичны. Показано, что ЭПС Р. polymyxa представляют собой биологически активные вещества, обладающие иммунотропным действием (Ермольева и Вайсберг, 1976; Розе с соавт., 1990; Jung et al., 2007). В том числе, по мнению ряда авторов (Timmuck et al., 2005; Hebbar et al., 1992; Bezzate et al, 2000; Haggag, 2007), внеклеточные полисахариды Р. polymyxa играют существенную роль в формировании растительно-микробных ассоциаций. В этой связи нам представлялось целесообразным исследовать некоторые физико-химические и биологические свойства изолированных препаратов ЭПС ряда штаммов Р. polymyxa.

В ходе данной работы в соответствии с поставленной целью были оценены различные факторы, влияющие на выход ЭПС и его свойства. Установлено, что продукция ЭПС, кинематическая вязкость культуральной жидкости и собственная вязкость растворов ЭПС определялись пггаммовой принадлежностью, возрастом культуры и природой используемого источника углерода. В результате сравнительного исследования бактерий Р. polymyxa 1465, 1460 и 92 по продукции ЭПС показано, что штамм 1465 характеризовался наибольшим выходом ЭПС (до 4 и 12 г/л на глюкозе и сахарозе соответственно), более высокими значениями вязкости КЖ и водных растворов ЭПС. Вязкость 0.1 % растворов ЭПСГл в среднем составила 4.5 мм2/с, у

ЭПСслх "" 1-4 мм /с. Продукция экзогликанов бактериями Р. polymyxa 1460 была в среднем в 3 раза меньше как на среде с глюкозой, так и с сахарозой, а собственная вязкость 0.1 % растворов ЭПС находилась на уровне контрольных значений в течение

2 1 всей ферментации и составляла около 1.3 мм /с.

Для построения обоснованных выводов относительно функций конкретных гликополимеров необходимо накопление данных о химической структуре этих важных макромолекул. В связи с этим следующий этап нашей работы был посвящен выделению, очистке и изучению состава экзогликанов ряда штаммов Р. polymyxa различными физико-химическими методами. Суммарные препараты ЭПС Р. polymyxa штаммов 1465, 1460 и 92 были проанализированы методами гель- и ионообменной хроматографии, электрофореза в ПААГ, ИК-спектроскопии, ГЖХ, а также колориметрическими методами. Обобщая полученные результаты, можно заключить, что данные бактерии в периодической культуре продуцируют ЭПС, гетерогенные по молекулярной массе (7><104-2х106 Да) и заряду, при этом условия культивирования влияют на соотношение фракций и реологические свойства синтезируемых ЭПС. Содержание углеводов в суммарных препаратах ЭПС достигало 72-75 %, белка 1.62.2 %. Выявлено значительное доминирование в ЭПС штаммов 1465 и 92 высокомолекулярных кислых фракций при культивировании на среде с глюкозой, причем водные растворы таких ЭПС имели более высокую вязкость. Результаты ИК-спекгроскопии ЭПС, синтезируемых на средах с глюкозой и сахарозой, указывали на сходство химического состава препаратов, однако были обнаружены и отличия. Максимумы поглощения на ИК-спектрах свидетельствовали о наличии в молекулах ЭПС гидроксильных групп, групп N11, СН, СН2, С=0, С-О-С, а также как а-, так и Р-гликозидных связей. В анализируемых экзогликанах преобладали манноза, глюкоза и галактоза, в разном соотношении, а также идентифицированы уроновые кислоты и аминосахара. На примере ЭПС14б5 показано, что изменение условий культивирования сказывается на моносахаридном составе полисахаридов: отмечалось существенное сокращение доли галактозы и уроновых кислот в суммарном препарате ЭПС при замене в среде выращивания глюкозы сахарозой. По данным ^-ЯМР-спектроскопии и ГЖХ-масс-спекгрометрии, ЭПС1465 является нерегулярным по структуре разветвленным гетерогликаном, основная цепь которого образована* (1—>4)- и (1—>6)- связанными остатками гексоз в пиранозной форме.

Для оценки степени родства ЭПС Р. ро1утуха 1465 с ЭПС других штаммов данного вида мы использовали сравнительный иммунохимический' анализ. Иммунизацией кроликов суммарным препаратом ЭПС14б5ГЛ получены поликлональные Ат. ЭПС14б5ГЛ формировал с Ат две полосы преципитации, что свидетельствовало о наличии в его составе двух различных фракций, отличающихся антигенными свойствами. Сравнительный иммунодиффузионный анализ препаратов ЭПС ряда штаммов Р. ро1утуха выявил взаимодействие полученных Ат с ЭПС штаммов 1459, .1460, 92 и 88А при выращивании последних на глюкозе, при этом перекрестная реакция была отмечена только по одной.из двух полос преципитации, характерных для штамма 1465 (предположительно, соответствующей кислой фракции). В то же время, ЭПС, продуцируемые на среде с сахарозой, не взаимодействовали с Ат. Исключение составлял ЭПС1465САХ, формирующий с данными Ат одну слабую полосу преципитации.

Для количественной оценки антигенных свойств ЭПС, выделенных из штаммов Р. ро1утуха 92, 1460, 1465, 1459 и 88А, выращенных на разных средах, использовали непрямой ИФА. Было установлено, что ЭПС штаммов 1465 и 92 среди сравниваемых препаратов наиболее близки между собой и имеют примерно одинаковое количество общих антигенных детерминант в составе кислых фракций препаратов. В то время как с ЭПСнбогд полученные Ат взаимодействовали очень слабо, а значения ИФА ЭПСибослх были близки к контрольным, что находилось в хорошем согласии с полученными ранее результатами иммунодиффузионного анализа. На основании полученных данных можно говорить об отсутствии выраженной штаммовой специфичности антигенных детерминант ЭПС в пределах вида Р. ро1утуха, а также о том, что условия культивирования влияют на соотношение фракций и на антигенные свойства синтезируемых ЭПС.

Поскольку предполагается, что ЭПС Р. ро1утуха вовлечены в формирование растительно-микробных ассоциаций, очередной этап нашей работы был посвящен изучению биологической активности ЭПС ряда штаммов Р. ро1утуха в отношении морфологии корневых волосков проростков пшеницы. Хорошо известно, что образование деформаций корневых волосков является одним из наиболее ранних откликов растения на присутствие в окружающей среде бактерий. Нами обнаружено, что ЭПС Р. ро1утуха способны индуцировать морфологические изменения корневых волосков проростков пшеницы с разной интенсивностью. Зарегистрировано несколько типов деформаций. Наибольшей активностью характеризовались ЭПС бактерий Р. ро1утуха 1465 и 92. Полученные результаты свидетельствуют в пользу предположения об активной роли экзогликанов ризобактерий Р. ро1утуха в процессах формирования растительно-микробных ассоциаций.

Следующий этап нашей работы был посвящен качественной и количественной оценке способности бактерий Р. ро1утуха к колонизации корней пшеницы. Корни трехсуточных проростков мягкой яровой пшеницы Саратовская 29 инокулировали в бактериальной суспензии в течение 0.25-48 ч. Наблюдения с помощью световой микроскопии выявили неравномерный характер колонизации корневой поверхности. Больше бактерий обнаруживалось около кончика корня, в зоне элонгации и в местах соединения корневых волосков с поверхностью корня. При длительном совместном инкубировании Р. ро1утуха формировали на поверхности корня многослойные клеточные агрегаты. Сравнение динамики прикрепления к корням проростков пшеницы штаммов Р. ро1утуха, отличающихся по выходу и реологическим свойствам ЭПС, показало более высокую адсорбционную способность штамма 1465 по сравнению со штаммом 1460 на всем протяжении контакта с корнями: количество адсорбированных клеток Р. ро1утуха 1465 в 5 раз превышало таковое для штамма 1460.

