Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез и физико-химические свойства термо- и рН-стабильных амилаз термотолерантного микромицета A. awamori ВУД Т-2

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез и физико-химические свойства термо- и рН-стабильных амилаз термотолерантного микромицета A. awamori ВУД Т-2"

Министерство науки,высшей школы и_ технической политики. Российской Федерации

воронежский шнолшжеекий институт

На правах тзукоплок ЯКОВЛЕВ .Алексей Николаевич

биосинтез и фшико-хжические свойства таю- и рн-стабилшюс амилаз тейютолераншого микромицета ал/атоЭ1 буд т-2

Специальность 03.00.23-Биотехнология

Автореферат диссертации яа соискание ученой степени кандидата технических наук

Бороне"?: - 1992

Работа выполнена в Воронежском Технологическом институте

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор ЖЕРЕБЦОВ H.A.

Научной консультант - кандидат биологических наук,

доцент ГРИГОРОВ B.C.

Специальные оппоненты- доктор технических наук .iipgjoc сор

кафедры биотехнологии и экологической безопасности МТ1-1Ш1 МОСЖЕВ М.С.

КУРгИЕЖ Н.Г.

Вздудая организация - Московски!; ззт:-».". ВШИ шодевоп био-

технологии

нл заседании Специализированного Совета К 063.90,01 Воронежского Технологического института по адресу: 394017, г.Воронеж, проспект Революции, 19, В1И.

С диссертацией ыовно ознакомиться в библиотеке ВТИ.

кандидат технических наук, дбцент кафедры биотехнологии ВТИ

Защита состоится

1992 г. в 14 час.30 мин.

Автореферат разослан

ч

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук доцент

ОНДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБ01Ы

Актуальность тем. В настоящее время биотехнология выдвигается на передни!! край научно-технического прогресса. Этому способствует бурное развитие современной молекулярной биологии и генетики. а такхэ практическая потребность в новцх технологиях , призваннпх ликвидировать нехватку продовольствия, энергии, улучшить состояние здравоохранения и охрану округащей среди. Немалая роль в развитии биотехнологии отводится инженерной энзякологни. Значительше успехи. достигнутые эизишлогаей в последние годи. позволили пепосредствеиш пзреити к применению ферментов тз различных отраслях народного хозяйства, что приводит к существенному улучшению технологических процессов, более полному использованию сырья и улучшению качества выпускаемой продукции.

Среди ферментов микробного происхождения, применяв!,шх в различных отраслях народного хозяйства«большое практическое значение имеют амилазы. Ферментативное расщепление крахмала в промышленных масштабах используют уже давно и в настоящее время практически запенило традиционные процессы кислотного гидролиза.

Продукты ферментативного гидролиза крахмала являются заменителями сахата при производстве хлебобулочных,мучных, кондитерских изделии, мороженого.

Особый интерес представляет получение и использование тевмо-и с11-стабнлышх амилаз, продуцируемых терм.отолерянтшш) шкромице-таии. Во-первых, способность микрог.шцотов развиваться при попышзп-нш: температурах, создает более благоприятные условия для их культивирования; при этом увеличивается скорость получения целевого <} о шел та, уменьшается вероятность заражения среди посторонней микрофлорой, снижаются расходы на еа охлахдвиие. Ьо-втошх.биот'зхно-

логии, 'связанной с применением ферментов, наряду с их высокой активностью особо важной характеристикой является термо- и тй-ста-ойльность ферментов. Это позволяет вести обработку субстрата- при высоких температурах и низких значениях рН. что дает вевоятностъ получить более высокий выход продукта, предотвратить развитие вредной микрофлоры в обрабатываемой среде, осуществить непреывно-поточные технологии. .При продолжительном взаимодействии ферментов с субстраяои , превалирующую роль играет стабильность фермента, а не его активность. _ .

Цель и задачи работы. Целью работы было выделить тесмотолерантный микромицет, синтезилзующий термо- и рН-стабйльнае амилазы, получить ферментный препарат комплексного действия для гидролиза крахмалосодержащего сырья.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решить следующие задачи:

- выделить активный термотолерантный продуцент амилаз среди микромицегов;

- исследовать условия биосинтеза амилаз, оптимизацию состава питательной среды;

- разработать метод выделения ферментного препарата и очистки терюстабидьной глюкоамилазы;

- исследовать некоторые физико-химические свойства ферментов;

- использовать комплексный препарат при производстве глюкозы и адучных кондитерских изделий.

Настоящая работа выполнялась в соответствии' о тематикой научных исследований кафедры биохимии и микробиологии Воронежского технологического института по проблеме "Изыскание оптимальных условий микробного синтеза ферментов и исследование их физико-хи-№П9СХ1К свойств", входгацэй в координационный план АН СССР.

