Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробная трансформация каолинов и каолинсодержащего сырья

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробная трансформация каолинов и каолинсодержащего сырья"

* 4 1V;

й

На правах рукописи

ГУРОВА Евгения Станиславовна

МИКРОБНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ КАОЛИНОВ И КАОЛИНСОДЕРЖАЩЕГО

СЫРЬЯ

Специальность 03.00.07. — Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1997

Работа выполнена в Институте микробиологии Российской Академии Наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Г. И. Каравайко

доктор биологических наук Г. А. Дубинина доктор биологических наук В. И. Дуда

Факультет почвоведения МГУ им. Л1. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 11 июня 1997 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.002.64.01 в Институте микробиологии РАН по адресу: 117811, г. Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН

Автореферат разослан 29 апреля 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к. б. н.

Л. Е. Никитин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Каолинами называют глинистые горные породы, состоящие не менее чем на 50% из минералов группы каолинита. При содержании каолинитовых минералов менее 50% породы называют каолинсодержащими. Вместе с каолинитовыми минералами в состав каолинов и каолинсодержащих пород входят в разных количествах такие силикатные и алюмосиликатные минералы, как кварц, монтмориллонит, калиевый полевой шпат, слюды, а также в качестве хромофорных примесей - минералы железа и титана.

Исследование микробной трансформации каолинов интересно как в связи с изучением геохимической роли микроорганизмов в процессах выветривания горных пород, так и в связи с существующей необходимостью обогащения глин и каолинов месторождений РФ, характеризующихся повышенным содержанием красящих окислов железа и титана. Значительный интерес представляет разработка экологически безопасного способа их обезжелезнения.

В ряде исследований (Вайнберг и др., 1980, 1981, Баранов и др., 1985, Чернышов и др., 1988, Власов и др., 1990) для обезжелезнения каолинов и керамических масс (приготовленых на основе каолинов), а также для повышения дисперсности и степени несовершенства структуры частиц породообразующих силикатных минералов предлагалось использовать штаммы слизеобразующих бацилл, относимые к "Bacillus mucilaginosus". В результате воздействия жидкой культуры "Bacillus mucilaginosus" повышались пластичность керамической массы, а также прочность при изгибе и трещиностойкость готовых изделий. Существуют многочисленные исследования (Александров и соавт, 1953, 1968, Tesic, 1972, Андреев, 1975, 1976, 1979, Каравайко и соавт., 1984, Groudev & Groudeva, 1987), свидетельствующие об активности штаммов "Bacillus mucilaginosus" в выносе из силикатных минералов и некоторых горных пород ряда элементов: кремния, алюминия, калия. Установлено, что деструкция силикатных минералов указанными штаммами слизеобразующих бацилл является косвенным процессом и осуществляется под действием экзополисахарида и низкомолекулярных метаболитов кислой природы (молочной, лимонной, щавелевой, щавелевоуксусной, аминопропионовой, кетоглутаровой и глюконовой кислот), выделяемых ими в среду (Малиновская и соавт., 1989).

Хотя в работах А.С.Власова и сотрудников изменение характеристик каолина и керамических масс связывалось именно с внесением культуры "Bacillus mucilaginosus", те же авторы (Вайнберг, 1983) отмечали, что наилучшие результаты были получены на материале, не подвергнутом стерилизации. Тем не менее биотехнологический потенциал естественных микробных сообществ каолинов и каолинсодержащего сырья не учитывался. В свете этих данных представляло интерес изучение вклада микробных сообществ в процессы трансформации минералов каолинов и каолинсодержащего сырья.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является изучение сообществ микроорганизмов каолинов и их роли в процессах трансформации минералов каолина и каолинсодержащего сырья. Конкретные задачи исследования включали1.

1. Изучение распространения микроорганизмов в каолинах и каолин-содержащем сырье месторождений России и Украины. Изучение структуры микробного сообщества каолина Просяновского месторождения.

2. Изучение новых штаммов слизеобразующих бацилл и уточнение таксономического статуса бактерий, относимых к виду "Bacillus mucilaginosus".

3. Сравнительное изучение воздействия на фарфоровую массу естественного микробного сообщества и "Bacillus mucilaginosus".

4. Изучение динамики развития микробного сообщества каолина при внесении питательной среды. Исследование форм соединений железа, образующихся в результате развития микробного сообщества, а также воздействия микроорганизмов на силикатные и алюмосиликатные минералы.

5. Выяснение возможности использования естественных микробных сообществ в процессах обогащения каолинов и каолинсодержащего сырья.

Научная новизна. Впервые проведено изучение распространения микроорганизмов в каолинах и каолинсодержащем сырье различных месторождений. Для изучения структуры микробного сообщества каолина Просяновского месторождения применен новый подход, заключающийся в соотнесении жирно-кислотного профиля суммарной биомассы сообщества с известными жирно-кислотными профилями чистых культур микроорганизмов различных таксонов и проверкой правильности определения традиционными микробиологическими методами.

Показано, что в состав микробного сообщества каолина входят автотрофные бактерии рода Nitrobacter, аэробные и факультативно анаэробные гетеротрофные бактерии родов Bacillus, Pseudomonas, Burkholderia, Nocardia, Caulobacter, Deinococcus и Arthrobacter, анаэробные бактерии родов Clostridium, Bacteroides, Desulfovibrio, Desulfobacter и железовосстанавливающая бактерия - штамм FeRed.

