Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение молочной кислоты пряной ферментацией крахмалсодержащих отходов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение молочной кислоты пряной ферментацией крахмалсодержащих отходов"



#

/

На правах рукописи

р С

ШАМЦЯН МАРК МАРКиВИЧ

Получение молочной кислоты пряной ферментацией 'крахмалсодераащих отходов

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соис.-аши учет'* степени кандидата технических на/к

Санкт-Петербург - 1997

Работа выполнена в Санкт-ПетерЗургском Государственном Технологическом институте (Те-шическом Университете),

Научнчй руководитель доктор /еьничесжчх наук, профессор

Официальное оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

кандидат технических науг, доцент

Ведущая организагчя: Всероссийский научно-исследова-тельс :ий институт пищевых ароматизаторов, кислот и красителей РАСХН (Санкт-Петербург)

Защита состоится * ..'¿¿¿-Д 1997 года в 10.00 на

заседании диссертационного совета Д 063.25.09 в Санкт-Петербургском Государственной Технологическом институте (Техническом Университете): 198013, Санкт-Петербург, Мос-коьсхнй пр., 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библ.ютеке Санкт-Петербургского Государственного Технологического Института.

Отзгвы на автореферат в одном экземпляре, -аверенные гербовой печатью, просим направлять в адр-зс института.

4»вто1 еферат разослан 'Ъ^са-рАсз 1997 года.

/

Ученый секретарь _

диссертационного совета Лисицкая Т.Б.

ЯКОВЛЕВ Владимир Иванович

ЯКОВЛЕВА Елена Павловна

КРАСНИКОЬА Людмила Васильевна

- 3 -

Общая характеристика работг Актуальность проблемы. В последние 10 - 15 лет значительно возрос гчтерес к различьыг аспектам получения и применения молочной к-.слоты, п^омышленно.1 производство которой ь мире осушествляетсэ бальз ста ле!. В настоящее время около ..оловины объ»_ка к! ровопо производства чолоч-но(. кис оты осуществляется микрабюлогк ¿ес;£им методом, основанным нд :браживанич таких ценных сахарсодеоаащих субстратов, как рафинадная патока, келг-cja, кристэлличес-кая сахароза, caxap.it'Л сироп и др., что существенно отражается на себестоимости конечного пг^ДУ^а. Относительно высока." стоимость молочнпй кислоты авляе.-ся основным фактором, ограничивающим ее шгрокое применение в качестве исходного сырья для синтеза других продуктов. Получанче . относительно чистых рас-воров моточной шслоти при низ-ой себестоимости позволит реализовать ее применение в к--че^тве источника семейства нов_х экологичных полимеров, способных Е_1теснить многие из нырэ используемых, прежде всего благодаря подверженности био- и фотодеградации, зы-сокой прочности, термопла :тичности, легкоФорлуемости, совместимости с природной ^.редой и воз! занести их выработки из возобновляемого сырья (Lipinski, Sinclair, 198r," Maude, 1989; ОЬчга et al., 19У2).

Однлм из возможных путей создания высокоэффект"вных и ресурсосберегающих технологий прслзводства молочной кислоты яьляется расширение сырьевой базы для молочнокислых фермен-аций. с целью замены дорогостоящих и дефгцит-пых источников углеводов ролее дешевлм к доступный сырьем. В качестве перспективных mctj4hhkob слрья рассматриваются разнообразные от :оды перерабатывающей промышленности сельского хозяйства

Рациональная утилизация конкретных отходов пергработки растительного сырья предполагает поиск и подбор новых, высокоэффективных итаммов-продуцентов, способных осуществлять наиболее полную конверс..ю углеводов суострата в молочную кислоту. Создание новых технологий, основанных на утилизации отходов переработки растительного -ырья с применением высокоэффективных ш.аммов-продуцен'ов, разработка оптимальных условий молочнокисл >й ферментации, совер-

шенствованиг способов получения и выделения ко.-ечного продукта обеспечат существенное псвык'знче эффективности производства молочной кчслоты.

В настоящей работе установлена возможность получения нолочной кисчо'Ы сбра- иванием крахмалсодериащих отходов произгодст'.а японской рисовой водки (сакэ), пшеничных отрубей и картофельных очисток. Эксперименты вь.лолнялись на Кафедре те :нологии микробиологического синтеза СПГТИ, (ТУ), лаборатсии спорообразующи:: бакт«1риГ Инсгитута микробиологии НАН Армении и Центральных исследовательских лабораториях компании "Та1уо Кадаки" (Япония). Полупроиз-впдг.твенные ферментации проведены нг заводе фирмы "М." уа-гак1 .киНеп" (г. ";оккаичи, Япония,.