Научная новизна. Показано, что из 40 исследуемых ыикромице-тов наибольшей способностью к биосинтезу амилаз обладал термотолерантный штамм с0.атмтогс ВУД Т-2.

Для его глубинного культивирования подобрана рациональная питательная среда. Разработана способы получения комплексного ферментного препарата и предлонена схема очистки глюкоамилазы.Получена рН-и тершстабшгьная глюкоамилаза со степеиьга очистки 59. Исследован процесс кислотной и термической инактивации глюкоамилазы, вдюнтифицированы функциональные группы каталитического центра. Показана возможность использования комплексного ферментного препарата при производстве глюкозы и мучных кондитерских изделий.

Практическая ценность. Производственные испытания по глубинному выращиванию мшромицета на оптимизированной питательной среде на Московском опытной заводе ВНИИ пищевой биотехнологии дали положительные результаты. Получен рН- и тармоогабвлышй препарат глюкоамилоаваморин Г 10х.

Проведены лабораторные исследования по применению ферментного препарата при гидролизе крахмалсодержащего сырья. Разработаны рекомендации производству. Ориентировочный годовой экономический аффект от использования мучных гидролизатов при производстве сдобного печенья для линии I тонна в смену составит около 16 тыо.руб. -

Апробация работа. Основные результаты диссертационной работы докладывались на отчетных научных конференциях: Воронежского технологического института (1988-1991 гг.). на научно-технической конференции "Биотехника и Биотехнология" (Тамбов. 1990 г.), на Всесоюзной научно-технической конференции "Разработка комбинированных продуктов питания (Недико-биологические аспекты,технология. аппаратурное огГюрмление. оптимизация)"(Кемерово, 1991г.).

Публикация. По материалам диссертации опубликовано 7 статей.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения. обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов и их обсуждений, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложений. •

Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 26 таблиц, 30 рисунков и 4 приложения. Список литературы включает 157 наименований- отечественных и зару- ■ ■бежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ - ..

Во введении обоснована актуальность темы и направление исследований. - ■

В обзоре литературы дана характеристика продуцентов амилаз. Приводятся данные об особенностях биосинтеза, выделении и очистки амилаз, физико-химических свойств ферментов, их использовании

г - ■

в различных отраслях пищевой промышленности.

•Б результате анализа литературных данных установлено, что в - настоящее время недостаточно освещены вопросы термотолерантности микромицетов, их способности к синтезу термо- и рН-стабильных амилаз.

Обоснованы цели и задачи, исследований.

В экспериментальной части представлены материалы исследований. обоснован выбор основных показателей и факторов, обобщены и обсуждены результаты экспериментальных данных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований'служили чистые культуры микромицетор, полученные из Всесоюзной коллекции микроорганизмов и Всесоюзного научно-исследовательского института лицевой биотехнологии (г.Москва).

Культивирование проводили глубинным методом в колбах бм - . костью 750 см3, содержащих 100 см3 питательной среды, на лабораторной качалке о частотой вращения 3,8-4,0 в течение 120 часов при температуре 35 °С. В опытно-промышленных условиях выращивание проводили в ферментаторе емкостью 0,1 м3.

При определении сбалансированного состава питательной среды, а также выбора режимов гидролиза кукурузного крахмала и муки использовали полный факторный эксперимент (ПФЭ 2з)* учитш,ающиЯ ' межфакторше взаимодействия (Грачев, 1975 г.). Статистический анализ регрессионных уравнений проводили по программе, заложенной в матрицу планирования экспериментов согласно избранному методу на ЭБМ ЕС 100.25. .

ГлюкозМйлазную активность определяли тлгокозооксидазным методом. За единицу активности принимали такое количество "фермента, которое, катализируя гидролиз крахмала при 30 °С и рй 4,7 в течение I мин. освобождает I мкмоль глюкозы.

Активность d-амилазы определяли методом ВНИИ ПрБ СРухлядева А.П., 1979). За единицу активности oí-амилазы принято такое количество ферментов, которое при 30 °С и тН 4,7 в течение I часа катализирует до дэктринов различной молекулярной массы I г растворимого крахмала.

Для выделения технических препаратов ферментов использовали осаждение органическими растворителями, высокоочищенных - ионообменную хромотографшо и гельфильтрацию (Детерман, 1971).

Электрофорегические исследования фермента проводили по методу Дэвиса {fflav¿!> , 1964).

Содержание глюкозу в гидролиза гах определяли на приборе ПЛАГ-1Г.