Колонизирующую способность Р. ро1утуха оценивали также с помощью количественного ИФА с использованием кроличьих поликлональных антител, полученных на суммарный препарат ЭПС Р. ро1утуха 1465. Тестируемыми образцами являлись гомогенаты корней пшеницы, инокулированных бактериями Р. ро1утуха 1465 (в течение 0.25-48 ч), а также суспензии бактерий данного штамма и бактерий других родов. Была установлена высокая степень выявления клеток штамма 1465 с помощью полученных Ат по сравнению с другими протестированными бактериями. На основании результатов титрования антигенов были выбраны оптимальные разведения проб для проведения ИФА и разработан соответствующий протокол. Динамика выявления с помощью ИФА специфических бактериальных антигенных детерминант коррелировала с увеличением численности бактерий на корнях по результатам подсчета КОЕ, при этом ИФА позволял проанализировать большое количество образцов. Полученные результаты свидетельствовали о перспективности применения твердофазного ИФА с использованием Ат на ЭПС для количественной оценки колонизации бактериями Р. ро1утуха корней.

Способность Р. ро1утуха к эффективной колонизации и формированию биопленок, по мнению ряда исследователей, имеет определяющее значение в увеличении сопротивляемости растительного организма биотическим и абиотическим стрессам (Haggag, Тишпшк, 2008; Тлттизк е1 а1, 2009). На следующем этапе нашего исследования мы оценивали способность ряда штаммов ризобактерий Р. ро1утуха, отличающихся по выходу и реологическим свойствам ЭПС, к формированию биопленок на абиотических поверхностях (стекло, полистирол). Было показано, что хорошо выраженные биопленки на стеклянных и пластиковых поверхностях образуются клетками штаммов 1465 и 92. Менее выраженные биопленки формировались клетками Р. ро1утуха 1460. Следует заметить, что штамм 1465 характеризовался наибольшим выходом ЭПС, более высокими значениями вязкости КЖ и водных растворов ЭПС. Полученные результаты свидетельствуют об участии ЭПС Р. ро1утуха в формировании биопленок данными бактериями на твердых гидрофобных и гидрофильных поверхностях, что может способствовать успешной колонизации данными бактериями корней растения.

В настоящее время актуален поиск нетоксичных и доступных биополимеров, обладающих иммунотропным действием. Весьма перспективными в этом отношении являются полисахариды непатогенных микроорганизмов. За последние годы установлено, что некоторые бактериальные полисахариды отличаются выраженной способностью влиять на иммунобиологическую реактивность организма. Они вызывают многокомпонентную защитную реакцию организма, обусловливая изменение уровня сопротивляемости (Ермольева и Вайсберг, 1976). Сообщалось, что Р-1,3-0-глюканы являются мультимодальными модуляторами биологической реактивности организма со значительным клиническим противоопухолевым и противоинфекционным (противомикробным, противопротозойным, противовирусным) потенциалом, позволяющим усилить вакцинацию и активировать процессы гемопоэза (Беседнова с соавт., 2000). Исследованиями ряда ученых показано, что ЭПС P. polymyxa повышают неспецифическую реактивность организма (Афонская и Колесова, 1980; Розе с соавт., 1990; Jung et al., 2007).

Заключительный этап наших исследований посвящен исследованию активности экзополисахаридов P. polymyxa 1465 в отношении индукции факторов неспецифической резистентности макроорганизма. Были проведены эксперименты in vitro по изучению влияния ЭПС 1465, синтезируемых на средах с глюкозой и сахарозой, на фагоцитарную активность, генерацию активных форм кислорода и ферментов (кислой фосфатазы, миелопероксидазы), а также синтеза провоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-ip) мышиными и человеческими лейкоцитами.

Установлено, что внесение ЭПС1465 в концентрации 1 мкг/мл в культуру перитонеальных макрофагов перед началом фагоцитоза приводило к увеличению количества активированных макрофагов по сравнению с контролем. ЭПС в интервале доз 0.01-10 мкг/мл не оказывали стимулирующего влияния на продукцию АФК перитонеальными макрофагами, было отмечено ингибирующее действие ЭПСслх на образование АФК при всех дозах примерно на 15-24 %, что может свидетельствовать об антиоксидантных свойствах исследуемых полисахаридов. В то же время ЭПСщ незначительно активировал миелопероксидазу, обеспечивающую альтернативный механизм кислородзависимого киллинга. Наши исследования показали, что стимуляция пролиферации спленоцитов препаратами ЭПС1465 была незначительной, и не носила концентрационно-зависимого характера. Показано, что ЭПС1465 активировали кислую фосфатазу, в большей степени - ЭПСГЛ в концентрациях 0.01 и 1 мкг/мл (в 2.0 и 1.8 раза по сравнению с контролем, соответственно). Анализируемые ЭПС преимущественно стимулировали образование ИЛ-1 р и незначительно ФНО-а на завершающих стадиях фагоцитоза. Отмеченные нами некоторые различия в активности гликополимеров ЭПСрл и ЭПСсах могут объясняться отличиями по молекулярной массе, составу и структуре данных полисахаридов. Полученные нами результаты достоверно свидетельствуют о том, что препараты ЭПС P. polymyxa 1465 оказывают стимулирующее действие на неспецифический иммунитет, что открывает перспективу их использования в качестве биологически активных веществ, обладающих иммунотропным действием.

Дальнейшее изучение биохимической структуры микробных ПС является одним из наиболее важных направлений современной химии живого вещества. Наряду с нуклеиновыми кислотами и белками высокомолекулярные ПС являются третьей важнейшей категорией биополимеров, обладающих широким спектром биологических функций и, прежде всего, функций рецепторных, обеспечивающих взаимодействие клеток друг с другом и с представителями других видов (Васильев с соавт., 1984).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Трегубова, Кристина Владимировна, Саратов

1. Андреева И.Н., Редькина Т.В., Измайлов С.Ф. Роль индолилуксусной кислоты в стимулирующем действии Azospirillum brasilense на бобово-ризобиальный симбиоз // Физиол. раст. 1993. - Т. 40, № 6. - С. 902-907.

2. Апринян B.C., Михайлова A.A., Петров Р.В. Миелопептид-3 повышает интенсивность фагоцитоза Salmonella typhimurium мышиными перитонеальными макрофагами // Иммунология. 2001. - № 2. - С. 20 - 22.

3. Аркадьева Г.Е. Биологическая активность некоторых микробных полисахаридов: Автореф. дисс. докт. биол. наук. — Л., 1974. 24 с.

4. Архипова Т.Н. Исследование цитокининов, продуцируемых ризосферными микроорганизмами: Автореф. дис. канд. биол. наук. Уфа, 1999. - 17 с.

5. Афонская С.В., Колесова Э.Л. Профилактическое действие экстрацеллюлярных полисахаридов некоторых видов рода Bacillus при стафилококковой инфекции // Тез. докл. V Съезда Укр. микробиол. о-ва- Киев: Наукова думка, 1980. С. 156.

6. Басс-Шадхан Х.Ф. Зимозан: методы получения. Биохимическая характеристика и перспективы применения. Рига, 1970. - 313 с.

7. Беседнова H.H., Иванушко Л.А., Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А. Иммунотропные свойства I—>3; I—>6-Р-0-глюканов // Антибиотики и химиотерапия. -2000-№2.-С. 37-44.

8. Бойко A.C. Структурные особенности липополисахаридов азоспирилл в связи с их участием в коммуникации микроорганизмов в ризосфере: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2009. - 23 с.

9. Бухарова E.H. Экзополисахарид Paenibacillus polymyxa 88А: получение, характеристика и перспективы использования в хлебопекарной промышленности: Автореф. дис. канд. биол.наук. Саратов, 2004. - 22 с.

10. Васильев Н.В., Луцик Н.Б., Палий Г.К., Смирнова О.В. Биохимия и иммунология микробных полисахаридов. Томск: Изд-во Изд. Томск, ун-та, 1984. -303 с.