С использованием комплекса методов фено-, хемо- и генотипического анализа, в том числе изучения спектра жирных кислот, определения уровня сходства ДНК и секвенирования 16S рРНК, проведено изучение таксономического положения как новых, так и используемых ранее, но не имеющих точного таксономического статуса штаммов слизеобразующих бацилл, относимых к "Bacillus mucilaginosus". В результате подтвержден таксономический статус вида "В. mucilaginosus" (Авакян и соавт., 1986), изученную группу новых штаммов слизеобразующих бацилл и "В. mucilaginosus subsp. siliceus" (Александров и соавт, 1950) предложено выделить в новый вид Bacillus edaphicus sp.nov..

При сравнительном изучении вклада "В. mucilaginosus" и естественного микробного сообщества в улучшение характеристик фарфоровой массы на основе каолина, а также качества фарфора выявлено преобладающее значение развития микробного сообщества. Показано, что развитие микробного сообщества каолина сопровождается снижением степени кристалличности каолина, а также увеличением доли оксалатрастворимого железа и содержания сильномагнитной фракции. В результате трансформации минералов железа микробным сообществом и последующей магнитной сепарации валовое содержание железа в каолине снижается с 0.70% до 0.34%.

Практическая значимость работы. Проведенные исследования послужили основой для разработки комплексного метода обогащения каолинов и каолинсодержащего сырья, защищенного патентом РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Международных симпозиумах "Interaction of Soil Minerals with Organic Components and Microorganisms" (Франция, 3-6 сентября 1996 г), "International Symposium on SUBSURFACE MICROBIOLOGY (Швейцария, 1521 сентября 1996 г), Международной конференции "Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические

проблемы" (Пермь, Россия, 8-11 октября 1996 г.) и Международной Научно-Практической Конференции по использованию достижений науки и техники в развитии городов, посвященной 850-летию основания Москвы (Москва, Россия, 19-22 ноября 1996 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи и 4 статьи находятся в печати, получено положительное решение на патент РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на ¡36стра-ницах машинописного текста и содержит таблиц и 36 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Список цитируемой литературы включает^0<Р наименований.

Место проведения работы. Работа выполнена в Институте микробиологии РАН в лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов (заведующий лабораторией - член-корреспондент РАН, профессор, доктор биологических наук Г.И.Каравайко). Исследования жирно-кислотного состава биомассы проводили совместно с д.б.н. Г.А.Осиповым, группа акад. Исакова при РАМН; исследования трансформации минералов железа - совместно с д.с-х.н. Ю.Н.Водя-ницким, Почвенный Институт им. Докучаева; разработка технологической схемы обезжелезнения каолинов осуществлялась коллективом авторов, включающим к.б.н. З.А.Авакян и член-корр.РАН Г.И.Каравайко (ИНМИ РАН), проф., д.т.н. Г.Н.Масленникову (Российская Академия Управления), к.т.н. Р.А.Халилуллову и д.т.н. Ю.Н.Платова (ВНИИ Электрокерамики) и д.с-х.н. Ю.Н.Водяницкого (Почвенный Институт им. Докучаева).

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

В качестве объектов исследования выбраны естественные микробные сообщества каолинов Просяновского месторождения (Украина) и каолинов и каолинсодержащего сырья Российских месторождений: "Журавлиный Лог", "Трошковское", "Гусевское", "Чалганское", "Часов-Ярское" и "Ново-Райское". Исследуемые каолины и каолинсодержащее сырье принадлежат к различным генетическим типам. Каолин Чалганского месторождения относится к осадочным (аллохтонным) каолинам. Из остаточных (автохтонных) каолинов к элювиальному генетическому типу относятся каолины и глины месторождений "Трошковское", "Журавлиный Лог", "Часов-Ярское", "Ново-Райское" и

"Просяновское"; фарфоровый камень Гусевского месторождения относится к каолинсодержащему сырью гидротермального генетического типа. Все исследуемые каолины характеризуются повышенным содержанием Fe203 и ТЮ2.

Количественный учет микроорганизмов осуществляли методом предельных десятикратных разведений. Использовали следующие среды: для аэробной микрофлоры - МПБ в разведении 1:10, для бактерий, осуществляющих бродильный метаболизм - агаризованную среду Виноградского (Кузнецов, Дубинина, 1989), для сульфатвосстанавливаю-щих бактерий - среду Постгейта (Postgate, 1966) с лактатом, для железо-восстанавливающих бактерий - среду Лавли (Lovley, Phillips, 1986), для денитрифицирующих бактерий - среду Г ильтая без аспарагина (Романенко, Кузнецов, 1974).

Определение жирно-кислотного состава биомассы проводили на хромато-масс-спектрометре НР-5985В фирмы Хьюлетт-Паккард (США). Экстракцию липидов осуществляли по методу Фолча (Folch et al., 1957) смесью хлороформ-метанол-вода. Состав микробного сообщества рассчитывали в электронных таблицах "EXCEL" с помощью специально разработанного алгоритма расчета.

При исследовании таксономического положения слизеобразующих бактерий, относимых к "Bacillus mucilaginosus", использовали как ранее известные штаммы - "В.mucilaginosus subsp. siliceus" (Александров, Зак, 1950), "В.mucilaginosus" ВКМ B-1480D (Авакян и др., 1986), так и 11 новых штаммов, выделенных из образцов глин и почв. Слизеобразующие бациллы выделяли на модифицированой среде Эшби следующего состава (г/л): глюкоза - 10, К2НР04 - 1, MgS04x7H20 - 0.2, СаСОэ - 5, агар-агар -15.