В ходе исследорания была использованы общепринятые методы:

общи& азот определяли по Кьельдалю (Белозерский, Проскуряков, 19511; бело',; - по методу Лоури ( , 1951),

РЕЗУЛШШ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУ'ШНИЕ

Шбор активного терштолерантного продуцента амилаз. С целью выявлений активного продуцента амилаз было проверено 40 штаммов шкрошцетов различных токсономдческих групп,

' Все микроорганизмы выращивали тверпо-с];азным способом на среде из пшеничных отрубей с начальной влажностью 60 в течение 40-42 ч температуре 30 °С.

Наибольшую способность к биосинтезу амилаз проявляют (таблица I): Ламтогс ЗУД 74?, 4аттог1-£250, Ла^ата^-Ш.

Таблица I

Биосинтез амилаз некоторыми микромицатами

Название продуцента Активность,ея/г глюка- :с{-ашшазы амилазы:

I 1 2 : 3

А шде. г БКМР -2092 55,0 4,5

шдр -1119 18,4 1,5

Л/тСдег ВШР -2259 27,2 1,8

Ламото?^ ВКЫЯ -808 148,2 65,2

Л.аштоъС вшг -2250 160,2 69,4

Л ач/а/погс БУД Т -2 380,0 24,5

К. огуяае вшр -435 35,2 4,8

огугае. БШР -497 30,0 4,1

И.огуяае. . ВКМР -596 5,4 0,5

Я. огугсге шр -593 15,0 ' 1,8

озулае. шмГ -605 10,3 1,2

/. шсгоуюгт. уа?. сАшипа. ша? -1361 30,2 4,5

уоз. сйслеггац вкмр -1062 50,4 6,9

Продолжение таблицы I

I.

2

3

Я..тс:с2оз/1огиЗ к?? сАсле/7И& -1218 45,0 5,4

Учитывая, что в последнее время перспективным является глубинный способ культивирования, мы провесили возможность выращивать наиболее активные микромицвтн при повыиаиных температурах ; (35-40 °С). При культивировании глубинным способом ^.^¡уатогг ВУД Т-2 обладает максимальной активностью глюкоамилазы. Этот мик-ромицег используется как продуцент глюкоамилазы в производство ■ спирта. В связи с этим настоящая работа посвящена подбору рациональной питательной среда для биосинтеза комплекса амилолитических ферментов, очистке, изучению физико-химических свойств ферментов и их использовании для осахаривания крахдалосодеркащего сырья при производстве глюкозы и мучных кондитерских изделий.

Влияние различных источников питания на биосинтез амилаз. В качестве источников углерода были испытаны: крахмал, дектрины, мальтоза, сахароза, глюкоза, рафию за, фруктоза,, галактоза, лактоза, ксилоза, зрэбнноза, таидаза.мавнит.дульцит, сорбит. Рос1-микромицета Ла\\^тог£ ЪУД Т-2 наблюдается на всех источникам углерода,но снчгоз амилаз осуществляется только на крахмала, дектринэ, мальтозе и рафинозе. то есть на углеводах, имеэдих _ <^-1,4 и -1,6 -гдгжозцшше связи. Причем, максимальное яакол-

ВШГ -595 25,2 1,4 В]№ -610 27,0 4,6 ВКМР -1217 32,2 2,4

/1удтаие г. Pf

110,0 25,4 125,2 15,7

лание амилаз наблюдается на среде с дектршами. Из вышеизложен-' ного можно сделать вывод, что амилазы, продуцируемые микромицета-ми, являются индуцибельными ферментами.

; В качества источников азота были испытаны минеральные соли:

и органические соединения: мочевина, пептон, кукурузный экстракт, солодовые ростки и дрокжевой автолизат. Более' интенсивное действие на биосинтез амилаз оказывали органические источники азота (кроме мочевины), они же обеспечивали значительное накопление биомассы. Из неорганического азота наибольшее влияние оказывают окисленные формы: и КМО*, . Строгой корре-

ляции между накоплением амилаз и биомассы'не установлено. Однако активность на I г биомассы на средах с неорганическим азотом несколько выше, чем на его органических формах.

Максимальный биосинтез амилаз происходит на средах с кукурузным экстрактом и . При добавлении в питательную среду биосинтез фермента протекает при рН 4,0-4,8, что способствует накоплению в культурной жидкости наряду с глюкоамилазой и «¡¿-амилазы. Видимо, влияет на физиологию питания и развития микро-мицета.

