Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Образование и свойства внеклеточных полисахаридов AZOTOBACTER BEIJERINCKII и MYCOBACTERIUM LACTICOLUM

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Образование и свойства внеклеточных полисахаридов AZOTOBACTER BEIJERINCKII и MYCOBACTERIUM LACTICOLUM"

ЭСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РШЛКЦИИ И ОГДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ.ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ . ШЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УЖ 576.852.29

ДАНИЛОВА Ирина Валентинозна

ОБРАЗОВАНИЕ И СВОЙСТВА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ АгОТОВАСТЕЛ ЕЕЫЕЫКСКИ И МТСОВАСГ ЕИГЛ,! 1АСТ1СОЫШ.

Специальность 03.00.07 - мккробьология

Ав?орсферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

/

/

/ .,

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского Государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Н.С.Егоров

Официальные оппоненты: доктор химических наук, гл. н. сотр. В.Д.Щербухин кандидат биологических наук Л.В.Лысак

Ведущее учреждение - Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Г.Пущина.

Защита состоится "40" 199 2г. в 45— час

на заседании специализированного совета Д 053. 05. 66. при Московском государственном университете по адресу: 119899, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологическ факультета МЕГ.

Автореферат разослан " ^ " 199 2-т.

Ученнй секретарь специализированного совета кандидат биологических наук '^Ьс^у¿¿¿б^ Н.Ф. Пискунко

Актуальность проблемы. Исследование внеклеточных полисахаридов бактерий в настоящее время приобретает комплексный характер, так как включает в себя их изучение в микробиологическом, химическом, физико-химическом и практическом С биотехнологическом и дадино-фармацевтическом ) аспектах. Яти соединения обладают широким разнообразием строения и, соответственно, свойств. Поиск новых продуцентов экзополисахаридов углубляет знание о разнообразии Зактерий, приводит v открытию новых, ранее неизвестных стр/ктур.

Внеклеточные полисахариды бактерий ценны для практического ис-гользования благодаря коллоидным и клеящим свойствам, способности збразовывать пленки и гели, изменять реологические свойства жидкостей. Эти полимеры используются в пищевой, текстильной, фармацевтической, косметической прога,тленности ( суспендирующие агенты, загустители, гелеобразукщиз агенты ) , в медицме (как физиологи-тесгат активные вещества )., в металлургии (очистка, разделение, концентрация металлов ) , при добыче нефти (вторичная добыча из ютощеннюс пластов и смазка дая буров ), в строительстве .(повшпа-ше адгезивных свойств'цемента ), в лабораторной практике (полу-гение сорбентов ) и других областях (Sandford, 1979» Sutherland :979; Блинов, 1982 ).

Научный и практический интерес представляет вопрос о биологи-[еских функциях бактериальных экзополисахаридов. Для некоторых бак-'ерий показано их участие в защите и питании клеточ, а также в |роцессах адгезии и биологического "узнавания" при взаимодействии ! другими биомолекулами. Однако для большинства микроорганизмов дологическая роль их экзополисахаридов находится на уровне пред-олслений.

К настоящему времени накоплено много сведений об экзогликанах •яда бактерий, в основном - патогенных п симбиотических. Сапротроф-ые бактерии в этом плане изучены недостаточно, хотя некоторые из них

являются активными продуцентами внеклеточных полисахаридов. Так, свободаокивущге азотфиксаторы, в частности, представители рода АгоАоЪас-иг , являются классическим примером бактерий, образующих; экзогликаны. Тем не менее структура и свойства акзополисах* ридов у азотобактеров исследованы мало.

Значительные количества внеклеточных полисахаридов образует и другая группа почвенных микроорганизмов - .рапротрофные микобакте-рш. Установлена структура и изучены некоторые особенности образования внеклеточного полисахарида ЫусоЪа^ег1ит 1ас-Ысо1ит 121 ( Гоголева и др., 1976; КосЪе^коу е* а1., 1979). Однако почти ничего не известно о свойствах и функциях этого полимера.

Химически близкие экзогликаны могут образовывать не только родственные бактерии, но и представители эволвдионно отдаленных групп, имеющие сходные условия существования. Представлялось важным установить, насколько структура внеклеточных полисахаридов определяет их свойства и функции для различных в систематическом ' 'плане микроорганизмов.

■ Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было обна-. ружение активных продуцентов зкзополисахаридов, имеющих научный и практический интерес, среди бактерий рода Аао-ЬоЪа^ег , а также сравнительное изучение свойств внеклеточных полисахаридов Аао'коЪасЪвг и сапротрофных микобактврий.

В соответствии с поставленной целью определены следующие задачи:

- провести поиск активных продуцентов экзополисахаридов ореда бактерий рода Аао-ЬоЬас^гч

- установить отруктуру экзополисахарвдов выбранного организма;

- изучить закономерности образования этого полимера;

- исследовать' в сравнительном плане свойства этого полисахарида и экзополисахарида м.1ас-Ысо:1ш1 121$

- выяснить возможные функции исследуемых экзополисахаридов.

Научная новизна и значимость результатов. Обнаружено, что А.beij erlncküштамм B-ISI5 образует значительное количество (около I г/л ) внеклеточных полисахаридов. Экзополисахариды А. beijerinckü представлены совокупностью двух кислых полимеров I соотношении 9 : Г. Установлена структура основного полисахарвда .beijerinckü. Такой полимер обнаружен впервые. Минорный окзопо-исахарид А.beijerinckü и экзополисахариды исследованных штаммов .chroococcum аналогичны бактериальному альгинату, то есть показано, что бактериальный альгинат специфичен не только для .vineiandii как считалось ранее, но и для других представителей ода Azotobacter.

