Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие Bifidobacterium bifidum штамм 1 и Escherichia coli штамм М-17 в бификоле, изготовленном при совместном культивировании производственных штаммов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие Bifidobacterium bifidum штамм 1 и Escherichia coli штамм М-17 в бификоле, изготовленном при совместном культивировании производственных штаммов"

ÜÜ34811Б9

На правах рукописи

ЛАДЫГИНА Александра Владимировна

Взаимодействие Bifidobacterium bifidum штамм 1 и

Escherichia coli штамм М-17 в бификоле, изготовленном при совместном культивировании производственных штаммов

03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

о О О ' ■ • .7Л J

Москва - 2009

003481159

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л. А. Тарасевича Роспотребнадзора

Научный руководитель:

доктор медицинских наук

Чупринина Раиса Павловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

кандидат биологических наук

Грубер Ирина Мироновна Суркова Инна Генриховна

Ведущая организация:

Федеральное государственное унитарное предприятие «Научно-производственное объедргнение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» Министерства здравоохранения Российской Федерации ФИЛИАЛ в г. Пермь «Пермское Научно-производственное объединение «Биомед»

Защита состоится « 2009 г в 1Э на заседании диссертационного

совета. Д 212.203.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» по адресу:! 17198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6

Автореферат разослан

<1 бМлИ

-12009 ]

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

О.Б. Гигани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Постоянное влияние неблагоприятных факторов на жизнедеятельность человека, нередко превышающее компенсаторные возможности состояния системы «окружающая среда - макроорганизм микробиоциноз», способствует развитию дисбиотического состояния и, как следствие этого, проявлению заболеваний инфекционной и неинфекционной природы. Известно, что представители нормофлоры принимают самое непосредственное участие в биохимических, метаболических и иммунологических процессах макроорганизма за счет продукции ими различных ферментов, витаминов, биологически активных (антибиотикоподобных) веществ и других, разных по действию, продуктов метаболизма (Воробьев А.А. с соавт., 1999; Шендеров Б.А., 2002; Бондаренко В.М., 2008). Поэтому для профилактики и лечения таких состояний в медицинской практике широко используют пробиотики.

Лечебное действие монопрепарата ограничено индивидуальным спектром биологической активности штамма, на основе которого изготовлен пробиотик. Для повышения и расширения лечебного действия пробиотиков в практику здравоохранения внедрены комплексные препараты, изготовленные на основе двух и более штаммов одного вида или разных видов представителей нормофлоры: бификол, ацилакт, аципол, флорин форте.

Отечественный комплексный препарат бификол разработан на основе двух видов микроорганизмов - Bifidobacterium bifidum штамм 1 и Escherichia coli штамм М-17 (Рахимова Н.Г., 1977). Несмотря на длительный срок выпуска препарата, серии бификола отличаются друг от друга по показателям количественного содержания живых бифидобактерий и кишечной палочки в дозе. Это может быть обусловлено несовершенством технологии изготовления бификола, использованием различных по составу питательных сред, изменением свойств микроорганизмов при совместном их культивировании, несовместимостью используемых штаммов и другими факторами.

Лечебная эффективность пробиотиков определяется совокупностью биологических свойств штаммов, входящих в их состав. Вместе с тем данные литературы свидетельствуют о том, что при совместном культивировании нескольких видов микроорганизмов возможно усиление или ослабление некоторых биологическими свойствами монокультур: кислотообразующей, антагонистической и

• 2 адгезивной активностей, резистентности к антибиотикам, продукции биологически активных веществ (Ганина В.И., 2001; Фадеева И.В., 2004; Несчисляев В.А.; 2005; Петров Л.Н., 2008). Механизм взаимодействия культур в смешанной популяции недостаточно изучен и привлекает внимание исследователей для решения технологических вопросов микробиологического производства,

В этой связи, исследования по изучению механизма взаимодействия культур В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в бификоле в смешанной популяции при оценке их биологических свойств (биосовместимости, морфо-физиологического состояния клеток в бификоле, антагонистической активности in vitro и безопасности препарата in vivo) актуальны и имеют научную и практическую значимость для повышения качества коммерческого препарата.

Цель настоящей работы - изучение механизма взаимодействия В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в комплексном препарате бификол в опытах in vitro и in vivo.

Задачи исследования:

1. Изучение взаимовлияния культур бифидобакгерий и кишечной палочки и продуктов их жизнедеятельности друг на друга при совместном культивировании.

2. Изучение морфологического состояния клеток В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в коммерческих сериях бификола, бифидумбактерина и колибактерина.

3. Оценка антагонистической активности бификола и производственных штаммов В. bifidum urr. 1, Е. coli шт. М-17 в аэробных и анаэробных условиях по отношению к регламентированным и музейным тест-штаммам патогенных микроорганизмов.

4. Изучение безопасности бификола в опытах in vivo на модели «острой» и «хронической» токсичности, и оценка совместного действия двух компонентов бификола на организм экспериментальных животных.

Научная новизна исследования:

На экспериментальной модели оценки совместимости штаммов В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 установлено стимулирующее влияние кишечной палочки и продуктов ее жизнедеятельности на рост бифидобактерий и ингибирующее действие бифидобакгерий и продуктов их метаболизма на рост кишечной палочки.

Впервые изучено морфо-физиологическое состояние клеток В. bifidum urr.l и Е. coli шт. М-17 в коммерческих лиофилизированных препаратах бификоле,

бифидумбакгерине, колибактерине. Сравнительный анализ электронно-микроскопических исследований выявил наличие взаимного антагонизма бифидобактерий и кишечной палочки в смешанной популяции при их совместном и раздельном культивировании в процессе производства бификола.

На основании результатов изучения взаимодействия культур в смешанной популяции в бификоле при испытании антагонистической активности в аэробных условиях и с использованием анаэробных систем разработана модификация метода контроля антагонистической активности бификола.

При изучении взаимодействия В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в бификоле в опытах in vivo на моделях «острой» и «хронической» токсичности показана безопасность ассоциации штаммов в бификоле.

Теоретическая п практическая значимость исследования.

На модели бификола научно обоснована целесообразность: - изучения взаимодействия штаммов в комплексных препаратах с помощью различных методов исследования: оценки совместимости, антагонистической активности, кислотообразующей активности, безопасности;

изучения биологических свойств комплексных препаратов в сравнении со свойствами микроорганизмов, входящих в их состав, для оценки взаимовлияния их на основные показатели, определяющие качество готового комплексного препарата;

- изучения антагонистической активности комплексного препарата с использованием оптимальных условий культивирования для каждого компонента смешанной микробной популяции;

- изучения безопасности моно- и комплексных пробиотиков в опытах «острой» и «хронической» токсичности в сравнении со штаммами, входящими в состав препарата.

Электроннно - микроскопические методы исследования морфологического состояния клеток в коммерческих препаратах - бификоле, бифидумбактерине, колибактерине - расширяют существующие представления о взаимодействии культур в смешанных микробных популяциях; оценка морфо-физиологического состояния микроорганизмов в моно- и комплексном препаратах и соотношения физиологически активных и покоящихся форм клеток перспективна для прогнозирования развития микробных сообществ в процессе культивирования с заданными характеристиками.

Данные настоящей работы реализованы разработкой МУК «Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков» (разд. 2,3,4,6,8).

Результаты исследований могут бьтгь использованы в практической и научно-исследовательской работе при разработке новых лечебно-профилактических препаратов пробиотиков, а также в работах, направленных на повышение качества комплексных препаратов и совершенствование технологии их изготовления.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При совместном выращивании BMfidum шт.1 и E.coli шт. М-17 наблюдается сложный механизм их взаимодействия: бифидобакгерии и продукты их метаболизма оказывают ингибирующее действие на рост кишечной палочки, а кишечная палочка и продукты ее метаболизма стимулируют рост бифидобактерии, что проявляется в накоплении биомассы.

2. С помощью электронно-микроскопических методов исследования моно- и комплексного препаратов выявлен антагонистический механизм взаимоотношений двух видов микроорганизмов в смешанной популяции бификола, выражающийся в усилении фрагментации клеток бифидобактерий и появлении электронно-плотных гранул, в агрегации клеток кишечной палочки и деструктивных изменений в них.

3. Взаимодействие двух культур в смешанной популяции бификола проявляется по-разному при оценке антагонистической активности в аэробных и анаэробных условиях, что диктует целесообразность при наличии в комплексных препаратах представителей аэробных и анаэробных микроорганизмов использования оптимальных условий для культивирования каждого микроорганизма in vitro.

4. Комплексный препарат бификол по результатам испытания «острой» и «хронической» токсичности безопасен, что проявляется в отсутствии признаков токсического действия препарата на центральную нервную систему, органы иммунной системы и другие внутренние органы подопытных животных.

Апробация работы и публикация. Диссертация апробирована и рекомендована к защите на заседании Ученого совета Федерального государственного учреждения науки Государственного научно-исследовательского

института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича Роспотребнадзора (ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасовича Роспотребнадзора), протокол №18 от 16.12.2008 г. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Юбилейной научно-практической конференции НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, Москва, 1996; Международной научно-практической конференции памяти Г. И. Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования», Москва, 2002; Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы», Москва, 2004; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней»; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2008.

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 1 в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Объем н структура диссертации. Работа изложена на 154 страницах, содержит 22 таблицы и 46 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 133 источника, из них 73 отечественных и 60 иностранных, приложения.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена на базе лаборатории бактерийных вакцин и препаратов из нормофлоры в соответствии с планом НИР ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича, договоры № 737/089/024 и № 034/089/009 с Минздравом России - Отраслевая научно-исследовательская программа «Эпидемиология и микробиология» и с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека № 73-Д в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации на 2006-2010 годы».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментальных исследованиях использовали производственные штаммы Bifidobacterium bifidum 1, Escherichia coli M-17. Для определения антагонистической активности производственных штаммов и коммерческих серий бификола использовали тест-штаммы, полученные из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича: наборы регламентированных (Shigella flexneri 337 и 170, Shigella sonnei 5063, Escherichia coli 157, Staphylococcus aureus 209, Proteus vulgaris 177, Proteus mirabilis 249) и музейных тест-штаммов (P.vulgaris 4175, Р mirabilis 49, Hajhia alvei NCTC 8105 a №1, S. sonnei 20044, S. flexneri 2a 1607, Salmonella enteritidis 5765, Salmonella typhimurium 79, E. coli kauffmann 026 и Qlll, Staphylococcus aerogenes ¡0006). Коммерческие препараты пробиотиков включали бифидумбакгерин, колибактеринин и бификол, изготовленные разными производственными предприятиями.

Взаимодействие бифидобактерий и кишечной палочки в бификоле изучали в следующих" смоделированных опытах; 1. при одномоментном посеве в среды Блаурокка или казеиново-дрожжевую (КД-5а) по 1 дозе бифидумбактерина и колибактерина (смоделированный бификол); 2. при посеве 1 дозы колибактерина в центрифугат и фильтрат культуральной жидкости, полученной от суточной, двух- и трехсуточной культуры В. bifidum шт. 1; 3. при посеве 1 дозы бифидумбактерина в центрифугат и фильтрат культуральной жидкости суточной культуры Е. coli шт. М-17. Использовано два варианта смоделированного бификола: 1-вариант (1В)- посев одновременно по 1 дозе бифидумбактерина и колибактерина в 18 мл среды Блаурокка и КД-5а; 2 - вариант (2В)- бифидумбактерин и колибактерин каждый в отдельности сначала засевали по 1 дозе в среды Блаурокка и КД-5а, а затем культуры 1-го пассажа бифидобактерий и кишечной палочки засевали одновременно по 1 мл в пробирки с 18 мл среды Блаурокка и КД-5а. Количество выросших колоний в каждом опыте подтверждали путем высева десятикратных разведений выросшей культуры на питательные среды Блаурокка, Блаурокка с азидом натрия, МПБ. Центрифугаты и фильтраты культуральной жидкости (КЖ) бифидобактерий и кишечной палочки получали путем центрифугирования бактериальной взвеси при 3500 об/мин в течение 10 мин с последующей фильтрацией через фильтр миллипор (размер пор 0,22 мкм).

Питательные среды: Блаурокка, Блаурокка с натрия азидом, КД-5а, МПА, МПБ, Гаузе №2, МРС-5 приготовлены в соответствии с утвержденными нормативными документами.

Морфо-физиологическое состояние клеток В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в смешанной популяции в бификоле, приготовленном по разной технологии, изучали в сравнении с морфо-физиологическим состоянием этих штаммов в монопрепаратах -бифидумбактерине и колибактерине. Исследования проводили одновременно несколькими модифицированными электронно-микроскопическими методами позитивного окрашивания и ультратонких срезов (Рыбальченко О.В., 2003) совместно с лабораторией электронной микроскопии и спектроскопии ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России (г. С. Петербург)*. Для получения статистически значимых результатов материал на исследование брали из 3-х флаконов каждого препарата. При использовании метода позитивного окрашивания в каждом случае в электронном микроскопе просматривали не менее 50 сеточек (3-4-кратные опыты, с 3-5-кратными повторами, из каждого препарата готовили по 3 образца, из каждого образца готовили по 2-3 сеточки). При использовании метода ультратонких срезов в каждом случае исследовали не менее ста ультратонких срезов (3-4-кратные опыты с 3-5-кратными повторами, из каждого препарата готовили по 3 образца, из каждого образца готовили от 4 до.6 ультратонких срезов).

Антагонистическую активность коммерческих препаратов бификола и производственных штаммов В. bifidum шт. 1, Е. coli шт. М-17 изучали с помощью отсроченного антагонизма на плотной питательной среде Гаузе № 2 и МРС-5. Для оценки информативности регламентированного метода контроля антагонистической активности бификола в аэробных условиях был использован модифицированный метод отсроченного антагонизма: использованы две питательные среды - Гаузе №2 и МРС-5 и два способа культивирования - аэробный и с использованием анаэробных систем GENbox СО 2 с концентрацией углекислого газа в среднем 3-6 % (фирма bioMerieux®, Франция) и «OXOID» с концентрацией 5 % 02 и 10 % С02 (фирма «OXOID», Великобритания).

