Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез и свойства экзополисахарида Azotobacter vinelandii

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез и свойства экзополисахарида Azotobacter vinelandii"

На правах рукописи

4843141

ЛОГИНОВ ЯРОСЛАВ ОЛЕГОВИЧ

БИОСИНТЕЗ И СВОЙСТВА ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА АгоюЬас(ег \inelandii

.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

2 7 ян В 2311

Щелково - 2011

4843141

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии наук Институте биологии Уфимского научного центра РАН.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Мелентьев Александр Иванович доктор биологических наук, профессор Денисов Аркадий Алексеевич кандидат технических наук, доцент Прищепов Федор Александрович

Ведущая организация: Астраханский государственный технический университет, г. Астрахань

Защита состоится « » января 2011 года на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности Россельхозакадемии по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево ВНИТИБПРАСХН.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности

Автореферат разослан "сП . 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Ю.Д. Фролов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Известно, что бактерии, принадлежащие к роду Azotobacter vinelandii, при глубинном культивировании образуют значительные количества экзополисахарида (ЭПС), который представлен как в виде капсул, окружающих бактериальные клетки, так и в виде аморфной слизи, распространяющейся в питательной среде (Cohen, Johnstone, 1964, Campos et al., 1996, Sabra et al., 2000).

Реологические свойства ЭПС и их способность формировать гели завися! от молекулярной массы полимера и соотношения углеводных мономеров. Соотношение этих мономеров в бактериальных ЭПС варьирует в зависимости от вида (штамма) и условий культивирования (Smidsrod, Draget, 1996). Благодаря способности воздействовать на реологические свойства водных систем при малых концентрациях бактериальные ЭПС могут найти применение в различных отраслях промышленности. В пищевых производствах в качестве загустителей молочной продукции: йогурт, сметана, твороженные изделия, соусы, майонезы. Микробные полисахариды могут быть стабилизаторами пены при производстве пива и возможно их применение, как стабилизаторов формообразования в кондитерских изделиях. В фармацевтике микробные полисахариды используются в качестве полимерных перевязывающих материалов и матриц, содержащих различные лекарственные препараты. В сельском хозяйстве возможно использование этих продуктов, как инертных прилипателей и пленкообразователей для обработки различной сельскохозяйственной продукции. (Ботвинко, 1985, Гринберг и др., 1991). Полисахариды, водные растворы которых отличаются высокой вязкостью и особой стабильностью при резких изменениях температуры и в условиях агрессивной среды, могут использоваться в нефтяной промышленности для обеспечения более полного извлечение нефти из нефтяных пластов.

На сегодняшний день на рынке России практически нет отечественных микробных биополимеров полисахаридной природы, выпускаемых в промышленных масштабах. В связи с этим представляется актуальным разработка технологии получения биополимера на основе бактериального высоковязкого ЭПС с новыми свойствами и составом.

Цель исследования. Целью исследований являлась оптимизация условий биосинтеза ЭПС штаммом бактерий А2о1оЬас1ег \>те1агиЫ ИБ 1, а также изучение его состава и свойств.

Задачи исследования:

отработать режимы и условия культивирования штамма /\zotobacter \inelandii ИБ 1 для максимального выхода высоковязкого ЭПС,

подобрать условия выделения и очистки ЭПС, продуцируемого штаммом А. \inelandii ИБ 1,

установить химическую природу ЭПС исследуемого штамма,

исследовать физико-химические свойства гелей ЭПС исследуемого штамма.

Научная новизна. Описан новый штамм - продуцент ЭПС (Патент РФ 2343193), разработан способ получения ЭПС альгинатного типа (Патент РФ 2359028). Впервые выделен и охарактеризован бактериальный ЭПС альгинатной природы с уникально высоким содержанием а-Ь-гулуроновой кислоты (82 %), что обусловливает его высокие вязкостные характеристики.

Практическая значимость. Разработаны технологические подходы для промышленного производства высоковязкого биополимера «Азопол» с использованием штамма бактерий А. мтеЬпсШ ИБ 1.

По результатам тестирований в УФ ООО «ЮганскНИПИнефть» биополимер «Азопол» рекомендован к использованию при проведении опытно-промышленных работ для повышения нефтеотдачи.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2006), II Санкт-Петербургском Международном экологическом форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (Санкт-Петербург, 2008), Всероссийской научно-технической конференции «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), XXI Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (г. Уфа, 2008), XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 2 патента Российской Федерации и 3 статьи в научных журналах, рекомендуемых ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 119 страницах, содержит 19 таблиц и 14 рисунков. Список использованной литературы включает 186 наименований, из них 51 на русском языке.

Положения, выносимые на защиту:

- технология получения высоковязкого бактериального ЭПС альгинатной природы;

- структура и свойства высоковязкого бактериального ЭПС альгинатной природы.

Благодарности. Автор выражает благодарность и признательность академику РАИ Ю.Б. Монакову и к.х.н., с.н.с. Мударисовой Р.Х. за оказание методической и технической помощи в получении спектральных анализов и к.б.н., с.н.с. Четверикову С.П. за консультации и участие в обсуждении результатов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве продуцента ЭПС использовали штамм бактерии Аго^Ьааег \inelandii ИБ 1 из Коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН, который ранее был описан, как штамм бактерий для получения биопрепарата в борьбе с болезнями пшеницы, вызываемыми грибными фитопатогенами, и повышения урожая (Патент РФ № 2224791).

Для поддержания культуры, подготовки посевного материала и культивирования использовали питательную среду Федорова следующего состава (г/л): К2НР04 - 0.3, СаПР04 - 0.2, Мё$04 - 0.3, К2804 - 0.2, ЫаС1 - 0.5, РеС13 - 0.01, СаС03 - 5.0, меласса - 60.0.

Влияние природы источника углерода на образование вязкого ЭПС оценивали в среде, состоящей из минеральных составляющих среды Федорова, с использованием следующих углеродных субстратов: глюкозы, сахарозы, мальтозы, крахмала, мелассы, этанола. Культивирование проводили на воздушно-термостатируемой качалке УВМТ-12-250 (160 мин'1) в колбах емкостью 250 мл,

содержащих 100 мл среды в периодических условиях в течение 96 ч при температуре 30 °С.

Оптимизацию условий культивирования проводили с применением метода математического планирования эксперимента (Максимов В.Н., Федоров В.Д, 1969). В эксперименте единовременно проверяли серию вариантов условий культивирования, в которых все компоненты (факторы) варьировались на двух количественных уровнях ("верхнем" и "нижнем").

В качестве четырех факторов варьирования были взяты: содержание мелассы (X]), аэрация (Х2), температура (Х3), продолжительность культивирования (Х4) (табл. 1), содержание остальных компонентов ферментационной среды было зафиксировано, создав, таким образом, полно факторный эксперимент четвёртого порядка (ПФЭ 24).

Влияние принудительной аэрации и перемешивания на вязкость культуральной жидкости было оценено в условиях периодического культивирования в течение 72 ч в ферментерах АК-210 ("СКБ БП", Пущино, Россия) с рабочим объемом 6 л при значениях величины аэрации: 0,25; 0,50; 0,75; 1,00 объемов воздуха на 1 объем среды в 1 мин и перемешивания: 100; 200; 300; 400 мин"'.

Таблица 1

Условия культивирования и их уровни варьирования в ПФЭ 24

Параметр культивирования Фактор Средний уровень «0» Нижний уровень «-» Верхний уровень «+-» Единица варьирования

Содержание мелассы, г/л X, 40 20 60 20

Перемешивание (аэрация), мин"1 Х2 160 120 200 40

Температура, °С X, 30 25 35 5

Продолжительность культивирования, ч х4 96 48 144 48

Объемно-доливпое культивирование проводили в вышеприведенных условиях, где по окончании процесса периодического культивирования сливали культуральную жидкость (70-75% объема), а оставшийся в ферментере объем

культуралыгой жидкости доводили до первоначального свежеприготовленной стерильной питательной средой.

Определение содержания сахарозы в культуралыюй жидкости в процессе биосинтеза ЭПС проводили с помощью выскоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в системе, состоящей из насоса высокого давления модели 572Р ("Gasukuro Kogyo", Япония), детектора - рефрактометра ("Du Pont", CILLA). Для разделения использовали колонку из нержавеющей стали с сорбентом (размер зерна 5 мкм) HP - NH2 (250x4.6 мм, "Hewlett Packard", США). В качестве элюента использовали смесь ацетонитрил - вода (75 : 25) с расходом 1 мл/мин.

Определение кинематической вязкости культуралыюй жидкости осуществляли при помощи стеклянного капиллярного вискозиметра Оствальда при 20 °С (значения в сантистоксах (сСт) или мм7с), динамической вязкости культуралыюй жидкости - с использованием ротационного вискозиметра ВСН-3 (ОАО "Азнефтъхиммаш". Азербайджанская Республика) при 20 "С, скорости вращения гильзы 600 мин"1 и перемешивании исследуемой жидкости в течение 10 мин (значения в сантипуазах (сП) или Па-с).

ЭПС выделяли из культуралыюй жидкости осаждением изопропиловмм спиртом. Осадок промывали чистым изопропиловым спиртом, холодной водой и сушили до постоянной массы. Молекулярную массу 3LIC оценивали мегодом гель - фильтрации на колонке TSK G4000SW (300x7.8 мм, '"Toyo Soda", Япония) при элюнровании 0.15 M хлоридом натрия с расходом 1 мл/мип. В качестве стандартов использовали декстраны. ИК-спекгры записывали на спектрофотометре Specord M 80 ("Carl Zeise", Германия) в области 4000-600 см"1 (толщина пленки 15-20 мк). Спектры ЯМР 'Н регистрировали на спектрометре Bruker АМ-300 ("Bruker", Германия) с рабочей частотой 300 МГц для 2 % - ного расгвора полисахарида при 80 °С, растворитель - D20. Спектры ЯМР 13С регистрировали на спектрометре Bruker АМ-300 ("Bruker", Германия) с рабочей частотой 75,47 МГц для 2 % - ного раствора полисахарида при 80 "С, растворитель — D20.

Изучение термостабилыгости геля ЭПС проводили при 4 - кратном нагревании до 100 ° С и охлаждении до 20 °С. Влияние pH среды на стабильность ЭПС (динамическая вязкость) определяли при 20,40, 60, 80 °С в 0.05 M фосфатной буферной системе в соотношении ЭПС - фосфатная буферная система 3 : 1 в

диапазоне рН 2.0 - 11.0. ЭПС выдерживали в этой системе в течение 30 мин. Влияние солей металлов на стабильность ЭПС исследовали при их концентрации 150 г/л. Использовали хлориды, нитраты и сульфаты калия, натрия, кальция, магния, марганца и железа. Результаты по исследованию стабильности представлены в процентах относительно исходной вязкости ЭПС. Исследования реологических свойств ЭПС проводились на реометре RheoStress-1 ("Haake", Германия), используя три основных вида испытаний - сдвиговый, осциляторный и тест "ползучести", с использованием системы воспринимающих элементов «конус-плоскость».