Показано, что экзополисахариды филогенетически отдаленных бак-ерий А.beijerinckü и M.lnoticolum 121, обладающие сходной струк-урой (они являются линейными кислыми гетерогликгчгами ) , прояв-яют и сходные свойства. Обе бактерии принадлежат к микроорганиз-ам, образующим внеклеточные полисахариды преимущественно -во время ктивного роста. Экзополисахариды А.beijerinckü г M.lacticolun бразутот растворы с высокой вязкостью. Реологические свойства раст-оров полисахаридов существенно зависят от ионного состава системы, го свидетельствует о нестабильности конформацси этих полимеров, эдиг^итсация структуры основного полисахарида A.beijerinokü пока-зла, что его высокая вязкость определяется наличием пируват-кеталь-вс заместителей, а растворимость в присутствии солей кальция - на-ичием О-^ацетильных групп.

Подобраны методики, позволяйте установить прямое влияние экзо-злисахаридов на свойства меток продуцентов. Установлено, что капельные экзогликаны А.beijerinckü д M.lacticolum увеличивают юсобность клеток к гидрофильной адгезии, а их свободные экзополи-1хариды защищают клетки от действия ионов тяжелых металлов (меди)

в цитоцвдной концентрации.

Практическая ценность. Показано, что внеклеточные полисахарид А.bot j erinokii И u.laoticolwn перспективны для. практического использования, поскольку кинематическая вязкость их 0,1 % растворов (10,5 и 9,7 сСт соответственно )'почти в дня раза превышает таковуь у классического высоковязкого экзополисахарида ксантана ( 5,8 сСт ). Установленные закономерности образования исследуешх полимеров позволяют оптимизировать процесс выращивания бактерий с целью повышения выхода этих продуктов.

На примере M.lactlcolum установленб, что одной из причин уменьшения количества экзополисахарида при хемостатном культивиро вании является диссоциация штамма-продуцента. Учет этого явления при промышленном получении полисахаридов позволит избежать снижения выхода продукта. Образование полисахаридов A.beijerinokii пр хемостатном культивировании остается стабильным в течение дяитель ного времени, что позволяет рекомендовать этот метод доя'промните ного получения названных полимеров.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на XX Всесоюзной научной конференции молодых ученых "Проблемы современной биологии" ( 24 - 28 апр. 1989 г., г.Москва ) и на II Всесоюзном семинаре 'Химия и биохимия углеводов клеточной поверхности микроорганизмов" (9-13 сент. 1991 г., г. Саратов).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов исследований и выводов. Работа изложена на 150 страни цах машинописи,, иллюстрирована 12 таблицами и 18 рисунками. Список цитируемой литературы включает 189 работ, из них 37 на рус- ■ ском языке.

Экспериментальная часть.

Объекты и методы исследования.

Объектами исследования служили 5 штаммов АгогоЬас^ег (А.оЬгооооосиш В-1272 И В-1616, А. ПпеХажШ. В-1273 И В-1617, А.Ье:уег1пск:и В-161 ^полученные из ВКМ ИБШ РАН, штамм I.lactlcolum 121 из коллекции микроорганизмов кафедры микробио-эгии МГУ и штаммы АГ и А2, выделенные из почвы (согласно опреде-¡гаелю бактерий Берги, они могут принадлежать родам Аио1;оЪис<;сг НИ Агошопав (ТсЬап, Неп, 1984 )).

Культуры азотфтссаторов поддерживали и готовили к опытам на гаризованной среде Эшби с глюкозой (Метода оощей бактериологии, 384), 1 М.1асисо11ш - на среде БСА (ШБ : 4°Б сусло, Г : I, I 7,0, агар - 1,5 $ ).

' При периодическом культивировании А.Ье1^ег1по)с11 использовали ¡еду состава (г/л ): глзокоза - 20,0; На.ч?о4 - 0,2; КС1 - 0,2) аС12* 2Н20 - 0,04» МбЭСу 7Н20 - 0.02( Ре304>7Нг0 - 0,003» да водопроводная, рН 7,0. Дпл хемостатного культивирования среду •говили на дистиллированной воде с микроэлементами, добавляли

(2,0 г/л )уменьшали концентрацию Ка2НР04 до 0,025 г/л лимитация роста источником фосфора ). ы.1ас1;1со.Тит выращивали жидкой минеральной среде с глюкозой (Гоголева и др., 1976 ), и хемостатном культивировании концентрацию Ноно^ уменьшали до 25 г/л (лимитация роста источником азота ) . Опиты проводили в тгбях на 750 мл со 100 мл среды на качалке (300 об/мин ) при -30°С. Непрерывное культивзфование бактерий осуществляли в фермере с рабочим объемом 200 мл, собранном по чертежам, предостав-шьпл сотрудшпслми 1ШИ РАН.

Рост бактерий оценивали нефелометрически, рассевом на плотную ;ду и по белку биомассы, определяемому реакцией с Кумаси синим 1отодн об!цей бактериологии, 1984 ). Количество экзополисахарл-

дов определяли с ТГХ по редуцирующей способности диализованной культуральной жидкости после ее кислотного гидролиза (Егоров и др 1984 ). Концентрацию НОТ измеряли с сульфофеноловым реактивом, rat - с реактивом Несслера (Методы общей бактериологии, 1984 ) , а количество - реакцией с малахитовым зелены!.. (Danilov et el, .1980 ).