*Автор выражает глубокую признательность сотрудникам д.б.н., проф. О.В. Рыбальченко и ведущему научному сотруднику И.Л. Потокину за оказанную помощь в проведении исследований.

«Острую» и «хроническую» токсичность исследовали на 187 мышах обоего пола линии Black С/57 массой тела (15±1) г, чувствительных к действию токсических веществ, в соответствии с требованиями РД 42-28-8-89 «Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов». Исследования проводили совместно с к.м.н. Григорьевой JI.B. и к.м.н. Терешкиной Н.В. группы патоморфологии ГИСК им. JT.A. Тарасевича в соответствии с международным соглашением о соблюдении правил гуманного отношения к животным. В опытах по изучению «острой» токсичности исследовали смоделированный бификол и производственные штаммы В. bifidum 1, Е. coli М-17. Производственный штамм В. bifidum 1 выращивали в среде Блаурокка в течение 72 ч, центрифугировали при 5000 об/мин для освобождения от питательной среды и разводили 0,9 % раствором натрия хлорида. Производственный штамм Е. coli М-17 выращивали в МПБ в течение 5-6 ч, затем пересевали на МПА; выросшую культуру смывали 0,9 % раствором натрия хлорида. Концентрацию микробных клеток в 1 мл бифидобактерий и кишечной палочки определяли по ОСО 42-28-59-85П в сравнении со стандартом мутности 10 ОЕ. В 1 мл взвеси кишечной палочки содержалось 80 ОЕ, бифидобактерий - 40 ОЕ. Равный объем взвеси бифидобактерий и кишечной палочки объединяли, получив смоделированный бификол, содержащий в 1 мл 60 ОЕ (40 ОЕ Е. coli шт. М-17 и 20 ОЕ В. bifidum шт. 1). Полученные моно- и комплексные взвеси вводили мышам внутрибрюшинно и перорально в объеме 1 мл. Для определения LDSo при внутрибрюшинном введении использовали три разные дозы смоделированного бификола (20 ОЕ, 10 ОЕ и 5 ОЕ) и монокультуры Е. coli шт. М-17 (10 ОЕ, 5 ОЕ, 2,5 ОЕ). Расчет LDS0 проводили по методу Кербера в модификации Ашмарина И.П. и Воробьева A.A. Наблюдение за животными, после введения препаратов, проводили в течение последующих 7 суток. При изучении безопасности препаратов на модели «хронической» токсичности перорально вводили ежедневно в течение 14 суток терапевтические дозы бификола для человека (5xl0s бифидобактерий + 3 х108 колибакгерий КОЕ/мл), колибактерина (ЗхЮ8 КОЕ/мл) и бифидумбактерина (5х108 КОЕ /мл). Вводимые дозы превышали дозы для мышей более чем в 1000 раз.*

* Примечание: - суточную дозу, эквивалентную дозе для человека (Эд) на кг массы тела животного, рассчитывают следующим образом: Эд =МжхЧД/М ч, где Мж - масса тела животного, ЧД - человеческая доза, М ч - масса тела человека (масса тела взрослого человека 70 кг, масса тела ребенка - 10 кг). Пример расчета: Мж= 10 г; Мч= 10 кг= 1х104; ЧД = 1x107 Эд= 10х1х107/1х104=1х104

Наблюдение за животными проводили в течение периода введения препарата и последующих 7 суток. Ежедневной регистрации подлежали гибель животных, масса тела; оценивали внешний вид животных, поведенческие реакции. Для проведения гистологического исследования на 1 и 7 сутки после последнего введения препарата забивали по 5 животных соответственно.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методами вариационной статистики (Гланц С., 1999) с помощью компьютерной программы BioStat 2008. Статистическую значимость различий между группами оценивали с использованием t - критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Результаты в таблицах и на рисунках представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±т). Повторяемость опытов (п) З-б - кратная.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Изучение взаимодействия В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 и продуктов их метаболизма на рост каяадого штамма при их совместном культивировании Технология изготовления бификола предусматривает совместное культивирование В. bifidum шт.1 и Е. coli шт. М-17 на последнем этапе получения производственной биомассы. В специальных опытах по изучению биосовместимости штаммов использованы два варианта смоделированного бификола. Установлено, что при совместном культивировании оба штамма в смешанной популяции вели себя по-разному. Когда в варианте 2В- использовали культуры бифидо- и колибактерий 1-го пассажа для одномоментного посева в среды Блаурокка и КД-5а, через 24 ч совместного культивирования содержание коликомпонента в бификоле 2В было на два порядка меньше по сравнению с суточной культурой (CK) и бификолом 1В В то же время кишечная палочка стимулировала рост бифидобактерий: через 24 ч (вместо 48 - 72 ч) содержание бифидобактерий достигало 108 микр.кл/мл (рис.1. - IB, 2В). Особенно четко эта закономерность наблюдалась при оценке взаимовлияния их продуктов метаболизма на рост при использовании центрифугатов и фильтратов культуральных жидкостей. В исследованиях использовали центрифугаты и фильтраты суточной, двух- и трехсуточной культуральной жидкости бифидобактерий (ЦБ1, ЦБ2, ЦБЗ) и суточной культуральной жидкости кишечной палочки.

При посеве в центрифугаты ЦБ1, ЦБ2, ЦБЗ по 1 мл колибактерина с содержанием 109 микр. кл/мя обнаружен рост кишечной палочки в количестве 104-103 микр. кл/мл. На фоне слабого роста кишечной палочки содержание бифидобактерий существенно увеличилось (до 107, 105, 103 микр. кл/мл, соответственно, вместо исходного - 101 микр. кл/мл в ЦБ), Посев в МПБ колибактерина подтвердил содержание живых бактерий кишечной палочки в количестве 1010 микр. кл/мл (контроль) (рис.2).

п ск ск осо контроль

£2 Коликомпонент смоделированного бификола 53 Колибактерии

Е Бифидокомпонент смоделированного бификола В Вифидумбактерин □ ОСО бифидумбактерина

Рис.1. Содержание живых бифидобактерий и кишечной палочки через 24 ч при совместном культивировании двух штаммов: 1 - КД-5, 2 - Блаурокка 1В - одномоментный посев по 1 дозе коли- и бифидумбактерина 2В - одномоментный посев 24-часовых культур коли- и бифидобактерий П - монопрепарат, СК - 24 часовая культура, ОСО - отраслевой стандартный образец

Для исключения влияния кислой среды на рост кишечной палочки в следующем опыте параллельно засевали колибактерин с содержанием 109 микр. кл/мл в ЦБ2 с исходным показателем рН 4,5 и с коррекцией показателя рН до 7,0. При коррекции рН содержание кишечной палочки возрастало в ЦБ2 до 10 6 микр. кл/мл (на два порядка выше) по сравнению с ее содержанием при росте в

ЦБ2 с кислой реакцией, но было на четыре порядка ниже, чем в контроле (Ю10микр.кл/мл).

1 2 3 1 2 3 1 2 3 К

ВЕ. coliM-17 SB. bifidum 1 Й Бифидобактерии Е Колибактерин

Рис. 2. Содержание выросших бактерий Е. coli М-17 и В. bifidum 1 в мл при посеве в центрифугаты культурапьной среды бифидобактерий через 24 ч культивирования: 1 - ЦБ 1, 2-ДБ2, З-ЦБЗ

Аналогичные результаты были получены при использовании фильтратов культуральной жидкости бифидобактерий. При отсутствии в фильтратах бифидобактерий содержание кишечной палочки увеличилось на два порядка (до 10 6 микр. кл/мл), однако было значительно ниже их содержания в контроле (Ю10 микр. кл/мл).

Противоположные результаты были получены при изучении влияния метаболитов кишечной палочки на рост бифидобактерий. В центрифугат и фильтрат суточной КЖ кишечной палочки засевали по 1 мл бифидумбактерина (рис.3, ст.1) или суточной культуры бифидобактерий 1-го пассажа (рис.3, ст.2) и выращивали в течение 24 ч.

Контрольный посев центрифугата в МПБ, как и следовало ожидать, показал, что выбранный режим центрифугирования не полностью освобождал культуральную жидкость от колибактерий (рис. За, ст. 1, 2). Культура и продукты метаболизма кишечной палочки оказывали стимулирующее действие на рост бифидобактерий:

12 гч9

через 24 ч количество их достигало 10 микр. кл/мл вместо 10 микр. кл/мл; в контроле рост бифидобактерий учитывали через 72 ч (рис.За). Эта же закономерность отмечена при использовании фильтрата КЖ кишечной палочки (рис. 36).

а) Центр ифугяг кишечной палочки

6) Фильтрат кишечной палочки

контроль

П Кишечная палочка 0 Бифидумбактерин □ ОСО бифидумбактерина

1 контроль

3 Бифидобактерии

3 Суточная культура бифидобактерий

Рис. 3. Содержание живых бифидобактерий и кишечной палочки в мл при посеве в центрифугаты и фильтраты суточной культуральной жидкости кишечной палочки: 1 - посев 1 мл препарата бифидумбактерина, 2 - посев 1 мл суточной культуры бифидобактерий ОСО- отраслевой стандартный образец

Таким образом, проведенные исследования выявили сложный механизм взаимодействия бифидобактерий и кишечной палочки при их совместном выращивании. Накопление биомассы Е. coli шт. М-17 и В. bifidum шт.1 при совместном культивировании зависит от концентрации посевной дозы, физиологического состояния культур в посевном материале и образования различного типа метаболитов, что может отразиться на соотношении живых бактерий Е. coli шт. М-17 и В. bifidum шт. 1 и создавать условия получения нестандартного препарата.

Морфо-физио логические особенности клеток микробных популяций в составе бификола и препаратов бифидумбактерина, колибактерииа

Более детальную информацию о взаимодействии клеток разных видов и родов в смешанных микробных сообществах при их совместном развитии в среде

обитания позволяет получить электронно-микроскопический анализ препаратов. Нами впервые проведена оценка морфо-физиологического состояния клеток микроорганизмов в бификоле, изготовленном по разной технологии. В качестве контроля исследовали морфо-физиологическое состояние клеток В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17, выращенных в жидких питательных средах Блаурокка и МПБ, и в лиофилизированных препаратах - в бифидумбактерине и колибактерине.

Во всех исследованных препаратах в микробных популяциях идентифицировано несколько морфологических типов клеток: электронно-прозрачные - физиологически активные и электронно-плотные - покоящиеся клетки (рис.4,5,6,7), делящиеся, частично или полностью аутолизированные, фрагментированные, отличающиеся по характеру протекающих в них деструктивных нарушений, возникающих при изменении параметров роста, воздействия экстремальных факторов. Изменение ультраструктурной организации электронно-плотных (покоящихся) клеток (уменьшение размеров клеток, изменение структуры наружной мембраны и расположения в цитоплазме рибосом, нитей ДНК, зоны нуклеотида, увеличение плотности периплазматического пространства), свидетельствует о снижении уровня их метаболической активности. По-видимому.

Рис. 4-7. Ультратонкий срез моно- культур, выращенных в жидкой питательной среде. Увеличение х 40000

Рис.4.Электронно-прозрачная физиологически активная (ФА) клетка Е. coli шт. М-i 7 Рис. 5. Электронно-плотная физиологически неактивная (покоящаяся) клетка (ФН) Е. coli шт. М-17

Рис. 6.Электронно-прозрачная физиологически активная (ФА) клетка В .bifidum шт. 1 Рис. 7. Электронно-плотная физиологически неактивная (ФН) клетка В. bifidum шт. 1

образование покоящихся форм клеток является одним из механизмов приспособления микробной популяции к изменяющимся условиям окружающей среды, что способствует не только успешному ее выживанию в неблагоприятных условиях, но и обеспечивает возможность обратимого перехода в физиологически активное состояние.

Для электронно-микроскопического исследования морфологической гетерогенности в микробных популяциях Е, coli шт. М-17 и В. bifidum шт.1 лиофилизированные бифидумбактерин, колибактерин и бификол растворяли в среде Блаурокка при температуре 22 °С и 37 °С и экспозиции 30 мин и 2 часа.

Электронно-микроскопическое исследование препаратов показало, что микробная популяция в бифидумбактерине, регидратированном при 22 °С и 37 °С и экспозиции 30 мин, на две трети состояла из живых физиологически активных клеток, характеризующихся высоким уровнем метаболизма. Обнаружение в препаратах признаков фрагментации бифидобактерий и остатков разрушенных клеток свидетельствует о частичном аутолизе бифидобактерий, отражающем естественную динамику морфо-физиологических изменений представителей данного рода бактерий

В препаратах бифидумбактерина, регидратированного при температуре 22 °С и 37 °С, экспозиция в течение 2 ч выявляются только физиологически неактивные (покоящиеся) клетки, а также усиление фрагментации клеток бифидобактерий и появление большого числа электронно-плотных гранул (рис.8, 9).

Рис.8-9. Бифидумбактерин, Позитивное окрашивание бифидобактерий. Режим регидратации 22 °С, экспозиция 2 ч в среде Блаурокка. Увеличение х 20000 Рис.8. Электронно-плотные гранулы (ЭПГ), образующиеся при фрагментации бифидобактерий

Рис.9. Электронно-плотные (ФН) клетки бифидобактерий и электронно-плотные гранулы (ЭПГ), образующиеся при фрагментации бифидобактерий

Наличие в препаратах бифидумбактерина большого числа физиологически активных клеток, (62,7 ± 0,4) % и (61,2 ± 0,3) % соответственно при режимах регидратации 22 и 37 °С и экспозиции 30 мин, свидетельствует о том, что культура бифидобактерий перед высушиванием находилась на стадии активного роста и в достаточно высокой степени сохранила свою физиологическую активность. Одна треть клеток, перешедших в фазу покоя, отражает, вероятнее всего, переход в стационарную фазу роста и/или негативное влияние процесса высушивания. При увеличении времени экспозиции до 2 ч, в препаратах выявляются только покоящиеся клетки вследствие, вероятно, аэробных условий регидратации.