Для статистической обработки полученных результатов использовали метод вариационной статистики с вычислением средней (М), ошибки средней (т) и уровня значимости (р) по Стьюденту 5%. Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартных компьютерных программ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние природы источника углерода на синтез высоковязкого ЭПС бактериями A. vinelandii И Б 1

Биосинтетическое получение ЭПС осуществляют культивированием микроорганизмов на жидких минеральных средах с источником углерода, в качестве которого обычно используют глюкозу, сахарозу, мальтозу, крахмал, а в последнее время, для удешевления процесса производства, такие непищевые субстраты, как этанол, метанол, или отход производства сахарной промышленности - мелассу (Гринберг и др., 1991).

Данные, отражающие влияние источника углеродного питания на вязкость культур альной жидкости штамма A. vinelandii ИБ I представлены в таблице 2.

Только использование в качестве источника углерода мелассы позволяло получать культуральную жидкость A. vinelandii ИБ 1, обладающую повышенной вязкостью, что можно объяснить особенностями культуры-продуцента, которая нуждается в дополнительных факторах для роста и секреции ЭПС, и наличием этих факторов в составе мелассы. Поэтому все последующие исследования проводили с использованием в качестве источника углерода мелассы.

Таблица 2

Зависимость вязкости культуральной жидкости А. \inelanJii ИБ 1 от природы

источника углерода

Источник углерода Вязкость культуральной жидкости, сСт

Глюкоза 40

Сахароза 55

Мальтоза 43

Крахмал 45

Меласса 630

Этанол 28

Оптимизация условий культивирования бактерий А. ппе1амИ7 ИБ 1 и

биосннтеза ЭПС

Следующим этапом наших исследований явился поиск оптимальных условий биосинтеза ЭПС с максимальной вязкостью при культивировании бактерий А. \-inelandu ИБ 1 в жидкой среде с мелассой. Оптимизацию условий культивирования проводили с применением метода математического планирования эксперимента с варьированием содержания мелассы, аэрации, температуры, продолжительности культивирования, содержание остальных компонентов ферментационной среды было зафиксировано. Согласно плану эксперимента, проведено 17 опытов с различным варьированием изучаемых факторов (табл. 3).

Анализ результатов показал, что крайне негативно на вязкости культуральной жидкости сказывалось увеличение температуры культивирования до 35 °С (во всех вариантах культивирования при этой температуре вязкость ниже среднего уровня), тогда как культивирование при температуре 25 °С давало положительный эффект (варианты 4, 9, 11, 12 табл. 3).

Также положительное воздействие оказывали увеличение содержания мелассы в среде, повышение аэрации и продолжительности культивирования относительно среднего уровня.

В результате проведенного эксперимента были выявлены оптимальные параметры культивирования бактерий Л. \4nelandii ИБ 1 в качалочных колбах, позволяющие получать культуратьную жидкость этих бактерий с вязкостью более 30000 сСт (вариант 12 табл. 3). Дальнейшее увеличение содержания мелассы в среде не являлось целесообразным, так как не наблюдалось увеличения вязкости конечного продукта

Таблица 3

Зависимость вязкости культуральной жидкости А. ппе1апШ ИБ 1 от параметров культивирования

Вариант условий культивирования Содержание мелассы, г/л Перемешивание (аэрация), мин'1 Температура, °С Продолжительность культивирования, ч Вязкость, сСт

1 20 120 25 48 330

2 60 120 25 48 420

3 20 200 25 48 280

4 60 200 25 48 2260

5 20 120 35 48 170

6 60 120 35 48 40

7 20 200 35 48 60

8 60 200 35 48 170

9 20 120 25 144 1040

10 60 120 25 144 460

11 20 200 25 144 2450

12 60 200 25 144 >30000

13 20 120 35 144 120

14 60 120 35 144 230

15 20 200 35 144 150

16 60 200 35 144 110

Средний уровень 40 160 30 96 630

Культивирование А. у'ше1ап<1И ИБ 1 для наработки ЭПС

С учетом данных, полученных при культивировании А. хтеЬпйп ИБ 1 в колбах, было проведено периодическое культивирование в течение 72 ч в ферментерах АК-210 с разными величинами аэрации и перемешивания (табл. 4). Проведенные исследования выявили негативное воздействие на вязкость получаемой культуральной жидкости как низких значений аэрации и перемешивания (недостаток кислорода), так и их высоких значений (ингибирование роста культуры токсическим действием избытка кислорода) (Пирог и др., 1998).

Оптимальными оказались следующие показатели: перемешивание-300 мин"1, аэрация - 0,5 объема воздуха в 1 мин на 1 объем среды.

Сопоставив показатели биосинтеза ЭПС нескольких повторных ферментации А. уте1апсШ ИБ 1 на мелассе в ферментерах при оптимальных

условиях (рис. 1), можно сделать вывод о воспроизводимости процесса биосинтеза по таким показателям, как титр клеток, вязкость культуральной жидкости, выход ЭПС, утилизация сахарозы, продолжительность культивирования.

Таблица 4

Влияние принудительной аэрации и перемешивания на вязкость культуральной жидкости А. \inelandii ИБ 1 (в %-ом отношении)

Перемешивание,

Аэрация^\^ мин"1 объемов воздуха \. 100 200 300 400

на 1 объем среды в 1 мин^\

0.25 6 12 15 10

0.50 25 60 100 22

0,75 4 6 4 <1

1,00 2 4 <1 <1

Следует отметить, что культивирование с перемешиванием и принудительной аэрацией позволило сократить продолжительность культивирования до 40 часов без снижения финальной вязкости культуральной жидкости, выход ЭПС составил 20,5±0,5 г/л.

Биосинтез ЭПС в культуральной жидкости начинался через 20 ч культивирования без увеличения его вязкости, о чем свидетельствует снижение в среде концентрации трансформирующейся сахарозы.

Только в стационарной фазе роста культуры (28 ч) происходил резкий часовой скачок в образовании ЭПС, а также отмечено увеличение вязкости до 15000 сСт за счет связывания образовашегося ЭПС с ионами Са Дальнейшее увеличение вязкости (до 30000 сСт) может быть связано с реструктуризацией образовавшегося ЭПС, как, например, на заключительной стадии биосинтеза альгиновых кислот, где Б - маннуроновая кислота ферментативно эпимеризуется в Ь - гулуроновую кислоту, отвечающую за свойства геля (Усов, 1999).

Время, ч

Рис. 1. Динамика биосинтеза ЭПС и изменения вязкости культуральной жидкости при периодическом культивировании А. \те1ашШ ИБ 1 в ферментере АК-210.

1-титр клеток (*109 КОЕ/мл); 2- выход ЭПС (г/л); 3-вязкость КЖ(*103 сСт); 4~ содержание сахарозы (г/л).

Время, ч

Рис. 2. Динамика биосинтеза ЭПС и изменения вязкости культуральной жидкости при объемно - доливном методе культивирования А. vinelandii ИБ 1 в ферментере АК-210.

1-титр клеток с+10 КОЕ/мл); 2-выход ЭПС (г/л); 3-вязкость КЖ(*103 сСт); 4-содержание сахарозы (г/л).

В целом, характер накопления ЭПС и возрастания вязкости среды, согласуется с данными других авторов, отмечавших резкое повышение концентрации альгинатов в КЖ A. vinelandii по завершении логарифмического роста (Chen et al., 1985; Репа et al., 1997).

Использование процесса объемно - доливного культивирования позволило сократить процесс биосинтеза ЭПС до 20-24 ч без ухудшения его выходных характеристик (рис. 2).

Таким образом, для синтеза ЭПС с максимальной вязкостью при культивировании A. vinelandii ИБ 1 на среде с мелассой необходимы следующие условия: содержание мелассы (содержащей не менее 50% сахарозы) 60 г/л среды, принудительная аэрация и перемешивание, температура - 25 °С. Выход ЭПС в этих условиях к углеродному субстрату при периодическом культивировании доходит до 60 %, в условиях объемно - доливного метода культивирования - до 70%, вязкость получаемой культуральной жидкости выше 30000 сСт.

При соблюдении оптимальных условий культивирования штамм продуцирует ЭПС в шести последовательных ферментациях.

Выделение ЭПС из культуральной жидкости штамма A. vinelandii UR 1

На первом этапе изучали влияние природы растворителя и его концентрации на осаждение экзополисахарида (рис. За). Использование в качестве растворителя ацетона, метанола, этанола и изопропанола в концентрациях 40, 50, 60, 70 % насыщения позволило осадить от 15 до 26 г/л ЭПС. Максимальный выход достигался при использовании 50% метанола (25 г/л) и 60% изопропанола (26 г/л).

На второй стадии оценивали влияние температуры и рН на выделение ЭПС в условиях вышеописанного оптимального варианта с изопропиловым спиртом. Результаты этого этапа исследований представлены на рис. 36, их анализ показывает, что на осаждении ЭПС из культуральной жидкости крайне негативно сказывается значение рН ниже 6 (осаждается меньше 10 г/л) и увеличение температуры выше 30°С (не более 20 г/л), тогда как осаждение в интервале рН 6 - 8 и при температурах ниже 15°С дает положительный эффект (осаждается более 20 г/л). Оптимальным вариантом является использование в качестве осадителя ЭПС

изопропилового спирта 60 % насыщения растворителем к общему объему осаждаемой жидкости при рН 6 и температуре 5 °С (28 г/л).

ЭПС, г/л

30

30 25

яАцетон в Метанол 20 □Этанол и Из опроптл

ю

S о

40 50 60 70 Количество растаорителя, % рИ

масс.

Рис. 3. Зависимость выхода ЭПС от концентрации растворителя (а) и параметров осаждения (температуры и рН) (осадитель - изопропанол) (б).

Химическая природа и структура ЭПС, образуемого штаммом A vinelandii ИБ 1

В настоящее время химическая структура ЭПС A. vinelandii установлена - это линейный полисахарид альгинатной природы, построенный из остатков D-маннуроновой кислоты и ее С-5 эпимера, L-гулуроновой кислоты в различной последовательности и соотношении (Gorin, Spenser, 1966; Сливкин, 2000). Реологические свойства альгинатов и их способность формировать гели зависят от молекулярной массы полимера и соотношения остатков маннуроновой и гулуроновой кислот. Соотношение этих мономеров в бактериальных алъгинатах варьирует в зависимости от вида (штамма) и условий культивирования (Smidsrod, Draget, 1996).

Посредством гель - фильтрации показано, что продуцируемый штаммом А. vinelandii ИБ 1 полисахарид, выходит из колонки одним асимметричным пиком, ограниченным значениями молекулярных масс примерно от 250 до 350 кДа (рис. 4).

500 300 200 100

кДа кДа к Да кДа

H I I

Рис. 4. Гель - хроматограмма ЭПС A. vinelandii И Б 1 на TSK G4000SW (300x7,8 ми, "Toyo Soda", Япония) при элюнровании 0,15 M хлоридом натрия, расход 1 мл/мин.

Согласно данным, представленным в обзоре Galindo с соавторами (Galindo et al. 2007) молекулярная масса альгинатов различных штаммов A. vinelandii варьирует в достаточно широких пределах — от 340 до 4000 кДа кроме того, эта величина в определенной мере зависит от способа культивирования (в колбах или ферментационных аппаратах).

