Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная характеристика эубиотиков на основе аэробных спорообразующих бактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика эубиотиков на основе аэробных спорообразующих бактерий"

На правах рукописи

Васильев

Андрей Никифорович РГ6 од

1 8 ДЕК ?т

Сравнительная характеристика эубиотиков на основе аэробных спорообразугощих бактерий

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2000г.

Работа выполнена в Центре военно-технических проблем биологическ защиты НИИ микробиологии МО РФ и в институте новых технологий РАМ!

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор медицинских наук Н.В.Литусов

член-корреспондент РАМН, доктор медици ских наук,профессор Н.Н.Каркищенко

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

академик РАМН, доктор медицинск наук,профессор Ф.И.Ершов

доктор медицинских наук, професс С.Ю.Пчелинцев

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Государственный научный центр I антибиотикам.

Защита состоится «_»_2000г. в _часов на заседаш

Диссертационного Совета Д084.18.01 Московского научн исследовательского института эпидемиологии и микробиолоп им.Г.Н.Габричевского МЗ РФ (152212 г.Москва, ул.Адмирала Макарова, д. 1С

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИЭМ ш Г.Н.Габричевского МЗ РФ

■Автореферат разослан «_»_2000г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

к.б.н. С.ГО.Комбарова

А<6'6. О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы в Российской Федерации наблюдается увеличение числа инфекционных и аллергических заболеваний. За 1985 - 1998г.г. отмечено повышение удельного веса дисбактериозов, причиной которых являются ухудшение экологической обстановки, неконтролируемое использование в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве антибиотиков, химиотерапевтических препаратов, удобрений, инсектицидов, гормонов и др., снижение качества питьевой воды и продуктов питания. Широкое распространение дисбактериозов способствует развитию тяжелых рецидивирующих инфекционных заболеваний, иммунодефицитов, аллергопатий, анемий, гастроэнтерологических и других соматических болезней (Чупринина Р.П. и соавт., 1993; Грачева Н.М., Щетинина И.Н., 1980; Селезнев Е.Ф., 1993; Шаханина И.Л., 1996; Наркевич М.И., Тымчаковская И.М., 1997; Бухарин О.В., 1997).

В связи с изложенным, профилактика и лечение инфекционных заболеваний и дисбактериозов в настоящее время и на ближайшую перспективу являются приоритетными задачами общенационального значения. Решение этих задач возможно путем реализации комплекса соответствующих противоэпидемических, санитарно - гигиенических и других мероприятий, включая разработку, организацию серийного производства и внедрение в медицинскую практику новых медикаментозных средств для предупреждения и терапии инфекционных заболеваний и дисбактериозов. Новые препараты должны соответсвовать современному мировому уровню по эффективности, срокам хранения и ассортименту .выпускаемых лекарственных форм.

В настоящее время в числе высокоэффективных лечебно-профилактических медикаментозных средств специалистами рассматриваются эубиотики (пробиотики) - препараты из живых безвредных для организма человека и теплокровных животных активных бактерий -

антагонистов, подавляющих in vitro и in vivo рост и размножение патогенных и условно патогенных микроорганизмов, вызывающих острые кишечные заболевания и токсикоинфекции. Эубиотики, в отличие от антибиотиков и химиопрепаратов, не оказывают негативного влияния на представителей нормомикрофлоры желудочно - кишечного тракта, наоборот, при дисбиотических изменениях способствуют ее качественному и количественному восстановлению до нормальных значений (Смирнов В.В. и соавт., 1983; Слабоспицкая А.Т. и соавт., 1995; Захаренко С.М., 1997; Бродов Л.Е. и соавт., 1997; Буланцев AJI. и соавт., 1998; Златкина А.Р., 1999; Воробьев A.A., Лыкова Е.А., 1999).

Широкое использование эубиотиков в медицинской практике стимулировало работы по изучению их свойств, совершенствованию и поиску новых препаратов. Было установлено наличие у них, помимо антагонистической активности, ряда полезных ранее неизвестных свойств: иммуномодулирующих, антиаллергических, антирадиационных,

антитоксических (Будагов P.C. и соавт., 1996; Лопатина Т.К. и соавт., 1996; Долгушин И.И. и соавт., 1996; Позняк А.Л. и соавт., 1997; Журило O.A., Турлюк С.А., 1998). Эти данные имеют принципиальное теоретическое и прикладное значение в плане конструирования и применения эубиотиков. Перечень конкретных препаратов, серийно производимых в настоящее время отечественной медицинской промышленностью, а также находящихся в стадии разработки и клинических испытаний, достаточно представителен и постоянно расширяется (Тремасов М.Я. и соавт., 1998; Чупринина Р.П. и соавт., 1993; Смирнов В.В., 1998; Журило O.A., Турлюк С.А., 1998). Учитывая различия в степени выраженности тех или иных конкретных лечебно -профилактических свойств и их совокупности для отдельных препаратов, выбор и применение в лечебной практике наиболее эффективных эубиотиков предопределяет актуальность проведения их сравнительных исследований как в лабораторных, так и клинических условиях.

Среди большого числа используемых в настоящее время эубиотиков особое значение придается препаратам, приготовленным на основе аэробных спорообразующих бактерий — представителей экзогенной микрофлоры, являющихся важной составляющей нормомикробиоценоза кишечника человека и теплокровных животных. Эти препараты предназначены для использования в тех случаях, когда препараты на основе эндогенных микробов мало эффективны (Смирнов В.В. и соавт., 1988; Войчишина Л.Г. и соавт., 1991; Фазылова A.A. и соавт, 1996; Тремасов М.Я. и соавт., 1998). Наибольшее распространение среди них имеют бактисубтил, биоспорин, споробактерин, цереобиоген, флонивин - БС. Из них бактисубтил и флонивин - БС являются импортными препаратами, поступающими в Россию из Франции и Югославии. Наиболее известным практическим врачам из числа импортных препаратов является бактисубтил, изготовленный на основе В.species. Вместе с тем результаты сравнительных испытаний указанных лекарственных средств в доступной литературе отсутствуют, поэтому представляется целесообразным дать сравнительную характеристику подобных эубиотиков. Указанная задача является особенно актуальной в связи с разработкой новых технологий производства подобных препаратов. В частности, в Центре военно - технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ разработана технология глубинного культивирования компонентов биоспорина (B.subtilis и B.licheniformis), создана и сертифицирована аппаратурно - технологическая линия по его выпуску в различных готовых лекарственных формах (лиофильно высушенный препарат в ампулах или флаконах, таблетки, суппозитории). Это позволило нам сформулировать цель и задачи исследования.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Выявить особенности фармакодинамики и фармакокинетики эубиотиков, изготовленных на основе аэробных спорообразующих бацилл на примере бактисубтила (B.species) и биоспорина

(В.эиЫШз и В.НсЬетГопшБ), а также оценить профилактическую и лечебную эффективность биоспорина в эксперименте на животных.

ЗАДАЧИ:

1. Изучить биохимическую и антагонистическую активность микроорганизмов, входящих в состав биоспорина и бактисубтила.

2. Оценить безвредность в опытах по изучению острой и хронической токсичности биоспорина и бактисубтила и их влияние на некоторые показатели иммунитета у животных.

3. Определить фармакокинетику исследуемых препаратов.

4. Показать эффективность биоспорина и бактисубтила на модели инфекционного процесса.

5. Усовершенствовать методы производственного биологического контроля биоспорина с целью включения этих методов в «Стандарты предприятия», «Фармакопейную статью» и «Инструкцию по медицинскому применению».

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

Все положительные биологические и лечебно-профилактические свойства биоспорина, при использованием технологии глубинного выращивания компонентов препарата, сохраняются.

Комплексный эубиотик биоспорин, приготовленный на основе двух штаммов аэробных спорообразующих бактерий (В.эиЫШБ и В.НсЬешйэпшз) по совокупности положительных фармакодинамических и фармакокинетических свойств превосходит аналогичный зарубежный препарат бактисубтил.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В эксперименте на животных при сравнительной оценке фармакодинамических и фармакокинетических свойств биоспорина и

бактисубтнла выявлена более высокая эффективность биспорина.

В эксперименте на животных (изучена острая и хроническая токсичность) показана безопасность применения биоспорина и бактисубтнла.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Разработаны и включены в «Стандарты предприятия» и «Фармакопейную статью» методы производственного биологического контроля биоспорина.

Результаты, полученные в процессе выполнения данной диссертационной работы, позволили реализовать преимущества биоспорина путем внесения изменений в «Инструкцию по медицинскому применению», обосновании необходимости более широкого его применения в медицинской практике с точки зрения профилактики и лечения ОКИ и дисбактериозов.

Апробация и реализация результатов работы.