С целью удешевления питательной среды и максимального биосинтеза амилаз микромицегам использовали ферментативные гидролизаты кукурузной, ряаной, пшеничной, овсяной, ячменной муки и картофельной ыезги. Гидролизати едки почти одинаково влияют, на биосинтез ферментов. В дальнейших исследованиях.мы использовали кукурузную муку, так как на ней активность фермента выше, она имеет высокое содержание крахамала и пике цену.

В биосинтезе ферментов вакную роль играют внешние условия. Биосинтез амилаз итотекааг в интервала температур 32-40 °С, даст»-

гает максимума при температуре 35 °С. Это позволит заключить, что данный микромицет относится к тердатолерантным микроорганизмам.Оп- . тимальная начальная величина рН 5,0; количество вегетативного посевного материала 5 % к.объему питательной среды является наиболее оптимальным.

Оптимизация питательной среды с помощью математического метода планирования. В качестве основных факторов, влияющих ни рост мжромщета\rf.awQfnQZi ВУД Т-2,были выбрани: Х^концентрация кукурузной муки, %', Х2 - концентрация азотнокислого «алия , Хд - концентрация кукурузного экстракта, %. Критериями оценки влияния различных факторов на процесс биосинтеза амилаз ВУД Т-2 служила активность глюкоамилазы (Ур ед/см3) а сС- амилаза (У2, ед/см3). Для исследования применяли полный факторный эксперимент 23 с использованием центрального композиционного ротота-бельного униформпланирования. В результате обработки данных получены уравнения регрессии, адекватно описывающие процесс биосинтеза амилаз: .

^=120,6+3.65Х1+2,75Х2-1,723Сз-2,8X^-1,9Х22-1,9Хд2' ' У2=6,6-0,59Х1+1,95Х2-0,18Х3-0,41Х1Х2-0,89Х12-0,19Х22-0,29Х32

Определение оптимальных соогавов питательной среды проводили методом "Ридж-анализ" ,1963). При наложении оптимальных '-

составов питательных сред для биосинтеза глюкоамилазы и </-амилазы, рациональной средой является, %•. кукурузная мука -16; азотнокислый калий -0,8; кукурузный экстракт -0,85.При таких значениям параметров активность глюкоамилазы составляла 125-135 ед/см3, «¿-амилазы* 9,0-10,0 ед/см3.При культивировании Лат/логс ¡ад Т-2 биосинтез протекает в кислой среде (рН 4,0-4,8),при этом.как нами усганоплено, происходит частичная инактивация ^-амилазы.В конце 0иосштазз соотношения -амилазы и глюкоамилазы составляем 1:12.^..1:15,Для умень-

шеяия этого соотношения мы исследовали влияние СаС03 на биосинтез амилаз, так как ионы Са оказывают стабилизирующее действие на сС-амилазу (Жеребцов, 1984). Эффективное действие на стабилизацию «(-амилазы ионы Са+^ оказывают при внесении СаС03 в количестве 0,¡35 % к объему питательной среда на 24 ч культивирования. При этом соотношение глюкоамшгазы к «¿"-амилазы составляет 1:4 - 1,5 (активность глюкоамилаза 120-125 ед/см3, «¿-амилазы 25-30 ед/см3).

Динамика роста микроорганизма и биосинтеза им фермента представлена на рис.1.

?ис,1, Динамика биосинтеза амилаз,биомассы и потребления питательных веществ млкромицетом ^.СштогС ВУД Т-2: - I - активность гликоамилазы (А),ед/см3; 2 - активность о(,-амилазы (АС), ед/см3; 3 - биомасса (Ш), г/100 см3; • , Л. -.'Ш культуральиой жидкости; 5 - родуцируюдие вещества (ЕВ); мг/см3

Из рисунка видно, что развитие микроорганизма характеризуется лаг-фазой продолжительностью около 12 ч , за ней следует фаза роста, в которой интенсивно потребляются питательные вещества,увеличивается биомасса и к 96 ч ее накапливается максимальное количество. После 96 ч наступает стационарная фаза роста: часть'клеток претерпевает лизис, о чем свидетельствует уменьшение количества биомассы и повышение Д..Активный биосинтез ферментов протекает с 24 до S6 ч выращивания, максимум накопления ферментов наблюдается к 120 ч.

Получение ферментного препарата амилаз. Препарат амилаз из . культуральной жидкости dawamoZL~gjJ\ Т-2 получили методом осавде- . ния органическими растворителями (этанолом, мзопроланолом и ацетоном). Для получения препарата с высокой активностью глюкоамилазы оптимальным является значение рН культуральной квдкости 4,5, а <к - амилазы - 5,5. Для получения комплексного ферментного препарата осаждение вели при Ш 5,0. Лучшим осадителем для амилаз является этанол в концентрации 74,6 %.

