Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез экзополисахарида культурой Bacillus mucilaginosus

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез экзополисахарида культурой Bacillus mucilaginosus"

рг ц Ой , ц «й

На правах рукописи

Пестова Ольга Валерьевна

Биосинтез экзополисахарида культурой ВасШиз тисИад/'поБиэ

Специальность 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1998

Работа выполнена в Санкт-Петербургском Государственном Технологическом институте (Техническом университете)

Научный руководитель: доктор биологических каук, профессор,член-корр.АИН

Виноградов Евгений Яковлевич

Научный консультант: кандидат биологических наук, доцент

Няникова

Галина Геннадьевна

Официальные оппоненты: ,доктор биологических наук, профессор, академик МАИ доктор биологических наук, профессор

Злобин

Виктор Сергеевич Болотников Игорь Алексеевич

Ведущая организация:

Санкт-Петербургская Химико-фармацевтическая Академия Защита диссертации состоится " 1998г. в. часов

на заседании Диссертационного Совета Д 063.25.09 в Санкт-Петербургском Технологическом институте (Техническом университете).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Замечания и отзовы по работе, заверенные печатью, в одном экземпляре просим направлять по адресу: 198013, Санкт-Петербург, Московский пр., д, 26, Технологический институт, Ученый совет.

Автореферат разослан

Но,

1998 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 063.25.09 о < ^ Лисицкая Т.Е.

Актуальность В последнее время микробные полисахариды находят широкое применение во многих отраслях: в медицине и фармации, пищевой, парфюмерной, нефтедобывающей, горнодобывающей, химической и других отраслях промышленности. ,

Микробные полисахариды проявляют высокую биологическую активность, отличаются широким разнообразием по химическому составу, физико-химическим свойствам, что и обуславливает сферу их применения. Каждый новый продуцент, синтезирующий полисахариды с другими, отличными от ранее известных свойствами, весьма ценен для расширения ассортимента промышленно-значимых полисахаридов. В настоящее время во многих научно-исследовательских лабораториях ведущих стран мира ведется активная работа по выявлению новых продуцентов полисахаридов, по изучению физико-химических свойств полисахаридов и созданию на их основе новых лекарственных препаратов и других продуктов и полуфабрикатов, перспективных для различных отраслей.

Известно, что почвенный сапрофитный микроорганизм Bacillus mucilaginosus в процессе своей жизнедеятельности продуцирует экзополисахарид (ЭПС). По данным литературы при определенных условиях 1 Bacillus mucilaginosus образует слизь, содержащую 95% полисахарида и 5% белка. Работами Милевского Е.И. (1974), Виноградова Е.Я. (1973), Няниковой Г.Г. (1990) доказано, что экзогликан Bacillus mucilaginosus обладает способностью повышать иммунитет организма животных, проявляет антивирусную активность, противоязвенное и противоопухолевое i действие. Показана также возможность применения ЭПС Bacillus mucilaginosus в качестве технических смазок, добавок в буровую промывочную жидкость

Из вышесказанного становится очевидным важность получения значительных количеств ЭПС Bacillus mucilaginosus. Накоплено немало сведений о получении данного ЭПС на плотных питательных средах. Однако использование плотных питательных сред трудоемко и экономически невыгодно. Поэтому актуальным является оптимизация условий роста Bacillus mucilaginosus в жидкой питательной среде для получения ЭПС.

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы являлась разработка способа культивирования Bacillus mucilaginosus, позволяющего увеличить выход экзополисахарида.

В связи с поставленной целью решались следующие задачи:

- разработать рецепт новой жидкой питательной среды; -исследовать зависимость биосинтетической активности Bacillus

mucilaginosus от природы и концентрации в среде источника углерода и азота, влияние кислотности и аэрации среды на биосинтез ЭПС культурой Bacillus mucilaginosus;

-повысить продуктивность штамм Bacillus mucilaginosus путем УФ-облучения;

- сравнить динамику роста и биосинтеза ЭПС исходной и облученной культур;

- исследовать возможность иммобилизации клеток Bacillus mucilaginosus на хитиновых сорбентах и оценить роль ЭПС микроорганизма в процессе адгезии. Разработать способ получения экореабилитирующей добавки в грунт.

