Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез экзополисахаридов бактериями Bacillus mucilaginosus в глубинных условиях культивирования и новый аспект их использования

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез экзополисахаридов бактериями Bacillus mucilaginosus в глубинных условиях культивирования и новый аспект их использования"

РГо од

- S СЕН ш

На правах рукописи

Ольга Валерьевна

Биосинтез экзополисахаридов бактериями Bacillus mucilaginosus в глубинных условиях культивирования и новый аспект их использования

Специальность 03.00.23 - биотехнология Автореферат

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена в Санкт-Петербургском Государственном Технологическом институте (Техническом университете)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, ВИНОГРАДОВ

профессор,член-корр.АИН Евгений .Яковлевич

Научный консультант:

кандидат биологических наук, НЯНИКОВА

доцент Галина Геннадьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, ЯКОВЛЕВА

профессор Елена Павловна

кандидат биологических наук, СОРОКОЛЕТОВА

старший научный сотрудник Елена Федоровна

Ведущая организация:

Санкт- Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Защита диссертации состоится " 2000г. в_ часов

на заседании Диссертационного Совета Д 063.25.09 в Санкт-Петербургском Технологическом институте (Техническом университете).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Замечания и отзывы по работе, заверенные печатью, в одном экземпляре просим направлять по адресу: 198013, Санкт-Петербург, Московский пр., д, 26, Технологический институт, Ученый совет. Автореферат разослан " „СС&лЯ^- 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 063.25.09 Лисицкая Т.Б. £>{'

Актуальность В последнее время микробные полисахариды находят широкое применение в медицине, фармацевтической, пищевой, парфюмерной, нефтедобывающей и других отраслях промышленности. Интерес к бактериальным полисахаридам вызван их разнообразньм биологическим действием: они обладают иммуномодулирующей, антивирусной активностью, стимулируют кроветворение, эффективны при желудочно-кишечных заболеваниях. В связи с этим во многих странах мира ведется разработка способов получения полисахаридов путем микробиологического синтеза [Блинов Н.П., 19 84, У1«опо СгеБсепи, 1995].

Почвенный сапрофитный микроорганизм ВасШш тисИа%то$ш в процессе своей жизнедеятельности продуцирует внеклеточные полисахариды, которые находят применение в качестве препаратов направленного иммуномодулирующего действия [Виноградов Е.Я., 1973, Няникова Г.Г., 1990]. До сих пор полисахариды В, тисйа£1пст13 получали только путем поверхностного культивирования. Биосинтез в условиях глубинного культивирования продуцентов экономически и технологически более целесообразен и позволяет добиться существенного увеличения выхода целевых продуктов. Однако производство экзогликанов при глубинной ферментации сопровождается значительным увеличением вязкости среды, что затрудняет доступ кислорода к клеткам и снижает их метаболическую активность. Для решения этой проблемы необходимо, в частности, отработать режим аэрации, разработать состав жидкой питательной среды, исследовать факторы, оказывающие наиболее сильное влияние на биосинтетическую активность продуцента. Кроме того, использование специальных технологических приемов, таких, как подготовка посевного материала, иммобилизация клеток продуцента, поможет значительно повысить выход экзополисахаридов. Получение значительных объемов полисахаридов с учетом особенностей их химического строения позволит предложить новые способы их применения.

При производстве экзополисахаридов возникает проблема утилизации биомассы, как отхода производства. Биомасса В. тисПа§то5га богата аминокислотами, витаминами [Виноградов Е.Я.,1973] и может быть использована в качестве стимулятора роста микроорганизмов и азотсодержащего компонента

А

для приготовления микробиологических питательных сред. Рациональное использование биомассы может служить дополнительным доводом в пользу организации производства экзополисахаридов В. mucilaginosus как с точки зреиш экономики, так и с точки зрения экологии.

Все вышеизложенное дает основание считать данное исследование актуальным и представляющим практический интерес.

Работа выполнялась в рамках Межвузовской научно-технической программы П - 104 «Биотехнология» по направлению «Биохимический синтез лекарственных и биологически активных соединений».

Цель и задачи исследования Настоящая работа посвящена разработке основ биосинтеза экзополисахаридов бактериями Bacillus mucilaginosus в глубинных условиях культивирования, направленных на значительное увеличение целевого продукта.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: Установить факторы, оказывающие существенное влияние на биосинтетическую активность продуцента;

- Интенсифицировать биосинтез экзополисахаридов при глубинном культивировании продуцента;

- Определить влияние условий культивирования и состава питательной среды на химическое строение экзополисахаридов;

- Разработать способ переработки биомассы, являющейся отходом в производстве экзополисахаридов;

- Исследовать возможность использования экзополисахаридов, полученных при глубинном культивировании В. mucilaginosus, в качестве сорбента тяжелых металлов;

Научная новизна Впервые проведено комплексное исследование биосинтеза экзополисахаридов В. mucilaginosus в глубшшых условиях культивирования. Установлено, что на биосинтез экзополисахаридов оказывают влияние природа источников углерода и азота и соотношение этих компонентов в среде. Впервые показано, что дополнительное внесение источника углерода в питательную среду в стационарной фазе развития культуры В. mucilaginosus стимулирует синтез экзогликанов. От уровня снабжения бактерий кислородом

зависит химическое строение и количество образующихся экзополисахаридов. Выявлено положительное действие УФ-света на биосинтетическую активность продуцента. Обработка споровой суспензии В. тиЫ^тозш УФ-светом перед ферментацией увеличивает выход экзополисахаридов в 6.5 раз.

Определено, что средняя молекулярная масса экзополисахаридов В. muci¡aginosш варьирует в пределах 100-130 тыс Да, что говорит об их полидисперсности. Независимо от состава сред они относятся к к а - 1,4 -гетерогликанам и содержат глюкозу, галактозу, маннозу, уроновые кислоты. Условия культивирования и состав питательных сред влияют на соотношение функциональных групп в синтезируемых экзополисахаридах.

Впервые показано, что иммобилизация клеток В. тисг^тоБШ на хитиновых сорбентах повышает сорбционную способность экзополисахаридов в отношении ионов меди в 2.8 раза. Установлено, что экзополисахариды способствуют повышению эффективности иммобилизации клеток на сорбентах до 96%.

Практическая значимость Разработан состав питательной среды и режимы культивирования продуцента для производственного получения экзополисахаридов В. mucПaginosus (патент №2140454 от 27.10.99). На основе данных по культивированию продуцента в ферментаторе «Биотек-4» предложена схема безотходного цикла, позволяющая в едином технологическом процессе получать полисахариды, а биомассу после ферментативного гидролиза использовать в качестве компонента микробиологических питательных сред.

Особенности строения полисахаридов В. тиЫ^тозт позволили предложить новый способ их применения в качестве сорбентов тяжелых металлов. Комплексное исследование сорбционных свойств экзополисахаридов, биомассы В. тиЫ^то5и$ и агрохитина привело к созданию нового биосорбента способного из загрязненных почв инактивировать в течение десяти суток до 50% ионов меди. Особенности состава биосорбента позволяют пролонгировать его действие, устраняя негативное влияние тяжелых металлов на почвенную микрофлору, восстанавливая ее видовой состав, улучшая структуру и повышая плодородие почв.

Апробация работы Результаты работы были доложены на научно-технической конференции_аспирантов СПбГТИ (ТУ), посвященной памяти М.М. Сычева (С.-Петербург, 1997), на симпозиуме "Молодые ученые - экологии города" (С.-Петербург, 1997), на научи, конф."Международные ежегодные экологические чтения памяти К.К. Сент-Илера" (Воронеж, 1998), на научн. конф. «Фундаментальные и прикладные вопросы биотехнологии и медицины» (С.Петербург, 2000 г.)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 14 работ. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, шести глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов, списка литературы, приложения. Работа изложена на 167 страницах машинописного текста. В работу входит 23 рисунка и 36 таблиц . Библиография включает 155 наименований.

Содержание работы Обзор литературы состоит из 9 разделов, в которых описапы промышленно-значимые продуценты экзополисахаридов, основные области применения микробных полисахаридов, обобщены данные по механизмам биосинтеза, условиям и специфическим факторам, влияющим на синтез полисахаридов, показаны пути интенсификации биосинтеза, рассмотрены вопросы промышленного получения экзополисахаридов.

Материалы и методы исследования: Основным объектом исследования служила культура бацилл В. mucilaginosus, штамм ВКМ В-1446 Д. Культивирование проводили в колбах Эрленмейра вместимостью 750 мл на качалке с 200 об/мин и в ферментаторе «Биотек» с рабочим объемом 4 литра, при t = 36+1 °С, рН = 7.4+0.1, рОг - 20% -70%. Скорость прохождения кислорода через определенный объем питательной среды регистрировали с помощью шарикового ротаметра. Использовали плотную [Виноградов Е. Я.,1975] и жидкие среды, разработанные нами. Оптимизацию жидкой синтетической среды проводили экспериментально-аналитическим методом балансировки и методом последовательного варьирования концентраций компонентов. Биомассу определяли весовым методом по абсолютно сухому веществу и нефелометрически. Концентрацию остаточных редуцирующих

Сахаров определяли эбулиостатическим методом [Герхардт Ф., 1984]. рН определяли потснциометрически. УФ-облучению подвергали клеточную суспензию как в вегетативной, так и в споровой форме в концентрации 10 кл/мл в физиологическом растворе при длине волны 265 нм в разных временных режимах с помощью ламп ДБ-30. Полисахариды отделяли центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 минут. Выделение и очистку экзополисахаридов проводили общепринятым методом [Блинов Н.П., 1975]. Содержание полисахаридов определяли весовым методом и в реакции с фенолом и H2S04 [Захарова И.Л. и др., 1982]. Экспресс-оценку концентрации экзополисахаридов проводили по калибровочной кривой в зависимости от вязкости среды. Вязкость измеряли с помощью капиллярного вискозиметра стеклянного ВПЖ-2. ИК- спектры снимали на инфракрасном фурье-спектрофотометре ФСЛ-05. Молекулярную массу оценивали методом гель-фильтрации на сефадексе. Моносахаридный состав экзогликанов определяли с помощью метанолиза с последующим гидролизом 1н H2S04. Образующиеся соединения исследовали методом ТСХ в системе н-бутанол:этанол:вода 5:1:4 [Блинов Н.П., 1984]. После отделения полисахаридов биомассу подвергали термической обработке при t=95-105°C в течение 5-10 минут и гидролизовали пепсином, панкреатином или щелочной протеазой в концентрации 1-10 г/л в течение двух суток. Содержание общего азота определяли с реактивом Несслера, а аминного азота формольным титрованием [Герхардт Ф., 1984]. Ростовые свойства ферментативного гидролизата биомассы исследовали на тест-культурах: Escherichia coli, Bacillus mycoides, Saccharomyces cerevisiae, для культивирования которых использовали стандартные среды [Бергер М.О., 1982 ]. Иммобилизацию клеток В. mucilaginosus проводили на

хитине и агрохитине методом адсорбции [Синицын А.П., 1980]. Клеточную ?

суспензию с титром 10 кл/мл пропускали через сорбционную колонку со скоростью 0.02 мг/мл с соотношением суспензияхорбент 10:2,5. Клетки до и после иммобилизации подсчитывали по методу Коха. Медь извлекали биосорбептом из образцов дерпово-гумусных почв с влажностью от 74.62 до 91.97%. Сорбенты вносили в почву из расчета 0.5 %, а клеточную суспензию В. mucilaginosus - 2.5 мл с концентрацией 107-108 кл/мл. Пробы выдерживали в течение десяти дней при комнатной температуре и влажности 72%.

Концентрацию ионов меди в водной вытяжке почвы определяли на проточно-инжекционном анализаторе "FIA-STAR 5010". Структуру биосорбента

исследовали спектрофотометрическим методом (спектрометр «Pcrkin Elmer 16 PC»), Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента [Глотов Н.В., 1990]. Доверительные интервалы не превышают 5% при доверительной вероятности 0.95. Графики строились с использованием аппроксимации с точностью 95%.

Результаты исследования и их обсуждение 1. Биосинтез экзополисахарвдов В. mucilaginosus в глубинных

условиях культивирования. Глубинный способ культивирования продуцентов имеет ряд преимуществ перед поверхностным: возможность более тонкой регуляции условий культивирования, использование стандартного оборудования и получения значительных количеств целевого продукта при меньших затратах сырья. Из данных литературы известно, что при выращивании В. mucilaginosus на плотных средах интенсивный биосинтез экзополисахарвдов начинается в конце экспоненциальной фазы роста бактерий [Няникова Г.Г., 1990]. Следовательно, при переходе к культивированию в жидких средах необходимо использовать полноценную питательную среду для достижения максимально возможного прироста биомассы, способной к активным метаболическим процессам. Поэтому, на первом этапе работы оптимизировали жидкую питательную среду для роста и размножения культуры, содержащую глюкозу и соли. Выход биомассы на такой сиптегаческой сбалансированной среде в 6 раз превышает выход на полусинтетической несбалансировашюй, что свидетельствует об эффективном протекании метаболизма бацилл.

Известно, что способность к синтезу полисахаридов зависит от природы источника углерода [Гоголева Е.В., 1975, Блинов Н.П., 1984]. Оценка роста В. mucilaginosus на минеральных средах с глюкозой, сахарозой и мелассой показала, что культура проявляет наибольшую биосинтетическую активность на питательной среде, содержащей мелассу (табл. 1). Методом последовательного варьирования концентрации углеродного компонента в среде установлено, что среда, содержащая 8% мелассы и сбалансированная

Таблица 1

Рост В. mucilaginosus и синтез полисахаридов на средах с различными источниками углерода

Состав среды, % Биомасса, г/л Полисахариды, г/л

|im¿cá .- 8,Ü 0

1.29 ±0.02 2'56r30"í

K,S04. - 0,02

MsSOAtV 0,02

Míiü

сахароза - 4,00 1,30 + 0,07 1,82+0,04

те же соли

глюкоза-2.30 1.26+0.02 1.22+0.06

те же соли

по составу солей, обеспечивает достаточно высокую биосинтетическую активность культуры (состав среды выделен в табл. 1) и наиболее полную утилизацию углеродного компонента. Источники азота необходимы для нормального развития культуры и образования ферментов, ответственных за биосинтез экзогликанов. Было исследовано влияние на синтез экзополисахаридов азота, входящего в состав минеральных (NH4C1, (NH4)2S04, NaN03) и органических (пептоны семипалатинский ферментативный, «Serva» кислотный, «Serva» ферментативный, кислотный гидролизат казеина, электрохимический гидролизат гаммаруса) соединений. Установлено, что на средах, содержащих азот в форме аммония В. mucilaginosus проявляет большую биосинтетическую активность, чем на средах с азотом в нитро-форме. Это, вероятно, объясняется различным влиянием восстановленной и окисленной форм азота на углеродный метаболизм. Для большинства продуцентов органические соединения азота наиболее благоприятны для синтеза экзополисахаридов, т.к. культура сразу включает готовые аминокислоты в углеродный метаболизм, не затрачивая энергию на их синтез из минерального азота [Осадчая А.И. и др., 1975]. Действительно, выход экзополисахаридов В. mucilaginosus на среде с пептоном в 1.3 раза выше, чем на среде с хлоридом аммония. При этом наибольший выход экзополисахаридов обеспечивала среда с пептоном, содержащим аминный азот в количестве 2.1%, а наибольший выход биомассы-4.1%.

Таким образом, в результате проведенных исследований показана принципиальная возможность получения экзополисахаридов В. mucilaginosus в

глубинных условиях культивирования на сбалансированной среде следующего состава, г/л: меласса -80, пептон-10, Ка2НР04-4.49, 1у%804-0.15, К2Б04- 0.18. Максимальный выход полисахаридов на такой среде составил 3.4 г/л. Для достижения более высоких показателей необходимо определить факторы, оказывающие наиболее сильное влияние на биосинтетическую активность продуцента и подобрать условия для эффективного синтеза экзополисахаридов в глубинных условиях.

2. Интенсификация биосинтеза экзополисахаридов Б. тис11адтот$

Для интенсификации процесса биосинтеза необходимо знать не только его механизмы, но и факторы (рН, аэрация питательной среды, источники питания и др.), оказывающие наиболее существенное влияние на биосинтетическую активность продуцента в глубинных условиях культивирования. В условиях периодического культивирования синтезу внеклеточных полисахаридов благоприятствует создание избытка углерода в среде при некотором дефиците азота [Гоголева Е.В., 1975]. Поэтому дополнительное внесение углерода в среду в стационарную фазу не приводит к значительному повышению выхода биомассы, а существенно влияет на образование экзополисахаридов. Так, после внесения в среду мелассы (20 г/л по углероду) в середине стационарной фазы развития культуры выход экзополисахаридов в 1.75 раз превысил их выход в контроле. Добавление углерода в среду на стадии замедленного роста ингибирует биосинтез, так как, видимо, ферменты идиофазы еще неактивны, что приводит к избыточному накоплению углерода в среде и ингибировашно процесса развития культуры и синтеза метаболитов (рис.1)

Кислотность среды также оказывает существенное влияние на рост культуры и синтез экзополисахаридов. Поддержание рН около 7.4 обеспечивает более длительное развитие культуры. При этом выход биомассы превышает в 2.3 раза по сравнению со средой без корректировки рН, а биосинтез экзогликанов уменьшается в 1.3 раза. Максимальная биосинтетическая активность достигается при обычном развитии культуры, когда рН среды понижается до значения 5.5 (конец стационарной фазы - начало автолиза).

В. тисИа%то$и$ - факультативный аэроб, поэтому от уровня снабжения клеток кислородом существенно зависит состав и количество образующихся

т1

чб-.

и

¿5'

13'ИХВ 1бчззв

^вцис

«кпшрспь

□синтез экзсгаетжв ПИЕШШЯ >шрда

Рис. 1 Зависимость синтеза зкзогликанов от дополнительного внесения углерода в среду

на стадии замедленного роста(13 часов)и стационарной фазы (16 часов)

экзополисахаридов. Так, при культивировании В. тисйа&позиз в колбах установили, что чем меньше объем среды, тем выше биосинтетическая активность продуцента. Эти результаты указывают на то, что повышение содержания кислорода в среде способствует увеличению выхода экзополисахаридов. Данное предположение нашло подтверждение при культивировании В. тисИарпозш в лабораторном ферментаторе «Биотек-4». Установлено, что процесс развития культуры, интенсивность метаболизма находятся в прямой зависимости от насыщения кислородом питательной среды (рис. 2). Оптимальной концентрацией растворенного кислорода в среде для развития культуры является р02=20%, а для синтеза полисахаридов - 70%. В ферментаторе процесс развития культуры идет

>.

I ч. о

с. . =

! 5-5 3 ь

я

в< Й

я я

о

И

10 8

6 -4 , 2 '

О

'¿О

кО

й

10

Рис. 2 Зависимость образования экзополисахаридов и биомассы В. тисИазтозия от концентрации кислорода в среде

60

.......... __ _Р

' □ Биомасса, г/л О Полисахариды, г/л

&0

интенсивно, что объясняется высоким уровнем массообмена, который достигается регуляцией аэрации среды. Доя промышленного получения экзополисахаридов важно знать динамику их накопления и время максимального выхода. Соответствующие экспериментальные данные отражены на рис. 3. Максимальный выход биомассы наблюдался к 9.5 часам (9.3 г/л), а полисахаридов к 14 ч (6.1 г/л). При недостаточном насыщении среды кислородом (в колбах) пик максимального выхода экзогликанов наблюдается лишь к 18.5 часам, что является нежелательным при их промышленном получении, так как производство становится менее рентабильным.

, Рис. 3 Динамика роста ) В. тисИа£то$из и биосинтеза экзополисахаридов

20

I

При выборе факторов, влияющих на биосинтез экзогликанов, следует учитывать биологические особенности продуцента. Образование внеклеточного полисахарида бактериями В. тисИа&позш является ответной реакцией на неблагоприятные воздействия среды (высушивание, солнечная радиация, голодание) в условиях их естественного обитания [Милсвский Е. И., 1966 ]. В связи с этим для увеличения выхода полисахаридов можно использовать факторы, которые имитировали бы действие стрессовых условий. Действительно, при облучении споровой суспензии клеток (посевного материала) УФ-светом перед ферментацией (табл.2) биосинтетическая активность продуцента повышается в 6.5 раз. В то же врем аналогичное воздействие на вегетативные клетки приводит к их гибели.

Бремя,час

Таким образом, в результате проведенных экспериментов установлено,что наиболее сильное влияние на выход экзополисахаридов В. тисИа&повиз оказывает УФ-облучение посевного материала,который используется в виде спор.

Таблица 2

Обработка УФ-светом посевного материала В. тисИа&похш

Вариант культуры Биомасса, г/л Полисахариды, г/л

Контроль 2.50+0.08 1.55±0.03

Облученные споры 0.84±0.09 12;53'±0.41:

Наряду с УФ-облучением значительную роль в интенсификации биосинтеза играет аэрация питательной среды и дополнительное внесение углерода на стадии стационарной фазы развития культуры. Биосинтез экзополисахаридов в этих случаях увеличиватся в 1.8 раз (рис.4).

120%

180%

180%

650%

Рис. 4 Диаграмма влияния различных

факторов на биосинтез экзополисахаридов

При производстве экзополисахаридов биомасса бактерий становится отходом производства, который нужно утилизировать. Биомасса В. mucilaginosus содержит полноценный белок, витамины и может быть использована как азотсодержащий компонент микробиологических питательных сред и стимулятор роста микроорганизмов. Был разработан способ гидролиза биомассы В. тиа^Ыозия панкреатином с предварительной термической обработкой. В результате был получен комплексный препарат, который может служить и белковой основой (пептоном) и стимулятором роста в составе микробиологических питательных сред. Препарат представляет собой ферментативный гидролизат биомассы В. тисИа%\по$ш и имеет высокое содержание общего азота (15-16 % от сухих веществ), аминного азота (7-8%) и биологически активных веществ. Замена пептона и дрожжевого экстракта на

равное количество по сухому веществу комплексного препарата при выращивании генноинженерного штамма BL-21 Е. coli позволило увеличить выход биомассы на 57 % и значительно сократить время культивирования.