Морфологию клеток изучали с помощью световой микроскопии. Кап-сульный материал выявляли негативном контрастированием с тушью. Размеры клеток, капсул и флоков определяли о помощью винтового окулярного микрометра.

Выделение экзополисахарвдов проводили из диализованной, депро-теинизированной культуральной жидкости с помощью четвертичных аммонийных солей (Егоров и др., 1984 ) иди осаждением этанолом (Методы химии углеводов, 1967 ). Фракционирование полисахаридов A.beijerinckii осуществляли методом ионообменной хроматографии . на ДЭАЭ-целлшозе DE-50 (01") и ДЭАЭ-Трисакриле М ( Whatman, Англия )в градиентах хлорида и фосфата натрия. Моносахаридный состав полимеров определяли методом бумажной хроматографии их гидро-■ лизатов в системе бутанол : пиридин : вода, 6 : 4 : 3, с помощью газо-жидкостной хроматографии гексаацетатов полиолов составляющих Сахаров на приборе Hewlett-Packard 5890 (США ) И методом ионообменной хроматографии их гвдролизатов на анализаторе Biotronik ХС-2 ООО (Sirmer.Pulo, 1978). ЯМР-спектры полисахаридов снимали на спектрометрах Bruker та-250 ( %-спектр ) и Bruker АМ-300

-спектр )(ФНГ ). Метилирование полисахаридов проводили по методу Сиукану и Керека (Siukanu, Kerefc, 1984 ) Компьютерный анализ осуществляли, как описано в работе Липкинда с соавт. (Lipkind et al., 1988). Оптическое вращение измеряли на поляриметре Jasco DIP-360 (Япония ).

В экспериментах по измерению вязкости растворы полисахаридов предварительно освобождали от катионов обработкой смолой КУ-2( Н*) Кинематическую вязкость измеряли о помощью капиллярного вискозиметра ВПЯ-2.

Гвдрофобность клеток определяли по их распределению в системе н-гексздекан : вода (Rosenberg, Hoaenberg, 1985). Для определения способности к адгезии предметные стекла помещали в суспензии клеток, инкубировали 18 ч и промывали под сильной струей вода. Адге-зированные клетки л клетки в суспензии подсчитывали под микроскопом. Клетки убивали в автоклаве 20 мин при I агм ( рН 7,0). Де^ капсулировакие проводили в том же режиме при prt 4,0 - 4,5. Достоверность различий значений степени тидрофоб'*ости и адгезии оценивали, рассчитывая критерий достоверности разности ( Плохинский, 1970).

Для определения способности полисахаридов защищать клетки продуцента от Си2+ отмытую от экзогчиканов биомассу бактерий инкубировали в стерильных условиях с CuSO^ и.растворами очищенных полисахаридов 30 мин при комнатной температура. Затем определяли количество жизнеспособных клеток методом рассева на плотную среду.

Результаты и их обсуждение.

Г._Скргаинг а зотф1тсагоров_-_п202удентов_экаополисахаридов.

Образование внеклеточной слизи является отличительным признаком бактерий рода Azotobacter . Однако структура,' свойства, закономерности образования экэополисахаридов Azotobacter за'исключением бактериального альгиката A.vinelcndii (Jaiman, 19791 Brionese, Sutherland, 1979) практически не исследованы. Поэтому интерес к внеклеточном полисахаридам азотобактеров закономерен.

Из пяти исследованных нами штаммов Azotobacter четыре, принадлежащие к видам A.chroococcura И A.vinelandii, образуют экзо-

полисахарида, состоящие только из уроновых кислот. По-видимому, они представляют собой бактериальные альгинаты. Этот полимер типи чен для А. \гАюе1ап<111 . Данных о его образовании А.сЬгоососсиш в литературе ранее не имелось. Штаммы А.Ье13ег1пскИ В-1615, АГ и А2 образуют кислые гетерополисахариды. По визуа. ьной оценке, эк зополисахарвды А.ое1^ ег1пск!1 отличались высокой вязкостью, поэтому их исследовали более подробно. ■>

2. _С о став и ст^утст^ра вне^еточных_полис£харвдов^^^¿ег^псм Количество очищенного полисахаридного материала, образуемого А.Ье1^ег1пок11 при росте на жидкой среде Эшби с глюкозой, состав ляег 1,2 г/л.

Установлено, что экзополисахариды А.Ье13ег1пск11 представлен: двумя кислыми полимерами. Минорный полисахарид (10 % от суммы по. лисахаридного "материала ) содержит только маннуроновую и гулуро-новую кислоты в соотношении 2,3 : I. Вероятно, он является типичным бактериальным альгинатом. Преобладающий полисахарид содержит В-галактозу и 1-раинозу (2 : Г X В ЯМР-спектре: этого полисахарида присутствуют сигналы метильной группы остатка пировиноград-. ной кислоты ( 26,2 м.д. ) и О-ацетильных групп (21,4 м.д. ). В спектре наряду о основной серией сигналов наблюдается серия сигналов с меньшей интенсивностью, что свидетельствует об отсутствии регулярной структуры. По-ввдимому, это связано с нестехиометричес-киы количеством О-ацетильных групп, которое для данного образца составляет Г,5 по отношению к количеству ь-рамнозы. Присутствие: О-ацетильных групп подтвердил и % ЯМР-спектр полисахарида.