Анализ данных морфометрического исследования препаратов колибактерина показал, что изменение параметров процесса его регидратации приводит к незначительному сдвигу в структуре популяции Е. coli шт. М-17. При регидратации колибактерина при температуре 22 °С, экспозиции 30 мин, в препаратах выявлены физиологически активные клетки (68,0 ± 0,4) %, число покоящихся и частично аутолизированных клеток Е. coli шт. М-17 составляет по (16,0 ± 0,3) % в каждой группе, соответственно. При этом к частично аутолизированным клеткам Е. coli шт. М-17 относили клетки с характерными сферическими пустотами в цитоплазме.

Наличие большого числа физиологически активных клеток свидетельствует о том, что значительная часть популяции кишечной палочки перед высушиванием находилась в физиологически активной форме. С увеличением длительности экспозиции до 2 ч число клеток с характерными сферическими включениями возрастает (рис.Ю). Наблюдаемые деструктивные изменения, по-видимому, носят локальный характер и в дальнейшем, в зависимости от их степени и глубины, клетки могут восстановить свою физиологическую активность либо погибнут.

Рис.Ю. Колибактерин. Ультратонкий срез. Физиологически активные (ФА), физиологически неактивные (ФН) и частично аутолизированные (ЧА) клетки Е. coli шт. М-17 с характерными сферическими пустотами в цитоплазме. Регидратация при температуре 22 °С, экспозиция -2ч

Сравнительный анализ электронно-микроскопических препаратов бификола, приготовленного с использованием разной технологии подготовки посевного материала и культивирования, свидетельствует о различии морфо-физиологических свойств клеток бифидобактерий и кишечной палочки.

Так, в бификоле, изготовленном на основе биомассы совместного культивирования двух культур В. bifidum шт.1 и Е. coli шт. М-17 и регидратированном при температуре 22 °С, экспозиции 30 мин, соотношение физиологически активных (66,4±0,3) % и покоящихся клеток бифидобактерий (33,5±0,4) % было близко к их соотношению в монопрепарате. Все клетки кишечной палочки находятся в физиологически активном состоянии. Отличие электронно -микроскопических препаратов бификола и монопрепаратов заключается лишь в наличии выраженных признаков антагонистической активности двух неродственных видов микроорганизмов: более активный процесс секреции бифидобактериями продуктов метаболизма (рис. 11), более выраженные деструктивные изменения в клетках кишечной палочки, наличие в их клетках ультраструктурных изменений в области клеточной стенки, нуклеотида и цитоплазмы, возникающие при антагонистическом воздействии бифидобактерий (рис. 12).

Рис.11-12. Бификол. Ультратонкий срез бифидо- и колибактерий, регидратация при температуре 22 °С, экспозиция 30 мин. Увеличениех 40 ООО

Рис. 11. Электронно-плотные клетки В. bifidum шт. 1 (ФНББ), секреция электронно-плотного вещества, из которого образуются характерные гранулы (ЭПГ) Рис. 12. Электронно-прозрачные физиологически активные (ФАКП) клетки Е. coli шт. М-17 с ультраструктурными изменениями в области клеточной стенки, нуклеоида и цитоплазмы, Электронно-плотные (ФНББ) клетки В. bifidum шт. 1, характерные электронно-плотные гранулы (ЭПГ)

В электронно-микроскопических препаратах бификола, изготовленного на основе смешивания двух раздельно выращенных культур при их раздельном культивировании, соотношение физиологически активных и неактивных клеток бифидобактерий примерно равное (52,7±0,4 и 47,3±0,3 % соответственно). При этом морфологические свойства клеток бифидобактерий отличаются от клеток в бифидумбактерине и бификоле, изготовленном по технологии совместного культивирования двух штаммов. Так, физиологически активные клетки бифидобактерий в бификоле характеризуются более высоким уровнем метаболической активности по сравнению с клетками в бифидумбактерине и бификоле, изготовленном при совместном культивировании штаммов. Обнаружение фрагментированных клеток бифидобактерий и остатков разрушенных клеток связано с секрецией биологически активных веществ, направленных на подавление части популяции кишечной палочки, и их частичным аутолизом (рис. 13). Почти все клетки кишечной палочки (физиологически активные) находятся в агрегированном состоянии. Отсутствие в препаратах покоящихся клеток Е. coli шт. М-17, возможно, связано с тем, что бифидобактерии подавляют их настолько аютвно, что они не успевают перейти в фазу покоя, а остаются в физиологически активном и агрегированном состоянии (рис.14). По-видимому, при используемой технологии раздельного культивирования бифидобактерий и кишечной палочки и их смешивании для получения биомассы обе культуры испытывают сильное антагонистическое влияние друг на друга путем воздействия продуктами метаболизма. Это выражается в большем количестве фрагментированных клеток и появлении многочисленных остатков разрушенных бифидобактерий, повышенной агрегации клеток кишечной палочки, наличии в них изменений на разной стадии деструкции практически полном отсутствии покоящихся форм клеток (рис. 14 -16).

Таким образом, с помощью электронно - микроскопических методов исследования микробных клеток в популяциях моно- и комплексного препарата, выявили сложный характер взаимодействия культур на уровне отдельных клеток и на популяционном уровне. Так как используемые производственные штаммы в смешанных микробных популяциях подвержены значительным изменениям, это следует учитывать при дальнейшем совершенствовании и стандартизации технологии

совместного и раздельного культивирования не только при производстве бификола,

но и при разработке других комплексных пробиотиков.

Рис. 13-16. Бификол. Позитивное окрашивание бифидо- и колибактерий Рис.13 Электронно-плотные клетки бифидобактерий (ФНББ) и электронно-плотные гранулы (ЭПГ), образующиеся при их фрагментации. Регидратация при 37 "С, экспозиция -30 мин. Увеличение х 30000

Рис.14. Электронно-прозрачные физиологически активные клетки Е. coli шт. М-17 (ФАКП) в агрегированном состоянии и электронно-плотные гранулы (ЭПГ), образующиеся при фрагментации бифидобактерий. Регидратация при 22 °С, экспозиция - 30 мин. Увеличение х 20000

Рис. 15. Е. coli шт. М-17, окруженная электронно-плотными гранулами (ЭПГ). В верхней части рисунка разрушенная клетка Е. coli шт. М-17 (РККП). Регидратация при 22 °С, экспозиция -2ч Увеличение х 20000

Рис. 16. Частично лизированная клетка Е. coli шт. М-17 (ЧЛКП), клеточные стенки (КСКП) окружены электронно-плотными гранулами (ЭПГ). Регидратация при 22 "С, экспозиция -2ч Увеличение х 20000

Изучение взаимодействия В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в бификоле при оценке антагонистической активности in vitro

Лечебное действие препарата обусловлено биологическими свойствами штаммов, используемых для их изготовления. Одной из важных характеристик производственных штаммов является их антагонистическая активность.

Согласно требованиям НД антагонистическая активность определяется в тесте отсроченного антагонизма. Несмотря на то, что коммерческие серии различались по соотношению бифидо- и коликомпонентов в дозе препарата (10 ' и 108 КОЕ/мл), существенных различий между сериями бификола по антагонистической активности

не выявлено. Для оценки взаимодействия двух культур в бификоле и информативности регламентированного метода контроля антагонистической активности был использован модифицированный метод отсроченного антагонизма. При этом количество выросших бифидо- и колибактерий определяли на питательных средах Гаузе №2 и МРС-5 в аэробных условиях культивирования и с использованием анаэробных систем. Выросшую на чашках культуру бификола смывали 10 мл 0.9 % раствором натрия хлорида через 24, 48, 72 ч. Количество выросших колоний в каждом опыте подтверждали путем высева десятикратных разведений выросшей культуры на питательные среды Блаурокка с азидом натрия для бифидобактерий и МПБ для кишечной палочки. Результаты учитывали через 24 ч для кишечной палочки и 72 ч для бифидобактерий.

Сравнительный анализ полученных данных выявил, что в аэробных условиях наибольшее содержание бифидобактерий (103 микр. кл/мл) отмечается через 24 ч совместного роста с кишечной палочкой. В анаэробной системе СЕКЪох ССЬ с концентрацией углекислого газа в среднем 3-6 %, содержание жизнеспособных клеток бифидобактерий постепенно возрастало от 10 5 микр. кл/мл (через 24 ч) до 10 7-9 микр. кл/мл (через 48 ч и 72 ч) при росте на среде МРС-5; на среде Гаузе № 2 максимальное количество бифидобактерий было на 1-2 порядка меньше чем на среде МРС-5. Рост кишечной палочки в концентрации 10 8 микр. кл/мл отмечали через 24 ч в аэробных условиях, а в анаэробной системе - только через 48 ч независимо от используемой питательной среды. Возможно, это было связано с ингибирующим действием бифидобактерий. Таким образом, наибольшее содержание бифидо- и колибактерий в посеве бификола выявлено через 72 ч (108 микр. кл/мл). Ожидалось, что в этих условиях антагонистическая активность бификола должна была проявиться в большей степени. Однако, достоверного различия в показателях антагонистической активности при аэробном культивировании и с использование данной анаэробной системы при культивировании на среде МРС-5 и Гаузе №2 отмечено не было (р>0,05), несмотря на одинаковую посевную дозу обоих компонентов -108 микр.кл./мл (табл. 1). При использовании другой анаэробной системы - «ОХОШ» с концентрацией 5 % 02 и 10 % С02, испытуемые препараты достоверно различались по антагонистической активности (р<0,05). Так, в условиях анаэробной системы «ОХОШ» выявлено, что бификол и В. Ы/иЗит шт. 1 проявили выраженный

антагонизм по отношению к регламентированным и музейным тест-штаммам: зоны угнетения роста регламентированных тест-штаммов находились в пределе от 30 до 48 мм (табл.2), музейных тест-штаммов - от 30 до 43 мм (среда МРС-5).

Таблица.!

Оценка антагонистической активности бификола по отношению к регламентированным штаммам в аэробных условиях и в анаэробной системе

вЕКЬох СО ?

Регламентированные тест-штаммы Аэробные Анаэробная система

Зоны задержки роста в мм

Питательные среды

МРС-5 Гаузе №2 МРС-5 Гаузе №2

S.flexneri 170 19,25±1,5 17,25±2,06 19,75±0,5 15,5±4,2

S.flexneri 337 19,25±1,5 18,0±2,45 19,5±1,0 16,5±2,38

S. sonnei 5063 20,5±1,0 20,0±1,63 17,75±2,06 16,5±3,01

E.coli 157 17,0±2,45 15,0±1,63 17,5±2,88 15,0±4,08

S. aureus 209 14,25±2,98 9,75±3,5 17,25±4,57 10,0±0,0

P. vulgaris 177 16,25±2,5 14,5±1,0 19,0±1,15 14,75±3,30

P.mirabilis 237 15,75±3,40 18,75±2,5 19,5±1,0 15,75±2,21

Таблица 2

Оценка антагонистической активности бификола, В. ЫМит шт. 1. Е.соИ шт. М-17 по отношению регламентированным тест-штаммам в анаэробной системе «ОХОГО»

Регламентированные тест-штаммы Зоны задержки роста в мм

бификол В. bifidum 1 E.coli М-17

S. flexneri 170 41,2±0,84 43,0±1,22 20,4±1Д4

S.flexneri 337 44,6±2,88 48,2±1,48 20,6±1,52

S. sonnei 5063 45,0±1,87 46,6±1,52 20,0±1,87

E.coli 157 34,6±3,13 36,4±2,61 17,8±0,84

S. aureus 209 30,0±2,0 30,0±2,0 10,6±2,19

P. vulgaris m 39,2±2,28 40,4±1,67 19,2±11,0

P. mirabilis 237 40,0±0,71 40,6±1,34 19,8±1,48

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о сложном взаимодействии бифидобакгерий и кишечной палочки в бификоле при оценке в разных условиях показателя антагонистической активности. Было выявлено, что общее содержание жизнеспособных клеток микроорганизмов не всегда свидетельствует о формировании в популяции полноценных по биологическим свойствам клеток культур, входящих в состав комплексного препарата. Проявление данного свойства зависит от условий, в которых развиваются культуры: состава питательных сред, температуры культивирования, содержания кислорода в системе и других. Исходя из этого, при разработке комплексных препаратов, изготовленных на основе разных видов микроорганизмов, и испытания их антагонистических свойств следует учитывать оптимальные условия культивирования каждого микроорганизма in vitro и проводить изучение комплексных препаратов в сравнении с производственными штаммами, входящими в их состав.

Изучение взаимодействия культур В. bifldum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 на модели «острой» и «хронической» токсичности комплексного препарата бификола и составляющих его монокомпонентов

При оценке качества моно- и комплексных препаратов пробиотиков особо важным является изучение их безопасности. Многолетний опыт работы свидетельствует о том, что недостаточно иметь только характеристику безопасности штаммов, используемых для изготовления пробиотиков, без оценки безопасности готового препарата. В наших исследованиях взаимодействие двух штаммов в бификоле на организм подопытных мышей линии Black С/57 изучено на модели «острой» и «хронической» токсичности.

При изучении «острой» токсичности в результате однократного внутрибрюшинного введения в объеме 1 мл 80 ОЕ взвеси культуры E.coli шт. М-17, 40 ОЕ взвеси культуры В. bifldum шт. 1 и 60 ОЕ смоделированного бификола (40 ОЕ E.coli шт. М-17 и 20 ОЕ В. bifldum шт.1 в 1 мл) все мыши, получившие культуру E.coli шт. М-17 и смоделированный бификол, пали с явлениями шоковой реакции, выражавшейся в полнокровии и кровоизлияниях во внутренних органах. В то же время внутрибрюшинное введение 40 ОЕ взвеси культуры В. bifldum шт. 1 все подопытные животные переносили без проявления каких - либо симптомов интоксикации. Вместе с тем при вскрытии их на 1 и 7 сутки после введения при макроскопическом изучении

внутренних органов обнаружено выраженное полнокровие внутренних органов, особенно в легких, печени и почках, подтвержденное микроскопическими исследованиями, связанное с большой антигенной нагрузкой при внутрибрюшинном введении.

Для определения LD50 при внутрибрюшинном введении использовали три разные дозы смоделированного бификола (20 ОЕ, 10 ОЕ и 5 ОБ) и монокультуры Е. coli шт. М-17 (10 ОЕ, 5 ОЕ, 2,5 ОЕ). Несмотря на то, что в состав бификола входит равное количество живых бифидо- и колибактерий, отмечена тенденция снижения количества погибших животных при его введении: LD50 для E.coli шт. М-17 составляет 6,41, бификола - 14,13 ОЕ. Гибель животных наблюдали в первые сутки. Всех павших животных вскрывали и проводили макроскопическую оценку внутренних органов. При этом отмечали выраженное полнокровие печени, легких и других внутренних органов. Следовательно, добавление к культуре Е. coli шт. М-17 такого же количества культуры В. bifidum шт. 1 не приводило к увеличению токсического действия препарата.

Сравнительная оценка результатов «острой» токсичности при пероральном введении препаратов показала, что введение больших доз культур Е .coli шт. М-17, В. bifidum шт. 1 и комплексного препарата бификола (80 ОЕ, 40 ОЕ и 60 ОЕ, соответственно), не приводило к развитию шоковых реакций и лишь у отдельных животных сопровождалось развитием во внутренних органах умеренного полнокровия и очаговых дистрофических изменений.

При изучении безопасности препаратов на модели «хронической» токсичности перорально вводили в течение 14 суток терапевтические дозы бификола для человека (5х108бифидобакгерий + 3 х108 колибактерий КОЕ/мл), колибактерина (ЗхЮ8 КОЕ/мл) и бифидумбакгерина (5x108 КОЕ /мл). Вводимые дозы превышали дозы для мышей более чем 1000 раз. Морфологическое исследование внутренних органов не выявило признаков токсического действия указанных препаратов на ЦНС, дыхательную и иммунную системы, желудочно-кишечный тракт и другие органы.

Таким образом, в опытах на модели «острой» и «хронической» токсичности показана безопасность смешанной микробной популяции в комплексном препарате бификол.

На примере бификола выявлено, что механизм взаимодействия культур Е. coli шт. М-17 и В. bifidum шт. 1 в бификоле, полученном как при совестном, так и при раздельном их культивировании достаточно сложен и зависит от многих факторов: технологии ' изготовления, состава используемых питательных сред, методов испытания биологических свойств и других факторов. На основании данных литературы и результатов исследования сформулированы требования к доклиническому изучению пробиотиков. При разработке комплексных препаратов, включающих разные виды микроорганизмов или несколько штаммов одного вида, необходимо:

- обосновать подбор штаммов для комплексных препаратов;

- изучить биосовместимость штаммов, составляющих основу комплексных препаратов, с использованием разных методов исследования;

-. лимитировать количественные соотношения производственных штаммов и определить достаточно ограниченные пределы их колебаний;

- при количественной оценке специфической активности отработать методику идентификации каждого штамма, составляющего основу пробиотика, по морфологическим и культуральными свойствам;

- определить биологические свойства комплексных пробиотиков в сравнении с биологическими свойствами штаммов, входящих в их состав;

- изучить безопасность комплексных пробиотиков на модели «острой» и «хронической» токсичности в сравнении с моноштаммами и их смешанной популяцией.

Выводы

1. Установлено, что при совместном выращивании культура В. bifidum шт. 1 ингибирует рост кишечной палочки, а культура E.coli шт. М-17 стимулирует рост бифидобактерий.

2. Впервые при использовании электронно-микроскопических методов исследования выявлено антагонистическое взаимодействие двух неродственных видов микроорганизмов - В. bifidum шт.1 и Е. coli шт. М-17 в готовом препарате бификоле вне зависимости от способа его изготовления.

3. Установлены различия морфологического состояния клеток бифидобактерий и кишечной палочки в составе бификола, изготовленного по разной технологии.

Данный факт следует учитывать при совершенствовании и стандартизации технологии не только производства бификола, но и при разработке других комплексных препаратов.

4. При испытании антагонистической активности бификола в аэробных и анаэробных условиях выявлено, что в анаэробных условиях антагонистическая активность бификола выше и определяется антагонистической активностью бифидокомпонента.

5. В.опытах in vivo на моделях «острой» и «хронической» токсичности показана безопасность ассоциации культур В. bifldum шт.1 и Е. coli шт. М-17 в бификоле. Изучение безопасности комплексных пробиотиков следует проводить в сравнении со штаммами, входящими в состав препарата.

6. Результаты исследований реализованы разработкой МУК «Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков» (разд. 2,3, 4, 6, 8).

Список сокращений

КЖ - культуральная жидкость КД-5 - казеиново-дрожжевая среда КОЕ - колониеобразующие единицы Микр. кл. - микробных клеток МПА - мясо-петонный агар НД - нормативная документация об/мин - оборотов в минуту РД - руководящий документ ЦБ - центрифугат бифидобактерий шт-пггамм

LD5o - минимальная доза препарата, вызывающая гибель половины экспериментальных животных

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Евлашкина В.Ф., Чуприготаа Р.П., Осипова И.Г., Лукьянова О. Ю., Рыбачок (Ладыгина) А.В. К вопросу о стандартизации технологии изготовления бификола // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине. Материалы международного симпозиума, посвященного 150-летаю со дня рождения И.И. Мечникова и 90-летаю Уфимского НИИВС НПО «Иммунопрепарат» - Уфа. - 1995. - ч. 1.- С. 179 - 182.

2. Рыбачок (Ладыгина) А.В. К вопросу об усовершенствовании контроля антагонистической активности производственных штаммов бифидобактерий, лактобацилл и кишечной палочки М-17 // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине. Материалы международного симпозиума, посвященного 150-летию со дня рождения И.И: Мечникова и 90-летию Уфимского НИИВС НПО «Иммунопрепарат» - Уфа. -1995 -ч. 1.-С. 182- 186.

3. Чупринина Р.П., Конькова Н.К., Евлашкина В.Ф., Рыбачок (Ладыгина) А.В. Перспективы повышения качества препаратов эубиотиков // Современная вакцинология. Тезисы докладов 2-ой Международной конференции, посвященной 100-летаю Пермского НПО "Биомед". - Пермь, 16-18.06.98. - С. 143.

4. Чупршшна Р.П., Осипова И. Г., Евлашкина В.Ф., Ладыгина А.В. Доклинические испытания новых пробиотиков // Сборник материалов. Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы». - Москва, 2-4 июня 2004. - С. 10.

5. Чупринина Р.П., Осипова И. Г., Евлашкина В.Ф., Ладыгина А.В. Доклиническая оценка безопасности (безвредности) производственных штаммов и лекарственной формы пробиотиков // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - Москва, 21 - 22 ноября 2006. - С. 105.

6. Ладыгина А. В. Изучение влияния бифидобактерий и кишечной палочки при совместном культивировании // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - Москва, 21-22 ноября 2008. - С. 69.

7. Чупринина Р.П., Осипова И. Г., Евлашкина В.Ф., Ладыгина А.В, Терешкина Н.В., Абрамцева М.В. Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности пробиотиков // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - Москва, 21-22 ноября 2008. - С. 124.

8. Ладыгина А.В., Терешкина Н.В., Григорьева Л.В., Чупринина Р.П. Взаимодействие культур Bifidobacterium bifidum штамм 1 и Escherichia coli штамм М-17 в бификоле в опытах in vivo на модели «острой» и «хронической токсичности» //Биопрепараты. - 2009. - № 1 - 2. - С. 24 - 28.

9. Ладыгина А.В. Особенности взаимодействия Bifidobacterium bifidum 1 и Escherichia coli М-17 в бификоле при совместном их выращивании //Вестник Российского университета дружбы народов. - 2009. - № 3. - С. 10 - 14.

Ладыгина Александра Владимировна (Россия)

Взаимодействие Bifidobacterium bifidum штамм 1 и Escherichia coli штамм М-17 в бификоле, изготовленном при совместном культивировании производственных штаммов

Исследования посвящены изучению механизма взаимодействия культур В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в бификоле - биосовместимости, морфо-физиологического состояния клеток, антагонистической активности в опытах in vitro и оценке безопасности препарата в дозах, превышающих терапевтические в опытах in vivo.

Полученные результаты свидетельствуют о сложном механизме взаимодействия культур, составляющих бификол: выявлено стимулирующее влияние кишечной палочки и продуктов ее метаболизма на рост бифидобактерий и угнетающее влияние бифидобактерий и продуктов их метаболизма на рост кишечной палочки. Электронно-микроскопические исследования выявили более высокий уровень метаболической активности двух культур в бификоле по сравнению с монопрепаратами. При испытании в анаэробных условиях высокая антагонистическая активность бификола обусловлена бифидокомпонентом. Показана безопасность больших доз культур в смешанной популяции бификола. Разработаны требования к доклиническому изучению производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков. Alexandra Ladygina (Russia)

The interaction of the Bifidobacterium bifidum strain 1 and E. coli strain M-17 in the Bificol prepared during the simultaneous cultivation of the industrial strains

The investigations are dedicated to the study of the mechanisms of the in vitro interaction of the cultures of B. bifidum strain 1 and E. coli strain M-17 in the experiences on bio-compatibility, morpho-physiologica! state of the cells, antagonistic activity and the in vivo assessment of the safety of the preparation following the use of higher than therapeutic doses.

The results obtained demonstrate the presence of the complex mechanism of interaction of the strains composing the Bificol; the stimulating effect of the E. coli and it's metabolism products on the growth of the Bifidobacteria was shown as well the inhibitory effect of the Bifidobacteria and their metabolism products on the growth of E. coli. The electron microscopic investigations revealed an increased level of the metabolic activity of both Bificol cultures in comparison with the monocultures. During the tests under the anaerobic conditions the increased antagonistic activity of the Bificol was shown to be caused by the bifidum component. The safety of the large doses of the strains in the mixed population of the Bificol was demonstrated. The conditions for the pre-clinical investigation of the industrial strains used in the probiotic production were developed.

Подписано в печать: 15.10.2009

Заказ № 2732 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ладыгина, Александра Владимировна

Список основных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

• 1.1 .Современное состояние микроэкологии организма человека, взаимодействие микроорганизмов друг с другом и с макроорганизмом

1.2. Роль пробиотиков в нормализации микроэкологического состояния макроорганизма.

ГЛАВА 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.1.1. Штаммы микроорганизмов.

2.1.2. Фильтраты культуральных жидкостей.

• 2.1.3. Питательные среды.

2.1.4. Препараты.

2.1.5. Отраслевой стандарт бифидумбактерина.

2.1.6. Лабораторные животные.

2.2. Методы.

2.2.1. Контроль коммерческих препаратов.

2.2.2. Изучение взаимодействия штаммов и продуктов их метаболизма.

2.2.3. Оценка морфологической гетерогенности микробной популяции методами позитивного окрашивания и ультратонких срезов.

2.2.4. Морфометрический анализ.

2.2.5. Исследование антагонистической активности препаратов.

2.2.6. Изучение безопасности бификола на моделях «острой» и «хронической» токсичности.

2.2.7. Патоморфологическое исследование. 2.2.8. Статистические методы исследования.

ГЛАВА 3. Изучение взаимодействия В. bifidum шт.1 и Е. coli шт. М-17, и влияния продуктов их метаболизма на рост каждого при совместном культивировании штаммов.

3.1 Изучение взаимовлияния бифидобактерий и кишечной палочки на рост каждого при совместном культивировании.

3.2. Влияние продуктов метаболизма бифидобактерий на рост

Е. coli шт. М-17.

3.3. Влияние продуктов метаболизма кишечной палочки на рост В. bifidum шт 1.

ГЛАВА 4. Морфо-физиологические особенности клеток микробных популяций в составе бификола и препаратов бифидумбактерина, колибактерина.

4.1. Электронно-микроскопическое исследование морфологической гетерогенности микробных популяций Е. coli шт. М-17и В. bifidum шт.1, выращенных в жидких питательных средах.

4.2. Электронно-микроскопическое исследование бифидумбактерина (производитель - ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова, Петрово-Дальнее).

4.3. Электронно-микроскопическое исследование колибактериа (производитель - ОАО «Биомед» им. И. И. Мечникова, Петрово-Дальнее).

4.4. Электронно-микроскопическое исследование бификола.

4.4.1. Морфометрический анализ препарата бификола (производитель - ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова, Петрово-Дальнее), полученного при раздельном культивировании В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17.

4.4.2. Морфометрический анализ препарата бификола (производитель - НПО «Иммунопрепарат», г. Уфа), полученного при совместном культивировании

В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17.

ГЛАВА 5. Изучение взаимодействия В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. Мв бификоле при оценке антагонистической активности in vitro.

5.1-. Характеристика бификола по специфической активности.

5.2. Оценка взаимодействия бифидо- и коликомпонентов при контроле антагонистической активности бификола.

5.2.1. Определение количественного содержания бифидобактерий и кишечной палочки в посеве бификола.

5.2.2. Определение антагонистической активности бификола в аэробных условиях и с использованием анаэробной системы GENbox С02 с концентрацией углекислого газа в среднем

3-6 % (фирма bioMerieux® sa - Франция).

5.2-.3. Определение антагонистической активности бификола, В. bifidum шт. 1 с использованием анаэробной системы

ОХОГО» с концентрацией 5 % Ог и 10 % СО2 (фирма

ОХОГО», Великобритания).

ГЛАВА 6. Изучение взаимодействия культур В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 на модели «острой» и «хронической» токсичности комплексного препарата бификола и составляющих его монокомпонентов.

6.1. Патоморфологическое исследование.

6.1.1. Результаты исследования «острой» токсичности.

6.1.2. Результаты гистологического изучения внутренних органов мышей после введения Е. coli шт. М-17.

6.1.3. Результаты гистологического изучения внутренних органов мышей после введения В. bifidum шт. 1.

6.1.4. Результаты гистологического изучения внутренних органов мышей после введения смоделированного бификола.

6.2. Результаты исследования «хронической» токсичности.

6.2.1. Результаты гистологического изучения внутренних органов контрольных мышей.

6.2.2. Результаты гистологического изучения внутренних органов мышей после введения бифидумбактерина.

6.2.3. Результаты гистологического изучения внутренних органов мышей после введения колибактерина.

6.2.4. Результаты гистологического изучения внутренних органов мышей после введения смоделированного бификола.

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие Bifidobacterium bifidum штамм 1 и Escherichia coli штамм М-17 в бификоле, изготовленном при совместном культивировании производственных штаммов"

Актуальность темы исследования. Постоянное влияние неблагоприятных факторов на жизнедеятельность человека, нередко превышающее компенсаторные возможности состояния системы «окружающая среда — макроорганизм - микробиоциноз», способствует развитию дисбиотического состояния и, как следствие этого, проявлению заболеваний инфекционной и неинфекционной природы [1, 2, 9, 13, 54, 67, 69, 70]. Вместе с тем представители нормофлоры принимают самое непосредственное участие в биохимических, метаболических и иммунологических процессах макроорганизма за счет продукции ими различных ферментов, витаминов, биологически активных (антибиотикоподобных) веществ и других, разных по действию, продуктов метаболизма [4, 9, 14, 33, 59, 67, 90, 102, 103, 116]. Поэтому для профилактики и лечения таких состояний в медицинской практике широко используют пробиотики.

Лечебное действие монопрепарата ограничено индивидуальным спектром биологической активности штамма, на основе которого изготовлен пробиотик. Для повышения и расширения лечебного действия пробиотиков в практику здравоохранения внедрены комплексные препараты, изготовленные на основе двух и более штаммов одного вида или разных видов представителей нормофлоры: бификол, ацилакт, аципол, флорин форте.

Отечественный комплексный препарат бификол разработан на основе двух видов микроорганизмов - Bifidobacterium bifidum штамм 1 и Escherichia coli штамм М-17 [29,47]. Несмотря на длительный срок производства препарата, серии бификола отличаются друг от друга по показателям количественного содержания живых бифидобактерий и кишечной палочки в дозе. Это может быть обусловлено несовершенством технологии культивирования, использованием различных по составу питательных сред, изменением свойств микроорганизмов при совместном их культивировании, несовместимостью используемых штаммов и другими факторами.

Лечебная эффективность пробиотиков определяется совокупностью биологических свойств штаммов, входящих в их состав [9, 11, 12, 14, 21, 47, 63, 68, 69, 70]. Вместе с тем данные литературы свидетельствуют о том, что при совместном культивировании нескольких видов микроорганизмов возможно усиление или ослабление некоторых биологических свойств культур в смешанной популяции по сравнению с монокультурами: активности кислотообразования, антагонистической активности, резистентности к антибиотикам, адгезивной активности, продукции биологически активных веществ [14, 18, 20, 27, 35, 40, 55]. Механизм взаимодействия культур в смешанной популяции недостаточно изучен и привлекает внимание исследователей для решения технологических вопросов микробиологического производства.

В этой связи, исследования по изучению механизма взаимодействия культур В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в бификоле, в смешанной популяции при оценке их биологических свойств (биосовместимости, морфо-физиологического состояния клеток в бификоле, антагонистической активности, безопасности препарата при испытании in vivo) актуальны и имеют научную и практическую значимость для повышения качества коммерческого препарата.

Цель настоящей работы — изучение механизма взаимодействия В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в комплексном препарате бификол в опытах in vitro и in vivo.

Задачи исследования:

1. Изучение взаимовлияния культур бифидобактерий и кишечной палочки и продуктов их жизнедеятельности друг на друга при совместном культивировании.

2. Изучение морфологического состояния клеток В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в коммерческих сериях бификола, бифидумбактерина и колибактерина.

3. Оценка антагонистической активности бификола и производственных штаммов В. bifidum шт. 1, Е. coli шт. М-17 в аэробных и анаэробных условиях по отношению к регламентированным и музейным тест-штаммам патогенных микроорганизмов.

4. Изучение безопасности бификола в опытах in vivo на модели «острой» и «хронической» токсичности; оценка совместного действия двух компонентов бификола на организм экспериментальных животных.

Научная новизна исследования:

На экспериментальной модели оценки совместимости штаммов изучено взаимодействие В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 при их совместном культивировании: установлено стимулирующее влияние кишечной палочки и продуктов • ее жизнедеятельности на рост бифидобактерий и ингибирующее действие бифидобактерий и продуктов их метаболизма на рост кишечной палочки.

Впервые изучено морфо-физиологическое состояние клеток В. bifidum шт.1 и Е. coli шт. М-17 в коммерческих лиофилизированных препаратах бификоле, бифидумбактерине, колибактерине. Сравнительный анализ электронно-микроскопических исследований выявил наличие взаимного антагонизма бифидобактерий и кишечной палочки в смешанной популяции при их совместном и раздельном культивировании в процессе производства бификола. ■

На основании результатов изучения взаимодействия культур в смешанной популяции в бификоле при испытании антагонистической активности в аэробных и анаэробных условиях разработана модификация метода контроля антагонистической активности бификола.

Изучено взаимодействие В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в бификоле в опытах in vivo на моделях «острой» и «хронической» токсичности; показана безопасность ассоциации культур в бификоле.

Теоретическая и практическая значимость исследования

На модели бификола научно обоснована целесообразность: изучения взаимодействия штаммов в комплексных препаратах с помощью различных методов исследования: оценки совместимости, антагонистической активности, кислотообразующей активности, безопасности;

- изучения биологических свойств комплексных препаратов в сравнении с биологическими свойствами микроорганизмов, входящих в состав комплексного препарата для оценки взаимовлияния их на основные, определяющие показатели качества готового комплексного препарата;

- изучения антагонистической активности комплексного препарата с использованием оптимальных условий культивирования для каждого компонента смешанной микробной популяции;

- изучения безопасности моно- и комплексных пробиотиков в опытах «острой» и «хронической» токсичности в сравнении со штаммами, входящими в состав препарата.

Электроннно — микроскопические методы исследования морфологического состояния клеток в коммерческих препаратах бификоле, бифидумбактерине, колибактерине, расширяют существующие представления о взаимодействии культур в смешанных микробных популяциях; оценка морфо-физиологического состояния микроорганизмов в моно- и комплексном препаратах и соотношения физиологически активных и покоящихся форм клеток перспективна для прогнозирования развития микробных сообществ в процессе культивирования с заданными характеристиками.

Данные настоящей работы использованы для разработки МУК «Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков» (разд. 2, 3, 4, 6, 8).

Результаты исследований могут быть использованы в практической и научно-исследовательской работе при разработке новых лечебно-профилактических препаратов пробиотиков, работах, направленных на повышение качества препаратов и совершенствование технологии их изготовления.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При совместном выращивании В. bifidum шт.1 и E.coli шт. М-17 наблюдается сложный механизм взаимодействия: бифидобактерии и продукты их метаболизма оказывают ингибирующее действие на рост кишечной палочки, а кишечная палочка и продукты ее метаболизма стимулируют рост бифидобактерий, что проявляется в накоплении биомассы.

2. С помощью электронно-микроскопических методов исследования моно- и комплексного препаратов выявлен антагонистический механизм взаимоотношений двух видов микроорганизмов в смешанной популяции бификола, выражающийся в усилении фрагментации клеток бифидобактерий и появлении электронно-плотных гранул, в агрегации клеток кишечной палочки и деструктивных изменений в них.

3. Взаимодействие двух культур в смешанной популяции бификола проявляется по-разному при оценке антагонистической активности в аэробных и анаэробных условиях, что диктует целесообразность при наличии в комплексных препаратах представителей аэробных и анаэробных микроорганизмов использования оптимальных условий для культивирования каждого микроорганизма in vitro.

4. Комплексный препарат бификол по результатам испытания «острой» и «хронической» токсичности безопасен, что проявляется в отсутствии признаков токсического действия препарата на центральную нервную систему, органы иммунной системы и другие внутренние органы подопытных животных.

Апробация работы и публикации. Диссертация апробирована на заседании Ученого совета Федерального государственного учреждения науки Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича Роспотребнадзора (ФГУН ГИСК им. JI. А. Тарасевича Роспотребнадзора), протокол >Г°18 от 16.12.2008 г. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Юбилейной научно-практической конференции НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, Москва, 1996; Международной научно-практической конференции памяти Г. И. Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования», Москва, 2002; Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы», Москва, 2004; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней»; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2008.

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 1 в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 154 страницах, содержит 22 таблицы и 46 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 133 источника, из них 73 отечественных и 60 иностранных, приложения.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ладыгина, Александра Владимировна

Выводы.

1. Установлено, что при совместном выращивании культура В. bifidum шт. 1 ингибирует рост кишечной палочки, а культура E.coli шт. М-17 стимулирует рост бифидобактерий.

2. Впервые при использовании электронно-микроскопических методов исследования выявлено антагонистическое взаимодействие двух неродственных видов микроорганизмов - В. bifidum шт. 1 и E.coli шт. М-17 в готовом препарате бификоле вне зависимости от способа его изготовления.

3. Установлены различия морфологического состояния клеток бифидобактерий и кишечной палочки в составе бификола, изготовленного по разной технологии. Данный факт следует учитывать при совершенствовании и стандартизации технологии не только производства бификола, но и при разработке других комплексных препаратов.

4. При испытании антагонистической активности бификола в аэробных и анаэробных условиях выявлено, что в анаэробных условиях антагонистическая активность бификола выше и определяется антагонистической активностью бифидокомпонента.

5. В опытах in vivo на моделях «острой» и «хронической» токсичности показана безопасность ассоциации культур В. bifidum шт.1 и Е. coli шт. М-17 в бификоле. Изучение безопасности комплексных пробиотиков следует проводить в сравнении со штаммами, входящими в состав препарата.

6. Результаты исследований реализованы разработкой МУК «Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков» (разд. 2, 3, 4, 6, 8).

Заключение

На модели «острой» токсичности установлено, что внутрибрюшинное введение больших доз смоделированного препарата бификола (60 ОЕ/мл) и культуры Е. coli шт. М- 17 (80 ОЕ/мл) приводило в течение суток к гибели животных, обусловленной развитием выраженных сосудистых и дистрофических изменений во внутренних органах, тяжелых гемодинамических нарушений, относящихся к разряду шоковых реакций. После введения больших доз взвеси культуры В. bifidum шт. 1 (40 ОЕ /мл) обнаружены такие же морфологические изменения во внутренних органах, но они были выражены в меньшей степени и без развития гемодинамических нарушений и гибели животных.

Для определения LD50 внутрибрюшинно вводили три разные дозы взвеси смоделированного бификола (20 ОЕ, 10 ОЕ, 5 ОЕ) и культуры E.coli шт. М-17 (10 ОЕ, 5 ОЕ, 2,5 ОЕ) в объеме 0,5 мл. Несмотря на то, что бификол содержит одинаковое количество коли- и бифидобактерий, отмечена тенденция снижения гибели животных при его введении: LD50 для E.coli шт. М-17 составляет 6,41 ОЕ, бификола - 14,13 ОЕ. Внутрибрюшинное введение смоделированного бификола и взвеси культуры E.coli шт. М-17 в дозах 20 ОЕ и 10 ОЕ соответственно вызывало развитие выраженных сосудистых и дистрофических изменений во внутренних органах, что приводило к гибели животных. Характер морфологических изменений в ЦНС и внутренних органах сохранялся при уменьшении дозировки, но выраженность их была значительно ниже. По-видимому, сосудистые и дистрофические изменения во внутренних органах были обусловлены, с одной стороны, большой антигенной нагрузкой при внутрибрюшинном введении испытуемых препаратов и, с другой стороны, токсическим воздействием липополисахарида кишечной палочки. Присутствие в бификоле бифидобактерий приводило к снижению выраженности морфологических изменений во внутренних органах и количества погибших животных.

Сравнительная оценка результатов испытания смоделированного бификола (40 ОЕ + 20 ОЕ), взвеси культур E.coli шт. М-17 (80 ОЕ) и В. bifidum шт. 1 (40 ОЕ) при пероральном введении показала, что введение больших доз не приводило к развитию шоковых реакций. У отдельных животных отмечено развитие во внутренних органах умеренного полнокровия и умеренных дистрофических изменений. Признаков токсического воздействия смоделированного бификола, взвеси культур E.coli шт. М-17 и В. bifidum шт. 1 не обнаружено.

На модели «хронической» токсичности при многократном (14 сут) пероральном введении мышам разовой дозы для человека смоделированного бификола, бифидумбактерина и колибактерина не выявлено признаков токсического действия на ЦНС, дыхательную и иммунную системы, другие внутренние органы.

Таким образом, по результатам испытания «острой» и «хронической» токсичности комплексный препарат бификол, содержащий смешанную популяцию двух штаммов, безопасен, что проявляется в отсутствии признаков токсического действия препарата на центральную нервную систему и внутренние органы подопытных животных.

128

Обсуждение

Анализ опубликованной литературы свидетельствует о том, что макроорганизм и его нормальная микрофлора тесно взаимосвязаны и оказывают друг на друга разнообразное воздействие. Нормальная микрофлора, по современному представлению, является своеобразным экстракорпоральным органом, выполняющим многочисленные функции, способствующие поддержанию и сохранению здоровья макроорганизма. Изменение количественного и качественного состава микроорганизмов под влиянием разных факторов приводит к нарушению сложившейся колонизационной резистентности макроорганизма, многих функций его жизнедеятельности, снижению. иммунитета, и как следствие, способствуют развитию многих заболеваний. Для сохранения и коррекции индигенной микрофлоры, профилактики и лечения заболеваний, обусловленных дисбактериозами разной этиологии, используют моно- и комплексные пробиотики. Многолетний опыт применения пробиотиков показал несомненную их способность предохранять или корректировать дисбиотические изменения.

Лечебное действие монопрепарата ограничено индивидуальным спектром биологической активности штамма, на основе которого изготовлен пробиотик. Для повышения и расширения лечебного действия пробиотиков в практику здравоохранения внедрены комплексные препараты, изготовленные на основе двух и более штаммов одного вида или разных видов представителей нормофлоры: бификол, ацилакт, аципол, флорин форте. Отечественный комплексный препарат бификол разработан на основе двух видов микроорганизмов - В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 при совместном их культивировании на последнем этапе получения производственной биомассы. Несмотря на его длительный срок выпуска, серии коммерческого препарата различаются по показателям жизнеспособных бифидо- и коликомпонентов в дозе препарата. Это может быть обусловлено недостаточно стандартной технологией совместного культивирования штаммов, с использованием разных по составу питательных сред, изменением биологических свойств производственных штаммов при совместном культивировании, несовместимостью используемых штаммов и другими недостаточно изученными факторами.

Лечебная эффективность бактерийных препаратов определяется совокупностью биологических свойств штаммов, входящих в их состав. Вместе с тем данные литературы свидетельствуют о том, что при совместном культивировании нескольких штаммов возможно усиление или ослабление некоторых биологических свойств культур в смешанной популяции по сравнению с монокультурами: активности кислотообразования, антагонистической активности, резистентности к антибиотикам, адгезивной активности, продукции биологически активных веществ [14,35,40]. Механизм взаимодействия культур в смешанной популяции недостаточно изучен и привлекает внимание исследователей для решения технологических вопросов как в медицинской, так и в молочной промышленности.

В связи с этим, исследования по изучению механизма взаимодействия В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 в бификоле, оценке их биологических свойств (биосовместимости, морфо-физиологического состояния клеток культур, антагонистической активности, безопасности препарата при испытании in vivo) актуальны и имеют научную и практическую значимость для повышения качества коммерческого препарата.

Материалы опубликованных данных свидетельствуют о сложных взаимодействиях разных микроорганизмов в смешанной популяции как в организме человека, так и при совместном культивировании in vitro. Механизм взаимодействия в бификоле двух культур В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 недостаточно изучен. В наших исследованиях биосовместимость бифидо- и коликомпонентов в бификоле оценивали путем изучения взаимовлияния двух культур и продуктов их метаболизма при совместном культивировании по модифицированной нами методике. Результаты исследования позволили выявить сложный механизм их взаимоотношений. Установлено, что при совместном культивировании оба штамма в смешанной популяции ведут себя по-разному: культура бифидобактерий ингибирует рост кишечной палочки, в то время как кишечная палочка стимулирует рост бифидобактерий. Особенно четко это наблюдалось при оценке взаимовлияния их продуктов метаболизма на рост каждого при использовании фильтратов культуральной жидкости. Такие же взаимоотношения двух культур были отмечены при исследовании механизма поддержания колонизационной резистентности кишечника с помощью бифидобактерий [71]. Было установлено, что бифидобактерии ингибируют рост кишечных палочек, клостридий и других микроорганизмов за счет образования в процессе ферментации углеводов ацетата, лактата и продукции" антимикробных субстанций с широким спектром антимикробной активности.

Благодаря техническим и методическим усовершенствованиям электронно-микроскопические исследования в настоящее время позволяют получить более детальную информацию о взаимодействии клеток разных видов и родов в смешанных микробных сообществах при их совместном развитии в среде обитания [49, 52]. Нами впервые проведена оценка морфо-физиологического состояния клеток микроорганизмов в комплексном лиофилизированном бификоле, приготовленном на основе культур В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17 для оценки их взаимодействия в смешанной популяции при совместном и раздельном их выращивании. В качестве контроля исследовали морфо-физиологическое состояние клеток В. bifidum шт. 1 и Е. coli шт. М-17, выращенных в жидкой питательной среде Блаурокка и МПБ (соответственно), и в лиофилизированных бифидумбактерине и колибактерине.

Электронно-микроскопическое исследование препаратов показало, что в составе всех исследованных микробных популяций идентифицировано несколько морфологических типов клеток: электронно-прозрачные физиологически активные и электронно-плотные - покоящиеся клетки, делящиеся, частично или полностью аутолизированные и другие, отличающиеся по характеру протекающих в них деструктивных нарушений, возникающих при изменении параметров роста, воздействии экстремальных факторов, взаимодействии двух культур в смешанной популяции.

Микробная популяция в бифидумбактерине, регидратированном при 22 °С и 37 °С и экспозиции 30 мин на две трети (62,7±0,4) % и (61,2±0,3) % соответственно состояла из живых физиологически активных клеток, характеризующихся высоким уровнем метаболизма. Обнаружение в препаратах признаков фрагментации бифидобактерий и остатков разрушенных клеток свидетельствует о частичном аутолизе бифидобактерий, отражающем естественную динамику морфо-физиологических изменений представителей данного рода бактерий. Одна треть клеток, перешедших в фазу покоя, отражает, вероятнее всего, переход в стационарную фазу роста и/или негативное влияние процесса лиофильного высушивания.

В микробной популяции колибактерина, регидратированного при 22 °С и экспозиции 30 мин две трети (68,0±0,4) % популяции состояло из физиологически активных клеток, число покоящихся и частично аутолизированных клеток Е. coli шт. М-17 было одинаково.

Увеличение времени экспозиции до 2 ч при температуре 22 °С и 37 °С позволило выявить в препаратах бифидумбактерина только физиологически неактивные (покоящиеся) клетки, усиление фрагментации клеток бифидобактерий и появление большого числа электронно-плотных гранул. В препаратах колибактерина с увеличением длительности экспозиции до 2 ч при температуре 37 °С число клеток с характерными сферическими включениями возрастало. Наблюдаемые деструктивные изменения, по-видимому, носят обратимый характер и в дальнейшем, в зависимости от степени и глубины деструкции, клетки смогут либо восстановить свою физиологическую активность, либо погибнуть. Так, исследованиями JI.H. Евтуховой [19], изучавшей влияние лиофилизации на жизнеспособность Е. coli шт. М-17 в колибактерине, было выявлено, что при этом процессе происходит повреждение микробных клеток, для устранения которого необходимо проведение регидратации препарата в средах, богатых ростовыми субстратами.

Наличие в электронно-микроскопических препаратах бифидумбактерина и колибактерина большого числа физиологически активных клеток свидетельствует о том, что значительная часть популяции перед высушиванием находилась в физиологически активной форме. Образование покоящихся форм клеток является одним из механизмов приспособления микробной популяции к изменяющимся условиям окружающей среды, что способствует не только успешному выживанию микроорганизмов при воздействии неблагоприятных факторов, но и обеспечивает возможность обратимого перехода в физиологически активное состояние.

Для исследования морфо-физиологического состояния бифидобактерий и кишечной палочки в бификоле был использован коммерческий препарат, изготовленный двумя предприятиями по разной технологии: совместное или раздельное их культивирование при получении производственной биомассы. При совместном культивировании двух штаммов в среде КД-5а в полученную производственную биомассу добавляют сахарозо-желатиново-молочную среду, затем разливают во флаконы (не позднее 3-х сут после окончания культивирования), замораживают и высушивают. При раздельном культивировании получают биомассу бифидо- и коликомпонентов при выращивании штаммов в реакторах. После перемешивания смешанной культуры в течение 10-15 мин в нее добавляют сахарозо-желатиново-молочную среду, затем разливают во флаконы (не позднее 3-х сут после сведения двух биомасс), замораживают и высушивают.

В электронно - микроскопических препаратах бификола, изготовленного при совместном культивировании бифидобактерий и кишечной палочки, соотношение физиологически активных и физиологически неактивных клеток бифидобактерий близко к соотношению их в монопрепарате. Все клетки кишечной палочки находились в физиологически активном состоянии. Отличие электронно - микроскопических препаратов бификола от монопрепаратов (бифидумбактерина и колибактерина) заключалось лишь в наличие признаков антагонистической активности двух неродственных видов микрооргнаизмов: более активный процесс секреции бифидобактериями продуктов метаболизма, более выраженные деструктивные изменения в клетках кишечной палочки, возникающие в результате антагонистического воздействия бифидобактерий.

В электронно-микроскопических препаратах бификола, изготовленного при раздельном выращивании культур и затем их смешивании, морфологические свойства клеток бифидобактерий как физиологически активных, так и физиологически неактивных, в большей степени подвержены изменениям, чем в монопрепарате — бифидумбактерине, полученном по той же технологии, что и бифидокомпонент в бификоле. Физиологически активные клетки бифидобактерий в смешанной популяции бификола, полученного при раздельном культивировании, и соединении культур перед высушиванием, характеризуются более высоким уровнем метаболической активности по сравнению с монопрепаратом и бификолом, полученном при совместном культивировании. По-видимому, при используемой технологии раздельного культивирования бифидобактерий и кишечной палочки обе культуры при сведении производственных биомасс испытывают сильное стрессовое и антагонистическое влияние друг на друга путем воздействия продуктами метаболизма. Это выражается в большем количестве фрагментированных клеток бифидобактерий по сравнению с клетками в бифидумбактерине, и появлении многочисленных остатков разрушенных бифидобактерий, а также в повышенной агрегации клеток кишечной палочки, по сравнению с клетками в колибактерине, изготовленном по аналогичной с коликомпонентом технологии, наличии изменений на разной стадии деструкции в микробных клетках Е. coli шт. М-17, практически полном отсутствии покоящихся форм клеток.

Следовательно, в монокультурах, как и в смешанной популяции, морфо-физиологи^еское состояние клеток бифидобактерий и кишечной палочки разнообразно. Физиологически активные и покоящиеся клетки, фрагментированные клетки бифидобактерий, в разной степени аутолизированные клетки кишечной палочки отражают динамику развития популяции при совместном или раздельном культивировании. В смешанной популяции наиболее четко проявляется взаимный антагонизм двух неродственных видов микроорганизмов, при этом обе культуры продуцируют метаболиты, направленные на регуляцию количественного состава каждого ■ вида бактерий.

Так как количественное содержание коли- и бифидобактерий в дозе бификола, полученном при раздельном или совместном культивировании двух культур, соответствует требованиям НД, бификол, содержащий помимо живых микробных клеток продукты их жизнедеятельности, по-видимому, должен обладать большим лечебным и биологическим действием по сравнению с монопрепаратами. Согласно опубликованным данным, продукты метаболизма анаэробных и аэробных микроорганизмов принимают участие в регуляции состава и количества бактерий за счет антагонистического действия, оказывают морфокинетическое действие. Стимуляция роста эпителиальных клеток слизистой кишечника обусловлена продуктами метаболизма анаэробных микроорганизмов, которые являются дополнительным важным источником питания мукозных клеток [117]. Кроме того, разрушенные бифидобактерии, высвобождая белок и другие белковоподобные вещества, сами по себе могут являться дополнительным источником поступления белка в макроорганизм; при аутолизе кишечной палочки высвобождается липополисахарид, обладающий широким спектом биологического действия на организм [67].

Таким образом, сравнительный анализ электронно-микроскопических препаратов бифидумбактерина, колибактерина и бификола позволил наблюдать механизм взаимодействия клеток в однородной и смешанной популяции. Электронно-микроскопические методы исследования монокультур и комплексного препарата, изготовленного на их основе, раскрывают сложный характер их взаимодействия на уровне отдельных клеток и на популяционном уровне. Эти методы могут быть использованы при совершенствовании и стандартизации технологий совместного культивирования не только при производстве бификола, но и при разработке других комплексных препаратов пробиотиков.

Лечебное действие препарата обусловлено биологическими свойствами штаммов, используемых для их изготовления. Одной из важных характеристик производственных штаммов является их антагонистическая активность.

Согласно требованиям НД, специфическая активность бификола определяется двумя показателями: количеством жизнеспособных клеток бифидобактерий и кишечной палочки в дозе препарата и антагонистической активностью, определяемой в тесте отсроченного антагонизма. Коммерческие серии бификола по показателю жизнеспособных бифидо- и колибактерий удовлетворяли требованиям действующих НД, но различались по соотношению бифидо- и коликомпонентов (в допустимых пределах). Вместе с тем существенных различий между сериями бификола по антагонистической активности не выявлено.

Для оценки взаимодействия двух культур в бификоле и информативности регламентированного метода контроля антагонистической активности был использован модифицированный метод отсроченного антагонизма. При этом в посеве бификола определяли количество выросших бифидо- и колибактерий на питательных средах Гаузе №2 и МРС-5 в аэробных условиях культивирования и с использованием анаэробных систем.

Сравнительный анализ полученных данных выявил, что в аэробных условиях наибольшее содержание бифидобактерий (103 микр.кл/мл) отмечается через 24 ч совместного роста с кишечной палочкой. В условиях с использованием анаэробной системы GENbox С02 с концентрацией углекислого газа в среднем 3-6 % содержание жизнеспособных клеток бифидобактерий постепенно возрастал от 10 5 микр.кл/мл (через 24 ч) до 10 7-9 микрлсл/мл (через 48 ч и 72 ч) при росте на среде МРС-5; на среде

Гаузе № 2 максимальное содержание бифидобактерий было на 1-2 порядка меньше, чем на среде МРС-5. Ожидалось, что в этих условиях антагонистическая активность должна была проявиться в большей степени. Однако, достоверного различия в показателях антагонистической активности при аэробном культивировании и с использование данной анаэробной системы при культивировании на среде МРС-5 и Гаузе №2 отмечено не было, несмотря на то, что количество обоих компонентов в посеве бификола было о одинаковым- 10 живых микробных клеток.

Только при использовании анаэробной системы «ОХОГО» с концентрацией 5 % Ог и 10 % С02, испытуемые препараты достоверно различались по антагонистической активности. В условиях анаэробной системы «ОХОГО» выявлено, что бификол и В. bifidum шт. 1 проявили выраженный антагонизм по отношению ко всем испытуемым музейным штаммам: зоны угнетения роста разных тест-штаммов находились в пределе от 30 до 43 мм.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о сложном взаимодействии бифидобактерий и кишечной палочки в бификоле при оценке показателя антагонистической активности в разных условиях. Было выявлено, что общее содержание жизнеспособных клеток не всегда свидетельствует о формировании полноценных по биологическим свойствам клеток культур, входящих в состав комплексного препарата. Проявление данного свойства зависит от условий, в которых развиваются культуры: состава питательных сред, температуры культивирования, содержания кислорода в системе и других. Исходя из этого, при разработке комплексных препаратов, изготовленных на основе разных видов микроорганизмов, и испытания их антагонистических свойств следует учитывать оптимальные условия культивирования каждого микроорганизма in vitro и проводить изучение комплексных препаратов в сравнении с производственными штаммами.

При оценке качества моно- и комплексных препаратов пробиотиков немаловажным является изучение их безопасности. Многолетний опыт работы свидетельствует о том, что недостаточно иметь только характеристику безопасности штаммов, используемых для изготовления пробиотиков, без оценки безопасности готового препарата. В наших исследованиях взаимодействие двух штаммов в бификоле на организм подопытных мышей линии Black С/57 изучено на модели «острой» и «хронической» токсичности.

При однократном внутрибрюшинном введении в объеме 1 мл 80 ОЕ взвеси культуры E.coli шт. М-17, 40 ОЕ взвеси культуры В. bifidum шт. 1 и 60 ОЕ смоделированного бификола (40 ОЕ E.coli шт. М-17 и 20 ОЕ В. bifidum шт.1 в 1мл) все мыши, получившие культуру E.coli шт. М-17 и смоделированный бификол, пали с явлениями шоковой реакции, выражавшейся в полнокровии и кровоизлияниях во внутренних органах. В то же время внутрибрюшинное введение 40 ОЕ взвеси культуры В. bifidum шт. 1 все подопытные животные переносили без проявления каких - либо симптомов интоксикации. Вместе с тем при вскрытии их на 1 и 7 сутки после введения при макроскопическом изучении внутренних органов обнаружено выраженное полнокровие внутренних органов, особенно в легких, печени и почках, подтвержденное микроскопическими исследованиями, связанное с большой антигенной нагрузкой при внутрибрюшинном введении.

Для определения LD50 в следующем опыте мышам вводили однократно внутрибрюшинно три разные дозы взвеси культуры E.coli шт. М-17 и смоделированного бификола. Несмотря на то, что бификол содержит равное количество коли- и бифидобактерий, отмечена тенденция снижения количества погибших животных при его введении: LD50 для E.coli шт. М-17 составляет 6,41, бификола - 14,13 ОЕ. Гибель животных наблюдали в первые сутки. Всех павших животных вскрывали и проводили макроскопическую оценку внутренних органов. При этом отмечали выраженное полнокровие печени, легких и других внутренних органов. Следовательно, добавление к культуре E.coli шт. М-17 такого же количества культуры В. bifidum шт. 1 не приводило к увеличению токсического действия препарата.

Сравнительная оценка результатов перорального введения препаратов показала, что введение больших доз культур E.coli шт. М-17, В. bifidum шт. 1 и комплексного препарата бификол (80 ОЕ, 40 ОЕ и 60 ОЕ соответственно), не приводило- к развитию шоковых реакций и лишь у отдельных животных сопровождалось развитием во внутренних органах умеренного полнокровия и очаговых дистрофических изменений.

При изучении безопасности препаратов на модели «хронической» токсичности перорально вводили ежедневно в течение 14 сут терапевтические п о дозы бификола для человека (5x10 бифидобактерий + 3 х10 колибактерий о о

КОЕ/мл), колибактерина (3x10 КОЕ/мл) и бифидумбактерина (5x10 КОЕ /мл). Вводимые дозы превышали дозы для мышей более чем в 1000 раз. Морфологическое исследование внутренних органов не выявило признаков токсического действия указанных препаратов на ЦНС, дыхательную и иммунную системы, желудочно-кишечный тракт и другие органы.

Следовательно, в опытах на модели «острой» и «хронической» токсичности показана безопасность смешанной микробной популяции в комплексном препарате бификол.

Таким образом, на примере бификола выявлено, что механизм взаимодействия культур E.coli шт. М-17 и В. bifidum шт. 1 в бификоле полученном как при совестном, так и при раздельном их культивировании достаточно сложен и зависит о многих факторов: технологии изготовления, состава используемых питательных сред, методов испытания биологических свойств и других факторов. На основании данных литературы [14, 42, 44, 46, 47, 53, 60, 64, 65, 66, 132, 133] и результатов исследования сформулированы требования к доклиническому изучению пробиотиков [61].

При разработке комплексных препаратов, включающих разные виды микроорганизмов или несколько штаммов одного вида, необходимо:

- обосновать подбор штаммов для комплексных препаратов;

- изучить совместимость штаммов, составляющих основу комплексных препаратов, с использованием разных методов исследования;

-' лимитировать количественные соотношения производственных штаммов и определить достаточно ограниченные пределы их колебаний;

- при количественной оценке специфической активности отработать методику идентификации каждого штамма, составляющего основу пробиотика, по морфологическим и культуральными свойствам;

- определить биологические свойства комплексных пробиотиков в сравнении с биологическими свойствами штаммов, входящих в их состав;

- изучить безопасность комплексных пробиотиков на модели «острой» и «хронической» токсичности в сравнении с моноштаммами и их смешанной популяцией.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ладыгина, Александра Владимировна, Москва

1. Агаджанян Н.А., Труханов А.И., Шендеров Б.А. // Этюды об адаптации и путях сохранения здоровья.-М: Сирин, 2002,-156 с.

2. Анкирская А.С., Муравьева В.В. Видовой состав и некоторые биологические свойства лактобацилл при различных состояниях микроэкологии влагалища // Акушерство и гинекол. 2000. - №3. - С. 26-28.

3. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев.-Ленинград: Медгиз, 1962.-180

4. Бабин В.Н. Биохимические и молекулярные аспекты симбиоза человека и его микрофлоры / В.Н. Бабин, И.В. Домарадский, А.В. Дубинин, О.А. Кондраков // Журн. Рос. хим. о-ва им. Д.И. Менделеева.-1994.-Т.38.- № 6.-с.66-78.

5. Барышев М.Д., Благов Н.А. Колонизационная резистентность и химиотерапевтические антибактериальные препараты // Всесоюзный семинар.-М. 28-29 июня 1988.-Ч. 11.-е. 207.

6. Бартенева Н.С. Взаимосвязь химической структуры и биологической активности эндотоксина грамотрицательных бактерий. Молекулярная и клеточная теория инфекционного иммунитета. М ., 1985. - С. 62-71.

7. Белобородова Н.В. Метаболиты анаэробных бактерий (летучие жирные кислоты) и реактивность макроорганизма / Н.В. Белобородова, С.М. Белобородов. // Антибиотики и химиотерапия.-2000.-№ 2.- с. 28-36.

8. Бондаренко, В.М., Лихоед В.Г. Идеи И.И. Мечникова и современная микроэкология кишечника человека // ЖМЭИ.-2008.-№5.-с.23-29.

9. Борелло С.П. Микрофлора, секреторная и моторная деятельность желудочно-кишечного тракта // Лабораторное дело.- 1986.- № 4,- с. 210-212.

10. Воробьев А.А. Бактерии нормальной микрофлоры: Биологические свойства и защитные функции / А.А. Воробьев, Е.А. Лыкова // Журн. микробиол.- 1999.-№6.- с. 102-105.

11. Высоцкий В.В. Биологическое значение и структурные основы адгезивных свойств микроорганизмов // В кн. Медицинские аспекты микробной экологии/ под ред. Б.А. Шендерова.-М., 1993/1994, вып. 7/8.

12. Габриэлян Р.И. Функции микрофлоры желудочно-кишечного тракта и последствия ее нарушения после хирургических вмешательств./ Р.И. Габриэлян, Е.М. Горская, Н.Д. Снегова // Антибиотики и химиотерапия.-2000.- т. 45. № 9.- с.24-29.

13. Ганина В.И. Пробиотики. Назначение, свойства и основы биотехнологии Москва, 2001.- 169 с.

14. Гланц С. Медико-биологическая статистика: Пер. с англ. / С. Гланц.-Москва: Практика, 1999.-95 с.

15. Грачева Н.М., Ющюк Н.Д., Чупрынина Р.П., Мацулевич Т.В., Пожалостина Л.В. Дисбактериозы кишечника, причины возникновения, диагностика, применение бактерийных биологических препаратов // Пособие для врачей и студентов. М., 1999 г. - 44 с.

16. Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов: Руководящий документ 42-28-8-89.-8-10 с.

17. Евлашкина В.Ф., Чупринина Р.П., Осипова И.Г., Лукьянова О. Ю., Рыбачок А.В. К вопросу о стандартизации технологии изготовления бификола // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине. Уфа. -1995.-ч. 1, с.179-182.

18. Евтухова Л.Н. Восстановление жизнеспособности бактерий, поврежденных некоторыми физическими факторами: Автореф. дисс. канд. биол. наук. М, 1969. -14 с.

19. Ефимов, Б. А. Характеристика микроорганизмов, колонизирующих кишечник человека / Б. А. Ефимов с соавт. // ЖМЭИ.-2002.-№5.-с. 98-104.

20. Ильина Т.С. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития /Т.С. Ильина, Ю.М. Романова, A.JI. Гинсбург // Генетика.-2004.-№40 (11).-с. 1-12.

21. Калмыкова А.И. Пробиотики: терапия и профилактика заболеваний. Укрепление здоровья. / А.И. Калмыкова.- Новосибирск НПФ «Био-Веста», 2001.- 208 с.

22. Каширская Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной микрофлоры // Рус. мед. ж. 2000. -8, 13-14. - С.572-575.

23. Кокряков В.Н. Очерки о врожденном иммунитете // Санкт-Петербург: Наука, 2006.-е. 261.

24. Королев С.А. 1932. Основы технической микробиологии молочного дела. M.-JL, Сельхозгиз.

25. Коршунов В.М. /В.М.Коршунов, JI.B Поташник, Б.А. Ефимов, О.В. Коршунова, В.В. Смеянов, K.Gyr, R. Frei Качественный состав нормальной микрофлоры и лиц различных возрастных групп. // Журн. микробиолог.-2001.-№2.-57 с.

26. Куяров А.В. Колонизационная резистентность как показатель функциональных возможностей организма и коррекция ее нарушений: Автореф. дисс. докт. мед. наук. М.: Моск. мед. акад. - 2000 . - 46 с.

27. Ленцнер А.А., Ленцнер Х.Т., Микельсаар М.Э. Биология лактобацилл микрофлоры человека // Актуальные проблемы теоретической медицины: Ученые записки Тартуского государственного университета. Тарту, 1982. -С. 52-63.

28. Мальцева Н.Н. Стимуляция местного иммунитета с помощью микробов — представителей нормальной микрофлоры кишечника и их компонентов: Дисс. канд. мед. наук.- М.1988.

29. Маркова Т.Н. Бактериальные иммуномодуляторы. / Т.Н. Маркова, Д.Г. Чувиров // Рус. мед. журн,- 2001.-Т.9, № 16-17.-е. 703-706.

30. Мечников И.И. Этюды оптимизма. М: Наука.-1964.

31. Несчисляев В.А. Пробиотики: микробиологические и технологические аспекты получения, контроля и конструирования препаратов: Автореф. дисс. докт. мед. наук. — Пермь, 2005

32. Осипова И.Г. Некоторые аспекты механизма защитного действия колибактерина и споровых эубиотиков и новые методы их контроля: Дисс. канд. биол. наук, Москва, 1997.

33. Парфенов, А.И. Микробная флора кишечника и дисбактериоз // Рус. мед. журн.-1998.-№ 18.-е. 1170-1173.

34. Перетц Л.Г. Значение нормальной микрофлоры для организма человека. -М.: Медицина, 1965. 280 с.

35. Петров, JI.H. / JI.H. Петров, Г.Н. Галкин, Н.Л. Петров // Бактериальные пробиотики. Биотехнология, клиника, алгоритмы выбора. Санкт-Петербург.-2008.-е. 136.

36. Петровская В.Г., Марко О.П. Микрофлора человека в норме и патологии.-М. 1976.-21.7 с.

37. Поспелова В.В., Рахимова Н.Г., Халенева М.П., Морозова Л.В. и др. Новые сферы применения микробных биопрепаратов для коррекции бактериоценоза организма человека// Иммунобиол. препараты. М., 1989. -С. 142-152.

38. Рахимова Н.Г. Разработка комплексного препарата бификол и его эффективность при кишечных расстройствах, связанных с дисбактериозом: Дисс. канд биол. наук Москва, 1977.

39. Рыбальченко, О.В. Электронно-микроскопическое исследование межклеточных взаимодействий микроорганизмов при антагонистическом характере взаимодействий // Микробиология.-2006. т.75. № 4 с. 550-555.

40. Рыбальченко, О.В. Проявление антагонистического действия бактериоциногенных Lactobacillus acidophilus на Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii и Proteus mirabilis / О.В. Рыбальченко, B.M. Бондаренко, Н.Б. Вербицкая // ЖМЭИ-2006.-№7.-с. 8-11.

41. Рыбальченко О.В. Морфо-физиологические аспекты взаимодействий микроорганизмов в микробных сообществах: Автореф. дисс. докт. биол. наук. -Санкт-Петербург, 2003.

42. Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М, Вербицкая Н.Б. Ультраструктурные изменения в клетках Shigella flexneri при взаимодействии с бактериоциногенными Lactobacillus acidophilus. //ЖМЭИ.2006.-№4-с. 50-53.

43. Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М., Дробица В.П. Атлас Ультраструктуры микробиоты кишечника человека, С-Петербург, 2008, с. 13.

44. Сборник Инструкций по селекции молочнокислых бактерий и бифидобактерий и подбору заквасок для кисломолочных продуктов, утвержденный Министерством мясной и молочной промышленности 14.12.1185 г., с.88

45. Ткаченко Е.И., Успенский Ю.П. Питание, микробиоценоз и интеллект человека. // 2006,-СПб., Спец. Лит. 560 с.

46. Фадеева И.В. Разработка комплексного пробиотического препарата на основе лактобактерий: Дисс. канд. мед. наук, Пермь, 2004.

47. Фармакопейная статья 42-132 ВС-94 Бифидумбактерин сухой

48. Фармакопейная статья 42-3365-97 Колибактерин сухой

49. Фармакопейная статья 42-3268-96 Бификол сухой

50. Хавкин А.И. Микробиоциноз кишечника и иммунитет / А.И. Хавкин // Рус. мед. журн,- 2003.- Т.П. № 3.- с. 122-126.

51. Чупринина Р.П., Ладыгина А.В., Евлашкина В.Ф. Пробиотики и механизм их лечебного действия // Международный конгресс «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней — прогресс и проблемы», С. Петербург, 2003, с. 16^18.

52. Шимчук Л.Ф. Стандартизация колибактерина: Дисс. канд. биол. наук Москва, 1983.

53. Шендеров, Б.А. Микрофлора человека и животных и ее функции / Медицинская микробная экология и функциональное питание Т.1-М.: «ГРАНТЪ», 1998.-228 с.

54. Шендеров Б.А. Колонизационная резистентность и антимикробные препараты //Антибиотики и колонизационная резистентность. 1990. - Т. 19. -С. 5-16.

55. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том I: Микрофлора человека и животных и ее функции. М., 1998. -287 с.

56. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. ТЛИ: Пробиотики и функциональное питание. М, 2001. - 288 с.

57. Шендеров Б.А., Манвелова М.А. Микроэкологические аспекты функционального питания // Медицинские аспекты микробной экологии. -Выпуск 7/8. 1993/1994. - Ч. I. - С. 10 - 19.

58. Abrams G.D. Microbiological effects on mucous structure and function // Amer.J.Med.Sci.Biol. -1982. -vol.35.-№ 3

59. Anderson R. The Segnificanse and Potential Molecular Mechanisms of Gastrointestinal Barrier Homeostasis / R Anderson // Scand. J. gastroenterol. — 1997/-Vol. 32.№ 1.-P.1073-1083.

60. Arturo Fnadon *, Maria Rosa Martinez-Larranaga, Maria Aranzazu Martinez. Probiotics for animal nutrition in the European Union. Regulation and safety assessment // Regulatori Toxicology and Pharmacology 45 (2006) 91-95.

61. Bengmark S. Econutrition and health maintenance a new concept to prevent GL inflammation, ulceration and sepsis// Clin.Nutrition. -1996.- Vol.15. -P. 1-10

62. Вёппо, Y., Mitsuoka T. Development of intestinal microflora in humans and animals / Bifidobacteria and Microflora. 1986. - №5. - p. 430-435.

63. Benno Y., Endo К., Takeo M., et al. Comparison of fecal microflora of elderly persons in rural and urban areas of Japan // Apl. Environ. Vicrobiol. -1989.-№5.- P. 1100-1105.

64. Berezin, B.E. Opportunistic nosocomial multiply resistant bacterial infections their treatment and prevention / B.E. Berezin, D. Deere, J.M. Guillou // J. Antimicrob. Chemother. 1993. - № 32 Suppl A. - p. 39-47.

65. Bernhardt, H. Recent studies on the microbial ecology of the upper gastrointestinal tract / H. Bernhardt, M. Knoke // Infection. 1989. - №17 (4). -p.259-263.

66. Borriello S.P. Microbial flora of the Gastrointestinal tract. Jn.: Microbial Metabolism in the Digestive Tract (ed. M.J. Hill). - 1986.

67. Brenner S., Home R.W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses // Biochim. Biophys. Acta. 1959.V. 34. № 1. P. 103-110

68. Costerton J.W., Greenberg E.P. Bacterial biofilms: a common case of persistent infection. // Science.-1999.-v.284.-p.318-322.

69. Costerton J.W. Bacterial biofilms in Natura and Disease / J.W Costerton, K. G. Cheng, G.G. Geesey et al. // Ann. Rev. Microbiol., 1987, vol 41.

70. De Simone C., Ciardi A., Grassi A. et al. Effects of Bifidobacterium bifidum and of Lactobacillus acidiphilus on gut mucosa and peripheral blood

71. В- lymphocytes//Jmmunopharamacol.Immunotoxicol. 1982.-Vol.14. - № 1. P. 1-2.

72. Donskey, C.J. The role of the intestinal tract as a reservoir and source for transmission of nosocomial pathogens / C.J. Donskey // Clin. Ifect. Dis. 2004. -№39(2). -"p. 219-226.

73. Eckburg, P.B., Bik E.M., Bernstein C.N. et al. / Dirversity of the human intestinal microbial flora. // Science. 2005. - №308 - p. 1635-1638.

74. Engelhardt, H. Structural research on surface layers: a focus on stability, surface layer homology domains, and surface layer cell wall interactions / H. Engelhardt, J. Peters // J. Struct. Biol. - 1998. - № 124. - p. 276-302.

75. Faeth K.P., Radler F. Investigation of the formation of amines by lactic acid bacteria.// Wein-Wissenshafr, 1994. Vol. 49, №1. P. 11-16.

76. Farrell, R.J. Microbial factors in inflammatory bowel disease / R.J. Farrell, J.T. LaMont // Gastroenterol. Clin. North. Am. 2002. - № 31 (1). - p. 41-62.

77. Faria A.M.C., Weiner H.L. Oral tolerance: mechanisms and therapeutic applications // Adv. Immunol. 1999.- Vol. 73.- P. 153-364.

78. Finegold S.M., Sutter V.L., Mathisen G.E. Normal indigenous intestinal microflora //In : Human Intestinal Microflora in Health and Risease., D.J.Hengtes (ed.), Academic Press, New York (USA). -1983. -P. 356-447.

79. Glauert A.M. Factors influencing the appearance of biologic specimens in negatively stained preparations //Lab. Investig. 1965.V. 14. P. 1060-1079.

80. Gorbach S.L. Lactic acid bacteria and Human Health// Ann.Med. -1990.-Vol.22.-P: 756-761.

81. Gorbach S.L.Function of the normal human microflora// Scand.J.Infect. Dis.- 1986.-49 suppl.-P. 17-30.

82. Hentges D. The protective function of the indigenous intestinal flora// Pediatr.Infect.Dis. 1986. - Vol. 5. Suppl. 1.- P. 17-20.

83. Hentges D.J. Intestinal flora in defense against infection// In: Human Intestinal Microflora in Health and Disease , Academic Press, New York (USA).- 1983.-P. 309-319.

84. Hayat M.A. Principles and techniques of electron microscopy: Biological applications. V.l. № 1. New York: Van Nostrand Reinhold. Co., 1974. P. 3-51.

85. Hold, G.L. Assessment of microbial diversity in human colonic samples by 16S rRNA sequence analysis / G.L. Hold, S.E. Pryde, V.J. Russel et al. // FEMS Microbiol. Ecol. 2002. - № 39. - p. 33-39.

86. Holdeman L.V., Cato E.P., Moore W.E.C. Recent changes in identification And classification of some anaerobes. — In: Anaerobic bacteria selected topics // Eds.: D.W.Lambe et al. New York, 1980. - P.25-38

87. Ishikawa N., Onda M., Hurakawa K. et al. The effects of intestinal flora on the > function of neutrophils// J.Germfree Life Gnotobiol-1989.- Vol.19.

88. Jack, R.W. Bacteriocins of gramnositive bacteria / R.W. Jack, J.R. Tagg, B. Ray // Microbiol. Rev. 1995. — № 59 (2).-p. 171-200.

89. Kelly, D. Commensal gut bacteria: mechanisms of immune modulation / D. Kelly, S. Conway, R. Aminov // TRENDS Immunol. 2005. - № 26 (6). - p. 326333.

90. Luckey T.D. Intestinal microecology// In: Microoecologie des Magen-Darm Kanals des Menschen. Leipzig, 1982. - P. 149-164.

91. Macfarlane G.T., Macfarlane S. Human Colonic Microbiota: ecology, physiology and metabolic potential of intestinal bacteria// Scand.J.Gastro-enterol.- 1997. Vol.32, suppl.222. -P.3-10.

92. Matsuki, T. Distribution of Bifidobacterial species in human intestinal microflora examined with 16S rRNA-genetargeted species-specific primers / T. Matsuki," K. Watanable, R. Tanaka et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1999. -№65 (10).-p. 4506-4512.

93. Midvedt T. Intestinal microflora associated characteristics// Microecol. And Therapy. 1986 Vol.16. - P.283-288.

94. Miller, M.B. Quorum sensing in bacteria / M.B. Miller, B.L. Bassler // Annu. Rev. Microbiol.-2001.-№ 55.-p. 165-199.

95. Nielsen, D.S. Case study of distribution of mucosa-associated Bifidobacterium species, Lactobacillus species, and other lactic acid bacteria in the human colon /

96. D.S. Nielsen, P.L. Moller, V. Rosenfeldt et al. // Appl. Envir. Microbiol. 2003. -№ 69 (12).-p. 7545-7548.

97. Orrhage K., Nord C.E. Bifidobacteria and Lactobacilli in human health// Drugs Exp. and Clin.Res. -2000.- №3. P. 95-111.

98. Petersen W.L., Mackrowiak Ph.A., Bamett C.C. et al. The human gastric bactericidal barrier: mechanisms of action, relative antibacterial activity and dietary influences// J.Biochem. 1987.-Vol.31., P978-983.

99. Rambaud, J.-C. Gut Microflora. Digestive physiology and pathology / J.- C. Rambaud et al. // Paris: John Libbey Eurotext, 2006. 250 p.

100. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in electron microscopy // J. Cell Biol. 1963.V. 17. № 1. P. 208-217.

101. Risoen P.A., Johnsborg O., Diep D.B., et al. Regulation of bacteriotocin production in Lactobacillus plantarum depends on a conserved promoter arrangement with consensus binding sequence// Molecular Genetics and Genomics MGG, 2001. № 1. - P. 198-206.

102. Roediger.W.E.W. Interrelationship between bacteria and mucosa of the gastrointestinal tract.-In: «Microbial Metabolism in the Digestive Tract» (ed. M.J.Hill.-New.Yore: Academic Press, 1986.-p.29-32.

103. Rolfe R.D. The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal Health//J.Nutrition. -2000. Vol. 130,(2S suppl). -P.396-402.

104. Rolfe R.D. Interactions among microorganisms of the indigenous intestinal flora and their influence on the host// Rev.Infect.Dis. 1984. -vol.6 № 1. P.273-279.

105. Rosebury, T. Microorganisms indigenous to man / T. Rosebury. -N.Y., 1962.

106. Salminen, S. Gut flora in normal and disordered states / S. Salminen,

107. E. Isolauri, T. Onnela// Chemitherapy. 1995. -№ 41 (suppl. 1) - p. 5-15.

108. Samonis G., Gikas A., Anaissie E.J. et al. Prospective evaluation of effects of broad spectrum antibiotics on gastrointestinal yeast colonization of humans// Antimicrob.agents chemother.- 1993.№ 1. P.51-53.

109. Savage, D.C. Microorganisms associated with epithelial surfaces and stability of the indigenous gastrointestinal microflora // Nahrung. 1987. — Vol. 31 №5-6 — p. 383-395.

110. Sonnenburg J.L., et al. Glycan foraging in vivo by an intestine-adapted bacterial symbiont. // Science. 2005. -№ 307. - p. 1955-1959.

111. Spurr A.R. A low-viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy //J. Ultrastructure Res. 1969. V. 26. № 1. P. 31-43.

112. Tannock, G.W. New perception of the gut microbiota: implication for future research / G.W. Tannock // Gastroenterolelin, North. Am. 2005. - №34 (3) -p. 361-382.

113. Tannock, G.W. The normal microflora: new concepts in Health Bromotion / G.W Tannock,. //Microbiol. Sci. 1988. -V. 5. -№1. - p. 663-672.

114. Van der Waaij D. Colonization Resisteance of the Digestive tract; An Impotance first barrier of defense to opportunistic infections in man and animals. // Abstr. XI1 Intern. Sympos. Gnotobiology, Honolulu, June 23-28, 1996.

115. Van der Waaij D. The immunoregulation of the intestinal flora: experimental in vestigation on the olevelopement and composicion of the microflora in normal and thymusless mice / D.Van der Waaij // Microbiol. Therapy.-1984.-vol. 14.-P.63-74.

116. Weems W.A. Intestinal fluid flow; its production and control. // Ed. L.R. Iohson,New York: Raven Press. 1987.-Vol. l.-p. 571-593.

117. WHO Health and Nutritional Propertias of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria. Report of a Joint FAO/WHO Expert