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета Центра военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ 21 июня 2000г., а также на заседании Ученого совета Института новых технологий РАМН 25 сентября 2000г.

Основные положения работы доложены на юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 1998), на юбилейной научной конференции "Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария" _ (Екатеринбург, 1999) и на научных конференциях отдела лечебных препаратов Центра военно - технических проблем биологической защиты.

По материалам диссертации опубликовано б научных работ, в том числе 2 отчета по плановым темам НИР.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав,

заключения и выводов. Список использованной литературы включает 180 источник отечественных и зарубежных авторов. Диссертация содержит 32 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В работе использовали коммерческие эубиотнки: биоспорин производства Центра военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ, выпускаемый в соответствии с ФС 42-3476-98, а также бактисубтил производства Merrell Marion S.A. (Франция). Эубиотики применяли в пределах установленных сроков хранения.

Агаровые культуры микроорганизмов B.subtilis 3 (ВКПМ №В - 2335), B.licheniformis 31 (ВКПМ №В - 2336), С.albicans IMV - 690, S.aureus 209 - Р, E.coli, S.tiphymurium 55, P.vulgaris, S.dysenteria, S.sonnei 5063 получали путем выращивания на мясо-пептонном агаре клеток соответствующих штаммов, полученных из коллекции ГИСК им. Л.А.Тарасевича и хранящихся в музейной коллекции Центра военно-технических проблем биологической защиты.

Для выращивания микроорганизмов использовали мясо-пептонный агар, мясо-пептонный бульон, сусло - агар, среду Сабуро, среду Гаузе №2. Для определения антагонистической активности применяли мясо-пептоннный агар и среду Гаузе №2. В качестве разводящих растворов использовали дистиллированную воду и 0,85%-ный раствор хлорида натрия. Все питательные среды и растворы были производства Центра военно-технических проблем биологической защиты.

Исследования па экспериментальных животных проводили с использованием беспородных 942 белых мышей весом 16-22 грамма, и 15 кроликов весом 1500-2000 граммов из питомника Центра военно-технических проблем биологической защиты.

Антагонистическую активность эубиотиков определяли на плотной

питательной среде Гаузе №2 методом отсроченного антагонизма по отношению к тест - штаммам в соответствии с существующими рекомендациями. Учет результатов проводили путем измерения размера зон угнетения роста используемых тест - культур.

Концентрацию жизнеспособных клеток определяли путем высева соответствующих десятикратных разведений препаратов на плотную питательную среду, инкубированием посевов в оптимальных для данного вида микроорганизмов температурных условиях и подсчетом выросших колоний с последующим перерасчетом количества клеток в исходной суспензии.

Тепловую устойчивость спор определяли методом последовательных десятикратных разведений с последующим прогреванием суспензий при температуре 83°С в течение 13 минут и высевом на соответствующие плотные питательные среды. Учет результатов проводили путем подсчета выросших колоний через (24+4) часа инкубирования при температуре (36±1)°С. Жизнеспособность клеток (спор) изучали на момент разведения готовых лекарственных форм препаратов. Терморезистентность спор, характеризующую устойчивость подобных эубиотиков при хранении, определяли одновременно с изучением жизнеспособности клеток и выражали как в абсолютных показателях, так и в процентном отношении.

Биохимическую активность штаммов изучали с использованием среды Гисса с сахарами или углеводами и реактивом Андреде ("пестрый ряд") при культивировании посевов в течение суток при температуре (36±1)°С. Учет результатов осуществляли по характерному изменению окраски содержимого пробирок.

Острую и хроническую токсичность определяли общепринятыми методами на белых мышах, морских свинках и кроликах. Динамику размножения и развития микробных клеток в организме животных изучали после перорального введения бактериальной суспензии с последующей

эвтаназией и высевом проб органов с соблюдением правил асептики на питательные среды. При этом для последующих расчетов отобранные кусочки органов взвешивали и растирали с определенным количеством 0,85% - ного раствора хлорида натрия в асептических условиях. В дальнейшем после инкубирования посевов в течение 24 ч при температуре (36±1)°С производили перерасчет выросших колоний на содержание клеток в 1 мг ткани.

Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили согласно рекомендациям И.П.Ашмарина и А.А.Воробьева (1962) с вычислением средней арифметической (М) и ошибки средней арифметической (ш). Достоверность различий рассчитывали по критерию Стьюдента - Фишера (0 и считали значимым при р 0 0,05 (Углов Б.А., 1986).

Ф.И.О. соавторов: А.Ю.Грачев, А.М.Чебыкин, В.В.Щелгачев.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Новая технология получения эубиотика биоспорина, разработанная в Центре военно — технических проблем биологической защиты МО РФ, включает в себя глубинное культивирование В.зиЬНШ и В. ИсИет/огти в специально сконструированных для этих целей питательных средах (соответственно №4 и №7) в ферментерах БИОР - 0,1 и БИОР - 0,25 объемом 100 и 250 литров. Питательные среды содержали кукурузный экстракт, соевую муку, мел, крахмал, растворы солей, пеногаситель. Выход биомассы в культиваторах достигал для В.зыЫШб'до 3,7 млрд клеток в 1,0 мл, а для Д./гс/геиУ/Ьгши - до 12,9 млрд клеток в 1,0 мл. Цикл культивирования продолжался 24 - 36 часов. Следующей стадией технологии было концентрирование биомассы на сепараторах АСГ - 3МБ с периодической выгрузкой осадка из барабана. Сублимационное высушивание препарата осуществляли в сушильных установках ЬХ - 45, АКСС и МАСС - 25 с использованием защитной среды, включающей желатину, сахарозу и обезжиринное молоко. Указанная технология позволяла получать эубиотик -

биоспорин, соответствующий требованиям нормативных документов.

Терморезистентность бацилл, входящих в состав биоспорина, выше, что предопределяет его преимущества перед бактисубтилом, в первую очередь, в потребительских свойствах.

Одним из основных показателей, характеризующих эубиотик, является антагонистическая активность в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов, вызывающих острые кишечные инфекции и дисбактериозы (таблица 1).

Таблица 1

Антагонистическая активность препаратов

Тест - культуры Диаметр зон угнетения роста тест-культур, мм, для препаратов

Биоспорин Бактисубтил

S.sonnei 21±1 -

S. thyphimurium 13±1 -

S.aureus 35±4 -

S. epidermidis 25±0,5 -

P.vulgaris 36±3 -

P. mirabilis 34±2 -

E.coli 24±2 -

C.albicans 35±3 -

Примечание: "-" - отсутствие или слабое угнетения роста тест - культур.

Приведенные в таблице 1 данные свидетельствуют о высокой антагонистической активности биоспорина в отношении S.aureus, C.albicans, P.vulgaris, P.mirabilis, S.thyphimurium, S.sonnei, E.coli, являющихся возбудителями многих инфекционных заболеваний. Особенностью биоспорина является его высокая антагонистическая активность по

отношению к грибам рода Candida. Антагонистическая активность препарата бактисубтил в отношении используемых в опыте тест - штаммов отсутствует или слабо выражена, что предполагает низкую лечебно - профилактическую эффективность его в сравнении с биоспорином в случае использования при инфекционных заболеваниях, обусловленных данными возбудителями.

Данные, полученные в результате изучение биохимической акивности представлены в таблице 2.

Таблица 12

Биохимические свойства микроорганизмов, входящих в состав препаратов эубиотиков

Биохимические реакции Бактисубтил Биоспорин

Препарат Чистая культура (В.species) Препарат Чистая культура (B.subtilis) Чистая культура (B.licheni-formis)

Ферментация: Глюкозы + + + + +

Лактозы - - + - -

Арабинозы - - ++ + +

Маннита - - ++ + +

Ксилозы - - + + +

Гидролиз Мочевины +

Гидролиз крахмала + + + + +

Рост в присутствии 7% ЫаС1 + + +

Разжижение желатины + + + + +

Реакция с мети-леновым синим + +

Лецитиназная активность

Примечание: "+" - наличие признака;

"-" - отсутствие признака.

Исследуемые препараты обладают сходными свойствами по 3 показателям - ферментируют глюкозу, разжижают желатин, гидролизуют крахмал. Но только входящие в состав биоспорина микроорганизмы обладают более широким спектром биохимических реакций (ферментируют арабинозу, маннит, ксилозу, восстанавливают метиленовую синьку), что связано с выделением ими большого числа ферментов, аминокислот, витаминов и других биологически активных веществ (Смирнов В.В. и соавт., 1983). Таким образом, в итоге проведенного экспериментального исследования можно сделать вывод о том, что эубиотик бактисубтил существенно уступает по своим как потребительским (температурно — временные режимы хранения), так и биологическим (в частности, биохимической и антагонистической активности) свойствам препарату отечественного производства (биоспорину).

Безопасность штаммов, входящих в состав биоспорина и бактисубтила, оценивали по патогенности (вирулентности), токсичности, токсигенности на белых мышах, по раздражающему действию на слизистую оболочку глаза кролика в соответствии с существующими методиками (Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств.М.:МЗ СССР,1992, Доклинические испытания новых медицинских иммунологических препаратов. Основные положения. МЗ СССР.М.: 1989). Эксперименты проводили как в остром, так и хроническом вариантах с использованием животных обоего пола. В ходе экспериментов в качестве показателей интоксикации оценивали общее состояние животных, динамику массы тела, поведенческие реакции (число вставаний в минуту, активность,

характер походки, тремор). Взвешивание животных проводили перед кормлением.

В результате проведенных экспериментов установлено, что внутрибрюшинное введение микробных клеток, входящих в препарат биоспорин и бактисубтил, не вызывает гибели животных. Общее состояние, внешний вид и поведение подопытных животных не отличались от контрольных. В связи с тем, что вычислить средневирулентную дозу не представлялось возможным, так как последняя превышает максимально использованную (1.10ш м.к. на животное), исследуемые штаммы можно отнести к абсолютно безвредным для теплокровных животных.

При определении токсичности на белых мышах гибели животных в течение 15 дней наблюдения не выявлено, также не отмечено изменений в поведении и внешнем виде животных разного пола.

Изучение токсигенности штаммов, входящих в состав препаратов биоспорин и бактисубтил, на белых мышах показало, что гибели животных, изменений внешнего вида и поведения в течение срока наблюдения также не происходит. Полученные результаты характеризуют изучаемые штаммы как нетоксичные, т.е. безвредные и безопасные.

Экспериментальное изучение раздражающего действия эубиотиков осуществляли на кроликах. Критериями оценки степени раздражающего или повреждающего воздействия явились: гиперемия, отек конъюнктивы века или роговицы, наличие выделений из глаза. Установлено, что исследуемые штаммы за период наблюдения (15 мин и 24 часа) не вызывают отека век, инъецирования и гиперемии роговицы, а также выделений из глаз, т.е. не обладают раздражающим действием на слизистые оболочки глаза.

Исследование хронической токсичности препаратов - эубиотиков биоспорина и бактисубтила проводили путем ежедневного внутрижелудочного введения исследуемых препаратов нелинейным белым мышам в течение 30 суток в дозе 104 и 105 микробных клеток на 1 особь в 0,5

мл 0,85% - ного раствора хлорида натрия. Наблюдение за животными осуществляли в течение всего периода введения препаратов и последующих 7 суток. В течение указанного срока клинических симптомов заболеваний и гибели животных на фоне введения эубиотиков выявлено не было.

Таким образом, экспериментальные исследования показали, что как биоспорин, так и бактисубтил не обладают острой и хронической токсичностью для лабораторных животных.

Оценка показателей иммунитета у подопытных и контрольных животных осуществлялась после завершения исследования токсичности в хроническом опыте при многократных введениях исследуемых эубиотиков внутрижелудочным способом. Оценивались реакции фагоцитоза, гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и количественная оценка лимфоцитов периферической крови, способных к розеткообразованию (Е-РОК и ЕАС-РОК).

Оценка фагоцитарного потенциала экспериментальных животных проводилась на макрофагах перитонеалыюго экссудата мышей. При оценке результатов определяли фагоцитарный показатель (ФП) и фагоцитарный индекс (ФИ). Полученные результаты отражены в таблице 3.

Таблица 3

Интенсивность фагоцитоза микросфер латекса перитонеальными макрофагами у экспериментальных животных (М ± т)

Эубиотик Показатели фагоцитоза Р

ФП, % ФИ, количество частиц

104 105 104 105

Биоспорин 68,0±2,1 п= 10 69,5±2,4 п = 10 8,8±0,5 п= 10 8,2±0,4 п = 10 <0,05 >0,05

Бактисубтил 66,3±1,1 п= 10 69,0±1,2 п= 10 7,9±0,1 п =10 8,9±0,2 п = 10 <0,05 >0,05

Контроль 66,2±2,2 п= 10 8,7±0,1 п =10

Полученные результаты свидетельствуют о сходной фагоцитарной активности перитониальных макрофагов у контрольных и подопытных животных, что свидетельствует об иммунологческой безвредности исследуемых препаратов. Так при введении биоспорина и бактисубтила в течение 30 суток у исследуемых животных не наблюдалось статистически значимой разности в фагоцитарной активности .перитонеальных макрофагов.

Сенсибилизирующие действие оценивалось путем тестирования препаратов на модели реакции гиперчувствительности замедленного типа у мышей (по 10 животных обоего пола в каждой группе). Экспериментальным животным через 5 суток после завершения хронического опыта под апоневроз задней лапки вводили в объеме 0,05 мл свежеприготовленную на 0,85% - ном растворе хлорида натрия суспензию коммерческих препаратов биоспорина и бактисубтила. Оценку реакции проводили через 20 часов от момента введения суспензии. У подопытных и контрольных животных производили измерение толщины лапок микрометром МК-0-25 (таблица 4).

Таблица 4

Реакция гиперчувствительности замедленного типа у мышей после многократного поступления эубиотиков (М ± ш)

Эубиотик Показатель ГЗТ (толщина лапки, мм) при введении дозы, количество клеток Р

1.104 1.105

Биоспорин 3,9±1,7 п = 10 4,0±1,3 п= 10 <0,05 >0,05

Бактисубтил 4,0±1,1 п= 10 4,0±1,2 п= 10 <0,05 >0,05

Контроль 3,9±1,2 П= 10

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии статистически достоверных изменений реакции ГЗТ как у подопытных животных, получающих разные препараты, так и у контрольных животных.

Исследование количества лимфоцитов после хронического опыта в организме экспериментальных животных оценивали по тесту иммунного розеткообразования. С этой целью определяли количество Т- и В-лимфоцитов периферической крови мышей методом разеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК и ЕАС-РОК). Лимфоциты выделяли по общепринятой методике в градиенте плотности фикол - верографина. Мазки микроскопировали под иммерсией, просчитывали 100 лимфоцитов и вычисляли процент Т-розеток - лимфоциты с 3 и более эритроцитами барана, и В-розетки - клетки с 3 и более частицами зимозана. Полученные результаты отражены в таблице 5.

Таблица 5

Содержание Е- и ЕАС-розеткообразующих клеток крови у подопытных животных (М ± т)

Эубиотик Количество розеткообразующих клеток Р

Е-РОК, % ЕАС-РОК, %

104 103 10 105

Биоспорин 61,2+2,5 65,3 ±2,4 40,8±0,5 Зб,7±1,5 <0,05

п = 10 п= 10 п= 10 п = 10 >0,05

Бактисубтил 58,3±1,2 62,3±2,9 37,5±1,4 37,8±2,7 <0,05

п- 10 п= 10 п =10 п =10 >0,05

Контроль 59,1±1,4 35,9±0,2

П= 10 п =10

Полученные данные позволяют сделать заключение об отсутствии существенных отличий у контрольных и подопытных животных по количеству клеток периферической крови, способных к иммунному

розеткообразованию, что свидетельствует о физиологичности изучаемых препаратов. Однако для биоспорина отмечается незначительная тенденция к большему нарастанию количества иммунокомпетентных клеток.

При пероральном поступлении препаратов в организм определенная часть микробных клеток проникает в дыхательные пути. Поэтому изучали некоторые показатели иммунитета при хроническом аэрогенном поступлении микроорганизмов в организм животных. С этой целью белым мышам интраназально в течение двух месяцев ежедневно вводили взвесь микроорганизмов и оценивали количество Т- и В-лимфоцитов периферической крови в реакции спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК) и методом образования зимозан -комплементарных комплексов (ЕАС-РОК) (таблица 6).

Таблица 6

Показатели клеточного иммунитета у экспериментальных животных

(р+0,05)

Вводимая Концентрация Количество, %

культура микробных

клеток в 1 мл Т-лимфоцитов В-лимфоцитов

В.ьиЫШз 1-Ю3 61,1 ±0,05 38,5±0,2

1-Ю4 62,4±0,7 2б,5±1,2

В. НсИет/огтй МО3 59,4±0,01 32,6±0,1

МО4 60,1 ±0,2 35,7±0,2

В.сегет МО3 58,3±0,02 30,7±1,2

МО4 63,2±0,05 33,4±0,1

Контроль 1-Ю3 59,1±1,4 35,9±0,2

1-Ю4 58,6+0,7 34,5±0,1

Как видно из представленные в таблице 6 данных, не наблюдается

существенных отличий в количестве иммунокомпетентных клеток у контрольных и подопытных животных, что лишний раз подтверждает безвредность изученных препаратов.

Изучение фармакокинетики эубиотиков на лабораторных животных проводили на беспородных белых мышах после внутрижелудочного введения суспензий микробных клеток (препарата), приготовленных с таким расчетом, чтобы в 0,5 мл содержалась 1 доза препарата. Через 1, 7, 14, 21, 28, 35 и 42 суток умерщвляли хлороформом по 3 белых мыши. Животных вскрывали и отбирали стерильно пробы крови, печени, селезенки, легких. Отдельно собирали кал этого же животного в стерильную посуду. Отобранные пробы взвешивали, растирали в ступке, добавляли определенный объем стерильного 0,85% - ного раствора хлорида натрия и высевали на плотную питательную среду Гаузе №2. Посевы инкубировали при температуре (36±1)°С в течение 1 суток. По окончании культивирования подсчитывали количество выросших колоний и определяли содержание бактерий в 1 мг тканей.

Выявлено, что после внутрижелудочного введения биоспорина или бактисубтила бациллы обнаруживаются в течение первых суток в крови животных. В дальнейшем в печени белых мышей при внутрижелудочном введении препаратов штаммы, входящие в состав, биоспорина обнаруживаются в большем количестве и в течение более длительного времени, чем бактерии, входящие в состав бактисубтила. При внутрижелудочном введении эубиотиков определенная их часть попадает в дыхательные пути и сохраняется в них в течение нескольких суток. При этом компоненты биоспорина обнаруживаются в легких в меньшем количестве и раньше элиминируются из них. Значительное количество бактерий обнаруживается в селезенке, где происходит не только их сохранение, но и размножение. В этом случае также отмечается более длительная персистенция в селезенке бактерий, составляющих основу биоспорина (до 14 суток). Значительное количество бактерий удаляется с калом в течение

первых суток. Однако сенная палочка (компонент биоспорина) до двух недель присутствует в желудочно - кишечном тракте, местно проявляя свои положительные качества на макроорганизм.

Таким образом, проведенные исследования показали, что введенные внутрижелудочно эубиотики диссеминируют в органах лабораторных животных, где в течение довольно длительного времени не только сохраняются, но и размножаются. При этом введенные бактерии частично в течение первых суток выводятся из желудочно - кишечного тракта с калом. Эти данные согласуются с представлениями Смирнова В.В. (1998) и Никитенко В.И. (1991) о возможности транслокации бацилл через стенку желудочно — кишечного тракта и их диссеминации в организме теплокровных животных. При этом необходимо отметить, что вегетация штаммов, входящих в состав препарата, в органах экспериментальных животных не сопровождалась изменениями в поведении животных (подвижность, активность, число вставаний и т.д.), гибелью животных, симптомов токсичности не наблюдалось, что подтверждает безвредность препаратов.

Эффективность биоспорина и бактисубтила в сравнительном аспекте изучали на модели сальмонеллеза у белых мышей как при профилактическом, так и лечебном использовании эубиотиков. С этой целью лабораторным животным внутрижелудочно вводили 0,5 мл суспензии, содержащей возбудитель сальмонеллеза в количестве 5,0.106 клеток в 1,0 мл. За сутки до заражения, а также через 1 и 2 суток после заражения подопытным животным вводили внутрижелудочно суспензии эубиотиков, содержащие одну равноэффективную дозу препарата. В ходе эксперимента отмечали гибель лабораторных животных от специфической инфекции, подтверждаемой бактериологическим исследованием (таблица 7).

Таблица 7

Профилактическая и лечебная эффективность эубиотиков на модели сальмонеллезной инфекции у белых мышей

Эубиотик Срок введения эубиотика Количество взятых в опыт животных Количество выживших животных, %

Биоспорин За 1 сутки до заражения 20 100

Через 1 сутки после заражения 20 100

Через 2 суток после заражения 20 95

Бактисубтил За 1 сутки до заражения 20 65

Через 1 сутки после заражения 20 35

Через 2 суток после заражения 20 25

Контроль - 20 0

Полученные данные свидетельствуют о том, что биоспорин в эквивалентных дозах и при принятых сроках введения излечивает всех взятых в опыт животных. В то же время бактисубтил не оказывает выраженного как профилактического, так и лечебного эффекта. Отмеченный факт может быть объяснен тем, что бактерии, входящие в состав бактисубтила, не обладают выраженной антагонистической активностью по отношению к возбудителям кишечных инфекций.

выводы

1.Выявлены выраженные отличия биоспорнна от бактисубтила, по биохимическим признакам и антагонистической активности. Показано, что ферментативная активность в отношении углеводов, а также антагонистическая активность против возбудителей острых кишечных инфекций и дисбактериозов (сальмонеллы, шигеллы, стафилококки, стрептококки, протей, кандида) у бноспорина выше, чем у бактисубтила.

2.В опытах по изучению острой и хронической токсичности биоспорнна и бактисубтила, а также по изучению показателей иммунитета у лабораторных животных установлен однотипный характер реакций макроорганизма на введение эубиотиков и выявлена полная безвредность и иммунологическая безопасность исследуемых препаратов.

3. Определена фармакокннетика бактерий - компонентов бноспорина и бактисубтила в органах лабораторных животных после внутрнжелудочного введения препаратов. Обнаруженная диссеминация микроорганизмов в органах экспериментальных животных не влияет на показатели безопасности и безвредности препаратов.

4. На модели инфекционного процесса сальмонеллеза у экспериментальных животных установлена более высокая лечебная и профилактическая эффективность биоспорнна по сравнению с бактисубтилом.

5. Результаты экспериментального исследования вошли в НТД предприятия по контролю качества изготавлеваемого препарата - бноспорина (СТП - ОБТК - 042 - 048 - 98 и ФС 42-3476-98), а также использованы в "Инструкции по медицинскому применению бноспорина", утвержденной МЗ РФ в 1998г.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Грачев А.Ю., Адов С.А., Васильев А.Н. Экспериментальная оценка влияния аэрогенного хронического поступления B.subtilis на некоторые показатели иммунитета. - Материалы юбилейной научной конференции "Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария." - Екатеринбург, 1999, с. 50-51.

2. Грачев А.Ю., Адов С.А., Васильев А.Н. Экспериментальная оценка токсикологической характеристики бактериальной культуры B.subtilis штамм №3. - Материалы юбилейной научной конференции "Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария." - Екатеринбург, 1999, с. 51 - 53.

3. Отчет о НИР по теме "Усовершенствование процессов приготовления биоспорина в различных лекарственных формах в условиях его серийного выпуска и увеличения мощности производства (заключительный)." - ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Руководители Н.В.Литусов, В.А.Филин. - 1997. - Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв №Д - 95 - ДСП.

4. Отчет о НИР по теме "Разработка экспериментально -производственной технологии выпуска нового препарата биоспорин в различных видах готовых лекарственных форм (заключительный)." - ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Руководители Н.В.Литусов, И.А.Поберий. - 1998. - Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. №Д - 272 - ДСП.

5. Щелгачев В.В., Васильев А.П., Михайлова O.E., Васильев А.Н. Сравнительная характеристика пробиотиков на основе аэробных спорообразующих микроорганизмов. - Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 70 - летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 1998, с. 347-348.

6. Щелгачев В.В., Грачев А.Ю., Васильев А.Н. Экспериментальная оценка диссеминации бактерий, входящих в состав препарата биоспорин, при пероральном введении. - Материалы юбилейной научной конференции "Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария." - Екатеринбург, 1999, с. 300.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Васильев, Андрей Никифорович

Список сокращений, условных обозначений, символов, единиц и терминов.

Введение.

Глава 1. Проблема эубиотиков на современном этапе обзор литературы).

1.1. Состав, назначение и классификация эубиотиков.

1.2. Основные аспекты применения эубиотиков в медицинской практике.

1.3. Требования, предъявляемые к эубиотикам.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

2.1. Микроорганизмы и эубиотики.

2.2. Питательные среды, растворы, реактивы, оборудование и экспериментальные животные.

2.3. Выбор методов исследований.

2.4. Технология получения биоспорина.

Глава 3. Результаты исследований потребительских и биологических свойств препаратов.

3.1. Сравнительное изучение потребительских свойств эубиотиков.

3.2. Культурально - морфологические свойства штаммов -компонентов эубиотиков.

3.3. Антагонистическая активность культур.

3.4. Биохимическая активность микроорганизмов.

Глава 4. Доклиническая оценка токсичности и безопасности эубиотиков.

4.1. Острая и хроническая токсичность эубиотиков в эксперименте на животных.

4.2. Экспериментальная оценка показателей иммунитета после введения эубиотиков.

Глава 5. Сравнительное изучение фармакодинамики и фармакокинетики эубиотиков на лабораторных животных.

5.1. Изучение фармакодинамики эубиотиков.

5.2. Изучение эффективности эубиотиков на модели инфекционного процесса.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительная характеристика эубиотиков на основе аэробных спорообразующих бактерий"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В последние годы в Российской Федерации наблюдается резкое ухудшение эпидемической ситуации, нарастание неблагоприятных изменений в экосфере, увеличение числа инфекционных, аллергических и других заболеваний в результате воздействия соответствующих факторов риска. За 1985 - 1999 г.г. отмечено повышение удельного веса дисбактериозов, причиной которых являются ухудшение экологической обстановки, неконтролируемое использование в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве антибиотиков, химиотерапевтических препаратов, удобрений, инсектицидов, гормонов, а также стрессовые факторы, снижение качества питьевой воды и продуктов питания. Широкое распространение дисбактериозов способствует развитию тяжелых рецидивирующих инфекционных заболеваний, иммунодефицитов, аллергопатий, анемий, гастроэнтерологических и других соматических болезней (Инф. заболеваемость., 1998; Бродов Л.Е. и др., 1997; Руководство по эпидемиологии., 1993; Инфекционная заболеваемость., 1997; Пинегин Б.В. и др., 1984; Наркевич М.И. и др., 1997).

В связи с изложенным, профилактика и лечение инфекционных заболеваний и дисбактериозов в настоящее время и на ближайшую перспективу являются приоритетными задачами общенационального значения. Решение этих задач возможно путем реализации комплекса соответствующих противоэпидемических, санитарно - гигиенических и других мероприятий, включая разработку, серийное производство и внедрение в практику новых медикаментозных средств для предупреждения и терапии инфекционных заболеваний и дисбактериозов, отвечающих современному мировому уровню по эффективности, срокам хранения и ассортименту выпускаемых лекарственных форм.

В настоящее время в числе высокоэффективных лечебно-профилактических медикаментозных средств специалистами рассматриваются эубиотики (пробиотики) - препараты из живых безвредных для организма человека и теплокровных животных антагонистически активных бактерий, подавляющих in vitro и in vivo рост и размножение патогенных и условно патогенных микроорганизмов, вызывающих острые кишечные заболевания и токсикоинфекции (Чупринина Р.П. и др., 1993; Смирнов В.В. и др., 1983; Смирнов В.В. и др., 1992; Воробьев A.A. и др., 1999; Златкина А.Р., 1999; Буланцев А.Л. и др., 1998; Бродов Л.Е. и др., 1997; Пикина А.П. и др., 1999). Эубиотики, в отличие от антибиотиков и химиопрепаратов, не оказывают негативного влияния на представителей нормомикрофлоры желудочно - кишечного тракта, наоборот, при дисбиотических изменениях способствуют ее качественному и количественному восстановлению до нормальных значений. В некоторых случаях возможно одновременное использование эубиотиков с другими средствами симптоматического лечения, в том числе с антибактериальными препаратами (Позняк А.Л. и др., 1997).

Результаты расширенного использования эубиотиков в медицинской практике стимулировали работы по их совершенствованию, поиску новых препаратов, разработке новых технологий их производства, а также позволили установить наличие у них, помимо антагонистической активности, ряда полезных ранее неизвестных свойств: иммуномодулирующих, антиаллергических, антирадиационных, антитоксических (Смирнов В.В. и др., 1996; Пирузян Л.Ф. и др., 1992; Мазанкова Л.Н. и др., 1996; Евсеев A.A. и др., 1996). Эти данные имеют принципиальное теоретическое и прикладное значение в плане конструирования и применения эубиотиков. Перечень конкретных препаратов, серийно производимых в настоящее время отечественной медицинской промышленностью, а также находящихся в стадии разработки и клинических испытаний в мировой практике, достаточно представителен и постоянно расширяется (Чупринина Р.П. и др., 1993; Смирнов В.В. и др., 1983; Белявская В.А. и др., 1996; Королюк A.M., 1996;

Булагов P.C. и др., 1996; Королюк A.M. и др., 1996; Никитиенко В.И. и др., 1996; Новокшонова В.А. и др., 1996; Смирнов В.В. и др., 1996; Изучение продуктов., 1998; Микроинкапсулированные лактобациллы., 1997; Саркисов С.Э. и др., 2000; Журило O.A. и др., 1998). Учитывая различия в степени выраженности тех или иных конкретных лечебно - профилактических свойств и их совокупности для отдельных препаратов, выбор и применение в лечебной практике наиболее эффективных эубиотиков предопределяет актуальность проведения их сравнительных исследований как в лабораторных, так и клинических условиях.

Среди большого числа используемых в настоящее время эубиотиков особое значение придается препаратам, приготовленным на основе спорообразующих бактерий. Наибольшее распространение среди них имеют бактисубтил, биоспорин, споробактерин, флонивин - БС, цереобиоген, энтерогермин. Из них бактисубтил и флонивин - БС являются импортными препаратами, поступающими из Франции (фирма Marion MerrelT) и Югославии (фирма Galenika), хотя основой этих препаратов является один и тот же штамм, но обозначаемый по - разному {Bacillus cereus IP 5832 или Bacillus species IP 5832) из коллекции Института Пастера (Париж). В состав цереобиогена (фирма Xing Jian, Китай) входит штамм В. cereus DM 423. В основе энтерогермина (фирма Sanofi Winthrop, Милан) заложена культура Bacillus subtilis. Наиболее известен практическим врачам и населению в результате широкомасштабной рекламной компании и часто применяем в практике бактисубтил. Вместе с тем результаты сравнительных испытаний указанных лекарственных средств в доступной литературе отсутствуют, поэтому представляется целесообразным дать сравнительную характеристику подобных эубиотиков. Указанная задача является особенно актуальной в связи с разработкой новых технологий производства подобных препаратов. Это позволило нам сформулировать цель и задачи исследования. цель и задачи исследования.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Выявить особенности фармакодинамики и фармакокинетики эубиотиков, изготовленных на основе аэробных спорообразующих бацилл на примере бактисубтила (В.Брешез) и биоспорина (В.БиЫШБ и В.НсЬешГогпш), а также оценить профилактическую и лечебную эффективность биоспорина в эксперименте на животных.

ЗАДАЧИ:

1. Изучить биохимическую и антагонистическую активность микроорганизмов, входящих в состав биоспорина и бактисубтила.

2. Оценить безвредность в опытах по изучению острой и хронической токсичности биоспорина и бактисубтила и их влияние на некоторые показатели иммунитета у животных.

3. Определить фармакокинетику исследуемых препаратов.

4. Показать эффективность биоспорина и бактисубтила на модели инфекционного процесса.

5. Усовершенствовать методы производственного биологического контроля биоспорина с целью включения этих методов в «Стандарты предприятия», «Фармакопейную статью» и «Инструкцию по медицинскому применению».

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

Все положительные биологические и лечебно-профилактические свойства биоспорина, при использованием технологии глубинного выращивания компонентов препарата, сохраняются.

Комплексный эубиотик биоспорин, приготовленный на основе двух штаммов аэробных спорообразующих бактерий (В.БиМШв и В.НсЬе^опшз) по совокупности положительных фармакодинамических и фармакокинетических свойств превосходит аналогичный зарубежный препарат бактисубтил.

10

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В эксперименте на животных при сравнительной оценке фармакодинамических и фармакокинетических свойств биоспорина и бактисубтила выявлена более высокая эффективность биспорина.

В эксперименте на животных (изучена острая и хроническая токсичность) показана безопасность применения биоспорина и бактисубтила.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Разработаны и включены в «Стандарты предприятия» и «Фармакопейную статью» методы производственного биологического контроля биоспорина.

Результаты, полученные в процессе выполнения данной диссертационной работы, позволили реализовать преимущества биоспорина путем внесения изменений в «Инструкцию по медицинскому применению», обосновании необходимости более широкого его применения в медицинской практике с точки зрения профилактики и лечения ОКИ и дисбактериозов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Васильев, Андрей Никифорович

ВЫВОДЫ

1. Выявлены выраженные отличия биоспорина от бактисубтила, по биохимическим признакам и антагонистической активности. Показано, что ферментативная активность в отношении углеводов, а также антагонистическая активность против возбудителей острых кишечных инфекций и дисбактериозов (сальмонеллы, шигеллы, стафилококки, стрептококки, протей, кандида) у биоспорина выше, чем у бактисубтила.

2. В опытах по изучению острой и хронической токсичности биоспорина и бактисубтила, а также по изучению показателей иммунитета у лабораторных животных установлен однотипный характер реакций макроорганизма на введение эубиотиков и выявлена полная безвредность и иммунологическая безопасность исследуемых препаратов.

3. Определена фармакокинетика бактерий - компонентов биоспорина и бактисубтила в органах лабораторных животных после внутрижелудочного введения препаратов. Обнаруженная диссеминация микроорганизмов в органах экспериментальных животных не влияет на показатели безопасности и безвредности препаратов.

4. На модели инфекционного процесса сальмонеллеза у экспериментальных животных установлена более высокая лечебная и профилактическая эффективность биоспорина по сравнению с бактисубтилом.

5. Результаты экспериментального исследования вошли в НТД предприятия по контролю качества изготавлеваемого препарата - биоспорина (СТП - ОБТК - 042 - 048 - 98 и ФС 42-3476-98), а также использованы в "Инструкции по медицинскому применению биоспорина", утвержденной МЗ РФ в 1998г.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема практического использования эубиотиков на сегодняшний день является весьма актуальной. Разностороннее их применение в медицинской практике имело место в 30 - 50-е годы в нашей стране и за рубежом, что объясняется тем обстоятельством, что химиотерапия острых кишечных и других инфекционных заболеваний еще была недостаточно разработана, а антибиотики не имели столь широкого распространения.

С внедрением в практику антибиотиков и химиопрепаратов широкого спектра действия значение эубиотиков как лечебно - профилактических препаратов для инфекционной клиники было почти полностью утрачено. Pix роль ограничивалась только коррекцией нарушений нормомикробиоценоза у детей и в меньшей мере - у взрослых. Примечательно, что формированию дисбактериозов в значительной степени способствовали именно антибиотики и химиопрепараты, а затем, как оказалось, и другие неблагоприятные факторы и условия экологии и социальной сферы.

Параллельно происходили и другие явления: появление и широкое распространение антибиотикорезистентных штаммов патогенных и условно патогенных бактерий, утяжеление течения инфекционных заболеваний, нарушение нормальных функций гомеостаза человека и т. д. Конечные результаты этих и других неблагоприятных процессов еще далеко неясны, однако уже сейчас вполне очевидно, что использование все новых и новых антибиотиков и химиопрепаратов не способно решить все имеющиеся проблемы инфекционной заболеваемости.

На этом этапе развития медицинских знаний мы являемся свидетелями возраждения интереса ученых и врачей к эубиотикам, разработке теории и практики соответствующей проблематики. При этом успешно разрабатываются оригинальные композиции и лекарственные формы эубиотиков, расширяется их производство, исследуются новые, перспективные области применения данных препаратов. Не исключено, как полагают Л.А.Пирузян и Е.М.Михайловский (1992), что происходит формирование нового направления в фармакотерапии, обозначенного этими авторами как "микробная сапротрофная фармакотерапия".

Представленные данные позволили сформулировать цель исследований, которая заключалась в выявлении закономерностей и особенностей биологических свойств, биохимической и антагонистической активности, фармакокинетики и фармакодинамики эубиотиков, приготовленных на основе спорообразующих бацилл (на примере бактисубтила и биоспорина, приготовленного по новой технологии с использованием глубинного выращивания бактерий), а также в оценке профилактической и лечебной эффективности биоспорина.

На первом этапе исследований изучили культурально морфологические свойства, антагонистическую и биохимическую активность штаммов, входящих в состав биоспорина и бактисубтила. Установлено, что по основным свойствам использованные штаммы не отличались друг от друга. Вместе с тем штаммы - компоненты биоспорина обладали более выраженными биохимическими свойствами и антагонистической активностью по сравнению со штаммом, являющимся основой бактисубтила. Особые различия отмечаются при изучении антагонистической активности культур. В частности, биоспорин угнетает рост шигелл, сальмонелл, стафилококков, стрептококков, энтеропатогенной кишечной палочки, протея и кандиды. Бактисубтил не обладает указанными свойствами. Кроме того он имеет меньшую биохимическую активность, особенно в плане ферментации углеводов.

Доклиническая оценка токсичности, безопасности и фармакологической активности биоспорина и бактисубтила показала их безвредность для макроорганизма, в том числе на показатели иммунитета как в остром, так и хроническом эксперименте. Вместе с тем сравнительное изучение фармакодинамики и фармакокинетики эубиотиков на лабораторных животных позволило выявить более выраженную персистенцию клеток - компонентов биоспорина в органах и тканях макроорганизма по сравнению с бактериями, составляющими основу бактисубтила.

Полученные нами данные по диссеминации бацилл во внутренних органах экспериментальных животных можно трактовать с известной позиции В.В.Смирнова (1998) о возможности перманентной транслокации бацилл из просвета кишечника через его стенку в лимфоидные структуры, кровь, печень, селезенку, легкие и другие органы и ткани. Показано в эксперименте и на клиническом материале (Никитенко В.И., 1991) у больных с гнойными ранами и открытыми переломами при лечении споробактерином, что входящие в его состав бациллы как-бы "притягиваются" в район повреждений. Из желудочно - кишечного тракта и внутренних источников (лимфоидные фолликулы, лимфатические узлы, селезенка, печень) живые бактерии сенной палочки при различных повреждениях проникают с током крови и лимфы в воспалительные очаги различной локализации. Там они сохраняют жизнеспособность и не вызывают воспалительных или иных осложнений. Считается, что в соединительной ткани, окружающей рану или очаг повреждения, бактерии выделяют антибиотики, протеолитические ферменты, иммуномодуляторы и оказывают лечебное действие при гнойно -воспалительных процессах.

Выявленные положительные свойства биоспорина определяют и выраженную лечебно - профилактическую эффективность этого препарата по сравнению с бактисубтилом, что подтверждено в опытах на модели инфекционного процесса у лабораторных животных. При этом установлено, что биоспорин обладает иммуномодулирующим действием, оказывая положительное влияние на неспецифические факторы иммунитета. В связи с этим биоспорин может использоваться при многих заболеваниях, применение при которых не отражено в соответствующей Инструкции.

Таким образом, полученные результаты позволили выявить

97 особенности биологических свойств, антагонистической и биохимической активности, фармакокинетики и фармакодинамики эубиотиков на основе аэробных спорообразующих бактерий, что составляло цель настоящих исследований и определяло задачи, подлежащие решению.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васильев, Андрей Никифорович, Москва

1. А. С. 1398868 СССР, МКИ 4А 61 К 35/74. Способ лечения гнойно -септических послеродовых заболеваний// В.В.Смирнов, С.Р.Резник, И.Б.Сорокулова и др. Опубл. 30.05.1988, Бюлл. №20.

2. А. С. 1722502 А 1 СССР, МКИ А 61 К 39/02, 35/74. Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно кишечных заболеваний человека// В.В.Смирнов, С.Р.Резник, И.Б.Сорокулова и др. - Опубл. 30.03.1992, Бюлл. №12.

3. Абрамов H.A., Иванов Д.Г., Ланских А.Г. Перспективы создания промышленной технологии микрокапсулированных препаратов -эубиотиков. Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 2.

4. Микробиоценоз кишечника детей с диарейными заболеваниями в процессе лечения лактоглобулином. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1999. - №6. С. 92-93.

5. Алмагамбетов К.Х., Искаков С.С., Иманбаев Н.И. Дисбактериозы при терминальных состояниях и способы коррекции. Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 2.

6. Ашмарин И.П., Воробьев A.B. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л. ¡Медицина. 1962. 180с.

7. Ю.Байрамова Г.Р. Обоснование целесообразности применения эубиотиков после этиотропного лечения бактериального вагиноза. Тез. докл.

8. Всероссийской научно практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 42.11 .Бациллы. Генетика и биотехнология / Пер. с англ. Под ред. А.А.Прозорова. М.: Медицина. 1992. 296 с.

9. Башмакова Н.В., Заварзина Л.П., Головко В.Д. Использование эубиотиков в системе коррекции микробиоценоза урогенитального тракта. Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 7.

10. Беканов М.Х., Зелинская Е.П., Шортанова Т.Х., Ячная Е.В. Лечение дисбактериозов кишечника в условиях детского реабилитационного центра "Радуга." Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 42.

11. Белявская В.А., Сорокулова И.Б., Масычева В.А. Рекомбинантные пробиотики: проблемы и перспективы использования для медицины и ветеринарии. Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 7.

12. Блохина И.Н., Дорофейчук В.В. Дисбактериозы. Л.:Медицина. 1969. 137 с.

13. Блюгер А.Ф., Векслер Х.М., Новицкий И.М. Клиническая иммунология кишечных инфекций. Рига: Звайгзие. 1980. 214 с.

14. Бондаренко A.B., Бондаренко В.М. Новые подходы к лечению дисбактериозов. Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 8.

15. Бродов Л.Е., Ющук Н.Д., Малеев В.В. Диагностика и лечение острых кишечных инфекций.// Эпидемиология и инфекционные болезни. 1997. №4. С. 4 - 6.

16. Бродов Л.Е., Ющук Н.Д., Малеев В.В. Диагностика и лечение острых кишечных инфекций.// Эпидемиология и инфекционные болезни. 1997. № 4. С. 4 - 6.

17. Буланцев А.Л., Липницкий A.B., Тихонов Н.Г. Микробиоценоз кишечника человека и перспективы коррекции дисбиозов с помощью пробиотиков.// Поволж. экол. вестн. 1998. №5. С. 364 - 369.

18. Бухарин О.В. Техногенные факторы в инфекционной патологии.// Эпидемиология и инфекционные болезни. 1997. №4. С. 43 - 44.

19. Войчишина Л.Г., Чаплинский В.Я., Вьюницкая В.А. Применение спорообразующих бактерий в лечении больных дисбактериозом.// Врачебное дело. 1991. №6. С. 73-75.

20. Воробьев A.A., Абрамов H.A., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбактериозы актуальная проблема медицины. - Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 42.

21. Воробьев A.A., Лыкова Е.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1999. №6. С. 102 - 105.

22. Ганина В.И., Семенихина В.Ф., Иноземцева В.Ф. Бифацид новый отечественный биологический препарат. - Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 12.

23. Гапочко К.Г., Магазов Р.Ш., Мельников В.Н. и др. Система массовой комплексной и ассоциированной вакцинации для крупных эпидгеографических регионов мира. Уфа: Гилем. 1996. 280 с.

24. Гиль С.А., Колесинская Л.А. Бактерицидное влияние ацидофильного молока на микробы коли тифозной и дизентерийной групп.// Педиатрия. - 1936. №9. С. 55 - 57.

25. Горшевикова Э.В., Фурманова Ю.А., Слабоспицкая А.Т. и др. Применение биоспорина в лечении экспериментальной гнойной раны.// Клиническаяхирургия. 1992. №9 10. С. 30 - 32.

26. Государственные испытания и регистрация новых иммунобиологических препаратов: Санитарные правила. М.: Информационно-издательский центр МЗ России. 1998. 42 с.

27. Грачева Н.М., Щетинина И.Н. Клиническая химиотерапия при инфекционных болезнях. JL: Медицина. 1980. 120 с.

28. Григорьев A.B., Бондаренко В.М., Феклисова JI.B. и др. Разработка и клиническая оценка пробиотика "Бифидумбактерина форте." Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 11.

29. Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов. Основные положения. МЗ СССР. М.: 1989. 24 с.

30. Жакевич В.Д. "Bifî Life" - семейство целебных продуктов с комплексом человеческих бифидобактерий. - Тез. докл. Всероссийской научно -практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 14.

31. Иммунологические методы. Пер. с нем./ Под ред. Г.Фримоля. М.: Медицина. 1987. 472 с.

32. Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации за январь -декабрь 1996 г.// Эпидемиология и инфекционные болезни. 1997. №4. С. 63 - 64.

33. Каркищенко H.H., Каркищенко В.Н., С.Ю. Пчелинцев Психотропное, антистрессорное и антиноцицептивное действие интерферона.-Вестник Российской академии медицинских наук.-1999.№10.с.18-19.

34. Клиническая иммунология и аллергология. В 3 х томах. Пер. с нем./ Под ред. Л.Негера. -2-е изд. - М.: Медицина. 1990. Т. 1. 528 с.

35. Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии. М.:1. Медицина. 1950. 64 с.

36. Козлова Н.В., Спирина Т.С., Жиленко М.И., Яковлева Н.И. Состояние кишечного микробиоценоза и его коррекция у беременных, проживающих в условиях повышенного радиационного загрязнения.// Антибиотики и химиотерапия. 1994. №6. С. 39-43.

37. Коноплева В.И. Особенности микробного биоценоза толстого кишечника детей дома ребенка, подходы к коррекции его нарушений. Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 18.

38. V W .J 1 W U tt lililí, LJ I 1VÍ 1 VíillVJIVl llíl. J.V V Д. VJJ X Л X 1 11/1. 1—< 14 VI 1 VjJ lili W J A , 1 S S S ^ v. 1 V/103.

39. Коробкова E.H., Смирнов В.П. Об антагонистическом действии кишечной палочки на палочку чумы.// Вестник микробиол., эпидемиол. и паразитол. -1938. №3 4. Вып. 17. С. 21 - 25.

40. Королюк A.M., Петров JI.H., Вербицкая Н.В. и др. Разработка двухкомпонентного эубиотика для нормализации микрофлоры кишечника у детей. Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 19.

41. Краморенко Ю.С., Урашева С.М., Байсалбаева В.К., Добрица Т.А. Микрометод комплексного определения Т- и B-лимфоцитов в капиллярной крови.// Лабораторное дело 1990. №5. С. 16-18.

42. Краткий определитель бактерий Берги. Под ред. Дж. Хоулта, Г.А.Заварзина. -М.: Медицина. 1980. 358 с.

43. Кудзин К.И. Ацидофильная палочка, ее природа и терапевтическое значение культур. Минск: 1940. 132 с.

44. Ладодо К.С., Щербакова Э.Г. Применение БАД в педиатрической практике. Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 21.

45. Липатов H.H., Барышникова Е.П., Сажинов Г.Ю., Щербакова Э.Г. Биотехнологические подходы к совершенствованию качества кисломрлочных продуктов для специализированного питания.// Хранение и переработка сельхозсырья. 1998. №12. С. 9 - 11.

46. Литусов Н.В., Щелгачев В.В., Ларионов Л.П. Изучение возможности создания гелевой формы эубиотика биоспорина. Тез. докл. 3 Российско -итальянской конф. по инфекционным болезням, 3-6 июня 1998 г. - Санкт -Петербург, 1998, с. 35.

47. Мазанкова Л.Н., Бродинова И.С., Михайлова H.A. Опыт применения споробактерина при аллергодерматозах у детей раннего возраста. Тез. докл. Всероссийской научно — практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 25.

48. Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий рода Bacillus из организма человека и животных. МЗ УССР. АН УССР. Киев: 1983. 42 с.

49. Методические рекомендации по диагностике и лечению дисбактериоза. -М.: 1986. 76 с.

50. Методические рекомендации по оценке аллергенных свойств фармакологических средств. МЗ СССР, Ф.К, М.: 1988. 34 с.

51. Методические указания по экспериментальному обоснованию ПФК микроорганизмов-продуцентов и содержания их готовых форм препаратов в объектах производственной и окружающей среды. МЗ СССР, М.: 1991. 52 с.

52. Мирзабалаева А.К., Антонов Б.Б. Применение эубиотиков в терапии кандидоза гениталий у женщин. Тез. докл. Всероссийской научно -практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 25.

53. Морозова J1.B., Мельничук Г.М. Дисбаланс симбиотической микрофлоры при развитых формах пародонтита и лечебная эффективность ацилакта. -Тез. докл. Всероссийской научно практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 24.

54. Наркевич М.И., Тымчаковская И.М. Инфекционная заболеваемость в России.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. №3. С. 48 -52.

55. Никитенко В.И. Взаимоотношения макроорганизма и бактерий в ране и тканях человека и животных.// Хирургия. 1990. №9. С. 94 - 98.

56. Никитенко В.И. Вместо лекарств бактерии.// Наука в СССР. - 1991. №4. С. 116-121.

57. Никитенко В.И., Горбункова H.H., Жигайлов A.B. Споробактерин новый препарат для лечения дисбактериозов и гнойно - воспалительных процессов. - Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 26.

58. Пак С.Г., Турьянов М.Х., Пальцев М.А. Сальмонеллез. М.: Медицина. 1988.211 с.

59. Перетц Л.Г. Значение нормальной микрофлоры для организма человека. -М.: Медицина. 1955. 128 с.

60. Перетц Л.Г. Колитерапия и колипрофилактика дизентерии. Сб. Санитарная служба в дни Отечественной войны. - М.: 1945. №2. С. 21 - 23.

61. Перетц Л.Г. Роль кишечного дисбактериоза в возникновении, течении иисходе дизентерии и нормализации кишечной микрофлоры, как метод борьбы с дизентерией. В кн. Вопросы профилактики и лечения дизентерии. - М.: 1952. с. 27 - 29.

62. Перетц Л.Г., Невлер А.И., Калижникова А.И. и др. Антагонистическое влияние кишечных палочек на туберкулезную, дифтерийную и паракишечные палочки и на протей.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1936. №1. С. 31 - 34.

63. Пикина А.П., Смеянов В.В., Ефимов Б.А. и др. Первичный скрининг бифидобактерий и лактобактерий с целью разработки на их основе эффективных препаратов пробиотиков.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1999. №6. С. 34 - 38.

64. Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М. Дисбактериозы кишечника. М.: Медицина. 1984. 127 с.

65. Пирузян Л.Ф., Михайловский Е.М. Сапрофитная микрофлора в качестве продуцента биологически активных веществ для целей микробной сапротрофной фармакотерапии.// Изв. Академии наук. Сер. Биол. 1992. №6. С. 860 - 869.

66. Полищук Е.И., Сельникова О.П. Возможности регуляции формирования микробиоценозов новорожденных. Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 30.

67. Потапова С.Г., Хрустиков B.C., Демидова A.B. и др. Изучение поглотительной способности нейтрофилов крови с использованием инертных частиц латекса.// Пробл. гематологии и переливания крови. -1977. №9. С. 58-59.

68. Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP). М.: МЗ СССР. 1992. 34 с.

69. Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных. М.: МЗ РСФСР. 1977. 12 с.

70. Прикладная иммунология./ Под ред. А.А.Сохина, Е.Ф.Чернушенко. Киев: Здоровье. 1984. 320 с.

71. Рогозин И.И., Косовая Е.И. Использование микробного антагонизма для обезвреживания бацилловыделителей на путях эвакуации.// Воен. мед. журн. 1933. Т. 4. Вып. 4. С. 24 - 27.

72. Руководство по инфекционным болезням. Санкт - Петербург: Медицина. 1996. 316 с.

73. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней. М.: Медицина. 1973. 57 с.

74. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней/ Под ред. В.И.Покровского. М.: Медицина. 1993. Т. 1 2.

75. Савичева A.M., Башмакова М.А. Микробиоценозы влагалища и их регуляция. Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 33.

76. Саркисов С.Э., Крымшокалова З.С., Кафарская Л.И., Коршунов В.М. Применение биотерапевтического агента "Жлемик" для коррекции микрофлоры при бактериальных вагинозах.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2000. №1. С. 88 - 90.

77. Сборник инструкций по оценке качества готового препарата биоспорин в ампулированной (флаконированной) форме выпуска. СТП -ОБТК 042 - 048 - 98. - Инв. №Д - 106.

78. Селезнев Е.Ф. Оценка обоснованности применения лекарственных средств у стационарных больных с острыми кишечными заболеваниями.// Антибиотики и химиотерапия. 1993. Т. 38. №7. С. 44 - 47.

79. Слабоспицкая А.Т., Виноградов В.П., Крымовская С.С. и др.Новыйпрепарат биоспорин и его влияние на микрофлору кишечника при дисбактериозах новорожденных детей.// Микробиол. журн. 1995. Т. 57. №1. с. 71-76.

80. Смирнов А.О., Садовой Н.В., Литусов Н.В. и др. Выживаемость бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis при прессовании таблеток биоспорина.// Биотехнология. 1997. №4. С. 17-21.

81. Смирнов А.О., Харечко А.Т., Садовой Н.В. и др. Разработка технологии получения таблеточной формы препарата биоспорин.// Биотехнология. 1996. №11. С. 51 - 55.

82. Смирнов В.В. Антибиотики и /или пробиотики: размышления и факты.// Медицинская картотека мира. 1998. №8. С. 28 - 30.

83. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская H.A. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ. Киев: Наукова думка. 1983. 137 с.

84. Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В.А. и др. Современные представления о механизмах лечебно профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus.II Микробиол. журн. - 1993. Т. 54. №6. С. 82-94.

85. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А. Дискуссионные вопросы создания и применения бактериальных препаратов для коррекции микрофлоры теплокровных.// Микробиол. журн.- 1992. Т. 54. №6. С. 82-94.

86. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А. О некоторых механизмах возникновения бессимптомной бактериемии.// Микробиол. журн. 1988. Т. 50. №6. С. 56 - 59.

87. Смирнов В.В., Сорокулова И.Б. Перспективы применения бактерий рода Bacillus в качестве основы новых биопрепаратов для медицины. Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 33.

88. Смирнов В.В. Кудрявцев В.А., Осадчая А.И., Сафронова Л.А. Новый пробиотик эндоспорин для лечения и профилактики эндометритов животных. Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 32.

89. Сорокулова И.Б. Сравнительное изучение биологических свойств биоспорина и других коммерческих препаратов на основе бацилл.// Мкробюл. Ж. 1997. Т. 59, №6. С. 43 - 49.

90. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России. М.: 1998. 386 с.

91. Терентьев А.Н., Ломов Ю.М., Карбышев Г.Л. и др. Особенности распространения холеры и проведения противоэпидемических мероприятий в небольших населенных пунктах Дагестана.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1995. №2. С. 36 - 39.

92. Тремасов М.Я., Сергейчев А.И., Титова В.Ю., Зинатуллин P.P. Влияние пробиотика энтероспорина на течение микотоксикоза. -Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 70 летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 1998, с. 235 - 236.

93. Учайкин В.Ф., Мурашова А.О., Абрамов H.A. Бифидокефир в лечении и профилактике дисбактериозов. Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы иэубиотики." М., 1996, с. 36.

94. Фармакопейная статья: Биоспорин сухой. ФС 42-3476-98,1998 г.

95. Федосеева В.Н., Порядин Г.В., Ковальчук J1.B. и др. Руководство по иммунологическим методам в гигиенических исследованиях. М.: «Промедэк». 1993. 84 с.

96. Феклисова JI.B., Королева Н.С., Бавина H.A. Новый биологический препарат аципол для лечения и оздоровления детей. Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 36.

97. Харечко А.Т., Ларионов Л.П., Литусов Н.В. и др. Эубиотики для профилактики, лечения и реабилитации больных при инфекционных заболеваниях и дисбактериозах (методические рекомендации). Екатеринбург: Министерство обороны РФ. 1998. 52 с.

98. Червякова В.И., Береза И.М., Селезнева С.И. и др Бактериологическая и иммунологическая эффективность биоспорина при неспецифическом язвенном колите.// Микробиол. журн. 1993. Т.55. №3. С. 63-67.

99. Червякова В.И., Береза И.М., Селезнева С.И. и др. Бактериологическая и иммунологическая эффективность биоспорина при неспецифическом язвенном колите.// Микробиол. журн. 1993. Т. 55. №3. С. 63 - 67.

100. Чешева В.В., Поспелова В.В., Манвелова М.А. Пробиотики из лактобацилл в арсенале средств бактериальнлй терапии. — Тез. докл. Всероссийской научно практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 39.

101. Чупринина Р.П., Скорикова И.Г., Евлашкина В.Ф. Препараты для профилактики и лечения дисбактериозов разной этиологии. М.: ГИСК им. Л.А.Тарасевича. 1993. 56 с.

102. Шувалова Е.И. Инфекционные болезни. М.: Медицина. 1982. 218 с.

103. Шувалова Е.П., Кроткова М.Р. Особенности современного течения дизентерии по материалам Санкт Петербурга и применение эубиотиков. -Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 39.

104. Щербаков П.Л. Значение бактисубтила в лечении диарей идисбактериозов.// Лечащ. Врач. 1998. №1. С. 20 - 22.

105. Щербакова Э.Г., Грачева Н.М., Растунова Г.А. и др. Новый препарат Бпфилиз (ВИГЭЛ) и опыт его применения. Тез. докл. Всероссийской научно - практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики." М., 1996, с. 41.

106. Экспериментально производственный регламент №580 - 96. Биоспорин/ ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - 1994. - Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ.-Инв. №Д-64.

107. Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я., Садовой Н.В. и др. Клиническое изучение эффективности нового эубиотика биоспорина при лечении иерсиниозов. Тез. докл. 3 Российско - итальянской конф. по инфекционным болезням, 3-6 июня 1998 г. - Санкт - Петербург, 1998, с.

108. Изучение продуктов метаболизма и антагонистического действия комбинированных культур Lactobacillus bulgaricus и Streptococcus thermophilus/Aslim Belmaf/Turkhij. Deneysel biol.derg.- 1998. V. 55. №1. P. 17 -23.

109. Dityatkovskaja E.G., Chaplinsky V.Ya. Biosporin white allergietching dermatosis treatment// 1-st Int. Conf. Immunoreabilitation "Reabilitation oe Immune system". Dagomys, 1 5 Juli, 1992/ Tsk. 1992. - P. 97.

110. Priest F.G. DNA homology in the genus Bacillus. In: Aerobic Endospore- form. Bact.: CI. and Identif. Symp., Cambridqe, Apr., 1979. London e.a., 1981, p. 33-57.

111. Sears C.L., Kaper J.B. Enteric bacterial mechanisms of action and lineage to intestinal secretion/ Microbiological reviews. 1996. - V. 60, №1. - P. 167 -215.

112. Thach Pham Ngoc, Vu Thi Chin, Nguen Thi Hoi. Le Bacillus subtilis en therapeutique et dans la prophilaxie// Rev. Immunol. 1968. - Vol. 72, №1 - 2. -P. 53.

113. Tinole F. Fizioloski pomen bacteriemije z jejunalno mikrofloro// Zdrav. Vestn. -1981.- Vol.51. P. 3-5.