В результате дезацетилирования полисахарида и удаления остатков пировиноградНой кислоты был получен нейтральный полисахарид

зс

■ Осуществлено совместно о сотрудниками лаборатории химии углеводов ВДХ РАН.

то

1С II) . По данным С ЯМР он является регулярным. В его спектре отсутствуют сигналы трех аномерных атомов углерода при 96,8, 97,0 102,9 м.д., метальной группы (С—6) остатка рамнозы при 18,0 м.д., зух гидроксиметильных групп (С-6) остатков галактозы при 62,3 м.д,, зигнал двойной интенсивности) и двенадцать сигналов остальных уг-эродных атомов в области 67,0 - 78,4 м.д. Таким образом, этот злимер построен из трисахаридных повторяющихся звеньев, включающих за остатка галактозы и один остаток рамнозы. Отсутствие сигналов области 80 - 88 м.д. показывает, что все три моносахардцных ос-)тка присутствуют в пиранозной форме. При метилировании полисаха-ща были получены 1,3,5-три-0-ацетил-2,4-ди-0-метилрамнит и 1,3,5-гри-О-аце тил-2,4,6-0-ме тилдульцит в отношении I : 2. Следователь>, этот полимер является линейным и все моносахарвдные остатки у )Г0 замещены в положении 3.

Для дальнейшего структурного анализа ПС II был применен компыь »риэовашшй расчетный метод, основанный иа сопоставлении экспери-

■рэ

¡нтального АОС ЖР-спектра полисахарида со спектрами, расчитанны-[ для его возможных структур. В результате были выявлены две струк-■ры, расчетные спектры которых хорош совпадали с эксперименталь-м:

1, -3 L Rhap ос 1 D Galp ос 1 D Galp <*1

2. —3 X. Hhap ос 1 ~2 D (Jalp о«1 — 3 D Qalp оС1

Так как структура 2 не согласуется с данными метилирования, II имеет структуру I.

Для определения положения остатка пировиноградной кислоты были поставлены *3С ШР-спектрн ПС II и исходного кислого полисахари-. При этом было обнаружено заметнее смещение сигналов С-3,4,5,6 ного из остатков галактозы от 78,4; 70,4; 72,2 и 62,3 м.д. в ектре нейтрального полисахарида к 75,8; 72,7; 64,0 и 65,9 м.д. ответственно в спектре кислого полисахарида. Остальные сигналы

Таблица I.

Дашше 13С Я!,СР-спектров ПС I и ПО II.

Моносахарвдшй остаток йш. сдвиги атомов углерода моносахаридного остатка

С-1 С-2 С-3 С-4 С-5 С-6

ПС II ( структура I X

- 3 X Шш Ы 1 102,9 68,1 77,0 7Г,8 70,4 18,0 ,

(103,5) (68,3) (76,8) (71,8) (70,0) (18,0)

*3 И ба1 оС 96,8 68,8 78,4 70,4 72,2 62,3 1

(96,3) (68,9) (78,5) (70,6) (72,2) (62,4)

-3 в йа1 Ы. 1 97,0 68,1 75,9 67,0 71,9 62,3

Р (96,8) (68,1) (75,3) (66,9) (72,2) (62,4)

ПС Iх* .

-3 I Ш1ар ос 1 102,8 67,9 76,7 71,5 70,0 18,0

~3 0 ва1р оС 1 96,9 68,5 75,8 72,7 64,0 65,9

»3 В 0а1р оС\ 96,9 67,8 75,9 67,0 71,9 61,9

' х В скобках приведены расчетные данные для структуры I.

Химические сдвиги.остатка пировиноградной кислоты 26,2 (С~Е 101,8 (0-2) , 176,1 (С-1) ; О-ацетата - 21,4 (СНд) , 175,3 (СО) .

■сместились незначительно (табл.1) . Такое смещение указывает на присоединение остатка пировиноградной кислоты ацеталыюй связью в положения 4 и 6 этого остатка галактозы (смещение сигналов С-4 и С-6 в слабое поле отвечает «-эффектам замещения, а сигналов С-Е и С-5 в сильное поле - /1 -эффектам ). Так как сигнал при 78,4 м.д. в спектре ПО II принадлежит С-3 остатка галактозы, остаток пировиноградной кислоты присоединен именно к этому моносахаридному звену Сигнал 26,2 м.д. остатка пировиноградной кислоты указывает на в-конфигурацию кетальной связи.

Внеклеточный полисахарид, выделенный после культивирования

.beijerinckli на той же среде, но простерилизованной в другом ежиме ( в результате чего произошла частичная карамелизация глю-озн ) , отличался от первого образца по степени О-ацетилирования [0,4 вместо 1,5 на остаток рамнозы ) . Сопоставление 13С ЯМР-спект-ов этого полисахарида ПС III и'ПС I позволило определить поло-ение О-ацетильных групп. Заметному смещению при перехода от спект-а ПС III к спектру ПС I подвергаются сигналы C-I обоих остатков алактозы от 96,9 м.д, к 94,9 и 95,6 м.д., что может быть объясне-о д-эффектами О-ацетилирования этих звеньев в положении 2. Вывод б О-ацетилировании галактозных звеньев в полоса кии 2 подтверида-тся также частичным смещением сигналов С-2 и С-3 этих остатков з областей 75,8 - 75,9 м.д. и 67,8 - 63,5 м д. в области 73,4 -74,2 и 70,0 - 71,2 соответственно, что соответствует ß и ос-эф-зктам О-ацетилирования.