11. Васильева Г.И., Пустовалов В.Л., Дорошенко Е.П., Киселева А.К. Оценка вирулентности штаммов чумного микроба по индексу завершенности фагоцитоза // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1987. -№ 6. - С. 117-118.

12. Веселов С.Ю., Иванова Т.Н., Симонян М.В., Мелентьев А.И. Исследование цитокининов, продуцируемых ризосферными микроорганизмами // Прикл. биохим. и микробиол. 1998. - Т. 34, № 2. - С.175-179.

13. Войнов H.A., Степень P.A., Воронин С.М. Улучшение экологичности и повышение эффективности биохимических производств // Химия растительного сырья II. 1998. -№ 1. - С. 33-43.

14. Волошин С.А., Капрельянц A.C. Межклеточные взаимодействия в бактериальных популяциях // Биохимия. 2004. - Т. 69, № 11.- С. 1555-1564.

15. Гвоздяк Р.И., Матышевская М.С., Григорьев Е.Ф., Литвинчук O.A. Микробный полисахарид ксантан. Киев: Наукова думка, 1989. - С. 187-188.

16. Глухова Е.В., Шендеров Б.А., Яроцкий C.B. Образование экзополисахаридов при культивировании Bacillus polymyxa на различных углеводных субстратах // Антибиотики и медицинская биотехнология. 1985. - Т. 30, № 7. - С. 490-495.

17. Глухова Е.В., Яроцкий C.B., Дерябин В.В., Шендеров Б.А., Игнатов В.В. Внеклеточные полисахариды почвенной бактерии Bacillus polymyxa и ее мутантного штамма // Антибиотики и мед. биотехнология. 1986а. - Т. 31, № 9. - С. 669-674.

18. Глухова Е.В., Заславская П.Л., Шендеров Б.А. Сравнительный анализ 2 штаммов Bacillus polymyxa, различающихся по спектру продуцируемых экзогенных полисахаридов // Антибиотики и мед. биотехнология. 19866. - Т. 31, № 10. - С. 743748.

19. Граник В.Г. Экзогенные доноры оксида азота и ингибиторы NO-синтаз // Вестник РФФИ. 2002. - № 4 (зо). - С.48-74.

20. Дише 3. Цветные реакции гексуроновых кислот // Методы химии углеводов/ Под ред. Н.К. Кочеткова. М., 1967. - С. 38-42.

21. Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз. Екатеринбург: УрО РАН, 2001.-277 с.

22. Блинов Н.П. Некоторые микробные полисахариды и их практическое применение // Успехи микробиологии. 1982. - Т. 17. - С. 158-176.

23. Блинов Н.П. Химия микробных полисахаридов. М.: Высшая школа, 1984.-256 с.

24. Блинов Н.П. // Успехи микробиологии. 1987. - Т. 36. - С. 201-206.

25. Ермольева З.В., Вайсберг Г.Е. Стимуляция неспецифической резистентности организма и бактериальные полисахариды. М.: Медицина, 1976. -184 с.

26. Жбанков Р. Г. Инфракрасные спектры и структура углеводов. Минск:

27. Наука и техника, 1972. 456 с.

28. Жеребцов H.A., Абрамова И.Н., Шеламова A.C. Выделение экстрацеллюлярной бактериальной инулиназы и изучение ее физико-химических свойств // Биотехнология. — 2002. № 3. - С. 13-20.

29. Жеребцов H.A., Абрамова И.Н., Шеламова A.C., Попова Т.Н. Идентификация каталитически активных групп инулиназы Bacillus polymyxa 722 II Прикл. биохим. и микробиол. 2003. - Т. 39, № 6. - С. 619-624.

30. Захарова И.М., Косенко JI.B. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев: Наукова думка, 1982. — 67 с.

31. Игнатенко JI.A. Иммуномодулирующие и радиозащитные свойства транслама: Дисс. канд. мед. наук. Владивосток, 1994. - 160 с.

32. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург A.JI. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. 2004. - Т. 40, № 11.-С. 1445 - 1456.

33. Карпунина JI.B. Роль агглютинирующих белков азотфиксирующих бацилл и ризобий в жизнедеятельности бактерий при взаимодействии с растениями: Дис. . д-ра биол. наук. Саратов, 2002. - 315 с.

34. Карпунина Л. В., Мельникова У. Ю., Коннова С. А., Стадник Г. И. Изучение биологической роли лектинов Bacillus polymyxa при взаимодействии с углеводными компонентами корней пшеницы // Изв. РАН. Сер. биол. 2003. - № 3. -С. 311-314.

35. Кашкина М.А. Влияние дрожжевых полисахаридов на иммунологическую реактивность организма: Автореф. дисс. . канд. биол. наук Л., 1974.-19 с.

36. Клаус Д. Лимфоциты. Методы. М.: Мир, 1990. - 279 с.

37. Козак Н. И. Микробный полисахарид ксантан // Полимеры Деньги. -2006. -№ 15.-С. 30-32.

38. Козыровская H.A., Негруцкая В.В., Ковальчук М.В., Вознюк Т.Н. Paenibacillus sp. перспективная бактерия для создания технологии производства бакпрепаратов для растений // Биополимеры и клетка. 2005. - Т. 21, № 4. - С. 312-318.

39. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. Учебник для мед. ВУЗов. С-Пб.: СпецЛит., 2002. - 580 с.

40. Красов А.И., Попова И.А.,. Филипьечева Ю.А, Бурыгин ГЛ., Матора Л.Ю. Применение иммуноферметного анализа для выявления азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum в почвенных суспензиях // Микробиология. 2009. - Т. 78 -№ 5. — С. 662-666.

41. Кулинский В.И. Биохимические аспекты воспаления // Биохимия. 2007. - Т. 72, вып. 6. - С. 733-746.

42. Кэбот Е., Мейер М. Экспериментальная иммунохимия. М.: Медицина, 1968.-684 с.

43. Лукин С.А., Кожевин П.А., Звягинцев Д.Г. Азоспириллы и ассоциативная азотфиксация у небобовых культур в практике сельского хозяйства // Сельскохоз. биология. 1987. - № 1. - С. 51-58.

44. Лыков В.В., Ховрычев М.П., Полин А.Н. Биосинтез полимиксина Bacillus polymyxa при лимитации роста источниками питания // Микробиология. -1988. Т. 57, № 3. - С. 410-414.

45. Лященко В.А. Макрофаги в инфекционном процессе // Инфекционная иммунология. 1995, № 4. - С.48-52.

46. Майорова Т.Н., Кожевин П.А., Звягинцев Д.Г. Подходы к оптимизации интродукции азоспирилл // Микробиология. -1996. Т. 65, № 2. - С. 277-281.

47. Мальцева H.H., Надкерничная Е.В., Волкогон В.В., Ушакова М.А. Активность азотфиксации и азотфиксирующие микроорганизмы ризосферы озимой ржи // Микробиол. журнал. 1992. - Т. 54, № 6. - С.10-16.

48. Мамаева Г.Г. Выделение и идентификация бактерий Paenibacillus, разлагающих пиретроидные инсектициды, их биологическая активность и возможность использования для биоразложения остатков ядохимикатов // Экологическая безопасность в АПК.-2002.-С. 19.

49. Матора A.B. Получение и исследование промышленно-важных штаммов-продуцентов экзополисахаридов: Дис. канд. биол. наук. Саратов, 1993 - 170 с.

50. Мелентьев А.И., Еркеев А.М. Изучение антагонизма между почвенными бациллами и микромицетами рода Fusarium Lk:FR. // Микробиол. журн. 1990. - Т. 52, № 1.-С. 53-56.

51. Мельникова У.Ю. Лектины Bacillus polymyxa: физико-химические и биологические свойства: Автореф. дис. канд. биол. наук. Саратов, 2000. - 19 с.

52. Мишке И.В. Микробные фитогормоны в растениеводстве. Рига:1. Зинатне, 1988.-151 с.

53. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Хоулта Дж., Крига Н., Сниита П., Стейли Дж. и Уильямса С. -М.: Мир, 1997. Т. 2. - С.567-568.

54. Пирог Т.П., Гринберг Т.А., Пинчук Г.Э., Сенченкова С.А., Малашенко Ю.Р. Разделение экзополисахаридов, синтезируемых Acinetobacter sp., на ацилированный и неацелированный компоненты // Микробиология. 1994. - Т. 63, № 5.-С. 840-846.

55. Пирог Т.П., Слабоспицкая А.Т., Воцелко С.К., Мохаммед эль Сайд, Афонская C.B., Гринберг Т.А. Образование и физико-химические характеристики экзополисахаридов некоторых бактерий рода Bacillus II Микробиол. журн. 1985. - Т. 47. № 6. - С. 27-32.

56. Практикум по иммунологии / Под ред. Кондратьевой И.А., Самуилова В.Д. М.: МГУ, 2001.-224 с.

57. Проворов H.A., Воробьев Н.И., Андронов Е.Е. Макро- и микроэволюция бактерий в системах симбиоза // Генетика. 2008. - Т. 44, № 1. — С. 12-28.

58. Розе JI.B., Закенфельд Г.К., Лайвениекс М.Г., Беккер М.Е. Биологические эффекты левана // Изв. АН Латв ССР. 1990. - Т. 2. - С. 56-64.

59. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология / Пер. с англ. М.: Мир, 2000. - 592 с.

60. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск: Вышэйшая школа, 1973.-320 с.

61. Рудик Д.В., Тихомирова Е.И. Методы изучения фагоцитоза и функционально-метаболического состояния фагоцитирующих клеток Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2006. - 112 с.

62. Рулева Н.Ю., Звягинцева М.А., Дугин С.Ф. Миелопероксидаза: биологические функции и клиническое значение // Современные наукоемкие технологии. 2007 - № 8. - 11-14.

63. Рябичева Т.Г., Вараксин H.A., Тимофеева Н.В., Рукавишников М.Ю. Определение цитокинов методом иммуноферментного анализа // Новости «Вектор-Бест». 2004. - №4(34): Электронный документ. (http://www.vector-best.ru/nvb/st344.htm). Проверено 11.05. 2010.

64. Саидов М.З., Пинегин Б.В. Спектрофотометрический способ определения активности миелопероксидазы в фагоцитирующих клетках //

65. Лабораторное дело. 1991. - № 3. - С. 56-60.

66. Сафронова И.Ю., Ботвиненко И.В. Межклеточный матрикс Bacillus subtilis 271: полимерный состав и функции // Микробиология. 1998. - Т. 67, № 1. — С. 55- 60.

67. Симбирцев A.C. Цитокины: классификация и биологические функции // Цитокины и воспаление. 2004. - Т. 3, № 2. - С. 16-22.

68. Скворцова Н.Г., Умаров М.М., Костина Н.В. Влияние инокуляции смешанными культурами Bacillus polymyxa Pseudomonas на трансформацию азота в ризосфере небобовых растений // Микробиология. - 1998. - Т. 67, № 2. - С. 244-248.

69. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. - 342 с.

70. Скочинская H.H., Айзенберг В.А., Антипчук А.Т., Танцюренко Е. В. К вопросу о наличии пектинолитической активности у клубеньковых бактерий // Микробиол. журн. 1990. - Т. 52, № 1. - С. 22 - 23.

71. Слонекер Дж. Газожидкостная хроматография ацетатов альдитов // Методы исследования углеводов / Под ред. Хорлин А.Я. М.: Мир, 1975. - С. 22-25.

72. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ. - Киев: Наукова думка, 1982.-216 с.

73. Тихонович И.А., Проворов H.A. Симбиогенетика микробно-растительных взаимодействий // Экологич. генетика. 2003. - Т. 1. - С. 36-46.

74. Ткаченко A.A., Севрюгина Т.В. Биосинтез левана Bacillus polymyxa II Микробиология. 1989. - Т. 58, вып. 3. - С. 457-461.

75. Тотолян A.A., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы. Т. 1-2. СПб.: Наука, 2000.-231 с.

76. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1986.-134 с.

77. Усов А.И. Проблемы и достижения в структурном анализе сульфатированных полисахаридов красных водорослей. // Химия растительного сырья. 2001. -№ 2. - С. 7 - 20.

78. Федоненко Ю.П., Егоренкова И.В., Коннова С.А., Игнатов В.В. Участие липополисахаридов азоспирилл во взаимодействии с поверхностью корней пшеницы

79. Микробиология. 2001. - Т. 70, № 3. - С. 384-390.

80. Федоров М.В. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. -М.: Гос. изд-во сельскохоз. лит-ры, 1957. 231 с.

81. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. М.: Медицина, 2000. - 432 с.

82. Шерстобоева Е.В. Современные микробные препараты для сельского хозяйства // Оптимизация структури агроландшафт!в i ращональне використування грунтових pecypciB: Наук.- вироб. конф., Кшв, 4-7 липня 2000. Кшв: Д1А, 2000. - С. 92-93.

83. Щерба. В.В., Бабицкая В.Г. Полисахариды ксилотрофных базидиомицетов // Прикл. биохим. и микробиол. 2008. - Т. 44, № 1. - С. 90-95.

84. Щербухин В.Д. Применение инфракрасной спектроскопии к изучению углеводов // Успехи биологической химии. 1968. - Т. 9. - С. 198-219.

85. Щетинин Е.В. Полимиксины новый взгляд на известные антибиотики // КМАХ. - 2000. - Т. 2, № 3. - С. 1-8.

86. Широков А.А. Иммунохимическая идентификация поверхностных структур Azospirillum brasilense, участвующих в реализации социального поведения бактерий: Автореф. дис. канд. биол. наук. Саратов: ИБФРМ РАН, 2008. 23 с.

87. Экологическая роль микробных метаболитов / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1986. - 240 с.

88. Элисашвили В.И. Биосинтез левана уксуснокислыми бактериями, выделенными из природных источников // Прикл. биохимия и микробиол. 1982. - Т. 18, №2.-С. 180-185.

89. Элисашвили В.И. О синтезе левана культурой Paenibacillus sp. // Прикладная биохимия и микробиология. 1984. -№ 20. - С. 101-106.

90. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина, 2000. - 608 с.

91. Alexander K.G., Miller М.Н. The effect of soil aggregate site on early growth and shoot-root ratio of maize {Zea mays L.) // Plant Soil. 1991. - V. 138. - P. 189-194.

92. Arena A., Maugeri T.L., Pavone В., Iannello D., Gugliandolo C., Bisignano G.

93. Antiviral and immunoregulatory effect of a novel exopolysaccharide from a marine thermotolerant Bacillus licheniformis II Int Immunopharmacol 2006. - V. 6. - P. 8-13.

94. Arunakumari A., Lamm R.B., Neyra-Estens C.A. Changes in the cell surface properties of azospirilla in relation to cell pleomorphism and aggregation // Symbiosis. -1992.-V. 13.-P. 291-305.

95. Ash, C., Priest, F.G. and Collins, M.C. Molecular identification of rRNA group 3 bacilli using a PCR probe test // Antonie van Leeuwenhoek 1993. - V. 64. - P. 253-260.

96. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. Effects of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat // Can. J. Microbiol. 1983. - V. 29, №8.-P. 924-929.

97. Ball D.H., Adams G.A. II Can. J. Chem. 1959. - V. 37. - P. 1012-1017.

98. Bashan Y., Levanony H., Klein E. Evidence for a weak external adsorption of Azospirillum brasilense Cd to wheat roots // J. Gen. Microbiol. 1986. - V. 132. - P. 30693073.

99. Bashan Y., Holguin G. Azospirillum-plant relationships: environmental and phisiological advances (1990-1996) II Can. J. Microbiol. 1997. -V. 43. - P. 103-121.

100. Bastarrachea F., Zamudio M., Rivas R. Non-encapsulated mutants of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum II Can. J. Microbiol. 1988. - V. 34. -P. 24-29.

101. Beatty P.H., Jensen S.E. Paenibacillus polymyxa produces fusaricidin-type antifungal antibiotics active against Leptosphaeria maculans, the causative agent of blackleg disease of canola II Can. J. Microbiol. 2002. - № 48. - P. 159-169.

102. Bent E., Tuzun S., Chanway C.P. and Enebak S. Alterations in plant growth and hormone levels of lodgepole pines inoculated with rhizobacteria // Can. J. Microbiol. 2001. - V. 47, №9.-P. 793-800.

103. Bent E., Breuil C., Enebak S., Chanway C.P. Surface colonization of lodgepole pine (Pinus contorta var. latifolia roots by Pseudomonas fluorescens and Paenibacillus polymyxa under gnotobiotic conditions // Plant and Soil. 2002 - V. 241. - P. 187-196.

104. Bezzate S., Steinmetz M., Aymerich S. Cloning, sequencing, and disruption of a levanase gene of Bacillus polymyxa CF43 // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 21772183.

105. Bezzate S., Aymerich S., Chambert R., Czames S., Berge O., Heulin T. Disruption of the Paenibacillus polymyxa levansucrose gene impairs its ability to aggregate soil in the wheat rhizosphere // Environ. Microbiol. 2000. - V. 2. - P. 333-342.

106. Budi S.W., van Tuinen D., Arnould C., Dumas-Gaudot E., Gianinazzi-Pearson

107. V., Gianinazzi S. Hydrolytic enzyme activity of Paenibacillus sp. strain B2 and effects of the antagonistic bacterium on cell integrity of two soil-borne pathogenic fungi // Appl. Soil Ecol. -2000. V. 15.-P. 191-199.

108. Cakmakci R., Erat M., Erdogan U., Donmez M.F. The influence of plant growth-promoting rhizobacteria on growth and enzyme activities in wheat and spinach plants // J. Plant Nut. Soil Sci. 2007. - V. 170. - P. 288-295.

109. Chang Z.Q., Lee J.S, Hwang M.H., Hong J.H., Jung H.K., Lee S.P., Park S.C. A novel P-glucan produced by Paenibacillus polymyxa JB115 inducesnitric oxide production in RAW264.7 macrophages // J. Vet. Sci. 2009. - V. 10, № 2. - P. 165-167.

110. Chang Z.Q., Lee J.S., Gebru E., Hong J.H., Jung H.K., Jo W.S., Park S.C. Mechanism of macrophage activation induced by beta-glucan produced from Paenibacillus polymyxa JB115 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010. - V. 391, № 3. - P. 13581362.

111. Chanway C.P. Differential response of western hemlock from low and high elevation to inoculation with plant crowth-promoting Bacillus polymyxa II Soil Biol. Biochem. 1995. - V. 27, № 6. - P. 767-775.

112. Chanway C.P., Holl F.B., Turkington R. Genotypic coadaptation in plant growth promotion of forage species by Bacillus polymyxa II Plant and Soil. 1988. - V. 106.-P. 281-284.

113. Chanway, C.P., Holl, F.B. Biomass increase and associative nitrogen fixation of mycorryzal Pinus conforta Dougl. seedlings inoculated with a plant growth promoting Bacillus strain// Can. J. Bot. 1991. -№ 69. -P. 507-511.

114. Cheong H., Park S.-Y., Ryu C.-M., Kim J.F., Park S.-H., Chang S. P. Diversity of root-associated Paenibacillus spp. in winter crops from the southern part of Korea // Journal of microbiology and biotechnology. 2005. - V. 15, № 6. - P. 1286-1298.

115. Chida K., Chen G.J., Kodama T. // Agr. Biol. Chem. 1983. - V. 47. - P. 275-280.

116. Chockalingam E., Subramanian S., Natarajan K.A. Studies on biodégradation of organic flotation collectors using Bacillus polymyxa // Hydrometallurgy. 2003. - V. 71. -P. 249-256.

117. Chu K.H., Kim E.Y. Predictive modelling of competitive biosorption equilibrium data // Biotehchnol. Bioprocess Eng. 2006. - V. 11. - P. 67-71.

118. Chung, Y.R., Kim, C.H., Hwang, I., Chun, J. Paenibacillus koreensis sp. nov., a new species that produces an iturin-like antifungal compound // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. - V. 50. - P. 1495-1500.

119. Cleary J.A., Kelly G.E., Husband A.J. The effect of molecular weight and (31,6- linkages on priming of macrophage function in mice by (I,3)-P-D-glucan // Immunol.

120. Cell Biology. 1999. - V. 77. - P. 395-403.

121. Costacurta A., Vanderleyden J. Synthesis of phytogormones by plant-associated bacteria // Critical Rew. Microbiol. 1995. - № 21. - P. 1-18.

122. Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E. et al. Microbial biofilms // Annu. Rev. Microbiol. 1995. - V. 49. - P. 711-745.

123. Curran H.R., Evans F.R. The influence of iron or manganese upon the formation of spores by mesophilic aerobes in fluid organic media // J. Bacteriol. 1954. -V. 67, № 4. - P. 489-497.

124. Davey M., O'toole G. Microbial biofilm: from ecology to molecular genetics // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. -V. 64 (4). - P. 847-867.

125. Day J.M., Dobereiner J. Physiological aspects of N2-fixation by Spirillum from digitaria roots // Biol. Chem. 1976. - V. 8. - P. 46-60.

126. De Troch P., Vanderleyden J. Surface properties and motility of Rhizobium and Azospirillum in relation to plant root attachment // Microb. Ecol. 1996. - V. 32. - P. 149-169.

127. Deo N., Natarajan K.A., Somasundaran P. Mechanisms of adhesion of Paenibacillus polymyxa onto hematite, corundum and quartz // Intern. J. Miner. Process. -2001.-V. 62.-P. 27-39.

128. Dobereiner J. Physiological aspect of N2 fixationin grass-bacteria assotiation //

129. Resent Developments in Nitrogen Fixation London: Acad. Press. 1977. - P. 518-538.

130. Dobereiner J., Day J.M. Associative symbioses in tropical grasses: characterization of microorganisms and dinitrogen-fixing sites // Proc. I st Intern. Symp. on N2 Fixation. Washington, 1976. - P. 518-537.

131. Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms // Clinical Microbiology Reviews. 2002. - V. 15, №. 2. - P. 167-193.

132. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal. Chem. 1956. - V. 28, №3.-P. 350-356.

133. Fahraeus G. The infection of clover root hairs by nodule bacteria studied by simple glass slide technique // J. Gen. Microbiol. 1957. - V. 16. - P. 374-381.

134. Falch B.H., Espevik T., Ryan L., Stokke B.T. The cytokine stimulating activity of (l->3)-beta-D-glucans is dependent on the triple helix conformation // Carbohydr. Res. 2000. - V. 329, № 3. - P. 587-596.

135. Ferrieres L., Clarke D.J. The RcsC sensor kinase is reqired for normal biofilm formation in E.coli K12 and controls the expression of a regulon in respons to growth on a solid surface.// Molecular microbiology. 2003. - V. 50, № 5. - P. 1665-1682.

136. Fraser V., Braley-Mullen H. // Cell. Immunol. V.63, № 1.- P. 177-187.

137. Fukui H., Tanaka M., Misaki A. Structure of a physiologically active polysaccharide produced by Bacillus polymyxa S-4 // Agric. Biol. Chem. 1985. - V. 49. -P. 2343-2349.

138. Gamalero E., Lingua G., Berta G., Lemanceau P. Methods for studying root colonization by introduced beneficial bacteria // Agronomie. 2003. - V. 23. - P. 407-418.

139. Gaskins M.H., Hubbell D.H. Response of non-leguminous plants to root inoculation with free-living diazotrophic bacteria // The soil-root interface. N. Y., 1979. -P. 175-182.

