Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые аспекты механизма защитного действия колибактерина и споровых эубиотиков и новые методы их контроля

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Некоторые аспекты механизма защитного действия колибактерина и споровых эубиотиков и новые методы их контроля"

РГ6 Ой 2 3 ИЮН 1997

На правах рукописи

ОСИПОВА Ирина Григорьевна

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ МЕХАНИЗМА ЗАЩИТНОГО ДЕЙСТВИЯ КОЛИБАКТЕРИНА И СПОРОВЫХ ЭУБИОТИКОВ И НОВЫЕ МЕТОДЫ ИХ КОНТРОЛЯ

Специальность: 03.00.0 7 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Мосхза - 199Т

Работа выполнена в государственном институте стандартизации и контроля медицинских иммунобиологических препаратов им.Л.А.Тарасевича

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор З.М.АНДРЕЕВА

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Е.М.ГОРСКАЯ

доктор медицинских наук, профессор А.С. БЫКОВ

Ведущее учреждение - Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи

Зашита состоится Ч.Ь......1997 г в /.^часов на заседании

специализированного совета К.074.05.03. при Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова (119881, Москва, Г-435, Б.Пироговская ул., 2-6).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Московской медицинской академии им.И.М.Сеченова по адресу: 119042, Москва, Зубовский бульвар: 37/1.

Автореферат разослан ".....".................1997 г

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат медицинских наук, доцент А.Ю.Миронов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Нормальная микрофлора открытых полостей организма человека представляет собой сложную многокомпонентную, строго сбалансированную экологическую систему, каждый из сочленов которой составляет важное звено в обеспечении состояния эубиоза макроорганизма и служит естественным защитным механизмом (Van der Waaij D., 1987). С нарушением микробной экологии изменяется баланс, т.е. количественный и качественный состав микроорганизмов, при котором потенциально патогенные бактерии могут стать преобладающими в количественном отношении и привести к дисбиозу (Salroinen S.,-et al., 1995; Tazume S., et al., 1993).

Для нормализации микробного^ценоза в практике здравоохранения все более широкое применение находят средства бактериальной терапии. Накоплен достаточный опыт использования эубиотиков (пробиотиков). Практика применения эубиотиков из различных штаммов и видов нормофлоры показала их положительное влияние на кишечный микробиоценоз, повышение общей резистентности организма (Golledge C.L.. et al.. 1996: Perdigón G., et al., 1995). По данным ряда исследователей (В.В:Поспелова с соавт.. 1990; Mantere-Alhonen S., 1986) эффективность бактерийных препаратов определяется биологическими свойствами входящих в них штаммов. Не разработаны единые принципы отбора новых перспективных штаммов для изготовления эубиотиков и контроля производственных штаммов, также требуют совершенствования методы и критерии оценки биологических свойств обеспечивающих безопасность и лечебную эффективность препарата (А.А.Воробьев с соавт., 1997). В связи с этим, проблема конструирования и использования экологически безопасных эубиотиков из представителей нормальной микрофлоры в настоящее время чрезвычайно актуальна.

В нашей стране при отборе штаммов - кандидатов в эубиотики обращают внимание прежде всего на спектр и уровень антагонистической активности, их технологичность. Подобная характеристика является недостаточной, т.к. она не раскрывает механизм действия эубиотика, его взаимодействие с макроорганизмом и другими видами бактерий (В.М.Бондаренко. Е.М.Горская. 1992). Начиная с 90-х годов, некоторые исследователи зысхазали мнение, что основным требованием при подборе производственных штаммов

должна быть их высокая колонизационная резистентность (Fuller R.,1989; 1991; Gibson GR., et al., 1995).

Одним из старейших эубиотиков является колибактерин, исходный штамм E.coli М-17 выделен из "мутафлора" Ниссле. Многочисленные данные свидетельствуют о хорошей клинической эффективности колибактерина при острой и хронической дизентерии, которую связывают, в основном, с антагонистической активностью препарата в отношении ряда патогенных бактерий, а также стимуляцией специфического и неспецифического иммунитета (Ю.К.Зацепин, 1972; Н.Б.Касымова с соавт., 1982). Однако, отсутствие достаточно полных данных о взаимоотношениях между эубиотиком и условнопатогенными бактериями приводит порой к необоснованному назначению препарата и, как следствие этого, отсутствию положительного эффекта.

Однако остается недостаточно изученным механизм защитного действия и некоторых биологических свойств E.coli М-17: такие как адгезивность к эукариотическим клеткам и тканевым белкам, в частности, к фибронектину; влияние кишечной палочки на слизистую оболочку кишечника; спектр антагонистической активности.

Одной из задач стандартизации является сравнительное изучение и оценка методов контроля свойств препарата для выбора оптимальных тестов, дающих наиболее полную (адекватную) информацию о свойствах продукции при высокой степени надежности и удобстве применения. Существующий метод контроля антагонистической активности колибактерина, основанный на совместном культивировании производственного штамма E.coli М-17 с тест-штаммами шигелл несовершенен и трудоемок, поэтому разработка нового метода оценки и контроля антагонизма была своевременна и актуальна.

В последние годы в мировой практике получили развитие работы по изучению и внедрению в практику медицины эубиотиков из живых культур аэробных спорообразуюших бактерий. Препараты из бацилл (бактисубтил. флонивин, энтерогермин и др.) предназначены для лечения дисбактериозов, острых кишечных инфекций, аллергий и других патологических процессов, вызванных патогенными и условнопатогенными бактериями у людей (В.В.Смирнов, С.Р.Резник, И.Б.Сорокулова, 1992; Fais S., et al., 1987; Rocchietta G..1967; Thach P.N., Vu T.C., Nguen Т.Н., 1968; Wei H., Кап E.,1981). Не смотря на значительный опыт применения споровых эубиотиков в разных странах (Франция. Югославия. Китай, Япония) в нашей стране долгое

время ввелась дискуссия о безопасности широкого применения в медицинской практике споровых эубиотиков. В связи с этим, а также в соответствии с РД 42-28-889 "О создании новых препаратов и их безопасности" необходимы исследования: по безопасности споровых эубиотиков, определение контаминации посторонней микрофлорой, специфической активности (количества живых микробов в дозе препарата и антагонистической активности).

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось выявление новых биологических свойств производственных штаммов эубиотиков (колибактерина, биоспорина и споробактерина) обеспечивающих защиту макроорганизма и характеризующих качество препаратов,' а также их безопасность.

Учитывая вышеизложенное, в соответствие с целью были определены следующие конкретные задачи:

1. Изучение антагонистической и адгезивной активностей E.coli М-17 и производственных штаммов рода Bacillus. с

2. Оценка безопасности споровых эубиотиков и колибактерина.

3. Разработка и стандартизация новых методов контроля специфической активности производственных штаммов и оценка качества коммерческих препаратов.

4. Сравнение сохранения адгезивных и антагонистических свойств у производственного штамма и коммерческих серий препарата.

Научная новизна исследований.

Впервые в модельных опытах изучена адгезивная активность производственного штамма E.coli М-17 и серий колибактерина к эукариотическим клеткам и тканевым белкам. в частности, к фибронектцну, муцину и конА. Доказано, что адгезивная активность производственного штамма сохраняется и у коммерческих серий препарата.

Найдена прямая корреляция между СП А (средним показателем адгезявности) и специфической активностью (количеством живых микробрв в одной дозе препарата). Доказано, что метод определения адгезивной активности серий колибактерина на эритроцитах человека может быть использован как экспресс-метод хгя оценки качества препарата.

Разработана модификация методики оценки антагонистической активности колибактерина методом отсроченного антагонизма. Изучена антагонистическая активность Е.соН М-17 и колибактерина в отношении клинических патогенных и условнопатогенных бактерий.

Впервые дана характеристика адгезивной активности на разных моделях (эритроциты человека, изолированные эпителиальные клетки кишечника крыс) производственных штаммов В.зиЫШэ 534, В.зиЫШБ 3, В.Нс{1епШ)пшз 31 и споровых эубиотиков.

Впервые изучена адгезивносгь тесг-штаммов используемых для контроля антагонистической активности эубиотиков на модели эритроцитов человека и различных типах эпителиальных клеток кишечника крыс.

Изучена безопасность В.виЫШв 534, В.виЫШз 3, В.ИсЬешАэпшз 31 и споровых эубиотиков.

Впервые разработаны методы определения качества споровых эубиотиков, специфической активности (включающие методику отсроченного антагонизма, определения количества живых микробов в дозе препарата) и методика определения контаминации споровых эубиотиков посторонней микрофлорой.

Практическая значимость.

Усовершенствование метода контроля антагонистической активности производственного штамма Е.соИ М-17 и контроля качества (конечного продукта) колибактерина и бификола. Метод определения антагонистической активности внесен в НТД и позволяет объективно оценивать качество препаратов.

Изучение специфической активности (антагонистической активности и определения количества живых микробов в дозе), адгезивности, подбора сред для определения контаминации споровых эубиотиков позволило охарактеризовать биологическую активность и защитные свойства препаратов, отработать методы контроля производственных штаммов и препаратов. Была показана безопасность споровых эубиотиков.

Результаты научной работы отражены в НТД на изученные препараты.

В настоящий момент утверждены: 1. ФС 42 - 3365-97 на колибактерин сухой

- б -

2. ФС 42- 3364-97 на колибактерин в таблетках

3. ВФС 42-371 ВС-92 на споробактерин

4. ЭРП 415-92 на споробактерин

5. ВФС 42-366 ВС-92 на биоспорин

6. ЭРП 580-96 на биоспорин

7. ФС 42- 3268-96 на бификол сухой (контроль антагонизма коликомпонента)

Получен патент РФ № 1722502 "Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудо^о-кишечных заболеваний человека".

Положения, выносимые на защиту. 1. Адгезивная и антагонистическая активности основные механизмы защитного действия и показатели качества эубиотиков. 2. Разработанные я стандартизированные методы контроля качества7 колибактерина и споровых эубиотиков позволяют судить о безопасности препаратов.

Апробация диссертации. Основные положения работы были доложены на конференции молодых ученых в ГИСК им.Тарасевича (Москва, 1989, 1991); Конференции молодых ученых "Актуальные вопросы эпидемиологии и инфекционных болезней", посвященной 30-ти летию ЦНИИ эпидемиологии (Астрахань, 1992 г), на конференции бактериологического отдела ГИСК им.Л.А.Тарасевича.

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ГИСК им.Л.А.Тарасевича.

По материалам диссертации опубликовано 6 статей.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложения.

Работа содержит 207 страниц машинописного текста. 37 таблиц, 7 рисунков. Список использованной литературы составляет 257 названий, в том числе 142 - иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Объектом исследования являлись:

- три варианта E.coli М-17: производственный штамм, хранящийся в ГИСК им.Л.А.Тарасезича и рассылаемый на

производства; исходный штамм М-17П, выделенный Л.Г.Перетцем и хранящийся с 1956 г в музее Ленинградского ЦНИИРРИ; М-17со1 колициногенный вариант из коллекции МНИИЭМ им.Т.Н.Габричевского;

E.coli 18 (основа препарата "Гнотокол", представленный ИЭМ им.Гамалеи).

- новые производственные штаммы из рода Bacillus: B.subtilis 534, представленный Оренбургским мед.институтом; B.subtilis 3 и В. licheniformis 31, представленные Киевским ИЭМ им. Заболотного.

- коллекция свежевыделенных и музейных тест-культур, (включающая набор тест-штаммов, используемых при контроле антагонистической активности эубиотиков: S.sonnei 2802. 5063: S.flexneri 337, 170; E.coli 157; Р.vulgaris 177; P.mirabilis 24a. 249 : S.aureus 209); 64 штамма - представителей патогенной и условнопатогенной микрофлоры кишечника человека (полученные и хранящиеся во Всероссийском музее живых культур ГИСК им.Л.А.Тарасевича).

- препараты:

колибактерин - 35 коммерческих серий, изготовленных Нижегородским НИИЭМ, Тюменским НИИКИП, НПО "Биомед" им, Мечникова, Иркутским противочумным институтом, а также 10 коммерческих серий выпущенных Тбилисским ИВС и Пермским ИБС (данные исследования проводились в 1987г)

споробактерин - 6 лабораторно-экспериментальяых серий, изготовленных Днепропетровским хим.заводом и 10 экспериментально-производственных серий, изготовленных НПО "Иммунопрепарат" г.Уфа

биоспорин - 10 лабораторно-экспериментальных серий, экспериментально-производственных серий. 10 изготовленных Днепропетровским хим.заводом

- препарат сравнения: •- бактисубтил с.86 (Югославия "Галеника")

- животные:

а), при изучение адгезивной активности использовали крыс линии Фишер, самцов, массой 180-200 г

б), при изучение безвредности, острой токсичности использовали беспородных мышей, массой 10-12 г

в), при изучение хронической токсичности использовали гибридных мышей И (СВАхВ1), массой 10-12 г

- формалинизиропанные эритроциты человека 0/1 Ш1(+)

- перевиваемая культура клеток НЕр-2 -(полученная из ВНИИ Медицинской генетики)

- питательная среда - среда Гаузе №2, в ее состав входят: бульон Хотгингера ( 700 мг%КНгК= ) - 30 мл; пептон - 5 г; ЫаС1 - 5 г; глюкоза -Юг; агар-агар - 30 г; дист.вода до 1 л.

Результаты оценивали на основании данных 5-ти опытов.

Изучение культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств:

а), производственного штамма E.coli М-17 и его вариантов проводили регламентированными методами (ФС 42-253 ВС-89); б), штаммов p.Bacillus проводили с соответствии с Методическими рекомендациями (Смирнов с соавт.. 1983); в), патогенных и условнопатогенных микроорганизмов проводили общепринятыми методами.

Изучение адгезивных свойств осуществляли на моделях:

- формалинизированных эритроцитах человека (В.Брилис, 1984);

- изолированных эпителиальных клетках кишечника крыс in vitro (Е.М.Горская с соавт.. 1989);

- культуре клеток НЕр-2 (Baldassarii L.. et al.. 1987); иммобилизированных субстратах (фибронектин. муцин, конканавалин А) з реакции бактериосорбш-ш (В.Л.Николаев. М.У.Дусмагамбетов. М.М.Дыхно, 1990).

Также исследование фибронектинсвязывания осуществляли методом пассивной ггмагглютинацип (Е.В.Сокуренко с соавт.. 1989).

Выбор моделей обусловлен задачами работы по комплексному изучению механизмов адгезии эубиотиков и тест-штаммов.

Изучение антагонистической активности эубиотиков и их производственных штаммов проводили методами смешанных бульоных культур (ФС 42-253 ВС-89) и отсроченного антагонизма на плотных средах.

Определение количества живых микробов в 1 дозе препарата определяли культуральным методом путем высева на плотные среды различных разведений препарата с последующим инкубированием и подсчетом колоний.

Определение контаминации посторонней микрофлорой споровых эубиотиков осуществляли посевом препаратов на набор дифференцирующих сред, используемых в качестве селективных для определенных групп микроорганизмов, для контроля были избраны следующие среды: Эндо (для выявления лактозонегативных бактерий кишечной группы), Сабуро (для выявления грибов), агар с мочевиной (для выявления протея), солевой агар (для выявления стафилококков), МПА и среда Гаузе №2. Высев проводили по методу Дригальского, с последующим инкубированием.

Безопасность производственных штаммов р.Bacillus оценивали по отсутствию токсичности, токсигенности и вирулентности в соответствии с Методическими рекомендациями (Смирнов с соавт.. 1983). При изучении острой и хронической токсичности использовали Методические рекомендации доклинических испытаний новых медицинских иммунобиологических препаратов (РД 42-28-8-89: 1989).

Статистическую обработку экспериментального материала проводили согласно рекомендациям И.П.Ашмарина. В.В.Воробьева (1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для изучения показателя адгезивности использовали культуру E.coli М-17, выращенную на целлофане расположенном на МПА. без последующего отмывания от продуктов метаболизма. Способ культивирования культуры на целлофане наиболее физиологичен, т.к. при этом травматизация оболочки бактериальной клетки менее выражена. Нами установлено, что штамм обладает разным уровнем адгезивной активности в зависимости от использованной модели (Таблица № I). На модели эритроцитов штамм проявлял зысокую адгезивную активность: СПА (средний показатель адгезивности) -5.74 + 0,23; а процент эритроцитов, имеющих на сзоеп поверхности прилипшие микробы составлял - 98.6.

Для выявления основных рецепторов адгезии кишечной палочки на отдельных участках пищеварительного тракта были выбраны 3 модели исследования: энтероциты, энтероциты зоны пейровых

Таблица № I

Адгезивная активность производственного штамма E.coli М - 17 на

разных моделях

№ Модель (субстрат Показатель адгезивности Степень

№ для адгезии) (М±ш) адгезивности

1. Эритроциты СПА 5,74 +0.23 высокая

К(%) 98.6 +0,6

2. Энтероциты 6.15 ±0.971 средняя

3. Энтероциты зоны

пейеровых бляшек 4,275 ±1.095 слабая

4. Колоноциты 15.81+2.2274 высокая

5. ■ Культура клеток НЕр-2

/30 мин/ 64,667 +6,766 высокая (ДА)

/180 мин/ 149.5 +16.128 высокая

Бактериосорбция

6. Муцин /опыт/ 0.19+0,02 р<0.01 высокая

/контроль/ 0,06+0.01

7. Фибронектин /опыт/ 0.16+0.015 р<0,01 высокая

/контроль/ 0,05+0,01

8. Конканавалин А /опыт/ 0.14+0.01 р<0.01 высокая

/контроль/ 0.05 ±0,01

бляшек и колоноциты. Обнаружено, что E.coli М-17 обладает более зысокой адгезивной активностью к эпителиальным клеткам толстого кишечника, т.е. на поверхности микробной клетки расположено большое количество адггзинов к рецепторам колоноиитов. Данный гест может быть рекомендован хтя решения вопроса о месте микроба з кишечнике для его полной штаммовой характеристики

Определены высокие показатели колонизационной активности штамма Exal i М-¡7. Для кишечной палочки М-¡7 характерна диффузная адгезия к культуре клеток НЕр-2 (6—.667 - 6.766) п зыраженная способность к размножению после тиех часов инкубации ¡ !-9.5 - '.о. ¡231. Ранее исследователи считали, что днфшузнцл адгезия на клетка:; НЕр-2 характерна только для штаммов з-нтсропатогсннь;:;

эшерихий (Tacket С.О. et al„ 1990). Однако, Maslow et al. (1993) доказал, что диффузной адгезией обладают также штаммы непатогенных эшерихий, выделенных от здоровых детей.

В связи с вышеизложенным, по нашему мнению, согласно полученным данным также нельзя считать диффузную адгезию только показателем патогенности, и возможно благодаря ей

производственный штамм может успешно конкурировать за рецепторы кишечника с энтеропатогенными бактериями.

Впервые нам удалось установить, что штамм E.coii М-17 обладает высокой степенью адсорбции к муцину, фибронектину и конканавалину А (р>0,01). Таким способом, лектины

производственного штамма связываются с углеводными компонентами молекул макроорганизма. При этом адгезия E.coii М-17 к муцину находится в прямой коррелятивной связи с адгезией к фибронектину и конА. Полученные данные указывают на то. что E.coii М-17 может успешно соперничать с патогенами за места прикрепления и колонизировать фибронектин- и муцин-содержашие биосубстраты. Полученные данные позволяют раскрыть механизмы создания и коррекции микробных ценозов человека в норме и патологии. Определение же в каждом конкретном случае точной природы рецепторов имеет не только теоретическое, но и прикладное значение.

При анализе полученных результатов выявлена достаточно высокая корреляция между адгезивной активностью E.coii М-17 на моделях эритроцитов и колоноцитах кишечника крыс. Наиболее простой и доступной моделью оказались эритроциты, поэтому данная модель была использована в наших дальнейших исследованиях.

Было показано, что условия культивирования влияют на СПА. Наибольший показатель адгезивности выявлен у культуры выращенной на целлофане, при отмывании продуктов метаболизма он снижается (Таблица >62).

Изучено злияние на адгезивную активность производственного штамма E.coii М-17 лиофилизации, широко используемой для сохранения качества препарата. Показано. что процессы замораживания и высушивания не оказывают существенного злияния на адгезивную активность. Однако защитная ;реда зысушивання обволакивает оболочку, з результате чего клетка экранирует - снижая показатель адгезивности. При отмывании защитной среды показатель адгезивности восстанавливает-::!.

Таблица № 2

Адгезивная активность производственного штамма Е .coli М-17 __на модели на эритроцитов_

Условия Показатели адгезивной Показатели адгезивной

культивирова- активности активности

ния птг.Е.соЦ М- (прогрев при 56 "С в течение 1 ч.)

17 СПА К (%) СПА К(%)

[.Суточная 3,98+0,18 92 1.99+0,15 47

культура со 5,42+0.31 100 2.21+0,29 so

скошенного 5.88+0,75 94 1.83+0,21 42

МПА. с 3,38+0,28 94 - -

отмыванием 4,99+0,21 96 - -

М + ш 4,83+0,39 95.2+1.36 101+0.11 46.33+2.33

2. Счточная 6.09+0,25 98 1.8+0,11 60

культура с 5,11+0,11 100 2,04+0,298 67

целлофана, не 6,25+0,28 100 1.71+0,20 62

отмытая 5,97+0,34 97 - -

5.26+0.43 98 - -

М + т 5.74+0.23 98.6+0,6 1.85+0,098 63.0+2.081

3. Суточная 3.84+0,29 88 - -

культура с 2,72+0,189 86 - -

целлофана 3,09+0,251 85 - -

отмытая 2,97+0,31 82 - -

2.99+0.24 85 -

М - т 3,12+0,1896 85.2+0.97 -

4.Лиофилизиро- 5,64+0,41 92 1.3+0,21 65

ванная 4.28+0,125 94 2.01+0.33 68

культура. 3,76+0,315 94 2.6+0.28 60 :

отмытая от сред 4,58+0,33 100 - 1

высушивания и 5,08+0,441 99 -

защитной

М -т 4.668+0.524 95.8+1.562 2.137+0.299 64.3+2.33

5.Лиофилизиро- 2.01+0,26 70 1.21+0,195 42

ванная 1,98+0./7 73 /.39+0,112 48

культура, не 2,51+0,32 69 2.01+0.15 42

отмытая от сред 1,73+0,156 72 - -

высушивания и 2.40+0,35 75 - -

защитной

Мгш 2.126+0.144 71.8+1.07 | 1.703+0.249 | 46.3+2.186

В таблице приведены средние значения 5 опытов

Это было подтверждено при исследовании 30 серий колибактерина. выпущенных разными производствами (Рис. 1). Отмеченная при этом большая вариабельность значений СПА (от 3.89 + 0.48 до 13.2 + 1.5) коррелировала с вариабельностью количества живых микробов в дозе препарата (от 6.544 до 14.742x10 9). Было установлено, что на оба показателя оказывают влияние условия хранения препарата. Хранение колибактерина при 3 °С не приводит к сколько-нибудь значительному снижению как СПА. так и количества живых микробов в дозе до конца срока годности, в то время как хранение при 24 °С приводит к снижению обоих показателен.

Сит тецифичегкой активности (количеством живых микробов в дозе препарата) с показателем адгезивности (СПА) в колибактерине

12

□ СПА

Ц количество живых

НИИЭМ НИИКИП НПО «Биомед» НИИПЧИСДВ НИИВС НПО «Биомед» Производственный штамм

Нижний Новгород "(юмьпь им. Мечникова Иркутск Тбилиси Пермь E.coli М-17

•о

4 s

о

9

Адгезия производственных штаммов

□ ЕсоК М 17

□ 534 Ш ВзиЬпНь 3

М В11сЬеп|(оггп15 31

Эр1 процнш

Эпителиальные клетки тонкого кишечника

Эпителиальные

клетки кишечника зон пейероаых бляшек

Эпителиальные клетки толстого кишечника

пз X О

Отмеченная прямая зависимость между этими показателями, позволяет нам предложить оценку уровня адгезивности на эритроцитах, как экспресс-метод для определения качества готового препарата колибактерина без предварительного высева. Для уточнения критериев оценки качества по показателю адгезивности необходимо комиссионное испытание данного метода на базе предприятий.

Важно отметить, что серии колибактерина, выпущенные под вакуумом имели более высокие и стабильные показатели СПА и количества живых микробов в дозе, чем выпущенные в атмосфере азота. По нашему мнению это может быть связано с плохим качеством азота, применяемого в качестве инертного газа при запайке ампул с препаратом (повышенным содержанием кислорода или недостаточной концентрацией азота).

Сравнительное изучение адгезивной • активности

производственных штаммов Е.соН М-17 и В.БиЫШз 534. 3 и В.ПсЬешГоптш 31. споровых эубиотиков и колибактерина показали, что все изученные производственные штаммы споровых эубиотиков обладают низким индексом адгезивной активности (ИАМ) к эритроцитам (от 0.76+0,1 до 0.93+0,7) и слабой или средней адгезивностью к эпителиальным клеткам кишечника (Рис. 2).

Штаммы В.ьиЫШз 534 и 3 имеют больше адгезинов к рецепторам энтероцитов. особенно в зоне пейеровых бляшек /р.0.05/ и меньше - к рецепторам эпителиальных клеток толстого кишечника. Штамм В.ПсЬешГоггшз 31 лучше всего адгезировал к колоноцитам. Все вышеизложенное доказывает правильность подбора штаммов в биоспорине (В.зиЬгШэ 3 и В.Ис1геш1огт1Б 31). т.к. входящие в его состав штаммы имеют адггзины к рецепторам разных эпителиальных клеток кишечника, благодаря чему препарат может проявлять активность в разных отделах кишечника.

Коммерческие серии биоспорина и споробактерина подобно производственным штаммам и з отличие от колибактерина проявляют низк'/ю адгезивную активность на эритроцитах (1.02 ± 0.06: 0.74 ± 0.02)!

Сравненне .механизмов активности препаратов колибактерина и споровых эубиотиков позволяет сделать заключение, что первый обладает сзойстзами обеспечивающие задержку и фиксацию кишечной палочки з кишечнике (адгезия колоноцнтов. фибронектпна. муцина, колонизационная актизность >. Эти сзоистза практически отсутствуют у споровых >>оиотиков. следовательно они значительно быстрее покидают кишечник.

В связи с тем, что эубиотики используются для лечения ОКИ и дисбактериозов различной этиологии, был исследован уровень адгезивной активности 18 штаммов патогенных и условнопатогенных бактерий: свежевыделенных, клинических, коллекционных и тест-штаммов. Сравнение было проведено на эритроцитах человека, на эпителиальных клетках тонкого и толстого кишечника крыс (Таблица 3).

Результаты исследования свидетельствуют о том. что изученные штаммы различаются по адгезивной активности и тропности. Коллекционные штаммы, тест-штаммы шигелл обладали низкой и средней адгезивной активностью к эритроцитам и средней и высокой -к эпителиальным клеткам кишечника.

Свежевыделенные штаммы эшерихий (599 и 622) обладали низкими индексами а дг ез и в н о ctj|.h а эритроцитах. При этом штамм 599 выделенный из ликвора имел больше адгезинов к рецепторам толстого кишечника, а штамм 622 - выделенный из кала больного к^ рецепторам пейеровых бляшек.

Изучение уровня адгезивности тест-штаммов протеев показало, что штамм P.mirabilis 24а - обладает высоким показателем на эритроцитах и колоноцитах в отличии от P.vulgaris 177.

Штаммы Klebsiella и Serraiia (10886 и 60/2) выделенные из внешней среды обладали низким индексом адгезивности на эритроцитах в отличие от штаммов, выделенных из ликвора и крови (319. 10944 и 163). причем последние были наиболее активны в толстом кишечнике.

Штаммы стафилококков проявляли низкий индекс адгезивности на эритроцитах. Наибольшая активность у стафилококков связана с энтероцитамп ¿при более низких показателях к колоноцитам.

Сравнительное исследование адгезивной активности производственного штамма E.coli М- -7 со штаммами патогенных и условнопатогенных бактерии доказали, что кишечная палочка может конкурировать за рецепторы холоношггов кишечника со штаммами: S.sonnei. E.coli. К.pneumoniae. S.marcescens. Таким образом, результаты наших исследований сзидетгльстзуют. что при одинаковом механизме колонизации, основанном на наличии адгезинов и рецепторов у микро- л макрсорганизмов. эубиотики. патогенные л У7Т5 различаются ло зтепенп адгезизнести :< различным клеткам. Это .может :зидетелъстзоватз зб особенностях экологических ниш кишечника, обусловленных различной репенторнои активностью

Таблица № 3

Адгезия патогенных и условнопатогенных микроорганизмов

к различным моделям

Название штаммов Показатели адгезии на

эритроцитах эпителиальных клетках киш-ка

С ПА К% ИАМ тонкого пейеров. бляшек толстого

1. S.flexneri 170 1,94^0,6 80+8,2 2,42+ 0,4 (НА) 8,7+ 0,7 (СрА) 12,9+ 0,8 (ВА) 8,5+ 1,1 (СрА)

2. S.flexneri 337 1,81+0,4 64+7,5 2,81 + 0,5 (СрА) 10,4+ 0,1 (ВА) 9,17+ 1,1 (СрА) 10,96+ 0,8 (ВА)

3. S.sonnei 2802 1,80+0,28 73+8,4 2,46 +0,3 (НА) 4,7+ 0,53 (СлА) 14,77+ 1,9 (ВА) 24,2+ 2,7 (ВА)

4. S.sonnei 5063 2,70+0,31 63+7,4 4,29 +0,3 (ВА) 5,79+0,7 (СрА) 6,81 +0,7 (СрА) 8,72+ 0,9 (СрА)

5. E. coli 157 2,08+0,29 78,9+6,5 2,63+ 0.4 (СрА) 5,0 + 0,34 (СрА) 4,8+ 0,3 (СрА) 7,24 + 0,8 (СрА)

*"б. E.coIi E19a 4,40+0,2 94+7,5 4,68+0,3 (ВА) 2,4 + 0,37 (СлА) - 2,6+ 0.6 ' (СлА)

7.E.coli 622 1,65+0,11 84+6,5 2,1+0,1 (НА) 8.36+1,02 (СрА) 14,4+ 1.67 (ВА) 7,6 + 2,03 (СрА)

8.E. coli 599 1.425+0,2 70+7,8 2,04+ 0,3 (НА) 9,23 + 0,9 (СрА) 6.77+0,71 (СрА) 25,5+ 2.7 (ВА)

9. P.mirabilis 24a 7.96+0.3 100±0 7,96+ 0.4 (ВА) 6,3 +0,51 (СрА) - 7.8 +0.9 (СрА)

10. P.vulgaris 177 1,70+0.36 88+8,2 1.93 + 0,1 (НА) 7,5 +0,73 (СрА) - 4,3+ 0,3 (СлА)

1 l.K.pneumon. 10944 5,20+0.56 92,5+4,5 5,62+ 0,6 (ВА) 10,9+1,21 (ВА) 19.2+ 1,4 (ВА) 29,3 + 1,4 (ВА)

12.K.pneumon. 10886 1,78+0.3 75+5,3 2,38+ 0,2 (НА) 6,8 + 0,76 (СрА) 20.05+ 1.3 (ВА) 23,3 + 2,5 (ВА)

lj.K.pneumon. 319 6,00+0,63 92.3+6,1 6,75+ 0.2 (ВА) 17,2 + 3.02 (ВА) 15,3 + 1.94 (ВА) 9,76+ 0.S (СрА)

14.S.marcescens 60(2) 2,33+0.1 76.2+2,8 3,06+0,4 (СрА) 6,7 + 0,42 (СрА) 10,18+ 0,5 (ВА) 8.0 + 0,67 (СрА)

15.S.marcescens 163 4,40+0.6 92+4,2 4.3+ 0.2 (ВА) 14,29 + 1.5 (В А) 21.8+ 1.68 (ВА) 29,2+ 1,4 (ВА)

16. S. aureus 209 1,30+0.3 85.7+6.0 2,2+ 0,1 (НА) 15.3+ 1.93 (ВА) 11.87 + 1.5 (В А) 3.2 + 0,41 (СРА)

17. S.aureus ''Никифоров" 2,68+0,2 I 86+4,1 3,12+0.2 (СрА) 16.3 + 1.87 (ВА) 10.9 ± 1,82 (ВА) 4.0 + 1.2 (СрА)

18. S.aureus "Лоссмонов" 2,38+0.1 80+4.9 2.93+0.2 (НА) 17.9+1.1. 09 (ВА) 11,99+ 1.7 (ВА) 4.2+ 1.3 (С.тА)

Примечание: - - не изучали: ВА - высокоадгезивный штамм: СрА -среднеадгезнвный штамм: СлА - слабоадгезнвныГ/ штамм: НА - ннзкоадгезнвньш

штамм.

эпителиальных клеток. Следовательно, при подборе эубнотика для получения наибольшего лечебного эффекта необходимо учитывать общность его адггзинов к рецепторам эпителиальных клеток

щ

Антагонистическая активность производственного штамма Е coli М17, исходного штамма Е.coli М17П и колибактерина в отношении некоторых патогенных и условнопатогениых микроорганизмов

S. sonnei S. flexneri S. typhi S. typhimurium E. coli K. pneumon S. ilarcescens P. vulgaris P. mirabilis S. aureus

s о

кишечника. Особенно это нужно учитывать при оценке новых штаммов эубиотиков и подборе тест-штаммов к ним, так как если эубиотик наиболее адгезивно активен в толстом кишечнике, то для контроля его активности следует подбирать тесг-штаммы тех видов, которые поражают данный отдел.

Учитывая опыты изучения адгезивности на различных моделях для штаммов колибактерина и условнопатогенных бактерий можно сделать заключение, что адгезивная активность является одним из ведущих свойств в механизме лечебной эффективности препарата на ряду с антагонистической активностью. Оба эти механизма тесно связаны с количеством живых бактерий в препарате. Нарушение технологического процесса, условий хранения, снижает качество препарата.

Одним из общепринятых ведущих показателей качества эубиотиков на ряду с количеством живых микробов в дозе, является их антагонистическая активность. Контроль антагонистической активности колибактерина согласно действующей документации определяется методом совместного культивирования. Однако, этот метод требует использования как разных условий культивирования и подбора оптимальных соотношений между микробами, так и использования различных дифференцирующих сред, что затрудняет проведение объективной оценки антагонистической активности, внося в эти эксперименты элемент нестандартности и влияя на воспроизводимость результатов. Кроме того при контроле антагонистической активности при совместном культивировании проверяется свойство культуры, а не препарата. Ряд исследователей доказали, что E.coli М-17 проявляет свои антагонистические свойства и на плотных средах (Поспелова В.В. с соавт., 1990; Шимчук Л.Ф., 1983). Нами была отработана методика оценки антагонистической активности колибактерина на плотной среде Гаузе №2 методом отсроченного антагонизма. Данная методика позволила получить воспроизводимые результаты. Использование "чашечного" метода, а также единой среды для выращивания бактерий разных таксономических групп дало возможность стандартизовать условия опыта и объективно оценить активность эубиотиков в отношении тест-микробов.

С помощью нового метода контроля изучена антагонистическая активность производственного штамма E.coli М-17 и его исходного штамма E.coli М-17П и 5 серий колибактерина к 51 штамму патогенных и условнопатогенных микробов (Рис. 3).

Антагонистическая активность производственных штаммов В subtilis 534, В subtilis 3 и B.licheni-forrnis 31 в отношении патогенных и условнопатогенных микроорганизмов

40 35 1 30

• U

5 25

а

S 20

*

а..

а. 15

аз in

х 10

□ a subtilis 534 g в subtilis з I В licheni formis 31

w о

S. sonnei S. flexneri S. typhi S. typhimurium E. coli К. pneumon S. marcesüns P. vulgaris P. mirabilis S. aureus C. albicans

>o s о

5

AiiraroHHCTHMecKafl aKTHBHOCTb 3y6n0THK0B b OTHOwewuw. naioreHHbix m yCAOBHOnaTOreHHblX MHKpOOpraHH3MOB

S.sonriei S. flexneri S. typhi 5. typhimurium E. coli K. pneumoniae S. marcescens P. vulgaris P. mirabilis S. aureus C. albicans

s

Q

Ul

Исследование показало, что производственный штамм E.coli М-17 по показателю антагонистической активности не отличается от исходного авторского штамма E.coli М-17П и данный показатель сохраняется у готового препарата. Следует отметить, что нами впервые была показана антагонистическая активность колибактерина к клиническим штаммам K.pneumoniae и Serratia. Этот факт является чрезвычайно важным, так как во всем мире возрастают инфекции, вызываемые данными условнопатогенными микроорганизмами.

Антагонистическая активность новых производственных штаммов споровых эубиотиков изучена в отношении 54 штаммам патогенных и условнопатогенных микробов. Как показали исследования между показателями антагонистической активности производственных штаммов B.subtilis 534 и B.subtilis 3 существует разница, однако эти показатели статистически достоверны (р<0,05) только в отношении к штаммам S.sonnei, S.typhi. S.typhimurium. Производственные штаммы B.subtilis 534, 3 обладают высокой антагонистической активностью к штаммам S.aureus и Candida albicans (Рис.4).

Разница показателей антагонистической активности между штаммами B.subtilis 3 и B.licheniformis 31 по отношению к S.sonnei. S.flexneri. S.typhi. S.typhimurium, S.aureus, Candida albicans была статистически достоверной (p<0,05). Все это подтверждает то что в биоспорине данные штаммы дополняют друг друга.

Сравнительное изучение антагонистической активности колибактерина и споровых эубиотиков (Рис.5) показало, что первый обладает более высокой антагонистической активностью к тест-штаммам S.sonnei, S.flexneri, S. typhi, К. pneumoniae, S. marcescens (p<0,05). Вместе с тем в отличие от колибактерина производственные штаммы B.subtilis 534, 3 обладают высокой антагонистической активностью к штамму S.aureus и Candida albicans (р<0.05), а антагонистическая активность штамма B.licheniformis 31 сходна с колибактерином (р<0,05).

Проведенное исследование показало, что методика отсроченного антагонизма имеет преимущество с методом совместного культивирования кишечной палочки М-17 со штаммами шигелл ,она более информативна и эффективна. Благодаря этой методике установлено, что показатели антагонистической активности колибактерина и споровых эубиотиков в отношении регламентированных тест-штаммов не отличаются от показателей к аналогичным видам свежевыделенных штаммов. поэтому не представляется целесообразным замена их на новые штаммы. Вместе с

тем при контроле антагонистической активности колибактерина следует исключить штамм стафилококка, а при контроле споровых эубиотиков наоборот расширить набор стафилококков и включить Candida albicans, т.к. бациллы проявляют антагонизм в отношении этих микроорганизмов. На основании результатов исследования данный метод был внесен в НТД на эти препараты.

Создавая в 30-е года колибактерин, Перец в основном задумывал его как лечебный препарат против дизентерии, особенно хронической. Наше исследование показало, что препарат обладает высокой антагонистической активностью не только к штаммам S.sonnei, S.flexniri, S.typhi. но и K.pneumoniae. S.marcescens. Вместе с тем, при дисбактериозах обусловленных стафилококком и кандида следует применять иные препараты, такие как биоспорин и споробактерин.

В следующую задачу наших исследований входила отработка лабораторных методов контроля показателей качества производственных штаммов и препаратов споровых эубиотиков'" (безвредности, токсичности. токсигенности. вирулентности, контаминации посторонней микрофлорой, определения количества живых микробов в дозе препарата и антагонистической активности), их стандартизация и оценка безопасности в соответствии с Методическими рекомендациями (РД 42-28-889). Результаты исследований послужили основой для включения методов контроля в ВФС и РП на биоспорин и споробактерин. При изучении острой и хронической токсичности в качестве препарата сравнения были взяты: бактисубтил, который широко используется в медицинской практике всего мира, и колибактерин, обладающий иным механизмом лечебного действия. Доклинические методы исследований показали, что производственные штаммы и споровые эубиотики и штамм E.coli М-17 и колибактерин не вызывают во внутренних органах и ЦНС изменений, указывающих на наличие токсического действия даже при введении доз. значительно превышающих человеческие. Кроме того, для биоспорина. споробактерина и их производственных штаммов, в отличие от бактисубтила. не удалось установить LDso. Следует отметить, что у значительного числа подопытных и контрольных животных на первые сутки опыта отмечались з легких серозные и серозно-гнойные бронхопневмонии. Однако з отличие от контрольных и опытных животных, которым вводили бактисубтил. у мышей, получавших препараты биоспорин. споробактерин (а также их производственные штаммы) подобная патология в легких отсутствовала. Проведенные нами исследования показали, что новые споровые производственные штаммы и эубиотики не токсичны, не токснггнны. не вирулентны, безвредны, т. г. они безопасны.

- 24 -

Таким образом, на основании исследований уточнен механизм действия эубиотшеов. В механизме защитного действия колибактерина ведущим свойством является адгезивная и антагонистическая активности обеспечивающие колонизацию толстого кишечника за счет адгезии, колонизации и вытеснения патогенное. Споровые эубиотики обладают слабой или средней адгезивностыо, но при этом они проявляют выраженное антагонистическое действие и способствуют быстрому восстановлению исходной нормофлоры.

ВЫВОДЫ

1. Ведущим свойством в механизме защитного действия колибактерина является высокая адгезивная активность его производственного штамма Е.соН М-17, показанная на различных моделях: эритроцитах человека, культуре клеток НЕр2 и изолированных эпителиальных клетках толстого кишечника крыс. Установлено, что рецепторами к адгезинам кишечной палочки М-17 служат гликопротеины муцина и фибронектин, что позволяет ей успешно конкурировать за места адгезии с патогенными и условнопатогенными энтеробактериями.

2. На основе обнаружения прямой коррелятивной зависимости между выраженностью адгезии и количеством живых бактерий в колибактерине разработан экспресс-метод оценки адгезивной активности препарата на эритроцитах человека, что позволяет судить о его качестве и стандартности. Процесс лиофилизации препарата не оказывает влияния на средний показатель адгезивности. в то время как среда высушивания снижает адгезивные свойства, а продукты метаболизма - повышают их.

3. Разработанная модификация методики оценки антагонистической активности колибактерина методом отсроченного антагонизма позволила выявить более широкий спехтр антагонистической активности кишечной палочки, включающий значительное подавление роста клинических штаммов К.рпеитошае и Б.тагсезсеш. Установлены оптимальные показатели антагонистической активности при оценке качества колибактерина.

4. Производственные штаммы споровых эубиотиков - В.зиЬгШз 3. 534 н В.ПсИепйогпш 3! обладают низким индексом адгезивности на эритроцитах человека. низким и средним показателем адгезивности на эпителиальных клетках кишечника крыс.

5. Споровые эубиотики. длительность пребывания которых з кишечнике ограничена, обладают выраженным антагонистическим

действием в отношении патогенных и условнопатогенных бактерий, наибольшим эффектом в отношении S.aureus и Candida albicans.

6. Доказана безопасность споровых эубиотиков - биоспорина и споробактерина: они безвредны, не токсичны, не токсигенны, не вирулентны, не обладают острой и хронической токсичностью.

7. Разработанные методы контроля производственных штаммов и контроля качества споровых эубиотиков (определения контаминации посторонней микрофлорой, количества живых микробов в дозе препарата и антагонистической активности) позволяют судить о активности, стандарстности и безопасности препаратов.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1.Скорикова (Осипова) И.Г. Адгезия колибактерина./Сб. YI Всероссийского съезда ВНОМЭП., М., 1991., Т.2.,,£.128.

2.Сокуренко Е.В., Богин И.Б., Филатова H.H., Шнар М.В., Скорикова (Осипова) И.Г. и др. Исследование фибронектинсвязывания сальмонелл методом пассивной гемагглютинации./ЖМЭИ., 1991., №11, С.7-11.

3.Патент РФ № 1722502. Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека/ Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая O.A., Верило Э.А., Скорикова И.Г. с соавт.//Бюл. № 12 (46) 30.03.92.

4.Скорикова (Осипова) И.Г. Адгезия эубиотиков к различным отделам слизистой кишечника./ Сб.тр. молодых ученых:" Актуальные вопросы эпидемиологии и инфекционных болезней"., М.. 1992., С.84-86.

5. Чупринина Р.П.. Скорикова (Осипова) И.Г., Евлашкина В.Ф. Препараты для профилактики и лечения дисбактериозов различной этиологии./В монографии: "Актуальные проблемы создания и применения иммунологических препаратов для диагностики и профилактики инфекционных болезней. - Пермь, 1993., T.l, С.264-279.

6.Осипова И.Г.. Андреева З.М.. Абрикосова Н.Ю. Антагонистическая активность колибактерина и споровых эубиотиков./Тез. докл. Всероссийской научно-практической конференции "Дисбактериозы и эубиотиков"..М.. 1996.. С.28.