Морфологию и ультраструктуру клеток бацилл при росте на картофельном агаре и модифицированной среде Эшби изучали методами световой фазово-контрастной и электронной микроскопии. Отношение к источникам углерода и энергии и способность к кислотообразованию определяли на синтетической среде следующего состава (г/л): источник углерода и энергии -10, (NH4)2S04 - 0.2, КН2Р04 - 1, MgS04*7H20 - 0.05, агар-агар - 15, бромкрезол пурпуровый - 0.008, водопроводная вода - до 1 л; pH 7.5. Использовались следующие источники углерода и энергии: глюкоза, цитрат, малат, L-арабиноза, D-фруктоза, D-галактоза, мальтоза, лактоза, сахароза, D-ксилоза, трегалоза, глицерин, D-маннит, крахмал.

Отношение к источникам азота изучали на указанной среде с глюкозой, заменяя (NH4)2S04 на мочевину и KNO3. Для изучения устойчивости к лизоциму и способности к росту в присутствии NaCI в среду вносили 0,01% лизоцима и 2 и 5% NaCI. Для определения способности к восстановлению нитратов в среду, вместо (NH4)2S04, вносили 1 г/л KN03; через две недели роста колориметрически определяли присутствие нитритов.

Определение содержания ГЦ-пар в ДНК слизеобразующих бацилл проводили совместно с А.М.Лысенко (ИНМИ РАН) по температуре плавления ДНК методом Мармура (Marmur, 1961). Уровень гомологии ДНК определяли методом оптической реассоциации (De Ley et al., 1970). Анализ 16S-pPHK проводили совместно с Е.С.Булыгиной и Т.П.Туровой.

Опыты по изучению структуры микробного сообщества каолина, динамики его развития и осуществляемой микроорганизмами сообщества трансформации минералов, проводили, используя 60%-ную суспензию каолина Просяновского месторождения в воде с добавлением синтетической среды с глюкозой. Минеральный состав каолина (масс.%): каолинит - 90, слюда -1, иллит - 3-4, кварц - 5. Минералы железа в каолине представлены гематитом а-Ре203, гетитом a-FeOOH, протолепидокрокитом -/-FeOOH и магнетитом Рез04.

Растворенный в жидкости сероводород измеряли методом Трюпера (Tru'per et al., 1964), концентрацию глюкозы - глюкозооксидазным методом (Щербухин и соавт., 1970), pH и Eh - на рН-метре милливольтметре рН-121. Содержание в газовой фазе Нг, СОг, СН4 и летучих жирных кислот определяли методом ГЖХ на приборах Chromatograph N1 модель 3700 и Biotronik HPLC соответственно.

Для диагностики минералов железа в каолине проводили их концентрирование с использованием магнитной сепарации. Последовательно выделяли 4 магнитные фракции: первую фракцию извлекали с помощью ручного магнита с напряженностью магнитного поля Н=1 кЭ, вторую фракцию выделяли на магните Сочнева с Н=4 кЭ, третью и четвертую фракции получали на высокоградиентном электромагнитном сепараторе ЭКЛ-2 в магнитных полях с Н=10 кЭ и Н=15 кЭ соответственно. Определение состава минералов железа в магнитных фракциях проводили, изучая электронномикроскопические изображения, энергодисперсионные спектры и электронные дифрактограммы частиц минералов железа. Для этого использовали микроскоп JEM - 100С с

энергодисперсионной приставкой Kevex - 5100. Определение величин удельной магнитной восприимчивости % каолина и его магнитных фракций проводили на приборе Kappabridge KLY-2 (Чехословакия). О деструкции силикатных минералов судили по результатам рентгено-фазового анализа образцов на рентгеновском дифрактометрическом комплексе Geigerllex (Regaku).

Технологические характеристики обработанных микроорганизмами каолинов и каолинсодержащего сырья определяли совместно с Р.А.Халилулловой по стандартным методикам, принятым при технологическом контроле в производстве фарфора. Измерение белизны (W) образцов фарфора проводили на приборе "Спекол" по ГОСТ 2476891. Спектральные коэффициенты отражения, координаты цвета в системе LAB фарфора определяли на спектроколориметре "Пульсар".

В диссертации приведены данные типичных опытов. Все измерения проводились в трех - пяти повторностях.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение микроорганизмов, участвующих в трансформации породообразующих минералов каолина.

1.1. Изучение естественной микрофлоры каолинов и каолинсодержащего сырья. Все исследуемые образцы каолинов и фарфорового камня характеризуются нейтральной и слабощелочной реакцией (рН 7.2 - 7.8) и небольшим содержанием летучих жирных кислот (табл.1).

Таблица 1

Содержание в исследуемых материалах Соиг и летучих жирных кислот.

Месторождение Сорг, мг/кг Содержание в образцах летучих жирных кислот, мг/кг

формиат ацетат пропионат бутират лактат

Трошковское 314 4.20 2.48 - - -

Журавлиный Лог 123 1.86 8.12 2.03 0.81 0.25

Часов-Ярское 113 4.24 2.89 0.54 2.37 0.25

Ново-Райское 392 5.96 1.71 - - -

Чалганское 363 3.87 4.73 3.46 0.50 0.54

Просяновское 196 4.57 0.69 - - -

Г усевское 108 2.48 1.60 2.18 2.19 0.18

Примечание: "-" - вещество отсутствует.

Во всех исследованных образцах каолина и фарфорового камня присутствует естественная микрофлора, включающая аэробные

гетеротрофные бактерии, бактерии, осуществляющие брожение, денитрифицирующие, сульфатвосстанавливающие и железовосстанавли-вающие бактерии (табл.2).

Таблица 2

Микробиологическая характеристика образцов каолина

и фарфорового камня.