Таким образом, выявлены факторы, позволяющие добиться существенного увеличения выхода экзогликанов В. mucilaginosus почти в 10 раз, а отход их производства биомассу после ее гидролиза применять в качестве основы микробиологических питательных сред.

3. Влияние состава питательной среды и условий культивирования на химическое строение экзополисахаридов В. mucilaginosus.

Синтез экзополисахаридов весьма лабилен и зависит от изменений условий культивирования [Безбородое A.M., 1991, Гоголева Е.В., 1975, Пирог Т.П., 1998]. Поэтому очень важно знать меняется ли химическое стороение экзополисахаридов при переходе к глубинным условиям выращивания, когда изменяется состав среды и требуются другие параметры культивирования (pH, р02). Для этого провели сравнительный анализ строения экзополисахаридов В. mucilaginosus, синтезированных на плотной и в жидких средах. Было установлено, что независимо от состава среды и интенсивности аэрации, глюкоза, галактоза, манноза и уроновые кислоты являются основными компонентами экзогликанов. Средняя молекулярная масса экзополисахаридов во всех случаях варьировала от 100 до 130 тыс. Да, что говорит о полидисперсности данных продуктов. Химическое строение экзополисахаридов исследовали методом ИК-спектрофотометрии. Для всех экзополисахаридов характерными являются следующие полосы поглощения: в области 2950 см "проявляются полосы

-I

поглощения валентных колебаний С-С-связей; в области 3600-3200 см имеется широкая полоса гидроксильных и NH-ipyim; асимметричные валентные колебания С-О-С-связей проявляются в области 1150-1030 см~; валентные колебания карбонильных групп имеют интенсивную полосу 1600-1720 см.ЭПС являются а-сахарами,т.к. имеют полосу в области 844 см.1йаличие полосы 930 и

-I

758 см позволяют идентифицировать гликозидную связь как а-1,4 (рис.5). Анализ интенсивности ИК-спектров показал, что у экзополисахаридов, синтезированных на плотной среде (глюкозо-казеиновая) - 1, преобладают кислые группы по-сравнению с экзополисахаридами, полученными в жидких средах - 2, 3. Вероятно,

достаточно хорошая аэрация при росте на плотных средах способствует более активному протеканию процесса биосинтеза и последующему окислению экзополисахаридов. Кроме того, содержание -СООН- и -ОН-групп у экзополнсахаридов, синтезируемых на комплексных средах (меласса, пептон) - 2 выше, чем на синтетических средах (сахароза, минеральные соли) - 3. Обогащенные питательные среды способствуют более интенсивному метабализму бацилл и, в конечнм итоге, это сказывается на степень окисленности полисахарида. Таким образом, показано, что состав питательных сред и условия аэрации существенно влияют на соотношение функциональных групп в полисахаридах. Так, экзополисахариды, синтезируемые на плотных средах содержат больше кислых групп, которые определяют их иммуномодулирующие свойства. В жидкой среде с мелассой и пептоном синтезируются экзополисахариды с большим содержанием гидроксильных групп по-отношешпо к карбоксильным, в результате чего такие полисахариды способны сорбировать тяжелые металлы, связывая их в прочный комплекс. Следовательно, регулируя условия культивирования и состав среды можно получать экзополисахариды с разными свойствами, что расширяет область их применения.

4. Создание и исследование нового биосорбента на основе биомассы и экзополисахаридов В. тиа^то5и$.

Получение экзополисахаридов В. mucilaginosus с высокими сорбционными свойствами и возможность значительного увеличения выхода этих продуктов позволили разработать новый способ их использования. Эксперименты по

ч-2.

Рис.5 ИК-спектры экзополисахаридов.

биосорбции меди (эталона (¡-элементов тяжелых металлов) из дерново-гумусных

почв показали, что клеточная суспензия В. тиЫ^тохиз, обогащенная

экзополисахаридами, сорбирует ионы меди в 4.4 раза активнее, чем клеточная

суспензия без экзополисахаридов. Для повышения сорбционной способности

полисахаридов и клеточной суспензии В. тисИа§то$из провели иммобилизацию

клеток. Иммобилизации подвергали клетки, находящиеся в конце стационарной

фазы, когда происходит активный синтез экзополисахаридов. В качестве

носителей впервые использовали хитин и его производные. Выбор носителя был

обусловлен способностью его к комплексообразованию с тяжелыми металлами и

радионуклеидами, а также развитой удельной поверхностью (в= 1.8 мг/г).

Благодаря экзополисахаридам достигалась более полная и необратимая адгезия

клеток на носителе. Механизм положительного влияния экзогликанов на

иммобилизацию клеток можно объяснить образованием между

экзополисахаридами и частицами сорбента межмолекулярных водородных связей,

возникновением сложных ассоциатов, в результате чего полнота и эффективность

адсорбции повышается. Среди исследованных носителей (хитин, агрохитин,

хитин с сорбированными ионами меди) наиболее подходящим для сорбции

клеток В. тисйа§то$ш оказался агрохитин (96.4% иммобилизованных клеток).

Таким образом, был создан новый биосорбент, представляющий собой агрохитин

с иммобилизованными живыми клетками В. тисНа&позия, вырабатывающими

экзополисахариды.

Особенности структуры биосорбента иллюстрируют ИК- спектры,

представленные на рис. 6. Увеличения площади пиков амино-групп (3107 и 3207 -1

см ) и изменения пропускания в области 1500 см, характерной для аминных и

ацетамидных групп свидетельствуют об увеличении веществ белковой природы в

биосорбенте в сравнении с агрохитяном. Эти данные подтверждают факт

иммобилизации клеток В. тиЫ^тояиз на сорбенте-агрохитине. В области

-1

волновых чисел 2800-1900 см , характерной для поглощения симметричных и

-I

асимметричных С-Н связей, и в области 1000-1070 см, характерной для симметричных и асимметричных С-О-С связей, наблюдается уменьшение пропускания, что указывает на присутствие полисахарида в биосорбенте. Об образовании межмолекулярных связей между сорбентом и полисахаридом

свидетельствует изменение пропускания в области 3200 см. Эффективность биосорбента исследовали путем снятия изотерм сорбции из водных растворов различных концентраций нитрата меди в сравнении с хитином и хитозаном. Как видно из графиков (рис. 7), биосорбент обладает улучшенными сорбционными свойствами по-сравнению с хитином и приближается по величине сорбционной емкости к хитозану. Одинаковый ход сорбционных кривых, построенных в логарифмических координатах, свидетельствует о сопоставимости связи сорбент-переходный металл, что, в некоторой степени, раскрывает механизм сорбции. Сорбционная емкость биосорбента в 3 раза выше, чем у хитина. Улучшение сорбционных свойств биосорбента можно объяснить наличием на поверхности сорбента иммобилизованной бактерии, вырабатывающей экзополисахариды.

[ООО /ЮО &СО К0О ЗООО 3500

Волновое число) 1/см

1п С[ммоль/л]

Рис.6 ИК-спектр биосорбента

Рис.7 Изотермы сорбции ионов меди(2+): 1. -биосорбент; 2. хитин; 3.- хитозан

Сорбционные свойства разработанного биосорбента указывают на то, что его можно использовать для связывания тяжелых металлов в нетоксичные комплексы. Действительно, в экспериментах с образцами дерново- гумусных почв, загрязненных токсичными концентрациями меди, клеточная суспензия В. тисИа&поня с экзополисахаридами снижает концентрацию меди иа 16.7%, агрохитин - на 25%, а биосорбент на 50% Такая высокая эффективность биосорбента объясняется, вероятно, синергическим эффектом иммобилизованных клеток на агрохитине. Кроме того, биосорбент за счет иммобилизованых бактерий характеризуется пролонгирующими свойствами и способен улучшать почвенную микрофлору.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, в результате проведенной экспериментальной работы сделан важный для практики переход к получению экзополисахаридов В. тиа^товия в глубинных условиях культивирования. Разработана питательная среда для получения экзогликанов и установлены наиболее значимые факторы, позволяющие интенсифицировать процесс биосинтеза экзополисахаридов. Решена проблема увеличения вязкости питательной среды в ферментаторе путем подачи раствора мелассы в среду, когда культура находится в стационарной фазе роста. Путем тонкой регуляции аэрации питательной среды и управляемого культивирования можно получать экзогликаны с разными свойствами, что расширит сферу их применения. Поэтому дальнейшее исследование должно бьггь направлено на детальное изучение влияния состава питательной среды, аэрации и других факторов на механизмы биосинтеза и структуру экзополисахаридов. Исследование особенностей химического строения экзополисахаридов позволило предложить еще один способ использования экзогликанов в качестве сорбентов тяжелых металлов. На основе экзополисахаридов, клеток В. тисПаятозиз и агрохитина создана высокоэффективная экореабилитирующая добавка в почву.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны основы биосинтеза экзополисахаридов бактериями В. mucilagino.su.'; в глубинных условиях культивирования. Установлены факторы, оказывающие наиболее существенное влияние на выход экзополисахаридов: рН среды, интенсивность аэрации, соотношение углерода и азота в среде. Кроме того, впервые показано, что выход экзополисахаридов можно увеличить более, чем в 6,5 раз путем УФ-облучения посевного материала (в виде споровой суспензии).

2. Предложена новая питательная среда для глубинной ферментации В. mucilaginosus в условиях промышленного получения экзополисахаридов (патент № 2140454). Установлено, что использование пептона увеличивает выход экзополисахаридов в 1,3 раза по сравнению с минеральными источниками азота. Биосинтетическая активность на мелассно-пептонной среде выше в 2 раза, чем на глюкозо-солевой и сахарозо-солевой средах. Подача углерода в среду в стационарной фазе развития культуры приводит к увеличению выхода полисахаридов в 1.8 раза.

3. Максимальный синтез экзополисахаридов наблюдается при достаточно интенсивной аэрации (р02=70%). Концентрация растворенного кислорода в среде влияет на скорость накопления экзополисахаридов и на их качественный состав. Так, при высокой степени аэрации в экзополисахаридах увеличивается содержание -СООН-групп.

4. Установлено, что независимо от состава среды и условий культивирования В. mucilaginosus экзополисахариды относятся к а-1,4-гликанам, в состав которых входят глюкоза, галактоза, манноза и уроновые кислоты. Средняя молекулярная масса экзополисахаридов варьирует от 100 до 130 тыс Да.

5. Разработан новый комплексный препарат, который может служить белковой основой и стимулятором роста в составе микробиологических питательных сред. Препарат представляет собой ферментативный гидролизат биомассы В. mucilaginosus, являющейся отходом в производстве экзополисахаридов.

6. Установлено, что экзополисахариды обладают сорбционными свойствами в отношении ионов меди. Иммобилизация клеток В. mucilaginosus на хитиновых сорбентах приводит к улучшению сорбционных свойств экзополисахаридов в 2.8 раза. Эффективным носителем для иммобилизации клеток В. mucilaginosus служит агрохитин (степень иммобилизации достигает 96,4%).