Цель и задачи исследования, "сновтй целью 'астоящой работч являлась разрабочла эффективного нетода получения молочной хислоты с пр ;менением в качестве углеводсодер^а-щего субстрата ."ля молочногчелого брожения крахналсодег-*ар.их отходов произпдетва.

Для реализации этой цели иыш поставлены следующие задачи:

- изучень-э состага отходов производства сакэ - рисовых отпуаей с точки зрения их пригодности в качестве уг-леводсодерхащего субгтрата для молочнокислого брожения;

- раар^ботка способ? предферметационной подготовки сырья;

- выбор микроорганизма-продуцента, способного эффективно осуществлять конверсию крахмала рисовых отрубей в молочную кислоту, изучение и разработка оптимальных условии для его роста и лактатобразования;

- проведение нолоч!экислой ферментации рисовых отрубей в лабераторгых и полупроизводственных условиях;

- выделение и очктгка конечного продукта;

_ изученге во.)мсжности получения нолочной кислоты прямой ферментацией других крахмалсодеркащих отходов.

- на О' новани» полученнчх дачных разработать и рекомендовать для пргмыш: гнной реализации новый метод получения лактдта с примененном кр»хмалсодержащих отходов перерабатывающих производств.

Н.яучнар новизна работы^ Впервые мля производства молочной кислоты в качества продуцента применена культура

Streptococcus bovis, обладающая высокой амполитчческой активностью ( et-амилаза сахарогенного типа) и ла-'татобра-зующей способностью. Применение ьтсЗ культуры позволило впервые осуществить совмещенное осахариван.1е и брочение в процессе производства бактериями молошой кислоты из крахмалсодерк.щнх отхе.ов.

|1о.;азана возможность и перегэктлвкос.-ь лримечения в качестве yrj.aBC.¡содержащего сырья дл" производства молочной кислоти крахмалсодергащих отходов производств! саъ.э -рисовых отрубей, рлпее не ислользованных в бродильных ппоцессах, а также других крахмалсо;-ipHavix субстратов.

О ределены оптимальмые условие роста и лакт .тобразо-ьания продуцента, процессов фе^ентации, получения, эыде-ления и очистки целевого продукта - L(+) лактата.

В результате проверенных исследований разработан т-о-вый метод получения L( + ) лактата прямой ферментацией с---ро»о, негидролизованного крахмала р'совых отрубей.

Практь4еская значимость рабогм. Разработанный метод утилизации крахмагсодеркащич отходов з качестве сбраживаемого субстрата для молочнокислых ферментации .юзвепяет заменить традиционно используемые в прои:водстве молочной кислоты ценные спхаросодержащие субстраты (сахарш е стропы, рафинадная патокг, мсласса) более деловыми и доступными источниками сырья.

Лредлижеп.шй метод, основанный на применении в качестве предуцента L(+) молочной кислоты культуры S. bovis позволяет гсключить одну из н иболее энергоемких и ресур-созатратных стадий фермен-ации крахмалссдержап"?го сырья -предферментационный ги«ролиз рчя осахариЕания сбраживаемого субстрата.

Использование коммерческого препарата глюкоамилсзы "Sumizime 2000" в качестве дополнительного сахарогенного фактора позволяет существенно сократить продолжительгост1 бродильного процесса при практически полной конверсии сырого крахмала рисовых отрубе.., и тем cahWM повысить эффективность молочнокислбй ферментации

Апробация работы. Рез-льта1: л исследований доложены на конференции а^пяпонскоМ сельс^охозяйств чшои и биоло-

гической ассоцияг.ии (Кобе, 1992), Всероссийских ^.аучмх конференциях "Химия и технология лекгрственный вещестп" (Санкт-Петербург, 1994^ и "Актуальные проблемы создания "очых лекарственных cpiдств" (Санкт-Петербург 1996), совместном производствен! эм совещании лаборатории спогообра-зующиг б..к.ер"й института микробиологии HAH Армении и республиканского "чнтра депонирования микроСов HAH и Министерства образования и науки Армении (Лбовян, 1996*.

1.убликацк'' t Основное содерж ние диссг ртацги отражено в 7-ми публикациях.

структура и объем диссертации. Диссертация состой-из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, полученных результатов и чх обсуждения, заключения, выводов и биилиогр фическог? спгсг.а включающего 179 наименований.