Содержание микроорганизмов, кл/г

Месторождени аэробные броди- денитри- сульфат- железо-

гетеро- льные фицирую- восстанавли- восстанавли-

трофы щие вающие вающие

Трошковское 104 , 102 10 10 -

Журавлиный Лог 102 - 10 - 10

Часов-Ярское 102 10 10 10 единицы

Ново-Райское 104 10 102 10 10

Чалганское Ю5 10 - 10 -

Просяновское 103 102 10 единицы единицы

Гусевское 102 10 - 10 10

Примечание: "-" - микроорганизмы данной группы отсутствуют.

В результате проведенных исследований из Просяновского каолина выделено устойчивое сообщество микроорганизмов и подобрана синтетическая питательная среда, обеспечивающая его поддержание. Среда включает (в г/л): глюкозу - 5, (МН4)2804 - 0,2, К2НР04 - 1, МдЭ04* 7НгО - 0,2 и вносится в суспензию каолина в количестве 20%.

Используя данные липидного состава биомассы сообщества, полученные методом хромато-масс-спектрометрии, расшифрован состав сообщества и количественно оценено соотношение форм микроорганизмов в сообществе. Для этого использовали специальный алгоритм расчета, основанный на сопоставлении жирно-кислотного профиля суммарной биомассы сообщества с известными жирно-кислотными профилями чистых культур микроорганизмов. Полученные результаты подтверждали традиционными микробиологическими методами. Пробу осадка каолина для анализа структуры микробного сообщества отбирали после двухнедельной инкубации суспензии каолина с синтетичесой средой, содержащей глюкозу. К этому моменту численность аэробных гетеротрофных бактерий в осадке каолина составляла 106 кп/г, анаэробных бродильных бактерий - 105 кл/г, сульфатвосстанавливающих бактерий - 105 кл/г, железовосстанав-ливающих бактерий - 102 кл/г.

g

В результате ГХ-МС анализа в метанолизате липидной фракции суммарной биомассы сообщества определено 54 вещества из класса жирных кислот, оксикислот и альдегидов. На основании перечня членов сообщества, выявленных по наличию в биомассе сообщества соответствующих специфических веществ (маркеров), был сформирован банк данных состава липидных компонентов клеток микроорганизмов сообщества каолина. Составлена и оптимизирована система уравнений баланса, в которых концентрация каждого анализируемого вещества биомассы приравнена сумме вкладов членов сообщества, имеющих данное вещество в составе клетки: Aj = £ XjRy/q, где Aj- площадь пика вещества на хроматограмме суммарной биомассы, Xj - число клеток микроорганизма в 1 г пробы, Rjj - процентное содержание ¡-того вещества в жирно-кислотном профиле определяемого j-того микроорганизма, q -коэффициент пропорциональности, учитывающий условия анализа и чувствительность прибора. Жирно-кислотный профиль суммарной биомассы сообщества и детали расчета приведены в диссертации.

В результате анализа остаточного профиля невостребованных компонентов выявлены неучтенные микроорганизмы: анаэробная железовосстанавливающая бактерия, выделенная параллельно из данного сообщества и обозначенная нами как штамм FeRed, и представитель микроскопических грибов. Таким образом, использование метода хромато-масс-спектрометрии, а также специального алгоритма расчета позволило определить в составе микробного сообщества каолина следующие микроорганизмы. Автотрофные бактерии представлены нитрифицирующими бактериями рода Nitrobacter (4*105кл/г). Аэробные и факультативно анаэробные гетеротрофные микроорганизмы представлены бактериями родов Bacillus (9* 10^кл/г), Pseudomonas (3*1 О^кл/г), Burkholderia (Г104кл/г), Nocardia (4*104кл/г), Caulobacter (3*105кл/г), Deinococcus (4*105кл/г) и Arthrobacter (7*104кл/г) и штаммом микроскопического гриба рода Acremonium. Анаэробные микроорганизмы представлены бактериями родов Clostridium (4*105кл/г), Bacteroides (8*103кл/г), Desulfovibrio (1*105кл/г) и Desulfobacter (3*104кл/г). Определение жирно-кислотного профиля клеток штамма FeRed показало, что он содержит редко встречающиеся у бактерий ненасыщенные кислоты - пентадеценовую и гептадеценовую, а также специфический компонент -окситридекановую кислоту, и отличен от жирно-кислотных профилей ранее описанных представителей железовосстанавливающих бактерий

родов Shewanella и Geobacter. Единственный штамм микроскопического гриба имеет дрожжеподобную стадию роста и как доминирующую содержит линолевую кислоту.

1.2. Изучение новых штаммов слизеобразуюших бацилл и уточнение таксономического статуса слизеобразующих бацилл, относимых к "Bacillus mucilaainosus".

Морфолого-культуральные признаки новых изолятов. "В. mucilaginosus subsp. siliceus" и "В.mucilaainosus 148DD". Клетки палочковидные, правильной формы, (1.0-1.3x4-10 мкм), с закругленными концами, часто располагаются парами. Клетки окружены слизистыми капсулами, размеры которых варьируют от 15-20 до 20-25 мкм в зависимости от состава среды. Окраска по Граму положительная. Образуют эллипсоидальные эндоспоры (1-1.2x1.7-2.0 мкм) с 8-10 гребневидными выростами. У штамма "B.mucilaginosus 1480D" спора деформирует спорангий.