В ИК - спектре полисахарида обнаружены сигналы, характерные для полос поглощения ацетильных групп 1250, 1730 см"', полосы поглощения валентных колебаний пиранозного кольца гулуроновой кислоты (G) 787 и 1290 см"1, и полосы поглощения валентных колебаний пиранозного кольца маинуроновой кислоты (М) 808 и 1320 см"1.

Из спектров ЯМР 'Н и ПС полисахарида видно, что в ero структуре содержится по десять пиков (табл. 5, 6), типичных для спектров альгинатов. Таким образом, на основе данных ИК - и ЯМР - спектроскопии показано, что выделенный полисахарид построен из 1 - 4 связанных остатков Р - D - маинуроновой и а - L - гулуроновой кислот.

Исходя из данных ИК - спектроскопии представляется возможным расчитать величину M/G как соотношение интенсивностей полос поглощения при 808 (М) и 787 см"1 (G) (Усов, 1999). Для исследуемого полисахарида A. vinelandii ИБ 1

величина М/С = 0,22. Это соотношение подтверждается и данными ЯМР -спектроскопии: отношение суммы интегральных интенсивностей сигналов С] - С5 остатков р - Б-маннуроновой кислоты к соответствующей сумме интегральных интенсивностей сигналов С] - С5 остатков а - Ь - гулуроновой кислоты дает ту же величину.

Таблица 5

Характерные химические сдвиги спектра ЯМР 'II ЭГТС А. гте1ап(1п ИБ 1

Кислота Химические сдвиги, м.д.

Н1 Н2 НЗ Н4 Н5

D - маннуроновая кислота 4,79 4,74 4,69 4,72 4,67

L - гулуроновая кислота 4,84 4,72 4,74 4,76 4,82

Таблица 6

Характерные химические сдвиги спектра ЯМР 13С ЭПС A. vinelandii ИБ 1

Кислота Химические сдвиги, м.д.

Cl С2 СЗ С4 С5

D-маннуроновая кислота 105,82 70,84 71,31 78,70 77,56

L-гулуроновая кислота 106,51 65,72 68,83 82,61 68,83

Вязкость и способность к гелеобразованию альгинатных полисахаридов определяется, главным образом, высоким содержанием a- L - гулуроновой кислоты (относительной длиной G - блоков в полимерной цепи) и степенью наличия ацетильных групп. Имеющиеся в литературе данные по вязкостным характеристикам альганатов A. vinelandii трудно сопоставимы, ввиду отсутствия полноты сведений по концентрации ЭПС, плотности культуральной жидкости, скоростей сдвига при определении кинематической вязкости и других параметров. Наиболее приемлемыми для сопоставления с нашими результатами можно считать данные Galindo et al. (Galindo et al., 2007), согласно которым вязкость культуральной среды (0,6% ЭПС), установленная при скорости сдвига 12 с"1 , составляла 560 сП. В наших экспериментах, при концентрации ЭПС в среде 2,0%, кинематическая вязкость составила 9100 сП при скорости сдвига 10 с"1. Следует отметить, что молекулярная масса ЭПС в наших экспериментах существенно ниже

— 250-350 кДа, против 1500-1900 кДа у цитируемых авторов, а уровень накопления ЭПС в культуральной среде выше примерно в 3 раза.

Известно, что бактериальные альгиновые кислоты обычно ацетилированы в положения 2 и/или 3 остатков D - маннуроновой кислоты. Причем содержание более чем 22 % ацетильных групп характерно для альгинатов, состоящих из более чем 55 % остатков маннуроновой кислоты, тогда как полимеры, содержащие до 4 % ацетильных групп, состоят в основном из остатков L-гулуроновой кислоты (Skjak-Braek et al., 1986). Данные ИК - и ЯМР - спектроскопии исследуемого полисахарида указывают на наличие 8 % ацетильных групп, что вкупе с уникально высоким содержанием a- L - гулуроновой кислоты (82%) обуславливает его высокие вязкостные характеристики. Ранее считалось, что для бактериальных альгинатов максимальное содержание a- L - гулуроновой кислоты находится на уровне 56 % (Sutherland, 1995).

Таким образом, новый высоковязкий биополимер представляет собой экзополисахарид альгинатной структуры с преобладанием а - L - гулуроновой кислоты (M/G = 0,22), молекулярная масса которого в интервале 250-350 кДа.

Физические свойства ЭПС, образуемого штаммом A. vinelandii И К 1

Для возможного практического использования ЭПС важной характеристикой является стабильность его свойств в условиях меняющейся внешней среды. Показано, что четырехкратное нагревание до 100 °С с последующим охлаждением до 20 ° С не оказывало существенного деструктивного влияния на гель ЭПС, то есть его вязкость падала незначительно и была обратима (рис. 5). Это свойство может иметь решающее значение для использования ЭПС в условиях нефтяных месторождений с высокой пластовой температу рой.

При оценке влияния рН среды на стабильность биополимера (рис. 6) при температурах 20, 40, 60, 80 °С видно, что экзополисахарид при температуре 20° С сохранял стабильную вязкость в диапазоне рН 4,0-8,0. Динамическая вязкость незначительно снижалась при рН 9,0. При 40 ° С ЭПС сохранял стабильную вязкость в диапазоне рН 5,0-9,0; при 60 °С - в диапазоне рН 5,5-9,0. При 80"С вязкость ЭПС стабильна в диапазоне рН 6,0-8,0. Анализируя данные результаты,

можно сделать вывод о том, что при повышении температуры диапазон рН, при котором гель экзополисахарида сохраняет стабильность, сужается.

Вязкость, % от исх.

90 90

I I

кратность нагревания-охлаждения

Рис. 5. Влияние кратности нагревания до 100 °С и охлаждения до 20 °С на вязкость ЭПС Л. \inelandii ИБ 1

0 2 4 в 8 10 рн 12

Рис. 6. Влияние рН и температуры среды на вязкость ЭПС А. ппе1апс1и ИБ 1

Важной характеристикой стабильности товарного биополимера является его устойчивое гелеобразование в солевых растворах. С этой целью была изучена динамическая вязкость нативного, разбавленного водой и частично гидролизованного ЭПС в средах с хлоридами, нитратами и сульфатами К, N8, Са, М§, Мп и Ре. Выбор этих солей обусловлен их наличием в компонентном составе

пластовых вод. Полученные результаты по стабильности полисахарида, продуцируемого А. \inelandii ИБ 1, свидетельствуют о том, что его вязкостные свойства не терялись в присутствии данных солей (рис. 7).

■ нативный ЭПС И разбавленный ЭПС □ частично гидролизованный ЭПС

Рис. 7. Влияние солей металлов на вязкость ЭПС Л. щпе1апЛи ИБ 1

При добавлении исследуемых сульфатов в культуральную жидкость вязкость нативного ЭПС возрастала до 146 % по отношению к исходной вязкости без добавления солей, разбавленного - до 148 %, частично гидролизованного - до 161%. Повышение вязкости в большей степени наблюдалось под воздействием сульфатов натрия и марганца. Влияние хлоридов на вязкостную стабильность экзополисахарида отличалось от влияния сульфатов. Так, хлориды металлов понижали вязкость ЭПС до 61-84 %, разбавленного и частично гидролизованного ЭПС - до 74-82%. Хлорид железа (III), обладая сильно выраженными свойствами кислоты Льюиса, оказывал отрицательное действие на вязкость геля полисахарида, осаждая его из раствора. Нитраты щелочных и щелочноземельных металлов понижали вязкость как нативного, так и разбавленного ЭПС до уровня 60 - 70 % от

Наименование солей

исходного, на частично гидролизованный ЭПС эти соли оказывали стабилизирующее действие.

Таким образом, новый высоковязкий биополимер является стабильным при рН 4-9 в широком интервале температур, хорошо растворяется в высокоминерализованной воде, сохраняя высокий уровень вязкости.

Реологические характеристики биополимера «Азопол» на основе ЭПС, продуцируемого штаммом A. vinelandii ИБ 1

С учетом способности полисахарида хорошо растворяться в

высокоминерализованной воде, биополимер на его основе был протестирован в качестве потокоотклонягощего агента, применяемого на поздней стадии разработки месторождений с целью регулирования заводнения. Исследованию реологических характеристик были подвержены растворы биополимера различных концентраций (100, 60, 50, 25, 20, 17, 9 %), полученные разбавлением товарной формы водой (минерализация 150 г/л, характерная для пластовых вод Нефтеюганского региона).

Для тестируемых растворов был применен сдвиговый тест при изменении градиента скорости сдвига в диапазоне от 0,01 до 150 с"', показавший значения эффективной вязкости порядка 17,7 Па с для неразбавленного биополимера и 0,03 Па с для 9%-ного раствора при градиенте скорости сдвига 0,01 с"1.

Результаты исследований зависимости напряжения сдвига от градиента скорости сдвига, фильтрационных тестов (табл. 7) на нефтенасьнценных кернах Приобского месторождения в термобарических условиях пласта показали, что биополимер обладает необходимыми регулирующими свойствами.

Таблица 7

Результаты фильтрационных исследований в стадии вытеснения нефти водой и доотмыва полимерным составом

Коэффициент Оста- Градиент Фактор

вытеснения Расход воды, Vn точная давления, оста-

Вытес- нефти, д.е. нефте- мПа/м точно-

няющий агент безводный период конечный безводный период конечный насыщен- ность, % в момент прорыва воды конечный го сопротивления

Пластовая вода 0,38 0,59 0,26 3,07 0,28 0,18 0,11 -

ЭПС - 0,62 - 1,38 0,26 - 1,51 9,47

Так, на стадии доотмыва фактор сопротивления составил 117, а фактор остаточного сопротивления оказался равен 9,4, что является весьма положительным результатом для подобных реагентов. Коэффициент вытеснения при этом увеличился на 3%, а остаточная нефтенасыщенность была снижена на 2%.

Таким образом, положительные результаты испытаний позволяют утверждать о перспективности дальнейшего использования нового биополимера при проведении опытно-промышленных работ для повышения нефтеотдачи.

Токснколого-гагиеническне характеристики биополимера «Азопол»

Представленные выше исследования привели к разработке технологических подходов для промышленного производства высоковязкого биополимера «Азопол» с использованием штамма А. \чпе1ап<Ш ИБ 1.

Токсичность биополимера «Азопол» оценивалась на беспородных белых крысах, белых мышах, морских свинках и кроликах. Проведенный стандартный набор исследований показал, что «Азопол» не представляет опасности острых ингаляционных отравлений, не обладает местным раздражающим влиянием на кожу при повторных контактах, не вызывает воспалительных изменений слизистой оболочки глаза при однократном внесении препарата в конъюнктивальный мешок, не обладает заметным кожно-резорбтивным влиянием, мало опасен (4 класс опасности) при энтеральном введении.