Диссертационная ^а-ота изложена на 156 страницах ..а--шнописного текста, содержит 11 рисунков и 14 таблиц, "одержампе работч Материалы и. мечодм исгтн зования. В качестве основного углеводсодьржаще-о субстрата для молочнокислого брожения использовались крахмалсодержащкj отходы производства сакэ - рисовые отруб! . Рациональная утилизация образующегося при полировке риса порошкообразного продукта из наружных слоев зерна представляем реэтьную проблему для пргизводителей японской рисовой водки. В работе использовались рисое ie отг_-би, полученные от "Mlvazaki Honten Co., Li.d." - крунейшего произвол! т«!ля сакэ в префектуре Мие (Япония). В дальнейшем на базе Кафедры технологии микробиологического синг.гза СПГГИ (ТУ) были испытаны крахмалистые отходы переработки пшеницы и картофеля.

В качества продуцзнта молочной кислоты для ферментации сырого кр; хмала рисовых отрубчй был выбран Streptococcus bovis 148, в~деленш:й из »зубца теленка, полученный из ноллекцш культур микроорганизмов отдела биотехнологии университета фукуяма '.Япония). Выбор продуцента был обусловлен слособ-остыо S.bovis а отличие от большинства молочнокислых бактерий активно гидролизовать сырой зерновой крахма." с образованием ферментируемых сахсров и параллельно осуществлять гомоферментативное молочнокислое брожение с образованием Ц + )нолочной кислоты. На базе Инсти-

тута м:.кробио..огии НАЧ Армении и Кафедры технологии микробиологического синтеза 0ПГ1Л (TV) был выделен и испытан ряд других штаммов S. "jovis.

В качестве дополнительного сгчариф ¡цируищего фа.стора использовался коммерчески?" ¡трегчрат глгакиамилазы "Ruraizy-ше 20G0", полученный из Rhizopus del-эпи-г (Shin Nihon Che-nical Co. L13, Япония).

Молоч'-ую кислоту определили. методами ТСХ на ^люм! ни-евых пластинах с склнкагелом UC (Mer^k, CEjA) с испол^о-ваниеч а качестве растворителя смесь оу.ансла - уксусной кислот" - воды в соотно'чьнин 4 : 0,5 : 1. Окрашивание производили 0,5%-м раствором бромфенсювого синегч в 0,2%-м растворе лимоь юй кислоты.

К "¡нцентрацию нолоч;,ой кислоты определяли MjTO"OM ВЭЖХ на хроматографе Eyela PLC - 5Р (Tokyo Rikakik^l Co.,Ltd, Япония), соединенном : хроматоинтегратором Hitachi - 2S00 и оснащенном колонкой "Aminex НРХ - 8711 (Bio-Rad Laboratories,Токио, Япония).

L(+) изомер молочной к-слоты количественно определяли идентификацией с помощь: энзиматического метод.., используя набор реь.знтов "Boehringer Mannheim" (Германия) с последующим фотометригованием при дл;.не вогни 340 нм. Изм^рени.: оптической плотности проводили на спектрофотометре. "Shii..adzu MPS- 2000" (Shimadzu с jrporation,Япония).

Наличие крахмала а среде качественно определял л ио-дометрическим мчтодом.

Концентрацию крахмала и сбралшв темь'ч сахаиов в отрубях и в ферментационной среде определяли после ферментативного расщепления полисах?рндов препаратол глюкоа.шлазы "Sumizyme - 2000". Концентрацию образовавшейся глюкезы определяли методом Сомодки-Нельсона.

Численность клеток микроорганизме ) определяли путем подсчета колонкЛ и фотометрирования. Микробиплоги,-еский ксн-роль осуществлялся периодически в те 1ение всех фер-ментаций.

РЕЗУЛЬТУГЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕ'ИК X. Подготовка субстрата ДЛЯ НОЛОЧНоГ'СЛОЙ ферментрции. Важным этапом щедуермент ционной подготовки

сырья к брожению является его предварит зльное обеззараживание. С целью исключения хополчительных энергозатрат, свчз; иных с тепловой сгзрилизацией ь учитывая, что -амилаза продуцента проявляет высокую амилолитическую активность на ырон зерновом крахмале,- изучали возможность стерили^ ации фрпкн..й рисивых отрубей при комгатной темпера-. уре рапСавленными растворами верной кислоты (0,°2 -0,04 1'). В результате проведеннпх экспериментов было _с-тановлЕ-ю, что для обеззараж тания фракций рисовых отгу-бей, необходимо выдерживание в разба-ленном растворе кислоты не менее трех -.асов при комна-чой температуре. По чаверленил процесса обеззараживп.ия дли нейтрализации кислоты к субстрату добгвляли про;.ипяче-,ную взве~ь карбоната кальция.