Физиолого-биохимические свойства штаммов. Новые изоляты и штаммы "В. mucilaginosus subsp. siliceus" и "B.mucilaginosus 1480D" являются хемоорганотрофными, каталазоположительными бактериями, не способными к росту в анаэробных условиях. Культуры растут в присутствии лизоцима, не гидролиз уют казеин и желатин, не образуют индол, нитрит из нитрата, сероводород на среде с тиосульфатом и газ на среде с глюкозой. Гидролизуют крахмал. Штаммы Т4, Т6, Т7, Т9 и Т15 используют в качестве источника азота нитраты. Штаммы Т2, Т6, Т7, Т8, Т9, Т13, Т14 и Т15 не способны к росту на средах с 2% NaCI; все штаммы, кроме Т6, не способны использовать малат в качестве источника углерода. Оптимальный для роста интервал значений pH составляет от 6.5 до 7.8. Интервал температур роста: от 7-12°С до 38-45°С.

Определение состава жирных кислот. Для штаммов Т7, "В. mucilaginosus" 1480D и "В. mucilaginosus subsp. siliceus" определен суммарный состав жирных кислот липидов клетки. По составу жирных кислот большее сходство наблюдается между штаммами Т7 и "В. mucilaginosus subsp. siliceus". Доминирующие кислоты липидов клеток этих штаммов располагаются по убыванию содержания в следующем порядке: пальмитиновая > стеариновая > антеизопентадекановая. В липидах клеток "В. mucilaginosus" штамма 1480D наоборот преобладает антеизотридекановая кислота - 32,9%.

Анализ ДНК. Нуклеотидный состав ДНК штаммов "В. тисИадтозиз зиЬзр. зШссиз", "В. тисИад'тоБив" 1480Р и новых изолятов варьировал незначительно: от 54.6 до 56.7 мол% Г+Ц, при этом он сильно отличался от нуклеотидного состава В. с/гси/апв (36.7 мол%) и В. ро1утуха (50.0 мол %) (табл.3). Обнаружен высокий уровень сходства ДНК всех новых изолятов (71-99% гомологии). Примерно такой же уровень сходства геномов был обнаружен между группой новых штаммов и штаммом "В. тисНад'тозив яиЬзр. вШсеия" (81-85% гомологий). В то же время уровень сходства геномов группы новых штаммов и "В. тисИадтозиз" штамм 14800 составлял лишь 36-54%. Еще ниже был уровень сходства ДНК у штаммов изучаемых бацилл и вида В. ро1утуха (4-12% гомологий). В ДНК вида В. агси/апэ и ДНК новых изолятов гомологий не обнаружено.

Таблица 3

Результаты ДНК-ДНК гибридизации новых изолятов, штаммов "В.тисИад/повия 14800", "В.тисИад'товия яиЬБр.вШсеия" и типовых штаммов В.ро1утуха и В.агсЫапя._

Штамм С+С, мол.% Гомология в ДНК по отношению к ДНК (%)

Т 3 Т 7 В.тисНад'то-эив 14800 В.ро1утуха ВКМВ 514 В.агси!апя ВКМВ 1224

Т 3 56.7 100

Т 7 56.4 79 100

"В.тисИадтозиз 1480 0" 55.8 50 44 100

В.ро1утуха ВКМ В-514 50.0 7 8 11 100

В.с1гси1апя ВКМ В-1224 36.7 0 0 0 4 100

"В.тисИад'1-позив зиЬвр. зШсеиБ" 56.3 81 85 36 н* н

Т 1 55.9 73 87 54 12 0

Т 2 56.3 84 н н н н

Т 4 56.2 76 99 50 9 0

Т 6 54.6 95 73 41 6 0

Т 8 56.5 94 н н н н

Т 9 55.8 91 71 н н н

Т 13 54.7 88 н 48 н н

Т 14 54.6 90 85 45 н 0

Т 15 55.8 87 73 53 н н

* н - не определяли

- В. сеreus

B.circulans

— B.coagulans

55

[- B.kaustophilus

100 - j

63

90

89

• B.stearothermophihis ■ B.globisporus

- B.pasteurii

— B.sphaericus

85

100

75

— B.brevis

— B.laterosporus B.aneurinolyticm

_B.mucilaginosus

(штамм 1480D)

59

B.edaphicus (штамм T7)

99

■ B.gordonae

I— B.larvae — 100

L B.pulvifaciens

100

74

• B.amylolyticus — B.macquariens

B.pabuli - B.alvei

■ B.macerans

' B.azotofixans

B.polymyxa 0.05

4

Рис. 1 Филогенетическое древо бацилл, основанное на сравнении последовательности 16S рРНК, показывающее положение штаммов Т7 и 1480D в системе рода Bacillus. Корень определен включением последовательности 16S рРНК E.coli в качестве внешней группы. Масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap" анализа 100 альтернативных деревьев; значения < 50 не указаны.

Анализ последовательностей 16S рРНК. Сравнительный анализ 16-S рРНК штаммов Т7 и 1480D, а также различных видов бацилл, в составе которых наиболее полно были представлены бациллы фенотипической группы А, куда входят слизеобразующие формы (Priest F.G. et al., 1988) показал, что штаммы Т7 и 1480D входят в генотипический кластер 3, обнаруженный при анализе значительного количества видов бацилл (Ash et al., 1991). Филогенетическое древо, построенное согласно этим данным представлено на рисунке 1. Внутри кластера 3 штаммы Т7 и 1480D были наиболее близки друг с другом, обнаруживая 96.4% сходства нуклеотидных последовательностей 16S рРНК, а также с видом В. gordonae (96.0-96.6% сходства).

Полученные нами данные позволяют подтвердить таксономический статус предложенного ранее (Авакян и соавт., 1986) вида В. mucilaginosus с типовым (и единственным пока) штаммом 1480D. Приведен уточненный диагноз вида В. mucilaginosus. Кроме того, на основании наших данных можно предложить выделить изученную группу новых штаммов в отдельный новый вид В. edaphicus sp.nov. с типовым штаммом 17. Описанный ранее как "В. mucilaginosus subsp. siliceus" штамм (Александров и соавт., 1950) также следует включить в этот вид. Приведен диагноз вида В. edaphicus sp.nov.

