Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Технология приготовления сухих питательных основ для производства биоспорина

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Технология приготовления сухих питательных основ для производства биоспорина"

На правахрукописи

КОРОБЕЙНИКОВ АНДРЕЙ ЛЕОНИДОВИЧ

ТЕХНОЛОГИЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ СУХИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ ОСНОВ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА БИОСПОРИНА

03.00.23 - Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина МГАВМиБ) и Центре военно-технических проблем биологической за'щиты научно-исследовательского института микробиологии Министерства обороны Российской Федерации (ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Тихонов Игорь Владимирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Мирзаев Микаэль Нурбогандович; доктор биологических наук

Малик Нина Ивановна

Ведущая организация: ФГУП "Покровский завод биопрепаратов".

Защита состоится 17 ию,ня 2004 г. в 11.30 часов на заседании диссертационного совета Д-220.042.01 в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина по адресу: 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Тел. (095) 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии.

Автореферат разослан "17" мая 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Брылина В.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из эффективных пробиотиков для лечения ОКИ и дисбактериозов является биоспорин, выпускаемый Центром военно-технических проблем биологической защиты. За счет удачного сочетания в его составе свойств взаимодополняющих штаммов В.виЫШв ВКПМ №2335 (3) и В.И^еп1Гогт1в ВКПМ № 2336 (31) биоспорин обладает несомненными преимуществами перед другими пробиотиками, используемыми для профилактики и лечения ряда болезней человека и животных.

Экспериментально доказано, что стабильность культивирования споровых культур В.виЬШв и В.11^еп1^гт1в и свойств готового препарата в значительной степени зависят от стандартности питательных сред по биологическим и физико-химическим характеристикам. Возможность получения таких питательных сред определяется, прежде всего, стандартностью как используемого исходного сырья, так и технологией процесса их производства.

Одним из направлений решения данного вопроса является увеличение объема каждой серии выпускаемых жидких питательных основ с последующей их сушкой. Полученные таким образом питательные основы, кроме высокой стандартности, обладают продолжительным сроком годности и практически не меняют свои свойства в период гарантированного хранения.

Основные недостатки жидких питательных основ связаны с качеством исходного сырья и обусловлены изменением компонентного состава при длительном хранении в течение 3-6 месяцев Указанные питательные основы имеют ограниченные сроки хранения и требуют создания специальных условий (температурный режим (4+2) °С, использование большого количества тары, наличие холодильных камер и расход консерванта), а также значительные трудности при фильтрации и большой расход фильтрующего материала.

Данные обстоятельства потребовали усовершенствования технологии получения гидролизатов. Одним из методов, позволяющим на длительный период стабилизтровать свойства белковых питательных основ, является получение их в сухом виде.

В настоящее время наиболее эффективным способом высушивания различных растворов, суспензий, эмульсий и паст является сушка распылением. Использование данного метода обусловлено доступностью и относительной дешевизной аппаратурного оформления процесса сушки, высокой производительностью, экономичностью и незначительными физическими воздействиями на продукт при обезвоживании. Как правило, препараты, полученные с использованием данного метода сушки, обладают длительным сроком год-

ности, не требуют особых условий хранения, удобны в применении и имеют низкую себестоимость.

Таким образом, актуальность работы обусловлена необходимостью получения гидролизатов, имеющих длительные сроки хранения и обладающие необходимым для производства питательных сред стабильными ростовыми характеристиками.

Цель и задачи исследований. Целью научных исследований является разработка технологии получения и экспериментальное обоснование применения сухих питательных основ, используемых для приготовления питательных сред в производстве биоспорина.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Разработать технологию приготовления сухих гидролизатов казеина, соевой муки и мяса.

2. Провести комплексную оценку по физико-химическим и биологическим показателям сухих ПО.

3. Оценить воспроизводимость технологии получения сухих питательных основ, определить сроки их хранения.

4. Оценить возможность использования сухих питательных основ в производстве биоспорина.

5. Обосновать экономическую целесообразность внедрения разработанной технологии.

6. Разработать и утвердить нормативно-техническую документацию на производство и контроль питательных основ.

Научная новизна. Впервые в отечественной практике разработана технология получения сухого солянокислотного гидролизата соевой муки.

Сухие гидролизаты казеина, соевой муки и мяса крупного рогатого скота используются для производства биоспсрина.

Затраты на производство и хранение сухих гидролизатов в 2 раза ниже по сравнению с жидкими гидролизатами.

Научная новизна подтверждена решением Государственного патентного ведомства о выдаче патента на „Питательная среда для глубинного выращивания спор В.ап№гао1в вакцинного штамма СТИ-1, B.liоheniformis 31, В.виЬШв 3 и способ приготовления 3 %-го соля-нокислотного гидролизата соевой муки"

Практическая значимость. Использование метода распылительного высушивания в кипящем слое гранул инертного материала обеспечивает получение сухих питательных основ с необходимой дисперсностью и влажностью, что позволяет исключить стадию измельчения конечного продукта и гарантированно хранить данные сухие препараты в течение 3 лет.

Применение сухих питательных основ в технологии производства биоспорина позволяет получать готовые формы данного препарата с показателями качества, удовлетворяющими требования ФС.

Апробация работы. Материалы работы доложены на научно-практической конференции Центра ВТП БЗ НИИ МО РФ.

Основные положения, выносимые на защиту: " 1. Использование метода распылительного высушивания обеспечивает получение сухих питательных основ с необходимой дисперсностью и влажностью, что позволяет исключить стадию измельчения конечного продукта и гарантированно хранить данные сухие препараты в течение 3 лет;

2. В.виЬШв 3 и B.licheniformis 31, входящие в состав готовой лекарственной формы препарата биоспорин обладают высокой антагонистической активностью по отношению к возбудителям острых кишечных инфекций.

3. Применение сухих питательных основ в технологии производства биоспорина позволяет получать готовые формы данного препарата с показателями качества, удовлетворяющими требования ФС.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практическое использование полученных результатов исследований, список использованных источников.

Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, иллюстрирована 2 рисунками и 46 таблицами. Список использованной литературы включает 117 источников, из них 9 - зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Работа была выполнена на базе Центра военно-технических пoo-блем биологической защиты научно-исследовательского института микробиологии Министерства обороны Российской Федерации и кафедры биотехнологии Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина.

В процессе проведения исследований использовали споровые и вегетативные клетки непатогенных аэробных спорообразующих микроорганизмов В. subtilis ВКПМ В-2335 и В. licheniformis ВКПМ В-2336. Данные микроорганизмы с 1992 г. находятся в коллекции Центра ВТП БЗ НИИ микробиологии МО РФ и систематически репродуцируются. Указанные штаммы обладают типичными морфологическими, культу-ральными и биохимическими свойствами, характерными для данных

видов спорообразующих бацилл. Используемые микроорганизмы не обладают патогенностью для человека и животных.

В качестве посевного материала использовали паспортизованные культуры B.subtilis 3 и B.licheniformis 31. Оценка биологических и ростовых свойств ПС, приготовленных на основе гидролизатов соевой муки, казеина,мяса КРС, осуществлялась с помощью тех, же культур.

В работе использовали сырье, реактивы и материалы, прошедшие входной контроль и отвечающие требованиям действующих нормативных документов. Стандартные и модифицированные ПС готовили из следующих питательных основ: ферментативный гидролизат мяса, солянокислотный гидролизат соевой муки, солянокислотный гидролизат казеина.

Для приготовления гидролизатов использовали следующее сырье:

- говяжью вырезку, ГОСТ 779-87 или ГОСТ 4814-57, или МРТУ 180/190-65;

- соевую муку, ГОСТ 3898-56;

- казеин технический, ГОСТ 17626-81;

- поджелудочную железу, ГОСТ 11285-73;

- панкреатин, ГФ. - Изд. 9-е. - С. 353-354.

Кислотный гидролиз белкового сырья осуществляли в эмалированных реакторах вместимостью 0,3 и 0,15 м3; ферментативный- в нержавеющем аппарате вместимостью 1 м3. Осветление полученных гидролизатов проводили на воронках через ткань бельтинг. Исследуемые ПО сушили на установке распылительной сушки УСП-2.

Выращивание микроорганизмов проводили на качалках New Brunswick (США, модель G-53), ферментерах типа БИОР-0,1, БИОР-0,25.

В исследованиях использовали общепринятые в практике методы анализа физико-химических, биохимических и биологических характеристик микроорганизмов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Получение сухих питательных основ

В основу технологии обезвоживания гидролизатов был положен метод распылительной сушки в кипящем слое гранул инертного материала. В ходе исследований было смонтировано оборудование и АТЛ производства сухих ПО, которые прошли индивидуальные испытания и комплексное опробывание.

Проведенные предварительные эксперименты по обезвоживанию питательных основ позволили значительным образом сузить спектр контролируемых параметров, влияющих на высушивание гидроли-затов. Так, существующие специфические особенности процесса

6

распылительной сушки на установке УСП-2, заключающиеся в том, что в течение сушки невозможно варьировать массой инертного наполнителя, регулировать скорость подачи теплоносителя, исключили последние из числа управляемых факторов технологического процесса. Кроме того, такой показатель, как температура отработанного воздуха, является зависимым от количества продукта, подаваемого на сушку, что также ограничило число варьируемых факторов.

На основании вышеизложенного были выбраны два основных значимых варьируемых параметра, которые позволяют в полном объеме управлять технологическим процессом сушки на установке УСП-2. К ним следует отнести температуру сушильного агента и скорость подачи препарата на сушку.

Учитывая то, что на сегодняшний день в технологии производства биоспорина для приготовления плотных и жидких питательных сред используют ферментативный гидролизат говяжьего мяса, кислотный гидролизат соевой муки и кислотный гидролизат казеина, полученные различными способами расщепления белка и отличающимися по конечному составу, рассмотрели процесс обезвоживания данных гидролизатов на установке УСП-2 отдельно.

Проведенные предварительные эксперименты показали, что кислотный гидролизат казеина, полученный по регламентной прописи и имеющий водородный показатель меньше 4,0 ед.рН, трудно поддается высушиванию на данной установке, т.к. вызывает слипание инертного материала, что в свою очередь ведет к невозможности дальнейшего проведения процесса сушки. Кроме того, после сушки кислотного гидролизата казеина с таким значением водородного показателя в дальнейшем требуется проводить корректировку его кислотности в готовой питательной среде, при этом выпадает обильный осадок и среду приходится дополнительно фильтровать.

С целью определения оптимального диапазона водородного показателя в высушиваемом кислотном гидролизате был поставлен ряд опытов по обезвоживанию ПО с различными значениями водородного показателя. Результаты экспериментов показали, что оптимальный рН обезвоживаемого гидролизата казеина, с учетом последующей регидратации и приготовления питательной среды, составил 7,0-7,2 ед.рН. Исследования по определению оптимального водородного показателя ферментативного гидролизата говяжьего мяса показали, что данная основа хорошо высушивается при величине рН, получаемой в конце процесса гидролиза, и соответствует 7,0-7,5 ед.рН. Кислотный гидролизат соевой муки подщелачивают до значения рН; равного 7,2-7,5 ед.рН, нагревают до кипения и

фильтруют через бельтинг. Распылительная сушка питательной основы, подготовленной вышеуказанным способом, не вызывает затруднений. *

Для достижения наибольшей производительности установки представлялось целесообразным вести технологический процесс при максимальной температуре теплоносителя. Однако проведенное изучение термоустойчивости образцов сухих ПО показало, что повышение температуры теплоносителя выше 125°С может вызвать частичное разложение белковых гидролизатов и соответственно изменить их качественные характеристики. По этой причине за оптимальную температуру сушильного агента была принята температура 120-125°С.

Для определения расхода гидролизатов, подаваемых на сушку, был проведен ряд экспериментов с варьированием количества жидких питательных основ от 4 до 12 дм3 в час. .

В результате исследований интенсифицирован процесс подготовки жидких гидролизатов к высушиванию, установлены наиболее приемлемые параметры процесса обезвоживания, позволяющие достигнуть максимального выхода продуктов по сухому весу.

Технологические параметры обезвоживания КГСМ, ФГМ и КГК представлены в табл. 1.

1. Технологические параметры обезвоживания КГСМ, ФГМ, КГК

Питательная основа Температура теплоносителя, °С Температура отработанного теплоносителя, "С Скорость подачи ПО на сушку, дм'-ч'1

ФГМ 120-125 92-98 8-10

КГСМ 120-125 98-104 6-8

КГК 120125 100-106 6-8

Технологические параметры обезвоживания КГСМ, ФГМ, КГК при температуре теплоносителя 120-125 °С следующие: для ферментативного гидролизата говяжьего мяса, скорость подачи гидролизата 8-10 дм3чм1; кислотного гидролизата соевой муки и кислотного гидролизата казеина, скорость подачи гидролизата6-8 дм3ч'\

По установленным режимам обезвоживания получили экспериментальные серии распылительно высушенных питательных основ.

Сравнительное изучение физико-химических показателей качества экспериментальных сухих питательных основ с существующими аналогами

Для проведения комплексной оценки показателей качества сухих гидролизатов экспериментальные образцы сухих питательных основ сравнивали с их аналогами, полученными по регламентной технологии, по физико-химическим и биологическим свойствам.

8

Известно, что смесь аминокислот, пептидов и полипептидов, а также нерастворимых остатков, образующаяся при ферментативном и кислотном гидролизе белков, определяется разнообразием активных компонентов, содержащихся в комплексных ферментных препаратах, и условиями кислотного гидролиза. В этой связи, был исследован компонентный (аминокислотный, пептидный и минеральный) состав сухих ПО из ФГМ, КГК, КГСМ.

Для исследования аминокислотного и пептидного состава в сухих образцах ПО, полученных распылительным высушиванием, был использован метод высокоэффективной хроматографии. Анализ полученных результатов показал, что сухие ФГМ, КГК и КГСМ являются полноценными основами для приготовления питательных сред, содержат весь определяемый спектр аминокислот, а пептидный и минеральный состав незначительно отличаются от жидких ПО.

Оценку качества сухих гидролизатов проводили по следующим физико-химическим показателям: концентрация водородных ионов, содержание общего и аминного азота. Данные сравнительного анализа сухих образцов ПО и их жидких аналогов представлены в табл. 2.

2. Сравнительная характеристика жидких и сухих ПО по физико-химическим показаетлям

Наименование РН Общий азот, мг% Аминный азот, мг% Триптофан, мг% Хлориды, %

Кислотный гид эолизат казеина

Требование НД 7,0+0,5 2200+200 1600+200 - -

Жидкий 7,1+0,3 2350+50 1660+70 - -

Сухой 7,0+0,4 2320+40 1430+30 - -

Кислотный гидролизат соевой муки

Требование НД 7,0+0,5 850+50 440+40 - -

Жидкий 7,2+0,2 870+30- 460+20 - -

Сухой 7,3+0,1 860+20 420+20 - -

Ферментативный гидролизат мяса

Требование НД 7,0+0,5 1000+100 600+100 250+50 не более 0,5

Жидкий 7,3+0,2 1050+50 650+40 270+20 0,3+0,1

Сухой 7,2+0,2 1070+30 590+30 220+10 0,3+0,1

Исходя из данных табл. 2 видно, что показатели качества сухих ПО в сравнении с жидкими аналогами изменяются в пределах требований НД.

По данным проведенных исследований, можно сделать вывод, что сухие гидролизаты являются полноценными основами для приготовления ПС, которые имеют в своем составе все факторы роста, необходимые для выращивания В.виЬШв 3 и В.11^еп^огт1в 31.

Для сравнительной оценки качества экспериментальных сред на основе сухих КГК, КГСМ и ФГМ по биологическим показателям про-

вели пробное культивирование выбранных микроорганизмов. Данные среды по показателям чувствительности, скорости роста и эффективности практически не отличаются от сред сравнения, а иногда и превосходят их. Таким образом, полученные ПС могут быть использованы для получения посевного материала и глубинных культур B.subtilis 3 и В. licheniformis 31.

Воспроизводимость технологии получения сухих питательных основ

Воспроизводимость технологии получения сухих ПО оценивали посредством наработки и изучения характеристик их контрольных серий.

С этой целью были приготовлены три контрольные серии сухих ПО из КГК, КГСМ и ФГМ. Приготовление ПО осуществляли на созданной АТЛ по режимам, изложенным в проектах ЭПР. Характеристики контрольных серий ПО представлены в табл. 3.

3. Характеристика контрольных серий сухих ПО

Наименование показателя Требования проекта ТУ Значение показателей серии

1 2 3

1 2 3 4 5

СУХАЯ ПО ИЗ КГК

Внешний вид Мелкодисперсный, гомогенный порошок темно-коричневого цвета. Гигроскопичен Соответствует Соответствует Соответствует

Растворимость 2 г препарата должны растворяться в течение 2 мин в 98 см3 дистиллированной воды при кипячении Соответствует Соответствует Соответствует

Прозрачность и цветность 2%-й раствор препарата прозрачный, темно-коричневого цвета Соответствует Соответствует Соответствует

Содержание общего азота, мг% 2200+200 2120 2240 2270

Содержание амин-ного азота, мг% 1600+200 1590 1620 1680

Потери в массе при зысушивании, %, не более 5,0 2,3 2,8 2,5

Водородный показатель, ед.рН 7,0+0,5 6,5 6,6 6,5

Чувствительность, наибольшее разведение, обеспечивающее визуально видимый рост микроорганизма ю-' Соответствует Соответствует Соответствует

1 2 3 4 5

Скорость роста гест-штамма, ч 24 Соответствует Соответствует Соответствует

Эффективность, кратность увеличения оптической плотности Увеличение оптической плот ности на 24 ч инкубации должно быть не менее, чем е 2-3 раза по отношению к ис ход ной культуре Соответствует Соответствует Соответствует

СУХАЯ ПО ИЗ КГСМ

Внешний вид Мелкодисперсный, гомогенный порошок темно-коричневого цвета. Гигроскопичен Соответствует Соответствует Соответствует

Растворимость 2 г препарата должны растворяться в течение 2 мин в 98 см3 дистиллированной воды при кипячении Соответствует Соответствует Соответ-стаует

Потери в массе при высушивании, %, не более 5,0 2,7 2,8 2,5

Содержание общего азота, мг% 850+50 855 860 840

Содержание амин-ного азота, мг% 440+40 450 465 420

Водородный показатель, ед рН 7,0+0,5 6,5 6.6 6,6

Чувствительность, наибольшее разведение, обеспечивающее визуально видимый рост микроорганизма 10* Соответствует Соответствует Соответствует

Скорость роста тест-штамма, ч 24 Соответствует Соответствует Соответствует

Эффективность, кратность увеличения оптической плотности Увеличение оптической плотности на 24 ч инкубации должно быть не менее, чем в 2-3 раза по отношению к исходной культуре Соответствует Соответствует Соответствует

СУХАЯ ПО ИЗ ФГМ

Внешний вид Гомогенный, мелкодисперсный порошок светло-желтого цвета. Гигроскопичен Соответствует Соответствует Соответствует

Растворимость 2 г препарата должны растворяться в течение 2-мин в 98 см9 дистиллированной воды при кипячении Соответствует Соответствует Соответствует

Прозрачность и цветность 2%-й раствор препарата прозрачный, светло-соломенного цвета Соответствует Соответствует Соответствует

1 2 3 4 5

Потери в массе при высушивании, %, не более 5,0 2,2 1.9 2,0

Содержание общего азота,мг% 1000+100 1050 1100 1090

Содержание амин-ного азота, мг% 600+100 690 685 693

Содержание триптофана, мг% 250+50 270 275 260

Содержание хлоридов, не более, % 0,5 0,45 0,40 0,43

Водородный показатель, ед рН 7,0+0,5 6,8 6,5 6.5

Чувствительность, наибольшее разведение, обеспечивающее визуально видимый рост микроорганизма 10-8 Соответствует Соответствует Соответствует

Скорость роста гест-штамма, ч 24 Соответствует Соответствует Соответствует

Эффективность, число микробных тел в 1 смЗ среды В.виЬМю 3 В (юЬеп^оггтз 31 0,6* 109 1,0*109 Соответствует Соответствует Соответствует

Из данных табл. 3 следует, что все контрольные серии сухих ПО отвечали требованиям НД.

Таким образом, полученные результаты явились основанием для заключения об удовлетворительной воспроизводимости технологических процессов и параметров получения сухих ПО по физико-химическим и биологическим показателям.

Оценка возможности использования сухих питательных основ в производстве биоспорина Одним из наиболее ответственных и трудоемких этапов исследований, в ходе которых в реальных условиях проверялись ростовые свойства питательных сред на основе сухих ПО, являлось культивирование Б.виЫШв 3 и В.lichemformis 31 в ферментерах вместимостью 0,25 и 0,1 м3.

В ходе исследований были изучены жидкие среды (прописи №№ 4Э, 5Э, 6Э, 7Э) на основе сухих КГК и КГСМ, которые являются аналогами существующих ПС и могут быть использованы для выращивания Вsubtilis 3 и B.licheniformis 31 глубинным способом в производственных условиях. В качестве сред сравнения были использованы регламентные среды (прописи №№ 4,5,6,7) на основе жидких КГК и КГСМ.

Культивирование в аппаратах осуществляли при температуре 37°С в течение 36-39 ч до получения в КЖ 40-50 % свободных зрелых спор по микроскопической картине мазка. Выходные параметры КЖ Б. виЬИИв 3 и В. licheniformis 31, полученные на экспериментальных и контрольных средах, представлены в таблице 4.

Анализ результатов, представленных в таблице 4, показывает, что показатели качества КЖ B.subtilis 3 и Б. licheniformis 31, полученные как на средах, содержащих сухие ПО, так и на регламентных средах, не имели достоверных отличий.

Характеристики контрольных серий биоспорина, полученных на экспериментальных питательных средах представлены в таблице 5. Приведенные данные показывают, что показатели качества контрольных серий препарата отвечают требованиям ФС.

Таким образом, результаты исследований свидетельствуют, что технология производства сухих ПО на созданной АТЛ воспроизводима и обеспечивает получение конечных препаратов с заданными свойствами.

4. Сравнительная характеристика КЖ, полученных при глубинном выращивании B.subtilis 3 ив. licheniformis 31

Условное обозначение ПС Характеристика конечных КЖ

ок, млрд. спор БК, млрд.спор Тм, % рН, ед. рН ОП, ед. ОП

Сухой КГСМ

В виЬЫя 3 в БИОР - 0,25

№ 5Э - из сухого КГСМ № 5 - контроль 3,00+1,06 2,56+1,37 2,25+1,22 1,89+0,38 63,20+8,70 60,60+10,10 6,50+0,49 5,93+0,33 3,17+0,52 2,76+0.40

В. //сЛего/сэтл« 31 в БИОР - 0,1

№ 6Э - из сухого КГСМ № 6 - контроль 7,18+2,71 6,91+2,13 4,22+0,53 3,88+0,27 44,00+2,00 54,50+4,50 7,70+0,36 7,48+0,49 5.83+0,32 5,23+0,49

Сухой КГК

В.виЫЛэ 3 в БИОР - 0,25

N2 4Э - из сухого КГК № 4 - контроль 2,34+0,31 2,43+0,22 1,19+0,15 1,06+0,21 4,68+0,53 5,66+0,04 7,15+0,15 6,70+0,25 2,36+0,23 2,50+0,36

В. //сЛего/олтаз 31 в БИОР - 0,1

№ 7Э - из сухого КГК № 7 - контроль 5,34+0,71 7,16+0,28 3,99+0,38 4,08+0,53 46,81+8,57 52,66+7,89 7,50+0,50 7,50+0,50 5,74+0,58 4,36+0,36

5. Показатели качества контрольных серий биоспорина

Показатель качества Серия п репэрата

1 2 3 4 5 6

pH, ед. pH 5,5-8,0 6,0 6,0 6,2 6,9 6,9 7,1

БК, млрд спор в дозе:

B.subtilis3 1,0-8,0 3,1 4,2 3,6 2,2 2,5 2,9

В lichemformis 31 0,1-2,0 1,0 1,0 1,3 0,7 0,8 1.1

Антагонистическая активность

(зона угнетения роста тест-культуры), мм

S. sonnei 5063 Не менее 10 15 14 15 15 15 15

S. typhimureum 55 Не менее 10 13 13 15 14 14 14

S. aureus 209 Не менее 15 21 23 22 24 25 26

С. albicans 2401 Не менее 12 24 25 25 28 28 29

Экономическая целесообразность полученных результатов

Рассчитали производственную мощность существующей аппара-турно-технологической линии по производству сухих гидролизатов. Определили, что производственная мощность составляет для сухого ферментативного гидролизата говяжьего мяса 406 кг, кислотного гидролизата соевой муки 1480 кг и кислотного гидролизата казеина 1350 кг при круглосуточной работе сушильного оборудования. Наработка сухих ПО в течение 1,5 месяцев обеспечивает производство биоспорина качественными питательными средами на протяжении 3 лет. Для оценки экономической целесообразности разработанной технологии рассчитали сметную себестоимость жидких ПО с учетом затрат на хранение и сухих гидролизатов. Приготовленные жидкие ПО используются по мере необходимости и нуждаются в консервации хлороформом и особых условиях хранения (температурный режим (4+2) °С), что значительно сказывается на себестоимости гидролизатов. На диаграмме (рисунок) видно, что стоимость сухих ФГМ, КГСМ и КГК сопоставима со стоимостью жидких ПО, хранившихся в течение 3 месяцев, и ниже стоимости жидких ПО после 6 месяцев хранения.

ФГМ кгсм кгк

ЕРЯД1 _ жидкая ПО

НРяд2 — жидкая ПО после 3 месяцев хранения ИРядЗ — редкая ПО после 6 месяцев хранения

,ВРад4 - сУхаяП0

Рис. Сравнительная оценка себестоимости сухих и жидких ПО после хранения

Определение срока хранения сухих питательных основ

На заключительном этапе работы определили условия хранения и срок годности сухих ФГМ, КГК и КГСМ по методу "ускоренного старения", который основан на увеличении скорости протекания химических процессов в сухих ПО при повышенной температуре.

С этой целью экспериментальные серии сухих образцов в количестве 200 г были расфасованы в двойные пакеты из полиэтиленовой пленки, герметично термосварены и помещены в термостат с температурой 50 °С. Качество экспериментальных серий ПО, заложенных на хранение при повышенной температуре, оценивали по физико-химическим и биологическим показателям. Результаты эксперимента представлены в табл. 6.

Дата проверю* Физико-химические показатели Биологические показатели

рН. ед.рН амин-ный азот, мг% общий азот, мг% чувствительность (степень разведение ПС) скорость роста гест-ияамма, ч эффективность (кратность увеличения ОП)

Сухой КГСМ

Т эебования НД

7,0+0,5 440+40 850+50 не менее 10"8 не более 24 Изменение ОП за 24 ч не менее чем в 2-3 раза к исходной культуре

Показатели качества экспериментальной серии

6.03.03 7,2 445 860 10' 24 2

6.06 03 7,1 417 850 10» 24 2

7.09 03 7,0 413 820 10" 24 2

4.12.03 6,9 391 780 10» 24 2

Сухой ФГМ

т эебования НД

7,0+0,5 600+ 100 1000+ 100 не менее 10"» не бо-лее24 не менее 1 млрд м.к.

Показатели качества экспериментальной серии

6 03.03 7,5 644 1092 10" 24 1,2

6.06.03 7,3 634 1021 10* 24 1,2

7.09.03 7,0 600 959 10е 24 1,1

4.12.03 6,9 577 902 10" 24 1,0

Сухой КГК

Т эебования НД

7,0+0,5 1600+ 200 2200+ 200 не менее 10'8 не более 24 Изменение ОП за 24 ч не менее чем в 2-3 раза к исходной культуре

Показатели качества экспериментальной серии

3.03 03 7,2 1650 2255 10 24 3

6.06 03 7,2 1605 2235 10 е 24 3

7.09.03 7.0 1525 2120 10° 24 3

4.12.03 6.7 1385 1990 10" 24 3

Анализ данных таблицы 6 показывает, что исследуемые свойства всех серий сухих КГСМ и КГК соответствовали требованиям НД на протяжении 9 месяцев, а ФГМ - 10 месяцев экспериментального хранения. Расчет срока годности проводили по известной формуле и установили, что он соответствует 3 годам.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология получения сухих питательных основ, используемых в производстве биоспорина, методом распылительного высушивания на установке УСП-2: ферментативный гидролизат мзса;

кислотный гидролизат казеина; кислотный гидролизат соевой муки. Определены параметры проведения процесса высушивания ферментативных и кислотных гидролизатов. Для ферментативного гидролизата мяса, солянокислотного гидролизата казеина и кислотного гидролизата соевой муки температура теплоносителя составляет 120-125 °С; скорость подачи продуктов на сушку 8-10 дм ч для ФГМ и 6-8 дм ч для КГК и КГСМ.

2. Сухие ФГМ, КГК и КГСМ по физико-химическим и биологическим показателям являются полноценными питательными основами и применяются для приготовления питательных сред, используемых для глубинного культивирования В.виЬТШв 3 и В.!1сЬепйогт1в 31.

3. Результаты контроля качества питательных сред, приготовленных на основе жидких и сухих кислотных гидролизатов, свидетельствуют о сравнимости биологических показателей. Рост и спорообразование В.виЬТШв 3 и В.ИсЬеп1^гт1в 31 на питательных средах, содержащих сухие ФГМ, КГК и КГСМ, аналогичны тем же показателям на средах из жидких гидролизатов.

4. Микроорганизмы В.виЫШв 3 и В.ИсЬеп1^гт1в 31, входящие в состав готовой лекарственной формы препарата биоспорин, полученные глубинным культивированием на питательных средах с использованием сухих ФГМ, КГСМ и КГК, обладают высокой антагонистической активностью к возбудителям ОКИ и соответствуют требованиям нормативных документов.

5. Затраты на производство и хранение сухих гидролизатов в 2, 7 раза ниже по сразнению с жидкими гидролизатами, имеющими сроки годности 6 месяцев. Сухие гидролизаты ФГМ, КГСМ и КГК сохраняют ростовые свойства в течение 3-х лет хранения при температуре 18+2°С.

6. Проведена технико-экономическая оценка получения сухих питательных основ по разработанной технологии. Показано, что сметная себестоимость гидролизатов, обезвоженных распылительным методом, сопоставима со стоимостью жидких питательных основ, хранившихся в течение 3 месяцев, и значительно ниже их стоимости после 6 месяцев хранения.

7. Приготовлена и утверждена установленным порядком нормативно-техническая документация на производство и контроль сухих питательных основ для выпуска биоспорина.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты исследований реализованы разработкой, согласованием и утверждением следующей нормативно-технологической документации:

- временные технические условия на ферментативный гидролизат говяжьего мяса сухой (Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. № Д-602);

- временные технические условия на кислотный гидролизат соевой муки сухой (Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. № Д-604);

- временные технические условия на солянокислотный гидролизат казеина сухой (Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. № Д-603);

- ведомость изменений к регламенту производства Рп № Д-326 "Биоспорин" (Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. № Д-542);

- инструкция по приготовлению и контролю качества ферментативного гид-

ролизата говяжьего мяса сухого (Арх ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ - № Д-608),

- инструкция по приготовлению и контролю качества кислотного гидроли-зата соевой муки сухого (Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. № Д-607);

- инструкция по приготовлению и контролю качества солянокислотного гидролизата казеина сухого (Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. № Д-609);

- экспериментально-производственный регламент "Питательная основа из ферментативного гидролизата говяжьего мяса сухая (Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. № Д-539);

- экспериментально-производственный регламент "Питательная основа из солянокислотного гидролизата казеина сухая" (Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. -Инв. №Д-541),

- экспериментально-производственный регламент "Питательная основа из кислотного гидролизата соевой муки сухая" (Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. -Инв. № Д-536).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рогожин А.З., Васильев П.Г., Тихонов И.В., Грязнева Т.Н., Лиморен-. ко А.П., Волков М.Ю., Коломейцев А.В., Коробейников А.Л., Гулькова О.В.,

Сирик М.С., Вишняков А.В. Разработка технологии получения сухих питательных сред в различных формах для использования в производстве препарата "БИОД-5" // Сборник научных тудов, посвященных 75-летию НИИ микробиологии МО РФ, 2003. - С. 164-165.

2. Рогожин А.З., Васильев П.Г., Тихонов И.В., Грязнева Т.Н., Лиморен-коА.П., Маслов СП., Коломейцев А.В., Коробейников А.Л., Гулькова О.В., Сирик М.С., Вишняков А.В. Экспериментальное обоснование возможности использования сухих ПС в производстве препарата "БИОД-5" // Сборник научных тудов, посвященных 75-летию НИИ микробиологии МО РФ, 2003. - С. 165-166.

3. Лиморенко А.П., Рогожин А.З., Коробейников А.Л., Петрякова Г.В. Оценка возможности использования сухих питательных сред а производстве биоспорина // Ветеринарная медицина, 2002, №1.-С. 16.

4. Грязнева Т.Н., Рогожин А.З., Коробейников А.Л., Васильев П.Г., Лимо-ренко А.П., Гулькова О.В. Экспериментальное обоснование использования сухих питательных сред в производстве препарата "БИОД-5" // Ветеринарная медицина, 2003, №3. - С 14-15.

5. Грязнева Т.Н., Рогожин А.З., Коробейников А.Л., Васильев П.Г., Л к морен ко А.П., Гулькова О.В., Коломейцев А.В. Разработка технологии получения сухих питательных сред в порошковой, гранулированной и таблетированной формах для использования в производстве препарата "БИОД-5" // Ветеринарная медицина, 2003, №3. - С 16-17.

6. Рогожин А.З., Лиморенко А.П., Васильев П.Г., Коробейников А.Л. и др. Создание аппаратурно-технологической линии приготовления сухих питательных основ для производства биоспорина /Отчет о НИР ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ, 2001. -Арх. НИР ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. № 347.

Сдано в производство 14.05.2004 г. Ризограф Тираж 100 Заказ <89

Издательско-полиграфический отдел ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина.

109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23

- 06 3*

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Коробейников, Андрей Леонидович

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,

СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Питательные потребности B.subtilis 3, B.licheniformis 31 как основа для разработки питательных основ и сред.

1.2 Современные методы высушивания термолабильных нутриентов.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Выбор направления исследований.

2.2 Материалы и методы исследований.

2.2.1 Микроорганизмы.

2.2.2 Питательные среды, растворы и реактивы.

2.2.3 Методы исследований.

2.3 Результаты исследований.

2.3.1 Разработка технологии получения сухих гидролизатов казеина, соевой муки и мяса методом распылительной сушки.

2.3.1.1 Экспериментальное обоснование способа подготовки гидролизатов к сушке.

2.3.1.2 Отработка режимов обезвоживания питательных основ на

4 распылительной установке.

2.3.2 Комплексная оценка показателей качества сухих питательных основ

2.3.2.1 Изучение физико-химических свойств экспериментальных образцов 61 сухих питательных основ.

2.3.2.2 Сравнительное изучение физико-химических показателей качества экспериментальных сухих питательных основ с существующими аналогами.

2.3.2.3 Изучение ростовых свойств сухих гидролизатов при глубинном вы-ращивани культур B.subtilis 3 и B.licheniformis 31.

2.3.3 Оценка воспроизводимости технологии получения сухих питательных основ.

2.3.4 Применение полученных сухих питательных основ в производстве биоспорина.

2.3.5 Расчет экономической целесообразности получения сухих питательных основ.

2.3.6 Определение длительности хранения питательных основ.

3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4 ВЫВОДЫ.

5 ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Технология приготовления сухих питательных основ для производства биоспорина"

В последние годы в РФ и ближнем зарубежье сложилась сложная экономическая ситуация, вызвавшая снижение жизненного уровня населения, и как следствие, ухудшение эпидемической обстановки. Наблюдается также нарастание неблагоприятных изменений в экологической сфере. Их следствием является увеличение числа инфекционных, аллергических и других заболеваний среди населения /35/.

В связи с вышесказанным профилактика и лечение инфекционных заболеваний и дисбактериозов в настоящее время и на ближайшую перспективу являются приоритетными задачами в медицинской и ветеринарной практике. Их решение возможно только при условии реализации комплекса соответствующих противоэпидемических, противоэпизотических, санитарно-гигиенических и других мероприятий, включая разработку, серийное производство и внедрение в практику новых высокоэффективных лечебно-профилактических препаратов, в том числе пробиотиков.

Одним из эффективных пробиотиков является биоспорин, выпускаемый Центром ВТП БЗ НИИ микробиологии МО РФ /106, 107/. За счет удачного сочетания в его составе свойств взаимодополняющих штаммов B.subtilis ВКПМ № 2335 (3) и B.licheniformis ВКПМ № 2336 (31) биоспорин обладает несомненными преимуществами перед другими пробиотиками, используемыми для профилактики и лечения ряда заболеваний человека и животных. Высокая антагонистическая активность по отношению к широкому кругу возбудителей острых кишечных инфекций (ОКИ), а также выраженность иммуномодули-рующего эффекта его действия позволяет с успехом применять биоспорин в качестве лечебно-профилактического средства в период роста заболеваний ОКИ в экологически, эпизоотологически и эпидемиологически неблагоприятных регионах.

Экспериментально доказано /1/, что стабильность культивирования споровых культур B.subtilis 3 и B.licheniformis 31 и свойств готового препарата в значительной степени зависят от стандартности питательных сред по биологическим и физико-химическим характеристикам. Возможность получения таких питательных сред определяется, прежде всего, стандартностью как используемого исходного сырья, так и технологией процесса их производства.

Одним из направлений решения данного вопроса является увеличение объема каждой серии выпускаемых жидких питательных основ с последующей их сушкой. Полученные таким образом ПО, кроме высокой стандартности, обладают продолжительным сроком годности и практически не меняют свои свойства в период гарантированного хранения.

Жидкие солянокислотные гидролизаты казеина и соевой муки, применяемые в настоящее время в технологии производства биоспорина в соответствии с регламентом производства /106, 107/, имеют существенные недостатки.

К основным из них относятся нестабильность исходных компонентов при длительном хранении и ограниченные сроки их использования, что является следствием неустойчивости органической системы, к которой относятся белковые гидролизаты и необходимость создания специальных условий хранения (температурный режим (4+2) °С, использование большого количества тары, наличие холодильных камер и расход консерванта).

Помимо вышеуказанных недостатков, отрицательными сторонами в технологии получения жидких гидролизатов казеина и соевой муки, используемых для приготовления нативных споровых культур, являются значительные трудности при фильтрации: плохая фильтруемость, большой расход фильтрующего материала и отсутствие стадии деионизации.

Данные обстоятельства требуют усовершенствования технологии получения гидролизатов казеина и соевой муки, последующее высушивание которых должно увеличить срок хранения ПО до 3-5 лет.

В настоящее время наиболее эффективным способом обезвоживания различных растворов, суспензий, эмульсий и паст является сушка распылением, получившая достаточно широкое применение в биотехнологии. Данный метод обезвоживания обладает рядом специфических особенностей и преимуществ перед другими существующими методами /12, 45/.

За рубежом это направление давно уже оценено по достоинству. Работают крупные фирмы, производящие сухие среды разнообразного характера и применения. Однако перечень выпускаемых в нашей стране сухих сред невелик, что обусловлено отсутствием специального оборудования для сушки ПО и сред, а существующие технологии отличаются сложностью и многостадийно-стью.

Таким образом, актуальность работы обусловлена необходимостью получения гидролизатов с длительным сроком хранения необходимых для производства ПС со стабильными ростовыми характеристиками.

Целью научных исследований является разработка технологии получения и экспериментальное обоснование применения сухих питательных основ, используемых для приготовления ПС в производстве биоспорина.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие основные задачи:

1. Разработать технологию приготовления сухих гидролизатов казеина, соевой муки и мяса.

2. Провести комплексную оценку по физико-химическим и биологическим показателям сухих ПО.

3. Оценить воспроизводимость технологии получения сухих питательных основ, определить сроки их хранения.

4. Оценить возможность использования сухих питательных основ в производстве биоспорина.

5. Обосновать экономическую целесообразность внедрения разработанной технологии.

6. Разработать и утвердить нормативно-техническую документацию на производство и контроль питательных основ.

Научная новизна работы состоит в том, что:

- впервые в отечественной практике разработана технология получения сухого солянокислотного гидролизата соевой муки;

- сухие гидролизаты казеина, соевой муки и мяса крупного рогатого скота используются для производства биоспорина.

- затраты на производство и хранение сухих гидролизатов в 2,7 раза ниже по сравнению с жидкими гидролизатами.

Научная новизна подтверждена решением Государственного патентного ведомства о выдаче патента на „Питательная среда для глубинного выращивания спор B.anthracis вакцинного штамма СТИ-1, B.licheniformis 31, B.subtilis 3 и способ приготовления 3 %-го солянокислотного гидролизата соевой муки" /72/.

На защиту выносятся следующие основные научные положения и результаты:

- использование метода распылительного высушивания в кипящем слое гранул инертного материала обеспечивает получение сухих питательных основ с необходимой дисперсностью и влажностью, что позволяет исключить стадию измельчения конечного продукта и гарантированно хранить данные сухие препараты в течение 3 лет;

- B.subtilis 3 и B.licheniformis 31, входящие в состав готовой лекарственной формы препарата биоспорин обладают высокой антагонистической активностью по отношению к возбудителям острых кишечных инфекций.

- применение сухих питательных основ в технологии производства биоспорина позволяет получать готовые формы данного препарата с показателями качества, удовлетворяющими требования ФС.

Полученные результаты реализованы в следующих документах:

Инструкция по приготовлению и контролю качества ферментативного гидролизата говяжьего мяса сухого (Арх. ЦВТП БЗ. - Инв. № Д-608, 2001).

Инструкция по приготовлению и контролю качества солянокислотного гидролизата казеина сухого (Арх. ЦВТП БЗ. - Инв. № Д-609,2001).

Инструкция по приготовлению и контролю качества солянокислотного гидролизата соевой муки сухого (Арх. ЦВТП БЗ. - Инв. № Д-607, 2001).

Временные технические условия "Ферментативный гидролизат говяжьего мяса сухой" (Арх. ЦВТП БЗ. - Инв. № Д-602,2001).

Временные технические условия "Солянокислотный гидролизат казеина сухой" (Арх. ЦВТП БЗ. - Инв. № Д-603, 2001).

Временные технические условия "Кислотный гидролизат соевой муки сухой" (Арх. ЦВТП БЗ. - Инв. № Д-604,2001).

Экспериментально-производственный регламент "Сухая питательная основа из ферментативного гидролизата говяжьего мяса " (Арх. ЦВТП БЗ. - Инв. № Д-539, 2001).

Экспериментально-производственный регламент "Сухая питательная основа из солянокислотного гидролизата казеина" (Арх. ЦВТП БЗ. - Инв. № Д-541,2001).

Экспериментально-производственный регламент "Сухая питательная основа из кислотного гидролизата соевой муки" (Арх. ЦВТП БЗ. - Инв. № Д-536, 2001).

Изменения и дополнения к проекту экспериментально-производственного регламента "Биоспорин сухой" (Арх. ЦВТП БЗ. - Инв. № Д-542, 2001).

Автор лично участвовал в планировании и проведении экспериментов по оптимизации режимов обезвоживания питательных основ, изучению физико-химических свойств гидролизатов, разработке нормативной документации на приготовление и контроль сухих питательных основ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Коробейников, Андрей Леонидович

2.3 Результаты исследований

2.3.1 Разработка технологии получения сухих гидролизатов казеина, соевой муки и мяса методом распылительной сушки

С целью разработки технологии получения сухих гидролизатов методом распылительного высушивания представлялось целесообразным изучить технологические свойства материалов как объектов сушки, выбрать способ и обосновать режимы их обезвоживания, при условии получения в конечной стадии качественных питательных сред, не уступающих по физико-химическим и биологическим показателям аналогичным средам на основе жидких гидролизатов.

2.3.1.1 Экспериментальное обоснование способа подготовки гидролизатов к сушке

В соответствии с требованиями регламента на производство биоспорина ПС, используемые в его производстве, за исключением агаровых, должны быть прозрачными и не содержать нерастворимого осадка. В свою очередь прозрачность ПС находится в непосредственной зависимости от свойств ПО, идущих на их приготовление. В этой связи считалось целесообразным провести исследования по выбору и обоснованию способов осветления жидких гидролизатов, а следовательно, и подготовке их к сушке.

Качество белковых гидролизатов в значительной степени обусловливается выбранным способом проведения гидролиза и степенью последующей очистки получаемого гидролизата /58/.

В зависимости от вида использованных субстратов, ферментов, способа гидролиза и необходимой степени конверсии белка требуется более простая или более сложная очистка продуктов /55/.

Кислотный гидролиз относится к химическому способу переработки белкового сырья /32/. Проводят его, как правило, при нагреве до (120-130 °С) и избыточном давлении (0,2-0,3 МПа) /2/. Чаще всего для проведения гидролиза данным способом используют серную или соляную кислоты различных концентраций /32/, в некоторых случаях применяют ортофосфорную, уксусную или смеси кислот. При этом продолжительность процесса варьирует от 1 до 6 часов /2/.

В случае кислотного гидролиза белковые гидролизаты наряду со свободными аминокислотами и пептидами содержат соли минеральных и органических кислот, амины, окрашенные смолообразные примеси (меланоидные компоненты) и другие остатки клеточных биополимеров и продуктов их деградации /57/.

Сопряженные ненасыщенные системы, сорбируясь на клеточной стенке микроорганизмов, вызывают окислительные процессы, приводящие к сокращению сроков хранения биомассы, особенно в высушенном состоянии.

Как правило, режим кислотного гидролиза выбирается с учетом необходимой степени расщепления белкового сырья и получаемых в его результате продуктов, во многих случаях специфичных для питания отдельных микроорганизмов. Соответственно полного гидролиза субстрата не происходит, а балластные белки, присутствующие в реакционной смеси, в отдельных случаях затрудняющие последующие процессы культивирования микроорганизмов и очистки вакцинных препаратов, подлежат удалению.

При кислотном гидролизе может происходить частичное или полное разрушение триптофана, а также других аминокислот: метионина, цистина, гистидина, лизина. Кроме того, происходит образование значительного количества аммиака и карбонильных соединений /59/.

Известно, что невозможность использования кислотных гидролизатов для выращивания какой-либо культуры микроорганизмов бывает обусловлена, в основном, наличием в них токсических примесей. Так, хроматографическим и электрофоретическим методами установлен химический состав некоторых побочных продуктов кислотного расщепления белков (метилглиоксаль, окси-метилфурфурол, формальдегид и др.), обуславливающих их токсичность для ряда микроорганизмов /10/. Более того, экспериментально доказано, что кислые гидролизаты с рН<4,0 трудно поддаются высушиванию, т.к. вызывают за-липание слоя гранул инертного материала. В этой связи, необходим выбор способа очистки ПО, получаемых гидролизом кислотой. Очистка кислотных гидролизатов белка обычно начинается с подбора условий их нейтрализации подходящим щелочным реагентом /58/.

Кроме нейтрализации, для очистки белковых гидролизатов от ионов кислотных остатков применяют высокоселективные анионообменные смолы (ИА-1Ф, ЭДЭ-1 ОПТ и др.).

Помимо прочего, для осветления гидролизатов и адсорбции окрашенных примесей широко применялись и применяются в настоящее время активированные угли различных марок /16/, которые добавляются до или после подще-лачивания растворов. Смесь выпавших нерастворимых солей отфильтровывают вместе с активированным углем или другим сорбентом, предназначенным для осветления раствора. Одновременно с деминерализацией и осветлением раствора происходит отделение избытка дикарбоновых кислот и тирозина, образовавшихся в процессе гидролиза.

В случае проведения солянокислотного гидролиза оставшуюся соляную кислоту удаляют нейтрализацией NaOH, КОН или Ыа2СОз /94/, а также при помощи ионообменных мембран или анионитов различных марок /102, 111/.

В противоположность химическому гидролизу ферментативный гидролиз белков, как известно, протекает в мягких условиях в нейтральной, слабокислой или слабощелочной среде при температуре 35-50 °С в течение 8-120 ч и приводит к получению смеси аминокислот и пептидов /8, 58/. Обычно для гидролиза в препаративных целях применяют неочищенные ферментативные препараты из поджелудочной железы или слизистой тонкого кишечника различных сельскохозяйственных животных, а также ферменты растительного происхождения.

При ферментативном гидролизе не происходит разрушение триптофана и наблюдается самая низкая степень рацемизации аминокислот /9/. Ферментативные гидролизаты белков содержат в своем составе значительно меньшее количество солей и в отдельных случаях не требуют специальных процедур очистки / 58,26, 114/.

Некоторые гидролизаты, особенно из растительных белков, часто содержат высокомолекулярные примеси, которые необходимо удалять, для чего применяют, например, ультрафильтрацию растворов гидролизатов через полупроницаемые мембраны с различным размером пор, обеспечивающую не только фракционирование, но и очистку, в частности осветление растворов /113, 117/. В случае необходимости можно ограничиться обычной фильтрацией гидролизатов через активированные угли различных марок, бентониты, неорганические соединения кальция /13, 114/, а также через фильтровальное полотно или картон.

Учитывая, что фильтрованный ФГМ имеет рН (7,5+0,3) ед.рН, который отвечает требованиям к жидким полуфабрикатам по рН, подаваемым на установку сушки УСП-2, представлялось целесообразным его высушивать без применения какой-либо дополнительной подготовки. Высушенный ФГМ имел вид мелкодисперсного гомогенного порошка с влажностью не более 5 %. Данный эксперимент подтвердил предположение о том, что данная ПО перед обезвоживанием не требует дополнительной подготовки, так как экспериментальные образцы сухого ФГМ соответствовали предъявляемым требованиям НД.

Гидролиз КГК и КГСМ осуществляли с использованием 6 и 3 %-го растворов соляной кислоты соответственно требованиям НД. Первоначально провели эксперименты по высушиванию полученных гидролизатов на установке УСП-2 без предварительной подготовки. Однако высушить их не удалось, так как происходило слипание слоя гранул инертного материала, что в свою очередь привело к невозможности дальнейшего проведения процесса сушки. Повидимому это вызвано тем, что значения рН данных гидролизатов значительно меньше 5,0 ед.рН. Исходя из этого, был поставлен ряд экспериментов с целью определения оптимального диапазона водородного показателя в предлагаемых к высушиванию КГК и КГСМ. Для этого готовили образцы по 20 дм3 ПО, в которых устанавливали 40 %-м раствором NaOH рН, равное 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 ед. рН, с последующей фильтрацией через полотно бельтинг и высушиванием. Все пробы были высушены. Полученные материалы представляли собой рассыпчатый, мелкодисперсный, гомогенный порошок от светло- до темно-коричневого цвета.

Ввиду того, что в последующем ПО использовали для приготовления ПС, аналогичным способом провели еще ряд экспериментов для более точного определения верхних и нижних пределов водородного показателя высушиваемых гидролизатов в диапазоне 6,0-8,0 ед.рН, с шагом 0,5. Результаты полученных экспериментов показали, что рН приготовленных ПС после их стерилизации значительно снижается. Так, при использовании ПО с рН в интервале 6,07,0 ед. рН стерильные ПС имеют водородный показатель, равный 5,5-6,5, что не соответствует значениям, указанным в требованиях НД. Исходя из этого, наиболее оптимальная концентрация рН обезвоживаемых ПО составила для КГК 7,0-7,5, для КГСМ 7,5-8,0 ед.рН. Сушка КГК и КГСМ, подготовленных вышеуказанным способом, не вызывает затруднений, дает возможность получения качественного сухого препарата.

Таким образом, в результате проведенных исследований, были выбраны и обоснованы способы подготовки жидких полуфабрикатов к сушке. Физико-химические показатели ПС, полученных с использованием сухих гидролизатов, подготовленных вышеизложенными способами, соответствуют нормам, изложенным в НД, и не содержат нерастворимого осадка.

2.3.1.2 Отработка режимов обезвоживания питательных основ на распылительной установке

Из теории известно, что сушка - это сложный технологический тепло-массообменный процесс, который во многих производствах должен обеспечить не только сохранение ряда нативных свойств материала, но и улучшение этих свойств. Поэтому решение актуальных задач в области сушки должно базироваться на научных основах технологии сушки: от изучения технологических свойств материала (продукта) как объекта сушки — к выбору методов и обоснованию режимов процесса и только на этой основе — к созданию рациональных конструкций сушильных установок или выбору выпускаемых промышленностью сушилок /12/.

Под технологическими свойствами материалов понимаются самые различные свойства: биологические, физико-химические, структурно-механические, теплофизические, электрофизические и др. Для каждого конкретного продукта те или иные свойства играют решающую роль, определяющую его качественные показатели в самом широком смысле этого слова. Важно, чтобы в процессе сушки были сохранены и улучшены именно эти основные свойства, в то время как другие свойства неизбежно изменяются /46, 99/.

Таким образом, специфические свойства отдельных материалов обуславливают различные требования к процессу сушки, а следовательно, и к режиму его проведения, и, соответственно, к оборудованию. Поэтому при организации процесса сушки необходимо учесть свойства продуктов как объектов сушки. Знание этих свойств и закономерностей изменения их при сушке в зависимости от параметров процесса дает возможность выбрать наиболее рациональный способ сушки и обосновать наилучший режим проведения процесса.

Оптимальный режим сушки должен обеспечить получение продукта стандартного качества при высоких технико-экономических показателях. При обосновании и выборе режима сушки и, следовательно, сушильного оборудования необходимо исходить из технологических свойств материала, которые изменяются в процессе сушки, т.е. нужно выбрать такие режимные параметры (температуру, влажность, скорость воздуха и др.), воздействие которых на те или иные характеристики материала обеспечило бы его наилучшие технологические свойства.

Выбор режима сушки обычно начинается с изучения термоустойчивости продукта, связанной с процессами денатурации белков и карамелизацией углеводов, обусловленных нагреванием материала в процессе сушки.

Сушка в распылительных аппаратах белковых ПО, обладающих широкой полидисперсностью, неизбежно сопровождается неравномерным нагревом отдельных частиц продукта. В результате этого температура частиц мелких фракций может превысить предел их термической стойкости. В связи с этим представляло определенный интерес экспериментальное изучение кинетики и температурных интервалов термического разложения высушиваемых ПО.

Для решения этой задачи был использован метод дифференциальной термогравиметрии, получивший за последнее время большое развитие. Исследования проводились на дериватографе фирмы "Shimadzu", позволяющем одновременно фиксировать изменение температуры образца, его массы и энергии инактивации.

Проведенные исследования позволили выявить кинетику теплового разложения образцов. Показатели термогравиметрического анализа ПО по трем параллельным опытам представлены в таблице 2.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коробейников, Андрей Леонидович, Москва

1. Артюхин В.И., Шепелин А.П., Кисилева Н.В. Белковые гидролизаты в производстве питательных сред. Производство и применение продуктов микробиологических производств.: Обзорн. информ.-М., 1990.-Вып.10.

2. Бациллы. Генетика и биотехнология. / пер. с англ. Под ред. А.А.Прозорова. -М., 1992.

3. Ванек 3., Винтер В. Микробная дифференциация, споруляция и синтез метаболитов // Микробиологический журнал 1977. - т.39, № 3. - с.275-280.

4. Ванек 3., Винтер В. Процессы регуляции при делении, споруляции и синтезе метаболитов у микроорганизмов//Микробиол.ж.-1977.-т.39,№6.-с.683-695.

5. Васильев П.С., Судалева В.В., Неклюдов А.Д. и др. Препараты для паран-терального питания. // В кн.: Современные кровезаменители. М.: ВНИИ медицинской информации 1980, с.28-43.

6. Витт С.В., Саноровская М.В., Пасконова Е.А. и др. Аминокислотный состав пекарских дрожжей и некоторых промышленных аминокислотных смесей // Прикл. биохимия и микробиол. 1975. - т. 11, № 3. - с.418-422.

7. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии: Пер. с англ. / Под ред. А. Хеншен и др. М., Мир, 1988.

8. Гекли Дж. Консервирование бактерий методом лиофилизации // Gryjbiol-ogy.-1980.-vol. 17.-№ 6.-Р. 598 / Преводы статей. 1981. - № 5(261).-С. 150.

9. Гинзбург А.С. Сушка пищевых продуктов. М., 1960.

10. Горская Н.А. Лечебные препараты из крови и тканей. Л.: Медицина, 1974, с. 171-173.

11. Государственная Фармакопея изд. X, 1968.

12. Государственная Фармакопея изд. XI, 1992.

13. Гуйко Э.И., Журавская Г.К., Каухчешвилли Э.И. Сублимационная сушка в пищевой промышленности. — М., 1972.

14. Детерман Г. Гель-хроматография. Изд-во "Мир"-М.,1970.

15. Дзагуров С.Г., Быченко Б.Д., Сумароков А.А. Современные принципы стандартизации вакцинных препаратов.//Журн. Микробиол.-1982, №12, с. 7-12.

16. Долинов К.Е. Основы технологии сухих биопрепаратов. -М., 1969.

17. Долинский А.А., Иваницкий Г.К. Оптимизация процессов распылительной сушки. Киев, 1984.

18. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки: Пер. с англ. / Под ред. Р.С. Незлина. М., Мир, 1976.

19. Егоров Н.Е., Выборных С.Н., Лория Ж.К. Влияние ионов марганца и цинка на синтез бацитрацина и спорообразование B.licheniformis 28КА. // Вестник МГУ, сер. Биология. -1985. № 2, с. 56-58.

20. Егоров Н.Е., Выборных С.Н., Лория Ж.К. и др. Влияние катионов на синтез экзопротеазы и спорообразование B.licheniformis. Микробиология. 1985.-т.53, № 4. С. 568-571.

21. Егоров Н.Е., Выборных С.Н., Лория Ж.К. и др. Влияние катионов на синтез экзопротеазы и спорообразование B.licheniformis. Микробиология. 1985.-т.53, № 4. С.568-571.

22. Калмыков П.Е., Голубев Т.Н. Белковый препарат для парантерального питания. Современная медицина, 1956, № 3, с. 585-588.

23. Кантере В.М., Мосичев М.С., Дорошенко М.И. и др. Основы проектирования предприятий микробиологической промышленности. М., 1990.

24. Карпов A.M., Улумиев А.А. Сушка продуктов микробиологического синтеза. М., Легкая и пищевая промышленность, 1982.

25. Карташева Л.Д., Копылов В.А., Пичурина Н.Л. Роль пептидов в стандартизации питательных сред. // Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии. Махачкала, 1988.-ч.1-с.146-148.

26. Каталог микробиологических питательных сред, их компонентов и другой продукции. Отделение "Питательные среды" ГНЦПМ. - Оболенск, 2001.

27. Каталог сухих питательных сред / Изд. пятое. Махачкала, 1998.

28. Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии. М., 1950.

29. Колесов С.Г. Высушивание микроорганизмов и биопрепаратов. М., 1952.

30. Кондрашкова Т.В., Донская Т.Н., Зимарина Л.С. Влияние некоторых минеральных солей на качество и срок годности питательной среды для выращивания чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. 1978, № 4/62.- с.25-27 (РЖ "Биология" 1987, 7 Л 230).

31. Коробейников А.Л., Кочелорова Г.Ю., Федорова Н.В. и др. Оценка возможности использования сухих основ питательных сред в производствебиоспорина. // В сб. докл. на научной конференции ЦВТП БЗ. Екатеринбург, 2001, с. 96-105.

32. Кудрявцев В.А., Сафронова JI.A., Осадчая А.И., Козачко И.А. Подбор состава среды для оптимизации аминосинтетической активности аэробных бацилл. Микробиологический журнал, 1991, т.53, №4, с. 68-72.

33. Кудрявцев В.А., Сафронова JI.A., Осадчая А.И., Козачко И.А. Подбор состава среды для оптимизации аминосинтетической активности аэробных бацилл. Микробиологический журнал, 1991, т.53, №4, с. 68-72.

34. Курочкина М.И. Взвешенный слой в химической промышленности. Д., Химия, 1972.

35. Лабораторный регламент ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ-1993-Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ -Инв №373/3.

36. Лиепиньш Г.К., Дунце М.Э. Сырье и питательные субстраты для промышленной биотехнологии. Рига, 1986.

37. Лиморенко А.П. Разработка технологии культивирования B.subtillis 3 и B.licheniformis 31 при производстве биоспорина. Автореф. дис.канд. биол. наук. Екатеринбург, 2003,22 с.

38. Лиморенко А.П., Рогожин А.З., Коробейников А.Л., Петрякова Г.В. Оценка возможности использования сухих питательных сред в производстве биоспорина// Ветеринарная медицина. 2002. - № 1.-е. 16.

39. Лопатина Н.В., Наталич Л.А. Методологические подходы к получению вакцинных штаммов чумного микроба с повышенной устойчивостью к лиофи-лизации / Биотехнология.- 1994. № 8.

40. Лыков М.В. Сушка в химической промышленности. М., 1970.

41. Лыков М.В., ЛеончикБ.И. Распылительные сушилки. Основы теории ирасчета. М., 1966.

42. Меджидов М.М. Состояние и перспективы развития производства микробиологических питательных сред // Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии: Тез. конф., 26-27 мая 1988 г. Махачкала, 1988. - Ч. I. - С. 3-8.

43. Мейнелл Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология / Пер. с англ. Под ред. А.С.Кривинского и В.И.Урбаха.-М., 1967.

44. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. // Москва, 1980, 15 с.

45. Методические рекомендации по физико-химическому и биологическому контролю белковых гидролизатов для бактериальных питательных сред. -М., 1983.

46. Методические указания по применению физико-химических методов контроля питательных сред: М., 1977.

47. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям. / Методические указания МУК 4.1/4.2.588-96.

48. Методы общей бактериологии / Пер. с англ. Под ред. Е.Н.Кондратьевой, Л.В.Калануцкого.-М., 1984.

49. Научные основы производства бактерийных и вирусных препаратов / Н.А.Лихварь, И.Н.Виноградова, Е.В.Власова и др. Уфа, 1969.

50. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина А.В. Получение и очистка белковых гидролизатов (обзор)// Прикл. биохимия и микробиол. 2000. - т.36, № 4. - с.371-379.

51. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина А.В. Свойства и применение белковых гидролизатов (обзор)// Прикл. биохимия и микробиол. 2000. - т.36, № 5. - с.525-534.

52. Неклюдов А.Д., Крестьянова И.Н., Васильева Л.И., Денякина Е.К. // Прикл. биохимия и микробиол. 1985. - т.21, № 1. - с.48-57.

53. Неклюдов А.Д., Навашин С.М. Получение белковых гидролизатов с заданными свойствами (обзор)// Прикл. биохимия и микробиол. — 1985. — т.11, №1. -с.3-17.

54. Неклюдов А.Д., Степиков К.А., Бердутина А.В. Белковые гидролизаты технология получения и пути использования.// В кн.: Проблемы парантерального питания. Рига.- 1969, с.55-59.

55. Никитин Е.Е., Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов. -М., 1971.6106 унификации методов контроля медицинских иммунобиологических препаратов: Приказ МЗ СССР №31 от 13.01.83.

56. Определение сроков годности сухих микробиологических сред и питательных основ методом "ускоренного старения" при повышенной температуре: Методические рекомендации. Махачкала, 1990.

57. Опытно-промышденный регламент. Биоспорин сухой / ИМВ им. Д.К.Заболотного НАН Украины, Днепропетровский химфармзавод. 1989. - Арх. ГИСКа им. Л.А.Тарасевича.

58. Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова Л.А. Роль аминокислот в интенсификации биосинтеза экзополисахаридов B.subtillis в глубинных условиях роста. Микробиология. -1995. т.64, № 1, с.44-50.

59. Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова Л.А., Козачко И.А. Стимуляция роста и спорообразование B.subtillis с оптимизацией углеводного питания при глубинном культивировании. Прикладная биохимия и микробиология. 1997. т.ЗЗ, № 3, с.321-324.

60. Отчет о НИР (внеплановый) / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ, ИМВ им. Д.К. За-болотного НАН Украины, руководители А.Т. Харечко, Г.И. Архангельский, А.И. Фролов. 1993. - Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. № 226/3

61. Отчет о НИР (внеплановый). ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ, ИМВ НАН Украины. Рук-ли А.Т.Харечко, Г.И.Архангельский, А.И.Фролов.-1994. Арх.ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Инв.№ 287.

62. Отчет о НИР (заключительный) / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Руководители А.З. Рогожин, Ю.В. Сидельников. Тема № 0-00-11У-СД, 2001. Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. № 347.

63. Отчет о НИР (заключительный) / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Руководители Н.В. Садовой, Н.В. Литусов, В.А. Филин. Тема № 0-97-42У-С, 1998. -Арх. Вч 47051. - Инв. № Д-267.

64. Пат. РФ 1722502 МКИ А61 К39/02 35/74. Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека /В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.Б. Сорокулова и др.

65. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. -М., 1978.

66. Питательные среды, микротест-системы, лекарственные препараты: Каталог. Махачкала, 2001.

67. Практикум по биохимии: Учеб. пособие / Под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. М., Изд-во МГУ, 1989.

68. Практическая химия белка: Пер с англ. / Под ред. А. Дарбе. М., Мир, 1989.

69. Равилов A.3., Гильмудинов Р.Я., Хусаинов М.Ш. Микробиологические среды. Казань: ФЭН, 1999.-398 с.

70. Распылительная сушка фармацевтических предприятий / ЦВТП БЗ // Сб. ПС № 6. -1983. -С. 195-207. Пер. ст. Nielsen F. из журн.: Manufact. Chemist - 1982, Vol. 53, № 7, P. 38-41.

71. Романков П.Г., Рашковская Н.Б. Сушка во взвешенном состоянии.-3-е изд. испр. -Д., Химия, 1979.

72. Роуз Э. Химическая микробиология. Пер. с англ., с.65. М.,1971.

73. Сажин Б.С. Основы техники сушки. М., 1984.

74. Сажин Б.С., Кочетов JI.M., Осинский В.П. Сушилки кипящего слоя с механическими побудителями. — М., ЦИНТИХимнефтемаш, 1974.

75. Санитарные правила: СП 3.3.2.015-94. Производство и контроль медицинских иммунобиологических препаратов для обеспечения их качества. М., 1994.

76. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов: Справ. -М., 1990.

77. Смирнов В.В., Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова Л.А. Рост и спорообразование B.subtillis в различных условиях аэрации. Микробиол. журн., 1993, т.55, № 3 -с.38-41.

78. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская Н.А. Спорообразующие аэробные бактерии-продуценты биологически активных веществ. Киев: Наук, думка, 1982.-240 с.

79. Смирнов В.В., Резник С.Р., Васильевская Н.А., Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ. - Киев, 1993.

80. Смирнов В.В., Чаплинский В.Я., Андреева З.М., Богоявленский Л.Б. Научные основы производства диагностических препаратов. // Москва, 1980, 149 с.

81. Смирнова Г.А., Мельникова В.А., Целигорова E.JI. Влияние пептидного состава общепринятых белковых питательных основ на рост микроорганизмов // Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии. -Махачкала, 1988.-Ч.1, с. 146-148.

82. Смирнова Г.А., Раскин Б.М., Целигорова E.JI. Изучение пептидного и аминокислотного состава различных белковых основ питательных сред // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1985, №12, с.22-27.

83. Справочник по микробиологическим питательным основам и средам. -Оболенск, 1998.

84. Тарков М.И. Микробиологические методы оценки искусственных питательных сред. // Кишинев: Штиинца, 1972, 166 с.

85. Тарков М.И. Микробиологические методы оценки искусственных питательных сред. //Кишинев: Штиинца, 1972,166 с.

86. Технические условия. Сухой кислотный гидролизат казеина (ТУ 93 8560083-01). Инв. № 371.

87. Технические условия. Сухой кислотный гидролизат соевой муки (ТУ 93 8560-085-01). Инв. № 373.

88. Технические условия. Сухой ферментативный гидролизат мяса (ТУ 93 8560-087-01). Инв. № 370.

89. Токио Ней. Замораживание и высушивание микроорганизмов / Пер. с англ. Под ред. И.П. Ашмарина. М., 1972.

90. Труды всесоюзной межинститутской научной конференции. -М., 1963.

91. Тутова Э.Г., Куц П.С. Сушка продуктов микробиологического синтеза. — М., 1983.

92. Филатов А.Н., Чаплыгина З.А., Депп М.Е. Белковые гидролизаты. Л.: Медицина, 1968., с.29-41.

93. ФС 42-344 ВС-90. Физико-химические, химические, физические и имму-нохимические методы контроля МИБП.

94. Чаплыгина З.А., Горская Н.А., Немюоль А.Н. О методах получения расщепленного белка.// В кн.: Актуальные вопросы парантерального питания. Рига.- 1972, с.145-150.

95. Черкес Ф.К., Богоявленская Л.Б., Вельская Н.А. Микробиология. М.: Медицина, 1986.

96. Шагам Н.Л., Раскин Б.М., Мельникова В.А., и др. О физико-химических методах стандартизации микробиологических питательных сред. // Микробиология эпидемиологии и иммунобиологии., 1981, № 4, с.24-29.

97. Экспериментально-производственный регламент на производство биоспорина (таблеточная форма). МО РФ, ЦВТП БЗ. Арх. ЦВТП БЗ- Инв.№ Д-66 "ДСП", 1995.

98. Экспериментально-производственный регламент. Биоспорин №580-96/ ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ.-1996.-Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ-Инв №Д84.-ДСП.

99. Экспериментально-производственный регламент "Питательная основа из ферментативного гидролизата говяжьего мяса сухая (Арх. ЦВТП БЗ. -Инв. № Д-539);

100. Экспериментально-производственный регламент "Питательная основа из солянокислотного гидролизата казеина сухая" (Арх. ЦВТП БЗ. Инв. № Д-541);

101. Экспериментально-производственный регламет "Питательная основа из кислотного гидролизата соевой муки сухая" (Арх. ЦВТП БЗ. Инв. № Д-536).

102. Hampton M.G. Process for product of protein hydrolysis of Great Brifain. 1977, № 1494856, K. C07D, 7/00; Winifz M. Process for maring nutrientcomposition. Patent of USA, 1972, № 3698312, K. 14-99.

103. Heber U. Freezing injury in relation to loss of enzyme activities and protection against freezing // Gryobiology. 1968. vol. 5. № 2.- P. 188-190.

104. Huang X.L., Catigrani G.L., Swaisgood H.E. // J. Agr. Food Chem. 1996. V. 44, № 11, p. 3437-3445.

105. Lahl W.J., Braun S.D. //Food Technol, 1994, v. 48, № 10, p. 68-71.

106. Merymen H.T. В кн.: Recent research m freezing. Aid drying./ Ed by Parkes-and Smith. 1960.-P.23.

107. Tsvetkov. Ts., Vulchanov N. Toward me mathematical modeling of heat and mass transfer in vacuum freeze drying // Gryobiology. - 1984. - Vol. 18, № 2.-P. 155-165.

108. Zumbuseh P., Kulre W., Brunner G. // Chem. Jnd. Techn., 1997, V. 69, № 9, p. 1226-1227.