Суспчнзия рисовы : отрубей, содержащих около 70% "рахм;:ла, п еле разбавлениг до требуемой концентрации случила полноценной ферментационной средой для осуществления гомоферментатлвноги мпочнокислого брожения с по-нощью S. bovis;.

Ьред^ерментациончс я подготовка крахмалсодержащего сырья для бродильных производств включает обягательные стадии ожкж^ния и осахарквания крахмала, которые связаны с высокими энергозатратами. Пр ;м«ненче в качестве продуцента S. bovis 148, способного осуществлять прямую конверсию сырого крахмала а молочную кислоту, позволяет исключить эти энергозатратные стадии предфернентационного гидролиза ^рахмэла. Подобраный режим стерилизации для рисовых отрубей и исключение предварительных стадий осаха-ривания крахмал? позволили осуществить пропесс предфер-неыациенной подготовкч сырья без значительных энергозатрат.

II. Подбор опт..мальных условий для роста и лактатоб-рагоаания продуцента. ^ свячи с тем, что культура S. bovis в качестве продуцента молочной кислочы ранее не изу-чаласг , лами исследованы все стадии молочнокислого брожения, включающие подготовку посевного материала, оптимизацию ферментации и получения целевого ..родукта.

Установлены темпиратурные оптимумы для процессов

роста продуцента- 37°С и лактатобраг>ования- 40°С, опту |ум pH для обоих процессов - £.0 - 6.S.

III. Ферментация рисовых ~тр^бей с приленением S. bovis 148. Процесс феру^чтации проводили в периодическом режиме в а'наэрооных ус :ов».ях, з лабораторных ферм. 1тато-рах ооь-мом 10 л, при постоянной температуре 40°С и pH 6,0 - 6,5. Посевной материал, подгттовленныЛ по схеме, описанной ~ методич^ско" час-и, содержащий не уэнее 109 клеток S. bovis 144 в 1 мл, вносили в ферментационную среду ь соотношении 5% к общему оСьему. Начальна концентрации крахмала в ферментационной среде рисовых отру-Сей составляли 8 и 12%. '. инс^ические лараметры potra S. bovis 148, образование молочноТ кислоты и потребления углеводов представлены на рис. 1. Полученные результаты показывают, что процесс лактатобразования начинается и гро-должается параллельно с pocícm клет-к. Однако после прр"-ращгния роста клеток и даке а услсзипх уменьшения их титра в ферментационной среде, процесс образования молочной кислоты продолжается, хоть и менее чнтенсивнп. Процессы характеризовались относительно продолжи1.елыюй лаг-фазой (около 10 часов) и нэпродоллительной стационарной фазой, после которой численность к; еток нлчинала зачетно уменьшаться, что, по-видимому, связано с ингибнр1х:\ин эфф жтом накапливающейся молочной кислоты.

Максимальнее значения удельных скоростей потребления крахмала (глюкооы) наолюдаются в период лаг-фазы, тогда как для роста клеток S. bovis и образования ими лактата -сразу после завершения лаг-фазы (рис. 2). При высокой нг-чальной концентрации крахмала в ферментационной среде (12%) эти значения несколько превь"аают аналогичные показатели, полученные в вариантах с низкоР концентрацией сбрагиваемого субстрата (8%).

Показатели уд'льной скорости образования ллстата ч начала фермен ации заметно ни -е значений удельных скоростей потребления cyi. страта, однако в процессе ферментации эти значения вы^авниваютгч и на определенных стадиях коэффициент конверс.г" крахмала 'глюког ы) в молочную кис юту приближается к теоретическим величинам.

Сравнени вариантов с различной исходной концентрацией крахмала покг.зывр ;т нег.ропо^ циональное повыш~нию ксчцентрации сбраживаемого субстрата увеличение продолжительности ферментации. В варианте, содержащей 12% грахма-ла, продол-лтольность процесса et'e -"ментации рисовых отрубей составляет 140 часов, а при 8% начагьной концентрации крахмала процесс завершаемся в течение 70 часов. Одной из, причин столь значительного увеличения продолгдтельноети ферментации очевидно ячляетсл накапливающийся в ерг^е лактат, ингчбнрующий рост меток и образоь-шие молочной

КГС."ОТЫ.

v-ледует отме»»-ть, «то в течение ферментации только около 60 - 65% крахмала потребляется для обеспечения пр~-цессот роста и лактатобрьзования продуцента, что обусловлено особенностями аии-юлитической активности S. bovis. ~понсх"е исследователи показали, что по специфичности действия о(^амилаза Е . bovis иркнадле-ит к типу cixaporen-ных < -амилаз (Handbook..., 1988). птот тип «(-амилаз проявляет больаую редуцирующую способность, чем так называемое разжижающие или декстокчизирующие с<-амилазы (Галич, 1987). Расщепляя <^-1,4-глюкозидные связи крахмала, они " качестве конечных г родуктов реакции гидролиза образуют сбраживаемые сахара - глюкозу и мальтозу, а также мальтотрис. зу и некоторые разветвленные олигосахариды. Образовавшуюся маль-отриозу сахарогенные й£- -амилазы далее гидролизуют до г-юкозы и мальтозы. Можно предположить, что неиспользовгчнмй в бродильном процессе остаток углеводов представлен разветвленными олигосаха^идами, не гид-ролизуемыми cí-^милазой S. bovis.

Приведение даниыа позволяют сделать основной вывод о целесообразности использования крахмалсодержащих отходов в качест,. е дешеього, но впохче удовлетворяющего пищевые потреби! сти S. bov4 s ис~*очни*са для осуществления го— моферментати^ного нолочнокислого брожения. Ферментационная среда, содержащая рисовые отруби, без внесения дополнительных -сомпонентов служит полноценным источником углерода, азота, органических и неорганических соединений, обеспечивающим процессы роста и лактатобразования S.bovis.

Дальнейшие исследования 6»um направлены на решение задач повышения степени конверсии крахмала в молочную кислоту и интенсификации бродильного процесса.

IY. Интенсификация процесса ферментации рисовых отрубей. Процесс молочнокислой ферментации можно ускорить добавлением к основному углево~содержащему субстрату различных дополнительных компонентов, стимулирующих рзст продуцента .. оказывающих положительный эффект на процесс лактатобразовапия. С целью ускорения процесса ферментации рисовых отрубей в качестве добавок, содержащих витамины, свободные аминокислоты, гидролизаты белков, микроэлементы и другие с зединепия, приме::яльсь различные концентрации дрожжевого и картофельного отваров, молочной сыворотли. Результаты экспериментов констатируют факт определенного положительного влияния пр[менения указанных добавсх, приводящих к сокращению продолкительности процесса феи'ента--,ии.

С целью ускорения стадии осахаривани" сырого рисоеэ-го крахмала и достижения наиболее полно? его конверсии в качестве дополнительного сахарифицирующего фактора применяли коммерческий препарат глкжоамилазы - фернента способного расщгплять как С<-1,4-, так,л ct-1, б-гяюкозидные свясч крахмала с образованием глюкозы в качестве конечного продукта гидролиза.

Экспериментально установлена оптимальная концентрация глюкоамилазы - 0,05 г препарата фермента на ^.00 г крахмала рисовых огрубей. Добавление глюкоамилазы к субс-■"paiy п это? концентрации, при начальном содержании крах-нала в ферментационной среде 8 и 12%, бродильные процессы завершаются за 42 и С5 часов соответственно и их продолжительность сокращается на 28 и 55 часов (табл.Т). Очевидно, что способствуя повышению интенсивности гидролиза сырого крахмала рисовых отрубей, глкжоакилаз~. вместе с Ct-анилазой S. bovis обеспечивают субстратом (глюкозой) интенсивное проведение стадии гликолиза, и в итоге происходит существенное сокращение продолжительности процесса гомоферментативного молочнокислого брожения (около 40«).

Приведенные в табл.1, данные свидетельствуют также.

Таблица 1

Вг-.лние глюкоамилазы и различных добаок на продолжительность ферментацги рисовых отрубе*, ö. bovis (pH 6.0; 40°С)

Варианты Продолжительн. ферментации^

Конц-циЛ крахмал?,% добавок без глюко- 1 о глюкоамилазы I амилазой*

12 без добавок 140 85

молочная счворотка* * 127 75

дрожжево.1 + картофельный г~тва[л*** 118 80

8 без добавок 70 42

молочная сыворотка 63 42

дрожжевой + картофельный отвары 62 41

* Количество добавленной глюкоамилчзы 0,05г на 100 г крахмала;

** Молочная сыворотка добавлялась в соотноше ши 10 мл к 100 мл среды;

* * * Дрожжевой, отвар и картофельный отвар добавлялись в сооткошен» ч по 10 мл к 100 мл среды.

что положительное влияние прлмененных добавок на сокращение продолжительности процесса ферментации не столь значительно, как при добгчлении небольших количеств глюкоамилазы. Эффе::т комбинированного применения глюкоамилазы с вышеуказаннь.мч добавкаьи более заметен при высокой концентрации крахмала (12%) в ферментационной среде.

Применение небольших количеств глюкоамилазы (0,05%), приводящее к существенному сокращению продолжительности процесса ферьентации, обеспечит повышение экгномической эффективности процесса ферментации рисовых отр"бей осуществляв лого с помощью S.bovis.

Влиянле количества посевного материала и исход; шх концентраций сбрахгваеного субстрата на процесс ферментации рисовых отрубей.

С целью подбора оптимальных количеств лосевного материала для периодической молочнокислой ферментации рисо-

вых отрубей нами изучено влкяни ; различных исходных концентраций инокулята в ферментационной среде на выход молочной кислоты и продолжительность бродильного процесса. Посевной материал, содержащий в 1 ил 109 клеток суточной культуры 5. bovis 148, вносили в количестве 3, 5, 10, 15 и 20% от объема ферментационной среды. В среду одновременно дооа!,ляли препарат глкжоамилаэы в концентрации 0,05% к кра-малу. Ферментации проводили в кол'ах Эрленме-йера емкостью 0,5 л и лабораторных ферментаторах обьемом 10 л, при наличии карбоьата кальцп в среде и постоянных значения.; «-Н (6,0-6,5) и температуры 40°С. На"адьная концентрация крахмала рисовых отрубей в ферментационной среде была 10%. Количество образовавшейся молочной кнепты определяли через каждые 5-10 часов ферментации до ее полного завершения. Полученные результаты анализов (за вычетом молочной кислоты, внесеьной с посевным м-териа-лом) пок-«зивают, чтг увеличение количестрт посоппого материала сопровождается повышением выхода молочной кислоты и приводит к некоторому сокращен.лс продолжительности процесса (табл. 2). Максимальный уровень о>актатобразования (окочо 90 г/л с козффи"иентом коньер ни крахнала 0.9) достигался при всех объемах внесения посевного материала с ррзличной продолжительность!, бродильного процесса. В варианте с наибольшим количеством посеьного материала (20 об.%) к 55-у часу ферментации наблюдается максимум накоп-

Таб-шца 2

Влияние количества посе-ного материале S. bovis 148 на интенсивность образования молочной кислоты

Колич CTJO посевного материала, об. % Динамика накопления молочной кислоты, г/л спустя (ч)

20 30 40 50 55 60 о5 70

13.3 35.7 55.3 73.8 80.2 84.7 88.5 89.9

5 19.4 46.1 66.8 81.7 86.1 89.1 89.3 * I

10 23.7 61.3 77.9 86.3 80.5 89.9 *

15 26.1 65.2 81. J 88.0 89.5 90.2 *

20 31.9 70.5 82.9 88.5 90.1 *

* - Анализы не проводились ввиду завершения ферментации.

ления молочной кислоты и завершение процесса брожения.

Максимальный выход молочной кислоты был отмечек на 60-м часу ферме1гаиии в вариантах с внесением посевного материала 5, 10, 15 об.%. При использовании в экспери ¡e.i-тах 3 об.% посевного материала процесс лактатобразования протек,'ет медленнее и ферментация завершайся в течение 70 часов.

Сравнение результатов, полученных в вариантах внесения различного количества посевного материала, указывает на небольшое сокращение продолжительности ферментации (5 часов), при существенной разнице вносимых объемов посевного матэриа; а. Можно ситать, что количество посевного материала 5 - 10 об.% является более предпочтительным для осуществления молочнокислого брожениь рисоьых отрубей.

Гз результативность бродильных процессов суцествен-ноо влияние оказывает не только состав сырья, но и начальные концентрации сбраживаемого субстрата в ферментационной среде. В табл. 3 представлены результаты экспериментов, характеризующих влияние различных концентраций рисовых отрубей (соответствующих 50, 80, 100, 120, 140 и 160 г/л крахмала в среде) на осювные показатели ферментационного процесса.

Таблица 3

Влияние начальных концентраций сырого рисового крахмала на основные показатели процесса ферментации рисовых отрубей

П .жазатели Начальная концентрация крахмала,г/л

процесса 60 80 100 120 140 160

Выход молочной ;ислоты, г/л 54.5 72.3 89.9 112.1 121.7 139.4

Продолжительность ферментации, ч 31 41 60 81 8ъ 106

Продуктивность процесса, г/л * ч 1.76 1. /6 1.50 1.38 1.38 1 .31

Коэффициент конверсии, г/г 0.91 0.90 0.90 0.93 0.87 0.87

Эксперим.шты проводились в 10 л ферментаторе при концентрации инокулята 5% об. и рй- 6,0, 40°С. Перед ферментацк-й к субстрату добавлялись карбонат кальция и

глюкоамипаэа - 0.05 г на 100 г рисового крахмала.

На рис. 3 показана динамика процессов молочнокислого брожения с применением клеток S. bovis и )гобавлеиием глюкоамилазы, при начат зных концентрациях крахмала рисовых отрубей CJ(a), 100(6) и 160(d) г/л. Сравнение результатов, полученных п[и всех начальных концентрациях крахмал-Сидержащего субстрата в среде ic применением глгскоанил^зы и без нее), показывает, что в ферментационных процессах с добавлением глюкоамилазы продолжительность лаг-фазы в 2 -2.5 раза короче, чей без нее (рис.рлс.1 и 3)

Очевидно, чг.о добавление глюкоамилазы, ускоряя стадию осахагчвания сырого крагназ. д, лимитирующую рост клеток и образование нолочноЛ кислоты. приводит к увеличе шю его потребления, роста клеток и образования продукта. Это отчетливо видно и ~ри срчвнении кинетических показателей молочнокислого брожения с добавлением глюкоамилазы с аналогичным»! показателе ли процессов без ее дэбавлення (рис. рис.2 и 4).

Добавление глюкоамила~ы приводит к сокращению продолжительности процесса ферментации на 40% и как следствие, повышению ее эффективности, а также способствует более полному сбраживанию крахмала__ и, соответственно, бол^иему выходу конечного продукта и меньшему содержанию остаточныз. Сахаров в культуралышй жидкости. Повышается и уровень конверсии ассимилированного сахара в молочную кислоту, что не только увеличивает еа выход, но также ведет к уменьшению затрат :*а стадии очистки и получению продукта лунного качества.

По мере накопления лактата в среде рост клеток замедляется и переходи" в стационагную фазу, а затем их численность значительно сокращается. Одновременно замедляется дальнейшее образование лактата, что приводит к значительно большей продолжительности ферментации с высокими концентрациями субстрата. В результате эффективность процессов при более высоких содержаниях субстрата оказк-^ется несколько пике. П этих процессах по завершении брожения существенно больпе и концентрация остаточных Сахаров, что создает дополнительные сложности на стадии

Рис.1. Динамика роста концентрации клеток продуцента (1) »образования молочной кислоты (2), и потребления углеводов (3) в течение фер-ментсций с исходными концентрациями крахнала в среде 8% -(а), < 12« -(б).

Рис.2. Уделыше скорости роста биолассы (1).образования молочной кислоты (2), и потребления углеводов (3) в течение ферментация* с исходными конце!, грациями крахмала в среде 8%-(а) и 12%-(б).

Продолжит .пьнооть 4 ориентации, ч

1ИС.З. .Дтнамика роста концентрации клеток продуцента (1).образования нолочной кислоты (2), и потребления углеводов (3) в течегие фер ментаций с исходными концен трациями крахмала ч сре/"э 6%-(а), 10%-чб) и 1б%-(в) и с добавлением глюкоами-лазы.

Продолжительность ферментации, ч

Рис.4. Удельные скорости роста биомассы (1),образования молочной кислоты (2), и потребления уг~е-годов (3) в течение фер-ментациях с нсхо/'чыни концентрациями крахмала в среде б%-(а), 104>-хб) и 1б%-(в) и с добавлением глюкоанилазы.

очистк7' и отрицательно сказывается на качестве конечного продукта. Поэтому молочнокислое брожение целесообразно проводить на средпх, содержащих i.C-12% рисового крахмала.

Установленные закономерности были подтверждены в по-лупроизводствснных условиях в 300 л ферментаторах завода фирмы "M'.yazaU Honten" и подобраны оптимальные режимы подачи углекислого газа (в первые часы ферментации), мела (одноразово- перед ферментацией) и перемешиьания среды (периодически - в начале и после 6 часов брожения, а после 12 часов - постоянно).

1актат полученной в 300 л ферментаторе, в результате сбраживания ферментационной среды рисовых отрубей с 10%-м содержанием крахмала с применением посевного материала в количестве 5 об % (109 клеток/мл) л добавлением 0,05 % препарата глюкоамилазы, был лыделен и очищен.

Хроматографические анализы очищенного лактата кальция давали идентичные со стандартными образцами результат, а чистота очищенного препарата была более 98%. Эти результата подтверждались и энзиматическими анализами полученной из образовавшегося лактата молочной кислоты, представлявшую собой правовращающий изомер.

Предварителнык t экспериментами показана принципиальная возможность использования другие крахмрлсодержащих отходов (пшеничные отруби, картофел1Чые отходы) для промышленного производства L(+) молочной кислоты в России.

Выводы

1. Разработаны основы технологии получения L(+) молочной кислоты и лактата кальция на основе прямой ферментации отходов переработки зерна продуцентом S. bovis с выходом целевого продукта в пределах 90- 91% от использованного крахмала.

2. Выделены культуры бактерий S. bovis, обладающие амилолитической и протеолитичоской активностью, которые могут успешно использоваться для гомоферментативного молочнокислого брожения сырья, содержащего сырой крчхмал.

3. Питательная -среда для молочнокислой ферментации продуцента S. bivis м-jeT содержать в качестве единственного источника углерода и энергии без дополнительного внесения

других компонентов питания только крахмалистые отходы переработки зерна.

4. Определены условия предферментационной обработки зерновых отходов расЗавленной серной кислотой с целью его обеззараживания вместо тепловой обработки, что приводит к значительной экономии энергозатрат.

5. Продолжительность ферментации сокращается (на 40%), а вых- д продукта увеличивается (на 30%) при внесении в ферментационную среду препарата глюкоамилазы (0.05 г на 100 г крахмала), котораь ускоргвт процесс оса-хариванчя юахна;»а и гидролизует tf-1-б глюкозидные овязи амилопектгча негидрсчшзуемы ; с!-амилазой продуцента.

6. Показано, что процесс гоиоферментативного молочнокислого брожения с применением кул1тур S. bovis на основе других видов крахмагчстого сырья (пшеничные отруби, отходы картофелепереработки), имеюшегосг в России, по своим технико- эконоиическим показателям, .(алой энергоемкости и минимальным затратам может быть рекомендован дпя создания эффективного и ресурсосберегающего производства L(+) молочной кислоты пищевого и медицинского назначения.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях: г

1. Гчосинтез молочной кислоты на крахмалистом сырье/ H.H. Шамцян, В.И. Яковлев, К. Низоками, Т. Ямамото//Тез. докл. Всерос. науч. конф. "Химия и технология лекарственных веществ", 23-30 июня 1994,- С.Петербург, 1994. С. 34.

2. Кикробиопчгческое аолучениз молочной кислоты из крахмалистого сырья //М.Н. Шамцян, В.И. Яковлев, л. Низоками, Т. Ямамото, э.Г. Афригян //Биолог, журн. Армении. - 1994. - Г.47, N1. - С. 3-8

3. Производство Ь( + ) молочной кислоты из картофельных отходов с применением клеток Streptococcus bo"ls / М.М. Шамцян, И.И. Булгак, Г.С. Вардоян, В.Г. Шмелева, В.И. 5^ковле-//Тез. докл. Всерос. науч. конф. "Актуальнь-э проблемы создания новых лекарственных средств", 11-23 нолб. 1996.- С.Петербу-ir, 1996.- С. 33.

4. Шамцян М.Н., Елисеева Ж.В., Яковлев А.И. Способ полу-

чения нолочной кислоты из негидролизс-занного крахмзд-содеряащего сырья //Тез. докл. В^ерос. науч. конф. "Актуальные лроблемы создания новых лекарственных средств", 21-23 нояб. 1996.- С. Петербург, 1996.- J. 33.

5. A novjl method of fermentative production of calcium . lactate directly from noncooked white rice bran /М.М. Shamtsian, T. Okubo, M. Murai, D.-C. Chu, V.A. ^beli-an, K. Mizokami, T. Yamamoto//Denpun Kagaku.-1993.- V. 40, N 3.- P.305-310.

6. Fermentativ production of calcium lactate from noncoo-ced cereal starch /М. Shamtsian, T. Okubo, M. Murai, D.-C. Chu, V.A. Abelian, K. Mizokami, T. Yamamoto //Ann. Meet. Japanese Soc. Agric. Biol. Sci.- Kobe, Ja{.an, 1992.- P.5.

7. Production of cvclodextrins along with rice protein concentrate and sugar syrup from white rice bran/ V.H. Abelian, M.M. Shamtsian, D.-C. Chu M. Kim, T. Yamamoto // Che~iis';ry express.- 1993,- V.8, N 6.- P.365-368.

Автор вырокает глубокую признательность своему руководителю проф. В.И. Яковлеву, проф. Т. Ямамото и академику Э.Г. Африкяну за постоянную помощь, внимание и консультации при проведении настоящей работы.

Автор благодарит коллег - сотрудников кафедры технологии микробиологического синтеза СПГТИ (ТУ), исследовательского центра компании "Та1уо Кадаки" и института микробиологии ПАН Армении за оказанную помощь при выполнении работы.

ту*-