Исследованием влияния температуры и рН на каталитическую активность комплексного препарата установлены оптимальные параметры-действия глюкоамилазы: температура 67 °С, рН - 4,0; е(-амилазы -соответственно 55 °С и 4,7.

Данные по очистке глюкоамилазы представлены в табл.2.

Таблица 2 '_.

Очистка глюкоамилазы rfawamosi W& Т-2

Стадии очистки Актив- :Коли- .-Удельная ность :чество:актив-глюкоами:белка,:ность лазы.ед : мг :еа/мг : : белка • Сте- :Выход, пень : % очист-: ки :

I 2:3:4 Ъ : 6

Культуральная эдкость 4750 590 8,05 1,00 100

Продолжение таблица 2

I : 2 : : 3 : 4 : 5 : 6

Освобождение оте{-амилазы 4370 293,4 14,85 1,65 92,0

Осандение изопропанолом в соотношении 1:1 2379 48,46 49,10 6,10 50,1

Хроматография на ДЕ-52 1035,5 6,02 171,87 21,35 21,8

Уль трафиль тра ция 1065,5 5,48 189,05 23,49 21,8

Гель-фильтрация на сефа-дексе 6-100 166,25 0,35 472,78 58,73 3,5

Как видно из табл.2, разработанный нами метод дает возможность получить высокоочиценный препарат глюкоамилазы с удельной активностью 473 ед/мг белка.

Некоторые (визико-химические свойства гжжоамгогазы. Основные параметры биотехнологического процесса, связанного с использованием ферментных препаратов, зависит от области наибольшей стабильности фермента.

Исследована динамика кислотной инактивации глгокоамилази в интервале рН 3,0-7,0. Наибольшую стабильность фермент проявлял в зоне рй 4,0-5,0. Так, за 72 часа при рй 4,0-5,0 активность глюкоамалаец снизилась на 5-6 % при 40 °С. При 50 °С за 24 часа инкубации остаточная активность составляла 78-82 %,

Термическую инактивацию глюкоамилазы исследовали в интервале температур 30-70 °С. Глйкоамилаза Лакатогс ВУД Т-2 имела достаточно высокую термостабильность в интервале температур

30-60 °С (рнс.2).

Процесс кислотной инактивации глюкоамилазы является типичной

реакцией первого порядка.

как функция рН пои температуре 60 °0 нШ: I - 7,0; 2 - 6,0; 3 - 3,0; 4 - 5,0; 5 - 4,0: А - активность ■ глкжоамилазы, % от исходной; & - время инкубации, ч.

Константы скорости инактивации ( К ) рассчитывали по уравнению:

к в Ь Ь- ,

Т я в

где Е0 - исходаая активность; Е - активность в момент времени .

В табл.3 дана сравнительная характеристика константы скорости инактивации (К._) глюкоамилазы те рмо толе та нтного и мезо<Виль-_ и и

ных микромицетов.

Как В1ЩН0 из табл.3, глюкоамллаза-йгш^ог1/ ВУД Т-2 аблг,1Г'-.т высокой рН- и термостабильностью. Ее инактивация несуществпина т< интервале рН 3,0-5,0. В то время, как гтк.6атиюзаЖам?/Г7огё-1Ъ и И^е&тагб менее стабильна в данной зоне рН. на что указивзет

высокое значение константы скорости инактивации (К„„). Константа инактивации в 4-5 раз и в 18-20 газ выше, чем \лютог1 ВУД Т-2.

Таблица 3

Влияние рН и температуры на константу скорости инактивации глюкоамилааы

Температура, °С

Кср • ТО2, ч"1 при рН

5,0 : 4,0

5,0 : 6,0 : 7,0

30 60

30 60

30 60

ВУД Т-2

0,05 0,02. 0,03 0,26 0,45

38,20 , 16,30 21,20 98,50 '424,10 Л. а ма/поёс - /6

2,16 0,56 0,28 0,30 0,46

192,00 80,50 .48,20 56,20 350,40 ¿е£егпаг &

3,72 0,67 0,31 0,35 0,80

516,40 386,20 220,60 260,30 490,40

Воспользовавшись теорией абсолютных скоростей реакций нами, были рассчитаны основные термодинамические характеристики йН'^ , А которые описывают переходное состояние фермента из

активной формы в инактивирОванную. Результаты расчета представлены в таблице 4. Энергия активации £ахт определялась по графикам Аррениуса (рис.3).

Полученные данные свидетельствуют о том, что инактивация глхжоамидазы Л.аштог£ ЗУД Т-2 носит слоеный характер и в формировании белковой глобулц фермента участвуют два типа взаимодействий:' различные ввды электростатических связей и гидрофобные ¡вваяыо-

действия. При повышении темпера туш ог 60 до 70 °С скорость инактивации возрастает» Зто объясняется. видимо, тем, что тепловая энетовя -вызывает разрушение гидрофобных взаимодействий, ко тора е вносят большой вклад в-стабильность фермента.

Таблица 4

Термодинамическая характеристика активированного комплекса процесса инактивации глюко амилазы Л.ашт08£ ВУД Т-£ '

Темпера тупа: °С ; Рй : Е : ^акт А,*

• — Т ' кДк.моль ■ Дж-К"Ь,юль

■ 30-60 3,0 153,1 150,5 68,2 258,8

60-70 3,0 382,7 379,9 61,9 940,8

30-60 4,0 114,8 112,2 70.8 130,2

60-70 4,0 459,3'' 456,5 ■ 66,2 1154,7 '

30-60 5,0 134,0 131,4 69,2 194,0

60-70 5,0 431,0 428,2 63,4 1079,3

30-60 6,0 172,2 169,6 66,5 324,2

60-70 6,0 191,4 188,6 61,2 376,9

30-60 7,0 181,8 179,2 62,7 366,4

60- 70 7*0 181,8 179,0. 60,2 351,5

Идентификация функциональных групп активного центра глкжо-амилазы Л о ^ото^е'щ^ Т-2. Идентификация функциональных групп ферментов, принимающих участие в аяте катализа, играет ваяную роль г' расшифровке механизма Катализа - одной.из главных задач современной энзимологин. Вакным критерием идентификации этих групп являются константы ионизации (гК) и теплота ионизации (д КП.

Эти величины мы показали используя кинетическую зависимость активность-рН при температурах 5 а 60 °С.

2,9 3,0 3,1 3,8 ЗД (Vr)lC?

Рис. Б. Графики Аррениуса для различных значений pH: I - 4,0; 2 - 5,0; 3 - 3,0; 4 - 6,0; 5 - -7,0.

Результаты расчетов представлены в табл.5.

Таблица 5

Величины рН и дН^ каталитически активных групп глюкоамилази Лму/отог^Ш^ Т-2

--------------------------------------------------—-----г-

Ветвь кривой активность- рН: рК : еДж.моль

: 5 °С : 60 °С

"Кислая" 2 2 2,5 9,67

"Щелочная" 6, 4 5,75 21,00

Полученные значения рК и дН5* соответствуют карбоксильной и имцдазольной группам.

О наличии имндазолыюй группы в каталитическом центре $вт>-монта так же можно судить по инактивации глшоамилазн в присутствии метилелового синего. По всей вероятности, в каталитически активной паре глюкоамилазц карбоксил-имидазол роль электрофильной' группы отводится имидазольной группе, в то время как карбоксильная группа выполняет функция нуклеофила, При совместном дзйотнии этой пары в глюкоз!!Дной связи крахмала будет иметь мвсто стягивания электронов к "точке закрепления" имидазольной группы и уход их от "точки закрепления" иона карбоксила, что и приводит к разруие- • виа этой связи.

Ферментативный гидролиз кукурузного крахмала с целью получения глккозы. Вакным моментом при разработке технологического режима ферментативного гидролиза является определение оптимальной дозировки фермента и продолжительности гидролиза, так как от этих факторов зависят не только технологические, но и техноэколомическла показатели. Для изучения взаимодействия различных факторов на гидролиз крахмала использовали полный факторный эксперимент 2? о централы«« композиционным рото табельный уна^юришгзнироеанвем.

В качестве основных факторов были выбраны: Х^- - дозировка , Сегментного препарата, ед Гл А/г крахмала; - прожшштель -¡гость гидролиза, ч; Хд - температура среды, °С. Выходным параметром процесса У являлось содержание глюкозы по сухим веществам в гидролизате.

В результате обработки экспериментальных данных получено уравнение регрессии:

У=39,48+5, 7Х1+2,7Х2+0,96Хд-2,079X^-1, бХ-^-а,33X^-9, ОТЭХд2

Оптимальными интервалами изменения параметров для гидролиза крах?.-,ала являются: до'зировка ферментного препарата 1,75-1-,85 ед.Гл А/г крахмала; продолжительность 48-50 часов; температура 59,5-60,5 °С. При этом содержание глюкозы в гвдролизатах составляет 98,4 %. На рис, 4 и 5 показаны кривые равных значении содержания глюкозы в гидролизатах. Данные графики несут смысл номограмм и представляют практический интерес для максимального выхода гляь козы в зависимости от дозировки ферментного препарата, продолжительность и температуры гидролиза.

Использование гидрэлизатов кукурузной муки при производстве

сдобного печенья. Использовали высушенный гвдролизат кукурузной

муки, содержащей 58 % глюкозы. Для определения рецептуры сдобно-

к

го печенья с добавлением твдролизата было применено симплекс-решетчатое планирование. В качестве исходной выбрана рецептура на основе печенья "Круглое". За единицу условно- ¥ была принята сумма сахаросодоркащих компонентов: Х^" - гидролизата щуки; Х2 - сахара; У^ - патоки.

В качостие выходного параметра использовали ода из харак-тефшх фиоико-хпмических показателей - намокаемость. Получена по-линоыа для выходного параметра:

А е

5

ь г. а 1

50 5 5 60 6 5 70 ^"с

Рис.4. Кривые равных значений содержания глюкозы в

гидролизатэ в зависимости от концентрации фермента и температзта гидролиза, %: I - 100; 2-95; 3 -90; 4 - 85; 5 - 80. £ -температура, °С; А - концентрация фермента, ед/г крахмала.

Pec.5. Кдавые равных значений содержания глюкозы в тидро-лизате в зависимости от концентрации фермента и продолжительности гидролиза, %: I - 100; 2-95; S - 90; 4 - 85; 5 - 80; продолжительность пиролиза, ч; А - концентрация фермента, ед/г крахмала.

У=151,46X^120,33X2+148, 5Bg+II6.048X^-101, ТбХ^+ЮЗ, 186X3X3

Построили диаграмму (рис.6), позволяющую определить намо-каемость пои различных соотношениях сахаросодержзщих компонентов.

Xi

Рис.6. Зависимость намокавмости печенья от массовой доля сахаросодержащих компонентов: I - 167; 2 - 160; 3 - 155; 4 - 150; 5 - 145. Массовая доля, %: Xj - ферментного гидролиза та муки; Xg - сахара; Xg - патоки.

По результатам реализации симплекс-решетчатого планирования выбраны следующие варианты внесения сахаросодергащего сырья в рецептуре, % : сахар 50-60 ;'•; гядролизат кукурузной муки 40-20; патока - Г0-20 . В подтверждение результатов по выбору рецептуры сдобного печенья с использованием оухого гидголпза-та кукурузной муки нами были проведена внлечка печенья и исследованы его характеристики. В табл.В приведены сравнительные

фшшо-хшичеакиэ показатели качества печенья с заменой 40 % сахара на 30 % гидролиза та и 10 % патоки.

Таблица 6

Физико-химические показатели качества сдобного печенья Наименование показателей

Влажность, $

Титруемая кислотность, град,

Масоовая доля, %: общего сахара

редуцируемых веществ

е-

глюкозы Намокаедасть, %

5,0 •

21,56 0,68 0.34 120,0

¡гидролизатов вдки

5,0 1,76

21,5 8,92 7,44 147,0

Результаты по выпечке сдобного печенья показали целесообразность замены в его рецептуре части сахара на сухой гидролизат кукурузной муки.

Использование гидролизатов пшеничной муки цри производстве прдников. В рецептуре пряников использовали гидролиза ты пшеничной муки, со да дазщвд: редуцирующие вещества 24,1 глюкозы 22,3%. Наш разработана рецептура на основе пряников "Воронежские", а 17 % сахара былэ заменено на гидролпзат пшеничной муки, Дальнейшее увеличение его дозировки затруднено в связи с увеличением влажности пряничного теста. В подтверждение результатов использования гидролизатов пшеничной одкп в рецептуре пряников были проведены выпечки пряников и исследованы их характеристики. Результата анализов контрольных а опытных образцов пряников, показали целесообразность использования гидволйзата пшеничной вдки в производства пряников.

ВЫВОДЫ

1. В работе исследовано 40 шташов микромицегов. Выделан ■ штамм rf.av/amozíWJl, Т-2, обладающий максимальной способностью к биосинтезу амилаз.

2. Установлено, что é.QwamoSi^H, Т-2 способен расти при температуре 35-40 °0. Это позволяет отнести данный штамм к термэ-толерантным микромйцэтам.

3. Биосинтез амилаз микромкцетом носит индуцибельный характер. Активность фермзнта в культуральной жидкости резко возрастает с увеличением концентрации крэхшлсодвржащего сырья,

4. С помощью математического планирования эксперимента получена рациональная питательная свода для глубинного культивирования микрошцета следующего состава, %\ кукурузная мука - I6,0j азотно-кислнй «алий - 0,8; кукурузный экстракт - 0,85j карбонат кальция - 0,25, которая в полтора раза дешевле райее предложенной.

5. Получен высокоактивный технический препарат амилаз, обладающий комплексным действием. Максимальная активность глюкоамила-зы проявляэгся при Ш 4,0 и температуре 6? °С, oí-амилазы при Ш 4,7 и температуре 55 °С.

6. Разработан метод получения внсокоочишенного препарата глв-коамшнзы с удельной активностью 4?3 ед/мг белка и степенью очистки 59. Молекулярная масса глюкоамилазы 32500 .

7. Исследован процеос кислотной и термической инактивации глюкоамилазы. Установлено, что глюкоамплаза обладает высокой термостабильностью в кислой зоне ' рН (4,0-5,0). Инактивация фермента описывается уравнением первого порядка. Расчет термодинамических параметров этого процесса позволяет сделать вывод т> том, что в формировании белковой глобулы фермента важную роль играют гидрофобные взаимодействия.

8. Лдентифнкация функциональных груш активного центра глю-коамплазц по величинам рКа и рКв, теплотам ионизации, фотоокисле-ниа в присутствии фотосшюанбилпзатора (мзтиленового синего)свиде-гвльствуа!' о вероятно?.! присутствии карбоксильной и шцдазольной групп в активном центре фермента.

9. Определены рациональные условия гидролиза кукурузного крахмала комплексным ферментным препаратом амилаз: концентрация крахмала 35 %\ температура 60 °ß; pH 4,5; дозировка Вермонта 1,8 ед.Гл .д/г . ' крахмала; про.нолготелыюсть 48 часов. .

10. Показана целесообразность использовашш гидролизатов пшеничной и кукурузной муки в производстве пряников и сдобного печенья.

11. Ориентировочный годовой экономический эффект продлагаеио-го способа производства сдобного печенья с использованием ферментативных гидролизатов составляет около 16 тыс.руо.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Яковлев А.Н., Ыерабцон H.A., Григоров B.C. Тормо толерантный ■микромщет, сштезирущий амилази./Воронок, техно л. ин-т.-Боронен, 1991. - 8 с. -Дэп. в ВШШСЭНТИ 04.02.91, Jf 542 мб -Дэп. 91.

2. Яковлев А,Н., £еребцотз H.A., Григоров B.C. Влияние источников азотного и углеродного питания на биосинтез амилоз термотолерантным микрошпдетоп oiawomoS-i В/Д 1-2 / Еороне^.техиол. ии—т. - Воронок, 1991,- ? с. - Доп. х. ВШГлСЭИ'Д! 04.02.91,

.'Г- 539 I.'iö - Деп.91.

Ъ. Лкокчаи А.Н., ii3p»6oou К.А., Гр:тог.оъ B.C. iiji;j-uiug фяипко-химпчгсг.г.с «{ангаров ;и дщакжу гидролиза кралтола

глюкоамилазой / Вороная, технол. ин-т. - Воронеж, 1991,- 7 с,-Деп. в ВНИИСЭНТИ 04.02.91, Я 540 мб. - Деп. 91.

4. В.С.Григоров, А.Н.Яковлев. Биосинтез глкжоамилазы и аминокислот штаммами рода при оптимальной а повышенной температуре / Биотехника и биотехнология: Тез. докл. заоч.науч,-техн. конф. ,март-июнь 1990 г. - Тамбов, 1990,- с.16.

5. Оптимизация ферментативного гидролиза пшеничной муки

/ ILA.Кевебцов, Ю.С.Сербулов, Н.М.Дэрканосова, А.Н.Яковлев, С. Е. Сомин а // Хлебопродукты1991.- Я 9.- C»oS-38.

6. .Использование ферментативных гидролизатов муки при производстве пряников ) Н.ЛЛеребцов, Н.М.Дерканосова, А.Н.Яковлев, С.Е.Фомина /У Научно-технические достижения л передовой опыт в отрасли хлебопродуктов: Гшформ.сборник.- 1,1., 1991.- Вып.З.-С.46-47.

7. Получение глюкозы фермента тдшшм путем из крахшлсодергащего сырья / Н.А.Ееребцов, В.С.Григоров, А.Н.Яковлев, В.А,Голыб1ш' / Тез. докл. четвертой Всесоюз.науч,- техн. конф. "Разработка комбинированных продуктов питания (мэдико-биологлчесгае*

и

аспоктп, технология, аппаратурное оформление, оптимизация).--Кемерово, 1991,- C.I50-I5I.

Подписано в печать 31.03.92 г. Формат 60x94 1/16» Бумага писчая. Тираж 100 экз. Заказ /3^". .

394017 Воронеж, пр. Революции, 19 Воронежский технологический институт Участок оперативной полиграфии.