Таким образом, можно .предложить следующую предельную структуру шторягощегося звена основного полисахарида А.beijerinckü в-1615»

(R) н»а . соон

- 3 ь Hha_ ос 1 — 3 D Gal oí 1 — 3 D Gal Ы 1 -Р 2 р 2 р

Ь - Ас 6 - Ас

>мпоненты этого полимера достаточно типичны для бактериальных эк-!Гликанов. Однако полисахарид такой структуры обнаружен впервые.

То, что A.beijerinckil , помимо основного полисахарида, син-зирует минорный экзогликан, альгинат, - явление не широко распро-раненное, но встречающееся у ряда микроорганизмов ( Cooke, Per-val, 1975! Dea et al., 1985 ).

3. ^Закономерности образован™ э к з о глшсл но b_A .b ei ¿erinekii.

Многие закономерности образования экзополисахарвдов beijerinckli типичны. Однако процесс синтеза полимеров этой бак-

40 60 Время, ч

РисЛ. Рост И образование экзогликанов A.beijerinokil.

Г « оптическая плотность; 2 - количество живых клеток 3 - белок биомассы; 4 - экзогликаны.

терией имеет и некоторые свои особенности.

Изучение динамики образования; внеклеточных полисахаридов A.fceijerinokli показало, что бактерия синтезирует полимеры в теч ние всего периода роста (рис,1 ) . Синтез экзогликанов во время р та характерен дая рдца микроорганизмов, в частности, дая предста вителя ТОГО же рода - A.vinelandii ( Horan et al., 1981; Brionei Sutherland, 1989 ). Однако, в отличие от A.beij erinckü , синтез экзогликана A.vinelanüü продолгкается после окончания роста бак терий.

Кроме свободной слчзи A.beijerinokii образует полисахарвдную капсулу. Капсульный полимер имеет тот же моносахарвдный состав, что и основной свободный экзополисахарцд. Толщина капсулы А.beijerinckü составляет 2,0 ¿0,5 мкм при среднем размере кле tokI,I + 0,IxI,9±0,I мкм. Начиная с фазы замедления роста

(30 ч) в культуре наряду с единичными присутствуют скопления клеток (флоки) неправильной формы с линейными размерами от 20 до 300 мкм. Клетки во флоках, по-видимому, объединены капсульным материалом. Очевидно, у большинства бактерий капсулышй и свободный внеклеточный полисахариды имеют одинаковую структуру ( Cohen, Johnatone,1964j Гоголева и др., 1986 ), однако в литературе этому вопросу уделено недостаточно внимания. Отмечены случаи, когда полисахариды капсулы и свободной слизи представлены разными полимерами ( Zevenhulzen, 1987 ).

При сравнительно невысокой концентрации в среде глюкозы (5 -- 10 г/л) A.beijerinckii образует экзогликанн столь же активно,, как и при ее избытке (20 - 60 г/л ). Активный синтез экзоглика-нов при дефиците источника углерода в среде считается нетипичным. Однако возможность образования значительных количеств полисахаридов в условиях углеродной лимитации показана для некоторых микроорганизмов, синтезирующих эти полимеры во время роста 'культур ( Расе, Righelato, 1980; 3egha et al., 1989 )«

A.beijerinckiiактивно»образует внеклеточные полисахариды как в условиях азотфиксации, так и в присутствии в среде источников связанного азота ( КаНО^ или NH^Cl X Продуктивность A.beijerinckli в отношении синтеза полисахаридов падает при увеличении концентрации источника азота, то есть при уменьшении соотношения с » я.

о

Такая закономерность типична для разных продуцентов экзополисаха-ридов ( Paoe, Righelato,1980| Семенова, Гречушкина, 1986 ).

При увеличении степени аэрации среды выход внеклеточных полисахаридов A.beijerinckli существенно возрастает. В литературе неоднократно отмечалось положительное влияние усиления аэрации ( в определенных пределах) на синтез экзогликана A.vinelandii ( Jarman, 19791 Brioneae, Sutherland,1989) .По нашим данным увеличение степени аэрации повышает синтез окзогликанов А.bei,)orinnkii

Таблица 2.

Влияние аэрации на образование энзогликанов А.Ъе!;)ег1покИ при росте на средах с разными источниками азота.

Источник азота

Показатели н2 ИН4С1 ( 40 ыМ NaNO., ( 40 мМ )

А Б А Б А Б

Белок, г/л 0,6 0,5 1,1 1.0 г,о 0,9

Экзоглинаны, г/л 0,6 1,Г 1,6 1,8 1.3 1.2

ВЖ г^г 1Д 2,3 1»5 1,8 1,3 1,4

Остаток источника азота, г/л н.о. н.о. 0,8 : 0,9 0,8 0,8

А - колба без отбойников;

. Б - колба с отбойниками;

н.о. - не определяли.

только в условиях азотфиксации (табл.2 ). Этот факт согласуется с гипотезой о защитной роли экзополисахарвдов Azotobacter по отношению к нитрогеназе. Однако фактам, установленным в нашей работе, можно найти и другое объяснение. При повышении снабжения бактерий кислородом их азотфиксиругацая активность падает. В результате возникает недостаток источника азота по сравнению с количеством углерода. В таких условиях увеличение синтеза полисахаридов закономерно.

A.beijerinckii, подобно ряду других бактерий (Семенова, Гре-чушкина, 1986; Lepa et al.,1987). активно образует полисахариды при всех значениях рН среды, которые допускают ее рост ( 6,0 -10,0). Но для биосинтеза полимеров оптимальна более щелочная среда ( рН 9,0 - 10,0) , чем для накопления биомассы ( рН 8,0 ) .

При 30°С A.beljerinckii достигает стационарной фазы роста

быстрее (через 48 ч) , чем при 20°С (через 72 ч) . В то ::се время при 20°С бактерия образует в два-три рапа больше экзоглшсанов, чем при 30°С. Более активное образование окзополисахаридов при температуре ниже оптимальной для роста типично для ряда бактерий ( Хорога 01; аХ., 1979; Расе, Ш.гЬеХа1;о, 1980 ).

4._0браэование_вне1и1етотаых полисахаридов А.ЪеуейпоМ.1_и__

М.1асЪ1со1иш п£и хем£стат1юм_к£татгаированш1.

Ранее било установлено, что iJ.lacticca.uiri 121 образует внеклеточный полисахарид, который, как и основной полимер А.Ье^егХпски является линешшм полианионным гетерогликаном ( Кой^кот et аХ., 1979) . Подобно полисахаридам л.Ье13ег1пскИ он образуется во время всего периода роста культур продуцента (Егоров и др., 1984 ).

Оказалось, что образование экзогликанов А.ЬеХЛегХпскН и м.Ха<^±со1ш1 в условиях хемостатного культивирования имеет общие закономерности (рис.2) . Для обеих бактерий продуктивность практически не зависит от скорости разбавления (и) . Удельная скорость синтеза полисахаридов А.Ьв1Дег1пок11 и Н.ХасЬХсоХша возрастает с увеличением о , го есть с повышением скорости роста культур. Считается общепринятым, что бактерии более активно синтезируют экзо-гликани при низких скоростях роста. Однако -закономерность, аналогичная обнаруженной нами, ранее отмечалась для некоторых микроорганизмов, в том числе близких исследуемым ( АЬгйаоп, Соиреги^е, Г986; Семенова и др., 1987) . Вероятно, такой тип синтеза экзогликанов также достаточно распространен среди различных в систематическом плане бактерий.

Существенное влияние на продукцию экзо1юлисахрридаы.1аоисоХига з хемостате оказывает процесс диссоциации. Эта бактерия диссоци-фует на слизистый (М-), гладкий(Б-) и шероховатый(И-) вариан-ги. 3-вчриант образует полисахарид того же моносахоридного соста-

Й 8 Й

к о

О

I4

Й3

О *

£

"§0,4

|о,з Й о т

я . 0,2

0,1

а

2

3 Г ч*

/

/

/

/

/

к ы

л н

з!

В

Р -Л

05 (ч

со

<а

н -

Ё я

Э о о аз

л § н Й о И о (н »о о со 1 «к о го

, 0,02 0,04 0,06 0,08 Скорость разбавления,

0,6

м _

.0,5

и

о со К со

¡0,4 0,3

0,2 ОД

2,0

1,5

1,0

0,5

е* 2,0

1,5

1,0 0,5

8 о

СП (н

со

а>

еч -

§п

о

о а: -

Л §

О и И Р)0 о Р> к « о го

0 0,01 0,02 0,03 0,04 Скорость разбавления,

Рис.2. Образование экзогликанов А.Ъе13 ег1пски(а ) и

м.1ас-Ысо1ит ( б) при хемостатноы культивировании. I - количество клеток; 2 - экзогликанн; 3 - продуктивность; 4 - скорость синтеза экзогликанов.

ва, что и М-вариант, но в четыре-пять раз меньше.R -вариант образует следовые количества нейтрального полисахарида. При длительном поддержании M.lacticoluin в режиме хемостата ( скорость разбавления - 0,03 ч-1) через 18 суток о момента установления стационарного состояния происходит почти полная замена исходного М-вариан-та s-вариантом. Его относительное количество возрастает от 0,6 до 96,4 %. При этом количество внеклеточного полисахарида в хемо-стате уменьшается в пять раз.

Уменьшение образования экзогликанов в хемостате из-за селекции вариантов с измененным синтезом полисахаридов ранее отмечалось для ряда бактерий ( Pace, Righelato, 19801 Weisrock, 19Э2$ Weiarocli, McCarthy, 1987 ). Это часто мешает использованию хемостатного метода для промышленного получения экзополисахаридов. В результате проведенных нами исследований установлено, что причиной возникновения вариантов может служить диссоциация штамма-продуцента. То, какой из диссоциантов достигнет селективного преимущества, зависит от условий культивирования. Следовательно, имеется возможность варьированием условий выращивания добиться преимущественного роста в хемостате•нужного варианта.

В отличие от M.lacticolum , для A.beijerinckil i характерна стабильность синтеза полисахаридов при хемостатном культивировании. Следовательно, этот метод может быть использован для промышленного выращивания.

5._Свойства экзогликановJ^bei^eilncld.^ и JJ-Ласticolum .

Внеклеточные полисахарида A.beijerinokii И •M.lacticolum имеют разный состав, но сходны в том, что являются линейными полианионными цолимерами. Мы поставили задачу определить, насколько зходство и различие структур экзогликанов этих бактерий опродолл-зт сходство и различие их свойств.