Научная новизна Впервые оптимизированы условия биосинтеза полисахарида Bacillus mucilaginosus. Предложен рецепт питательной среды для получения полисахарида. На способ получения ЭПС подана заявка на изобрететние (№ 98111126 от 19.06.98)

С помощью УФ-облучения получен мутант Bacillus mucilaginosus, обладающий высокой продуктивностью по синтезу ЭПС. Установлено, что пик биосинтетической активности мутанта смещен в фазу автолиза клеток, тогда как для исходной культуры он приходится на стационарную фазу роста. Продолжительность лаг-фазы облученной культуры значительно сократилась в сравнении с лаг-фазой исходной культуры.

Показана возможность иммобилизации клеток Bacillus mucilaginosus на хитиновых сорбентах. Определена зависимость сорбции клеток от концентрации клеточной суспензиии. Выявлена положительная роль ЭПС в иммобилизации клеток на сорбентах.

Впервые обнаружена способность клеток Bacillus mucilaginosus, иммобилизованных на хитине, извлекать медь из почвы. Установлено, что уровень сорбции клеток микроорганизма коррелирует с образованием ЭПС. Разработан способ получения экореабилитирующей добавки в грунт.

Практическая значимость Разработана питательная среда для

культивирования Bacillus mucilaginosus и биосинтеза ЭПС, что позволяет ускорить внедрение экспериментальных данных в практику.

Получен мутант Bacillus mucilaginosus, обладающий высокой биосинтетической активностью. Мутант может быть использован для получения нового штамма.

Предложена новая экореабилитирующая добавка в почву (агрохитин с иммобилизованными клетками Bacillus mucilaginosus). Биосорбент может извлекать медь (5.76 мг/кг и 22.14 мг/кг) из почвы, при этом исключается и распространение с талыми водами токсичных концентраций ионов меди.

Апробация работы

Результаты работы были доложены на научно-технической конференции_аспирантов СПбГТИ (ТУ), посвященной памяти М.М. Сычева (С.-Петербург, 1997), на 2-ой С.-Петербургской Ассамблеи молодых ученых и специалистов: симпозиуме "Молодые ученые - экологии города" (С.Петербург, 1997), на научн. конф."Международные ежегодные экологические чтения памяти К.К. Сент-Илера" (Воронеж, 1998), на научно-практической конференции "Разработка и производство диагностических питательных сред и микросистем" (Махачкала, 1998).Мутант Bacillus mucilaginosus - экспонат выставки " Технохимия-98" (С.-Петербург, 1998).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав экспериментальных исследований, включающих описания материалов и методов исследования и изложение полученных результатов, и их обсуждение, списка литературы и приложений.

Работа изложена на 130 страницах машинописного текста. Содержит 26 таблиц, 15 рисунков. Библиография включает 158 наименований.

Содержание работы

Материалы и методы исследования:

Объектом исследования служила культура слизистых бацилл Bacillus mucilaginosus, штамм ВКМ В-1446 Д, полученный профессором Е.Я.Виноградовым в С.-Петербургском НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Пастера. Для получения посевного материала культуру Bacillus mucilaginosus выращивали на скошенной агаризованной среде (казеин, 2% глюкозы) в течение 24 часов при температуре 37°С. Для получения инокулята делали смыв физиологическим раствором, и полученную суспензию переносили в 100 мл жидкой питательной среды (исходное значение pH среды - 7.4-7.6) и культивировали 24 часа при температуре 27- 30 0 С . Для основной ферментации с целью биосинтеза полисахарида 2 мл посевного материала вносили в 50 мл питательной среды. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл при температуре 27-30 °С на качалке с 200 об/мин.

Биомассу определяли весовым методом

Количество ЭПС определяли по общепринятой методике, а также о концентрации ЭПС судили по вязкости культуральной жидкости. Вязкость измеряли с помощью вискозиметра стеклянного ВПЖ-2.

Концентрацию остаточных редуцирующих веществ (PB) определяли эбулиостатическим методом.

pH определяли потенциометрически

Получение высокопродуктивного штамма Bacillus mucilaginosus:

Клеточную суспензию исходного штамма концентрацией 107 кл/мл в физиологическом растворе подвергали УФ-облучению при длине волны 260 нм. Облучению подвергали вегетативную культуру (24 часа культивирования) и споровую (144 часов культивирования) с различными экспозициями.

Иммобилизация клеток на хитиновых сорбентах;

Иммобилизацию клеток Bacillus mucilaginosus проводили на хитине, хитине-меди и агрохитине методом , адсорбции. Количество сорбента, используемого для иммобилизации составляло 2.0-2.8 г. Подсчет клеток до и после иммобилизации проводили методом Коха.

Для изучения способности биосорбента извлекать медь из почвы использовали образцы почв с влажностью от 74.62 до 91.97%. Сорбент и биосорбент вносили в почву из расчета 0.5 г на 100 г почвы. Количество клеточной суспензии Bacillus mucilaginosus для внесения в почву составляло 2.5 мл с концентрацией 10М08 кл/мл. Пробы выдерживали в течение десяти дней. Концентрацию ионов меди определяли на проточно-инжекционном анализаторе "FIA-STAR 5010". Прибор и методика определения лицензированы (Свидетельство №2423/56 от 26.12.91).

Результаты исследования и их обсуждение

1. Биосинтез экзополисахарида Bacillus mucilaginosus в различных . условиях периодического культивирования

Одним из основных фактором, влияющих на способность культуры синтезировать экзополисахарид, является источник углерода. Характер источника углерода, его концентрация в среде оказывают существенное влияние на выход полисахарида. При сравнении роста Bacillus mucilaginosus на средах с глюкозой, сахарозой и мелассой нами было установлено, что лучшую биосинтетическую активность культура проявляет на среде с мелассой (табл. 1,2).

Таблица 1

Рост Bacillus mucilaginosus и синтез полисахарида на средах

с глюкозой и сахарозой

Состав среды, % Биомасса, г/л Вязкость, CT

глюкоза - 2,3 NH4CI - 0,1 Na2HP04- 0,23 K2SO4 - 0,01 MgS04 - 0,05 1,26 + 0,02 1,35 + 0,05

сахароза - 4,0 NH4CI - 0,1 Na2HP04- 0,23 K2SO4 - 0,01 MgS04 - 0,05 1,30 + 0,07 1,65 + 0,02

Таблица 2

Вязкость культуральной жидкости на средах с мелассой

Состав среды, % Вязкость, CT

меласса - 8,0

NH4CI - 0,1

Na2HP04- 0,23 2,85 + 0,06

K2SO4 - 0,01

MgS04 - 0,05

меласса - 8,0

пептон - 1,0

Na2HP04- 0,23 4,76 + 0,09

K2SO4 - 0,01

MgS04 - 0,05

Было изучено влияние на рост культуры Bacillus mucilaginosus и синтез экзополисахарида отечественных и импортных пептонов. Установлено, что для получения биомассы предпочтительнее пептоны, содержащие аминный азот в количестве более 2.5-2.9%. Синтезу ЭПС способствует низкое содержание азота в среде (табл.3).

Таблица 3

Рост Bacillus mucilaginosus и синтез ЭПС на разных пептонах

Пептон Общий азот Аминный азот Биомасса, г/л Вязкость, CT

Семипалат инский 13.79+0.03 2.7+0.10 3,07 ±0,94 1.95+0.05

«Serva» ферментат ивный 12.10+0.20 4.10+0.30 4,53 + 0,13 1.7+0.00

«Serva» кислотный 9.1+0.10 2.1+0.10 2,37 ± 0,29 4.67+0.09

При изучении влияния на рост культуры и синтез ЭПС корректировки кислотности среды в процессе ферментации показано, что поддержание pH среды на уровне 6-7 обеспечивает постепенное и более длительное развитие культуры, при этом выход биомассы в 2.2-2.4 раза превышал выход биомассы на питательной среде без корректировки pH. В то же время в варианте, где pH среды не поддерживали на оптимальном для роста уровне, культура быстро достигала максимального значения биомассы , которое в 1.7-1.9 раз меньше, чем на средах с корректировкой pH. Таким образом, экспериментально доказано, что прирост биомассы Bacillus mucilaginosus находится в прямой зависимости от pH, оптимизация pH среды является непременным условием для получения биомассы. Оптимум pH среды для синтеза ЭПС культурой Bacillus mucilaginosus лежит в пределах 5-6. Поддержание pH среды на уровне 6-7 для получения ЭПС не требуется.

Исследовано влияние на выход ЭПС объема питательной среды. Культивирование проводили в колбах Эрленмейра с объемом питательной среды 50, 100 и 150 мл. Установлено,что чем меньше объем среды, тем выше биосинтетическая активность продуцента. Вязкость ферментационной среды

объемом 50 мл через 48 часов культивирования была в 2.8 раз выше, чем среды объемом 150 мл (рис.1). Таким образом, полученные данные позволяют предположить , что синтез ЭПС находится в прямой зависимости от количества растворенного в среде кислорода.

50 100 150

Объем среды,мл

Рис. 1 Зависимость синтеза ЭПС от объема среды

Дополнительное внесение 4-х % мелассы в стационарную фазу приводит к незначительному повышению выхода биомассы, но оказывает существенное влияние на образование ЭПС. Так, уже через 4 часа после углеродной добавки выход ЭПС в 1.75 раз превышает выход ЭПС в контроле (без добавки). Пик биосинтетической активности наблюдался к 40 часам культивирования в опытном варианте (с добавкой), выход ЭПС более, чем в 2 раза превышал выход ЭПС в контроле. Добавление углерода в фазу замедленного роста ингибирует синтез ЭПС ( рис.2). Графики рисунков 2,3,4 строились с использованием аппроксимации с точностью 95%, что соответствует инженерным методам расчета.

В результате проведенных экспериментов разработан рецепт жидкой питательной среды для культивирования Bacillus mucilaginosus,%: меласса-8.0,

30

9

■ 1

i2

ОЗ

О

13

16

1Э

22

40

44

Время, ч

Рис. 2 Влияние добавки мелассы через 13 и 16 часов культивирования на синтез ЭПС: 1 - контроль, 2 - добавка мелассы после 13-ти часов культивирования, 3 - добавка мелассы после 16-ти часов культивирования

пептон-1.0, Na2HP04-0.23, K2S04-0.01,MgS04-0.05, рН=7.5. Дополнительное внесение мелассы в стационарную фазу приводит к увеличению выхода ЭПС.

2. Получение высокопродуктивного штамма Bacillus mucilaginosus и изучение некоторых его свойств

Исходный штамм подвергали УФ облучению при длине волны 260 нм с различными экспозициями. В результате облучения был получен мутант, биосинтетическая активность которого в 2.4-6.5 раз превышает активность исходной культуры. Большой разброс значений связан с появлением вариантов с различной продуктивностью, так как не все клетки мутируют в одинаковой степени (табл.4),

Были обнаружены значительные различия в характере роста и динамике накопления ЭПС у исходной и облученной культур. Рост облученной культуры происходит быстрее, чем исходной. Лаг-фаза облученной культуры значительно сократилась (рис.3). Максимальный выход биомассы облученной культуры

достигается к 13 часам, а исходной - к 15 часам ферментации. Однако, максимальное количество биомассы у облученной культуры в 2,6 раз ниже, чем у исходной культуры (рис.3). Более интенсивный рост и раннее старение облученной культуры можно объяснить активным потреблением кислорода и быстрым исчерпанием азотсодержащего субстрата и минеральных компонентов. При сравнении биосинтетической активности исходной и облученной культуры установлено, что облученная культура гораздо активнее продуцирует ЭПС. Пик биосинтетической активности мутанта смещен в фазу автолиза клеток, тогда как для исходной культуры он приходится на стационарную фазу (рис.4).

Таблица 4

Синтез ЭПС исходной и облученной культурой ВасШиэ тиа^тозш

Вариант культуры Время облучения, мин Биомасса, г/л Вязкость, ст

Исходная культура 2,50 + 0,08 1,74 + 0,02

УФК - 1 45, 45 1,22 ±0,02 5,31 +0,90

УФК-2 45,45,30 0,84 ¿0,09 11,39 + 0,47

УФК-3 20, 20, 20 3.4М.18 1.69+0.03

На синтез ЭПС нового штамма также как и исходного существенное влияние оказывает аэрация среды (табл.5).Для облученной культуры повышения уровня аэрации примерно в два раза позволяет увеличить выход ЭПС более, чем в 25 раз. Для исходного штамма этот показатель равен 2.3.

Время, ч

л Исходная культура о Облученная культура

Рис.3 Динамика роста исходной и облучений культур

Время, ч

* Культура исходная о Культура облученная

Рис.4 Динамика синтеза экзополисахарида исходной и облученной культур.

Таблица 5

Влияние аэрации среды на биосинтез ЭПС

Объем среды, мл Вязкость, стоксы

Исходная культура Облученная культура

30 4,76 + 0,10 80,15+ 1,86

40 2,52 + 0,09 24,14+. 0,86

50 1,81+0,10 2,98 + 0,03

3. Иммобилизация клеток Bacillus mucilaginosus на хитиновых сорбентах. Практическое использование биосорбента

При изучении адсорбции клеток Bacillus mucilaginosus на хитиновых сорбентах была показана положительная роль ЭПС данногомикроорганизма на процесс иммобилизации. Эффективность иммобилизации снижается при использовании 48-часовой клеточной суспензии, когда концентрация ЭПС уменьшается. Выращивание Bacillus mucilaginosus на мелассно-солевой среде приводит к увеличению эффективности адсорбции в сравнении с глюкозо-солевой. Данный результат объясняется тем, что клетки продуцента проявляют большую биосинтетическую активность именно на мелассно-солевой среде. Наиболее подходящими сорбентами для сорбции клеток Bacillus mucilaginosus оказались агрохитин и хитин-медь (96.4% и 90.8% иммобилизованных клеток соответственно).

Представляло интерес исследовать сорбционные свойства разработанного биосорбента для оценки его эффективности как экореабилитирующей добавки, удаляющей тяжелые металлы из почв. Результаты опытов показывают, что биосорбент обладает лучшими сорбционными свойствами, чем ближайщий к нему аналог хитин.Сорбционная емкостть биосорбента по ионам меди (2+) из водных растворов в 2 раза превышает сорбционную емкость хитина.

Изучена способность биосорбента извлекать тяжелые металлы из почв, в частности, медь. Установлено, что в почвах, загрязненных токсическими концентрациями меди агрохитин снижает концентрацию меди на 25%, клетки Bacillus mucilaginosus - на 16.7%. а биосорбент на 50% (рис. 5). Лучшими сорбционными свойствами обладает биосорбент, так как агрохитин имеет высокие сорбционные свойства по иону меди, а Bacillus mucilaginosus синтезирует ЭПС, котрый связывает ионы меди и защищает клетки микроорганизама от токсических

концентраций меди. Уровень сорбции биосорбента коррелирует с образованием ЭПС Bacillus mucilaginosus (табл.6, рис.5).

1 2 3

Вад сорбента

Рис. 5 Диаграмма сорбции ионов меди (2+) из образцов почв: 1 -биосорбент; 2 - клеточная суспензия Bacillus mucilaginosus - а),б) с ЭПС, в) без

ЭПС; 3- агрохитин

Таблица 6

Извлечение ионов меди (2+) биосорбентом и клетками Bacillus mucilaginosus

из почв

Вариант Концентрация ионов меди (2$ в водной вытяжке, мг/кг ЭффективностЕ работы сорбента ,%

Контроль 22.14 -

Клеточная суспензия Bacillus mucilaginosus, несодержащая ЭПС 20.65 4.5

Клеточная суспензия, содержащая ЭПС 17.09 20

Биосорбент 11.66 46.7

ВЫВОДЫ

1.Разработан рецепт новой жидкой питательной среды для получения ЭПС, что дает возможность перейти из стадии лабораторных экспериментов получения ЭПС на плотной среде в сферу производства. Новая питательная среда для культивирования Bacillus mucilaginosus позволяет повысить выход полисахарида в 3.5 раз в сравнении с плотной питательной средой.

2. Методом УФ-облучения получен мутант Bacillus mucilaginosus, биосинтетическая активность которого в 2,4-6,5 раз превышает активность синтеза полисахарида исходной культуры.

3. Изучена динамика накопления ЭПС мутанта в сравнении с исходной культурой. Установлено, что пик биосинтетической активности нового штамма смещен в стадию автолиза.

4. Впервые изучена возможность иммобилизации клеток Bacillus mucilaginosus на хитиновых сорбентах. Установлено, что клетки Bacillus mucilaginosus хорошо сорбируются на агрохитине (96,4% иммобилизованных клеток) и хитине-медь (90,8 % иммобилизованных клеток). Эффективность сорбции клеток коррелирируетс уровнем синтеза ЭПС.

5. Предложена новая экореабилитирующая добавка в грунт для восстановления и улучшения почв, состоящая из агрохитина и иммобилизованных на нем клеток Bacillus mucilaginosus. Установлено, что новый биосорбент способствует выведению из почв ионов меди, его эффектикность составляет 50%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пестова О.В. Биосинтез экзополисахарида Bacillus mucilaginosus на средах различного состава//Тез. докл. научн.-технич. конф. аспирантов СПГТИ(ТУ), посвященной памяти М.М. Сычева, 24-25 мая 1997 г.- С-Петербург, 1997.-С.124.

2. Пестова О.В., Няникова Г.Г. Изучение условий биосинтеза экзополисахарида Bacillus mucilaginosus// Медицина, наука, практика.-Махачкала: ДНЦ РАМН, 1997.- №5.- С. 15.

3. Пестова О.В. Перспективы использования иммобилизованных клеток Bacillus mucilaginosus//Te3. докл. симпозиума " Молодые ученые-экологии города",8 декабря 1997 г.- С.- Петербург, 1997.- С.30.

4. Няникова Г.Г., Пестова О.В. Использование иммобилизации клеток микроорганизмов в получении продуктов биосинтеза//Академия.- 1997.- №4.-С.37-39.

5. Виноградов Е.Я., Няникова Г.Г., Пестова О.В. Некоторые аспекты практического использования экзополисахарида Bacillus mucilaginosus//AKafleMM.- 1997.- №4.-С.55-56.

6. Няникова Г.Г., Пестова О.В., Виноградов Е.Я. Синтез полисахарида слизеобразующими бациллами//Международная академия,- 1998,- №4-ЗС.-С.6-8

7. Новый экореабилитирующий сорбент в грунт/О.В. Пестова, Г.Г. Няникова, Е.Э. Куприна, C.B. Водолажская, Е.Я. Виноградов// Первые международные ежегодные экологические чтения памяти К.К. Сент-Илера: Сб. научн. тр.- Воронеж, 1998,- С. 127.

8. Белковые отходы производства хитина, как основа микробиологических питательных сред / C.B. Водолажская, Г.Г. Няникова, О.В. Пестова, Т.Э. Маметнабиев, И.А. Смирнова, E.H. Кургалимова // Первые международные ежегодные экологические чтения памяти К.К.Сент-Илера: Сб. научн. тр.- Воронеж, 1998.- С. 124

S. Биосинтез экзополисахарида Bacillus mucilaginosus на различных питательных средах/О.В. Пестова, C.B. Водолажская, Г.Г. Няникова, Е.Я. Виноградов IIТез. докл. Междунар. наун.-практ. конф. "Разработка и производство диагностических питательных сред и микротестсистем", 27-28 августа 1998г.-Махачкала, 1998,- С.27.

10. Экологический аспект использования иммобилизованных клеток Bacillus mucilaginosus / O.B. Пестова, Г.Г. Няникова, М.В. Рутто, Е.Б. Бобикова, Е.Я. Виноградов // Тез. Пятой Междунар. Ооткрытой межвузооовскоой научн,- практ. конф. "Региональные проблемы прикладной экологии", 22-25 сентября 1998 г. - Белгород, 1998. - С.75.

23.11.98г. Зак. 121-70 РТП ИК «Синтез» Московский пр.,26