7. Предложен новый способ использования экзополисахаридов В. mucilaginosus в составе комплексного сорбента для восстановления и улучшения почв, загрязненных тяжелыми металлами. Созданный биосорбент состоит из агрохитина и иммобилизованных на нем клеток В. mucilaginosus, вырабатывающих экзополисахариды,

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пестова О.В. Биосинтез экзополисахарида Bacillus mucilaginosus на средах различного состава//Тез. докл. научн.-технич. конф. аспирантов СПГТИ(ТУ), посвященной памяти М.М. Сычева, 24-25 мая 1997 г.- С-Петербург, 1997.-С.124.

2. Пестова О.В., Няникова Г.Г. Изучение условий биосинтеза экзополисахарида Bacillus mucilaginosus// Медицина, наука, практика.-Махачкала: ДНЦ РАМН, 1997,- №5,- С.15.

3. Пестова O.B. Перспективы использования иммобилизованных клеток Bacillus mucilaginosus//Te3. докл. симпозиума " Молодые ученые-экологии города",8 декабря 1997 г.- С.- Петербург, 1997.- С.ЗО.

4. Няникова Г.Г., Пестова О.В. Использование иммобилизации клеток микроорганизмов в получении продуктов биосинтеза//Академия.- 1997,- №4,-С.37-39.

5. Виноградов Е.Я., Няникова Г.Г., Пестова О.В. Некоторые аспекты практического использования экзополисахаридов Bacillus mucilaginosus/ZAKafleMM.- 1997.- №4.- С.55-56.

6. Няникова Г.Г., Пестова О.В., Виноградов Е.Я. Синтез полисахарида слизсобразующими бациллами/Международная академия,- 1998,- №4-ЗС,- С.6-8

7. Новый экореабилитирующий сорбент в грунт/О.В. Пестова, Г.Г. Няникова, Е.Э. Куприна, C.B. Водолажская, Е.Я. Виноградов// Первые международные ежегодные экологические чтения памяти К.К. Сент-Илера: Сб. научн. тр.- Воронеж, 1998,- С.127.

8. Биосинтез экзополисахаридов Bacillus mucilaginosus на различных питательных средах/О.В. Пестова, C.B. Водолажская, Г.Г. Няникова, Е.Я. Виноградов //Тез. докл. Междунар. наун.-практ. конф. "Разработка и производство диагностических питательных сред и микротсстсистем", 27-28 августа 1998г.- Махачкала, 1998,- С.27.

9. Экологический аспект использования иммобилизованных клеток Bacillus mucilaginosus / О.В. Пестова, Г.Г. Няникова, М.В. Рутто, Е.Э. Куприна.,Е.Б. Бобикова, Е.Я. Виноградов // Тез. Пятой Междунар. Открытой межвузовскоой научн,- пракг. конф. "Региональные проблемы прикладной экологии", 22-25 сентября 1998 г. - Белгород, 1998. - С.75.

10. Патент № 2140454 С 12 Р 19/04. Способ получения полисахарида Bacillus mucilaginosus (РФ)/Г.Г. Няникова, О.В. Пестова, Е.Я. Виноградов, М.В. Рутго.- Заявл. 09.06.98; Опубл. 27.10.99., Бюл.Ла 30,- 5 с.

11. Пестова О.В., Няникова Г.Г., Виноградов Е.Я. Строение экзополисахаридов Bacillus mucilaginosus и новые аспекты их применения // Тез. докл. научн.-практич. конф. «Биотехнология в ФЦП «Интеграция», октябрь,1999,-СПб.-С. 52-53

12. Няникова Г.Г., Виноградов Е.Я., Пестова О.В. Оптимизация условий биосинтеза полисахарида иммуностимулирующего действия//Тез.докл. VI Междунар. конференции «Наукоемкие химические технологии», 25-29 октября 1999г.-Москва, 1999. - С.167-168.

13. Some applications of chitins obtained by electrochemical method for purification of contaminated soil / Elena Kuprina, Irina Kozlova, Galina Nianikova, Olga Pestova // Chitin and Chitozan. - Poland: Polish Chitin Society, 1999. - S. 99-114.

14. Биологические свойства экзополисахаридов Bacillus mucilaginosus/ Г.Г. Няникова, Е.Я. Виноградов, О.В. Пестова, М.М. Расулов // Тез докл. научн,-технич. конф. «Фундаментальные и прикладные проблемы биотехнологии и медицины», 19-20 апреля 2000 г. - С.-Петербург, 2000. - С. 45-46

25.05.00г. Зак.110-65РТП Ж «Синтез» Московский пр., 26

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пестова, Ольга Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 .АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР 1.1 Экзополисахариды микроорганизмов, их физико-химические свойства.

1.2. Биохимические основы биосинтеза экзополисахаридов.

1.3. Влияние условий культивирования на биосинтез, физико-химические и биологические свойства экзополисахаридов.

1.4. Образование экзополисахаридов в процессе роста продуцентов.

1.5. Технологические приемы, оказывающие влияние на биосинтез экзополисахаридов.

1.6.Способы промышленного получения экзополисахаридов.

1.7. Сферы практического использования экзополисахаридов.

1.8. Экзополисахариды Bacillus mucilaginosus и области их применения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосинтез экзополисахаридов бактериями Bacillus mucilaginosus в глубинных условиях культивирования и новый аспект их использования"

В последнее время микробные полисахариды находят широкое применение в медицине, фармацевтической, пищевой, парфюмерной, нефтедобывающей и других отраслях промышленности. Интерес к бактериальным полисахаридам вызван их разнообразными физико-химическими свойствами и биологическим действием: они обладают иммуномодулирующей, антивирусной активностью, стимулируют кроветворение, эффективны при желудочно-кишечных заболеваниях. В связи с этим во многих научно-исследовательских лабораториях ведущих стран мира проводится разработка эффективных способов получения полисахаридов путем микробиологического синтеза. К промышленно-значимым полисахаридам относятся следующие: декстран, ксантан, геллан, склероглюкан, курдлан, пуллулан. В середине 60-х годов XX столетия на биотехнологических предприятиях США начинается выпуск микробных полисахаридов. В настоящее время крупнотоннажное производство ксантана налажено в США компанией «Келко» и во Франции компанией «Биосинтез-Мелле». По валовому производству полисахаридов 1-ое место занимают США и Европейские страны. По ассортименту данных продуктов (особенно для косметики и фармации) приоритет принадлежит Япония. В России объем промышленного производства полисахаридов невелик: на Красноярском заводе медпрепаратов налажено производство аубазидана, создана опытно-промышленная установка для наработки маннана, осваивается промышленное производство продигиозана [Блинов Н.П., 1984, Vittorio Crescenzi, 1995].

Микробные полисахариды, как правило, представляют собой смесь молекул разной молекулярной массы, но одинакового химического строения [Блинов Н.П., 1984]. Почвенный сапрофитный микроорганизм Bacillus тисИа^тош8 в процессе своей жизнедеятельности продуцирует экзополисахариды (ЭПС). Установлено, что ЭПС В. тисИа&позш состоит из высокомолекулярной фракции и низкомолекулярной фракции [Няникова Г.Г., 1990]. В работах Милевского Е.И. (1974), Виноградова ЕЛ. (1973), Няниковой Г.Г. (1990) показана ярко выраженная иммуностимулирующая активность ЭПС В. тиЫ^тоБт, доказана их безвредность для организма животных. Возможные области применения ЭПС В. тисг^тояш не ограничиваются медициной и ветеринарией. Так, при закачке в буровые скважины полисахаридов В. тисИа&поБш повышаются крепящие свойства промывочной жидкости [Виноградов Е.Я., 1973]. С целью использования ЭПС в клинической практике и в других отраслях промышленности (нефтедобывающая, фармацевтическая - при производстве иммуномодулирующих препаратов) представляется очевидной необходимость наработки значительных количеств ЭПС В. тисйа%1по$ж. На отечественных биотехнологических предприятиях полисахариды получают только глубинным способом, так как этот способ, по-сравнению с поверхностным культивированием, более дешевый, менее трудоемок и технологически легко осуществимый. К сожалению, полисахариды В. тисйа^товш до сих пор получали только на плотных питательных средах, что не позволяет производить их в больших количествах. Однако ничего не известно о синтезе этих ЭПС в условиях глубинного культивирования. Для получения полисахаридов с высоким выходом необходимо не только знать механизмы биосинтеза ЭПС, но и , вероятно, разработать состав питательной среды, исследовать факторы, оказывающие наиболее сильное влияние на биосинтетическую активность продуцента. Кроме того, использование специальных технологических приемов таких, как иммобилизация клеток продуцентов, подготовка посевного материала, внедрение специального оборудования, могут значительно повысить выход ЭПС при глубинном культивировании продуцента.

При крупномасштабном производстве ЭПС возникает проблема утилизации биомассы - отхода производства. Биомасса В. mucilaginosus богата аминокислотами, витаминами, микроэлементами и может быть использована в качестве источника полноценного белка, кормовой добавки в сельском хозяйстве. При создании рентабельного, малоотходного производства полисахаридов необходимо использовать не только дешевое и доступное сырье, но и создать такую биотехнологическую схему, которая позволит одновременно получать ЭПС и биомассу В. mucilaginosus, а также найти пути рационального использования этих ценных продуктов.

Настоящая работа посвящена исследованию биосинтеза ЭПС В. mucilaginosus в глубинных условиях культивирования и возможности интенсификации данного процесса для получения полисахаридов с высоким выходом, а также разработке на основе данных по химическому строению ЭПС, полученных в условиях глубинного культивирования, нового способа их использования.

Работа выполнялась в рамках Межвузовской научно-технической программы П - 104 «Биотехнология» по направлению «Биохимический синтез лекарственных и биологически активных соединений».

Цель и задачи исследования Настоящая работа посвящена разработке основ биосинтеза экзополисахаридов бактериями Bacillus mucilaginosus в глубинных условиях культивирования, направленных на значительное увеличение целевых продуктов.

Для осуществления поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

Установить факторы, оказывающие существенное влияние на биосинтетическую активность продуцента;

- Интенсифицировать биосинтез экзополисахаридов при глубинном культивировании продуцента;

- Определить влияние условий культивирования и состава питательной среды на химическое строение экзополисахаридов;

Разработать способ переработки биомассы, являющейся отходом в производстве экзополисахаридов;

- Исследовать возможность использования экзополисахаридов, полученных при глубинном культивировании бактерий В. тисйа^тоБш, в качестве сорбента тяжелых металлов;

Научная новизна Впервые проведено комплексное исследование биосинтеза экзополисахаридов В. гутЫ^тоят в глубинных условиях культивирования. Установлено, что на биосинтез экзополисахаридов оказывают влияние природа источника углерода и азота и соотношение этих компонентов в среде. Впервые показано, что внесение источника углерода в среду в стационарной фазе развития культуры В. тиы^тозш стимулирует синтез экзополисахаридов. От уровня снабжения бактерий кислородом зависит химическое строение и количество образующихся экзополисахаридов. Выявлено положительное действие УФ-света на биосинтетическую активность продуцента. Обработка споровой суспензии В. mucilaginosus УФ-светом перед ферментацией увеличивает выход экзополисахаридов в 6.5 раз.

Определено, что средняя молекулярная масса экзополисахаридов В. тим^тояш варьирует в пределах от 100-130 тыс Да., что говорит об их полидисперсности. Независимо от состава сред они относятся к к а - 1,4 -гетерогликанам и содержат глюкозу, галактозу, маннозу, уроновые компоненты. Условия культивирования и состав питательных сред поразному влияют на соотношение функциональных групп в синтезируемых экзополисахаридах.

Впервые показано, что иммобилизация клеток В. mucilaginosus на хитиновых сорбентах повышает сорбционную способность экзополисахаридов в отношении ионов меди в 2.8 раза. Установлено,что экзополисахариды способствуют повышению эффективности иммобилизации клеток на сорбентах до 96 % .

Практическая значимость Разработан состав питательной среды и режимы культивирования продуцента для производственного получения экзополисахаридов В. тисйа&пойш (патент №2140454 от 27.10.99). На основе данных по культивированию продуцента в ферментаторе «Биотек-4» предложена схема безотходного цикла, позволяющая в едином технологическом процессе получать полисахариды, а биомассу гидролизовать и использовать в качестве источника аминокислот, витаминов и микроэлементов.

Особенности строения полисахаридов В. тисйа^товш позволили предложить новый способ их применения в качестве сорбентов тяжелых металлов. Комплексное исследование сорбционных свойств экзополисахаридов, биомассы В. mucilaginosus и агрохитина привело к созданию нового биосорбента способного из загрязненных почв инактивировать в течение десяти суток до 50% ионов меди, значительно минимизируя содержание тяжелых металлов. Особенности состава биосорбента позволяют пролонгировать его действие, устраняя негативное влияние тяжелых металлов на почвенную микрофлору, восстанавливая ее видовой состав, улучшая структуру и повышая плодородие почв.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Пестова, Ольга Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. Разработаны основы биосинтеза экзополисахаридов бактериями В. тисИа^поБЖ. Установлены факторы, оказывающие наиболее существенное влияние на биосинтетическую активность продуцента: рН среды, интенсивность аэрации, соотношение углерода и азота в среде. Кроме того, впервые показано, что выход экзополисахаридов можно увеличить более, чем в 6,5 раз путем УФ-облучения посевного материала (в виде споровой суспензии).

2. Предложена новая питательная среда для глубинной ферментации В. тисИа&позш в условиях промышленного получения экзополисахаридов (патент № 2140454). Установлено, что использование пептона в качестве источника азота увеличивает выход экзополисахаридов в 1,3 раза по сравнению с минеральными источниками азота. Биосинтетическая активность на мелассно-пептонной среде выше в 2 раза, чем на глюкозо-и сахарозо-солевых средах. Подача углерода в среду в стационарной фазе развития культуры приводит к увеличению выхода полисахаридов в 1.8 раз.

3. Максимальный синтез ЭПС наблюдается при достаточно интенсивной аэрации (р02=70%). Концентрация растворенного кислорода в среде влияет как на динамику накопления ЭПС, так и на время их максимального выхода. В зависимости от аэрации питательной среды изменяется не только выход ЭПС, но и их качественный состав. При высокой степени аэрации в ЭПС увеличивается содержание -СООН-групп.

148

4. Установлено, что независимо от состава сред и условий культивирования ЭПС В. тисйа^тозж относятся к 1,4-гликанам, в состав которых входят глюкоза, галактоза, манноза и уроновые кислоты. Средняя молекулярная масса ЭПС варьирует от 100 до 130 тыс Да.

5. Разработан новый комплексный препарат, который может служить белковой основой и стимулятором роста в составе микробиологических питательных сред. Преперат представляет собой ферментативный гидролизат биомассы В. тисг^1по5и8, являющейся отходом в производстве экзополисахаридов.

6. Установлено, что ЭПС обладают сорбционными свойствами в отношении ионов меди. Иммобилизация клеток В. тисИа&поъж на хитиновых сорбентах приводит к улучшению сорбционных свойств ЭПС в 2.8 раза. Эффективным носителем для иммобилизации клеток В. тисйа&позж служит агрохитин (степень иммобилизации достигает 96,4%).

7. Предложен новый способ использования ЭПС В. тисйа^тоБШ в составе комплексного сорбента для восстановления и улучшения почв, загрязненных тяжелыми металлами. Созданный биосорбент состоит из агрохитина и иммобилизованных на нем клеток В. тиа^то8ж, вырабатывающих ЭПС.

5.8 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования особенностей химической строения ЭПС и возможность их получения в достаточно большом количестве позволяют предложить новые пути их использования. Установлено, что клеточная суспензия В. тиа^тояш, обогащенная ЭПС, сорбирует ионы меди в 4.4 раза больше, чем клеточная суспензия без ЭПС. Данный факт объясняется особенностями пространственной конфигурации ЭПС и образованием сложных комплексов полисахарид-металл. Комплекс образуется за счет коордиционных связей между -ОН и -СООН-группами. Химический анализ ЭПС, полученных при культивировании продуцента в жидких и на плотной средах показал, что экзогликаны, выделенные из жидкой среды содержат большее количество -ОН-групп, что также увеличивает их эффективность связывания с тяжелыми металлами. Тогда как ЭПС, полученные на плотной среде, содержат больше кислых групп, что, возможно, и объясняет их сильновыраженные иммуномодулирующие свойства. Нами впервые показано положительное влияние ЭПС на эффективность иммобилизации клеток В. тисИа%1по8№ на хитиновых сорбентах. Иммобилизацию клеток следует проводить тогда, когда культура достигает конца стационарной фазы, и начинает активно синтезировать ЭПС. Лучшим сорбентом для иммобилизации клеток В. mucilaginosus оказался агрохитин (96.4% иммобилизованных клеток соответственно). При иммобилизации клеток В. тисйа^тозт на агрохитине выявлен синергический эффект хитинового сорбента и ЭПС бактерии в отношении сорбции тяжелых металлов. Результаты ИК-спектрофотометрического анализа биосорбента (иммобилизованные клетки В. тисИадтояш на агрохитине) позволяют сделать вывод, что биосорбент связывает катионы металлов в прочный комплекс и обратной диффузии металлов в почву не происходит.

В результате проведенной интенсификации биосинтеза ЭПС продуцентом, помимо самого полисахарида образуется достаточно много биомассы, которая становится отходом производства. Опыты по ферментативному гидролизу биомассы позволили предложить способ ее переработки, что делает процесс получения полисахаридов экономически целесообразным и практически безотходным. Биомасса В. тисйа&позш - это ценный источник белка, витаминов, микроэлементов. Все это свидетельствует о перспективности использования данного объекта в качестве основы для получения питательных сред, для приготовления

136 которых в микробиологической практике используют дорогостоящие и дефицитные источники белка.

Таким образом, комплексное исследование сорбционных свойств ЭПС, биомассы В. тисИа&пояш и агрохитина привело к созданию нового биосорбента, способного инактивировать из загрязненных почв в течение десяти суток до 50% ионов меди, значительно минимизируя содержание тяжелых металлов. Кроме того, внесение разработанного биосорбента в почву, содержащего живые клетки бацилл, способствует обогащению почв живой микрофлорой, повышает плодородие и урожайность почв.

ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

6.1. ПЕРСПЕКТИВЫ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДОВ В ГЛУБИННЫХ УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Микробные экзополисахариды -биополимеры, производство которых напрямую зависит от условий выращивания продуцентов. Поверхностное культивирование исключает возможность управление процессом биосинтеза, требует нестандартного дорогостоящего оборудования, сложно масштабировать процесс. Кроме того, образование ЭПС на плотных питательных средах приводит к незначительному выходу продуктов, что ограничивает применение ЭПС в таких отраслях, как нефтедобывающая промышленность, в качестве сорбентов тяжелых металлов. Поэтому в данной работе сделан важный для практики переход к получению ЭПС в глубинных условиях культивирования В. mucilaginosus: разработана жидкая питательная среда и установлены факторы, способствующие максимальному накоплению данных продуктов (рис.1).

Производство экзогликанов в условиях глубинной ферментации имеет свои особенности и технологические трудности. Отрицательной стороной глубинного культивирования продуцентов ЭПС является увеличение вязкости среды в ферментаторе, поэтому культура быстро начинает испытывать недостаток в кислороде и в других компонентах питания. Кроме того, у микроорганизмов снижается энергетический баланс и тормозится синтез полисахаридов [155]. Решить эту проблему можно с помощью подбора оптимальной конструкции ферментатора, мешалки, отработкой режима перемешивания и подачи кислорода [6]. В данной работе для снижения вязкости среды предлагается добавлять 4-х % раствор мелассы (источник углерода) в питательную среду в середину стационарной фазы, что

120%

180%

650%

Рис. 6.1 Диаграмма влияния различных факторов на биосинтез ЭПС приводит не только к благоприятному для синтеза ЭПС избытку углерода по отношению к азоту, но и к разведению среды, благодаря чему вязкость ее понижается и доступ кислорода и питательных веществ к клеткам продуцента облегчается. При дополнительном внесении углерода в среду выход ЭПС увеличивается в 1.8 раз, вероятно, как за счет избытка углерода, так и за счет понижения вязкости среды.

Значительную роль в интенсификации биосинтеза играет аэрация питательной среды, так как В. mucilaginosus является факультативным аэробом. При высоких значениях растворенного кислорода в питательной среде (р02 = 70%) выход ЭПС увеличивается в 1.8 раз. Полученные нами данные показывают, что концентрация кислорода в среде оказывает влияние не только на количественный выход, но и на качественный состав полисахаридов. Так в ЭПС, синтезируемых на плотных средах, значительно увеличено содержание кислых групп (табл.6.1), что, возможно, объясняется максимальным контактом клеток с кислородом воздуха. Вероятно, достаточно хорошая аэрация при росте на плотных средах способствует более активному протеканию процесса биосинтеза и последующему окислению ЭПС. Данные, аналогичные нашим, были получены для культуры Acinetobacter species при изучении влияния аэрации на химическое строение ЭПС. Авторы предполагают, что в условиях высоких значений р02 увеличение кислых групп в составе ЭПС говорит о повышенном содержании глюкуроновой и (или) пировоноградных кислот [9]. Экзогликанам с большим содержанием кислых групп отдается предпочтение в фармакологии. Присутствие в полисахаридах достаточного количества карбоксильных групп активизирует синтез иммуноглобулинов через стимуляцию В-лимфоцитов [5]. Поэтому, использование ЭПС, полученных на плотной глюкозо-казеиновой среде, предпочтительнее в качестве иммуномодуляторов,

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пестова, Ольга Валерьевна, Санкт-Петербург

1. Vittorio Crescenzi. Microbial Polysaccharides of Applied Interest: Ongoing Research Activities in Europe // Biotechnol. Prog. 1995. - №3. - P.251-259.

2. Тихомирова O.M., Витовская Г.А., Синицкая И.А. Изменения в составе клеточных полисахаридов Rhodotorula rubra (Demme) Lodder в процессе биосинтеза экзоманнана//Микробиология. 1992. - Т.61, №1. - С.79-84.

3. Моносахаридный состав экзополисахаридов у олигонитрофильных бактерий / Л.В Косенко., И.Я Захарова., Н.Н Мальцева., Л.М Иваницкая. // Микробиология. 1977. - Т.46, вып.6. - С. 1039-1043.

4. Лысак Л.В., Горин С.Е., Вустина Т.Ф. Экзогликаны почвенных бактерий родов Arthrobacter и Rhodococcus // Микробиология.- 1992.- Т.61, вып.4.- С.622-627.

5. Блинов Н.П. Химия микробных полисахаридов. М.: Высш. шк. -1984.- 256 с.

6. Бекер М.Е., Мяпинып Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. М.: Агропроиздат, 1990. - 334 с.

7. Безбородов А.М. Биосинтез биологически активных веществ микроорганизмами.-Л.Медицина. -1969. 247 с.

8. Экологическая роль микробных метаболитов / Под ред. Д.Г. Звягинцева.- М.:Изд-во МГУ, 1986.-240 с.

9. Пирог Т.П., Гринберг Т.А., Малашенко Ю.Р. Влияние факторов внешней среды на образованеи и свойства экзополисахоридов Acinetobacter species // Прикладная биохимия и микробиология.- 1998.- Т.34, №1.- С.70-74.

10. Осадчая А.И. Кудрявцев В.А., Сафронова Л.А. Роль аминокислот в интенсификации биосинтеза экзополисахаридов Bacillus subtilis в глубинных условиях роста // Микробиология.- 1995.-Т.64, №1.- С.44-50.

11. Гринберг Т.А., Пирог Т.П, Малашенко Ю.Р. Микробный синтез экзополисахаридов на С1-С2-соединениях. Киев: Наук.думка, 1992.- 212 с.

12. Регуляция синтеза экзополисахарида Acinetobacter species на этаноле / Т.А. Гринберг, Т.П. Пирог, Г.Э. Пинчук, Ю.Р. Малашенко // Мпсробюл.журнал.- 1994.- №2.- С.48.

13. Логинова Н.В. Троценко Ю.А. Образование экзополисахарида Blastobacter viscosus при росте на среде с метанолом // Прикладная биохимия и микробиология.- 1989.-Т.16, вып.З.- С.331-334.

14. Образованеи экзополисахарида Xanthomonas campestrys на различных средах / М.С. Матышевская, Р.И. Гвоздяк, И.И. Майко, О.А. Литветнчук, Л.А. Пасичник, М.И. Липке, Г.Я. Дадусенко, Н.М. Колодкова // Микробиол. Журнал.- 1982.- Т.44, №4.- С.36-40.

15. Влияние источника углерода на биосинтетическую активность дрожжей- продуцентов экзополисахаридов / М.В. Замашко, Г.А. Салохина, Т.В. Шаличина, М.М. Грушенко // Микробиология.- 1990.- Т.59. вып.З.-С.1010-1014.

16. Синюшкин А.А., Северина Л.О., Митюшин Л.Л. Образование полисахаридной капсулы Sulfobacillus thermosulfidooxidans в олиготрофных и миксотрофных условиях // Микробиология.- 1997.- Т.66, №4.- С.455-461.

17. Genning I., Ranald С., Thibault J. Carbo source requinements for exopolysaccharide production by Lactobacillus casei, CGI 1 and partial structure analysis of the polymer// Appl. and Ennviron Microbiol.-1994.-№ 11.- C.3914-3919.

18. Андреюнюк Е.И., Изжеутов B.B., Путинская Г.А. Продуцирование экзополисахаридов почвенной микрофлорой при различных условиях периодического культивирования // Микробиологический журнал. 1984.-Т.46, №3.- С.19-22.

19. Гоголева Е.В. Биосинтез и некоторые особенности экзополисахарида Mycobacterium lacticolum: Автореф. дис.канд. биол. наук / Моск. гос. ун-т.-М., 1975.- 28с.

20. Гоголева Е.В., Гречушкина Н.Н., Егоров Н.С. Развитие Mycobacterium lacticilum и синтез ею экзополисахарида в условиях различной кислотности среды // Микробиология.- 1975.- Т.44, вып.5.- С.902-904.

21. Северина JI.O., Усенко И. А., Плакунов В.К. Биосинтез экзополисахарида экстремально галофильной архебактерией Halobacterium volcanii //Микробиология.- 1990.- Т.59, вып.З.- С.437-442.

22. Няникова Г.Г. Биосинтез полисахарида Bacillus mucilaginosus и изучение его иммуностимулирующей активности: Дис. . канд.биол.наук.-Л., 1990.- 158с.

23. Няникова Г.Г., Пестова О.В., Виноградов Е.Я. Синтез полисахарида слизеобразующими бациллами//Международная академия.-1998.-№4-ЗС.-С.6-8.

24. Юрлова Н.А., Кудряшова О.А., Софнин А.В. Влияние источников азота на биосинтез экзополисахаридов и активность ферментов углеродного обмена у Aureobasidium pullulans // Микробиология.- 1997.- Т.66, №4.- С.468-474.

25. Толкушкина И.В., Семенова Е.В., Егоров Н.С. Образование экзогликанов сапрофитными микобактериями при непрерывном и периодическом культивировании // Микробиология.- 1991.- Т.60, вып.5.-С.842-845.

26. Reeslev М., Jorgensen В. Exopolysaccharide production and morphology of Aureobasidium pullulans grown in continuons cultivation with warying cemmonium glucose ratio in the growth medium // J. Biotechnol.- 1996.- №2.-C.131-135.

27. Данилова И.В., Ботвинко И.В., Егоров Н.С. Образование внеклеточных полисахаридов Azotobacter beijerinckii // Микробиология.-1992.- Т.61, вып.6.- С.950-955.

28. Тулеолова Е.Г. Физиологические особенности слизеобразующей бактерии Bacterium aceris // Микробиология.- 1974, Т.43.- №2.-С.363-368.

29. Reeslev М., Jersen В. Influence of Zn 2+ and Fe 3+ on polysaccharide production and mycelium yeast dimorphism of Areobasidium pullulans in batch culturvations // Appl. Microbiol and Biothechnol.- 1995.- №6.- C.910-915.

30. Юрлова H.A., Кирий А.И., Кудряшова O.A. Влияние состава питательной среды на синтез экстрацеллюлярного полисахарида Aureobasidium pullulans // Микробиология,- 1994.- №6.- С.1031-1037.

31. Беспалов A.A. Влияние солей органических кислот на рост и биосинтез полисахаридов дрожжами Cryptococcus luteolus (Saito) Skiner, штамм 228 //Микология и фитопатология,- 1996.- №1.- С.39-43.

32. Предварительное изучение продуцирования экзополисахарида при брожении Armillarilla tabescens / Dai Minghua, Zou Wenxin, Yu Werhuan, Nanijng Xuebao // Zinan Kexue = J. Univ. Natur Sei Ed.- 1995.- №3.- P.436-442

33. Огурцова JI,В., Авакян З.А., Каравайко Г.А. Рост Bacillus mucilaginosusB гетеротрофных и автотрофных условиях // Микробиология.-1991.- Т.60, вып.5.- С.823-827.

34. Илларионова В .И., Матяшова Р.Н., Галкина Г.В. Биосинтез экзополисахарида бактериями Pseudomonas desmolytica // Тез.докл. конф."Биосинтез и деградация микробных полимеров, фундаментальные и прикладные аспекты", 13-17 июня 1995 г.- Пущино, 1995.- С.35.

35. Семенов A.M., Ботвинко И.В., Стейли Д.Т. Экзополисахариды бактерий Ancalomicrobium // Микробиология.- 1993.- Т.62, вып.2.~ С.249-252

36. Синтез полисахаридов Methylococcus capsulatus в различных условиях культивирования / В.Н.Хмеленина, Р.Р.Гаязов, Н.Е.Сузина, Н.Е. Доронина, Ю.Ню Мишенский, Ю.А. Троценко // Микробиология.- 1992.- Т.61, вып 3.-С.404-460.

37. Блинов Н.П., Хван A.B., Кравченко C.B. Влияние условий культивирования Aureobasidium pullulans D-BX Araud (1910) на физико-химические характеристики аубазидана // Антибиотики и медицинская технология.- 1987.- №7.-С.533-537.

38. Ананьева Е.П., Быстрова Г.А. Витовская Г.А. Влияние условий биосинтеза на физико-химические свойства экзополисахарида Bullera alba // Прикладная биохимия и микробиология,- 1995.- Т.31, №4.- С.417-421.

39. Изменение состава и свойств экзополисахарида, синтезируемого Acinetobacter species в процессе периодического культивирования/Гринберг Т.А., Пирог Т.П., Пинчук Г.Э. и др. // Микробиология.- 1994.- №6.-С.Ю15-1019.

40. Безбородов A.M., Коган И.Б., Бочева С.С. Основы биотехнологии микробного синтеза.- Р.-н -Дону, 1989.-112 с.

41. Особенности биосинтеза и характеристика экзогликанов дрожжей рода Sporobolomyces / Н.П. Блинов, Е.П. Ананьева, Г.А. Витовская, Н.В. Смирнова//Микробиология.- 1992.-Т.61, вып.4.- С.615-621.

42. Малиновская И.М. Динамика синтеза экзополисахарида Bacillus mucilaginosus // Тез.докл. конф. "Биосинтез и деградация микробных полимеров.Фундаментальные и прикладные аспекты", 13-17 июня 1995 г.-Пущино, 1995.- С.22.

43. Патент 2140454 РФ, МКИ С 12 Р 19/04. Способ получения полисахарида Bacillus mucilaginosus/Г.Г. Няникова, О.В. Пестова, Е.Я.

44. Виноградов, М.В. Рутто (РФ).- №98111126; Заявл.09.06.98; Опубл. 27.10.99, Бюл. № 30.

45. Басканян И.А., Шафоростова Л.Д., Боровкова В.М. О влиянии качества посевного материала на смещение удельной скорости синтеза вторичных метаболитов // Теория и практика непрерывного культивирования микроорганизмов.- М.: Наука, 1980.- С.20.

46. Регуляция внешними факторами синтеза экзополисахарида у Methylococcus themophillus / Т.А. Гринберг, З.П. Щурова, В.А. Романовская, Ю.Р. Малашенко //Микробиология.- 1986.- Т.55,вып.6.- С.800-803.

47. Болоховская В.А., Шинкаренко Л.Н., Гиро Т.Н. Влияние условий культивирования на синтез экзополисахаридов и спорогенез у штаммов Bacillus polymyxa //Тез.докл. конф."Биоконверсия-88", 12-14 сентября, 1988 г.- Рига,1988.- С.27.

48. Действие физических и химических мутагенов на изменчивость Aureobasidium pullulans (D. BY) Arnaud, штамм 8-продуцент аубазидана / Н.П. Блинов, М.И. Пронина, A.B. Погребная и др. //Микробиология. 1991.-Т.60, вып. 4 - С. 674-679.

49. Березин И.В. Иммобилизованные ферменты и клетки // Биотехнология.- 1985.-№2.- С.113-116.

50. Рыбальский Н.Г., Чаплина И.Г. Иммобилизованные клетки // Всесоюзное НИИ патентной информации, серия "Биотехнология".- М.-1990.-108С.

51. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы.- М: Изд-во МГУ, 1987.-256с.

52. Роль полисахарида Bacillus mucilaginosus в процессе деструкции силикатных минералов / И.Н. Малиновская. Л.В. Косенко, С.К. Воцелко, В.С.Подгорский// Микробиология.- 1990.- Т.59, вып.1.- С. 70-78.

53. Микробиологическая деструкция силикатных бериллий-содержащих минералов / Е.О. Мельникова, З.А. Авакян, Г.И. Каравайко, B.C. Круцко // Микробиология.- 1990.- Т.59, вып.1.- С.63-69.

54. Виноградов Е.Я. Злобин B.C., Няникова Г.Г. Экологическая роль микроорганизмов в трансформации органических и неорганических соединений // Академия.- 1997.-№2.- С.80-85.

55. Огурцова J1.B. Микроорганизмы и их роль в трансформации минералов бокситов: Автореф.дис. канд. биол. наук.- М, 1997.- 22с.

56. Воронков М.Г., Кузнецов И.Г. Кремний в живой природе.-Новосибирск: Наука, 1984.- 157с.

57. Никовская Г.Н. Адгезионная иммобилизация микроорганизмов в очистке воды // Химия и технология воды.- 1989.-№2.- С.158-169.

58. Физико-химические основы иммобилизации клеток методом сорбции / Е.И. Козляк. М.М. Якимов, И.Б. Уткин, И.С. Рогожин, З.Г. Соломон, A.M. Безбородов // Прикладная биохимия и микробиология.- 1991.-Т.27, вып.6.-С.788-803.

59. Сорбция клеток Pseudomonas fluorescens 16 №2 на волокне из триацетата целлюлозы / Е.И. Козляк, З.Г. Соломон, Н.М. Якимов и др. // Прикладная биохимия и микробиология.- 1991.- Т.27,вып.4.- С.508-513.

60. Иммобилизованные клетки микроорганизмов/А.П. Синицын, Е.И. Райнина, B.JI. Лозинский, С.Д.Спасов.- София (Изд-во Московского ун-та).-228с.

61. Quintero E.I., Weines R.M. Physical and chemical characterisation of the polysacchcride capsule of the marine bacterium Hyphomonas strain MHS-3 // J.Ind. Microbiol.- 1995.- №4.- P.347-351.

62. Звягинцев Д.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями.-М.: Изд-во МГУ, 1973

63. Immobilisiierung microbieller zeller und deren Nutzung zur Substratwandlung: eine Literaturstudie // Acta Biotechnol.- 1982.- №4.- S.343-358.

64. Волошенко М.И., Дислер E.H., Кощеенко К.А. Иммобилизация культуры Pseudomonas putida, образующей 2-кето-Д-глюконовую кислоту // Биотехнология.- 1985.-№5.- С.43-47.

65. Изучение иммобилизации клеток Aspergillus clavatus, продуцирующих рибонуклеазу / Р.Ж,Манолов, И.М.Тавобилов, В.И. Лозинский, Е.С. Вайнерман, Е.Ф. Титова, Е.М. Балавцева, С.И. Безбородова // Прикладная биохимия и микробиология.- 1988.-вып.4.- С.514-519.

66. Ферментативная активность клеток Arthorobacter globiformis 193, иммобилизованных на крупнопористых керамических носителях / А.Ю. Аринбасарова, A.A. Артемова, A.B. Киселев // Прикладная биохимия и микробиология.- 1982.- Т.18,вып.З.- С.331-338.

67. Kovalenko G.A, Sokolovskii V.D. Epoxidation of propene by microbial cells immobilized on inorganic suppots // Biotechnol. and Bioeng.- 1992.- №5.-P.522-526.

68. Kumakura M., Yoshida M., Asano M. Preparation of immobilised yeast cells with porous substrates // Proces.Biochem.- 1992.-№4.- P.225-229.

69. Никовская Г.Н., Гордиенко A.C., Глоба Л.И. Сорбция микроорганизмов волокнистыми материалами // Микробиология.- 1986.-№4.-С.691-694.

70. Иммобилизация дрожжей Saccharomyces cerevisiae на алюмоборосиликатных стекловолокнах / А.П. Синицын, Е.И. Райнина, А.Б. Ефремов, И.М. Грачева // Биотехнология.- 1986.-№3.-С.66-69.

71. Characteristics of immobilised Rhizopus oryzae in polyurethane foam cubes / Sun Yan, Y-L., H. Yang, S. Bai // Biothehnol Thechn.- 1996.- №11.-P.809-814.

72. Калбин Г.Г. Исследование кинетики иммобилизованных клеток.Характеристика действия биокатализатора: Сб.научн.тр. / Таллинский политехнический институт.- Таллин, 1987.- С.96.

73. Канаев П.А., Кузнецов С.И. Блинов Н.П. Сорбенты на основе микробных полисахаридов // Тез.докл. Всероссийской научн.конф."Химия и технология лекарственных веществ", 1-2 июня 1994г.- С-Петербург, 1994.1. C.16.

74. Карпенко В.И., Кудриш И.К., Малашенко Ю.Р. Иммобилизация клеток метанокисляющих бактерий на угле // Микробиологический журнал.-1983.- Т.45, №5.- С.32-36.

75. Кинетика роста микроорганизмов на поверхности полимерных материалов / С.И. Миронова, A.A. Малана, Т.В. Филимонова и другие // Доклады АН БССР.- 1985.-№6.- С.558-560.

76. Ныс П.С., Скляренко П.Л., Заславская Ю.Э. Общие принципы создания высокоэффективных биокатализаторов нв основе клеток микроорганизмов // Иммобилизованные клетки в биотехнологии.- Пущино.-1987.-С.27-38.

77. Могилевич Н.Ф. Иммобилизованные микроорганизмы и очистка воды //Мкробюл журнал.- 1995.-№5.- С.90-105.

78. Черкасов А.Н., Пасечник В. А. Мембраны и сорбенты в биотехнологии.- Л.: химия, 1991.-240с.

79. Thermostable a-amylase production by immobilized Bacillus licheniformis cells in agar gel and on acrylonitrile / A.Tonkowa, V.Ivanova, E. Dobreva,

80. D.Stefanova // Appl. Microbiol.and Biotechnol.- 1994.- №5.- P.517-522.

81. Быков В.П. Производство и применение хитина // IV Всероссийская конференция: Тез. докл.- М.: изд-во ВНИРО.- 1995.- С.3-5.

82. Мышкина Л.А., Луценко В.В.,Низовская А.Ю. Хитин, хитозан: получение, свойства. Применение // Обзорная информация. Химико-фармацевтическое производство.- М.,1991.-вып.4.- 33с.

83. Набауллин А.А. Строилова Ф.А., Ванюшкин В.В. Совершенствование производства хитина и хитозана из панцирьсодержащих отходов криля и пути их использования.- М.: Изд-во ВНИРОД992.-С.75-77.

84. Chutham Peter S.I. Use of biocatalysis for the production of flavour chemicals // Cerevisia.- 1996.- №4.- P.56-58.

85. Самойлова H.A., Березин Б.Б., Янсив И.Я. Новые хитиновые сорбенты для выделения лектина зародышей пшеницы // Прикладная биохимия и микробиология.- 1997.- Т.ЗЗ.-№2.- С.147-151.

86. Производство и применение хитина и хитозана / Т.М. Сафронова, В.П. Быков, В.М. Быкова и др.- М.: ВНИРОД995.-С.14-17.

87. Modification of chitosan and possibities of its application/M.Krysteva, E.Naidenova, A.Andreeva, Nguyen Dihn Huyen // Biotechnology and Biotechnologicol equipment.- 1995.- №1.- P. 66-70.

88. A.c. 5354879 США, МКИ С 12 № 11/10, С 12 № 11/04. Microorganism immobilization in (3-chitin carrier / Ohashi Eiji, Nippon Suisam Kaiska (USA).- № 904254; Заявл. 25.06.92; Опубл. 11.10.94.

89. Nakaniski Keijero, Ikebukuro Kazunori, Karube Isao. Determination of cyanide using a microbiol sensor // Appl. Biochem. and Biothechnol.- 1996.-№2.-P. 97-106.

90. Иммобилизация клеток Citrobacter freundii с тирозин- фенол- лиазной активностью методом включения в природные гели / И.В. Тысячная, М.Х. Родригес, В.И. Яковлева, И.В. Березин // Прикладная биохимия и микробиология.- 1984.-Т.20, вып.1.- С.79-80.

91. Norton S., Watson К., Amore Т. Ethanol tolerance of immobilized brewers yeast cells // Appl. Microbiol and Biotechnol.- 1995.- №1.- P. 18-19.

92. Очистка и доочистка бытовых сточных вод иммобилизованными микроорганизмами / Г.И. Корчак, М.Н. Земляк, И.В. Григорьева, Р.И. Иванникова, М.Ю. Антамонов, Г.И. Валявская // Химия и технология воды.-1996.-№2.- С. 187-192.

93. Биологическая очистка производственных сточных вод /C.B. Яковлев, И.В. Скирдов, В.Н. Швецов и др.- М.: Стройиздат, 1985.-208 с.

94. Бахчельников И.А., Грабик В.А. Биологическая очистка формальдегидсодержащих сточных вод // Очистка природных и сточных вод: Сб. / Новочеркасский государственный ун-т.- Новочеркасск.-1995.-С.58-64.

95. Няникова Г.Г., Пестова О.В. Использование иммобилизации клеток микроорганизмов в получении продуктов биосинтеза // Академия. 1997. -№4.-0 С.37-39.

96. Авакян З.А., Пивоварова Т.А., Каравайко Г.И. Характеристика нового вида Bacillus mucilaginosus // Микробиология.- 1986.-Т.55,вып.З.- С.477-480.

97. Виноградов Е.Я. Диэлектрические и электроповерхностные свойства клеток микроорганизма Bacillus mucilaginosus // Сибирский биол. Журнал.-Новосибирск: Наука, 1991.- с.67-71.

98. Kimi Doman, Sea Hyun-Cheng, Day Donal F. Dextran production by Leuconostoc mesenteroides in the presence of a dextranase producing yeast Lypomyces starkeyi // Biotechnol.Techn.- 1996.- №4.- C.227-232.

99. Гусева E.B., Балихина В.И. Иммуностимуляторы: Обзор /Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных. -Владимир, 1995. 34с.

100. Лазарева Д.Н., Алехин Е.К. Стимуляторы иммунитета. М.: Медицина, 1985. - 256с.

101. Сипинская О.Ф., Нешатаева Е.В. Полисахариды в производстве лекарственных препаратов: Обзор / Химико-фармацевтическая промышленность.- М., 1985.- вып.2. 32с.

102. Караваева А.В., Кашкина М.А., Огурцов Р.П. Экзогликан Rhodotorula rubra (Demme) Lodder 1889 как иммуностимулятор // Микология и фитопатология.- 1996.- №2,- С.31-34.

103. The involvement of CD 14 in stimulation of cytokine production by uronic acid polymers/ T.Epevic, M.Otterlei, G.Skjak-Braek et al. // Eur.J.Immunal. 1993.-Vol.23.-C.255-261.

104. Биологически активные вещества и изучение механизма их действия (полисахариды, витамины, гормоны, препараты анаболического действия) // Тез. докл. IX научной конференции Гродненского медицинского института, 19-20 октября 1978 г.- Гродно, 1978ю- 154с.

105. Федорова Л.Г. Экзогликаны базидиомицетовых дрожжей как иммуномодуляторы: Автореф. дис. .канд. биол. наук.- С.-Петербург, 1999.-25с.

106. Васильева Т.Г., Шапиро Н.И., Колотинская Т.М. Молекулярная гетерогенность и биологическая активность липополисахаридов (эндотоксинов) грамотрицательных бактерий / Труды IV Всесоюзного биохимич. съезда.- Л.,1979.- Т.2.- С.178-179.

107. Полисахаридные комплексы, липополисахаридные и О-специфические полисахариды бактерий Xanthomonas campestris PV 81183 а / В.В. Козулин, Н.Н.Митров, О.Е. Макаров и др. // Микробиология.- 1997.-Т.66, №2.- С.192-197.

108. Машковский М.Д. Лекарственные средства: Пособие по фармакотерапии для врачей: В 2ч.- Вильнюс: Ганта, 1993.- 527с.

109. Structure of the exopolysaccharide producent by Lactococcus lactis subspecias cremoris H414 grown in a defined medium or skimmed milk / M.Gruter, B. Leefland, J. Kuiper et al // Carbohydr.Res.-1992.- Vol. 231.- P.273-291.

110. Structural characterization of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus delbruckii subspecies bulgaricus grown in skimmed milk / M. Gruter, B. Leefland, J.Kuiper et al. // Carbohydr. Res.- 1993.- Vol.239.- P.209-226.

111. Gassem M.A., Schmidt K.A., Franc J.F. Exopolysaccharide production from whey lactose by fermentation with Lactibacillus delbruckii spp. bulgaricus // J. Food Sci.- 1997.- №1.- P.171-173.

112. Добровольский Г.В., Гришина Л.А. Охрана почв.- М.:Высшая школа, 1985.-224с.

113. Гончарук Е.И., Сидоренко Г.И. Гигиеническое нормирование химических веществ в почве: Руководство.- М.Медицина, 1986.-320с.

114. Блинов Н.П., Ананьева Е.П., Яскович Г.А. Сорбционная активность экзогликанов по отношению к тяжелым металлам //Прикладная биохимия и микробиология.- 1999.- Т.35, №2.- С.190-193.

115. Энтеросорбция. Enterosorption/Под ред. H.A. Белякова.- Л.:Центр сорбционных технологий.- 1991.-328с.

116. Биологически активные сульфаты гетерогликанов/ С.А. Воротынская, Г.А. Витовская, Е.П. Ананьева, М.А. Соловьева // Химико-фармацевтический журнал.-1995.-№6.-С.30-32.

117. Воротынская С.Л. Получение и изучение некоторых гетерогликанов криптококков и их производных: Дис. . канд.биол.наук.-С-Петербург, 1993.-165с.

118. Сенюк О.Ф., Горовой Л.Ф., Трутнева И.А. Использование хитинового препарата микотон в качестве радиопротектора// Тез. докл. V конференции "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана", 25-27 мая 1999 г.-Москва-Щелково, 1999.-С.193-197.

119. Различная способность полисахаридов клеточной стенки Aspergillus niger к сорбции металлов/ В.М. Терешина, В.Н. Марьин, В.Н. Костяков, В.П. Козаков, Е.П.Феофилова// Прикладная биохимия и микробиология.-1999.-Т.35, №4.- С. 432-436.

120. Олиферчук В.П., Сухомлин М.Н., Жданова Н.И. Адсорбция некоторыми микромицетами ионов тяжелых металлов из стоков предприятий точного машиностроения // Микробиол. журнал.- 1994.- Т.56, вып.6.- С.65-70.

121. Cadd C.V., Rome L. Biosorption of copper by fungal melanin//Appl. Microbiol.- 1988.- №6.- P.610-617.

122. Sandau E., Sandau Р., Pulz O. Heavy metal sorption by microalgae // Acta Biotechnol.- 1996.-№4.- P.227-235.

123. Лебедева E.B. Микромицеты почв в окрестностях комбината цветной металлургии на Кольском полуострове//Микология и фитопатология.- 1993.-Т.27,вып.1.- С.12-17.

124. О некоторых особенностях механизма бактерицидного действия тяжелых металлов / Маслюков А.П., Рахмалин Ю.А., Матюшин Г.А., Дюмаев K.M. // Доклады АН СССР.- 1992.-Т.323,№6.- С.1180-1185.

125. Алексеева С. А. Геохимическая экология микроорганизмов, обитающих в почвах с разным уровнем содержания меди и цинка: Автореф. дис. канд. биол. наук.- М.,1986.- 24с.

126. Илялетдинов А.Н. Микробиологические превращения металлов.-Алма-Ата: Наука, 1984.- 226с.

127. Виноградов Е.Я., Четверкин В.А. О действии микроэлементов меди, цинка, кобальта на рост и выживаемость силикатных бацилл // Труды целиноградского госмединститута.- 1969.- Т.З.- С. 158-161.

128. Ильин В.Б. О нормировании тяжелых металлов в почве//Почвоведение.-1986.- №9.-С. 90-98.

129. Александров В.Г. Силикантные бактерии и их роль в усвоении растениями калия // Тез. докл. V научн. конф. Куйбышевского с.-х. инс-та, 27-30 января, 1947 г.- Куйбышев, 1947.- С.13-15.

130. Александров В.Г., Зак Г.А. Бактерии, разрушающие алюмосиликаты //Микробиология.- 1950.- Т.19, вып.2.- С.97-104.

131. Виноградов Е.Я. Биологические свойства и систематическое положение Bacillus mucilaginosus: Дис. . докт. биол. наук: Защищена 17.12.73; Утв.1974.- М., 1973.- 272 с.

132. A.c. 948142 СССР, МКИ С1215 / 00. Штамм слизистых бацилл Bacillus mucilaginosus, используемый для биосинтеза слизи / Е.Я. Виноградов, А.И. Берденников (СССР) / Открытия. Изобретения. 1984.- С. 25.

133. Милевский Е.И. Бактерицидные свойства крови под действием полисахарида силикатных бацилл // Факторы естественного иммунитета различных физиологических и патологических состояниях.- Челябинск.-1974, вып. 3.- С.48-49.

134. Изучение иммуностимулирующей активности Bacillus mucilaginosus / Г.Г. Няникова, JI.E. Никитина, Ф.С. Носков. Е.Я. Виноградов // Генетическая инженерия иммуномодуляторов и вакцинных препаратов: Сб.-Л.:Наука, 1989.- С.186-188.

135. Immunogenesis stimulator of farming livesstock / G.G. Nyanikova, Yu.B. Trofomova, E.Ya. Vinogradov, A.I. Sobetov // International Conference " Biotechnology St.Petersburg'94", 21-23 September, 1994.- S-Peterburg,1994.-Р.95/

136. A.c. 1210452 СССР, МКИ С 12N 1/00. Штамм бактерии Bacillus mucilaginosus продуцента биостимулятора неспецифическогго иммунитета телят / Е.Я. Виноградов, В.П. Шичкина (СССР).- №3474518/15; Завл.21.07.82; Опубл. 27.09.96, Бюл. №12.-Зс.

137. Няникова Г.Г., Виноградов Е.Я. Сферы возможного применения культуры Bacillus mucilaginosus // Актуальные вопросы химической науки и технологии, экологии в химической промышленности: Сб.- М.: АО "НИИТЭХИМ ", 1995.- вып.З.- С.17.

138. Виноградов Е.Я., Няникова Г.Г., Пестова О.В. Некоторые аспекты практического использования экзополисахарида Bacillus mucilaginosus//Академия.- 1997.-№4.- С.55-56.

139. Виноградов Е.Я. Васильев М.Ф., Кусакин И.Н. Лечение бронхопневмонии у телят // Проблемы профилактики и терапии незаразных болезней с.-х. животных в нечерноземной зоне РСФСР: Сб.- Л.: ЛВИ, 1985.-С.9-12.

140. Испытание эффективности некоторых препаратов при криптоспоредиозе телят / Е.Я. Виноградов. Г.Г. Няникова, В.Ф. Галот и др. // Актуальные проблемы ветеринарной науки: Сб.- Киев: УСХ. 1992,- С. 117122.

141. Максина Т.П. Биологические основы профилактики стронгилоидоза поросят: Дис. канд. биол. наук: Защищена 23.12.88.- М.,1988.- 198 с.

142. Алифатические и алициклические карбоновые кислоты биомассы Bacillus mucilaginosus/М.Г. Воронков, Е.Я. Виноградов, В. Май и др.//Известия сибирского отделения Академии наук СССР.- 1987.-вып.2.-С.88-91.

143. Таусон E.JL, Виноградов Е.Я. Внеклеточные ферменты Bacillus mucilaginosus//MHKpo6Honorara.- 1988.- Т.57, вып.2.- С.236-240.

144. О целлюлозолитической активности Bacillus mucilaginosus/E.B. Будилова,Н.А. Родионова, Л.И. Мартинович, А.М. Безбородов, Г.Г. Няникова, Н.Г. Домонон //Микробиология.- 1987.- Т.56,вып.5.- С.778-782.

145. Vinogradov J., Poletaev S., Vedjapina J. Biologische Eigenschaften von Silikatbacillen// Moderne Medizin .- 1973.- № 5-6.-S.241-247.

146. Виноградов Е.Я., Воронков М.Г., Шичкина В.П. О влиянии сезонного фактора на микроорганизмы/Известия сибирского отделения Академии наук СССР.- 1984.-вып.З.- С.85-87.

147. Микробиологические и вирусологические методы исследования / Под ред. М.Биргера. -М.: Медицина, 1982. -463 с.166

148. Захарова И.Л., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов.- Киев: Наукова думка, 1982.-192 с.

149. Методы общей бактериологии: Пер. с англ./Под ред. Ф. Герхардта.-М.: Мир, 1984.-290с.

150. Силиверстов А.Ф., Емельянов А.Ю., Ершов Б.Г. Сорбция металлов из водных растворов хитин-содержащими материалами // Журнал прикладной химии.- 1993.- Т.66, вып.10.- С.2331-2336.

151. Биотехнология : Принципы и изменение : Пер. с англ./ Под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса.- М. МИР, 1988.- 480 с

152. Диаграмма регистрации концентрации растворенного кислорода впитательной среде

153. Динамика роста и биосинтеза ЭПС в ферментере «БИОТЕК-4»