К-ция катиона, мМ

Рис.3. Зависимость вязкости 0,1 % растворов экзополиса-харидов A.bei;jerinckii (1,3)И M.lacticolura (2,4) . от концентрации солей одно- и двухвалентных металлов. 1,2 - NaCl, KCl, Na2S04{ 3,4- СаС12, MgC

Водные растворы экзополисахаридов A.beij ertnckü и M.iacticoi обладают высокой вязкостью. Для 0,1 % растворов этих полимеров он равна соответственно 10,5 и 9,7 сСг. Эти значения почти в два раз превышают вязкость стандартного образца экзополисахарида ксантана измеренную в тех же условиях(5,8 сСг) . Известно, что ксантан является классическим примером высоковязкого полисахарида ( Powell, 1979).

В отличие от ксантана и других полимеров того ice типа ( janee et al., 1986f Morris et al., 1990 ). вязкость растворов экзополисахаридов A.beijerinckli и M.lacticolum сильно зависит от кон-

дентрации солей и рН. Кинематическая вязкость 0,1 % растворов поли-¡ахаридов обеих бактерий уменьшается при увеличении в них концентрации солей одно- и двухвалентных металлов (рис.3) . Вероятно, юны металлов экранируют заряженные группы полимеров, что привода к уменьшению сил электростатического отталкивания внутри цепи i к ее сворачиванию. В результате уменьшается объем, занимаемый саздой молекулой в растворе, и зго вязкость падает. Можно предпо-ножить, что под действием солей происходит также сегрегация отдельных молекул в более крупные частицы. Возможность возникновения таких частиц показана, в частности, для полисахарида Methyiioba-oillua methylophillus ( Дерябин, 1991) .

Количество ацетильных и пирувилышх. групп в экзополисахаридах бактерий может варьировать в зависимости от условий их роста ( Cactaua et al., 1982; Tait et al., 19S6 ). Изменение степени 0-аце-гилирования полисахарида показано нами и для A.béijerinckii. Известно, что.присутствие и количество неуглеводных заместителей существенно влияет на свойства бактериальных экзогликанов. Мы установили, что после снятия пирувата, определяющего кислую природу основного полимера A.beij erinckii, полисахариды этой бактерии практически полностью теряют вязкость. Очевидно, высокая вязкость экзополисахаридов A.beijerinckii в большей степени определяется полианионной природой его основного полисахарида, и в меньшей -длиной его молекул. Можно предположить, что это справедливо и для экзогликана M.lacticolum. Однако превращение этого полисахарида в нейтральную форму технически трудноосуществимо.

Дезацетилированные полисахариды A.beijerinckii теряют растворимость и образуют гелеобразный осадок в присутствии. СаС^ в концентрации выше 10 мМ. Можно предположить, что уменьшение степени О-ацетилирования служит причиной' существования этих полимеров в гелеобразном состоянии in vivo ( соединительный глтрикс блоков ).

Таблица 3.

Способность к адгезии и гидрофобность клеток A.beijerinckii И M.lacticolum.

Свойства Интакгные клетки Убитые клетки ДекапсулироЕанные клетки

Способность к адгезии (х Ю-7)

A, belj erlnckll 26,1 ± 8,5 22,9 i 6,4 6,6 + 6,4

M.lacticolum 12,2 t 1,9 10,2 ± 1,5 1,8 + 0,1

Гидрофобность:

A.beljerinckii 0,33 ± 0,16 0,24 ± 0,09 0,63 ± 0,24

.M.lacticolum . 0,31 ± 0,06 0,26 ± 0,05 0,47 ± 0,08

Приобретение способности к образованию катион-зависимых гелей после дезацетилирования показано для ряда бактериальных экзополи-сахарвдов ( O'Heil et al., 1986} Crescenzi et al., 1986 ).

Экзогликанн A. beij erinckii и M.lacticolum ( Гоголева и др., 1976 ) существуют как в виде свободной слизи, так и в виде капсулы. Предполагается, что полисахарвдные капсулы могут являться факторами адгезии клеток к гидрофильным поверхностям ( Sutherland 1983 ) . Для проверки этой гипотезы определяли гидрофобность и способность к адгезии к стеклу у интактных, убитых и декапсулиро-ванных клеток A.beljerlnckii и M.lacticolum ( табл.3 ) . Установлено, что у этих бактерий, сильно различающихся строением клеточной стенки, декапсулирование оказывает одинаковый эффект на поверхностные свойства. При декапсулировании гидрофобность клеток возрастает. Очевидно, как следствие этого, их способность к адгезии на стекле резко снижается. Гидрофобность и способность к адгезии у интактных клеток и у меток, убитых автоклавлрованием, практически одинаковы. Можно предположить, что в естественной

о н

О) .

о

(р л

ГТ-УЛ1

ГУ^

0,5 1,0 0 . 0,5

К-Ция экзогликанов, %

1,0

Рис.4. Влияние экзогликанов А.Ъе^егАпокИ. И МЛао-ЫсоЗлип на жизнеспособность клеток продуцентов в присутствии СиБ04 . I А,Ъе±Зег1лск11 , 0,1 мМ Си304

2 - Ы,1асЫсо1ит , 0,7 мМ СивО^• •

зреде обитания А.Ъе1^ег1пок11 и 11.1аог1со1ш их капсулыше по-гасахариды способствуют адгезии клеток к минеральным частицам точвы и корням растений.

Известно, что многие кислые полисахариды обладают способностью звязывать катионы металлов ,( Шеап, 1987 ).Существует предположение, что такие полимеры способны повышать выживаемость бактерий

о

при воздействии на них ионов тяжелых металлов. Однако все подтверждения этому носят косвешшй характер и основаны на сравнении свойств капсульных и бескапоульных штаммов ( Ы/Ыюп, РгеНюГег, 1Э78| Саав1-Ьу, Ко1о4в1е;), 1984 ).

Мы определяли влияние свободных экзогликанов А., Ъе1 з егЗ.пскИ и Ы.1ас1;1со1иЛ на жизнеспособность клеток их продуцентов при концентрации Си304 , обеспечивающей 0,3 выживаемость'бактерий (рис.4 ).Оказалось, что, несмотря на разную устойчивость бактерий

к ионам меди (цитоцвдная концентрация СиБО^ для А.Ъе±) ег1пск11 равна 0,2 мМ, а для м. 1ас-Ысо1ш1 - 0,8 мМ ) , добавление к суспензии клеток их собственных лолисахарвдов оказывает одинаковый эффект. Процент живых клеток возрастает в прямой зависимости от концентрации полисахаридов. Следовательно, свободные внеклеточнт полисахарвды А.Ъе1;]ег1пск11 и ы.ХааЗДсоХш способны защищать клетки продуцентов от токсического действия ионов тяжелых металлов. По-видимому, подобную функцию способны выполнять и капсуль-нне полимеры этих бактерий.

Г. Установлено, что Аао1;оЪа^ег Ъе1Дег!пск1± , штамм В-16Г5 является активным продуцентом внеклеточных полисахаридов.

2. Внеклеточные полисахариды А.Ье^еПяскИ представляют собой совокупность двух кислых полимеров, находящихся в соотношенш 9 г I. Основной полисахарид имеет следующую структуру повторяющегося звена:

Экзогликан такой структуры обнаружен впервые. Минорный полимер содержит остатки маннуроновой и гулуроновой кислот в соотношении

3. А.Ъе13 ег±пок11 образует экзополисахариды только во время роста культур. Эти полимеры активно синтезируются при недостатке глюкозы в среде и при ее избытке, на средах с неорганическими

дуцента. Повышению выхода экзогликанов А.Ъе:иег1пск11 способствует недостаток в среде азота и фосфора, понижение температуры культивирования, усиление аэрации ( в условиях фиксации молекулях ного азота ).

вывода,

соон

2,3 : Г.

источниками азота и без них, при всех рН, допускающих рост про-

4. Образование экзогликанов А.Ъе1Эег1пск11 и ЦусоЪасЪег1ип 1ао1;1оо1и!в 121 в условиях хемостата имеет общие закономерности. Продуктивность бактерий в отношении синтеза полисахаридов в хемо-отате практически не зависит от скорости разбавления, а удельная скорость и>" образования растет с ее увеличением. Причиной уменьшим количества экзоглинана М.1ас1;1со1ш1 при длительном выра-цивании в хемостате является диссоциация шташа-продуцента.

5. детворы экзополисахаридов А.Ье±Зег1пок11и Ы.1ао-Ыоо1ша тро являют сходные реологические свойства. Для них характерна высокая вязкость, которая уменьшается при снижении и повышении рН юходного раствора экзогликанов в дистиллированной вод©, а также фи увеличении в растворе концентрации солей одао- и двухвалентных металлов.

Для экзополисахаридов А.Ье1^ег1пок11 показано, что депирувили-ювание основного полимера на два порядна сникает вязкость раст-юра, а его дезацетилирование способствует образованию гелеобраз-юго осадка в присутствии ионов

6. Внеклеточные полисахариды А. Ъе3.^вг1х1ск3.1 ц М.1асЫсоД.ит ¡пособны выполнять сходные функции. Наличие капсульных полисаха-вдов снижает гидрофобность клеток и способствует их адгезии к теклу. Свободные экзогликаны повышают выживаемость бактерий в рисутствии цитоцидных концентраций СиЗО^,

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

I. Толкушкина И.В. (Данилова) Влияние"процесса диссоциации а образование внеклеточного полисахарида МусоЪа^ег1ит ао1;1оо1ит в условиях хемоотата // Проблемы современной биологии: р. 20 науч.' конф. мол. ученых биол. фак. МГУ, Москва, 24 - 28 апр. 989/ М1У. М., Г989. 4.2. С.69-73. Деп. в ВИНИТИ 5.02.90, 1Ь 642 -В90.

2. Толкушкина И.В. ( Данилова) , Семенова Е.В., Егоров Н.С. Образование экзогликанов сапротрофннми микобактериями при непрерывном и периодическом культивировании // Микробиология. Т.60.

1991. Вып. 5. С. 842-845.

3. Likfaoaherstor 1.Ы., Senchenoova S.Я., Shashkor А.З., Dere-vitskaya V.A,, Danilova I.V., Botvineс I.V. // Structure of the mayor exopolysacoharide produced by Azotobacter heijerinokii Вр1б15 // Carbohydrate Research. 1991. V. 222, P. 233-238.

4. Данилова И.В., Ботвинко И.В., Егоров Н.С. Образование внеклеточных полисахаридов Azotobacter beijerinokii // Микробиолога

1992. T.61. Вып. 6.