Для оценки возможности аллергизации организма при контакте с продуктом использован тест ГЗТ (гиперчувствительности замедленного тина) на мышах, а также при сенсибилизации на морских свинках с постановкой иммунологических тестов. Разрешающая доза не выявила увеличения индекса ГЗТ у мышей. При обследовании морских свинок положительные кожные тесты у животных опытной группы не выявлены, иммунологические тесты: реакция специфической агломерации лейкоцитов, реакция дегрануляции тучных клеток, - также дали отрицательные результаты.

Таким образом, микробный экзополисахарид «Азопол» не имеет медико-экологических противопоказаний для использования в нефтедобывающей промышленности.

22

ВЫВОДЫ

1. Отработаны режимы и условия периодического и объемно - доливного культивирования штамма Azotobacter vinelandii ИБ 1 для максимальной секреции им высоковязкого ЭПС на среде с мелассой при температуре 25 °С в условиях принудительной аэрации и перемешивания. Выход ЭПС в этих условиях составлял до 70 % к углеродному субстрату (20,5±0,5 г/л) при финальной вязкости культуральной жидкости выше 30000 сСт.

2. Подобраны оптимальные условия выделения и очистки ЭПС A. vinelandii ИБ 1, зависящие от природы и концентрации растворителя - осадителя и физико-химических параметров осаждения. Оптимальным является использование в качестве осадителя ЭПС изопропилового спирта 60 % насыщения растворителем к общему объему осаждаемой жидкости при pH 6 и температуре 5 °С.

3. Методами жидкостной хроматографии, ИК- и ЯМР - спектроскопии показано, что выделенный ЭПС по химической природе альгинат с уникальным преобладанием a-L-гулуроновой кислоты (M/G = 0,22), молекулярная масса которого в интервале 250 - 350 кДа.

4. Биополимер на основе ЭПС стабилен в диапазоне pH 4,0-9,0 в интервале температур 20-100°С, хорошо растворяется в высокоминерализованной воде (минерализация до 150 г/л), сохраняя высокий уровень вязкости.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Черкасова Д.В., Логинов Я.О., Пигильцева С.А., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Оптимизация условий культивирования экзополисахарида Azotobacter vinelandii II Тезисы докладов XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (2-4.10.2006 г., Уфа). Уфа, «Реактив». - 2006. Т. 1. - С. 58-59.

2. Четвериков С.П., Логинов Я.О., Пигильцева С.А., Черкасова Д.В., Логинов О.Н. Оптимизация условий культивирования и биосинтеза экзополисахарида Azotobacter vinelandii II Башкирский химический журнал. - 2006. - № 5. - С. 8-11.

3. Патент РФ № 2343193. Продуцент экзополисахарида / Логинов Я.О., Четвериков С.П., Логинов O.IL, Силищев H.H., МударисоваР.Х.. Заявл. 26.03.2007; опубл. 10.01.2009.

4. Логинов Я.О., Мелентьев А.И., Логинов О.Н., Силищев H.H., Гатауллин А.Г., Дубинина О.Н., Хуснарнзанова Р.Ф., Черняева Н.Ю. Влияние бактерий

Azotobacter vinelandii ИБ 1 и препарата «Азопол» на его основе на макроорганизм // Токсикологический вестник. - 2008. № 3. - С. 41-43.

5. Логинов Я.О., Четвериков С.П., Силшцев H.H., Логинов О.Н. Новый наноматериал на основе продуктов метаболизма бактерий Azotobacter vinelandii И Материалы II Санкт-Петербургского Международного экологического форума «Окружающая среда и здоровье человека» (1-4.07.2008 г. Санкт-Петербург). -Санкт-Петербург: Вестник Российской Военно-медицинской Академии, 2008. - № 3 (23). - Часть II. - С. 485-486.

6. Логинов Я.О., Четвериков С.П. Биополимер на основе продуктов метаболизма бактерий Azotobacter vinelandii // Тезисы докладов Всероссийской научно-технической конференции «Ломоносов-2008». М.: МГУ, 2008, Секция «Биология». - С. 15.

7. Логинов Я.О., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Экзополисахариды на основе продуктов метаболизма бактерий // Материалы XXI Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (1416.10.2008 г., г. Уфа). Уфа, «Реактив». - 2008. - Т. 1. - С. 176-177.

8. Патент РФ № 2359028. Способ получения экзополисахарида альгинатного типа / Логинов Я.О., Четвериков С.П., Логинов О.Н., Силищев H.H. Заявл. 26.03.2007; опубл. 20.06.2009.

9. Логинов Я.О., Худайгулов Г.Г., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Экзополисахариды бактерий родов Azotobacter, Pseudomonas и Bacillus для создания биофунгицидов пролонгированного действия //Аграрная Россия. - 2009. -Специальный выпуск. - С. 125-126.

10. Мирошник В.И., Чернышева Н.В., Бойко Т.Ф., Логинов О.Н., Логинов Я.О. Влияние биоудобрения «Азолен» на урожайность и продуктивность растений сои // Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2009. - № 19. - С. 37-40.

11. Четвериков С.П., Логинов Я.О., Худайгулов Г.Г., Логинов О.Н. Экзополисахариды бактерий Azotobacter и Pseudomonas - основа биополимеров для увеличения нефтеотдачи II Вестник Оренбургского государственного университета. 2009. - № 10. - С. 509-511.

12. Логинов Я.О., Четвериков С.П. Реологические характеристики биополимера «Азопол» // Материалы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». - М.: Изд-во МГУ, 2009. -Микробиология. - С. 9.

13. Логинов Я.О., Худайгулов Г.Г., Четвериков С.П., Мелентьев А.И., Логинов О.Н. Биополимер альгинатной природы с преобладанием L-гулуроновой кислоты // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. - № 3. (принято к печати).

Отпечатано с готового оришнал-макета в ООО «Типограф-У» 450098, г.Уфа, ул.Комсомольская, 2 Заказ №421, т.100,2010, Формат 60x90 1/16. Уч. п.л. 1,5, усл. печ. л. 1,4 Бумага офсетная. Отпечатано методом ризографии.

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Логинов, Ярослав Олегович

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Разнообразие микробных экзополисахаридов.

1.2. Физиологическая роль экзополисахаридов.

1.3. Биосинтез экзополисахаридов.

1.4.Химические и физические свойства экзополисахаридов.

1.5.Выделение микроорганизмов, продуцирующих экзополисахариды.

1.6. Основные методы выделения экзополисахаридов.

1.7. Альгинаты.

1.7.1. Структура и свойства альгинатов.

1.7.2. Источники альгинатов.

1.7.3.Альгинаты, продуцируемые АгогоЬаМег vinelandii.

1.7.4. Использование альгинатов.

1.7.4.1. Альгинаты как полимерные наночастицы и наногели.

1.7.4.2. Культивирование микроорганизмов с использованием гранул, содержащих альгинатный гель.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Условия хранения бактерий АгоюЬа^ег уте1апс1и ИБ 1.

2.3. Исследование влияния природы источника углерода на синтез вязкого ЭПС бактериями АгоЮЬаМег vinelandii ИБ 1.

2.4. Оптимизация условий культивирования бактерий Аго^Ьа^ег уте1апсШ ИБ 1.

2.5. Влияние принудительной аэрации и перемешивания на вязкость культуральной жидкости АгоШЬаМег уте!апсШ ИБ 1.

2.6. Культивирование Аго^Ьа^ег vinelandii ИБ 1 с целью наработки

2.7. Определение остаточной сахарозы в культуральной жидкости при культивировании АгоЮЬас1ег чЪпеЫпйи ИБ 1.

2.8. Определение вязкости культуральной жидкости Ахо1оЪа&ег vinelandiiШ} 1.

2.9. Выделение ЭПС АгоШЬаМег уте1а^п ИБ 1.

2.10. Методы изучения состава и структуры ЭПС Аго^Ъа^ег

У1пе1апс1и ИБ 1.

2.11. Определение рН — стабильности, термостабильности и влияния солей металлов на стабильность ЭПС АгоЮЪаМег уте1ап(Ш ИБ 1.

2.12. Исследование реологических свойств ЭПС АгоШЬаМег уте1апс1И1ДБ 1.

2.13. Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Влияние природы источника углерода на синтез вязкого ЭПС бактериями Аго^Ьа^ег уте1апеШ ИБ 1.

3.2.0птимизация условий культивирования бактерий АгоШЬаМег уте1апсШ ИБ 1 и биосинтеза ЭПС. ^

3.3. Культивирование Аго1оЬас1ег уте1апсШ ИБ 1 с целью наработки ЭПС.

3.4. Выделение ЭПС из культуральной жидкости.

3.5.Химическая природа и структура ЭПС, образуемого штаммом Аго^Ьас1ег уте1апс1п ИБ 1. ^

3.6.Физические свойства ЭПС, образуемого штаммом АгоШЬаМег уте1апсШ ИБ 1.

3.7. Сравнение растворимости ЭПС различных штаммов бактерий Аго1оЬас1ег уте1апсШ в нефтепромысловой пластовой воде. ^

3.8. Реологические характеристики ЭПС, продуцируемого Аго1оЬас1ег уте1апс1И ИБ 1. ^

3.9. Использование ЭПС Аго^ЬаЫег л>1пе1апс1и ИБ 1 для выделения ионов металлов из растворов. ^

3.10. Использование ЭПС АгоЮЬаМег уте1апс1и ИБ 1 для создания биофунгицидов пролонгированного действия. ^

3.11. Токсиколого-гигиенические характеристики биополимера

Азопол».

3.11.1. Назначение биополимера.

3.11.2. Микробиологическая и физико-химическая характеристика микроорганизма- продуцента и МЭПС ^ «Азопол».

3.11.2.1. Характеристика микроорганизма.

3.11.2.2. Физико-химические и микробиологические ^ показатели препарата МЭПС «Азопол».

3.11.3. Применение препарата МЭПС «Азопол».

3.11.4. Токсикологическая оценка штамма бактерий ^ Аго^Ъа^ег уте!апсШ ИБ-1.

3.11.5. Токсичность и опасность при воздействии на организм ^ МЭПС «Азопол».

3.11.5.1. Энтеральное введение.

3.11.5.2. Ингаляционное воздействие.

3.11.5.3. Местное действие.

3.11.5.4. Кожно-резорбтивное действие.

3.11.5.5. Аллергенная активность.

3.11.5.6. Кумулятивные свойства.

3.11.6. Токсикологическая характеристика компонентов ^ питательной среды Федорова.

3.11.7. Гикиенические нормативы при получении МЭПС ^ «Азопол».

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосинтез и свойства экзополисахарида Azotobacter vinelandii"

Актуальность проблемы.

Известно, что бактерии, принадлежащие к роду Azotobacter vinelandii, при глубинном культивировании образуют значительные количества экзополисахарида (ЭПС), который представлен как в виде капсул, окружающих бактериальные клетки, так и в виде аморфной слизи, распространяющейся в питательной среде (Cohen, Johnstone, 1964). Считается, что в природной среде обитания формирование удерживающих влагу цист способствует выживанию клеток в неблагоприятных условиях, а полисахаридный гель, снижая диффузию молекулярного кислорода, защищает нитрогеназную систему от вредного воздействия (Campos et al., 1996, Sabraetal., 2000).

Реологические свойства ЭПС и их способность формировать гели зависят от молекулярной массы полимера и соотношения углеводных мономеров. Соотношение этих мономеров в бактериальных ЭПС варьирует в зависимости от вида (штамма) и условий культивирования бактерий (Smidsrod, Draget, 1996). Благодаря способности воздействовать на реологические свойства водных систем при малых концентрациях бактериальные ЭПС могут найти применение в пищевой, фармацевтической областях промышленности и сельском хозяйстве (Ботвинко, 1985, Гринберг и др., 1991). Полисахариды, водные растворы которых отличаются высокой вязкостью и особой стабильностью при резких изменениях температуры и в условиях агрессивной среды, могут использоваться в нефтяной промышленности для обеспечения более полного извлечение нефти из нефтяных пластов.

На сегодняшний день на рынке России практически нет отечественных биополимеров полисахаридной природы, выпускаемых в, промышленных масштабах. В связи с чем, представляется актуальной разработка нового биополимера на основе бактериального высоковязкого ЭПС с исследованным составом и свойствами.

Цель исследования.

Целью исследований являлась оптимизация условий биосинтеза ЭПС штаммом бактерий A2.0t0ha.cter уте!апсШ ИБ 1, а также изучение его состава и свойств.

Задачи исследования: отработать режимы и условия культивирования исследуемого штамма для максимального выхода высоковязкого ЭПС, подобрать условия выделения и очистки ЭПС, продуцируемого штаммом А. у1пе1апсШ ИБ 1, установить химическую природу ЭПС исследуемого штамма, исследовать физико-химические свойства гелей ЭПС исследуемого штамма.

Научная новизна.

Описан новый штамм - продуцент ЭПС (Патент РФ 2343193) (этого нет в задачах). Впервые выделен и охарактеризован бактериальный ЭПС альгинатной природы с уникально высоким содержанием а-Ь-гулуроновой кислоты (82 %), что обусловливает его высокие вязкостные характеристики. Разработан способ получения ЭПС альгинатного типа (Патент РФ 2359028).

Практическая значимость.

Разработаны технологические подходы для промышленного производства высоковязкого биополимера «Азопол» с использованием штамма бактерий А. vinelandii ИБ 1.

По результатам тестирований в УФ ООО «ЮганскНИПИнефть» биополимер «Азопол» рекомендован к использованию при проведении опытно-промышленных работ для повышения нефтеотдачи.

Апробация работы.

Основные результаты исследований были представлены на XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2006), II Санкт-Петербургском Международном экологическом форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (Санкт-Петербург, 2008), Всероссийской научно-технической конференции «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), XXI Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (г.Уфа, 2008), XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 2 патента Российской Федерации и 3 статьи в научных журналах, рекомендуемых ВАК.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 119 страницах, содержит 19 таблиц и 14 рисунков. Список использованной литературы включает 187 наименований, из них 52 на русском языке.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Логинов, Ярослав Олегович

ВЫВОДЫ

1. Отработаны режимы и условия периодического и объемно -доливного культивирования штамма Azotobacter vinelandii ИБ 1 для максимальной секреции им высоковязкого ЭПС на среде с мелассой при температуре 25°С в условиях принудительной аэрации и перемешивания. Выход ЭПС в этих условиях составлял до 70% к углеродному субстрату (20,5±0,5 г/л) при финальной вязкости культуральной жидкости выше 30000 сСт.

2. Подобраны оптимальные условия выделения и очистки ЭПС А. vinelandii ИБ 1, зависящие от природы и концентрации растворителя— осадителя и физико-химических параметров осаждения. Оптимальным является использование в качестве осадителя ЭПС изопропилового спирта 60% насыщения растворителем к общему объему осаждаемой жидкости при рН 6 и температуре 5 °С.

3. Методами жидкостной хроматографии, ИК- и ЯМР - спектроскопии показано, что выделенный ЭПС по химической природе альгинат с уникальным преобладанием a-L-гулуроновой кислоты (M/G = 0,22), молекулярная масса которого в интервале 250 - 350 кДа.

4. Биополимер на основе ЭПС стабилен в диапазоне рН 4,0-9,0 в интервале температур 20-100°С, хорошо растворяется в высокоминерализованной воде (минерализация до 150 г/л), сохраняя высокий уровень вязкости.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В промышленности в основном используют биополимеры на основе полисахаридов растительного происхождения. Производство растительных полисахаридов носит сезонный характер, невозможно обеспечить контроль их качества, а цены на них во многом зависят от урожаев, которые, в свою очередь, зависят от погодных условий. Дополнительными источниками полисахаридов являются микробные экзополисахариды, полученные путем биосинтеза. Интерес к микробным полисахаридам как к объектам для применения в промышленности объясняется следующим: возможностью получения полисахаридов с заранее определенными свойствами в количествах, требуемых производством; наличием у микробных экзополисахаридов уникальных физических и химических характеристик; пригодностью для употребления в пищу без побочных эффектов, так как остатки Сахаров и структура их гликозидных связей допускают либо переваривание и метаболизм в организме, либо инертность и отсутствие калорийного эффекта; экономической целесообразностью их получения, обусловленной как внеклеточной природой этих полимеров, так и высокой продуктивностью их образования на дешевых субстратах. Такие биополимеры являются экологически чистыми, а их производство -экологически безопасным.

Недостатком производства известных бактериальных экзополисахаридов является высокая требовательность микроорганизмов к условиям и питательной среде. В нашей работе, направленной на решение фундаментальной проблемы биотехнологии, связанной с созданием и характеристикой биоматериалов, и разработкой технологий, основанных на использовании биологически активных соединений нового поколения, получен штамм А. уте1апйп ИБ 1, способный осуществлять синтез экзополисахаридов на дешевых средах с широким набором углеродных субстратов, вплоть до утилизации отходов пищевых производств.

Биополимеры, полученные таким образом, не уступают по физико-химическим, реологическим, технологическим параметрам известным биополимерам, немаловажен экономический эффект.

Решение задач работы связано с комбинированным подходом, сочетающим применение микробиологических методов при изучении условий биосинтеза экзополисахарида высокоэффективным штаммом, химических и биохимических - при определении состава, свойств полисахарида, и биотехнологических методов для разработки технологий использования биополимеров.

В ходе работы были отработаны режимы культивирования штамма АгоШЬаМег уте1ап<йг ИБ 1 для максимальной секреции им высоковязкого ЭПС на среде с мелассой. Подобраны оптимальные условия выделения и очистки ЭПС А. уте1апс!И ИБ 1, зависящие от природы и концентрации растворителя - осадителя и физико-химических параметров осаждения. В конечном итоге был выделен экзополисахарид уникального строения с соответствующими свойствами, обладающий высокой стабильностью.

Биополимеры на основе полисахаридов, водные растворы которых отличаются высокой вязкостью и особой стабильностью при резких изменениях температуры и в условиях агрессивной среды, могут использоваться в нефтяной и газодобывающей промышленности в качестве стабилизаторов и структурообразователей промывных жидкостей, предназначенных для бурения нефтяных и газовых скважин, и обеспечивать более полное извлечение нефти из нефтяных, в том числе и обедненных пластов. В пищевой промышленности биополимеры в зависимости от строения и свойств могут широко применяться в качестве пищевых добавок и способствовать повышению биологической и пищевой ценности тех продуктов, к которым их добавляют.

Комплексное использование биополимеров с биопрепаратами-фунгицидами, а также с антибиотиками фунгицидной природы, в сельскохозяйственной практике позволит пролонгировать действие последних за счет их выхода из образуемой "капсулы" не сразу, а по мере необходимости в течение всего вегетативного периода роста культуры растений.

98

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Логинов, Ярослав Олегович, Щёлково

1. Альба, Н.В. Пектины в производстве йогуртов Текст. / Н.В. Альба, Г.С. Барнашова, Н.П. Ананьева // Биология: теория, практика, эксперимент: Сб. матер. Международной научной конференции. Саранск, 2008. - С.182-186.

2. Беседнова, H.H. Иммунотропные свойства I->3; I->6-ß-D-niK>KaHOB Текст. / H.H. Беседнова, Л.А. Иванушко, Т.Н. Звягинцева, Л.А. Елякова. -Антибиотики и химиотерапия. -2000. №2. - С. 37-44.

3. Ботвинко, И.В. Экзополисахариды бактерий Текст. / И.В. Ботвинко // Успехи микробиологии. 1985. — Т. 20. -С. 79-122.

4. Гельперина, С.Э. Системы доставки лекарственных веществ на основе полимерных наночастиц Текст. / С.Э. Гельперина, В.И. Швец // Биотехнология. 2009. - №3. - С. 8-23.

5. Горюнова, О.Б. Рост гриба Tolypocladium cylindrosporum из гранул кальций-альгинатного геля Текст. / О.Б. Горюнова, Н.С. Марквичев // Биотехнология. -2009. №3. - С. 34-39.

6. Гринберг Т.А., Смоляр С.И., Малашенко Ю.Р., Пирог Т.П., Капиловская Е.Д. // Микробиол. журнал. 1991. Т. 53. № 5. С. 82 96.

7. Гринберг, Т.А. Микробный синтез экзополисахаридов на СгС2 соединениях Текст. / Т.А. Гринберг, Т.П. Пирог, Ю.Р. Малашенко, Г.Э. Пинчук. Киев: Наук. Думка, 1992. -212 с.

8. Егоренкова, И.В. Физико-химические свойства и биологическая активность экзополисахаридов ризобактерий Paenibacillus polymyxa 1465 Текст. / И.В. Егоренкова, A.A. Фомина, К.В. Трегубова, С.А. Коннова, В.В.

9. Игнатов // Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения: Тез. докл. научно-практической конф. — Киев, 2009. С.267.

10. Блинов, Н.П. Химия микробных полисахаридов Текст. / Н.П. Блинов. М.: Высш. шк., 1984. - 200 с.

11. П.Еремеева, C.B. Нефтеокисляющие микроорганизмы природных и техногенных экосистем аридной зоны Текст.: автореф. дис. . канд. биол. наук. / C.B. Еремеева. — Астрахань: Астрахан. гос. тех. ун-т, 2000. 24 с.

12. Звягинцев, Д.Г., Бабьева, И.П., Зенова, Г.М. Биология почв Текст. / Д.Г. Звягинцев, И.П. Бабьева, Г.М. Зенова. М.Ж Изд-во МГУ, 2005. - 445 с.

13. Ибатуллин, P.P. Биополимеры полисахариды для увеличения нефтеотдачи пластов Текст. / P.P. Ибатуллин, И.Ф. Глумов, М.Р. Хисаметдинов, С.Г. Уваров // Нефтяное хозяйство. — 2006. - №3. - С. 46-47.

14. Кириченко, Е.В., Титова, JI.B., Коць, С.Я. Роль экзометаболитов в процессе формирования и функционирования соево-ризобиального симбиоза Текст. / Е.В. Кириченко, JI.B. Титова, С.Я. Коць // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. - №5. - С. 567-570.

15. Козак, Н. Название. Электронный ресурс. -http://www.newchemistrv.ru/printletter.php7n id= 1705. 2003.

16. Кочеткова, A.A. Научно-техническое сотрудничество в области производства и использования пектина Текст. / А.А.Кочеткова, Г.Ф. Фокс, Р. Асмуссен, К. Фишер, Х-У. Эндресс // Пищевая промышленность. 1992. -№10.-С. 64-66.

17. Матора, A.B. Бактериальный полисахарид полимиксан 88А. Основные характеристики и сферы возможного применения Текст. / A.B. Матора, E.H.

18. Игнатова, Д.А. Жемеричкин, И.В. Егоренкова, О.В. Шипин, В.И. Панасенко, Л.Ю. Арсеньева, А.Л. Барковский // Прикладная биохимия и микробиология. 1992. -№5.-С. 731-737.

19. Микробный полисахарид ксантан Текст. / Под ред. Р.И. Гвоздяка, М.С. Мартышевской, Е.Ф. Григорьева, O.A. Литвинчука. Киев: Наук. Думка, 1989.-212 с.

20. Назина, Т.Н. Микроорганизмы нефтяных пластов и использование их в биотехнологии повышения нефтеотдачи Текст. / Т.Н. Назина. М.: ИНМИ РАН, 2000. - 67 с.

21. Николаев, Ю.А. Биопленка «город микробов» или аналог многоклеточного организма? Текст. / Ю.А. Николаев, В.К. Плакунов // Микробиология. - 2007. - №2. - С. 149-163.

22. Няникова, Г.Г. Иммобилизация на хитине Bacillus mucilaginosus — продуцента экзополисахаридов Текст. / Г.Г. Няникова, Е.Э. Куприна, О.В. Пестова, C.B. Водолажская // Прикладная биохимия и микробиология. -2002.-№3.-С. 300-304.

23. Облучинская, Е.Д. Совершенствование комплексной технологии лекарственных средств из фукуса пузырчатого (F. Versiculosus L.) Текст.: автореф. дисс. канд. фарм. наук. / Е.Д. Облучинская. СПб, 2004. - 23 с.

24. Общая биотехнология. Лабораторный практикум. Текст. / М., 2001. -118 с.

25. Оводов, Ю.С. Биогликаны иммуномодуляторы Текст. / Ю.С. Оводов, Р.Г. Оводова, Ю.Н.Лоенко // Химия природных соединений. - 1983. - С. 675694.

26. Патент РФ № 2073712, кл. С 12 N 1/20, 1997.

27. Пирог Т.П., Гринберг Т.А., Малашенко Ю.Р. // Прикл. биохимия и микробиология. 1998. - Т. 34. № 1. - С. 70-74.

28. Пирог, Т.П. Двухстадийный способ получения микробного экзополисахарида этаполана с улучшенными реологическими свойствами Текст. / Т.П. Пирог, Ю.Р. Малашенко, С.К. Воцелко // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. - №4. - С. 429-435.

29. Пирог, Т.П. Особенности синтеза экзополисахарида этаполана на энергетически дефицитных ростовых субстратов Текст. / Т.П. Пирог, Н.В. Высятецкая, Ю.В. Корж // Прикладная биохимия и микробиология. 2007,а. - №1. - С. 32-38.

30. Пирог, Т.П. Образование экзополисахарида этаполана при выращивании Acinetobacter sp. ИМВ В-7005 на смеси фумарата и глюкозы Текст. / Т.П. Пирог, Н.В. Высятецкая, Ю.В. Корж // Прикладная биохимия и микробиология. -2007,6. №6. - С. 790-796.

31. Пирог, Т.П. Влияние условий культивирования на физико-химические свойства экзополисахарида этаполана Текст. / Т.П. Пирог, Ю.В. Корж, Т.А. Шевчук // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. - №1. - С. 58-63.

32. Помогайло, А.Д. Наночастицы металлов в полимерах Текст. / А.Д. Помогало, A.C. Розенберг, И.Е. Уфлянд. М.: Химия, 2000. — 672 с.

33. Практикум по микробиологии Текст. / Под ред. Н.С. Егорова. — М.: Изд-во МГУ, 1976. 307 с.

34. Роль стабилизаторов в производстве кисломолочных продуктов Электронный ресурс. 2005/5005/08/09/rol stabilizatorov-v-5227html. - 2005.

35. Семенова, Е.В. внеклеточные полисахариды микроорганизмов, условия их биосинтеза и физиологическая роль Текст. / Е.В. Семенова, H.H. Гречушкина // Экологическая роль микробных метаболитов / Под ред. Д.Г. Звягинцева. -М.: Изд-во МГУ, 1986. С. 121-130.

36. Свешникова, Е.В. Новые бактерии рода Pseudomonas анатагонисты фитопатогенов и перспективы их использования в сельскохозяйственной практике Текст.: автореф. дисс. . канд. биол. наук. / Е.В. Свешникова. — Уфа, 2003.-23 с.

37. Сливкин, А.И. Полиурониды. Структура, свойства, применение (обзор) Текст. / А.И. Сливкин // Вестник ВГУ. Серия химия, биология. 2000. - С. 30-46.

38. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas Текст. / В.В. Смирнов, Е.А. Киприанова. Киев: Наук, думка, 1990. - 264 с.

39. Сохань, Т.С. Поиск новых бактериальных экзополисахаридов для нефтегазового комплекса Текст. / Т.С. Сохань, Данянь Чжан, И.В. Ботвинко, А.И. Нетрусов // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. №5. - 2008. - С. 62-64.

40. Стяжкин, К.К. Экзогенные полимеры микроорганизмов природных и техногенных экосистем нефтепромысловых районов Текст. / К.К. Стяжкин, И.Ю. Артемкина, JI.B. Заквашевская // Нефтепромысловое дело. №1. - 2007. -С. 21-25.

41. Сургуев M.JL, Горбунов А.Т., Забродин Д.П. и др. Методы извлечения остаточной нефти М.: Недра, 1991. - 347 с.

42. Технология производства йогурта: йогурт, пищевое оборудование Электронный ресурс. — www.protex.ru/solutions / texnonotes/kmn/yogurt.phtml. 2006.

43. Степаненко, Б.Н. Современные проблемы биохимии углеводов Текст. / Б.Н. Степаненко. -М.: Наука, 1977. 55 с.

44. Степаненко, Б.Н. Химия и биохимия углеводов (полисахариды) Текст. / Б.Н. Степаненко. М.: Высш. шк., 1978. - 256 с.

45. Усов А.И. // Успехи химии. 1999. Т. 68. № 11. С. 1051 1061.

46. Чекалова, К.В. Исследование колонизации торфосубстратов грибом Trichoderma viridae при внесении иммобилизованных форм Текст. / К.В. Чекалова, У.И. Подшивалова, Е.С. Игнатьева, Н.С. Марквичев // Известия ТСХА. 2006. - №4. - С. 123-127.

47. Aarons, S. J. A novel gene, algk, fromthe alginate biosynthetic cluster of Pseudomonas aeruginosa Text. / S .J. Aarons, I.W. Sutherland, A.M. Chakrabarty, M.P. Gallagher //Microbiology. 1997. - 143. - P. 641-652.

48. Alvarez, A.M. Black rot of crucifers Text. / A.M. Alvarez // Mechanisms of Resistance to Plant Diseases. Dordrecht: Kluwer Academic Publications, 2000. -P.21-52.

49. Amanullah, A. The influence of impeller type in pilot scale xanthan fermentations Text. / A. Amanullah, L. Serranocarreon, B. Castro, E. Galindo, A. W. Nienow // Biotechnology Bioengineering. 1998. - 57. - P. 95-108.

50. Anderson, A.J. Alternative pathway for the biosyntesis of alginate from fructose and glucose in Pseudomonas mendocina and Azothobacter vinelandii Text. / A J. Anderson, A.J. Hacking, E.A. Dawes // J. Gen. Microbiol. 1987. -133.-P. 1045-1052.

51. Ashby, M.J. Effect of antibiotics on non-growing planktonic cells and biofilms of Escherichia coli Text. / M.J. Ashby, J.E. Neale, S.J. Knott, I.A. Critchley // J. Antimicrob. Chemother. 1994. - 33. - P. 443^152.

52. Boyd, A. Role of alginate lyase in cell detachment of Pseudomonas aeruginosa Text. / A. Boyd, A.M. Chakrabarty // Appl. Environ. Microbiol. -1994.-60.-P. 2355-2359.

53. Boyd, A. Pseudomonas aeruginosa biofilms: role of the alginate polysaccharide Text. / A. Boyd, A.M. Chakrabarty // J. Ind. Microbiol. 1995. -15.-P. 162-168.

54. Boucher, J.C. Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: Role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity Text. / J.C. Boucher, M.J. Schurr, H. Yu, D.W. Rowen, V. Deretic // Microbiology. 1997. - 143. - P. 3473-3480.

55. Castañeda, M. The GacS sensor kinase regulates alginate and poly-ß-hydroxybutyrate production in Azothobacter vinelandii Text. / M. Castañeda, J. Guzman, S. Moreno, G. Espin // J. Bacteriol. 2000. - 182. - P. 2624-2628.

56. Castaneda, M. The global regulators GacA and a s form part of a cascade that controls alginate production in Azothobacter vinelandii Text. / M. Castaneda, J. Sanches, S. Moreno, C. Nunes, G. Espin // J. Bacteriol. 2001. - 183. - P. 67876793.

57. Cerning, J. Isolation and characterization of exopolysaccharides from slime-forming mesophilic lactic acid bacteria Text. / J. Cerning, C. Bouillanne, M.J. Desmazeaud, M.J. Landon // J. Dairy Sei. 1992. - 75. - P. 692-699.

58. Chandrasekaran, M., 1997. Industrial enzymes.from marine microorganisms: The Indian scenario. Text. / M. Chandrasekaran // J. Mar. Biotechnol. -1997. 5. -P. 86-89.

59. Chen, W.P. Bacterial alginate produced by mutant of Azothobacter vinelandii Text. / W.P. Chen, J.Y. Chen, C.L. Su // Appl. Environ. Microbiol. -1985.-49.-P. 543-546.

60. Cheze-Lange, H. Production of microbial alginate in a membrane bioreactor Text. / H. Cheze-Lange, D. Beunard, P. Dhulster, A.-M. Caze, M. Morcellet, N. Saude, G.-A. Junter // Enzyme and Microbial Technology. 2002. - 30. - P. 656661.

61. Clementi, F. Optimal conditions for alginate production by Azotobacter vinelandii Text. / F. Clementi, P. Fantozzii, F. Mancini, M. Moresi // Enzyme Microbiol. Technol. 1995. - 17. P. 983-988.

62. Clementi, F. Rheological behaviour of aqueous dispersions of bacterial sodium alginate Text. / F. Clementi F. Mancini, M. Mancini, M. Moresi // Engeneering and food at ICEF7, 1997. Part I. — Scheffild Academic press. - P. 25-28.

63. Clementi, F. Production and characterisation of alginate from Azotobacter vinelandii Text. / F. Clementi, M.A. Crudele, E. Parente, M. Mancini, M. Moresi // J. Sei. Food. Agric. 1999. - 79. - P. 602-610.

64. Cochran, W.L. Role of RpoS and AlgT in Pseudomonas aeruginosa biofiXm resistance to hydrogen peroxide and monochloramine Text. / W.L. Cochran, S.J.

65. Suh, G.A. McFeters, P.S. Stewart // J. Appl. Microbiol. 2000. - 88. - P. 546553.

66. Cohen G.H., Johnstone D.B. // J. Bacteriol. 1964. V. 88. P. 329 338.

67. Conti, E. Alginate from Pseudomonas fluorescens and P. putida: production and properties Text. / E. Conti, A. Flaibani, M. O'Regan, I.W. Sutherland // Microbiology. 1994. - 140. - P. 1125-1132.

68. Cote, G.L. Characterization of the exocellular polysaccharides from Azotobacter chroococcum Text. / G.L. Cote, L.H. Krull // Carbohydrate Research. -1988.-181. —P.143-152.

69. Danese, P. N. Exopolysaccharide production is required for development of Escherichia coli K-12 biofilm architecture. Text. / P.N. Danese, L.A. Pratt, R. Kolter // J. Bacteriol. 2000. - 182. - P. 3593-3596.

70. Davidson, P. Localization of O-acetil groups in bacterial alginate Text. / P. Davidson, I.W. Sutherland and C.J. Lawson // J. Gen. Microbiol. 1977. - 98. - P. 603-606.

71. De Souza, A.M. Exopolysaccharide and storage polymer production in Enterobacter aerogenes type 8 strains. Text. / A.M. De Souza, I.W. Sutherland // J. Appl. Bacteriol. 1994. - 76. - P. 463-468.

72. Draget, K.I. Alginates from Algae Text. / K.I. Draget, O. Smidsrad, G. Skjâk-Brask // Polysaccharides and Polyamides in the food industry. Properties, Production, and Patents. WILEY -VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2005.-P. 1-30.

73. Ertesväg, H. Cloning and expression of an Azothobacter vinelandii mannuronan C5 epimerase // J. Bacteriol. 1994. - 176. - P. 2846-2853.

74. Ertesväg, H. A family of modular type mannuronan C5 epimerase genes controls the alginate structure in Azothobacter vinelandii Text. / H. Ertesväg, H.K. H0ydal, I.K. Hals, A. Rian, B. Doseth, S. Valla // Mol. Microbiol. 1995. -16.-P. 719-731.

75. Ertesväg, H. Genetics and biosynthesis of alginates Text. / H. Ertesväg, S. Valla, G. Skjak-Brask // Carbohydr. Eur. 1996. - 14. - P. 14-18.

76. Ertesväg, H. Biosynthesis and applications of alginates Text. / H. Ertesväg, S. Valla // Polym. Degrad. Stabil. 1998 a. - 59. - P. 85-91.

77. Ertesväg, H. The Azothobacter vinelandii mannuronan C-5 epimerase AlgEl consists of two separate catalytic domains alginates Text. / H. Ertesväg, H.K. Hay dal, G. Skjäk-Br^k, S. Valla // J. Biol. Chem. 1998 6. - 273. - P. 3092730937.

78. Escalante, A. Enzymes involved in carbohydrate metabolism and their role on exopolysaccharide production in Streptococcus thermophilus Text. / A.Escalante, C. Wacher-Rodarte, M. Garcia-Garibay, A. Farres // J. Appl. Microbiol. 1998. - 84. - P. 108-114.

79. Evans, L.R. Production and characterization of the slime polysaccharide of Pseudomonas aeruginosa Text. / L.R. Evans, A. Linker // J. Bacteriol. 1973. -116.-P. 915-924.

80. Fujihara, M. The effect of the content of D-mannuronic acid and L-guluronic acid blocks in alginates on mtitumor activity Text. / M. Fujihara, T. Nagumo // Carbolydr. Res. -1992. 224. - P. 343-347.

81. Farres, J. Influence of phosphate on rhamnose-containing exopolysaccharide rheology and production by Klebsiella 1-174 Text. / J. Farres, G. Caminal, J. Lopez-Santin // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - 48. - P. 522-527.

82. Fett, W.F. Alginate production by plant-pathogenic Pseudomonas Text. / W.F. Fett, S .F. Osman, MX. Fishman // Ibid. №3 p. 466-473.

83. Fuchs, S. Synthesis of le van by Pseudomonas Text. / S. Fuchs // Nature. — 1956. №4539 - P. 921-922.

84. Gacesa, P. Bacterial alginate biosynthesis recent progress and future prospects Text. / P. Gacesa // Microbiology. - 1998. - 114. - P. 1133-1143.

85. Galindo E., Pena C., Nünez C., Segur D., Espin G. // Microb. Cell Fact. 2007. V. 6. P. 1 16.

86. Gancel, F. Exopolysaccharide production by Streptococcus salivarius spp. thermophilus culture 1. Conditions of production Text. / F. Gancel, G. Novel // Conditions of production. J. Dairy Sei. 1994. - 77. - P. 685-688.

87. Gander, S. Bacterial biofilms: resistance to antimicrobial agents Text. / S. Gander // J. Antimicrob. Chemother. 1996. - 37. - P. 1047-1050.

88. Garcia-Ochoa, F. Xanthan gum: production, recovery, and properties Text. / F. Garcia-Ochoa, V.E. Santos, J.A. Casas, E. Gomez // Biotechnol. Adv. 2000. - 18.-P. 549-579.

89. Geddie, G.LThe effect of acetylation on cation binding by algal and bacterial alginates Text. / G.L. Geddie, I.W. Sutherland // Biotechnol. Appl. Biochem.-1994. -20.-P. 117-129.

90. Gelperina, S. Brain delivery by nanoparticles Text. / S. Gelperina // Nanoperticles Technology for Drud Delivery. New York: Taylor and Francis, 2006.-P. 273-318.

91. Gombotz, W.R. Protein release from alginate matrices Text. / W.R. Gombotz, S.F. Wee // Adv. Drug Deliv. Rev. 1998. - 31. - P. 267-285.

92. Gorin, P.A. Extracellular alginic acid from Azothobacter vinelandii Text. / P.A. Gorin, J.F.T. Spenser // Can. J. Chem. 1966. - 44. - P. 993-998.

93. Grobben, G.J. Influence of ions on growth and production of exopolysaccharides by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB 2772 Text. / G.J. Grobben, I.C. Boels, J. Sikkema, M.R. Smith, J.A.M. De Bont, // J. Dairy Res.-2000.-67.-P. 131-135.

94. Hammand, A.M.M. Evaluation of alginate encapsulled Azothobacter croococcum as a phage-resistant and effective inoculum Text. / A.M.M. Hammand // J. Basic. Microbiol. 1998. - 1. - P. 9-16.

95. Hentzer, M. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function Text. / M. Hentzer, G.M. Teitzel, G.J. Balzer, A. Heydorn, S. Molin, M. Givskov, M.R. Parsek // J. Bacteriol. 2001. - 183. - P. 5395-5401.

96. Hoydal, H. Biochemical properties and mechanism of action of the recombinant Azotobacter vinelandii mannuronan C-5 epimerase Text. / H. Hoydal, H. Ertesväg, B.T. Stokke, G. Skjak-Brask // J. Biol. Chem. 1999. - 274. -P. 12316-12322.

97. Hoyle, B.D. Bacterial resistance to antibiotics: the role of biofilms Text. / B.D. Hoyle, J.W. Costerton // Prog. Drug. Res. 1991. - 37. - P. 91-105.

98. Jain, R.K. Delivery of molecular medicine to solid tumors: lessons from in vivo imaging of gene expression and function Text. / R.K. Jain // J. Control. Release. 2001. - V. 74. - P. 7-25.

99. Jarman, T.R. Investigation of the effect of environmental conditions of the role of exopolysaccharide synthesis in Azothobacter vinelandii Text. / T.R. Jarman, L. Deavin, S. Slocombe, R.C. Righelato //J. of General Microbiology. -1978. 107.-P. 59-64.

100. Jensen, E.T. Human polymorphonuclear leukocyte response to Pseudomonas aeruginosa grown in biofilms Text. / A. Kharazmi, K. Lam, J.W. Costerton, N. H0iby / /Infect. Immun. 1990. - 58. - P. 2383-2385.

101. Kaul, G. Biodistribution and targeting potential of polyethylene glycol)-modified gelatin nanoparticles in subcutaneous mutine tumor model Text. / G. Kaul, M. Amiji // Drug Target. 2004. - V. 12. - P. 585-591.

102. Kidambri, P.S. Copper as a signal for alginate synthesis in Pseudomonas syringae pv. Syringae Text. / P.S. Kidambri, G.W. Sundin, A.D. Palmer, M.A. Chakrabarty, L.C. Bendar // Appl. Environ Microbiol. 1995. — 61. -P. 2172-2179.

103. Kreuter, J. Nanoparticles Text. / J. Kreuter // Encyclopedia of Phermaceutical Technology. 1994. -V.10. - P. 165-190.

104. Kumar, A.S. Bacterial exopolysaccharides — a perception Text. /A.S. Kumar, K. Mody, B. Jha // Journal of Basic Microbiology. -2007. 47. - P. 103117.

105. Larsen, B. Biosynthesis of alginate. Part 1. Composition and structure of alginate prodused by Azothobacter vinelandii Text. / B. Larsen, A. Haug // Carbohydrate Research. 17. - P. 287-296.

106. Linkerhägner, K. Cellular ATP level and nitrogenase switchoff upon oxygen stress in chemostat cultures of Azothobacter vinelandii Text. / K. Linkerhägner, J. Oelze // J. Bacteriol. 1995. - 177. - P. 5289-5293.

107. Linkerhägner, K. Nitrogenase activity and regeneration of the cellular ATP pool in Azothobacter vinelandii adaoted to different oxygen concentrations Text. / K. Linkerhägner, J. Oelze // J. Bacteriol. 1997. - 179. - P. 1362-1367.

108. Lu, G.T. The role of glucose kinase in carbohydrate utilization and extracellular polysaccharide production in Xanthomonas campestris pathovar campestris Text. / G.T. Lu, Z.J. Yang, F.Y. Peng, Y.N. Tan, Y.Q. Tang, J.X.

109. Feng, D.J. Tang, Y.Q. He, J.L. Tang // Microbiology. 2007. - 153. - P. 42844294.

110. Maharaj, R. Sequence of the alg8 and alg44 genes involved in the synthesis of alginate by Pseudomonas aeruginosa Text. / R. Maharaj, T. B. May, S. K. Wang, A. M. Chakrabarty // Gene. 1993. - 136. - P. 267-269.

111. Manojlovic, V. Investigations of cell immobilization in alginate: rheological and electrostatic extrusion studies Text. / V. Manojlovic, J. Djonlagic, B. Obradovic, V. Nedovic, B. Bugarski // J. Chem. Technol.Biotechnol. 2006. -81.-P. 505-510.

112. Moe, S.T. Alginates Text. / S.T. Moe, K.I. Draget, G. Skjak-Brask, O. Smidsrod // Food polysaccharide and application. 1995. — New York. — P. 245-286.

113. Moreno, C. The mitogenic immunogenic and tolerogenic properties of dextran and levan. Lack of correlation according to differences of molecular structure and size Text. / C. Moreno, Ch. Hale, L. Ivangi // Immunology. 1977. №2 —P.261-267.

114. Morin, A. Screening of polysaccharide-producing microorganisms, factors influencing the production and recovery of microbial polysaccharides

115. Text. / A. Morin // Polysaccharides — Structural Diversity and Functional Versatility. Inc. Publication, New York, 1998. - P. 275-296.

116. Moshiri, F. The nitrogenase protective FeSII protein of Azothobacter vinelandii: over-expression, characterization and crystallization Text. / F. Moshiri, B.R. Crouse, M.K. Johnson, R.J. Maier // Biochemistry. 1995. - 34. -P. 12973-12982.

117. Mozzi, F. Exopolysaccharide production by Lactobacillus casei. I. Influence of salts Text. / F. Mozzi, G.S. de Giori, G. Oliver, G.F. de Valdez // Milchwissenschaft. 1995. - 50. - P. 186-188.

118. Neidleman, S. Microbial production of biochemical. The genetic engineer and biotechnologist Text. / S. Neidleman // Biopaper. J. 1991. - №3. -20-22.

119. Nivens, D.E. Role of alginate and its O acetylation in formation of Pseudomonas aeruginosa microcolonies and biofilms Text. / D.E. Nivens, D. E. Ohman, J. Williams,'and M. J. Franklin // J. Bacteriol. 2001. - 183. - P. 10471057.

120. Nunez, C. The Azothobacter vinelandii response regulator AlgR is essential for cyst formation Text. / C. Nunez, S. Moreno, G. Soberon-Chavez, G. Espin // J. Bacteriol. 1999.-181.-P. 141-148.

121. Nunez, C. Role of Azotobacter vinelandii mucA and mucC gene products in alginate production Text. / C. Nunez, R. Leon, J. Guzman, G. Espin, G. Soberon-Chavez // Journal of Bacteriology. 2000. - 182. - P. 6550-6556.

122. Obika, H. Direct control of the constituent ratio in a wide range in alginate produced by Azothobacter vinelandii Text. / H. Obika, J. Sakakiba, Y. Kobayashi // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1993. - 57. - P. 332-333.

123. Okabe, E. Investigation of carbon and phosphorous sources in cultural media of a selected strain of alginate producing Azotobacter vinelandii Text. / E. Okabe, M. Nakayima, H. Murooka, K. Nisizawa // J. Ferment. Technol. -1981. -59.-P. 1-7.

124. Okamoto, Y. Resolution by high-performance liquid chromatography using polysaccharide carbamates and benzoates as chiral stationary phases Text. / Y. Okamoto, Y. Kaida // Journal of Chromatography. 1994. - 666. - P. 403-419.

125. Onosoyen, E. Commercial applications of alginates Text. / E. Onosoyen // Carbohydr. Eur. 1996. - 14. - P. 26-31.

126. O'Toole, G. Biofilm formation as microbial development Text. / G. O'Toole, H. B. Kaplan, R. Kolter // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - 54. - P. 4979.

127. Otterlei, M. Induction of cytokine production from human monocytes stimulated with alginate Text. / M. Otterlei, K. Ostgaard, G. Skjak-Braek, O. Smidsrod, P. Soon-Shiong, T. Espevik // J. Immunother. 1991. - 10. - 286-291.

128. Padera, T.P. Cancer cells compress intratumour vessels Text. / T.P. Padera, B.R. Stoll, J.B. Tooredman, D. Capen, E. di Tomaso, R.K. Jain // Nature. -2004.-V. 427.-P. 695.

129. Page, W.J. Relationship between caltium and uronic acids in the encystment of Azothobacter vinelandii Text. / W.J. Page // J. Bacteriology. -1975.-№1.-P. 466-473.

130. Pandey, A. Iron requirement and search for siderophores in lactic acid bacteria Text. / A. Pandey, F. Bringel, J.M. Meyer // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. 40.-P. 735-739.

131. Parente, E. Alginate production by Azotobacter vinelandii DSM576 in batch fermentation Text. / E. Parente, M.A. Crudele, M. Aquino, F. Clementi // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1998. - 20. - P. 171-176.

132. Pena, C. Evolution of alginate molecular weight distributions, broth viscosity and morphology of Azotobacter vinelandii cultured in shake flasks Text. / C. Pena, N. Campos, E. Galindo // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. - 48. - P. 510-515.

133. Pena, C. Influence of the dissolved oxygen tension on the polymer molecular weight produced by Azotobacter vinelandii Text. / C. Pena, N. Trujillo-Roldan, E. Galindo // Enzyme Microb. Technol. 2000. - 27. - P. 390-398.

134. Pier, G.B. Role of alginate O acetylation in resistance of mucoid Pseudomonas aeruginosa to opsonic phagocytosis Text. / G.B. Pier, F. Coleman, M. Grout, M. Franklin, and D.E. Ohman // Infect. Immun. 2001. - 69. - P. 18951901.

135. Pollock, T.J. Gellan-related polysaccharides and the genus Sphingomonas Text. / T.J. Pollock // J. Gen. Microbiol. 1993. - 139. - P. 19391945.

136. Rehm, B.N.A. Bacterial alginates: biosynthesis and applications Text. / B.N.A. Rehm, S. Valla // Applied Microbiology and Biotechnology. -1997.-48.-P. 281-288.

137. Rehm, B.N.A. Alginate lyase from Pseudomonas aeruginosa CF1/M1 prefers the hexameric oligomannuronate as substrate Text. / B.N.A. Rehm // FEMS Microbiol. 1998. - 165. - P. 175-180.

138. Sabra, W. Function and variation of alginate production in Azothobacter vinelandii Text. / W. Sabra, A.-P. Zeng, W.-D. Deckwer // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - 66. - P. 4037-4044.

139. Sabra, W. Bacterial alginate: physiology, product quality and process aspects Text. / W. Sabra, A.-P. Zeng, W.-D. Deckwer // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - 56. - P. 315-325.

140. Savalgi, V. Alginate production by Azotobacter vinelandii in batch culture Text. / V. Savalgi, V. Savalgi // J. Gen. Appl. Microbiol. 1992. - 38. -P.641-645.

141. Schierholz, J.M. Antimicrobial substances and effects on sessile bacteria Text. / J.M. Schierholz, J. Beuth, D. König, A. Nürnberger, G. Pulverer // Zentralbl. Bakteriol. 1999. - 289. - P. 165-177.

142. Skjäk-Brask, G. Monomer sequence and acetylation patterns in some bacterial alginates Text. / G. Skjäk-Braek, H. Grasdalen, B. Larsen // Carbohydrate Research 1986. - 154. - 239-250.

143. Skjäk-Brask, G. Alginate: biosynthesis and some structure function relationships relevant to biomedical and biotechnological applications Text. / G. Skjak-Brask // Biochem. Soc. Trans. 1992. - 20. - P. 27-33.

144. Skjak-Brask, G. Application of alginate gels in biotechnology and medicine Text. / G. Skjäk-Brsek, T. Espevik // Carbohydrate in Europe. -1996. — 14.-P. 19-25.

145. Smidsrod, O. Chemistry and physical properties of alginates Text. / O. Smidsrod, K.I. Draget // Carbohydrate in Europe. -1996. 14. - P. 6-13.

146. Southwick, J.G. Self-Association of xanthan in aqeous solventsystems Text. / J.G. Southwick, H. Lee, A.M. Jameson, J. Blackwell // Carbohydrate Research. 1980. - Vol. 84. - P. 287-295.

147. Stanier, R.V. The aerobic Pseudomonas, a taxonomic study Text. / R.V. Stanier, N.J. Palleron, M. Doudoroff // J. of General Microbiology. 1966. -№2.-P. 159-271.

148. Sutherland, I.W. Bacterial exopolysaccharides Text. / I.W. Sutherland // Advances in Microbial Physiology. Academic Press, London - New York, 1972.-P. 143-213.

149. Sutherland, I.W. Biosynthesis and composition of gram-negative bacterial extracellular and wall polysaccharides Text. / I.W. Sutherland // Ann. Rev. Microbiol. 1985. - №3. - P. 243-270.

150. Sutherland, I.W. Biotechnology of microbal exopolysaccharides Text. / I.W. Sutherland. Cambrige: Cambrige University Press, 1990.-215 p.

151. Sutherland, I.W. Stucture-function relationships in microbal exopolysaccharides Text. / I.W. Sutherland // Biotechnology Advances. 1994. -12.-P. 393-448.

152. Sutherland, I.W. Polysaccharide lyases f rorn gellan-producing Sphingomonas spp. Text. / I.W. Sutherland, L. Kennedy // Microbiol. 1996. -142. - P. 867-872.

153. Trujillo-Roldan, N. Components in the inoculum determine the kinetics of the Azotobacter vinelandii cultures and the molecular weight of its alginate Text. / N. Trujillo-Roldan, C. Pena, E. Galindo // Biotechnology Letters. -2003.-25.-P. 1251-1254.

154. Valla, S. Genetic and biosynthesis of alginates Text. / S. Valla, H. Ertesvâg, G. Skjâk-Brask// Carbohydr. Eur. -2005. 14. - P. 14-18.

155. Vanhooren, P. Biosynthesis, physiological role, use and fermentation process characteristics of bacterial exopolysaccharides Text. / P. Vanhooren, E.J. Vandamme // Recent Res. Devel. Fermen. Bioeng. 1998. - 1. - P.253-299.

156. Vermani, M.V. Novel exopolysaccharide production by Azotobacter vinelandii MTCC 2459, a plant rhizosphere isolate Text. / M.V. Vermani, S.M. Kelkar, Y. Kamat // Lett. Appl. Bacteriol. 1997. - 24. - P. 379-383.

157. Watnick, P.I. Steps in the development of a Vibrio cholerae El Tor biofilm Text. / P.I. Watnick, R. Kolter // Mol. Microbiol. 1999. - 34. - P. 586595.

158. Whitfield, C. Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia coli. Text. / C. Whitfield, I. S. Roberts // Molecular Microbiology. 1999. -31. - P. 1307-1319.

159. Williams, A.G. Exopolysaccharide production by Pseudomonas NCIB 11264 grown in batch culture Text. / A.G. Williams, J.W.T.Wimpenny // J. Gen. Microbiol. 1977. - 102 - P. 13-21.

160. West, T.P. Effect of carbon source on exopolysaccharide production by Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461 Text. / T.P. West, B. Strohfus // Microbiol. Res. 1998. - 153. - P. 327-329.

161. Wong, T.Y. Alginate lyase: a review of major sources and enzyme characteristics, structure-function analysis, biological roles, and applications Text. / T.Y. Wong, L.A. Preston, N.L. Schiller // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - 54. -P. 289-340.

162. Yi, Y. A polymeric nanoparticle consisting of mPEG-PLA-Toco and PLMA-COONa as drug carrier: improvements in cellular uptake and biodistribution Text. / Y. Yi, J.H. Kim, H.W. Kang, H.S. Oh, S.W. Kim, M.H. Seo // Pharm. Res. 2005. - V. 22. - P. 200-208.