2. Сравнительное изучение воздействия сообщества микроорганизмов и "Bacillus mucilaginosus" на свойства фарфоровой массы при хранении.

Далее проводили сравнение эффективности воздействия штамма Bacillus mucilaginosus и • сообщества микроорганизмов на свойства фарфоровых масс в процессе необходимой технологической стадии -хранения массы й течение заданного времени. Фарфоровые массы представляют собой тонко измельченную смесь основного компонента -каолина с другими силикатными и алюмосиликатными составляющими.

Для этого фарфоровые массы готовили в следующих вариантах: (1) с добавлением стерильной синтетической питательной среды с глюкозой, (2) с добавлением жидкой культуры Bacillus mucilaginosus, выращенной на той же синтетической среде и (3) контрольный вариант - без добавок.

В образуах фарфоровой массы влажностью 25% в динамике хранения определяли колориметрические показатели и численность отдельных групп микроорганизмов.

—V— сульфатвосстанавливающие бактерии —»— бактерии, осуществляющие брожение

Рис.2. Динамика развития микроорганизмов в образцах фарфоровых масс (ФМ).

Т1,%

Рис.3. Спектрофотометрические кривые образцов

фарфоровых масс (ФМ) в динамике хранения.

(а)

2.3 2.2 2.1 2.0

5.0 4.0 3.0 2.0 1. 0

кДж/м2

о .

ВИ ВК ВБ ВС

см3/мин (В)

-- |5|(

, м

ВИ ВК ВБ

(б)

98 96 МП А

94 ■Щ

92

90 [531 [33 ? Щ

88 ш + Ы , ■

1

ВИ ВК ВБ ВС

ВИ - исходная фарфоровая масса (ФМ) ВК - контрольная ФМ ВБ - ФМ, в которую вносили жидкую культуру ВасШив тисИадюозив ВС - ФМ, в которую вносили питательную среду

ВС

Рис.4. Предел прочности образцов фарфора, обожженных при 1320°С: при ударе (а), при изгибе (б); фильтруемость фарфоровой массы (в)

Количественный учет микроорганизмов в динамике хранения фарфоровых масс (рис.2) показывает, что развитие естественной микрофлоры фарфоровой массы стимулируется как при внесении жидкой культуры "В.тисИад/позиз", так и при добавлении синтетической среды с глюкозой. Численность "В. тисНад'товиз" во втором варианте опыта (104 КОЕ/г) не менялась на протяжении опыта. Развитие и смена форм микроорганизмов протекали сходным образом в вариантах 1 и 2. То есть внесение жидкой культуры В.тисИадтозиБ стимулирует развитие тех же групп микроорганизмов, что и при внесении стерильной питательной среды. В варианте без добавок микроорганизмы не развивались.

В опытных вариантах происходит восстановление Ре(III), о чем свидетельствует снижение величин коэффициента отражения фарфоровых масс а области длин волн 500-700 нм (рис.3). Поглощение в указанной области спектра обусловлено в основном наличием хромофорных групп, содержащих 3-х валентное железо.

Стимулирование нативной микрофлоры в обоих опытных вариантах вызвает сходные эффекты: более интенсивно происходит спекание масс, повышаются степень гомогенизации стекломуллитовой матрицы фарфора и механическая прочность (рис.4 а и б).

Влияние метаболитов B.mucilaginosus, а именно - экзополисахари-дов, проявляется только в изменении реологических свойств массы,, что приводит к нежелательному снижению фильтруемости суспензии, полученной из фарфоровой массы (рис.4 в).

Таким образом, сравнительное изучение воздействия сообщества микроорганизмов и "Bacillus mucilaginosus" на свойства фарфоровой массы при хранении позволяет сделать вывод о том, что преимущественный вклад в улучшение свойств фарфора вносит не добавление "Bacillus mucilaginosus", а стимулирование развития естественной микрофлоры составляющих фарфоровую массу материалов.

3. Трансформация минералов каолина под действием микробного

сообщества.

3.1. Динамика развития микробного сообщества в каолине.

Развитие микробного сообщества в каолине при внесении питательной среды протекало в два этапа (рис.5). Первый этап (1-11 сутки) характеризовался активным развитием аэробных и факультативно анаэробных бактерий и бактерий, осуществляющих бродильный метаболизм. Второй этап (12-38 сутки) - возрастанием численности анаэробных бактерий, представленных сульфатвосстанавливающими, железовосстанавливающими и метанобразующими бактериями.

Жизнедеятельность микроорганизмов приводит к образованию органических кислот, диоксида углерода, водорода, сероводорода и метана (рис.6), к снижению pH в надосадочном растворе и к изменению окислительно-восстановительного потенциала в сторону восстановительных значений (рис.7).

3.2. Трансформация минералов железа в каолине при развитии микробного сообщества.

В опытном образце каолина существенно возрастает количество извлекаемого при магнитной сепарации железа, особенно в сильномагнитных фракциях (рис.8). При этом валовое содержание железа в каолине снижается с 0.70% до 0.34%.

lg N [кл/г]

сут

Рис.5. Динамика развития микроорганизмов, а-дени-трифицирующие бактерии; б-аэробные и факультативно анаэробные гетеротрофные микроорганизмы; в-бактерии, осуществляющие брожение; г-сульфат-восстанавливающие бактерии; д- метанобразующие бактерии; е- железовосста-навливающие бактерии, о - количество микроорганизмов в жидкости; • - количество микроорганизмов в осадке.

Рис.6. Динамика потребления глюкозы и образования продуктов метаболизма микроорганизмами сообщества. а - состав газов, б - компоненты среды. ■ -глюкоза; кислоты: о - масляная, Д - уксусная, а - муравьиная, д - молочная, в -пропионовая.

Рис.7. Изменение рН и ЕИ в динамике развития микробного сообщества. а - изменение рН; б - изменение Е1т. ° - жидкая фаза, • - твердая фаза.

В каолине, обработанном микробным сообществом, увеличивается разнообразие минералов железа: повышается выход магнетита, появляются пирит, новые термодинамически нестабильные гидроксиды Ре(Ш) (ферригидрит 5Ре203*9Н20, акаганеит р-РеООН и впервые обнаруженная железистая разновидность гиббситоподобной фазы Ре(ОН)з) (рис.9).

Рис.8. Содержание магнитных фракций в исходном и опытном образцах каолина, а) - исходный образец, б) - опытный образец. 1 - немагнитная фракция; 2 - сильномагнитные фракции 1 и 2 ; 3 - магнитная фракция 3; 4 - магнитная фракция 4.

Рис.9. Некоторые минера- Л3),^^ лы железа: а) - гиббсито- ] ' " подобный гидроксид желе- [ у за (изображение и элект- Г ронная дифрактограмма), | б) - магнетит, образуемый £ штаммом РеЯес! (изображение, электронная диф- | . рактограмма и энерго-дис- I персионный спектр). I

0.5 мкм

(б)

О

5 .

" ^ ё • /"]

' 0.5 мкм

Новообразование магнетита и термодинамически нестабильных гидроксидов железа приводит к росту содержания оксалатрастворимого железа с 1 до 10% от валового. Происходит изменение минерального состава магнитных фракций (табл.4).

Таблица 4

Минеральный состав магнитных фракций каолина

Магнитная фракция Минералы

в исходном образце каолина в образце каолина, обработанного микробным сообществом

№ 1 (Н = 1 ООО Э) каолинит, гематит, магнетит магнетит, гематит, ферригидрит, лепидокрокит

№ 2 (Н = 4 ООО Э) каолинит, гетит, гематит, анатаз магнетит, гематит, гиббсито-подобный гидроксид железа, пирит, анатаз, рутил

№ 3 (Н = 10 ООО Э) магнетит, гетит, ильменит, анатаз гетит по магнетиту, гематит, лепидокрокит, ильменит, анатаз

№ 4 (Н = 15 ООО Э) гетит, гематит, магнетит, прото-лепидокрокит, анатаз гетит, гематит, магнетит, лепидокрокит

Повышение выхода магнетита при магнитной сепарации в опытном варианте может быть следствием как биогенного его образования, так и диспергации минералов каолина под действием микроорганизмов сообщества, приводящей к высвобождению частиц магнетита из сростков с другими минералами, что повышает эффективность магнитной сепарации. Определение минералов осадка, образующегося при культивировании штамма РеЯес!, входящего в состав микробного сообщества каолина, на среде Лавли с аморфным гидроксидом Ре(Ш) методами аналитической просвечивающей электронной микроскопии показало присутствие округлых частиц биогенного магнетита размером менее 0,5 мкм (рис.9), что подтверждает предположение о возможности образования магнетита микроорганизмами сообщества.

3.3. Деструкция силикатных и алюмосиликатных минералов каолина под действием микробного сообщества.

О деструкции силикатных и алюмосиликатных минералов судили по данным рентгенофазового анализа. По данным анализа, в опытных образцах каолина увеличивается вынос с магнитными фракциями кварца, слюд и гидрослюд, что свидетельствует о разрушении контактов между частицами силикатных минералов. Степень кристалличности (упорядоченности) каолина в опытном образце уменьшается на 3% и составляет 60% по сравнению с 63% у исходного образца каолина.

4. Использование процессов микробной трансформации минералов для обогащения каолинов и каолинсодержашего сырья.

В результате исследований, проведенных совместно с Институтом Электрокерамики, предложен метод обогащения каолина и каолинсодержашего сырья. Метод предусматривает, кроме бактериальной обработки, также удаление различных новообразованных форм железа: растворимых (промыванием водой), аморфных и слабоокриталлизованных (промыванием раствором щавелевокислого аммония) и магнитных форм (магнитной сепарацией) (рис. 10).

Метод защищен патентом РФ (Авакян и др., 1995). Его использование проиллюстрировано на примере обогащения каолина Просяновского месторождения.

Рис.10. Технологическая схема обогащения каолинов и каолин-содержащего сырья.

Для интенсификации процесса в качестве посевного материала применяли смешанную культуру микроорганизмов, состав которой описан в разделе 1.1, в качестве питательной среды - синтетическую среду с глюкозой. Использованный в работе каолин содержал 103 клеток/г аэробных бактерий, 102 клеток/г анаэробных бактерий. Состав вносимой в каолин в качестве посевного материала смешанной культуры микроорганизмов отличался более высоким содержанием анаэробных бактерий (до 108 клеток/г).

В контрольном варианте опыта развитие микроорганизмов предотвращалось стерилизацией суспензии каолина.

Вклад каждой ступени обработки в обогащение каолина проанализирован на основании данных химического состава проб каолина, соста-

ва кристаллической фазы в обожженном каолине и его колориметрических характеристик (табл.5).

Таблица 5

Изменение технологических характеристик каолина в процессе обогащения.

Каолин Ре203, % Состав кристаллических фаз Колориметрические показатели

Муллита Кристобалита Координаты цвета Белизна V/, %

1 А В

Исходный 0,81 52 24 93,2 -1,9 9,2 69,6

После бактериальной обработки и отмывания водой 0,75 61 27 94.7 -0,8 7,6 74,7

После отмывания 0,1 Н раствором оксалата аммония 0,70 64 26 95,1 -0,3 6,0 80,2

После магнитной сепарации 0,66 64 26 95,3 -0,6 5,7 81,9

Контрольный каолин после всех видов обработки 0,81 52 24 93,4 -1,7 9,2 70,2

Сопоставляя колориметрические показатели каолина после обжига с содержанием в нем кристаллической фазы (муллита и кристобалита) и общим содержанием оксидов железа, можно заключить, что в основе повышения белизны {Щ каолина лежат два процесса: (1) улучшение колориметрического показателя "светлоты" I. обожженного каолина за счет увеличения количества кристаллической фазы после обжига, обусловленного повышением дисперсности частиц силикатных минералов; (2) улучшение светлоты 1_ обожженного каолина за счет снижения желтизны В, обусловленного удалением оксидов железа.

В контрольном варианте опыта заметного повышения белизны каолина не происходит. Таким образом, апробирование предложенной схемы на образцах каолина Просяновского месторождения показало, что микробиологическая обработка и последующее удаление различных форм железа приводит к повышению белизны изделия с 69,6 до 81,9 % , что соответствует мировым стандартам.

Выводы

1. Изучение распространения микроорганизмов в образцах каолина и фарфорового камня различных генетических типов показало, что во всех исследованных образцах присутствует микрофлора, включающая аэробные гетеротрофные бактерии, бактерии, осуществляющие брожение, денитрифицирующие, сульфатвосстанавливающие и железовосстанавливаю-щие бактерии.

2. Применение нового подхода, заключающегося в соотнесении жирно-кислотного профиля суммарной биомассы сообщества с известными жирно-кислотными профилями чистых культур микроорганизмов различных таксонов позволило расшифровать структуру микробного сообщества каолина Просяновского месторождения.

3. Изучена динамика развития сообщества аэробных и анаэробных бактерий в каолине при добавлении питательной среды. Смена аэробных и факультативно анаэробных форм микроорганизмов - представителей родов Pseudomonas, Bacillus, Arthrobacter, анаэробными, включающими представителей родов Clostridium, Bacteroides, Desulfovibrio, Desultobacter, железовосстанавливающие бактерии, сопровождается выносом железа в раствор, увеличением доли оксалатрастворимого железа и содержания сильномагнитной фракции, представленной в основном магнетитом.

4. Выделен новый вид слизеобразующих бацилл Bacillus edaphicus, включающий как вновь изолированные штаммы, так и ранее описанный штамм Bacillus mucilaginosus subsp. siliceus. Подтвержден таксономический статус вида Bacillus mucilaginosus с типовым штаммом 1480Д.

5. При сравнительном изучении воздействия на свойства фарфоровой массы естественного сообщества микроорганизмов и штамма Bacillus mucilaginosus 1480D показано, что улучшение свойств фарфора достигается за счет стимулирования естественной микрофлоры составляющих фарфоровую массу материалов.

6. Предложена технологическая схема обогащения каолинов и каолин-содержащего сырья, основанная на стимулировании развития естественной микрофлоры каолинов с последующим удалением новообразованных форм железа. Предложенный метод защищен патентом РФ. Он позволяет повысить белизну изделий с 69,6 до 81,9 % , что соответствует мировым стандартам.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Авакян З.А., Платов Ю.Т., Халиуллова Р.А., Турова Е.С., Каравайко Г.И., Масленникова Г.Н., Водяницкий Ю.Н. Способ отбеливания керамических материалов. Заявка на патент № 95116993; Положительное решение от 11.10.95.

2. Турова Е.С., Осипов Г.А. Изучение структуры микробного сообщества, активного в биотрансформации минералов железа в каолине // Микробиология, 1996, т.65, № 5, стр. 682-689.

3. Турова Е.С., Авакян З.А., Каравайко Г.И. Роль сообщества бактерий в трансформации минералов железа в каолине // Микробиология, 1996, т.65, № 6, стр. 837-843.

4. Водяницкий Ю.Н., Турова Е.С., Авакян З.А., Каравайко Г.И. Изучение анаэробиоза в модельном опыте на каолине // Почвоведение, 1997, в печати.

5. Турова Е.С., Авакян З.А., Булыгина Е.С., Турова Т.П., Лысенко A.M., Осипов Г.А.Каравайко Г.И. Описание нового вида слизеобразующих бактерий Bacillus edapicus sp.nov. и подтверждение таксономического статуса Bacillus mucilaginosus (Авакян и соавт. 1986) с использованием данных фенотипического и генотипического анализов // Микробиология. 1997, в печати.

6. Turova, E.S., Z.A. Avakyan, and G.I. Karavaiko. Transformation of iron-containing minerals in kaolin during the development of natural microflora. In: Interaction of Soil Minerals with Organic Components and Microorganisms: Proc. II Ind. Symp. Nancy, France, 3-6 Sept. 1996. Ed. J. Berthelin et.al. (in press), (1997).

7. Osipov G. A. and E. S. Turova. Studying Species Composition of Microbial Communities with the Use of Gas Chromatography-Mass Spectrometry. Microbial Community of Kaolin //. FEMS Microbiology Review. Proc. International Symposium on SUBSURFACE MICROBIOLOGY, 15-21. Sept. 1996, Davos, Switzerland, (in press) (1997).