140. Girardin H., Albagnas C., Dargaignaratz C., Nguyen-The C., Carlin F. Antimicrobial activity of foodborne Paenibacillus and Bacillus sp against Clostridium botulinum HI. Food Prot. -2002. V. 65 (5). - P. 806-813.

141. Grau F.H., Wilson P.W. Physiology of nitrogen fixation by Bacillus polymyxa II J. Appl. Chem. and Biotechnol. -1962. -V. 83. P. 490-496.

142. Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J., et al. Analysis of nitrate, nitrite, and (15N) nitrate in biological fluids II Analyt Biochem. 1982. -№ 126. -P. 131-138.

143. Guemouri-Athmani S., Berge O., Bourrain M., Mavingui P., Thiery J.M., Bhatnagar T. and Heulin T. Diversity of Paenibacillus polymyxa in the rhizosphere of wheat (Triticum durum) in Algerian soils II Eur. J. Soil Biol. 2000. - V. 36. - P. 149-159.

144. Gummadi S.N. and Kumar K. Production of extracellular water insoluble p-1.3-glucan (curdlan) from Bacillus sp. SNC07 // Biotechnol. Bioprocess Eng. 2005. - V. 10.-P. 546-551.

145. Gupta A, Gopal M, Tilak KV. Mechanism of plant growth promotion by rhizobacteria // Division of Microbiology. New Delhi, 2000. - V. 38, № 9. - P. 856-862.

146. Haggag W.M. Colonization of exopolysaccharide-producing Paenibacillus polymyxa on peanut roots for enhancing resistance against crown rot disease //Afr. J. Biotechnol. 2007. - V. 6, № 13. - P. 1568-1577.

147. Haggag W.M. Colonization of peanut roots by biofilm forming Paenibacillus polymyxa initiates biocontrol against crown rot disease // J. Appl. Microbiol. 2008. - V. 104, №4.-P. 961-969.

148. Haggag W.M., Timmusk S. Colonization of peanut roots by biofilm forming Paenibacillus polymyxa initiates biocontrol against crown rot disease // J. Appl. Microbiol. 2008. - 104(4). - P. 961-969.

149. Hakomori S.-I. A rapid permetylaion of glicolipids and polysaccharides catalyzed by methylsulfinyl carbanion in dimethylsulfoxide // J. Biochem. — 1964. — V. 55. P. 205-208.

150. Halverson L.J., Stacey G. Signal exchange in plant-microbe interactions // Microbiol. Rev. 1986. - V. 50, № 2. - P. 193-225.

151. Han Y.W. Levan production by Bacillus polymyxa II J. Indian. Microbiol. -1989.-V. 4.-P. 447-452.

152. Han Y.W., Lee R.E. Microbial rout to levan // Bioprocess Technol. 1990. -V. 12, №3.-P. 1.

153. Hebbar K.P., Gueniot B., Heyraud A., Colin-Morel P., Heulin T., Balandreau J., Rinaudo M. Characterization of exopolysaccharides produced by rhizobacteria // Applied and Microbiology Biotechnology. 1992. - V. 38. - P. 248-253.

154. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stain polyacrylamide gels // J. Bacteriol. 1983. -V. 154.-P. 269-277.

155. Hubbel D.H., Morales V.M., Umali-Garcia M. Proteolytic enzymes in Rhizobium II Appl. Environ. Microbiol. 1978. -V. 31, № 1. - P. 210-213.

156. Iman G.M., Abd-Allah N.M. Fructosan, a new soil conditishing polysaccharide isolated from the methabolites of Bacillus polymyxa AS-1 and its clinical application // Egypt. J. Botan. 1974. - V. 17, № 1. - P. 19-26.

157. Ito M., Kojama J. Iolipeptin, a new peptide antibiotic // J. Antibiotics. 1972. -V. 25.-P. 304-312.

158. Jain D.K., Patriquin D.G. Root hair deformation, bacterial attachment and plant growth in wheal-Azospirillum associations // Appl. Environ. Microbiol. 1984. - V. 48.-P. 1208-1213.

159. Johnson B.A., Pitt B.R., Davies P. Pulmonary arterial smooth muscle cells modulate cytokine- and LPS-induced cytotoxicity in endothelial cells // Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 2000. - V. 278. - P. 460-468.

160. Jung H.-K., Hong J.-H., Park S.-C., Park B.-K., Nam D.-H. and Kim S.-D. Production and physicochemical characterization of p-glucan by Paenibacillus polymyxa JB115 // Biotechnol. and Bioprocess Engineer. 2007. - V. 12. - P. 713-719.

161. Kahn M.L., Schroeder B.K., House B.L. Foraging for meaning-postgenome approaches to Sinorhizobium meliloti II Biology of Plant-Microbe Interactions. 2004. - V. 4.-P. 416-422.

162. Kajimura Y., Kaneda M. Fusaricidin A, a new depsipeptide antibiotic produced by Bacillus polymyxa KT-8. Taxonomy, fermentation, isolation, structure elucidation, and biological activity // J. Antibiot. 1996. - V. 49. - P. 129-135.

163. Karpunina L.V., Melnikova U.Yu., Konnova S.A. Biological role of lectins from the nitrogen-fixing Paenibacillus polymyxa strains 1460 during bacterial-plant-root interaction // Curr. Microbiol. 2003. - V. 47. - P. 376-378.

164. Kim Y.M., Bombeck C.A., Billiar T.R. Nitric oxide as a bifunctional regulator of apoptosis // Circ Res. 1999. V. 84. - P. 253-256.

165. Kloepper J. W., Lifshitz R., Zablowicz R. Free-living bacterial inocula for enhancing crop productivity // Frends Biotechnol. -1989. V. 7. - P. 39-44.

166. Kumar A.S., Mody K. and Jha B. Bacterial exopolysaccharides-a perception // J. Basic Microbiol. 2007. - V. 47. - P. 103-117.

167. Lai S., Tabacchioni S. Ecology and biotechnological potential of Paenibacillus polymyxa: a minireview // Indian J. Microbiol. 2009. - V. 49. - P. 2-10.

168. Lebuhn M., Heulin Т., Hartmann A Production of auxin and other indolic and phenolic compounds by Paenibacillus polymyxa strains isolated from different proximity to plant roots // FEMS Microbioly Ecol.-1997. V. 22, № 4. - P. 325-334.

169. Lee I.Y., Seo W.T., Kim G.J., Kim M.K., Ahn S.G., Kwon G.S., Park Y.H. Optimization of fermentation conditions for production of exopolysaccharide by Bacilluspolymyxa //Bioprocess Engineer. 1997. - № 16. - P.71-75.

170. Lee K.Y., Lee M.H., Chang I.Y., Yoon S.P., Lim D.Y., Jeon Y.J. Macrophage activation by polysaccharide fraction isolated from Salicornia herbacea. II J. Ethnopharmacol. 2006. - V. 103. - P. 372-378.

171. Leung M.Y.K., Liu C., Koon J.C.M, Fung K.P. Polysaccharide biological response modifiers // Immunology Letters. 2006. - V. 105, № 2. - P. 101-114.

172. Lindberg T., Granhall U., Tomenius K. Infectivity and acetylene reduction of diazotrophic rhizosphere bacteria in wheat (Triticum aestivum) seedlings under gnotobiotic conditions // Biol. Fertil. Soils. 1985. - V. 1. - P. 123-129.

173. Ljunggren H., Fahraeus C. The role of polygalacturonase in root-hair invasion by nodule bacteria // J. Gen. Microbiol. 1961. - V. 26, № 2. - P. 521-528.

174. Lowenstein C.J., Dinerman J.L., Snyder S.H. Nitric oxide: a physiologic messenger. // Ann. Intern. Med. 1994. - V. 120. - P. 227-237.

175. Maes M., Baeyen S. Exreriences and perspectives for the use of a Paenibacillus strain as a plant protectant // Commun. Agric. Appl. Biol. Sci. 2003. - V. 68.-P. 457-462.

176. Mannanov R.N., Sattarov R.K. Antibiotics produced by Bacillus bacteria // Chemistry of Natural Compounds. 2001. - V. 37, № 2. - P. 117-123.

177. Matora L., Serebrennikova O., Shchyogolev S. Structural effects of the Azospirillum Iipopolysaccharides in cell suspensions // Biomacromolecules. 2001. - V. 2. -P. 402-406.

178. Mavingui P., Laguerre G., Berge O., Heulin T. Genetic and phenotypic diversity of Bacillus polymyxa in soil and in the wheat rhizosphere // Appl. Environ. Microbiol. 1992.-V. 58.-P. 1894-1903.

179. Mavingui P., Heulin T. In vitro chitinase and antifungal activity of a soil, rhizosphere and rhizoplane population of Bacillus polymyxa II Soil Biol. Biochem. 1994. -V. 26.-P. 801-803.

180. McAuliffe O., Ross R. P., Hill C. Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action // FEMS Microbiol. Rev. 2001. - V. 25. - P. 285-308.

181. McNeely I., Kang C.J. Stabilisation of saccharide structure // Microbiol. Ecol. 1996. -№ 2. - P. 29-34.

182. McSpadden Gardener B.B. Ecology of Bacillus and Paenibacillus spp. in agricultural system // Phytopathology. 2004. - V. 94. - P. 1252-1258.

183. Michiels K., Verreth C., Vanderleyden J. Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum surface polysaccharide mutants that are affected in flocculation // J. Appl. Bacteriol. 1990. -V. 69. - P. 705-711.

184. Michiels K.W., Croes C.L., Vanderleyden J. Two different modes of attachment of Azospirillum brasilense Sp7 to wheat roots // J. Gen. Microbiol. 1991. - V. 137, №9.-P. 2241-2246.

185. Mitsuda C., Miyata N., Hirota T., Kikuchi T. High-viscosity polysaccharide by Bacilluspolymyxa II Hakko Kogaku Zasshi. 1981. - V. 59. - P. 303-309.

186. Mok M.C. Cytokinins and plant development an overview. // Cytokinins: Chemistry, Activity and Function. - New York, 1994. - P. 115-166.

187. Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology // Pharmacol. Rev. 1991. - V. 43. - P. 109-142.

188. Moon S.H., Park J.M., Chun H.Y., Kim S.J. Comparisons of physical properties of bacterial cellulose produced in different culture conditions using saccharified food wastes // Biotechnol. Bioprocess Eng. 2006. - № 11. - P. 26-31.

189. Muratova A., Hiibner Th., Tischer S. et al. Plant-rhizosphere-microflora association during phytoremediation of PAH-contaminated soil // Int. J. Phytorem. 2003. V.5.-P. 137-151.

190. Nakajiama N., Chihara S., Koyama V. A new antibiotic, gatavalin // J. Antibiotics 1972. - V. 25. - P. 243-252.

191. Nakashimada Y., Kanai K. and Nishio N. Optimization of dilution rate, pH and oxygen supply on optical purity of 2, 3-butanediol produced by Paenibacillus polymyxa in chemostat culture // Biotechnol. Lett. 1998. - V. 20. - P. 1133-1138.

192. Narula N., Deubel A., Gans W., Behl RK., Merbach W. Paranodules and colonization of whet roots by phytohormone producing bacteria in soil // Plant soil environ. -2006.-V. 3.-P. 119-129.

193. Nielsen P., Sorensen J. Multi-target and medium-independent fungal antagonism by hydrolytic enzymes in Paenibacillus polymyxa and Bacillus pumilus strains from barley rhyzosphere // FEMS Microbiol. Ecol. 1997. - V. 22. - P. 183-192.

194. Ninomiya E., Kizari T.s Harada K. High viscous polysaccharide produced by spore-forming bacterium. Part I. Identification of product // J. Agr. Chem. Soc. Jap. -1968a.-V. 42.-P. 178-184.

195. Ninomiya E., Kizari T., Harada K. High viscous polysaccharide produced by spore-forming bacterium. Part II. Physical properties and consistent sugar ratio // J. Agr. Chem. Soc. Jap. 1968b. - V. 42. - P. 431-434.

196. Ninomiya E., Kizari T. Bacterial polysaccharide produced from Bacillus polymyxa № 271 // Die Angewandene Makromolek. Chem. 1969. - V. 6. - P. 179-185.

197. Okon Y., Kapulnik Y. Development and function of Azospirillum inoculated roots // Plant Soil. 1986. - V. 90. - P. 3-16.

198. Ouchterlony O., Nilsson L.-A. Immunodiffusion and immunoelectrophoresis // Handbook of experimental immunology. Vol. 1. Immunochemistry / Ed. D.M. Weiz. -Oxford: Alden Press, 1979.-P. 19-33.

199. Patra P., Natarajan K.A. Microbially induced flotation and flocculation of pyrite and sphalerite // Coll. Surf. B: Biointerfaces. 2004. - V. 36. - P. 91-99.

200. Patra P., Natarajan K.A. Surface chemical studies on selective separation of pyrite and galena in the presence of bacterial cells and metabolic products of Paenibacillus polymyxa II J. Coll. Interface Sci. 2006. - V. 298. - P. 720-729.

201. Patriquin D.G., Dobereiner J., Jain D.K. Sites and processes of association between diazotrophs and grasses // Can. J. Microbiol. 1983. - V. 29, № 8. - P. 900-915.

202. Petersen, D.J., Srinivasan, M., Chanway C. Bacillus polymyxa stimulates increased Rhizobium etli populations and nodulation when co-resident in the rhizosphere of Phaseolus vulgaris IIFEMS Microbiology Letters. -1996. V. 142. - P. 271-276.

203. Philip L., Iyengar L., Venkobachar C. Site of interaction of copper on Bacillus polymyxa II Water, Air and Soil Pollut. 2000. - V. 119. - P. 11-21.

204. Prado Acosta M., Valdman E., Leite S.G.F., Battaglini F., Ruzal S.M. Biosorption of copper by Paenibacillus polymyxa cells and their exopolysaccharide // World J. Microbiol. Biotechnol. 2005. - Vol. 21. - P. 1157-1163.

205. Railkin A.I. Protsessy kolonizatsii I zashchita ot bioobrastaniya (Colonization Processes and Protection from Biofouling) // St. Petersburg: Izd-vo S-Petersburg, un-ta, 1998.

206. Renato de Freitas J. Yield and assimilation of winter wheat (Triticum aestivum L., var. Norstar) inoculated with rhizobacteria // Pedobiologia. 2000. - V. 44. - P. 97-104.

207. Renni R.J., Thomas J.B. 15N-determination effect of inoculation with N2-fixing bacteria on nitrogen assimilation in Western Canadian wheat // Plant and Soil. -1987.-V. 100.-P. 213-223.

208. Rosado A.S., Seldin L. Production of a potentially novel anti-microbial substance by Bacillus polymyxa II World J. Microbiol. Biotechnol. 1993. - V. 9. - P. 521528.

209. Ross G.D., Vetvicka V., Yan .J, Xia Y., Vetvickova J. Therapeutic intervention with complement and beta-glucan in cancer // Immunopharmacology. 1999. -V. 42.-P. 61-74.

210. Ruiz-Bravo A., Jimenez-Valera M., Moreno E., Guerra V., Ramos-Cormenzana A. Biological Response Modifier Activity of an Exopolysaccharide from

211. Paenibacillus jamilae CP-7 // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2001. - V. 8, №. 4. - P. 706710.

212. Ryu C.-M., Kima J., Choi O., Kima S.H., Park C.S. Improvement of biological control capacity of Paenibacillus polymyxa E681 by seed pelleting on sesame // Biol Control. 2006. - V. 39. - P. 282-289.

213. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition. — Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

214. Sandula J., Kogan G., Kacurakova M., Machova E. Microbial (1—>3)-ß-D-glucans, their preparation, physicochemical characterization and immonomodulatory activity // Carbohydr. Polym. 1999. -V. 38. - P. 247-253.

215. Santhiya D., Subramanian S., Natarajan K.A. Surface chemical studies on sphalerite and galena, using extracellular polysaccharides isolated from Bacillus polymyxa II J. Coll. Int. Sei. 2002. - V. 256. - P. 237-248.

216. Sharma P.K., Rao Hanumantha K. Adgesion of Paenibacillus polymyxa on chalcopyrite and pyrite: surface thermodynamics and extended DLYO theory // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2003. - V. 29. - P. 21-38.

217. Shishido M., Breuil C., Chanway C.P. Endophytic colonization of spruce by plant growth-promoting rhizobacteria//FEMS Microbiol. Ecol.- 1999. V. 29. -P. 191-196.

218. Siddiqui Z.A., Baghel G. and Akhtar M.S. Biocontrol of Meloidogyne javanica by Rhizobium and plant growth promoting rhizobacteria on lentil // World J. Microbiol. Biotechnol. 2007. - V. 23. - P. 435-441.

219. Singh H.P., Sing T.A. The interaction of a rockphosphate, Bradyrhizobium, vesicular-arbuscular mycorrhizae and phosphatesolubilizing microbes on soybean grown in a sub-Himalayan mollisol // Mycorriza. 1993. - V. 4. - P. 37-43.

220. Skvortsov I.M., Ignatov V.V. Extracellular polysaccharides and polysaccharide-containing biopolymers from Azospirillum species: properties and the possible role in interaction with plant roots // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - V. 165. - P. 223-229.

221. Smit G. Adhesin from Rhizobiaceae and their role in plant-bacterium interaction // Ph. D. Thesis Leuden Univ. -The Netherlands, 1994.

222. Stansly P.G., Schlosser M.E. Studies on polymyxin: isolation and identification of Bacillus polymyxa and differentiation of polymyxin from certain known antibiotics // J. Bacteriol. 1947. - V. 54, № 5. - P. 549-560.

223. Sutherland I.M. Bacterial exopolysaccharides // Adv. Microbiol. Physiol. -1972.-V. 8.-P. 143.

224. Sutherland I.W. Exopolysaccharides in biofilm, floes, and related structures // Water Sci. Technol. 2001. - V. 43, № 6. - P. 77-86.

225. Sutherland I.W. Industrielly useful of microbial polysaccharides // Microbiol. Sci.- 1986.-V. 3.-P. 5-9.

226. Sutherland I.W. Structure-function relationships in microbial exopolysaccharides // Biotechnol. Adv. 1994. - V. 12, № 2. - P. 393-448.

227. Syu M.J. Biological production of 2,3-butanediol // Appl. Microbiol. Biotechnol.-2001.-V. 55.-P. 10-18.

228. Tien T.M., Diem H.G., Gaskins M.H., Hubbell D.H. Polygalacturonic acid transeliminase production by Azospirillum species // Can. J. Microbiol. 1981. - V. 27. - P. 426-431.

229. Tien T.M., Gaskins M.N., Hubbell D.H. Plant growth substances produced by Azospirillum brasilense and their effect on the growth of Pearl Millet (Pennisetum americanum L.) // Appl. Environ. Microbiol. 1979. - V. 37. - P. 1016-1024.

230. Timmusk S., Nicander B., Granhall U., Tillberg E. Cytokinin production by Paenibacilluspolymyxa II Soil Biol. Biochem. 1999. - V. 31. - P. 1847-1852.

231. Timmuck S., Grantcharova N., Wagner E.G.H. Paenibacillus polymyxa invades plant roots and forms biofilm // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V. 71, № 11. - P. 7292-7300.

232. Timmusk S., van West P., Gow N.A.R, Huffstutler R.P. Paenibacillus polymyxa antagonizes oomycete plant pathogens Phytophthora palmivora and Pythium aphanidermatum II Journal of Applied Microbiology. 2009. - V. 106, № 5. - P. 14731481.

233. Tsai C.M., Frasch C.E. A sensitive silver stain for delecting lipopolysaccharides inpolyacrylamide gels // Anal. Biochem. -1982. V. 119. - P. 115-119.

234. Tupinamba G., da Silva A.J.R., Alviano C.S., Souto-Padron T., Seldin L., Alviano D.S. Antimicrobial activity of Paenibacillus polymyxa SCE2 against some mycotoxin-producing fungi // Journal of Applied Microbiology. 2008. - V. 105, № 4. - P. 1044-1053.

235. Umali-Garcia M., Hubbel D.H., Gaskins M.H., Dazzo F.B. Association of Azospirillum with grass roots // Appl. Environ. Microbiol. 1980. - V. 39. - P. 219-226.

236. Van Loosdrecht M.C.H. Bacterial Adhesion Wageningen, 1988.

237. Vijayalakshmi S.P., Raichur A.M. Bioflocculation of high-ash Indian coals using Paenibacillus polymyxa II Intern. J. Miner. Process. 2002. - V. 67. - P. 199-210.

238. Vlamakis H., Aguilar C., Losick R., Kolter R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community // Genes Dev. 2008. - V. 22, №7.-P. 945-953.

239. Vogel S.N., Marshall S.T., Rosenstreich D.L. Analysis of the effects of lipopolysaccharide on macrophages: differential phagocytic responses of C3H/HeN and C3H/HeJ macrophages in vitro //Infect Immun. 1979. -V. 25. - 328-336.

240. Vogt C., Simon D., Alfreider A., Babel W. Microbial degradation of chlorobenzene under oxygen-limited conditions leads to accumulation of 3-chlorocatechol // Environ. Toxicol. Chem. 2004. - V. 23, № 2. - P. 265-270.

241. Von der Weid I.A., Paiva E., Nobrega A., van Elsas J.D., Seldin L. Diversity of Paenibacillus polymyxa strains isolated from the rhizosphere of maize planted in Cerrado soil // Res. Microbiol. 2000. - V. 151. - P. 369-3 81.

242. Whatley M., Bodwin J., Lippincott B., Lippincott J. Role for Agrobacterium cell envelop lipopolysaccharide in infection site attachment // Infection and Immunity. -1976.-V. 13.-P. 1080-1083.

243. Williams D.L., Browder J.W., McName R. et al. // Adv. Exp. Med. Biol. -1982.-V. 155.-P. 701-706.

244. Wood P J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides // Carbohydr. Res. 1980. -V. 85. - P. 271-287.

245. Yahalom E., Dovrat A., Okon Y., Czosnek H. Effect of inoculation with Azospirillum brasilense strain Cd and Rhizobium on the root morphology of burr medic CMedicago polymorpha L.) // Isr. J. Bot. 1991. - V. 40. - P. 155-164.

246. Yopk G.M., Gonzalez J.E., Walker G.C. Exopolyccharides and their role in nodule invasion // Biology of Plant-Microbe Interaction. St. Paul, USA, 1996. - P. 325330.

247. Zamudio M., Bastarrachea F. Adhesiveness and root hair deformation capacity of Azospirillum strains for wheat seedlings // Soil Biol. Biochem. 1994. - V. 26, № 6. - P. 791-797.

248. Zanchetta P., Lagarde N. and Guezennec J. A new bone-healing material: A hyaluronic acid-like bacterial exopolysaccharide // Calcif. Tissue Int. 2003. - V. 72. - P. 74-79.

249. Zengguo H., Duygu K., Liwen Z., Chunhua Y., Kari B.G.-C., Ahmed E.Y. Isolation and identification of a Paenibacillus polymyxa strain that coproduces a novel lantibiotic and polymyxin // Appl. and Environ. Microbiol. 2007. - V. 73, № 1. - P. 168178.

Информация о работе

Трегубова, Кристина Владимировна
кандидата биологических наук
Саратов, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Состав, биологическая активность и роль экзогликанов бактерий Paenibacillus polymyxa во взаимодействиях с растениями - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы