Разработка научных основ технологии получения ферментативных гидролизатов биополимеров на основе отходов пищевой и микробиологической промышленности

Красноштанова, Алла Альбертовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка научных основ технологии получения ферментативных гидролизатов биополимеров на основе отходов пищевой и микробиологической промышленности
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка научных основ технологии получения ферментативных гидролизатов биополимеров на основе отходов пищевой и микробиологической промышленности"

На праяах рукописи

Красноштанова Алла Альбертовна

РАЗРАБОТКА НАУЧНЫХ ОСНОВ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ ГИДРОЛИЗАТОВ БИОПОЛИМЕРОВ НА ОСНОВЕ ОТХОДОВ ПИЩЕВОЙ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Специальность 03.00.23 - биотехноло'ия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

МОСКВА 2009 г

003482704

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета им. Д.И.Менделеева.

Научный консультант: доктор химических наук, профессор

Крылов Игорь Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Коваленко Леонид Владимирович

доктор химических наук, профессор Сульман Эсфирь Михайловна

доктор химических наук, профессор Семенова Мария Германовна

Ведущая организация: Научно-Технический Центр

«Лекарства и биотехнология» (НТЦ «Лекбиотех»)

Защита диссертации состоится «24» ноября 2009 г б 10часов на заседании объединенного Диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева по адресу: 125047, Миусская пл., д.9 в аудитории 443.

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан « '¡}_ / у> О/С Т-% <!2009г .

Ученый секретарь Диссертационного совета ДМ 212.204.13, к.т.н. ЛУ И.В. Шакир

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Разработка недорогих эффективных препаратов кормового, пищевого и медицинского назначения отечественного производства является одной из актуальных задач современной биотехнологии. Наибольшее практическое значение имеют препараты белковой, липидной, нуклеотидной и углеводной природы.

Препараты нуклеотидной природы (например, препарат ЭНКАД — смесь олигорибонуклеотидов и пиримидиновых нуклеозид-З'-фосфатов) широко применяются как лекарственные средства. Они регулируют нуклеотидный обмен, обладают иммуномодулирующими свойствами, применяются для лечения абиотрофий различного происхождения, псориаза, рассеянного склероза и других социально значимых заболеваний [Шабанова с соавг., 2005].

Препараты белковой природы (гидролизаты и ферментолизаты) применяются в качестве источника азота в микробиологических средах, как пищевые добавки, а при соответствующей очистке как смесь аминокислот для парентерального питания. Кроме этого, белковые гидролизаты служат сырьем для получения аминокислот, аминосульфокислоты таурина, играющей важную роль в обеспечении зрительной, кроветворной и др. функций организма человека и животных [Нестерова с соавт., 2001].

Моносахара, получаемые путем гидролиза углеводсодержащих субстратов, используют для производства кормовых и пищевых препаратов. [Мамыкин с соавт., 1998].

На основе жировых отходов возможно получение свободных жирных кислот, применяемых в производстве мыла, высших жирных кислот и спиртов для получения пищевых, парфюмерно-косметических и фармацевтических продуктов [Малахов, 2003].

В качестве сырья наиболее перспективно использовать отходы пищевой и микробиологической промышленности животного, растительного и микробного происхождения: пивную дробину - отход пивоваренной промышленности, жиро-содержащие и кератансодержащие отходы мясоперерабатывающей промышленности, биомассу хлебопекарных дрожжей - отход спиртового производства, биомассу бактерий Вгеу1Ьас1егшт/1ауит - отход производства аминокислот и др. Практическая ценность отходов обусловлена: высоким содержанием в них липидов, белков, углеводов, нуклеиновых кислот; улучшением экологической обстановки на соответствующих производствах за счет утилизации данных отходов; возможностью организации выпуска дополнительной конкурентоспособной продукции, что позволит повысить рентабельность основного производства.

Вследствие высокого содержания в отходах биополимеров их целесообразно перерабатывать в гидролизаты пищевого, кормового или медицинского назначения. Для этого используют химический и ферментативный гидролиз.

Список сокращений

БСА - бычий сывороточный альбумин, АОБ - алкилоксибензол, СВ - сухое вещество, ФС ГОК - ферментные системы поджелудочной железы, ФС КП - ферментные системы клеток печени, ФП - ферментный препарат, ИЭТ - гаоэлектриче-ская точка, ВМФ - высокомолекулярная фракция, НМФ - низкомолекулярная фракция, НК - нуклеиновые кислоты, ЖК - жирные кислоты.

)

К недостаясам первого относятся жесткие условия проведения: высокая температура, сильнокислые или сильнощелочные значения рН среды. Это приводит к образованию нежелательных побочных продуктов, а также увеличению содержания минеральных примесей в гидролизатах, что осложняет и удорожает их очистку. Вышеуказанных недостатков лишен ферментативный гидролиз, проводимый в более мягких условиях. Однако в этом случае не удается достичь высокой степени гидролиза субстрата по причине инактивации ферментов. Для достижения высокой степени конверсии субстратов применяют дробную подачу ферментов, что ведет к повышению нормы их расхода, и, следовательно, увеличению себестоимости готового продукта и снижению эффективности ферментативного процесса. Одним из путей повышения эффективности ферментативного гидролиза является стабилизация ферментов, которую можно осуществить введением в реакционную среду или в раствор ферментного препарата модифицирующих добавок: полиолов, аминов, аминокислот, минеральных солей и др. [Tropak, 2007]. Однако, как правило, стабилизация белка сопровождается ингибированием его каталитической активности [G6ller,Galinski,1999]. Поэтому разработка приемов и выяснение механизмов модификации белков, приводящей к их функциональной и операционной стабильности одновременно с повышением функциональной активности, имеет важное теоретическое и практическое значение. Также следует отметать, что у потребителей, особенно, пищевых, медицинских и кормовых препаратов могут возникнуть проблемы с качеством гидролизатов, полученных с использованием добавок. Указанную проблему можно решить применением модифицирующих добавок, получаемых из природного сырья. В качестве таких добавок можно использовать алкилок-сибензолы (АОБ), широко распространенные в природе, синтезируемые микроорганизмами и растениями [Kozubek, Turnan, 1998; Эль-Регистан с соавт., 1998,2006] и обладающими функциями адаптогенов [Николаев с соавт., 2006]. Модифицированные АОБ ферменты обладают повышенной функциональной стабильностью, расширенными температурным и рН диапазонами активного катализа, что значительно снижает риск развития посторонней микрофлоры при продолжительном гидролизе и не требует поддержания стерильных условий. Кроме того, модификация белка АОБ приводит к значительному увеличению скорости ферментативного гидролиза [Маршросова с соавт., 2005; El-Registan et al., 2005].

Друтим «узким» местом ферментативного гидролиза является очистка получаемых продуктов, требующая использования дорогостоящих реагентов и препаративных методов (хроматографии, гель-фильтрации, диализа и т.п.), которые сложно масштабировать в промышленном производстве и желательно заменить более простыми и дешевыми методами.

Таким образом, утилизация отходов пищевой и микробиологической промышленности требует разработки эффективных способов получения ферментативных гидролизатов.

В условиях рыночной экономики конкурентоспособность производства зависит от его способности быстро адаптироваться к изменяющимся условиям рыночной среды и спроса на продукцию. Поэтому целесообразно разработать максимально унифицированные технологии получения ферментативных гидролизатов различной степени очистки и назначения для возможности быстрой подготовки технологических линий и получения продукции требуемого качества.

Анализ литературных данных показывает, что современные технологии получения ферментативных гидролизатов микробной, животной и растительной при-

роды существенно различаются как стадиями предварительной подготовки сырья, так и используемыми ФП и методами очистки получаемых продуктов. В связи с этим актуально разработать общие подходы к получению ферментативных гидро-лизатов из различных видов сырья; предложить общие пути повышения эффективности процессов ферментативного гидролиза; создать типовые кинетические схемы для количественного описания технологических стадий, что в совокупности позволит в дальнейшем предложить универсальные алгоритмы управления технологическими процессами.

Целью исследования является разработка научных основ технологии получения ферментативных гидролизатов белковой, липидной, углеводной и нуклео-тидной природы на основе отходов пищевой и микробиологической промышленности, а также повышение эффективности ферментативных процессов за счет структурной модификации и стабилизации применяемых ферментов. В работе были поставлены следующие задачи:

1) разработать технологические приемы предварительной обработки растительного, животного и микробного сырья, направленной на повышение эффективности их последующего ферментативного гидролиза;

2) изучить, используя кинетический метод исследований, закономерности процессов гидролиза биополимеров в реакциях, катализируемых модифицированными АОБ и нативными ферментами (на моделях высокоочшценных ферментов и субстратов); выявить общие закономерности влияния АОБ на скорость ферментативных реакций;

3) используя физико-химические методы анализа, выяснить возможные взаимодействия АОБ с ферментами и полимерными субстратами, способные научно обосновать наблюдаемые эффекты стимуляции или ингибирования катализа от введения АОБ в реакционную среду;

4) на основе выявленных на модельных системах закономерностей ферментативного гидролиза разработать пути повышения его эффективности для вариантов переработки микробного, растительного и животного сырья с применением технических ФП;

5) разработать технологические приемы выделения и очистки ферментативных гидролизатов белковой, липидной, нуклеотидной и углеводной природы и дать рекомендации по оптимизации условиям их получения;

6) провести проверку соответствия нормативных показателей получаемых препаратов требованиям соответствующих ТУ;

7) провести оценочные технико-экономические расчеты разработанных технологий и оценить их эколого-экономическую эффективность.

Научная новизна. Впервые показана возможность применения кинетического метода для описания закономерностей ферментативного гидролиза субстратов липидной, белковой и углеводной природы в составе микробного, растительного и животного сырья техническими препаратами нативных гидролаз, а также стабилизированных добавкой АОБ.

Выявлены общие для различных полимерных субстратов и ферментов закономерности ферментативных превращений, учитывающие влияние АОБ на скорость ферментативных реакций. Показано, что ключевыми стадиями, определяющими скорость ферментативного гидролиза в присутствии АОБ, являются образование комплексов фермента с АОБ и субстрата с АОБ.

Показана возможность применения подхода, разработанного для повышения активности и стабильности гидролаз в их комплексах с АОБ, к другим ферментным белкам на примере ферментных систем клеток печени, осуществляющих трансформацию серосодержащих аминокислот (цистеина и цистина) в таурин.

На основе количественного описания стадий ионного обмена и осаждения различных полимерных субстратов из водных и водно-спиртовых растворов разработаны схемы эффективной очистки гидролизатов.

Предложенные кинетические схемы предполагают возможность создания единого алгоритма управления технологическими процессами получения ферментативных гидролизатов на основе сырья различного происхождения.

Впервые с использованием квантово-химических и термодинамических расчетов, подтвержденных физико-химическими методами (УФ-, ИК-спекгроскопия), показано, что образование комплекса АОБ с ферментом происходит' за счет водородных связей между ОН-группами АОБ и функциональными группами аминокислот ферментного белка, расположенных в районах, прилегающих к активному центру, а также гидрофобных взаимодействий. Установлено, что образование комплексов АОБ с субстратом обусловлено теми же типами взаимодействий. Выявленные закономерности объясняют эффекты изменения каталитической активности ферментов, модифицированных АОБ.

Практическая значимость. Разработаны технологические режимы, обеспечивающие повышение эффективности ферментативного гидролиза биополимеров в составе отходов микробиологической и пищевой промышленности: 1) получения белковых гидролизатов из биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae и бактерий Brevibacterium flavum с применением протосубтилина ГЗх; 2) переработки кера-тинсодержащего сырья в таурин с использованием протосубтилина ГЗх, ферментных систем поджелудочной железы крупного рогатого скота (ФС ПЖ КРС) и печени быка (ФС КП); 3) получения углеводной фракции из пивной дробины путем ее гидролиза ферментным комплексом (целловиридин ГЗх, глюкоамилаза Aspergillus crwamori и панкреатическая а-амилаза); 4) получения панкреатического гидролиза-та дрожжевой РНК и 5) гидролиза жиросодержащих отходов панкреатической липазой.

Разработаны технологические схемы переработки гидролизатов белковой, липидной, нуклеотидной и углеводной природы в конкурентоспособную продукцию медицинского, пищевого и кормового назначения.

На основе разработанных кинетических схем гидролиза различных биополимеров модифицированными АОБ гидролазами подобраны режимы ведения процессов ферментативной переработки сырья, обеспечивающие степень конверсии субстратов в присутствии АОБ не менее 90%, что позволяет сократить норму расхода ФП и время гидролиза в 2 - 8 раз.

Используя кинетический метод исследований, обоснованы оптимальные режимы выделения и очистки продуктов гидролиза, основанные на применении методов ультрафильтрации, ионного обмена и осаждения из водных и водно-спиртовых растворов.

экономической оценки разработанных технологий показано, что предложенные способы переработки отходов позволяют снизить экологический ущерб на 0,5 -40 млн. руб/год-завод.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на Международных и Всероссийских научно-технических конференциях: Международной конференции «Химия и технология лекарственных средств» (Санкт-Петербург, 1994 г); 3, 4,5 и 12 Международных конференциях «Окружающая среда для нас и будущих поколений: экология, бизнес, экологическое образование» (Самара - Астрахань - Самара, 1998, 1999,2000,2007 гг); Заочной научно-практической конференции «Биотехнология в ФЦП «Интеграция» (Санкт-Петербург, 1999 г); Международной конференции «Химия и биотехнология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов» (Москва, 2000 г); Международной конференции «От фундаментальной науки к новым технологиям. Химия и биотехнология БАВ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Москва - Тверь, 2001 г); 1 - 5 Международных конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003, 2005, 2007, 2009 гт); Научно-технической конференции «Технологии живых систем» (Москва, 2003 г); XII Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Санкт-Петербург, 2003 г); Международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006 г); 4,5 Российских конференциях «Нейроиммунопатология» (Москва, 2006,2007 г).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликованы 32 работы, в том числе 17 статей в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах, получено 6 патентов РФ на изобретения. Результаты исследования нашли отражение в 4-х учебных пособиях и монографии, написанных с участием автора.

Работа выполнена в соответствии с программой Министерства науки и образования РФ «Приоритетные направления развития науки и техники. Технологии живых систем».

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора (5 глав), методической части, результатов исследования и их обсуждения (7 глав), выводов и списка литературы из 422 наименований, в том числе 795 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 325 стр. и содержит 122 таблицы и 196 рисунков. Материалы, производственной апробации, подтверждающие основные результаты работы, приведены в приложении.

Глава 1. Обзор литературы.

Обсуждены характеристики и области применения гидролизатов, получаемых на основе белкового, липидного, углеводного и нуьслеотидного сырья, даны обзор и анализ существующих технологий их получения. Приведены данные по структуре и свойствам наиболее распространенных гидролитических ферментов и существующих способах стабилизации ферментов, включая использование химических, фармакологических и молекулярных шаперонов для этой цели. Приведена информация о свойствах природных алкилоксибензолов (АОБ) и возможностях их применения в качестве стабилизирующих добавок.

Глава 2 «Материалы и методы исследования»

Объектами исследования являлись отходы пищевой и микробиологической промышленности. Их состав и годовое количество, образующееся на предприятиях средней мощности, приведены в табл. 1.

Таблица 1

Состав возобновляемых отходов растительного, животного и микробного происхождения

Наименование вторичного сырья Сред- Содержание, % к СВ

него- сырого углево- липи- Нуклеи-

довое протеина дов дов новых

коли- кислот

чество

отхо-

да, т/год

Пивная дробина 40000 30,0 70,0 отс. отс.

Жиросодержащие отходы 10000 следы следы 90.0 следы

Кератинсодержащее сырье 560 85.0 отс. 15.0 следы

Нативная биомасса дрожжей на 10000 52.0 22.0 21.0 6.5

примере 5ассИаготусе$ сегеу1$1ае

Нативная биомасса бактерий на 10000 61.2 12.2 20.0 8.3

примере ВгеуЛааепитАскит

Ферментные препараты: трипсин ПОх с активностью 2000 ед./г; рибонуклеаза ГЗх панкреатическая с активностью 12000 ед./мг; амилаза ГЗх панкреатическая с активностью 2000 ед./г; глюкоамилаза ГЗх Aspergillus awamori с активностью 2000 ед./г; липаза панкреатическая с активностью 16 ед./г; протосубтилин ГЗх с активностью 200 ед./г; целловиридин ГЗх с активностью 200 ед./г; протеазы и пептидазы в составе поджелудочной железы крупного рогатого скота с активностью 2000 ед./г СВ; комплекс тауринобразующих ферментов в составе печени крупного рогатого скота с активностью по таурину 2000 ед./г СВ.

Содержание нуклеиновых компонентов в микробных клетках, экстрактах, гидролизатах и препаратах определяли по методу A.C. Спирина [Спирин, 1986]; содержание общего азота в микробных клетках, пивной дробине, кератинсодержа-щем сырье и препаратах - микрометодом Къельдаля [Асатиани, 1964]; белковых веществ - модифицированным методом Jloypn[Lowry, 1951]; аминного азота - в реакции с нингидриновым реактивом [Асатиани, 1964]; углеводов - фенол-серным методом [Жданов, 1963]; содержание воздушно-сухого вещества - по методике [Шакир с соавт., 2008]; свободных жирных кислот - по методике [Шакир с соавг., 2008], ХПК - по методу [Лобачев, 2006]; количество нистина и цистеина - ппри-мстрически с использованием бромата и иодида калия соответственно [Критчфилд, 1965].

Активность протеаз и пептидаз ферментной системы поджелудочной железы определяли по методу Ансона [Северин, 1998]; тауринобразующих ферментов клеток печени - по методике [Сапронов, 1999]; панкреатической рибонуклеазы - по методу Калницкого [Фукс с соавт., 1990], амилазы и глюкоамилазы - спектрофо-тометрическим методом с 2,4-динитросалициловой кислотой [Грачева, 2001]; цел-ловиридина - по методу [Полыгалина с соавт., 2003], панкреатической липазы -титриметрическим методом [Полыгалина с соавт., 2003].

Содержание мононуклеотидов в гидролизатах РНК и растворах определяли спектрофотометрически после разделения методом двуслойной ТСХ на пластинах марки «SiIufol-UV-254» с использованием элюентов: 1) изопропанол - аммиак -вода (45: 45: 2: 8 % об.) и 2) н-бутанол - ацетон - муравьиная кислота - вода (45: 45:2:8 % об.)

Спекгрофотометрические измерения в ультрафиолетовой и видимой области спектра проводили на спектрофотометре марки «Спекорд М-40» (Германия). ИК-спектры снимали на ИК-спектрофотометре Фурье марки ФСМ-1201 (Россия)с использованием таблеток бромида калия, пропитанных 0,1%-ными растворами исследуемых веществ. Квантово-химические расчеты проводили с использованием стандартной программы "Hyperchem 7", включающей полуэмпирические методы: расширенный метод Хюккеля, CNDO, INDO, MNDO, AMI, РМЗ, ZIND01, ZINDO/S, а также средства визуализации для создания структур молекул и организации интерфейса с Broknoven PDB, Sylyl MOL2 и МОР АС.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием стандартных программ решения алгебраических и дифференциальных уравнений с последующей оптимизацией их параметров и проверкой разработанных моделей на адекватность по критерию Фишера, отвечающего условию Fon. < Ртабл. для уровня значимости 0.05 [Худсон, 1970]. Глава 3. Результаты и обсуждение.

Среди большого разнообразия источников биотехнологического сырья в настоящее время ведущее место занимают возобновляемые отходы пищевой и микробиологической промышленности. В табл. 1 приведен состав и среднегодовое количество отходов, образующихся на соответствующих предприятиях средней мощности.

Эти отходы характеризуются высоким содержанием биополимеров и могут служить сырьем для получения низкомолекулярных продуктов белковой, липид-ной, нуклеотидной и углеводной природы путем гидролиза техническими препаратами гидролаз. Схема проведения исследований приведена на рис. 1. 3.1. Получение ферментативных гидролизатов белковых веществ из микробного сырья

3.1.1. Исследование количественных закономерностей ферментативного гидролиза белковых веществ на модельной системе БСА - трипсин

Для установления количественных закономерностей ферментативного гидролиза белка на первом этапе работы исследовали гидролиз модельного белка БСА трипсином. Математически процесс описывался в соответствии с кинетической схемой Михаэлиса-Ментен, в которой вследствие различий в скоростях разрыва различных связей в молекуле белка выделяют несколько последовательных стадий. Установлено число лимитирующих стадий.

В экспериментах установлено влияние на процесс ферментативного гидролиза: 1) концентрации субстрата для обработки данных в координатах Лайнуивера-Берка; 2) концентрации фермента, необходимая для нахождения линейного участка зависимости скорости реакции от концентрации фермента; 3) температуры; 4) рН среды.

Типичные результаты экспериментов представлены на рис. 2-5.

Рис. 1. Принципиальная схема получения гидролюатов биополимеров.

Обработка полученных экспериментальных данных по стандартным методикам показала, чгго для математического описания гидролиза БСА трипсином можно использовать кинетическую схему, включающую две лимитирующие стадии:

К, кР| К.2 крр) Е + Р0 ЕРо —► Р) + Е <-+ ЕР1 —> Е + РР] (1) I крро РРо

где: Р0, Е, ЕР0, ЕР) - соответственно концентрации субстрата, фермента, продукта, фермент-субстратного комплекса; Кь Кг - константы равновесия образования соответствующих комплексов, крЬ крро, Ц,р1 - эффективные константы скорости гидролиза.

Температурная зависимость описывалась уравнением Аррениуса, а рН среды - уравнением специфического кислотно-основного катализа: к = к*/(1+ Ка-[НГ]) (2),

где: к* - константа скорости, не зависящая от рН среды, Ка - константа равновесия образования протонированного комплекса, [Н+] - концентрация ионов водорода.

В результате обработки данных были найдены значения эффективных констант, энергий активации и параметров уравнения рН зависимости (табл.2).

Однако найденные закономерности оказались справедливыми только для начального участка кинетических кривых, а в дальнейшем экспериментальные данные по накоплению продуктов гидролиза оказались существенно ниже расчетных. Снижение скорости реакции может быть обусловлено инактивацией фермента в свободном состоянии или в комплексе с субстратом, а также ингибированием фермента продуктами гидролиза. Результаты исследования влияния начальной концентрации продукта на скорость гидролиза, а также частичной инактивации фермента (прогревом при температуре 90°С) показали, что для гидролиза БСА трипсином характерна инактивация свободного фермента при отсутствии ингибирова-ния конечным продуктом. Дополнение предложенной кинетической схемы (1) уравнением инактивации позволило добиться адекватного описания экспериментальных данных:

Е —► Ен/а (3),

где: кин - константа скорости инактивации, Е„/а - концентрация инакгивированного фермента.

В экспериментах степень гидролиза БСА при оптимальных условиях реакции не превышала 40%. Расчеты показали нецелесообразность увеличения времени гидролиза свыше 2 ч, т.к. к этому времени 81% фермента находится в инактивиро-ванном состоянии. Согласно разработанной кинетической схеме достижение 90% конверсии БСА возможно при условиях гидролиза, приведенных в табл. 3. При этом, норма расхода трипсина возрастает до 14% от массы субстрата, а длительность гидролиза составляет не менее 14 ч. Другой способ повышения эффективности ферментативного гидролиза основан на введении в реакционную среду добавок, способных повысить активность и стабильность ФП и, соответственно, увеличить выход продуктов гидролиза.

время, мин

Ее, моль №л

Рис.2. Зависимость начальной скорости Рис.3. Влияние начальной концентрации гидролиза БСА трипсином от началь- БСА на выход продуктов его гидролиза ной концентрации фермента. трипсином.

температура, °С

Рис. 4. Влияние температуры на выход Рис. 5. Влияние pH среды на выход продук-

(X*) продуктов гидролиза БСА трипси- тов гидролиза БСА трипсином.

ном.

* - на всех последующих рисунках обозначение X также относится к выходам продуктов при гидролизе, осаждении, ионообменном выделении и т.п.

Таблица 2

Значения эффективных констант и энергий активации отдельных стадий процесса ферментативного гидролиза БСА трипсином А) в отсутствие АОБ

Путь Е, кДж/ моль Ка, л/моль к*, с"' Ki = 0.50 ± 0.05 л/моль; К2 = 0.26 ±0.02 л/моль

кво 42 ±3 (3.53 ± 0.46)-10'6 0.0020 ±0,0002

крро 22±2 (4.24 ± 0.16)'10 5 0.0082 ± 0,0008

kppi 18±1 (1.05 ± 0.14)-10"5 0.015 ±0,002

кин 20±1 0.119 ±0.015 0.00023 ± 0,0003

Б) в присутствии С7-АОБ/ С12-АОБ

Путь E, кДж/моль К,, л/моль k*, c"1

kd 26±2/19±l (1,27 ± 0,17)-10"5/(1,02 ± 0,13)-10-" 0,30 ± 0,03/4,07 ± 0,45

ka 32±2/24±2 (6,83 ± 0,89)-10^/(5,47 ± 0,71)-10'" 0,0013 ± 0,0001/0,0014 ± 0,009

ks 15±1/17±1 (2,50± 0,33)-10"V(],04± 0,14)-10° 4,77 ±0,52/9,15 ±0,65

kppo.di 17±l/23±2 (9,37 ± 1 Д2)-10"6/(7,00 ± 0,91)10^ 0,0055 ± 0,0006/0,0057 ± 0,0007

kppl.dl 16±1/15±1 (1,59 ± 0,21>10"7(1.06 ± 0,14)-10° 0,0087 ±0,001/0,0085 ±0,001

kpi.di 24±2/37±3 (6,59 ± 0,86)-1 (У*/( 1.06 ± 0,14)-10"5 0,15 ± 0,02/0,0020 ±0,0002

kpp0.d2 18±2/21±2 (9,37 ± l,22)-10"6/(7,00 ± 0,21)10^ 0,0059 ± 0,006/0,0052 ± 0,004

kppl.d2 17±2/14±1 (1,59 ± 0,21)10's/(l,06± 0,14)-10'3 0,0093 ± 0,001/0,0077 ± 0,001

kpi,d2 26±2/34±2 (6,59 ± 0,86)-10"6/(3,33 ± 0,43)-1041 0,16 ± 0,02/0,0018 ±0,0002

кинй 21±2/34±2 (1,46 ± 0Д4)-10"('/(1,89 ± O,^)^"" 0,00045±0,0005/0,00083±0,00008

Kid = 0,25 ± 0,02 л/моль; K2d = 0,15 ± 0,01 л/моль; K3d = 0,17 ± 0,01 л/моль, Kid = 0,11±0,01 л/моль

Среди химических соединений, используемых для интенсификации ферментативных процессов: минеральных солей, ПАВ, полиолов, аминов и аминокислот,

были выбраны природные соединения, относящиеся к классу алкилоксибензолов (АОБ), вырабатываемые микроорганизмами и растениями и участвующими в контроле перехода в покоящееся состояние (анабиоз). В работе использовали два гомолога АОБ, различающихся длиной углеводородного радикала (гидрофобностью). Они были условно обозначены как С7-АОБ и С12-АОБ.

Таблица 3

Условия ферментативного гидролиза БСА трипсином, обеспечивающие степень гидролиза не менее 95%_

Расход фермента, % от субстрата т, ч Т,°С РН Тип АОБ; его концентрация, моль/л, мольное соотношение АОБ: фермент

14 14 45±2 6.0±0.2 без АОБ

6 6 55±2 6.0±0.2 Ст-АОБ; 2.5-10Л 5:1

16 16 55±2 6.0±0.2 С|2-АОБ; 5.0-10"', 1:1

Известно, что влияние АОБ на ферментативную активность (стимуляция -ингибирование) зависит от концентрации и структуры АОБ, также наблюдается эффект расширения Т- и рН-диапазонов активного катализа [Мартиросова с соавт., 2005; El-Regisnan et al., 2005]. Рис. 6 иллюстрирует влияние концентрации АОБ на скорость гидролиза БСА трипсином: в случае С7-АОБ она увеличивается по сравнению с кошролем в 4 раза, а в случае С|2-АОБ - уменьшается в 4 раза.

Поскольку в данных экспериментах исследовалась 3-х компонентная система, то для установления кинетической схемы, описывающей участие АОБ в процессе гидролиза, были поставлены опыты по предынкубации раздельно фермента и субстрата с АОБ в ранее подобранных оптимальных концентрациях при ведении гидролиза в стандартном режиме (рис. 7 и 8). Оказалось, что при малом времени предынкубации для каждого АОБ наблюдается снижение скорости гидролиза на 10 - 20%, а при его увеличении до 20 мин — увеличение на 50 - 70%.

С позиций формальной кинетики процесс ферментативного гидролиза в присутствии АОБ может быть описан схемами превращений (1) и (2), дополненными уравнениями, учитывающими образование комплексов АОБ с ферментом и субстратом:

k<i ka Е + D —► ED—► Е + D; ks

S + D —> SD

K)d kpidi K.2d

ED+Po-^EDPo—Pi+ED-s-» EDP,

ikppOdl Ikppldl

PPo PP.

K3d kpid2 Kid E+DPo<->EDPo—»DP 1 +E<-> EDP,

Ikpp0d2 Ikppld2 PP0 PPl

(4),

где: D, ED, DP0, DP,, P,D, EDP0, EDP,, -соответственно концентрации АОБ, комплексов фермента с АОБ, субстрата с АОБ, тройного ингермедиата субстрата и фермента с АОБ. Остальные обозначения аналогичны схеме (1).

0 2 4

концентрация АОБ, моль/л 10*

10 20 время, мин

Рис. 6. Зависимость начальной скорости гидролиза БСА трипсином от начальной концентрации С7-АОБ(1) и С,2-АОБ (2).

Е 2

10 18 20 время, мин

Рис. 7. Зависимость начальной скорости гидролиза БСА трипсином от времени предынкубации с ферментным препаратом С7-АОБ (1) и С12-АОБ (2).

Рис. 8. Зависимость начальной скорости гидролиза БСА трипсином от времени предынкубации субстрата с С7-АОБ (1) АОБ (2).

зо

Таким образом, введение АОБ в среду гидролиза БСА трипсином в оптимальных условиях позволяет сократить норму расхода ФП и время процесса в 2 раза (табл. 3).

3.1.2. Исследование количественных закономерностей экстракции белковых веществ из биомассы дрожжей и бактерий протосубтилином ГЗх и ФС ПЖ КРС

Полученные на модельной системе закономерности были применены к получению белковых гидролизатов из биомассы дрожжей и бактерий.

В качестве сырья для получения белковых гидролизатов использовали: биомассу дрожжей сегеуйг'яе (отход пивоваренного производства) и биомассу бактерий В. Атит (отход производства аминокислот), которые характеризуются высоким содержанием сырого протеина и нуклеиновых кислот (табл. 1). Поэтому из них целесообразно получать гидролизаты белковой и нуклеотидной природы. При извлечении из микробной биомассы белковых веществ ее подвергали предварительной денуклеинизации по ранее разработанной технологии [Крылов, Волкова, 1995]: температура 90°С; рН 9.0; время обработки клеток 1 ч; концентрация клеток 10% СВ. После обработки денуклеинизированную биомассу отделяли фильтрованием и направляли на ферментативный гидролиз. Так как наибольшее практиче-

ское значение имеют гидролизаты со степенью гидролиза белка (отношением аминного азота к общему) не менее 50%, получаемые при использовании пептидаз, в наших исследованиях применяли пептидазы в составе ПЖ КРС, подготовленные по известной методике [Неклюдов с соавт., 1995]. С целью снижения нормы расхода ПЖ КРС ферментативный гидролиз проводили в два этапа: на первом - осуществляли гидролиз микробных белков ФП протосубтилином ГЗх с целью расщепления ВМФ белка до пептидов, а на втором этапе - гидролизуя пептиды протеазами ФППЖКРС.

С целью повышения эффективности гидролиза ферментные препараты стабилизировали с помощью АОБ. Эксперименты показали, что процессы распада микробных белков подчиняются вышеприведенным кинетическим схемам для модельной системы и различаются только значениями параметров (табл. 4), а также тем, что ФС ПЖ КРС подвергаются ингибированию продуктами гидролиза по уравнению:

Кя

Е + Р <-»■ ЕР„/а (5), где: Ки - константа ингибирования, ЕРш'а - концентрация неактивного комплекса фермент-продукт.

Таблица 4.

Значения констант и энергий активации отдельных стадий процесса гидролиза белковых веществ дрожжей и бактерий под действием протосубтилина и ФС ПЖ КРС А) под действием протосубтилина ГЗх

Определяемый параметр Путь кинетической схемы, определяемый эффективной константой

kppo 1 kppi | кРо } кщ,

Белок дрожжей

Е, кДж/моль 31±2 17±1 16±1 50 ±4

к', с"1 0,35 ± 0,02 0,51 ±0,04 0,31 ±0,04 (1,3± 0,02) ■Ю'4

Ка, л/моль 1,2 ±0,2 1,4 ±0,2 2,9 ± 0,3 1,4 ±0,2

К, = 0,037 ± 0,002 л/г, К2 = 0,018 ± 0,003 л/г

Белок бактерий

Е, кДж/моль 31±2 17±1 16±1 50±4

kV 0,17 ±0,02 0,25 ± 0,04 0,15 ±0,02 (0,9±0,1)-1 О-4

Ks, л/моль 1,2 ±0,2 1,4 ±0,2 2,9 ±0,3 1,4 ±0,2

Ki = 0,53 ± 0,04 л/моль, К2 = 0,26 ± 0,03 л/моль

Б) под действием ФС ПЖ КРС

Определяемый параметр Путь кинетической схемы, определяемый эффективной константой

kppo 1 kppi 1 кро 1 кщ.

Белок дрожжей

Е, кДж/моль 25±2 40 ±2 I 32 ±2 22 ±2

к', с" 1,3 ±0,1 2,0 ±0,2 1,5 ±0,1 1,7 ±0,2

К„, л/моль (6,2 ±0,5)-10"0 (5,3 ±0,4У10"Ь (2,9 ±0,4)-10* (3,8±0,3)-10~<>

Ки = 47,6±5,6 л/моль, К2() = 32,0±5,6 л/моль, K„d = 350±40 л/моль

Белок бактерий

Е, кДж/моль 25±2 40 ±2 32 ±2 22 ±2

к*, с"1 0.8 ±0,1 1,2 ±0,1 0,10 ±0,01 3,4 ±0,3

Ка, л/моль (3,1 ±0,4)-10"<' (2-6±0,3)'106 (2,9 ±0,3)-10"6 (3,8 ±0,3>10"<>

К, = 0,24± 0,02 л/моль, К2= 0,16±0,01 л/моль, К„ = 0,58±0,06 л/моль

Результаты исследований влияния АОБ на ферментативный гидролиз микробных белков, обобщенные в табл. 5, показали принципиальную идентичность констант с ранее полученными для модельного процесса.

Применение С7-АОБ позволяет сократить норму расхода протосубтилина в 2 раза и, соответственно, во столько же раз сократить время ферментолиза. Для достижения 50%-ного выхода аминного азота получешше на первом этапе пептиды гидро-лизовали ФС ПЖ КРС, в которой ферменты стабилизировали С12-АОБ, эффективном в более гидрофобной среде раствора пептидов. При ведении процесса при повышенных до 60 — 65°С температурах время гидролиза и расход ФП сокращались в 2 раза.

Таблица 5

Оптимальные условия гидролиза микробных субстратов техническими ФП протеаз

Наименование ферментативно- Тип АОБ; Условия гидролиза

го процесса концентрация, Т, рН Расход Т

моль/л °С ФП, %

от суб- ч

страта

Экстракция белковых веществ из биомассы дрожжей сеге-\4siae протосубтилином ГЗх без 55 ±2 7,4± 0,2 4,0 4

С7,1,0- ИГ4 60 ±2 8,0± 0,2 2,0 2

Си. 5,0- 10"' 60 ±2 8,0± 0,2 6,0 6

Экстракция белковых веществ из биомассы бактерий В. }1а-\~ит протосубтилином ГЗх Без 55 ±2 7,4± 0.2 8,0 8

с7.1,0-10" 60 ±2 8,0±0,2 4,0 4

С[2,5,0-10"' 60 ±2 8,04 0,2 12,0 12

Гидролиз белковых веществ дрожжей Б.сегехтае ФС ПЖ КРС без 60 ±2 6,5± 0,2 8,0 8

С7,1,0-10"5 65 ±2 6,5± 0,2 12,0 12

С)2,1,0-10-5 65 ±2 6,5±0Д 4,0 4

Гидролиз белковых веществ бактерий В. Аатт ФС ПЖ КРС без 60 ±2 6,5± 0,2 16,0 16

С7,1,0-10"' 65 ±2 6,5± 0,2 20,0 20

с,2,1,0-Ю"5 65 ±2 6,5± 0,2 8,0 8

3.1.4. Разработка стадий выделения и очистки белковых гидролизатов

Полученный ферментолизат перерабатывался по ранее предложенной [Ку-пов, 1990] для дрожжей p. Candida maltosa схеме. На заключительных стадиях очистки проводили отделение взвешанных частиц путем мембранной фильтрации с использованием полых волокон ВПУ-15 ПА; ионообменную хроматографию на катеоните КУ-2х8 в статических условиях с элюцией смеси аминокислот и низших пептидов 3%-ным раствором аммиака. Применение этих обработок позволило повысить содержание аминного азота в гидролизате на 10% и снизить количество примесей углеводов в 1,7 раза. Готовый концентрат выдерживали при температуре 4-6°С в течение 8-10 ч с целью осаждения хлорида аммония, который отделяли фильтрованием. Очищенный препарат гвдролизата высушивали в распылительной сушилке до остаточной влажности не более 7% (рис. 9).

Проведенные технико-экономические расчеты показали, что из 1 т дрожжей можно получить 53,5 кг гидролизата с себестоимостью около 600 руб/т. Предотвращенный экологический ущерб при переработке 1000 т дрожжевой биомассы в год составляет не менее 1,5 млн. руб.

Экстракция белковых веществ протосубтшшном ГЗх из микробной биомассы в присутствии С7-АОБ

Гидролиз микробных белков ФС ПЖ КРС в присутствии С)2-АОБ

Разделение микробной биомассы и раствора гидролизата фильтрованием

Рис. 9. Принципиальная схема получения белковых гидролизатов из микробной биомассы.

3.2. Получение панкреатического гидролизата дрожжевой РНК

Микробная биомасса содержит до 11% нуклеиновых кислот и может служить сырьем для получения микробной РНК, из которой можно получать деринаты (смесь олигонуклеотидов). В частности, панкреатический гидролизат РНК, который находит применение в медицине для лечения широкого круга заболеваний.

3.2.1. Исследование количественных закономерностей гидролиза дрожжевой РНК панкреатической рибонуклеазой

В наших исследованиях сырьем явилась РНК, выделенная из биомассы дрожжей р. БассЬаготусез сегехчпае по ранее разработанной технологии [Волкова, 1996], которую гидролизовали панкреатической рибонуклеазой (14000 ед./мг). Исследовали кинетику гидролиза дрожжевой РНК панкреатической РНК-азой и влияние АОБ на эффективность процесса. Было установлено, что в отличие от гидролиза микробных белков, в данном случае процесс может быть описан в одну стадию, а фермент подвергается как термоинактивации, так и ингибированию продуктами гидролиза (олигонуклеотидами): К, к,

З+Е^ЕБ-^Р + Е (6),

Ки кин Е + Р«->ЕР Е—►Ец/д

При этом, согласно результатам расчетов (6), вклад термоинактивации в общую инактивацию фермента не превышает 20%, что объясняется высокой стабиль-

ностъю данного фермента. В результате обработки экспериментальных данных была доказана адекватность предложенной схемы и рассчитаны ее параметры. Таким образом, можно сделать вывод о том, что ферментативный гидролиз как белков, так и нуклеиновых кислот может быть описан единой кинетической схемой, в которой различаются только численные значения параметров и число лимитирующих стадий.

Полученные кинетические схемы были использованы для подбора оптимальных условий гидролиза дрожжевой РНК как в отсутствие, так и в присутствии стабилизирующих добавок (табл. 6).

Таблица 6

Условия ферментативного гидролиза дрожжевой РНК, обеспечивающие степень гидролиза не менее 95%_

Расход фермента, % от субстрата т,ч Т,°С рн ТипАОБ; концентрация, моль/л; мольное соотношение АОБ: фермент

0.4 4 65±2 5.5±0.2 эез

9.2 2 85±2 5.5±0.2 а,-С7,2.5-10"4; 10:1

0.7 7 65±2 5.5±0.2 ¿1-0,2, 5.0-10-4; 20:1

В результате ферментативного гидролиза был получен гидролизат, содержащий не менее 70% олигонуклеотидов, которые отделяли от ВМФ рибопуклеотидов ультрафильтрацией на мембране УАМ-100, что позволило сконцентрировать раствор в три раза при 2-х кратной промывке водой.

Из кинетической схемы следует, что для повышения эффективности процесса целесообразно использовать С7-АОБ. Это приводит к сокращению времени процесса и нормы расхода ФП в 2 раза при выходе продукта 65% от массы РНК. Эффективность С7-АОБ при гидролизе РНК согласуется с данными для гидролиза микробных белков и подтверждает, что С7-АОБ оказывается более эффективным в гидрофильной среде, чем С^-АОБ.

3.2.2. Разработка стадий выделения и очистки панкреатического гидролизата дрожжевой РНК

Согласно литературным данным олигонуклеотиды выделяют осаждением из водно-спиртового раствора [Фукс, 1996]. В этом случае степень осаждения продуктов гидролиза не превышает 80%. Это связано с дополнительным гидролизом РНК примесными РНК-азами в процессе ультрафильтрации, что приводит к увеличению выхода спирторастворимой фракции. Снижения ее выхода можно добиться: 1) ведением процесса в стерильных условиях, что значительно повысит энергозатраты; 2) введением в гидролизат на стадии ультрафильтрации ингибитора нуклеаз. Второй способ предпочтителен. В качестве ингибитора нуклеаз использовали миндальную кислоту, которая, являясь медицинским препаратом, не будет ухудшать санитарно-токсикологические качества гидролизата.

Добавление миндальной кислоты в гидролизат (0.115 г/л) минимизировало образование спирторастворимой фракции и обеспечивало выход олигонуклеотидов на стадии осаждения не менее 95%. Смесь олигонуклеотидов осаждали из водно-спиртового раствора при объемном соотношении спирт: вода (10:1), температуре 4

- 6°С в течение 4 ч. Осадок отделяли центрифугированием и высушивали в вакуум-сушильном шкафу при температуре не выше 60°С до остаточной влажности 5- 6%.

Для получения лекарственной формы готовили раствор в 0.65% №аС1 (35 г/л), проводили стерилизующую фильтрацию (О = 200 А), разливали в ампулы и стерилизовали в течение 30 - 35 мин при температуре 120°С. Результаты испытаний, проведенных в соответствии с требованиями ВФС, показали, что полученный продукт не обладает токсичностью и апирогенностъю. Принципиальная схема получения панкреатического гидролизата приведена на рис. 10.

Рис. 10. Принципиальная схема получения панкреатического гидролизата РНК.

Согласно технико-экономической оценке разработанной технологии себестоимость панкреатического гидролизата РНК при мощности производства 50 кг/год составляет 190 тыс. руб/кг, что ниже, чем по известным технологиям [Шабанова, 2005] в 1,8 раза.

3.3. Получение ферментативных гидролизатов иа основе животного сырья

В качестве сырья были выбраны отходы мясоперерабатывающих производств - кератинсодержащие и жиросодержащие, наиболее крупнотоннажные и трудноутилизируемые. Так, на мясокомбинате средней мощности образуется до 560 т/год кератинсодержащих и до 10 тыс. т/год жиросодержащих отходов.

3.3.1 Получение ферментативных гидролизатов белковой природы из кератинсодержащего животного сырья

Кератинсодержащее сырье содержит до 85% сырого протеина и может быть эффективно переработано в белковый гидролизат. Характерной особенностью такого белка является высокое содержание цистина и цистеина (до 11%), в связи с чем его можно использовать для балансировки аминокислотного состава белковых

гидролизатов микробного происхождения, бедных серосодержащими аминокислотами. Не менее перспективным представляется получение на основе тидролизата кератинов препарата таурина — 2-аминосульфокислоты, находящей широкое применение в медицине и кормопроизводстве. В мировой биотехнологической практике производство таурина широко поставлено. Однако все известные технологии основаны либо на химическом синтезе, либо на переработке ценного пищевого сырья (петушиные гребни) или морских гидробионтов [пат. США №4232123, 1980; пат. США № 3692538,1997].

Первой стадией переработки кератинсодержащего сырья является экстракция кератинов водно-щелочными (но не кислыми) растворами (по данным предварительных исследований). В качестве экстрагента использовали раствор гидроксида натрия. На рис. 11 приведены типичные кривые экстракции кератинов и расходования щелочи в данном процессе. Исследования по влиянию начальной концентрации кератинов и щелочи в среде, а также температуры, показали, что как процесс экстракции кератинов, так и расходование щелочи подчиняются уравнению первого порядка, что может быть выражено следующей схемой последовательно-параллельных превращений: кр (путь 1) PN Р0

+NaOH

+NaOH|kp0 +NaOH|kpp) (7),

РРо(ААо) PPi (AAi) (путь 2) (путь 3)

Рис. 11. Кривые расходования гидроксида натрия (5) и накопления белковых веществ: ВМФ (1), НМФ (2), аминного азота (3), а также их сумма (4) в процессе щелочной

экстракции кератинов.

время, мин

Кинетика процесса подчиняется уравнениям Аррениуса и специфического кислотно-основного катализа. В результате обработки экспериментальных данных была доказана справедливость схемы (7), и найдены значения ее параметров.

На основе разработанной кинетической схемы предложены оптимальные условия экстракции кератинов: температура 90°С; концентрация гидроксида натрия 0.2 моль/л; начальная концентрация кератинов в суспензии — 10%; время экстракции — 1 ч. При данных условиях степень экстракции кератинов составляла 9597%, а соотношение ВМФ и НМФ белковых веществ в экстракте - 3:2, причем степень деструкции аминокислот, прежде всего, цистина, а также аргинина, не превышала 5 — 7%, что контролировалось по накоплению в растворе свободных сероводорода и аммиака. Для получения таурина необходимо, чтобы не менее 70% белковых веществ в экстракте было представлено свободными аминокислотами. По-

этому с целью глубокого гидролиза белка полученный экстракт подвергали дополнительной обработке в двух вариантах: 1) проведения экстракции в более жестких условиях для гидролиза ВМФ кератинов до НМФ; 2) ферментативного гидролиза ВМФ белков в составе экстракта до пептидов и свободных аминокислот.

В первом варианте на основе разработанной кинетической схемы были подобраны оптимальные условия экстракции кератинов, обеспечивающие 95%-ный выход НМФ белков: температура 150°С; концентрация щелочи 0,25 моль/л; время экстракции 60-90 мин. При экспериментальной проверке состав экстракта соответствовал расчетному, однако полученный раствор имел интенсивную окраску, что существенно осложняло его дальнейшую очистку.

Для реализации второго варианта необходимо было выбрать ФП для гидролиза кератинов. Отметим, что до настоящего времени не удалось подобрать эффективных протеаз и пешидаз, а использование специфических кератиназ приводит к существенному удорожанию процесса [Ноймюллер, 2003]. Мы оценили результативность применения для гидролиза кератина тех же ФП, которые использовались для гидролиза микробных белков. Результаты последовательной обработки кератинов протосубтилином ГЗх и ФС ПЖ КРС, в том числе варианты стабилизации гидролаз с помощью АОБ приведены в табл. 7.

Таблица 7

Оптимальные условия гидролиза кератинов и трансформации цистина и цистеина в таурин техническими ферментными препаратами

Наименование Расход ФП, т,ч Т,°С рН Тип АОБ;

ферментативного % от концентрация,

процесса субстрата моль/л.

Гидролиз кератинов 4.0 4 55 ±2 7,4 ±0,2 без

протосубтилином 10.0 10 55 ±2 7,4 ±0,2 Си 5.0-10"5

3.2 3 60 ± 2 7,4 ±0,2 с7,1.0-10"4

Гидролиз кератинов ФС 8.0 8 60 ±2 6,5 ± 0,2 без

ПЖКРС 20.0 20 60 ±2 6,5 ±0,2 С7,1,0-10"5

4.0 4 65 ±2 6,5 ± 0,2 Си, 1,0- КГ5 ,

Трансформация цистина 6.0 6 40±2 2,0± 0,2 без

ФСКП 9.0 7.5 50 ±2 1,5 ±0,2 С7, 5-Ю"5

6.0 5.0 50± 2 1,5 ±0,2 С12,5-10"4

Трансформация 10.0 10 40± 2 5,0± 0,2 без

цистеина ФС КП 5.0 4.5 40±2 5,0± 0,2 С7,5-10"5

3.5 3.0 40± 2 5,0± 0,2 С,2,5-10"4

Обработка соответствующих серий экспериментальных данных показала, что кинетическое описание процесса гидролиза кератиновых белков как в отсутствие, так и в присутствии АОБ, аналогично ранее установленному для микробных белков и позволяет рассчитать для данного процесса параметры согласно схемам (1) - (4), а также определить оптимальные условия процесса, которые оказались близки к ранее установленным для гидролиза дрожжевых белков. Из полученных данных следует, что последовательное применение протосубтилина ГЗх и ФС ПЖ КРС позволяет производить гидролизаты кератинов со степенью гидролиза белка

не менее 70% с содержанием в них цистина и цистеина, соответственно, 0.033 и 0.017 моль/л. Такой гидролизат в дальнейшем может быть использован для получения таурина.

3.3.2. Получение таурипа из кератинсодержащего сырья.

Процесс получения таурина основан на биотрансформации цистина и цистеина, для чего целесообразно использовать ферментные системы клеток печени КРС (ФСКП КРС) [Неклюдов, 2005], которые можно получать непосредственно на том же мясокомбинате, что и исходное сырье.

Из литературы известно, что биохимическая схема этого процесса сложная и многостадийная [Антипова, 2003] (рис.12).

---—........ О О О О

Й Б

СН2 СНШ2

Н2С

Н2МНС

I I ноос соон

Ь-Цистиа

Цистин оютдаза

й - 5

Н2С Н2ШС

сн2

сшн.

ноос соон

Цисгаднясульфоксвд

НгС

СН2

Н2Ш2С СВДНг

Цксгяиин.гисульфоксид

5Н I

сн2

снш2

соон

Цистенн-оксида»

—Н»-1

Л'АО

502Н I

,сн2

СНГО]2

соон

Цнстеинсульфянат-декарбоксияаза шридоксалъ-фосфат

ХОД!

СНг I

СНДШ2

50,Н ' 1

Гнпотаурин- СН2 детдрогеказе ] -СН2НН2

1- Цистеин Цистеинсульфеиовая Гипогаурим Таурин

Кислота

Рис. 12. Биохимическая схема биосинтеза таурина.

На первом этапе работы были изучены количественные закономерности трансформации индивидуальных аминокислот: цистина и цистеина, которые показали, что процесс может быть описан одностадийной схемой превращений Михаэлиса-Ментен и имеепг одну лимитирующую стадию. Процесс трансформации осложнен термоинактивацией ФС КП и их ингибированием таурином. В результате обработки экспериментальных данных было достигнуто адекватное описание всего массива экспериментальных данных и рассчитаны параметры данной кинетической схемы.

Полученные для индивидуальных аминокислот (цистина и цистеина) закономерности были апробированы для трансформации в таурин тех же аминокислот в составе гидролизата кератинов и оказались полностью применимы к данному объекту. Поскольку трансформация цистина происходит в более жестких условиях, то процесс гидролизата кератинов следует проводить в условиях, оптимальных для этой аминокислоты: при температуре 35-40°С, рН 1.5, концентрации ФС КП 12.8

г/л (по СВ), концентрации С12-АОБ 0.013 г/л. В этих условиях ведения процесса при трехкратной загрузке ФП (через каждые 2 ч) выход таурина составляет не менее 70% от суммарного содержания цистина и цистеина в гидролизате. После отделения взвешенных частиц фильтрованием был получен раствор, содержащий 0.07 моль/л таурина, 0.40 моль/л других аминокислот и 0.25 моль/л минеральных примесей, прежде всего, хлорида натрия. В этой смеси таурин является единственной аминокислотой, содержащей вОзН-группу, поэтому для его выделения использовали метод ионообменной сорбции на анионите, а в целях сокращения объема сточных вод его проводили в статических условиях. Среди исследованных анионитов (АВ-17-2, АВ-17, ЭДЭ-10П) наибольшей емкостью по таурину (0.17 г/г смолы) обладал анионит АВ-17-2 в СГ-форме. Оптимальная концентрация анионита, обеспечивающая 95%-ную сорбцию таурина, составляла 5% (рис. 13). Несорбированная фракция, содержащая аминокислоты, низшие пептиды и минеральные примеси после обессоливания может быть использована для получения кормового продукта. Элюцшо таурина (рис.14), следует проводить 6%-ным раствором хлорида натрия, причем с целью концентрирования таурина элюат можно повторно использовать на стадии десорбции не менее 3-х раз.

1 0,8 0,6 0,4 0,2

! 5,6 ' 4

сз ¡2

20 40 60 80 время, мин

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

»__14,!, Т3

___Лг

_____

- |

20 40 60 время, мин

Рис. 13. Зависимость степени сорбции Рис. 14. Зависимость степени десорбции таурина на анионит АВ-17-2 из водного таурина с анионита АВ-17-2 от раствора (1,2,3,4,5) и из гидролизата (6) концентрации элюента (хлорида от %-ного содержания анионита в натрия): 1 - 1%, 2 - 4%, 3 - 8%, 4 -12%, 5 суспензии: 1- 5%, 2 - 10%, 3 - 15%, 4 - -16%. ао%^5%, б - зо%

Элюат, содержащий 97 г/л таурина и 60 г/л хлорида натрия, направляли на стадию кристаллизации (3 ч, 4-6°С). Степень осаждения таурина составила 90%. Полученный осадок, в расчете на СВ содержащий 62% основного вещества, подвергали перекристаллизации из водно-спиртового раствора (концентрация основного вещества не менее 100 г/л), при его охлаждении до 4-6°С и добавлении 10-ти кратного объема этилового спирта. Степень осаждения таурина составила 95%, а после двойной перекристаллизации - 96%. Влажный осадок на заключительной стадии технологического процесса высушивали в вакуум-сушильном шкафу при температуре не выше 70°С.

Принципиальная схема получения таурина приведена на рис. 15. себестои-

мость 1 кг таурина не превышает 3300 руб/кг, что ниже себестоимости существующих аналогов на 50%. [Антипова, 2003]. Разработанная технология позволяет предотвратить экологический ущерб от загрязнения окружающей среды в размере 1372 тыс. руб./ год-завод.

Рис. 15. Принципиальная схема получения таурина из кератинсодержащего сырья.

3.3.2. Получение гидролизатов на основе жиросодержащих отходов мясоперерабатывающей промышленности

Другим крупнотоннажным отходом мясоперерабатывающих производств являются жиросодержащие отходы, представляющие ценное сырье для получения жирных кислот (табл. 8). В этом разделе работы представлены результаты гидролиза жировых отходов мясокомбинатов панкреатической липазой ГЗх. Так как данный ФП является дорогостоящим, необходима разработка способов повышения его эффективности.

На первом этапе исследований были изучены закономерности гидролиза жиров панкреатической липазой на модельном субстрате - оливковом масле. Максимальная степень гидролиза масла (400 г/л воды) при однократной загрузке ФП не превышает 25%, что могло быть обусловлено неустойчивостью эмульсии оливкового масла в воде. Для повышения устойчивости эмульсии была предложена ее предварительная обработка ультразвуком. При частоте 25 кГц и времени санации в течение 5-7 мин размер капель масла снижается с 15 - 16 до 2.0 - 2.5 мкм, а степень гидролиза оливкового масла панкреатической липазой возрастает до 51% (рис.16).

Анализ количественных закономерностей данного процесса показал, что он может быть описан одностадийной схемой ферментативных превращений с учетом термоинакгивации фермента и его ингибирования продуктами гидролиза.

Таблица 8

Состав жировых отходов, образующихся на Можайском мясокомбинате

Наименование показателя, размерность Значение

плотность при 18°С, г/см3 0,939

показатель преломления при 60°С 1,4556

вязкость при 60°С, мПа-с 16

температура плавления, °С 47

йодное число, % Ь 41

число омыления, мг КОН/г 207

Жирные кислоты, % от суммы:

насыщенные 59

ненасыщенные 41

неомыляемые липиды, % 0,5

миристиновая 2,3

пальмитиновая кислота 36

стеариновая кислота 21

олеиновая кислота 29

линолевая кислота 12

Исследования по повышению эффективности гидролитической активности панкреатической липазы за счет введения АОБ проводились вышеописанным способом.

Рис. 16. Влияние времени обработки эмульсии оливкового масла в воде (400 г/л) ультразвуком при частоте 25 кГц на выход продуктов его гидролиза панкреатической липазой

----------- --

и 2 4 6 8 время, мин

Из полученных результатов (табл. 9) следует, что гидролиз следует проводить в

присутствии С|2-АОБ, эффективным также как и в случае ФС ПЖ КРС и ФСКП КРС в средах с высокой гидрофобностью. При этом норма расхода ФП и время ферментолиза снижаются в 2 раза. Подобранные в модельной системе условия гидролиза оливкового масла оказались оптимальными и для гидролиза жировых отходов.

Таблица 9

Оптимальные условия гидролиза оливкового масла панкреатической липазой

Расход фермента, % от субстрата т,ч т, °с рн Тип АОБ; концентрация, моль/л; мольное соотношение АОБ: фермент

16.0 16 40± 2 7.0 ±0.2 Без

8.0 8 45 ± 2 7.0 ±0.2 СцЗ.О-Ю"4; 25:1

20.0 20 45 ±2 7.0 ±0.2 С^О-Ю"4;

Таким образом, разработаны способы утилизации двух крупнотоннажных отходов мясоперерабатывающих производств: кератин- и жиросодержащих. Эко-лого-экономическая оценка разработанных технологий показала, что предотвращенный ущерб в данном случае составляет 1,37 млн. руб/год на одном мясокомбинате вышеуказанной мощности.

3.4. Получение ферментативных гидролизатов на основе растительного сырья

В качестве сырья использовали пивную дробину - отход пивоваренного производства, который образуется на заводах средней мощности в количестве до 40 тыс. т/год'завод. Углеводы дробины в среднем представлены крахмалом (20%) и целлюлозой (80%) [Лукин, 2006], для гидролиза которых необходимо использовать как целлюлазы, так и амилазы. В работе применяли комплексный ферментный препарат - целловиридин ГЗх, панкреатическую а-амилазу, расщепляющей 1,4-гликозидные связи, и глюкоамилазу Asp. awamori, расщепляющую кроме того 1,6-гликозидные связи.

На первом этапе исследований были изучены кинетические характеристики гидролиза ферментными системами модельных субстратов: целлюлозы и крахмала. Процесс гидролиза в обоих случаях может быть описан одностадийной схемой ферментативных превращений, в которых амилаза и глюкоамилаза подвергаются только термоинактивации, а целловиридин помимо этого - ингибированию конечными продуктами реакции. Стандартная обработка экспериментальных данных позволила установить параметры кинетической схемы, а также рассчитать и экспериментально проверить оптимальные условия гидролиза (табл. 10). Из расчетных данных следует, что при стандартных подходах полный гидролиз полисахаридов возможен только при высоких (до 16%) нормах расхода ФП и общей продолжительности гидролиза до 16 ч. Поэтому для рассматриваемого вида сырья поиск путей повышения эффективности процесса особенно важен. Также как и при обработке других отходов в данном случае применили подход стабилизации и повышения активности гадролаз модифицирующими добавками - АОБ (табл. 10). Введение в среду ферментолиза АОБ позволило существенно повысить скорость гидролиза; наиболее эффективным для гидрофильной среды оказался С7-АОБ, примене-

ние которого привело к понижению нормы расхода ФП в 8 раз и во столько же раз - сокращению времени гидролиза.

Выявленные в модельных экспериментах условия были апробированы для гидролиза крахмала и целлюлозы в составе пивной дробины. Наши исследования показали, что для достижения 95%-ного расщепления углеводов даже в присутствии АОБ необходимо увеличить норму расхода каждого ФП до 6%, пролонгировать время гидролиза до 6 ч, что в три раза превышает время гидролиза модельных субстратов. Причиной этого могут быть высокая гетерогенность сырья, наличие в нем белка, что затрудняет доступ молекул фермента к субстрату.

Таблица 10

Оптимальные условия гидролиза углеводных субстратов техническими ферментными препаратами

Наименование ферментативного процесса Условия гидролиза

Т,°С рн Расход ФП, % от субстрата т, ч АОБ; его концентрация, моль/л; мольное соотношение АОБ:фермент*

Гидролиз пивной дробины а-амилазой 40 ±2 7.0± 0.2 18.0 18 без

60 ±2 6.5 ±0.2 2.0 2 Б,-С7,3.0-10"''; 2:1

70 ± 2 6.5 ± 0.2 20.0 20 О.-С^.О-Ю"4

Гидролиз пивной дробины глю-коамилазой 40 ± 2 7.0± 0.2 18.0 18 без

60 ±2 6.0± 0.2 2.0 2 0,-С7,1.0-10Л 2:1

60 ±2 6.5 ±0.2 20.0 20 ОгСи^О-Ю"3

Гидролиз пивной дробины целло-виридином 50 ±2 6.5 ± 0.2 16.0 16 Без

50 ±2 6.5 ± 0.2 2.0 2 0|-С7,3.0-10"

50 ±2 5.5 ±0.2 20.0 20 БрСи, 1.0-10-4

* - приводится только для индивидуальных ферментов - амилазы и ппокоамилазы.

Возможным приемом для успешной реализации комплексной переработки пивной дробины могла быть предварительная экстракция из нее белковых веществ с получением изолята ВМФ белка.

В первом варианте, по аналогии с кератинсодержащим сырьем, экстракцию белка проводили водно-щелочными растворами. Этот процесс описывался той же кинетической схемой превращений (7). Однако, в отличие от кератинов, в данном случае дополнительное расходование щелочи в ходе экстракции не наблюдалось, что позволило учитывать в схеме превращений (7) только первый порядок по белку. Согласно рассчитанным кинетическим параметрам и кривым экстракции в оптимальных условиях (рис. 17), выход ВМФ белка не превышал 20%. В более жестких условиях экстракции выход снижался за счет увеличения скорости гидролиза ВМФ до пептидов и аминокислот. В другом варианте извлечения из дробины ВМФ белка ее обрабатывали ультразвуком при комнатной температуре и частоте 25 кГц. При установленном оптимальном времени обработки дробины (15 мин) выход ВМФ белков в ходе последующей водно-щелочной экстракции составлял 80 - 83%. После отделения дробины фильтрованием из раствора осаждали глобулиновую фракцию белковых веществ в ИЭТ (рН 4.2-4.7). Степень осаждения белка составила 76% от содержания ВМФ белковых веществ в растворе, а содержание основного вещества - 43%, в расчете на СВ, а после переосаждения в тех же условиях увеличивалось до 83%. Влажный осадок обезвоживали путем обработки одним объемом

этилового спирта и сушили под вакуумом при температуре 60°С. Результаты проверки препарата на острую токсичность показали ее отсутствие, что позволяет использовать белок дробины для кормовых целей.

Рис. 17. Кривые извлечения ВМФ белковых веществ из пивной дробины в процессе щелочной экстракции: 1 -60°С, 2 - 70°С, 3 - 80°С, 4 - 90°С.

50 100

время, мин

Дня оптимизации гидролиза высокомолекулярных углеводов пивной дробины после извлечения из нее белковых веществ было изучено влияние на интенсивность процесса: 1) режима последовательной обработки дробины ФП; 2) режима одновременной параллельной обработки несколькими ФП; 3) способов последовательной обработки путем внесения каждого следующего ФП непосредственно в гидролизат или при поэтапном отделении гидролизата, полученного на предыдущей стадии, фильтрованием; 4) ультразвуковой обработки гидролизуемого материала.

Результаты исследований показали целесообразность поэтапного внесения гидролаз при использовании препаратов амилаз. В этом варианте степень конверсии субстрата при последующем гидролизе его целловиридином повышалась на 15 - 20%. По-видимому, гидролиз крахмала обуславливает «разрыхление» пивной дробины, что приводит к увеличению поверхности взаимодействия клетчатки с целловиридином. Последовательность внесения амилаз не оказывала влияния на выход продуктов гидролиза. Что касается способов предварительной обработки пивной дробины, то суммарная степень гидролиза субстрата практически не менялась. Однако в варианте последовательного отъема ферментолизата конечная концентрация глюкозы в гидролгоате не превышала 8-10 г/л, тогда как без отьема она составляет 30 - 35 г/л. В этом случае не требуется дополнительного концентрирования гидролизата перед его использованием (в микробиологических средах), что снижает энергозатраты и тепловую деструкцию углеводов.

Таким образом, вариант последовательного внесения ФП без отделения ферментолизата на каждом этапе, безусловно, является предпочтительным. Также отмечено, что предварительная ультразвуковая обработка не только повышает выход белковой фракции, но также увеличивает степень конверсии углеводов пивной дробины. На основании проведенных исследований была предложена принципиальная схема переработки пивной дробины, представленная на рис. 18.

Технико-экономическая оценка разработанной схемы показала, что себестоимость 1 кг изолята ВМФ белка дробины составляет около 13 руб., а 1 кг раствора углеводной фракции - 1100 руб. Предлагаемая технология позволяет предотвратить экологический ущерб на 40 млн. руб/год.

Рис. 18. Принципиальная схема переработки пивной дробины.

3.6. Изучение физико-химических аспектов взаимодействия ЛОБ с гидролитическими ферментами и их субстратами.

Задачей заключительного этапа работы было выяснение физико-химических причин наблюдаемого повышения эффективности ферментативного гидролиза в присутствии АОБ. Были выполнены физико-химические исследования взаимодействия используемых гомологов С7- и Сц-АОБ с биополимерами на модельных вы-сокоочщценных ФП и субстратах.

Анализ химического строения молекул АОБ и ферментов предполагает, что взаимодействия между ними осуществляются за счет образования водородных связей, гидрофобных и электростатических взаимодействий. В табл. 11 приведены варианты наиболее вероятных взаимодействий АОБ с аминокислотами ферментов, исходя из минимальной энергии связи и длины не более 3 А [Кузнецова с соавт., 2006]. В рассматриваемых случаях, главным образом, образуются так называемые высокобарьерные водородные связи с энергией 2-15 кДж/моль.

Такой тип взаимодействия, по-видимому, характерен для С7-АОБ. Помимо высокобарьерных водородных связей при взаимодействии АОБ с ферментами имеет место образование низкобарьерных водородных связей с энергией более 80 кДж/моль, которые характерны для взаимодействий в гидрофобной среде, а также

между АОБ и аминокислотами сложного строения, например, аргинином или гис-тидином, и будут свойственны, в основном, С12-АОБ.

Таблица 19

Наиболее вероятные взаимодействия АОБ с гидролитическими ферментами

Фермент / АОБ Аминокислота в составе фермента, тип взаимодействия

Панкреатическая рибонуклеаза/Ст-АОБ Низкобарьерные водородные связи: ArgILI, LysJ/. Высокобарьерные водородные связи: Met3D, Asn121.

Панкреатическая рибонуклеаза/ Сп-АОВ Высокобарьеряые водородные связи: Arg'".

Трипсин /С7-АОБ Высокобарьерные водородные связи: Asn21",. Val™, Ser54, Thr , Туг"7

Трипсин /С12-АОБ Высокобарьерные водородные связи: Cys3S

Липаза /С7-АОБ Высокобарьерные водородные связи: Ser1*, His168

Липаза/Сп-АОБ Низкобарьерные водородные связи: His132 Высокобарьерные водородные связи: Thr'32, Asp262, Ser121.

Не в меньшей степени на структурную модификацию фермента оказывают влияние взаимодействия, характерные для длинноцепочечного гомолога С^-АОВ.

Доказательства образования устойчивых комплексов «биополимер-АОБ» за счет указанных выше взаимодействий были получены при изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой области смешивающихся растворов С7-, С12-АОБ, РНК-азы, трипсина, БСА и дрожжевой РНК (рис.19, 20). В процессе предынкуба-ции трипсина с С7-АОБ наблюдаются снижение амплитуды поглощения на 20 -40%, что, согласно, литературным данным, связано с образованием водородных связей [Кузнецова с соавт., 2006] и смещение максимума поглощения в сторону больших длин волн, что свидетельствукт об образовании комплекса «фермент-АОБ». Аналогичные зависимости были получены для других исследованных в работе индивидуальных ферментов и субстратов.

длина волны, ни длина В0ЛНЫ1 нм

Рис. 19. Влияние времени предынкуба- Рис. 23. Влияние времени предынкубац

ции С7-АОБ с трипсином на спектр по- С7-АОБ с БСА на спектр поглощения

глощения трипсина. Время предынкуба- БСА. Время предынкубации: 1-0 мин,

ции: 1-0 мин, 2-5 мин, 3-10 мин, 4 - 2-5 мин, 3-10 мин, 4-15 мин, 5 - 20,

15 мин, 5 - 20, 25 мин. 25 мин.

Об образовании между АОБ и белком водородных связей можно также судить по результатам ИК-спектроскопии. Исследуемые вещества имели характерные полосы поглощения в ИК-спекграх, отвечающие ОН-группе, -С-С-связям в углеводородном радикале, бензольному кольцу, а-1\тН2-группе, карбоксильной группе, амидам I и II белков. В процессе предынкубации ферментов и субстратов с АОБ наблюдалось заметное расширение полосы поглощения 3200 - 3400 см"1, отвечающей ОН-группе, до частоты 3600 см'1. Согласно литературным подобное изменение ИК-спектра поглощения свидетельствует об образовании водородных связей между молекулами АОБ и ферментным белком (рис. 21). А) Б)

Рис. 21. ИК-спектры интермедиата АОБ di-C7 - трипсин при времени предынкубации: а) 0 - 2 мин, б) 20 - 25 мин.

Эти результаты согласуются с данными квантово-химических и термодинамических расчетов, выполненными с помощью протраммы Hyperchem 7. Используя параметрическую модель 3 (Метод РМ 3), находили исходные и конечные теплоты образования АОБ. На основе полученных величин теплот образования комплексов «фермент-АОБ» с использованием закона Гесса были рассчитаны энтальпии химических реакций взаимодействия АОБ с ферментами.

Для теоретического объяснения повышения скорости и степени гидролиза биополимеров при добавке в реакционную смесь АОБ были рассчитаны термодинамические функции реакций, ведущихся в оптимальных условиях при модификации ферментов (табл. 20) и полимерных субстратов.

Для сравнения те же функции энтальпии, энтропии и энергии Гиббса были рассчитаны для вариантов катализа нативными ^модифицированными ферментами. Из данных табл. 20 следует, что для процессов, идущих в гидрофильной среде эффективно применение С7-АОБ, когда наблюдается сравнительное повышение энтропии и снижение энергии Гиббса. Для гидрофобных условий гидролиза оливкового масла липазой, напротив, такие же изменения термодинамических функций наблюдаются в варианте модификации липазы С^-АОБ. Эти данные подтверждают более эффективный катализ в присутствии АОБ.

Таким образом, теоретические расчеты термодинамических функций состояния реакций подтверждают полученные экспериментально результаты.

Таблица 20

Термодинамические функции состояния реакций ферментативного гидролиза модельных субстратов высокоочищенными препаратами гидролаз_

Модельная система фермент-субстрат Термодинамические функции состояния

В присутствии АОБ в отсутствии АОБ

ДН, кДж/ моль ДБ, кДж/ К моль Дв, кДж/ моль ДН, кДж/ моль ДБ, нДж/К • моль Дв, кДж/ моль

Ст-АОБ

Панкреатическая РНК-аза -дрожжевая РНК 309 0,99 -25,6 43,4 0,16 -11,1

Трипсин - БСЛ 277 0,93 1^18,7 17,5 0,07 -3,7

Панкреатическая а-амилаза -крахмал 216 0,83 -43,8 38,9 0,14 -5,5

Грибная глюкоамилаза крахмал 85 0,35 -24,6 37,3 0,13 -3,5

Панкреатическая липаза -оливковое масло 51 0,24 -25,3 28,4 0,21 -38,6

С)2-АОБ

Панкреатическая РНК-аза -дрожжевая РНК 33 0,12 -7,5 43,4 0,16 -11,1

Трипсин - БСА 13 0,05 -2,6 17,5 0,07 -3,7

Панкреатическая а-амилаза -крахмал 34 0,11 -1,7 38,9 0,14 -5,5

Грибная глюкоамилаза крахмал 21 0,07 -1,3 37,3 0,13 -3,5

Панкреатическая липаза -оливковое масло 69 0,36 -45,7 28,4 0,21 -38,6

Заключение

Анализ результатов исследований ферментативного гидролиза и путей повышения его эффективности выявил общие закономерности ферментативного гидролиза биополимеров в составе отходов пищевой и микробиологической промышленности и позволил разработать на этой основе принципиальную схему переработки отходов, пригодную для реализации на различных производствах пищевой промышленности.

Установлено, что кинетические закономерности ферментативного гидролиза биополимеров, как в индивидуальном виде, так и в составе природных субстанций идентичны и могут быть описаны уравнением Михаэлиса-Ментен и отличаться лишь количеством лимитирующих стадий, а также факторов, инактивирующих фермент и численными значениями кинетических параметров;

Повысить эффективность ферментативного гидролиза биополимеров можно за счет повышения либо гидролизуемости субстрата, либо активности фермента путем модификации его АОБ: в гидрофильной среде целесообразно использовать Сг АОБ, в гидрофобной - С,2-АОБ. Кинетика гидролиза биополимеров ферментами, модифицированными АОБ, также подчинялась общим закономерностям.

Предложенные кинетические схемы ферментативного гидролиза могут служить основой для разработки алгоритма управления гидролизом, что позволит подбирать оптимальные режимы ведения процесса с целью получения гидролиза-тов требуемого качества и назначения.

Стадии выделения и очистки продуктов ферментативного г,идролиза основанные на методах ультрафильтрации, ионного обмена и осаждения, предполагают использование стандартного технологического оборудования и не предполагают использования дорогостоящих реагентов. Это позволит предприятиям пищевой и микробиологической промышленности при минимальных дополнительных капитальных затратах организовать выпуск дорогостоящей конкурентоспособной продукции пищевого и медицинского назначения и за счет этого существенно увеличить рентабельность основного производства.

ВЫВОДЫ

1. С использованием кинетического метода исследований установлены количественные закономерности процесса гидролиза белковых, липидных, углеводных и нуклеотидных субстратов высокоочшценными препаратами гидро-лаз. Процесс гидролиза может быть описан в виде одно- или двухстадийной ферментативной реакции с использованием уравнения Михаэлиса-Ментен и осложнен инактивацией свободного фермента по уравнению первого порядка, а также в случае пашфеатических липазы и РНК-азы - ингибированием фермента продуктами гидролиза.

2. Предложенная кинетическая схема апробирована при разработке режимов ферментативного гидролиза в производственных условиях. Установлено, что для достижения степени гидролиза субстратов не менее 90% норма расхода ферментов должна составлять 10 -16%, а время гидролиза -18ч.

3. Разработаны новые подходы интенсификации ферментативных процессов на основе промышленных гидролаз за счет введения в среду гидролиза природных модификаторов ферментов, относящихся к классу алкилоксибензолов. На примере высокоочшценных препаратов гидролаз показана зависимость модифицирующего действия АОБ от их структуры и концентрации. Установлено, что в гидрофильных средах целесообразнее использовать С7-АОБ, а в гидрофобных - С12-АОБ. Установлено, что применение АОБ в количестве 0.01 - 0.1% от массы фермента позволяет сократить норму расхода последнего и время процесса в 2 - 8 раз.

4. С использованием квантово-химических и физико-химических методов исследований установлено, что взаимодействие АОБ с ферментом и субстратом происходит за счет образования водородных связей между гидроксиль-ными группами АОБ и функциональными группами, входящими в состав высокомолекулярных соединений (ферментов и субстратов), а также посредством гидрофобных взаимодействий.

5. Разработанные кинетические схемы полностью применимы к гидролизу природных субстратов модифицированными АОБ препаратами технических гидролаз, а также к катализу ферментами других классов, например, оксида-зами печени быка, осуществляющими трансформацию цистина и цистсина в таурин. На основе полученных закономерностей предложены пути интенсификации с помощью АОБ гидролиза микробных и кератиновых белков про-тосубтилином ГЗх, пивной дробины целловиридином ГЗх, жиросодержащих

отходов мясоперерабатывающей промышленности панкреатической липазой, дрожжевой РНК панкреатической РНК-азой, Разработанные приемы позволяют сократить норму расхода фермента и время гидролиза в 1,5 - 4 раза.

6. Разработаны основы технологии получения белковых гидролизатов с различной степенью гидролиза на основе микробных, растительных и керати-новых белков с выходом 20-30% от содержания белка в сырье, включающие стадии предподготовки сырья, ферментативного гидролиза, осветления гид-ролизата ультрафильтрацией, ионообменной очистки. Предложены кинетические схемы каждой стадии, позволившие установить оптимальные условия их проведения.

7. Разработаны основы технологии получения препарата таурина пищевого назначения с выходом 28% от содержания цистина в сырье на основе гидроли-зата кератинов путем трансформации серосодержащих аминокислот (цистина и цистеина) ферментными системами клеток печени быка. Предложены оптимальные условия проведения стадий выделения и очистки таурина -ионного обмена и осаждения из водного и водно-спиртовых растворов.

8. Проведена технико-экономическая оценка разработанных технологий в сравнении с базовыми. Установлено, что применение модифицированных ферментов и стадий предобработки сырья позволяет снизить себестоимость продукции в 1,2 - 5,0 раз при сохранении ее качества за счет снижения норм расхода фермента, а также сократить длительность технологического цикла в 1,3 -2,0 раза, что повышает эффективность работы оборудования. Разработанные пути утилизации отходов позволяют предотвратить экологический ущерб на сумму 0,5 - 40 млн. руб/год.

Список публикаций по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах

1. Красноштаноеа, А. А. Кислотный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Количественные закономерности процесса. 1. Исследование модельной системы альбумин - серная кислота [Текст] / А. А. Красноштанова, И. А. Крылов, М. Н. Манаков // Биотехнология. - М., 1996. 3. - с. 39 - 44. - ISSN 0234-2758.

2. Красноштанова, А. А. Кислотный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Количественные закономерности процесса. 2. Кинетика гидролиза белковых фракций дрожжей и бактерий [Текст] / А. А. Красноштанова, И. А. Крылов, Б. С. Карпо, М. Н. Манаков // Биотехнология. - М„ 1996. - №3. - с. 45 - 49. - ISSN 0234-2758.

3. Красноштанова, А. А. Кислотный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Количественные закономерности процесса. 3. Кинетика кислотной экстракции белковых веществ из клеток дрожжей и бактерий [Текст] / А. А. Красноштанова, И. А. Крылов, М. Н. Манаков // Биотехнология. - М., 1996. - №3. - с. 50 - 55,- ISSN 0234-2758.

4. Красноштанова, А. А. Ферментативный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Количественные закономерности процесса. 1. Кинетика гидролиза белковых фракций дрожжей протосубтилином [Текст] / А. А. Красноштанова, И. А. Крылов, М. Н. Манаков И Биотехнология. - М., 1998. - №6. - с. 50 - 56. - ISSN 0234-2758.

5. Красноштанова, А. А. Ферментативный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Количественные закономерности про-

цесса. 2. Кинетика гидролиза белковых фракций дрожжей и бактерий прото-субтилином [Текст] / А.А. Красноштанова, И. А. Крылов, М. Н. Манаков // Биотехнология. - М., 1998. - №6. - с. 57 - 62. - ISSN 0234-2758.

6. Красноштанова, А. А. Ферментативный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Количественные закономерности процесса. 3. Гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов ферментными системами поджелудочной железы [Текст] / А. А. Красноштанова, И. А. Крылов, М. Н. Манаков // Биотехнология. - М., 1998. -№6. - с. 63 - 68. - ISSN 0234-2758.

7. Красноштанова, А. А. Трансформация L-цистина и L-цистеина в таурин под действием ферментных систем клеток печени [Текст] / А. В. Соболева, А. А. Красноштанова, И. А. Крылов //Прикладная биохимия и микробиология. -М, 2004. -Т. 40, №3 - с. 282-287.

8. Красноштанова, А. А. Трансформация L-цистина и L-цистеина в составе белкового гидролизата кератинов в таурин под действием ферментных систем клеток печени [Текст] / А. В. Соболева, А. А. Красноштанова, И. А. Крылов;/ Химическая технология. - М., 200411.-е. 18-22.

9. Красноштанова, А. А. Количественные закономерности процесса растворения природных кератинов [Текст] / А.В. Соболева, А. А. Красноштанова, И. А. Крылов // Химическая технология. - М, 2004. - № 10. - с. 6-10.

10.Красноштанова, А. А. Разработка ресурсосберегающей технологии получения рибонуклеазы из поджелудочной железы КРС [Текст] / М. М. Баурина, А. А. Красноштанова, И. А. Крылов // Химическая технология. - М, 2007. -Т.8, №4.-с. 185-190.

11 .Дудникоба, Е. А. Выделение а-амилазы из биомассы поджелудочной железы крупного рогатого скота [Текст] / Е. А. Дудникова, А. А. Красноштанова, И. А. Крылов // Химическая технология. - М, 2008. - Т. 9, № 4. - с. 182 - 188.

12. Красноштанова, А. А. Интенсификация ферментативных процессов гидролиза биополимеров [Текст] / А. А. Красноштанова, Т. А. Рукинова, Е. А. Кашкина, М. М. Баурина, И. А. Крылов, Г. И. Эль-Регистан // Хранение и переработка сельско-хозяйственного сырья. - М, 2000. - № 6. - с. 59-60.

13.Красноштанова, А. А. Способ получения и характеристика иммунокоррек-тора нуклеинового ряда [Текст] / М. М. Баурина, А. А. Красноштанова, М. Е. Шабанова, И. А. Крылов, Ю. М. Краснопольский // Нейроиммунология. -СПб., 2003.-Т.1, №2.-с. 18-19.

14.Краско~мтанова, А. А. Способ усиления пролиферантной активности костного мозга [Текст] / М. Е. Шабанова, В. В. Казаньев, М. М. Баурина, А. А. Красноштанова, И. А. Крылов // Патогенез. - М, 2006. - Т.4., № 1. - с. 71.

15.Krasnoshtanova, A. A. Transformation L-cystin and L-cystein into taurin with en-zyn-iaiic system of bovine liver cells [Text] / A. V. Soboleva, A. A. Krasnosh-lanove, L A. Kiylov // Industrial Application of Biotechnology. - New York, Nova Science Publisher, 2003. - c. 121- 130. - ISBN 1-60021-039-2.

16. Krasnoshtanova, A. A. Development of Resource-Saving Technology of Bovine rancreaiic Ribonuclease [Text] / M. M. Baurina, A. A. Krasnoshtanova, I. A. Xryiov // Industrial Application of Biotechnology. - New York, Nova Science Publisher, 2005. - c. 55- 61. - ISBN 1-60021-039-2.

17.Krasnoshtanova, A. A. Elaborating Bases of Technology of Isolation of Amylase, Lipase and a Complex of Proteases from Cattle Pancreas [Text] / E. A. Dudnik-

ova, A. A. Krasnoshtanova, I A. Krylov // Industrial Application of biotechnology. - New York, Nova Science Publisher, 2006. - c. 28 - 37. - ISBN 1-60021-039-2. Тезисы конференций

1. Краспоштанова, А. А. Современные подходы к созданию экологических производств на основе комплексной переработки отходов пищевой и микробиологической промышленности, использующих современные достижения химии и био-технолоши [Тезисы] / Рукинова Т.А., Краснопгганова A.A., Крылов И.А. // Тез. докл. IV Междунар. конгресса «Окружающая среда для нас и будущих поколений: экология, бизнес, экологическое образование». - Самара-Астрахань-Самара, сентябрь 1999. -С.52.

2. Краспоштанова, А. А. Интенсификация ферментативных процессов переработки отходов пивоваренной и мясоперерабатывающей промышленности с использованием ауторегуляторных факторов d микроорганизмов [Тезисы] / Крылов И.А, Краснопгганова А.А, Рукинова Т.А. И Тез. докл. V Межд. конгресса "Окружающая среда для нас и будущих поколений: экология, бизнес, экологическое образование". - Самара-Астрахань-Самара, сентябрь 2000. - с.74.

3. Краспоштанова, А. А. Стабилизация индивидуальных ферментов и ферментных систем алкилоксибензолами [Тезисы] / Г. И. Эль-Регистан, Т. А. Карпекина, И. Ю.Степаяенко, Е. И. Крылова, Е. Ф. Шаненко, И. А. Крылов, А. А. Краснонггано-ва, М. М. Баурина, Ж. Будран // Сборник трудов 1 Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - М., 2002. - с. 195-196.

4. Краспоштанова, А. А. Применение лекарственного препарата Энкад в качестве средства, стимулирующего гемопоэтическую функцию костного мозга [Тезисы] / М. Е. Шабанова, М. М. Баурина, А. А. Красноштанова, И. А. Крылов // Сборник трудов (тезисов доклада) Международной конференции «Биотехнология и медицина». - М., 2006. - с. 142-143.

Патенты

1. 1. Пат. 2095478 С1 Российская Федерация, МПК6 С 25 С 1/20. Способ извлечения золота из отходов [Текст] / Красноштанова A.A., Крылов ИА., Бо-гданойская В.А., Тарасевич М.Р., Манаков М.Н.; заявитель и патентообладатель, Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева.

55108195/02; заявл. 25.04.1996; опубл. 10.11.1997. - 5 с.

2. Пат. 215 5751 С1 Российская Федерация, МПК6 С 22 В 11/00, 7/00, 3/18. Способ извлечения драгоценных металлов [Текст] / Красноштанова A.A., Крылов И.А., Богдановская В.А., Тарасевич М.Р., Манаков М.Н.; заявитель и патентообладатель Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева. - № 97110752/02; заявл. 26.06.1997; опубл. 20.07.1998. - 4 с.

3. Пат. 2179579 С2 Российская Федерация, МПК7 С 12 Р 1/00. Способ получения низкомолекулярных фракций биологически активных веществ из клеточных биополимеров [Текст] / Красноштанова A.A., Крылов И.А., Баурина ¡Vi. М., Кухаренко А. А., Зль-Регистан Г. И., Рукинова Т.А., Шабанова М.Е.; заявитель и патентообладатель Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева. - № 2000104372/13; заявл. 24.02.2000; опубл. 20.02,2002.-4 с.

4. Пат. 2 J 30918 С1 Российская Федерация, МПК7 С12 N 9/22. Способ получений; панкреатической рибокуклеазы [Текст] / Краснопгганова А. А., Баурина М. М., Кидкиьа Е. А., Крылов И. А.; заявитель и патентообладатель Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева. - № 2000116984/13; заявл. 30.05.2000; опубл. 27.03.2002. -4 с.

5. Пат. 2249040 С2 Российская Федерация, МПК7 С 12 Р 13/04, С 12 N 9/64. Способ получения таурина [Текст] / Краснопгганова А.А., Соболева А.В., Крылов И.А.; патентообладатель Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева. - № 2003112648/13; заявл. 05.05.2003; опубл. 27.03.2005 Бгол.№ 9. -5 с.

6. Пат. 2274658 С2 Российская федерация, МПК С12 Р 19/34 (2006.01). Способ получения панкреатического гидролизата нуклеиновой кислоты [Текст] / Краснопгганова АЛ., Баурина М.М., Крылов И.А., Шабанова М.Е.; патентообладатель Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева. - № 2004102936/13; заявл. 03.02.2004; опубл. 20.04.2006 Бюл. №11.

ООО «ВНИПР» 127644, Москва, Клязьминская ул., д.15 (495) 486-80-76 зак.№ 6279 от 02.10.2009 г. тираж 100 экз

Содержание диссертации, доктора химических наук, Красноштанова, Алла Альбертовна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Практическое значение ферментативных гидролизатов биополимеров

1.1.1. Практическое значение ферментативных гидролизатов белковой природы

1.1.2. Практическое значение таурина

1.1.3. Практическое значение гидролизатов углеводной природы

1.1.4. Практическое значение панкреатического гидролизата РНК

1.1.5. Практическое значение переработки жиросодержащих отходов

1.2. Технологические приемы получения гидролизатов на основе микробного сырья

1.2.1. Технологические приёмы получения гидролизатов белковой 36 природы

1.2.2. Технологические приемы получения гидролизатов нуклео- 40 тидной природы

1.3. Технологические приемы получения гидролизатов на основе 42 животного сырья

1.3.1. Технологические приемы получения гидролизатов белковой 43 природы на основе кератинсодержащего сырья

1.3.2. Технологические приемы получения таурина

1.3.3. Технологические приемы переработки жиросодержащих отходов

1.4. Технологические приемы получения гидролизатов на основе растительного сырья

1.5. Характеристика важнейших гидролитических ферментов

1.5.1. Характеристика протеолитических ферментов

1.5.2. Характеристика целлюлитических ферментов

1.5.3. Характеристика амилолитических ферментов

1.5.4. Характеристика панкреатической рибонуклеазы

1.5.5. Характеристика ферментных систем клеток печени, участвующих в биосинтезе таурина

1.5.6. Характеристика панкреатической липазы

1.6. Методы стабилизации ферментов

1.6.1. Молекулярные шапероны

1.6.2. Химические шапероны

1.6.3. Фармакологические шапероны

1.7. Изучение влияния стабилизирующих факторов на белковые молекулы на количественном и качественно уровне

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Материалы и реактивы

2.3. Методы исследования

2.4. Методы анализа

2.5. Статистическая обработка экспериментальных данных

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ 132 РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Получение ферментативных гидролизатов белковых веществ из микробного сырья

3.1.2. Исследование количественных закономерностей экстракции белковых веществ из биомассы дрожжей и бактерий прото-субтилином ГЗх.

3.1.3. Исследование количественных закономерностей гидролиза микробных белков ферментными системами ПЖ КРС

3.1.4. Разработка стадий выделения и очистки белковых гидролизатов

3.2. Получение панкреатического гидролизата дрожжевой РНК

3.2.1. Исследование количественных закономерностей гидролиза дрожжевой РНК панкреатической рибонуклеазой

3.2.2. Разработка стадий выделения и очистки панкреатического гидролизата дрожжевой РНК

3.3. Получение ферментативных гидролизатов белковой природы из животного сырья (на примере кератинсодержащего)

3.3.1. Исследование количественных закономерностей экстракции кератинов водно-щелочными растворами

3.3.2. Исследование количественных закономерностей гидролиза кератинов протосубтилином и протеолитическими ферментами ПЖКРС

3.3.3. Исследование количественных закономерностей трансформации L-цистина и L- цистеина (свободных и в составе белкового гидролизата) в таурин ферментными системами клеток печени.

3.3.4. Разработка стадий выделения таурина

3.4. Получение ферментативных гидролизатов на основе жиросо-держащих отходов мясоперерабатывающей промышленности

3.4.1. Исследование количественных закономерностей гидролиза оливкового масла панкреатической липазой

3.4.2. Разработка основ технологии гидролиза жировых отходов мясоперерабатывающей промышленности панкреатической липазой

3.5. Получение ферментативных гидролизатов на основе растительного сырья (на примере пивной дробины)

3.5.1. Разработка научных основ технологии получения белковой фракции из пивной дробины

3.5.2. Исследование количественных закономерностей гидролиза крахмала панкреатической а-амилазой

3.5.3. Исследование количественных закономерностей гидролиза крахмала глюкоамилазой Asp. Awamori.

3.5.4. Исследование количественных закономерностей гидролиза целлюлозы ферментным препаратом целловиридином ГЗх

3.5.5. Разработка основ технологии получения водорастворимой углеводной фракции из пивной дробины

3.6. Общие подходы к переработке отходов пищевой и микробиологической промышленности с получением ферментативных гидролизатов белковой, липидной и углеводной природы

3.7. Исследование физико-химических аспектов взаимодействия АОБ с гидролитическими ферментами и их субстратами

4. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка научных основ технологии получения ферментативных гидролизатов биополимеров на основе отходов пищевой и микробиологической промышленности"

Актуальность темы.

Разработка недорогих эффективных препаратов кормового, пищевого и медицинского назначения отечественного производства является одной из актуальных задач современной биотехнологии. Среди такого рода препаратов наибольшее практическое значение имеют гидролизаты белковой, липидной, нуклеотидной и углеводной природы

Препараты нуклеотидной природы находят широкое применение в качестве лекарственных средств. Они регулируют обмен нуклеотидов в тканях, обладают иммуномодулирующими свойствами, применяются для лечения абиотрофий различного происхождения, псориаза, рассеянного склероза и других социально значимых заболеваний.

Препараты белковой природы в виде гидролизатов и ферментолизатов находят применение в качестве азотсодержащей основы питательных сред для культивирования микроорганизмов, в качестве пищевых добавок, а при соответствующем уровне очистки в виде смеси аминокислот и в медицине для парентерального питания и в качестве сырья.

Гидролиз углеводсодержащих субстратов позволяет получать моносахара, которые можно использовать для производства кормовых и пищевых препаратов углеводов. На основе жировых отходов получают свободные жирные кислоты, применяемые для производства различных видов мыл, высших спиртов, пищевых, парфюмерно-косметических и фармацевтических продуктов.

Для получения гидролизатов биополимеров наиболее перспективно использовать возобновляемые отходы пищевой и микробиологической промышленности, животного, растительного и микробного происхождения. Примером отходов растительного происхождения является пивная дробина - отход пивоваренной промышленности, животного - жиросодержащие и кератинсодержащие отходы мясоперерабатывающей промышленности, микробного - биомасса хлебопекарных дрожжей — отход спиртового производства, биомасса бактерий ВгеуЛаМег'шт glll-Шт'юит — отход производства аминокислот микробиологическим синтезом и др.

Практическая ценность перечисленных отходов обусловлена следующими причинами:

- высоким содержанием липидов, белков, углеводов, нуклеиновых кислот;

- возможностью улучшения экологической обстановки на соответствующих производствах в случае утилизации данных отходов;

- возможностью организации выпуска дополнительной конкурентоспособной продукции, что позволит повысить рентабельность основного производства.

Вследствие высокого содержания биополимеров данные отходы целесообразно перерабатывать в гидролизаты белковой, липидной, нуклеотидной и углеводной природы пищевого, кормового или медицинского назначения. Для этого используют химический и ферментативный гидролиз. К недостатку первого относятся жесткие условия проведения: высокая температура, сильнокислые или сильнощелочные значения рН среды, что приводит к образованию нежелательных побочных продуктов, а также увеличению содержания минеральных примесей в получаемых гидролизатах, что осложняет и удорожает их очистку. Вышеуказанных недостатков лишен ферментативный гидролиз, проводимый в более мягких условиях. Однако в этом случае не удается достичь высокой степени гидролиза субстрата по причине инактивации ферментов. В связи с этим гидролиз проводят в режиме дробной подачи фермента. Это ведет к повышению нормы расхода последнего, и, следовательно, к увеличению себестоимости готового продукта, т.е. эффективность ферментативного процесса существенно снижается. Одним из путей ее повышения является стабилизация ферментов. Для этого в реакционную среду или в ферментный препарат вводят различные химические соединения: по-лиолы, амины, аминокислоты, минеральные соли и др. Однако в этом случае у потребителей продуктов ферментативного гидролиза, особенно, для пищевых, медицинских и кормовых целей могут возникнуть проблемы с качеством гидролизатов. Наиболее просто решить данную проблему, если найти природный источник нетоксичных стабилизаторов. В качестве таких стабилизаторов можно использовать вырабатываемые микробными клетками ауторегуляторы, называемые факторами с! 1, которые стабилизируют ферментные системы клетки и обеспечивают ее выживание в анабиозе. Известно, что данные соединения относятся к классу алкилоксибензолов (АОБ) и способны расширять температурный и рН оптимум действия фермента, что значительно снижает риск развития посторонней микрофлоры при продолжительном гидролизе и не требует поддержания стерильных условий. Кроме того, введение АОБ приводит к значительному увеличению скорости ферментативного гидролиза.

Узким» местом существующих технологий ферментативного гидролиза является также очистка получаемых гидролизатов. Как правило, она предполагает использование дорогостоящих реагентов и препаративных методов (аффинной хроматографии, гель-фильтрации, диализа и т.п.), которые сложно масштабировать в промышленном крупнотоннажном производстве. Таким образом, проблема утилизации отходов пищевой и микробиологической промышленности является актуальной и перспективной, однако, требуется разработка эффективных способов получения и очистки ферментативных гидролизатов на их основе.

Анализ литературных данных показывает, что технологии получения и очистки ферментативных гидролизатов, получаемых из микробного, животного и рас-штельного сырья существенно различаются как стадиями предварительной подготовки сырья, так и используемыми ферментными препаратами и методами очистки гидролизатов. В связи с этим целесообразно разработать общие подходы к получению ферментативных гидролизатов из различных видов сырья, предложить общие пути повышения эффективности процессов ферментативного гидролиза, создать типовые кинетические схемы для количественного описания технологических стадий, что позволит в дальнейшем разработать универсальные алгоритмы управления технологическими процессами.

В условиях рыночной экономики конкурентоспособным может быть только гибкое, динамичное производственное предприятие, способное быстро адаптироваться к изменяющимся условиям рыночной среды и спроса на продукцию. Поэтому представляется целесообразным разработать максимально унифицированную малоотходную технологию получения ферментативных гидролизатов, которая позволила бы предприятию перерабатывать отходы различного происхождения и получать на их основе продукцию требуемого качества и назначения.

Целью работы является разработка научных основ технологии получения ферментативных гидролизатов промышленности белковой, липидной, углеводной и нуклеотидной природы с использованием технических ФП на основе отходов пищевой и микробиологической, а также повышение эффективности ферментативных процессов за счет введения в среду гидролиза природных ауторегуляторов -факторов с1]. обеспечивающих повышение устойчивости и стабильности ферментов. Последнее должно привести к повышению качества гидролизатов при более низких нормах расхода ФП.

Для достижения поставленной цели в работе необходимо было решить следующие задачи:

1. разработать технологические приемы предварительной обработки растительного, животного и микробного сырья, способные обеспечить повышение эффективности последующего ферментативного гидролиза;

2. изучить, используя кинетический метод исследований, количественные закономерности процессов гидролиза в отсутствии и в присутствии интенсифицирующих факторов (АОБ) на модельных системах (высокоочищенных ферментах и субстратах);

3. установить единую для всех субстратов, ферментов и АОБ схему ферментативных превращений, учитывающую влияние АОБ на скорость ферментативной реакции.

4. па основе полученных на модельных системах закономерностей ферментативного гидролиза рекомендовать пути повышения его эффективности для гидролиза микробного, растительного и животного сырья техническими ФП;

5. разработать технологические приемы выделения и очистки ферментативных гидролизатов белковой, липидной, нуклеотидной и углеводной природы и дать рекомендации по оптимальным условиям их проведения;

6. провести проверку соответствия физико-химических показателей получаемых препаратов требованиям соответствующих ТУ;

7. провести оценочные технико-экономические расчеты разработанных технологий и оценить их эколого-экономическую эффективность;

8. используя физико-химические методы анализа, установить структуры интер-медиатов на уровне субстрат — АОБ — фермент, способные научно обосновать наблюдаемый эффект автокатализа или ингибирования от введения АОБ в среду гидролиза.

Научная новизна. Впервые с использованием кинетического метода исследований установлены количественные закономерности процесса ферментативного гидролиза биополимеров белковой, липидной, углеводной и нуклеотидной природы техническим препаратами гидролаз.

Впервые показана возможность применения кинетического метода для описания закономерностей ферментативного гидролиза субстратов липидной, белковой и углеводной природы в составе микробного, растительного и животного сырья техническими препаратами гидролаз с участием АОБ.

Установлена единая для всех субстратов, ферментов и АОБ схема ферментативных превращений, учитывающая влияние АОБ на скорость ферментативной реакции. Показано, что ключевыми стадиями, определяющими скорость ферментативного гидролиза в присутствии АОБ, являются образование интермедиатов фермента с АОБ и субстрата с АОБ.

Показана возможность применения выбранного подхода к отличным от гидролаз комплексным ферментным препаратам на примере ферментных систем клеток печени, осуществляющих трансформацию серосодержащих аминокислот (цистеина и цистина) в таурин.

Разработано количественное описание стадий ионного обмена и осаждения продуктов ферментативного гидролиза из водных и водно-спиртовых растворов.

Предложенные кинетические схемы позволят в дальнейшем разработать единый алгоритм управления технологическими процессами получения ферментативных гидролизатов на основе сырья различного происхождения.

Впервые с использованием квантово-химических и термодинамических расчетов, подтвержденных физико-химическими методами (УФ-, ИК-спектроскопия) показано, что образование интермедиата АОБ с ферментом происходит за счет образования водородных связей между ОН-группами АОБ и амино- и гидроксогруп-пами аминокислот фермента, расположенными вблизи активного центра, а также гидрофобных взаимодействий. Установлено, что образование интермедиата между АОБ и субстратом также связано с образованием водородных связей.

Практическая значимость. Проведенные исследования явились основой для подбора технологических режимов, обеспечивающих повышение эффективности ферментативного гидролиза биополимеров в составе отходов микробиологической и пищевой промышленности:, а именно: экстракции белковых веществ из биомассы дрожжей и бактерий на примере Saccharomyces cerevisiae и Brevibacterium ght-tamicum техническим ферментным препаратом (ФП) протосубтилином ГЗх, переработки кератинсодержащего сырья в таурин с использованием технических ферментных препаратов протосубтилина ГЗх, ферментных систем поджелудочной железы крупного рогатого скота (ФС ПЖ КРС) и печени быка (ФС КП); получения углеводной фракции из пивной дробины путем ее гидролиза техническим ФП цел-ловиридином ГЗх, грибной глюкоамилазы Aspergillus awamori и панкреатической а-амилазы; получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК и гидролиза жиросодержащих отходов панкреатической липазой.

На основе разработанных кинетических схем подобраны режимы ведения вышеперечисленных процессов ферментативного гидролиза, обеспечивающих степень конверсии субстрата в присутствии АОБ не менее 90%, что позволяет сократить норму расхода ФП и время ведения процесса в 2 — 9 раз.

На основе кинетического метода исследований, обоснованы оптимальные режимы ведения стадий выделения и очистки продуктов гидролиза, основанные на применении методов ультрафильтрации, ионного обмена и осаждения из водных и водно-спиртовых растворов.

Проведена технико-экономическая оценка разработанных технологий, которая показала, что применение АОБ для интенсификации ферментативных процессов приводит к снижению себестоимости продукции в.2- 4 раза за счет снижения затрат на ФП, сокращения длительности технологического цикла и повышения вследствие этого эффективности работы оборудования. На основе экологоэкономической оценки разработанных технологий показано, что предложенные способы переработки отходов позволяют снизить экологический ущерб на 0,5 - 1,5 млн. руб/год.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Красноштанова, Алла Альбертовна

ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые принципы интенсификации ферментативных процессов с участием промышленных гидролаз, основанные на введении в среду гидролиза природных стабилизаторов ферментов - микробных ауторегуляторных факторов с1ь относящихся к классу алкилоксибензолов.

2. С использованием кинетического метода исследований установлены количественные закономерности процесса гидролиза белковых, липидных, углеводных и нуклеотидных субстратов высокоочищенными препаратами гидролаз. Установлено, что процесс гидролиза может быть описан в виде одно- или двухстадийной ферментативной' реакции с использованием уравнения Михаэлиса-Ментен и осложнен инактивацией свободного фермента по уравнению первого порядка, а также в случае панкреатических липазы и РНК-азы ингибированием фермента продуктами гидролиза.

3. Предложенная кинетическая схема может служить основой'для разработки алгоритма^ управления ферментативными процессами в производственных условиях. На ее основе установлено, что для» достижения степени гидролиза субстратов не менее 90% норма расхода ферментов составляет 10 - 16%, а время гидролиза достигает 18 ч.

4. На примере высокоочищенных препаратов гидролаз показана эффективность применения АОБ для, интенсификации ферментативного гидролиза. Показано, что в гидрофильных средах целесообразнее использовать АОБ й\-С-], а в гидрофобных - с^-С^. Установлено, что применение АОБ в количестве 0.01 - 0.1% от массы фермента позволяет сократить норму расхода последнего и время процесса в 2 - 9 раз.

5. На основе кинетического метода исследований показано, что в ходе ферментативного гидролиза происходит образование промежуточных интермедиатов АОБ с ферментом и субстратом. € использованием квантово-химических и физико-химических методов исследований установлено, что взаимодействие АОБ' с ферментом и субстратом происходит за счет образования, водородных связей между гидроксильными группами АОБ и атомами азота, кислорода и серы, входящими в состав высокомолекулярных соединений (ферментов и субстратов), а также гидрофобных взаимодействий.

6. Показано, что вышеустановленные кинетические схемы полностью применимы к гидролизу природных субстратов препаратами технических гидролаз, а также к ферментам других классов, например, оксидазам печени быка, осуществляющим трансформацию цистина и цистеина в таурин. На основе полученных закономерностей предложены пути интенсификации с помощью АОБ гидролиза микробных и кератиновых белков протосубтилином ГЗх, пивной дробины целловиридином ГЗх, жиросодержащих отходов* мясоперерабатывающей промышленности? панкреатическоШ липазощ дрожжевой РНК панкреатической; ВНК-азой,4 , позволяющие1 сократить норму расхода фермента'и время гидролиза в 1.5 - 4 раза.

7. Разработаны основы: технологии получения белковых гидролизатов с различной степенью; гидролиза на основе дрожжевых, бактериальных^ иг кератиновых белков с выходом 20-25% от содержания? белка« в сырье, включающие стадии ферментативного гидролиза техническими; ферментами протосубтилином F3x, ферментными1 системами» поджелудочной? железы быка; осветления гидролизата ультрафильтрациёй^ ионообменнойючисткища катеоните КУ-2х8. Предложены кинетические схемы каждой стадии; позволившие установить оптимальные условия;их; проведения:,

8. Разработаны основы технологии* получения препарата! таурина пищевого назначения с выходом 28% от содержания? цистина; в\ сырье- на« основе гидролизата кератинов путем трансформации серосодержащих аминокислот (цистина и цистеина) ферментными? системами клеток печени быка; Подобраны? оптимальные; условия5, проведения« стадий выделения« и? очистки^ таурина» - ионного обмена, иг осаждения; из водного и водно-спиртовых растворов; ,

9. Разработаны основы-технолбгиишереработкигпивной дробины с получением белкового^ изолята с выходом; 30% от- содержания« белка; bi сырье, и водорастворимой углевод!юй фракцииi с концентрацией РВ 30 г/л. Показана эффективность ее: примененияг для? культивирования промышленных штаммов дрожжей и бактерий.

10. Проведена технико-экономическая; оценка разработанных технологий в сравнении* с. базовыми; не предполагающими; использования? АОБ. Установлено; что применение последних позволяет снизить себестоимость продукции;в' Г.2'.— 5.0 раз при сохранении ее качества за счет снижения норм расхода фермента в 1,5 — 4,0 раза и сокращения длительности технологического цикла.в 1.3 -2.0 раза, что повышает эффективность работы оборудования:

Библиография Диссертация по биологии, доктора химических наук, Красноштанова, Алла Альбертовна, Москва

1. Калмыков П.Е., Голубев Т.И. Белковый препарат для парентерального пита- • ния - аминопептид. // Советская медицина. - 1956. - №3. - С. 66-69.

2. Денякина Е.К., Неклюдов А.Д., Герасимова Е.В. О количественном соотношении аминокислот и пептидов в белковых гидролизатах для парентерального питания. // Прикладная биохимия и микробиология. 1983. - Т. XIX, № 4. -С.503-506.

3. Неклюдов А.Д., Навашин С.М., Получение белковых гидролизатов с заданными свойствами. // Прикладная биохимия и микробиология. T.XIX, №7. -С.3-17.

4. Васильев П.С., Суздалев В.В., Неклюдов А.Д. и др. Препараты для парентерального питания // В кн. Современные кровезаменители. //М.: ВНИИМИ. -1980. С. 28-43.

5. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина A.B. и др. Получение пищевых гидролизатов из отходов мясопереработки в присутствии ферментов поджелудочной железы. //В сб. научных трудов ВНИИПМ М.: ВНИИМП. - 1998. - С. 70-78.

6. Beil Е., Hoeppner A. Wolff Н.С. Способ получения частично гидролизован-ных белков. Патент ГДР № 2008493. - опубл. 03.09.1970

7. Таранич A.B., Анохина В.И., Кононенко A.B. Способ получения кормовой добавки из отходов мехового сырья. Патент СССР № 3671661/28-13. -опубл. 23.04.1985.

8. Файвишевский M.JL, Либерман С.Г. Производство животных кормов. / М.: Легкая и пищевая промышленность. 1984. - С. 307.

9. Папков Н.Ф., Комлев А.П., Чеховский А.А. и др. Способ изготовления белковой колбасной оболочки. А.С. СССР № 686710. опубл. 25. 09.1979.

10. Speer Н. Е. Способ получения белкового продукта.- Патент США № 578923. -опубл. 25. 06.1957.

11. Hamclton.C.S. Производство пенообразователя'из кератинсодержащего сырья. Патент США № 298848. -опубл. 20.05.1884.

12. Горяев М.И., Быкова JI.H. и др. Способ получения пептона из кератинсодержащего сырья. Патент СССР № 2808824128-13. - опубл. 15.05.1981.

13. Шепелин А.П., Шамичева.И.Н. и др. Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии: ч. 1 - Махачкала, 1988- с. 9-10.

14. Раскин Б.М. ЖМЭИ. № 5 - С. 25-32. 85. Гриднева Н.И., Исаева З.А. и др. -Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии. - Махачкала, 1990- с. 10.

15. Артюхин В.И., Шепелин А.П., Киселева Н.В. Белковые гидролизаты в производстве питательных средб производство и применение продуктов микробиологических производств. Обзорн. Информ.,- М. ВНИИСЭНТИ Минмед-прома СССР, 1990, Вып. 9-10. 52с.

16. Максименко А.В., Надирашвили JI.A., Абрамова В.В., Еркомашвили Г.С. и др. Биотехнология. - 1990 - № 6 - с. 29-32.

17. В.А. Богдановская, М.Р. Тарасевич, И.А. Крылов, М.Н. Манаков. Способ извлечения драгоценных металлов. Патент РФ № 2115751. - опубл. 20.07.98.

18. Docken Ii Ml Способ переработки измельченных отходов мяса птицы для получения корма и; продуктов питания Патент ФРГ № 1208168. - опубл. 30.12.1965.

19. Е.П. Елизарова, Б.Г. Ходжакушев, Л.И. Заволовская, Е.П. Черногубова. Фар-мокинетака таурина. .— 1995: № 4. - С. 69-70.

20. И-Mf Кахновскищ Т.В. Королева. В Н. Захаренко, С.М. Ларионов. Таурин в лечении«сахарного диабета: // Клиническая фармакология и терапия; — 1997.№ 6. С.З.

21. НС. Сапронов, А.В. Самойленко, П.А. Торкунов, А.Ю. Юров. Название. //

22. Российский физиологический журнал: 1998- - т.84.-№ В-2. - G.39-44;

23. Ц.Р. Орлова. Г.II. Елизарова, И.М: Рыфор; Н;№ Фетисова», Л(И;;Митькина: Использование таурина для лечения застойной сердечной недостаточности. //Кардиология. 1991 г. - № 6. С. 77- 80.

24. Л.И. Заволовская, Е.П. Елизарова; В А. Орлов: Клиническая эффективность тауфона в комбинированном леченит больных с; хронической недостаточностью .кровообращения. // Экспериментальная и клиническая; фармакология. — 1995. - Т. 58, № 6. - С. 29 - 32.

25. Бабусенко E.G. Ауторегуляция роста.и развития метанокисляющих бактерий. // Автореф. диссертацииша; соискание ученой степени канд. биол. наук. М. -1992 г. 1

26. B.C. Гуревич. Таурин и функция возбудимых клеток. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1986. -№ 5. - С. 44-47.

27. А. Майстер. Биохимия аминокислот. // М.: Мир. 1961. - 386 с.

28. Фармакология и клиническое применение нейроактивных аминокислот и их аналогов. Под ред: Г.В: Ковалева. / Труды ВГМИ. - Волгоград. - 1986. - С. 12-15.

29. Marques L.A., DunfordH.B.Chlorinationof taurine by myeloperoxidase. Kinetic evidence for an enzyme-bound: intermediate //J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269, №22. - P. 7950-7956.

30. W. Vogt; D. Hess. Oxidants generated by the myeloperoxidase-halide system activate the fifth componentof human complement, C5.// Immunobiology. 1994. -Vol. 192, №1.-2.-P. 1 -9.

31. G. Schuller-Levis, M.R. Qvinn, C. Wright et all. Taurine protects against oxidant-induced lung injury: possible mechanism(s) of action. // Adw. Exp. Med. Biol. — 1994.-Vol. 359.-P. 31-39. ,

32. B.K. Мамыкин, H.C. Мазур, T.M. Бершова и др. Использование ферментных систем препарата' целлюлазы для биоконверсии растительного сырья. // Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья. 1998. - № 5. - С. 46.

33. Селиванов А.С. Малоотходная технология биоконверсии растительного сырья. // Автореф. диссертации на соискание ученой степени канд. техн. наук. -М. — 1992. 27 с.

34. Селиванов А.С. Комплексная переработка^ целлюлозосодержащих отходов лесоперерабатывающих и сельскохозяйственных предприятий на основе биоконверсии. // Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы. -Киров.-2001.- С. 89-91.

35. Sudguist J. The role of biotechnology in the wood^rocessing industry of the future. // Kemia-Kemi. 1987. - Vol. 14, № 100; - P.184.

36. Баурина M.M. Разработка основ технологии получения панкератического гидролизата дрожжевой РНК- автореф. дисс. на соискание ученой степени канд хим. наук. М. 2007.

37. Фукс Б.Б., Шабанова М.Е., Федоров С.Н., Краснопольский Ю.М. и др. Способ получения рибонуклеотидов. А'.с. СССР 1575359. - опубл. 01.03.90.

38. Akin cavit, Chao Kweic. Ammonia extraction of unicellular organisms. Патент США №3775393. - опубл. 15.03.80.

39. Fux B.B., Shabanova M.E. Method of preparing a mixture of ribonucleotides. -Патент США№ 5064758. опубл. 12.11.1991.

40. Шабанова M.E. Регенерация родопсина при наследственной дистрофии сетчатки. // Автореф. диссертации на соискание ученой степени канд. биол. наук. Москва. - 1980.-С. 22.

41. Шабанова М.Е., Гринио Л.П., Корбальников Н.И., Фукс Б.Б. Лекарственный препарат для лечения дегенеративных заболеваний нервно-мышечной системы. // Материалы симпозиума ИБХ РАН .- Изд-во РУДН. 2005. - С. 108.

42. Авцын А.П., Фукс Б.Б., Шабанова М.Е., Терещенко О.Д». Наследственные дистрофии сетчатки у человека и животных в связи с результатами их пато-генетическойтерапии. // Вестник АМН СССР. № 1. - 1977. - С. 34-39:

43. Борисова Э.А., Мармур Р.К., Плавинскис В.П1, Фукс Б.Б., Шабанова М.Е. Влияние фонофореза препарата ЭНКАД на-цитохимию роговицы животных разного возраста. // «Вестник офтальмологии». 1985. - № 5. — С. 48.

44. Шабанова М.Е., Крылов И.А. Новые возможности медицинского применения отечественного препарата нуклеотидов.//Аллергология и иммунология в педиатрии. 2006. - № 2-3. - С.94.

45. Арутюнян Н.С. Технология переработки жиров. М.: Пищепромиздат. -1999.

46. Мартынов А.Я., Никаноров Л.Л. Переработка органических отходов мясокомбинатов методом анаэробного сбраживания. // Мясная индустрия. 2003. - № 8. - С. 44-48

47. Иванкин А.Н., Илюхина Р.В. Мясная индустрия. 2001. - № 5.- С. 39-44.

48. Кобрин B.C., Кузубова Л.И. Опасные органические отходы (технология управления). // Аналитический обзор. Новосибирск. - 1995. - С. 23- 28.

49. Очистка сточных вод предприятий мясной промышленности. Пищевая и перерабатывающая промышленность. //Серия «Мясная и холодильная индустрия». Обзорная информация. - выт 7. - М.' - 1996.

50. Миркин М.Г., Кошелева A.B., Горнова №.Б., Градова Н.Б., Цапина A.B. Разработка основ технологии переработки жиросодержащих отходов мясоперерабатывающей промышленности. М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева, Гос-НИИсинтезбелок. - 2000. - с. 286 - 290.

51. Иванкин А.Н., Неклюдов А.Д., Бердутина A.B., Горбатова В.М. Биотрансформация малоценных жировых отходов в продукты повышенной »биологической ценности. //Мясная индустрия. 2002. -№ 6. - С. 43-44

52. Файвишевский M.JL Производство природных жиров. М.: Мир.- -1995. -347 с.

53. Рабилизиров М.Н., Лисенкова Л .Я. Физико-химические методы очистки сточных вод предприятий мясной'и молочной промышленности. //Обзорная информация. Mi: ЦНИИТЭИмяспром. -2002.

54. Сухарев Юй, Гофман В.Р., Николаенко Е.В., Матвейчук Ю.В. Очистка сточных вод предприятий масложировой промышленности. Челябинск, 1998.

55. Методические указания по разработке индивидуальных балансовых норм во-допотребления и* водоотведения для предприятий * масложировой промышленности. /Л.: ВНИИЖ. 1992 г. - 160 с.

56. Darnako D., Cherman ММ J. Amer. Oil. Chem. Soc. -2000.

57. Отчет о НИР по проекту 003.05.03.009. «Создать систему биотрансформации малоисследуемых жировых отходов в продукты повышенной биологической ценности» М., 2002.

58. Иванкин А.Н., Неклюдов А.Д., Герман А.Б., Бердутина A.B., Горбатова В.М. Биотрансформация малоценных жировых отходов в продукты повышенной биологической ценности. — Прикладная биохимия и микробиология. 2002. -т. 40.v - № 2. - С. 38 - 42.

59. Вторичные сырьевые ресурсы пищевой и мясоперерабатывающей промышленности АПК России и охрана окружающей среды. Справочник, 1998.

60. Артюхин В.И., Шепелин А.П., Киселева Н.В. Белковые гидролизаты в производстве питательных сред: производство и применение продуктов микробиологических производств.- Обзорн.информ. -М.: ВНИИСЭНТИ. 1990. -вып. 9-10.-52 С.

61. Раскин Б.М. Белковые гидролизаты в промышленности. ЖМЭИ. - 1990. - № 5.-С. 25-32.

62. Максименко А.В., Надирашвили Л.А., Абрамова В .В., Еркомашвили Г.С. Модификация комплекса протеиназ папайи. — Биотехнология. 1990. - №6. -С. 56-60.

63. Levine Rodney L. Rapid benchtop method of alkaline hydrolysis of proteins. J. Chromatography. - 1982. - V. 236 (2). - P. 499 -502.

64. Konbeck Winfried, Pytrik Heinz. Preparation of mineral salts by electrolytic neutralization and reduction. Ger. Offen DE 37112825, C07C 93/02. Опубл. 03.1-1.88.

65. Armanet Jean Michel; Giddey Claude Jahcketto, Jtfii Pieve. Hydrolysing pro-teiaceus inateriaks of animal or vegetable origin. Eur. Pat. Appl: EP 169166, A23J 3/00. - опубл. 13.06.84.

66. Webster J.D., Levward D.A., Lawrie R.A. Protein hydrolysate from meat1 byproducts. - Meat Sci. - 1992. - V.2. - P. 147 - 157.

67. Баер H.A., Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Дубина В.И:, Бердутина A.B. Способ получения белкового гидролизата из мясного и мясокостного сырья. Патент РФ №2112397-опубл. 10.06:1998.

68. Kilara A. Enzyme-modified proteinTood ingredients. Process Biochem. - 1985. -V. 20.-№3.-p. 146- 157.

69. Антонов B.K. Химия протеолиза: — М.: Наука. 1984. - С. 113 - 161.

70. Alder-Nisson J. Enzymatic hydrolysis of food proteins. dan. Kemi. - 1986: - V. IV.-№67.-p. 19-25.

71. Богатков C.B1, Фролова T.T., Грачева И1М. Оптимизация гидролиза-белков щелочной протеиназой-ßöc. Subtilis. Прикладная биохимия-и микробиология. - 1982.-т. 18. - № 1. - С. 71 -75.

72. Латов?В.К. Получение смесей аминокислот ферментативным гидролизом белков и их применение. // в кн.: Аминокислоты для.сельского хозяйства, пищевой промышленности и научных,исследований. Тез докл. Всесоюзного совещания. - Фрунзе, 1981. - С. 10 - 13.

73. Пивненко Т.Н., ЖданюкВ.М:, Эйнштейн Л.М. Способ получения протеоли-тического комплекса. Патент РФ№ 2034028. - 1995. - опубл. 10.04.95.

74. Попова В.А., Езерская Н.Ф., Петрейнова М.Н., Шилова С.А. Получение смеси аминокислот из дрожжей. — в сб. Труды ВНИгидр. Растительных материалов. 1981.'-№ 31. - С. 97-104.

75. Ву Тхи Фыонг Ань Разработка* основ технологии РНК из дрожжей. // авто-реф. дисс. на соискание ученой степени канд. хим. наук. М. - 1997.

76. Рубенис 0:С., Бринкманис P.A., Ирген' А. М., Лиепеня В.А., Тенисон P.A. Прикладная биохимия ^микробиология, 1976, T.XII, вып. 3, с. 403 407

77. Дудникова Е.А. Разработка гибкой технологии^ комплексной переработки поджелудочной1 железы крупного рогатого скота с получением гидролитических ферментов. автореф. Дисс. На соискание ученой степени^ канд техн. Наук. - М. 2009.

78. Шестаков С.С., Муляргук М.В. Комплексное производство природных аминокислот из белкового сырья. М.: ЦНИИТИПтицепром. - 1979.

79. Визбуле А.Д. Беликов В:М:, Арен А.К. Сложный вид ингибирования при гидролизе белков микробными протеолитическими ферментами. Известия АН Латв. ССР 1982. №7. - С. 110 - 114.

80. Крылов И.А., Красноштанова A.A., Манаков М:Н. Ферментативный гидролиз белков биомассы промышленных микроорганизмов.// Биотехнология. -1998.-№6.-С. 63-68.

81. Гауровиц Ф. Химия и функции белков: /Пер. с англ. В.В. Борисова, М.И. Вер-ховецкой. //Под ред. В.О. Шпикитера. М.: Мир. - 1965. - С. 252 - 257.

82. Денякина Е.К., Неклюдов А.Д., Герасимова Е.В. О количественном соотношении аминокислот и пептидов в белковых гидролизатах для парентерального питания. // Прикладная биохимия и микробиология. — 1983. т. XIX.- № 4. - С. 503-506.

83. Неклюдов А.Д., Навашин С.М. Получение белковых гидролизатов с заданными свойствами. //Прикладная биохимия и микробиология. 1995. - т. XXI. -№•!. —С. 3-17.

84. Васильев П.С., Суздалев В.В., Неклюдов А.Д. и др. Препараты для парентерального питания, //в кн.: Современные кровезаменители. Ml: ВНИИМИ.-1980.-С. 28-43.

85. Савченко И.Л., Благодатский В:Н. Способ получения белкового гидролизата из сухих белоксодержащих отходов животного происхождения. A.C. СССР №4214061.-1986.

86. КрыловаВ.Б., Попов В .П. Способ получения белкового гидролизата из кератинсодержащего сырья. АС СССР № 3701630/28-13. - 1985.

87. Антипова Л.В., Пащенко Л.П., Шамханов Ч.Ю., Курилова Е.С. Получение и характеристика пищевого кератинового гидролизата. //Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья. 2003. - №7. - С. 63-65:

88. Либерман С.Г., Шевкунов К.Ф., Щербаков А.Р.* Переработка кератинсодержащего сырья. //Обзорная информация. Серия «Мясная промышленность». М.: ЦНИИТЭИмясомолпром. - 1979. - С. 30.

89. Антипова Л.В. Полянских С.Н., Кочергина H.B. Биотехнология переработки кератинсодержащих отходов. //Птицеводство. — 1998. №2. - С. 26-29.

90. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Баер H.A., Бердутина A.B., Дубина В.И. Источники резервного белка для получения пищевых гидролизатов из животного сырья. // Хранение и переработка сельхозсырья.,- 1998.- № 3. С. 24 -25; ' ' . • ' .' '

91. Неклюдов А.Д., Иванкин A.I1. и др. Способ получения кормовых средств из протеинсодержащих отходов переработки животного сырья; Патент СССР № 1028236.- 1993.110: Способ получения белкового продукта;,-Патент ФРГ №284047. 1994.

92. ИЗ. Способ приготовления белкового продукта. Патент^США № 3578461. -1994. •.114: Пивненко Т.Н-, Жданюк BíM!, Энпггейн JIIM: Способ i получения протео-литического комплекса. Патент РФ № 2034028!,- 1995; - №12:

93. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина А.В. Свойствам и применение белковых гидролизатов (обзор)// Прикладная биохимия ишикробиология. -2000. т.36: - №5. - С. 525-534.

94. Braeumer К., Eckmayer Z.(+3) Способ получения водорастворимых гидролизатов кератинсодержащих материалов. Method for making water-soluble hy-drolyzates of keratinaceous materials Патент США № 4232123. опубл. 04.11.1980

95. Weeks L.E; Wildi ВiS. Способ приготовления, белкового продукта. PROCESS FOR THE PREPARATION OF PROTEINACEOUS MATERIALS -Патент CILIA № 3578461. опубл. 11. 05.1971.

96. Способ приготовления белковых гидролизатов; имеющих аромат мяса. -Патент США № 3692538. 1997.

97. Федорова II.В., Неклюдов А.Д. Влияние концентрации дрожжевой биомассы и экзогенных протеолитических ферментов;на интенсивность процессаавтолиза пекарских дрожжей. /Прикладная биохимия и микробиология. 1985. -т. XXI.-№6.-С. 714-718.

98. Нестерова Е.И., Кочеткова М.Г., ШатковскаяВ.В., Шагалов Л.Б., Бондарева Г.И., Будникова Т.И., Прохода Е.Ф. Способ получения 2-аминоэтансульфоновой кислоты. Патент РФ № 1370948. - опубл. 20.01.1996.

99. Фетисова Н. И., Титенко Н. Ю., Сафронова»А. Л., Бондарева Г. И., Шагалов Л. Б., Елизарова Е. П., Орлова Ц. Р., Петров В. И., Ковалев Г. В. Средство для течения сердечно-сосудистой недостаточности. Патент РФ № 2001616. -опубл. 30.10.-1993.

100. Петров В.И., Недогода C.B., Елизарова Е.П., Фетисова Н.И., Орлова Ц.Р., Фролов М.Ю. Средство для лечения хронических диффузных заболеваний печени. Патент РФ № 2024256. - опубл. 15.12.1994

101. Стекольников Л. И., Рыльцев В. В., Игнатюк Т. Е., Виноградова M. Н.

102. Способ получения таурина. Патент РФ № 1657491. - опубл. 23.06.199Ь

103. Фармакологический справочник. -М.:Мир. 1998. - С. 157-159.126. Патент РФ №2001616127. Патент РФ № 2024256

104. Хроматография на бумаге. // под ред. И.М. Хайса и К. Мцека./ пер. с чешского. М.: Мир. - 1962.

105. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды; пер. с англ./ под ред. В.Г. Дебабова. М.: Мир. - 1987. - С. 411.

106. Кушин A.B., Карманова Л.П. и др. Способ переработки органических отходов, содержащих жиры и белки. Патент РФ № 2119347. - опубл. 27.09.1998.

107. Очистка производственных сточных вод. / Под ред. Гурского Ю.И., Фил-липова И.В. Высшая химия. - 1987. — С.

108. Большаков О.В. Основные направления эффективного использования вторичных и; нетрадиционных^ источников э нергии на мясокомбинатах. М., . 1988.

109. Мартынов; А.Ю;:, Никифоров ; Л.Л., Руденко Г.С. Переработка органических отходов мясокомбинатов методом анаэробного; сбраживания. Мясная индустрия?-Ml-2003-- №81- G.:45- 47

110. Ьсзбородов A.M. Биохимические основы микробиологического синтеза. -М.: Мир. 1984.-320 с.

111. Гусельникова ТВ., Антонова Г .В. и др. Оценка относительной j ценности; белковых продуктов микробного синтеза химическими и: биотехнологическими методами? //Биотехнология. — 1988. Т.4, №6. — С. 56-60;

112. М\рзаков Б.Г., Литвинов В.Ф., Листов 1".J1. и др. Способ очистки сточных вод, образующихся на свалках пищевых и бытовых отходов. Патент РФ № 200132315.-опубл.10. 09.2003

113. Антипов С.Т., Шахов С.В., Фараджева Е.Д., Прибытков A.B., Кораблин Р.В., Моисеева И.С. Способ получения пищевой биодобавки и сушилка для его осуществления.-Патент РФ № 2204263.-20.05.2002.

114. Тарханов О.В., Тарханова Л;С., Тарханов А.О. Способ приготовления теста: Патент РФ № 2202891. - опубл. 27.04.2003.143: Калимулов М. Ю., Дрягин С. В. Способ производства хлеба. Патент РФ № 2159549. - опубл. 27.11.2000.

115. Андреенков В.А., Сницарь А.И., Рыжов С.А., Ващук Е.А., Сницарь A.A. Способ производства мучных кондитерских изделий. Патент РФ' № 2191513.-опубл. : 27.10.2002.

116. Андреенков В.А., Сницарь А.И., Алехина JI.B., Ващук Е.А. Способ приготовления мясных или мясорастительных рубленых полуфабрикатов или фаршей. Патент РФ № 2175207. - опубл. 27.10.2001.

117. Мушинский A.C., Быкова И.А. Субстрат для выращивания съедобного гриба вешенки обыкновенной Патент РФ № 2204236. - опубл. 20.05.2003.

118. Блинков С.Д., Букин Ю.Б., Немойтин М.М., Федоров A.JI. Способ переработки растительного сырья для получения пентозных гидролизатов, содержащих, преимущественно ксилозу. — Патент РФ № 2109059. опубл. 20.04.1998.

119. Орлова B.C., Кодитувакку П. А. Д. Э., Филатов H.H., Шаимов Р.Г., Тычи-нин В.Н., Джафаров Ш.А. Способ получения глюкозы из, целлюлозосодержащего сырья, преимущественно отходов пивного производства. Патент РФ № 2223327. - опубл. 10.02.2004.

120. Ушакова H.A. Изучение мутуалистических взаимодействий микроорганизмов и животных и использование микросимбионтов в биотехнологических целях. автореф: дисс. на соискание ученой степени докг. биол. наук. -М. - 2006.

121. Ленкова 'Г.Н. Мультиэнзимные композиции в комбикормах, содержащих нетрадиционные компоненты. //Птицеводство. 2007. - №2. - С.46-49.

122. Касаткина А.Н. Зерновая дробина как основа для получения биологически активных добавок с пробиотическими свойствами. автореф: дисс. на соискание ученой степени канд. биол. наук. - М. - 2008.

123. Кочетов Т.А. Практическое руководство по энзимологии M. -1989 г.

124. Калашникова H.A., Гребешкова Р.Н., Виноградова И1Н. Получение белковых гидролизатов с использованием микробных' протеолитических ферментов: // В кн. Новое в получении и приготовлении ферментов. М.: Наука - 1978.-412 С.

125. Jursh Louis В., Mikelvy Jeffrey F. An aminopeptidase from bovin brain wich catalizcd the hydrolysis of enkefalin. // J. Naturochem. — 1981. — V. 36, №1. P. 171 - 178.

126. Zamost Bruce L., Brantlay Ountin J., Elm Dana D., Reck Carol M. Production and characterisation of a termostable protease produced by an asparagenous mutant of Вас. Stearothermophilus. // J. Ind. Microbion. 1990. - V.5, №5. - P. 303 -312.

127. E. Ron win. The active center of thrombin and trypsin. // Biochimica et Bio-phisica acta. V. 33, № 2. - 1959. - P. 326 -332.

128. N. Weller, G. Zundel. Proton tranfer processes in the hydrogen bonded structure of the active centre of serine proteses — ann FT — IR study. // J. of Molecular structure. - V. 317, № 3. - 1994. - P. 249-259.

129. Kawatta Shuji, Takayama Shuli, Nimoniga Kazuto, Sotoru. Purification* and some properties of porcine liver aminopeptidase B. // J. Biochem. Tokio. - 1990. - V.88, №4. -C. 1025- 1032.

130. C.B. Галактионов. Биологические активные. // M.: Изд-во. 1988*. - С. 210.

131. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. М.: «Элевар». -2000. - С. 512.

132. Hashi. Annu. Название. // Rev. Plant., Physiol. Plant., Mol. Biol. V. 40. -1989. - P. 139- 168.

133. T. Hayashi, K. Ogawa, Y. Mitsuishi. Effects of the degree of polymerization on the binding of xyloglucans to cellulose. Plant cell Physiol. - № 35. - 1994. - P. 893-899 1199-1205.

134. W.S. York, A.G. Darvill and P. Albersheim. Inhibition of 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid-Stimulated Elongation of Pea Stem Segments by a Xyloglucan Oligosaccharide. // Plant Physiol. № 75. - 1984. - P. 295 - 297.

135. S.C. Fry. Structure-Activity Relationships for Xyloglucan Oligosaccharides with Antiauxin Activity. // J. Exp. Bot. V. 40. - 1989. - P. 1 - 11.

136. G.J. Dougall and S.C. Fry Xyloglucan Oligosaccharides Promote Growth and Activate Cellulase: Evidence for a Role of Cellulase in Cell Expansion. // Plant Physiol. № 93. - 1990. - P. 1042 - 1048.

137. C.Augur, L. Yu, K. Sokai, T. Ogawa, P. Sinai, A. G. Darwell and P. Alber-sheim.- Further Studies of the Ability of Xyloglucan Oligosaccharides to Inhibit Auxin-Stimulated Growth. // Plant Physiol. № 99. - 1992. - P. 180 - 185.

138. T. Takeda, Y. Furuta, T. Awano etc. Suppression and acceleration of cell elongation by integration of xyloglucans in pea stem segments. // Proc. Natr. Acad. Sci. USA. № 99. - 2002. - P. 9055 - 9060.

139. K. Yaoi, Y. Mitsuishi. Purification, characterization, cloning, and expression of a novel xyloglucan-specific glycosidase, oligoxyloglucan reducing end-specific cellobiohydrolase. // J. Biol. Chem. № 277. - 2002. - P. 48276 - 4828 k

140. Katsuro Yaoi, Jasushi Mitsushi. Purification, characterization, CDNA cloning and expression of axylaglucan endoglucanase from geotrichum sp. M 128. // FEBS letters. № 1 - 3. - 2004. - P. 45-50.

141. Ferereira C., Tarres B.B.\ Terra W. R. Substrate specifities- of midgut p-glycosidases from insects orders. // Comp. Biochem. Physiol. 19981 - № 119B. -P. 219-225.

142. Sandro R. marana, Walter R. Terra, Clelia Fereira. Purififcation and>properties of a p-glycosidase purified from midgut cells of Spodoptera frugipedra larvae. // Insect. Biochemistry and molecular biology. -V. 30. № 12. - 2000i - P. 1139 -1146.

143. Davies G. J., Wilson K.S., Henrisat B., Nomenclature for sugar-binding subsites in glycosyl. //Analyt. Biochem. 2004. - V. 97, № 21. - P. 110-115.

144. Fereira C., Capella A.N., Sitnik R., Terra W.R. Digestive enzymes in midgut cells, cndo- and ectoperitrophic contents and peritropic membranes of Spodoptera frugipedra larvae. // Arch. Insect Biochem.' Physiol. 2004. - № 26. - P. 299-313.

145. Ferreria C., Terra W.R. The effect of dietary plant'glycosides inlarval midgut P-glycosidases from Spodoptera frugipedra and Diatraca saccarolis. // Insect. Biochem. Molec. Biol. -1997. № 27. - P. 55-59.

146. Micchelle.Ricard, Jan D. Reid. Purified pectinase lowers cationic demand in peroxidate-bleached mechanicals pulp. Enzyme and Microbial Technology, 2004', V.5, pp. 499-504.

147. Калунянц К.А., Яровенко B.JL, Домарецкий В.А., Колчева P.A. Технология солода, пива и безалкогольных'напитков. / М.: Колос. 1992. - С. 446.

148. Калунянц К.А. Химия солода и пива: / М.: Агропромиздат. 1990. - С., 176.190: Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. М.: Элевар. - 2000. - 512 с.

149. Квеситадзе Г.И., Грибные и бактериальные амилазы. / Тбилиси: Медние-реба.- 1984.-С. 156.

150. Хорунжина С.И. Биохимические и физико-химические технологии солода и пива: / М.: Колос. 1999. - С.312.

151. Цыперович A.C. Ферменты. / Киев: техника. -1971. С. 360.

152. Главачек Ф., Лхотский А. Пивоварение. / М.: Пищевая промышленность. -1977.-С. 625.

153. Рухлядева А.П., Полыгалина Г.В. Методы определения активности гидролитических ферментов. / М.: Легкая и пищевая промышленность. — 1981. -С.82 -86.

154. Нарцисс Л. Технология солода. /М.: Пищевая промышленность. 1980. -504 с.

155. Кретович В.Л., Введение в энзимологию. /М.: Наука. 1986. - 336 с.

156. Яковлев А.Н. Биосинтез и физико-химические свойства термо- и рН-стабильных амилаз термотолерантного микромицета A. awamori ВУД-Т2. /Автореф. диссерт. на соискание ученой степени канд. техн: наук. Воронеж. - 1992. - 25 с.

157. Шевелькова А.Н. Кинетика и механизм действия ферментов амилазного комплекса. /Автореф. дисс. на соискание ученой степени, канд. хим. наук. — Москва. -1993.-22 с.

158. Григорьев B.C. Исследование биосинтеза и физико-химических свойств амилаз термотолерантных микромицетов. /Автореф. диссерт. на соиск. уч. степени д-ра техн. наук. Воронеж. — 1994. - 42 с.

159. S. llayachida, К. Nakamura, W. Kanlayakrit et al. Role of the carbohydrate moiety of a glucoamylase from Aspergillus awamori var. kawachi in the digestion of raw starch. //Agr. Biol. Chem. 1989. - Vol. 53. - P. 143 - 149.

160. Kraulis I. Modulation by adrenal steroids of limbic function. // J. Appl. Crystallogr. 1991. - Vol. 24. - P. 946 - 950.

161. B. Stoffer, T.R. Frandsen, P.K. Busk. Production, purification and characterization of the catalytic domain of glucoamylase from Aspergillus niger. // Biochem J.- 1993. Vol. 292. - P. 197 - 202.

162. Williamson G., Belshaw N.J., Williamson M.P. O-glycosylation in Aspergillus glucoamylase. Conformation and role in binding. //Biochem. J. 1992. - Vol. 282. -Part 2.-P. 423 -428.

163. T.A. Ковалева. О механизме действия и строении активного центра глю-коамилазы. //Вестник ВГУ. Серия химия, биология. 2000. - С. 104 - 107.

164. Ковалева Т.А., Артюзов В.Г., Кожокина О.М. Исследование функциональных свойств глюкоамилазы из дрожжей Saccharomyces cerevisiae. //Успехи современного естествознания. — 2003. № 5. - С. 49.

165. Т. Ashikari, N. Nakamura, Y. Tahaka et al. //Arg. Biol. Chem. 1986. - V. 50(4). - P. 957-964.

166. Yould G.W., Bell G.I. //Trends Biochem Sci. 1990. - V. 15. - P. 18-23.

167. Дикман M., Уэбб Э. Ферменты. / т. 1 3. - M.: Мир. - 1982. - С.1120.

168. Dubos R.J and Thomson R.S. // The Decomposition of Yeast Nucleic Acid by a Heat-Resistant Enzyme J. Biol. Chem. 1938. -V. 124. - P.501.

169. Moore S., Stein W.H. Chemical structure of Pancretic ribonuclease. // Science.- 1973. V. 180. - PP. 458-464.

170. Cantor C.R., Shimmel P.R. // Biophysical Chemistry. 1980. - P. 100.

171. Шапот B.C. и др. Методы выделения и определения активности нуклеаз. /Современные методы в биохимии. М. - 1964. - 450 с.

172. Хомов В.В., Сизов А.А. Масычева В.И., Загребальный С.Н. Способ получения рибонуклеазы панкреатической. А.с. РФ № 0291195. - Опубл. 20.09.97.

173. Scheit K.H., Reddy E.S.P., und Pondit M.W. Seminalplasmaribonuclease. ihre Gevinnung und Vervendung offen - DE P2911, 867. - 16.10.80.

174. Scheit K.H., Reddy E.R. and Murtr T.R. Seminal plasma ribonuclease and method for its recovery. US Pat. 4, 331, 764 C12N 9/22 25.05.82.

175. Czerlinsky G. In: Rapid Mising and Sampling Techniques in Biochemistry. // Academic Press. 1964. - New York. - P. 183.

176. Практикум по биохимии. /Под ред. С.Е. Северина и Т.А.Соловьевой: -Изд-во Московского Университета. 1989 г. - С.

177. Л.И. Нефедов. Биосинтез таурина // Известия АН Беларуси. Серия биологических наук. № 3-4. - 1992. - С. 48-50.

178. Н.С. Сапронов, П.А. Торкунов, В.В. Елисеев и др. Пути биосинтеза таурина. // Пат. Физиол., 1999; № 4, с; 19-20.

179. W.G. Martin, P.G. Patrick. The incorporation of S3504 into bile of chick. //Proc. Soc. Exp. Biol. Med. V.121'. - 1974. - P. 414-417.

180. H. Finney, K.C. Hayes. A review on the biotical function of taurine. // Nutr. Rev.-V. 34.- 1974.-P. 161-165.223. 131. G. Mandel, L. Pasantes-Moroles. // J. Anim. Sei. V. 69. - 1989/ - P. 609-612.

181. Verger R., de Haas G.N., Sardra L., Desnuelle P. //Biochim. Biophys. Acta. -1969.-V. 188.-P. 272

182. Hatch F.T. Correlation of Amino-Acid Composition with Certain Characteristics of Proteins //Nature. 1965. -V. 206. - P. 777.

183. Verger R. //Thesis. Faculte des Scienses de Marseille. - 1970.

184. Brockerhoff H. Название //Chem. Phys. Lipids. 1973. - V. 10. - P. 215

185. Garner G.W., Smith L.C. Porcine Pancreatic Lipase. A GLYCOPROTEIN // J.

186. Biol.chem. 1972. - V. 247. - P. 561-565 267.

187. Jackson R.L., Hires C.H. The Primary Structure of Porcine Pancreatic Ribonuclease. I. The Discription and Sites of Carbohydrate Attachment // J. Biol. Chem. -1967. 1970,-V. 245. - P. 624.

188. Брокерхов X., Дженсен P. Липолитические ферменты. M: Мир, 1978.

189. Капранчиков B.C. Липаза зародышей семян пшеницы: препаративное получение, свойства, регуляция активности. Автореферет диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Воронеж, 2003.

190. Mozhaev V. Mechanism-based strategics for protein thermostabilization.// Trends. Biotechnool. 1993. -V. 11. - P. 305-314.

191. Katchalsky-Katzir E. Immobilized enzymes learning from past successes and failures. // Trends Biotechnol. - 1993. - V. 11. P. 214 - 220.

192. Guissan J., Fernandes-Laluentre R., Rodrigues V., Bastida A. and Alvaro G. Enzyme stabilization by multipoint covalent attachment to activated pre-existing supports. // in: Stability and stabilization of enzymes. Amsterdam: Elsevier. -1993.-P. 55-62.

193. Goodenough P. W. Food enzymes and the new technology. //Enzymes in Food Proceeding. 2nd ed. Glasgow: Academic and Professional. 1995.

194. Wintrode W.J., Brown C.R. Influence of molecular and chemical chaperones on protein folding. Cell Stress Chaperones. - 1996. - V. 1(2). - P. 109 - 115.

195. Hirokawa K., Kajiyama N., Murakami S. Improved practical usefulness of firefly luceferase by gene chimerization and randommutagenesis. // Biochim. Biophys. Acta.-2002.-V. 1597.-P. 271-279.

196. Ptytsin O.V. In protein folding. // Creighton. 1992. - P. 243 - 300.

197. Котова H.B., Семисотнов Г.В. // Успехи биол. Химии. 1998. - т.38. - С. 199-223.

198. Курочкина Л.П., Месянжинов В.В. // Успехи биол. Химии. 1996. - С. 49 -86.

199. Akiyoshi K., Sasaki Y., Sunamoto J. // Int. J. Food Microbiol. 2000. - Vol. 10.-P. 321 -324.

200. Bukau B., Deuerling E., Pfund C., Craig E.A. // Cell. 2000. - Vol. 101. -P.119- 122.

201. Csermely P.//News Physiol. Sci.-2001.-V. 16.-P. 123- 126.

202. Lund P.A. // Adv. Mycrob. Physiol. 2001. - V. 44. - P. 93 - 140.

203. Martin I., Hartl F.U. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. - V. 7. - P. 41 - 52.

204. Morimoto R.J., Tisseres A., Georgopoulos C., eds. Progress Perspectives on the Biology of Heat shock Proteines Molecular Chaperones. /New York: Cold Spring 1 larbor Laboratory. Cold Spring Harbor. - 1994.

205. Muller M., Koch H. G., Beck K., Schafer U. Prog. Nucleic Acid res. Mol. Biol.-2001.-V. 66.-P. 107- 157.

206. Ruddon R.W., Bedows E. Assisted Protein Folding // J. Biol. Chem. 1997. -V. 272.-P. 3125-3128.

207. Santhoshkumar P., Sharma K.K. Phe71 Is Essential for Chaperone-like Function in aA-crystallin // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - P. 47094 - 47099.

208. Thirumalai D., Lorimer G.N. //Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2001. -V. 30.-P. 245-269.

209. Buchner J. Supervising the fold: functional principles of molecular chaperones //FASEB J. 1996. -V. 10.-P. 10-19.t

210. Freeman B.C., Morimoto R.I. //EMBO J.- 1996,-V. 15.-P. 2969-2979.

211. Freeman B.C., Toft D.O., Morimoto R.I. Molecular Chaperone Machines: Chaperone Activities of the Cyclophilin Cyp-40 and the Steroid Aporeceptor-Associated Protein p23 //Science. 1996. - Vol. 274. - P. 1718 - 1720.

212. Hwahg D.S., Crooke E., Komberg A. Aggregated dnaA protein is dissociated and activated for DNA replication by phospholipase or dnaK protein // J. Biol. Chem. 1990. - Vol. 265. - P. 1244 - 19248.

213. Jakob U., Buchner J. //Trends Biochem. Sci. 1994i - Vol. 19. - P. 205 - 211.

214. Jaenicke R. // Current Topics in cellular Regulation. / New York: Academic Press. 1997. - Vol. 34. - P. 209 - 314.

215. Skowyra D., Georgopoulos C., Zylicz M. // Cell. 1990. - Vol 62. - P. 939 -944.

216. Zuemienowicz A., Skowrsa D., Zeilstra-Ryalls I., Fayet O., Georgopoulos C., Zylicz M. // J. Biol. Chem. 1993. - Vol. 268. - P. 25425 - 25431.270.

217. Hartl F.- U. Hlodan R., Langer T. Molecular chaperones in protein folding: the art of avoiding sticky situation. // Trends in Bioch. Sci . 1994. - V. 19. - P. 20 -25.

218. Aggaraberes F., Dice J. A molecular chaperone complex at the lysosomal membrane is required for protein translocation. //Journal of Cell science. 2001. - V. 114.-P. 2491-2499.

219. Aggaraberes F., Dice J. Protein translocation across membranes. //Biochimica etBiophysica Acta.-2001.-V. 1513. P. 1 - 24.

220. Aggaraberes F., Terlecky S., Dice J. Requirement for an introlysosomal hsc 73 for a selective pathway of lysosomal proteolysis. //Journal of Cell Biology. 1997. -V. 137.-P. 825-834.

221. Alberti S., Esser C., Hohfeld J. BAG-1: A nucleotide exchange factor of hsc 70 with multiple cellular functions. //Cell stress and chaperones. 2003. - P. 225-231.

222. Backer J., Dice J. Covalent linkage of ribonuclease-S-peptide to microinjected proteins causes theirs intracellular degradation to be enhanced by serum withdrawal. // Proceeding of the Natural Academy of the USA. 1986. - V.83. - P. 5830-5834.

223. Backer J., Bourret C.,Dice J. Regulation of catabolism of microinjected ribonu-clease A requires the amino terminal twenty aminoacids. // Proceeding of the national Academy of Sciences of the USA. 1983. - V. 80. - P. 2160-2170.

224. Ballinger C., Connell P., Wu Y., Hu Z., Thomson L., Yin L., Patterson C. Identification o CHIP. // Molecular and cellular Biology. 2002. - V.19. - P. 4535 -4545.

225. Brown C. Mccann J., Chiang H. The heat shock protein SSA 2p is required for import of fructose-1,6-biphosphate into VZD vesicles. // Journal of Cell biology. -2000.-V. 150.-P. 65-76.

226. Chen X., Schnell D. Protein import into chloroplasts. // Trends in Cell biology. -V. 9.- 1999.-P. 222-227.

227. Chiang H., Dice J. Peptide sequences that target proteins for enhanced degradation during serum withdrawal. // Journal of Biological chemistry. — 1988. V. 262. - P. 6797-6805.

228. Chirico W., Waters M. and Blobel G. 70 K heat shock related ptoteins stimulate protein translocation into microsomes. //Nature. -1988. V. 332. - P. 805-810.

229. Ciehanover A., Schwarts A. Ubiquintion-meduated degradation of cellular protein in health and disease. // Hepathology. 2002. - P. 3 - 6.

230. Coux O. The 26 S proteasome. // Progress in molecular and submolecular Biology. 2002. - V. 29. - P. 85-107.

231. Cuervo A., Dice J. A receptor for selective uptake and degradation of proteins by lysosomes. 1996. - V. 273. - P. 501-503.

232. Cuervo A., Dice J. Lysosomes, a meeting point of proteins, chaperones, proteases. //Journal of Molecular Medicine. 1998. - V. 76. - P. 6-12.

233. Cuervo A., Dice J. Age-related dectine in chaperone mediated authophagy.// Journal of biological chemistry. - 2000. - V. 275. - P. 31505-31513.

234. Cuervo A., Dice J. Regulation of lamp 2a levels in the lysosomal membrane.// Traffic. 2000. - v. 1. - P. 570-583.

235. Cuervo A., Dice J. Unique properties of lamp2 compared to other lamp2 iso-forms. //Journal of Cell Science. -2000. V.l 13. - P. 4441-4450.

236. Cuervo A., Dice J., Knecht E. A population of rat liver lysosomes responsible for the selective uptake and degradation of isotonic proteins. //Journal of Biological Chemistry. 1997. - V. 272. - P. 5606-5615.

237. Cuervo A., Dice J., Knecht E. Selective degradation of annexins by chaperone-mediated autophagy. //Journal of Biological chemistry. 2000. - V. 275. - P. 33329-33335.

238. Cuervo A., Hildebrand H:, Bomhard E., Dice J. Direct-lysososmal uptake of al-pha-2-microglobulin contributes the chemicallyinduced nephropathy. // Kidney International. 1999. - V.55. - P. 529-545.

239. Cuervo A., Hu W. Lim B., Dice J. 1KB is a substrate for a selective pathway of lysosomal proteolysis. // Molecular Biology of the Cell. 1998. - V. 9, P. 19952010.

240. Cuervo A., Knecht E., Terlecky S., Dice J. Activation of a selective pathway of lysosomal proteolysis in rat liver by prolonged starvation. // American Journal of Physiology, 1995. V. 269. - P.- C1200 - C 1208.

241. Cuervo A., Mann L., Bontenn E., d'Azzo A., Dice J. Cathepsin A regulated au-thophagy through cleavage of the lysosomal receptor. // EMBO Journal. 2003. -V. 22. - P. 47-59.

242. Cuervo A., Terlecky S., Dice J., Knecht E. Selective binding and uptake of ri-bonucleasc A and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by rat liver lysosomes. // Journal of Biological chemistry. 1994. - V. 269. - P. 26374-26380.

243. Deshails R., Koch B., Werner-Washbucne m., Craig E., Senekman R., 70 kDa stress protein homolugues facilitate translocation of secretory and mitochondrial precursor polipeptides. //Nature. 1988. - V. 332. - P. 800-805.

244. Dice J. Peptide sequences that target cytosolic proteins for lysosomal protolysis. //Trends in biochemical Sciences. 1990. - V. 15. - P. 305-309.

245. Dice J., Lysosomal pathways of protein degradation. //Austin: Landes Bioscience.-2000. P. 108.

246. Dice J., Chiang H-L, Spenser E., Bacer J. Regulation of catabolism of microin-jected ribonuclease A: identification of residues 7-11 as essential pentapeptide. // Journal of biological chemistry. 1986. - V.262. - P. 6853-6859.

247. Franch H., Soopart S., Du J., Brown N. A mechanism regulating proteolysis of specific proteins during renal tubular cell growth. // Journal of Biological chemistry.-2001.-276.-pp. 19126-19131.

248. Hightower 1., Leung S. Mammalian Hsc 70 and'Hsp 70. In M.J. Gething Guieldebook to molecular chaperones and protein-folding catalysis. // London: Oxford University Press. P. 53-58.

249. Holttzman E. Lysosomes. /New York Plenum-Press. P. 439.

250. Kim J., Klionsky D. J. Autophagy, cytoplasm to-vacuole targeting pathway in yeast and mammalian cells. // Annual Review of Biochemistry. - 2000. - V. 69. -P. 303-342.

251. Klionsky D., Emr. S. Autophagy as a regulated pathway of cellular degradation. //Science. -2000. V. 290. - P. 1717-1721.

252. Lill R., Newpert W. Mechanisms of protein import across the mitochondrial outer membrane. // Trends in Cell Biology. 1996. - № 6. - P.56-61.

253. Milani V., Noessner E., Glose S., Kuppner M.,Ahrens B., Scharner A., Gasspar R., Issels R. Heat shock protein 70: Role in, antigen .presentation and' immune stimulation. // International Journal of Hyperthermia. 2002. - V.18. - P. 563-575.

254. Mizushima N., Noda T., Yoshimori T., Tanaka Y., Ishii T., George M., Klyon-sky D., Ohsumi Y. A protein conjugation system essential for authophagy. // Nature. 1998. - V. 395. - P. 395-398.

255. Mizushima N., Ohsumi Y. and Yoshimori T. Auto phagosome formation in mammalian cells. // Cell Structure Function. 2002. - P. 421-429.

256. Mortimone G., Poso A., Lardeux B. Mechanism and regulation of protein degradation in liver. // Diabetes/Metabolism Review. № 5. - P. 49-70.

257. Neff N., Bourret L., Miao P., Dice J. Degradation of proteins microinjected into JMR-90 human diploid fibroplasts. // Journal of cell Biology. 1981. - V. 91. - P. 184-194.

258. Newmyer.S., Christensen A., Sever S. Auxilin-dynamin interactions link the uncoating ATPase chaperone machinery with vesicle formation. // Developmentall Cell. 2003. - V.4. - P. 929-940.

259. Noda Т., Suzuki K., Ohsumi Y. Yeast autophagosomes: De novo formation of a membrane structure. // Trends Cell-Biology. 2002. - № 12. - P. 231-235.

260. Ohsumi Y. Molecular digestion of autophagy: Two ubiquintinlike systems.316. // Natural Review of Molecular and Cellular, Biology. 2001. - № 2. - P. 211216.

261. Panaretou В., Siligaroli-G., Meyer. P., Maloney A., Silivan J., Singh S., Millson J. et. al. Activation,of the ATPase activity of hsp 90 by stress-regulated cochaper-one aha 1. // Molecular Cell. 2002. - №10. - P. 1307 - 1318.

262. Roberts P., Moshitch S., Kvam E., O'Toolro, Winey M., GoldfarbD.S. Piecemeal microaphtophagy of the nucleus in Saccaromyces cerevisiae.319. //Molecular Biology of the CelL-2003. V. 14. - P. 129-141.

263. Jarret J. Т., Lansbury Pt. Seeding "one dimensional'crystallization" of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie. // Cell. 1993. - Jun 18.-V. 73(6).-P. 1055-10588.

264. Caughey В., Kocisko D.A, Raymond GJ, Lansbury Pt. Agregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-resistant state. //Chem. Biol. 1995.-Dec. 2(12).-P. 807-817.

265. М.Д. Тер-Аванесян, C.B. Паушкин, B.B. Кушниров; H.B. Кочнева-Первухова. Молекулярные механизмы «белковой»,наследственности: прионы дрожжей. // Молекулярная биология. 1998. - т. 32: - № 1.-0. 32-42.

266. Chernoff YO. Newman GP, Kumar J, Allen K., Zink AD. Evidence for a protein mutator in yeast: role of the HSP 70-related shaperone ssb in formation, stability and toxity of the Psi+. prion. // Mob Cell: Biol-. 1999. - Dec. 19. - V. 12. - P. 8103-8112.

267. Chernoff YO, Linquist SL, Ono В., Inge-Vechtomov SG. Role of the chaperone protein Hsp 104 in propagation of the yeast prion-like factor Psi+. // Science. -1995. May 12. - V. 268 (5212). - P. 880-884.

268. Wickner RB URE3. is an altered URE 2'protein for a prion analog in Saccharomyces eerevisiae. Science. - 1994. - V. 264. - P. 566-569.

269. Wickner R.B., Chernoff YO. Prions of fungi: URE3., [Psi+], [Het-s] discovered as heritable traits. // In S.B. Prusiner. Prion biology and diseases. / Cold spring Harbor laboratory Press. Cold Spring Harbor. - N.Y. - 1999. - P. 229-272.

270. Tzanov Т., Andreus J., Guebitz G., Cavac-Paulo A. Protein interaction in enzymatic processes in textiles. //Electron J. Biotechnol. 2003.- V. 36. - P. 1002 -1005.

271. Volkin D.V., Klibanov A.M., A practical approach. In Protein function //Ed. Crcighton T.E. 1RL Press. Oxford. UK 1989. - P. 1 -24.

272. Klibanov A.M. Why are enzymes less active in organic solvents than in water? // Trends Biotechnol. 1997. - V. 15. - P.97 - 101.

273. Andersson M.M., Hatti-Kaul R. Protein stabilizing effect of polyethyle-neimine.// J. Biotechnol. 1999. V.72. - P.21 - 31.339/ Tombs M.P. Stability of enzymes. // J. Apl. Biochem.- 1985. V. 11. - P. 306 -312.

274. Barry K. Derham, John J. Hardling. a-Crystallin as molecular chaperone. //

275. Progress in Retinal and Eye Research. V. 18. - № 4. - 1999. - P. 463-509.i

276. Matsummura T., Nafnamishi T., Jizyja N., Janamoto T. Hydrolysis of protein by successive incubation with proteinase and aminopeptidase mixture. // Agric. Biol. Chem. 1975. - V. 39. - № 2. - P. 379-386.

277. Yancey P.N., Clark M.E., Hand S.C., Bowlus R.D., Somego G.N. Living whith, water stress: Evolution of osmolyte systems // Science. 1982. -1. 217. - P. 1214 -1222

278. Walker J.E., Wonacott A. J., Harris J.I. Heat stability of tetrameric enzyme, D-glyceraldcgyde-3-phosphate dehydrogenase. //Eur. J. Biochem 1980. - V. 108. -P. 581-586.

279. Singer M.A., Lindquist S. Multiple effects of trehalose on protein folding in vitro and in vivo.// Mol. Cell. 198. - V.l. - P. 639 - 648.

280. Knapp S., Ladenstein R., Galinski E.A. Extrinsic protein stabilistabilization by the naturally occuring osmolytes 3-hydroxyectoine and betain. //Extrcmophiles. -1999.- V.3.-P. 191-198.

281. Cherain M., Deeslic W.D. Production of hydrolysate in ultrafiltration enzyme reactors. // Polym. Sci-technol. -1980. - V.3. - P. 591-601.

282. Roosen J.P., Pilnic W. Enzymic protein hydrolysis on membrane reactors related to toyte properties. // Enzyme Microb. Technol. 1979. - V.L - № 2. - P. 122-124.

283. Fernandez-Vinas A., Arios J.M., Montoya E. Autolysis in Myxococcus coraloidcs O. // FEMS microbial. Let.l. - 1983. - V. 20. - № 1. - P. 97-101.

284. Wretling K.A. Patent fur bermanien, 1953, N 875992, K. 30h, 2-30.350.! Nelson D. Фармацевтическая композиция для лечения судорог. Пат. Великобритании, № 2175804: Опубл. 10.12:86.

285. Г. Scoirf U., Schlingmann' M., Rymon L.W. Функциональный белковый гид-ролизат, способ его получения и получения продуктов питания, содержащих этот белковый гидролизат. Акц. заявка ФРГ, № 3143947, опубл. 11.05.83.

286. Kanegae Y., Sugiyama Y., Minami К. Дрожжевой экстракт, полученный на-греванием« водной суспензии автолизом при. щелочных pH. Пат. Японии № 258417, опубл. 25.01.94.

287. Kollar R., Sturdik е., Sajbiolor Y., Sanolula Y., Hrmar S., Forshenoffer y. Frac-tionacia a vyzitie komponentov ptarskeho drosolia Bull. Potravin Wysk., 1989,1. V. 28, N 1-2, p. 45-56.

288. Heijnoork J., Ledue M., Iieijenoort; Y., Kosra K., Freheb C. Autolysis of E. coli: induction and ontrol. Target penicillin: Murein Soc. cuius Bact. Cell walls Ar-chit. Grown. Proc.Int. FEMS Symp. Berlin: New York. 1983, p. 191-196.

289. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Шмидт M.A., Дорошенко Е.В., Мулюкин* А.Л., Эль-РегистанГ.И. Роль бактериальных ауторегуляторов роста группы алкилоксибензолов в ответе стафилококков на стрессовые воздействия. Микробиология, 2002, Т.71, №Г, с. 23-29.

290. Колпаков А.И: Стабилизация ферментов аутоиндукторами анабиоза как дин из механизмов1 устойчивости покоящихся форм микроорганизмов. Микробиология, 2000, № 1, с. 224-230.

291. Степаненко И.Ю. Изучение роли-алкилоксибензолов в стрессовом ответе микроорганизмов. Автореферат дисс. на» соискание ученой степени. канд. биол. наук, М., 2005.

292. Бабусенко Е.С., Эль-РегистанТ.И., Градова Н.Б. и др. Исследование мем-бранотропных ауторегуляторных факторов метанокисляющих бактерий; // Успехи химии. 1991.-т.60.-Вып. 11.-С. 2362-2373.

293. Жоли М. / Физическая химия денатурации. М.: Мир. - 1968. - С. 153 — 170.

294. Dc Young L.R., Fink A.L., Dill К.A. // Accounts Chem. Res. 1993. - Vol. 26.-P. 614-620.

295. Morello J. -P., Bouvier M., Petaja-Repo U.E., Bichet D. G. Pharmacological chaperones6 a new twist on receptor folding. //Trends Pharmacol.Sci. 2000. - V. 21.-P. 466 -469.

296. Arakawa Т., Ejima D., Kita Y. Tsumoto K. Small molecule pharmacological chaperones: from thermodynamic stabilization to pharmaceutical drugs. //Biochim. Biophys. Acta Protein & Proteomics. - 2006. - V. 1764. - p. 1677 - 187.

297. Steet R., Chung S., Lee W.-S., Pine C. W., Do H., Kornfeld S. Selective action of iminosugar isofagomine, pharmacological chaperone for mutant forms of acid-3-glucosidase.// Biochem. Pharmacol. 2007. - V. 73. - P. 1376 - 1383.

298. Tropak M.B., BlanChard J.E., Withers S.G., Brown E.D., Mahuran D. High-throughput screening for human lysosomal ß-N-Acetyl Hexosaminidase inhibitors as phamacological chaperones. //Chem. Biol. 2007. - V. 14. - P. 153 - 164.

299. Fields G.B., Alonso D.O.V., Stringier D., Dill K.A. // J. Phys. Chem. 1992. -Vol. 96.-P. 3974-3981.

300. Jaenicke R. //J. Polym Sei. 1967. — Vol. 16.-P. 2143-2160.

301. Mitraki A., King J. // J. Biotechnology. 1989. - Vol. 7. - P. 690 - 697.

302. Орлов B.H., Арутюнян A.M., Куст C.B., Литманович E.A., Драчев В.А., Добров E.H. //Биохимия. 2001. - т. 66. - С. 195 - 204.

303. Linker RA., Treweek Т.М.> Garver J.A. //Biochem. J. 2001. - Vol. 354. - P. 79 -87.

304. Pots A.M., den Grotenhuis E., Gruppen H., Voragen A.G.J, de Kruif К. G. //J. Agric. Chem. 1999. - Vol. 47. - P. 4600 - 4605.

305. Schokker E.P., Singh H., Ringer D.N., Cresmer L. K. // Intern. Dairy J. 2000. -Vol. 275.-P. 13349- 13352.

306. Jaenicke R. //Current Topicsin Cellular Regulation. Vol. 34. - New York: Academic Press. - 1997. - P. 209-314.

307. Klinov S. V., Chebotarcva N.A., Lisovskaya N. P., Davidov D.R., Kurganov V.l. // Biochim. Biophis. Acta. 1982. - Vol. 709. - P. 91 - 98.381. .Knappik A., Pluckthun A. // Protein Eng. 1995. - Vol. 8. -P. 81 - 89.

308. Б.И. Курганов. Оценка активности шаперонов в тест-системах, основанных на подавлении агрегации белков. // Успехи биол. Хим. 2002. - т.42. - С. 89-138.

309. Roher N., Mire F., Boldyreff В., Leorens F., Plana M., Issinger O. G., Itarte E. // Eur. J. Biochem. - 2001. - Vol. 268. - P. 429 - 436.38*4. Lee G.R., Roseman A.M., Sailbien R., Vierling E. //EMBO J. 1997 - Vol. 16.-P. 659-671.

310. Chan W., Heems L.R., Brooks I., Lee G., Ngola S., Mc Nutty D„ Maluf В., Hensley P., Wetzel R. // Folding Des. 1996. - Vol. 1. - P. 77 - 89.

311. Base S., Weike Т., Bigl H., Buckner I. // Science. 1996. - Vol. 274. - P. 1715 -1717.

312. A.A. Ревина, Г.И. Эль-Регистан, В.И. Галактионов. //Химия высоких энергий. -2004. т. 38. -№ 3.

313. И.Ю. Степаненко A.A. Ревина, Г.И. Эль-Регистан и др. //Биотехнология.2004. т.73, № 12.

314. Е.К. Баранова, A.JI. Мулюкин, A.A. Ревина. // Наукоемкие технологии.2005.-№5.

315. Давыдова O.K. Взаимодействие алкилоксибензолов ауторегуляторных d.-факторов микроорганизмов с ДНК. - автореф. Дисс. На соискание ученой степени канд. биол. наук. - Саратов. - 2006.

316. Давыдова O.K. Топология и физико-химические свойства ДНК при взаимодействии с ауторегуляторными факторами d. микроорганизмов. // тез. Докл. Международной конф., посвященной памяти Б.Н. Алиханаяна пущи-но, 2006.-С. 21 -24.

317. Давыдова O.K., Никиян А.Н., Дерябин Д.Г. Формирование упорядоченных надмолекулярных структур ДНК в водных растворах в присутствии ал-килрезорцинов. // Вестник ОГУ. 2005. №1. - С. 174 - 177.

318. Иванов В.И., Минченкова Л.Е. А-форма ДНК: в поисках биологической роли. // Молекулярная биология. 1994. - т.28. - С. 1258 - 1271.

319. Шакир И.В;, Красноштанова А;А., Суясов Н.А., Смирнова В;Д.,Парфенова ЕВ; Общая биотехнология, Лабораторный практикум, //М.: Издательский центрРХТУ им; ДМ; Менделеева; 2008'г;.- Ш2:С. .

320. Полыгалина Г.В., Чередниченко В1С., РймареваШСС. Определение активностиферментов. Справочник. М: Дели-Принт. - 2003* - 375;с.

321. Худсон Д. Статистика для физиков. М.: Мир.- 1970. С. 254 - 270.

322. Иванкин А.Н. Биологически активные вещества из животной ткани и микроорганизмов. Методы получения и структурно-функциональные взаимосвязи. Автореф. дис.докт. хим. наук. — М. 1998. - 38 с.

323. Колпаков .А.И., Ильинская О.Н., Беспалов М.М. и др. Стабилизация ферментов аутоиндукторами анабиоза как один из механизмов устойчивости s покоящихся форм микроорганизмов. // Микробиология. 2000. - т. 69. - №2. -с. 224,-230.

324. Гауровиц Ф. Химиями функции белков. М. Мир. - 1965: - 465 с.

325. Orr David С., Audrey G., Kay John., Dunn. Ben M., Cameron Janet M. .Hydrolysis of series of synthetic peptide substrates by the human rinovirus 143c proteinase, cloned and expressed in E. coli.ll Biochim-. Biophys. Acvta. 2007. - V. 48.-P. 264- 267.

326. Купов X.A. Разработка и масштабирование процесса для азотистого парентерального питания избиомассы* хлебопекарных дрожжей. Автореф: дис. на соискание ученой степени канд. техн. наук. 1990.

327. В.М. Боровкина, А.Г. Попов. A.c. 757474 СССР. - опубл. 23.08180. - бюл. 31.

328. Крылов И.А., Маркина Н.С., Красноштанова A.A., Гунин В.А., Манаков М.Н. Выбор оптимальной схемы получения дрожжевой РНК в условиях современных биохимзаводов БВК и лизина. Биотехнология. - 1992. - №3. — С. 79 -82.

329. Дытнерский Ю.И., Баромембранные процессы. Теория и расчет. М.: Химия. 1986.-272 с.

330. Schroder С. а. о., "Progress in molecular and subcellular biology", 1985, v. 9, p. 53-103

331. Kobayashi Juataha, Kobayshi Rioko, Hirs C.H.W. Identification of zymogen E in a complex with bovine carboxypeptidase A. J. Biol.chem., - 1981. -V. 256(5). -p. 2466-2470.

332. Практикум по биохимии. //Под ред. C.E. Северина и Т.А.Соловьевой. -Изд-во Московского Университета. 1989 г. - 430 с.

333. Visser S., Slangen К. J., Alting А.С., Vzeeman H.J. Specifity of bovine plasmin in its action on bovine- casein.// J. Dairy Sci. 1981. - V.64. - №3. - p. 335 -339.

334. Пиментел Дж., Мак-Клеллан О., В. Водородная связь. М. - 1981. -290 с.

Информация о работе

Красноштанова, Алла Альбертовна
доктора химических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка научных основ технологии получения ферментативных гидролизатов биополимеров на основе отходов пищевой и микробиологической промышленности - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы