Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка физико-химических методов повышения эффективности культивирования пробиотических бактериальных культур

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка физико-химических методов повышения эффективности культивирования пробиотических бактериальных культур"

Кузнецов Денис Бахтиерович

РАЗРАБОТКА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

15 >;иЗ 1и15

Пермь-2014

005557514

005557514

Работа выполнена на кафедре микробиологии ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» МЗ РФ, филиале ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед», физическом факультете ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет». Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, Одегова Татьяна Федоровна профессор

Несчисляев Валерий Александрович

доктор медицинских наук, доцент кафедры эпидемиологии с курсом гигиены и эпидемиологии ФПК и ППС ГБОУ ВПО Пермского государственного медицинского университета им. ак. Е.А. Вагнера Минздрава России Захарова Юлия Александровна

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории водной микробиологии ФГБУН Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН Соломенный Александр Петрович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» (119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, МГУ имени М.В.Ломоносова, д. 1, стр. 2).

Защита состоится «27» февраля 2015 года в 12-00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс: (342)280 92 11.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и сайге Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.ieg3n.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭГМ УрО РАН и на сайге ИЭГМ УрО РАН (http://www.iegm.ru). Автореферат разослан «30» декабря 2015 года.

доктор медицинских наук Официальные оппоненты:

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Взаимодействие молекулярных структур живых систем с внешней средой является актуальным предметом исследований и обсуждений (Chari et al., 2010; Trevors, 2012). Наряду с этим все больше появляется работ о взаимодействии внешнего электромагнитного излучения низкой интенсивности (ЭМИНИ) с микроорганизмами (Chilochi et al., 2011; Torgomyan et al., 2012). Намечаются перспективы для прикладного использования новых данных (Колесников и др., 2010; Mishra et al., 2013), в том числе в российской микробиологической промышленности, которая нуждается в технологическом перевооружении. Невостребованность инноваций и современных технологий, необходимых при разработке и производстве различных микробиологических продуктов и лекарственных средств, является системной проблемой отечественной индустрии. В условиях глобализации доминируют объективные требования, одним из которых является создание эффективных высокотехнологических производств с минимальными затратами (Стратегия «Фарма 2020»).

В России и за рубежом в промышленных масштабах для культивирования микроорганизмов используют ферментеры (биореакторы), конструкция которых была разработана более 100 лет назад. Общепринятые способы оптимизации промышленных процессов сводятся к корректировке состава питательной среды, рН, температуры, содержания диоксида углерода, кислорода и перемешиванию среды. Конструктивное дифференцирование устройств для культивирования и ферментации определяется, в основном, способами подвода энергии и газов в питательные среды (Иоффе, 1998).

С развитием научно-технического прогресса появляются новые высокотехнологичные устройства, которые позволяют повысить биосинтетическую способность микроорганизмов путем дополнительного подвода нетепловой энергии электромагнитного излучения в процессе культивирования и ферментации. Практическое использование различных видов электромагнитного излучения представляется перспективным направлением оптимизации микробиологического производства (Usatii et al., 2010).

В настоящее время проведены исследования прикладного характера с возможностью реализации методов в промышленности путем подвода нетепловой энергии миллиметрового излучения (Голант и др., 1985; Furia et al., 1986; Тамбиев, Кирикова, 2000; Тамбиев и др., 2002; Hadjiloucas et al., 2002; Осипова, 2007).

Данная работа посвящена изучению возможности модернизации способов и устройств для культивирования пробиотических организмов с целью повышения

выхода биомассы. Актуальность представленных исследований обусловлена необходимостью совершенствования существующих микробиологических производств, в том числе по выпуску пробиотиков.

Цель исследования - изучение влияния ЭМИНИ на биологические показатели пробиотических микроорганизмов и сенсорной биолюминесцентной системы, оценка биотехнологического потенциала воздействия и разработка методов повышения эффективности культивирования.

Реализация данной цели достигалась решением следующих задач:

• Изучить биологические показатели культур производственных штаммов Bifidobacterium bifidum 1, Escherichia coli M-17, Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90T-C4, Lactobacillus acidophilus NK1, Lactobacillus acidophilus lOOash при воздействии на них ЭМИНИ;

• Исследовать влияние ЭМИНИ на сенсорную биолюминесцентную систему «Эколюм-8»;

• Изучить процессы трансформации околоповерхностного пространства клеток микроорганизмов и изменение свойств питательной среды при воздействии ЭМИНИ;

• Выработать алгоритм разработки методик стимуляции роста культур микроорганизмов и рекомендации по ведению процесса обработки ЭМИНИ бактериальных культур.

• Разработать методики культивирования пробиотических микроорганизмов при воздействии на них ЭМИНИ.

Научная новизна

Разработаны оригинальные методы повышения эффективности культивирования клеток промышленных штаммов с помощью ЭМИНИ, которые могут быть рекомендованы для производства пробиотических препаратов «Бифидумбакгерин», «Бификол» и «Колибактерин».

Впервые исследован отклик сенсорной биолюминесцентной системы «Эколюм-8» на основе индикаторного тест штамма Escherichia coli К12 TGI (plum) при воздействии на него ЭМИНИ с различной длиной волны и разной продолжительностью облучения. Установлена возможность использования сенсорной биолюминесцентной системы «Эколюм-8» в методике экспресс-тестирования оптимальных режимов облучения.

Впервые изучены межфазные процессы, протекающие при воздействии ЭМИНИ на поверхности клеток Е. coli К12 TGI (plum) с помощью атомно-силовой микроскопии.

Впервые обнаружен гипохромный эффект при измерении оптической плотности питательной среды МРС-1 под воздействием ЭМИНИ. Возможно, что данное явление связано с изменением полярного окружения молекул биополимеров и их конформации.

Теоретическое и практическое значение работы

Теоретическая значимость результатов исследований состоит в расширении знаний о воздействии ЭМИНИ на живые системы. Показана возможность изменения ряда биологических показателей культур микроорганизмов при воздействии на них ЭМИ низкой интенсивности. На основе полученных данных усовершенствован ряд методик и технических решений для научно-исследовательского и прикладного использования с целью повышения выхода биомассы в технологическом процессе, в том числе апробирована методика экспресс-тестирования индикаторным штаммом при подборе оптимальных режимов излучения и продолжительности экспозиций.

Разработан алгоритм принятия решений для выбора оптимальных режимов и продолжительности экспозиций при внедрении методики и технологических решений в производства, связанные с накоплением биомассы гетеротрофных микроорганизмов.

Проведен ряд исследований с использованием атомно-силовой микроскопии и УФ-спектрометрии для выяснения первичных звеньев механизма изменения биологических параметров микроорганизмов, протекающего при воздействии на них ЭМИНИ.

Разработанные методики внедрены в практику работы в Филиале ФГУП НПО «Микроген» Пермское НПО «Биомед» (акт внедрения от 29 января 2014 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

• ЭМИНИ ММ и ближнего ИК диапазонов вызывают изменения биологических показателей у исследуемых пробиотических культур и индикаторного штамма Е. coli Kl2 TGI (plum).

• ЭМИНИ влияют на динамику межфазных процессов на поверхности клеток микроорганизмов и изменяют свойства питательной среды.

• Индикаторный штамм Е. coli Kl2 TGI (plum) целесообразно использовать для экспресс-тестирования влияния ЭМИНИ на рост бактериальных культур.

Апробация работы и публикации

Основные положения и результаты диссертации обсуждены на научных конференциях Пермской государственной фармацевтической академии в 2011 и 2012 гг., краевой научно-практической конференции студентов, аспирантов

и молодых ученых «Физика для Пермского края» Пермского государственного национального исследовательского университета в 2013 году.

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, и монография в соавторстве.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами и 31 рисунком. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, результатов собственных исследований и главы, с описанием алгоритма разработки методики повышения эффективности культивирования бактериальных культур, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 251 источника, из них 86 отечественных и 165 зарубежных авторов, приложения.

Связь задач исследования с планом научно-исследовательских работ

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава РФ (номер государственной регистрации 01.9.50.007426).

Личный вклад автора

Основные результаты получены лично автором: разработка технологической цепочки (пробоподготовка, низкоэнергетическое электромагнитное воздействие, физико-химические методы анализа изменения параметров); разработка методики определения оптимальных режимов облучения биомассы ЭМИНИ коротковолнового инфракрасного (ИК) и сверхвысокочастотного миллиметрового (СВЧ ММ) диапазонов для стимулирования/ ингибирования роста микроорганизмов; сборка экспериментальных установок для облучения культур ЭМИНИ. Изучение биологических параметров культур микроорганизмов проведено совместно с сотрудниками научного отдела Филиала ФГУП НПО «Микроген» Пермское НПО «Биомед». Расчет диаграммы направленности антенн, измерение сопротивления питательной среды для определения толщины скин-слоя, атомно-силовая микроскопия (АСМ) проведены совместно с сотрудниками кафедры радиоэлектроники и защиты информации ГБОУ ВПО ПГНИУ. УФ-спектроскопия проведена в ФАРМАТЕСТ РИД ГБОУ ВПО ПГФА.

Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Бактериальные штаммы. Объектами исследования являлись производственные штаммы В. bifidum 1, L. plantarum 8R-A3, Е. coli М-17, L. fermentum 90Т-С4, L. acidophilus NK1, L. acidophilus lOOash, которые используются в производстве пробиотических препаратов и сенсорная биолюминесцентная система «Эколюм-8» на основе генно-инженерного штамма Е. coli К12 TGI (plum), соответствующие требованиям нормативной документации.

Среды культивирования. Бактериальные штаммы лактобактерий культивировали на среде МРС-1 и МРС-2 (ФСП 42-05047298-05 «Лактобактерин сухой, лиофилизат для приготовления суспензии для приема внутрь и местного применения»), В. bifidum 1 на казеиново-дрожжевой среде №5 (ПР №04862997-482010 «Бифидумбактерин сухой, лиофилизат для приготовления суспензии для приема внутрь и местного применения»), Е. coli М-17 на мясо-пептонном бульоне (ТУ 10-02-789-176-94). Указанные среды используются в производстве пробиотических препаратов Филиала ФГУП НПО «Микроген» Пермское НПО «Биомед».

Условия культивирования и определение ростовых характеристик.

Клетки бактерий выращивали в 100 мл среды в прямоугольных банках объемом 250 мл, либо в 10 мл в одноразовых пробирках. Бактериальный рост измеряли на приборе «Densi-La-Meter П» (Эрба Рус) с использованием оптических пробирок, входящих в комплект и «КФК-3» (ЗОМЗ) с использованием 0,5 см кюветы. Рост культуры бактерий оценивали по изменению оптической плотности суспензии клеток. Выживаемость оценивали путем определения колониеобразующих единиц (КОЕ). Исследование КОЕ Е. coli М-17, L. plantarum 8Р-АЗ, L. fermentum 90Т-С4, L. acidophilus NK1, L. acidophilus lOOash проводилось по ФСП 42-0504-7298-05. Исследование КОЕ В. bifidum 1 проводилось по ФСП 42-0028212701.

Определение физиологического статуса сенсорной биолюминесцентной системы. Оценка изменения физиологического статуса бактериальных клеток осуществлялась методом люминометрии на приборе «Биотоке-10» (ООО НЕРА-С) (ТУ 446-У-028-00-ОТУ) с использованием сенсорной биолюминесцентной системы «Эколюм-8» (ТУ 6-09-20-236-01). Люминесцентные бактерии, интенсивность свечения которых обусловлена активностью фермента люциферазы, реагируют на стимулирующее или ингибирующее воздействие изменением интенсивности люминесценции (A.c. СССР 1335569, 1987 и A.c. СССР 1540439, 1987). Проявление указанного эффекта поддается количественному учету при

кратковременной экспозиции тест-культуры. Предлагаемый способ исключает необходимость применения питательных сред, позволяет быстро оценить стимулирующее или ингибирующее воздействие ЭМИНИ.

Эффект воздействия излучения выражали в виде цифрового показателя Ила -индекс антибактериальной активности (безразмерная величина): Илл= (Xi— Х2УХ1, где Xi и X¡ - интенсивности свечения индикаторного штамма без и после облучения соответственно (Несчисляев и др., 2002).

Определение динамики межфазных процессов на поверхности бактериальных клеток. Лиофилизированную культуру бактерий Е. coli К12 TGI (plum) очищали от защитной среды путем центрифугирования на центрифуге лабораторной медицинской «ОПН-8 10» четыре раза по 10 мин на 2000 об/мин. Далее очищенную суспензию разливали в полимерные пробирки для облучения. После облучения из пробирок изымали суспензию микроорганизмов объемом 10 мкл и помещали на предметное стекло. С помощью центрифуги SPIN12000 (Midas) суспензию микроорганизмов распределяли по поверхности стекла. Поверхность клеток микроорганизмов сканировали на комплексе высокого разрешения «Ингегра Прима - НаноЛаборатория» (NT-MDT). Динамика межфазных процессов на поверхности бактериальных клеток оценивалась как изменение силы адгезии Fa=kx. AZ, где к - жесткость кантилевера, AZ- разность высоты кантилевера в момент соприкосновения с исследуемым образцом и в момент отрыва от исследуемого образца. Капиллярная сила Fc была постоянной, т.к. поверхность кантилевера покрыта золотом, которое обладает гидрофильными свойствами и, как следствие, в контактном режиме зонд из-за действия капиллярной силы будет непрерывно прижиматься к образцу (Рехвиашвили и др., 2008).

Выявление изменения свойств питательной среды при воздействии низкоинтенсивным электромагнитным излучением миллиметрового диапазона. В качестве метода исследования изменений свойств питательной среды выбрана УФ-спектроскопия на сканирующем спектрофотометре СФ-103 (АКВИЛОН). Раствор сравнения - вода. Толщина кюветы 10 мм. Питательную среду МРС-1 сканировали в диапазоне 230^370 нм, шаг сканирования — 1 нм. Пределы допустимого среднеквадратичного отклонения случайной составляющей погрешности при измерении спектральных коэффициентов направленного пропускания (по фотометрической шкале), составлял не более ±0,05%. Фотометрический диапазон измерений: -0,3-^3,0.

Определение активности кислотообразования. Кислотообразовательную способность определяли косвенно по измерению уровня pH на ионометре лабораторном И-160М. Значение уровня pH является интегральным показателем, который показывает количество органических кислот, продуцируемых растущей

бактериальной культурой. Измерение уровня рН проводили в двух параллельных пробах из каждой пробирки.

Определение поглощающей способности питательной среды. Дня вычисления поглощающей способности среды СВЧ-излучения измеряли электрическое сопротивление среды и вычисляли глубину проникновения электромагнитного поля в среде. Электрическое сопротивление измеряли в кварцевых кюветах, внутри которых помещались медные обкладки, соизмеримые с внутренними размерами стенок. Измерения проводили в течение 3,5 мин при комнатной температуре (24±2°С) с помощью Омметра цифрового АМ-6011. Из полученных данных вычисляли удельное электрическое сопротивление по формуле: R = р-1, где р - удельное электрическое сопротивление среды Ом/м, а = О, 018 м, b = 0,029 м, с = 0,016 м, R - электрическое сопротивление Ом. После этого, зная удельное электрическое сопротивление, подставляя известные данные, получили глубину проникновения поля для каждого режима по формуле: а = , где /- частота СВЧ-излучения Гц, а - глубина проникновения поля (скин-слой) м, -относительная магнитная проницаемость среды ( = 1), - активная проводимость среды Ом-1*м-1, из которого изготовлены стенки волновода, -магнитная проницаемость вакуума (4л* Ю-7 Гн/м).

Устройства и методы воздействия электромагнитным излучением. Собраны собственными силами экспериментальные установки для изучения эффектов воздействия ЭМИНИ на длинах волн >.=4,9; 5,6; 7,1 мм и >.=850^890 нм из аппаратов «МИЛТА-КВЧ» и «МИЛТА-Ф-8-01» (НПО «Космического приборостроения»). В установке «МИЛТА-КВЧ» с выходной мощностью 10 мВт для облучения ЭМИНИ миллиметрового диапазона расстояние между раскрывом волновода и пробой было выбрано порядка 1 см, что, с одной стороны обеспечивало работу в дальней волновой зоне, где d — диаметр раскрыва волновода, для >.=5,6 мм d=4,5 мм и R=7,2 мм; для >.=4,9 мм d=4,0 мм и R=6,5 мм, с другой стороны, пробирка находилась внутри сечения СВЧ-пучка на уровне половинной мощности, которое, по нашим расчетам, составляло порядка 1 см.

Установка на основе аппарата «МИЛТА-Ф-8-01» включала в себя ИК-лазер и ИК-светодиоды, работающие в диапазоне >.=85(Н890 нм. Импульсная мощность излучения лазера составляла 21 Вт, а непрерывная мощность излучения светодиодов (4 шт.) — 100 мВт. Светодиоды были необходимы для расширения спектра излучения. Пробирка с пробой размешалась внутри камеры так, что дно прилегало к излучающей поверхности лазера и крепилась сверху на отражающей алюминиевой опоре.

Для облучения образцов на >.=8,14 мм мощностью порядка 20 мВт в режиме непрерывной генерации использовалась установка на основе генератора Г4-156,

предоставленная кафедрой радиоэлектроники и защиты информации физического факультета ФГБОУ ВПО «ПГНИУ». Суммарные потери энергии: потери в антенно-волноводном тракте, рассеяние за пределами сечения на уровне половинной мощности и отражение от поверхности полимерной пробирки составляли порядка 30% генерируемой мощности, таким образом, поток мощности СВЧ-излучения, воздействовавший на исследуемую пробу, составлял порядка 0,4 мВт/см2. Расстояние от раскрыва антенны до центра пробирки составляло 38 см, что, с учетом применения СВЧ-линзы обеспечивало работу в дальней волновой зоне антенны.

Методы воздействия электромагнитным излучением низкой интенсивности основаны на помещении исследуемых образцов в электромагнитное поле. Облучение проводили при температуре 23±2°С. Исследовалось влияние коротковолнового ИК-излучения, СВЧ-излучения миллиметрового диапазона на культуры бактерий.

Статистическая обработка. Все эксперименты проводились не менее чем в трехкратной повторности. При статистической обработке определяли среднее арифметическое, стандартное отклонение и доверительные интервалы. Достоверность различий определяли с использованием t-критерия Стьюдента и U-критерия Манна-Уитни (Лакин, 1990).

Анализ результатов проводили с помощью прикладных программ MS Office 2010 Excel и Statistica 5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Определение поглощающей способности питательной среды. На первом этапе работы было установлено, что при толщине слоя питательной среды ~1 см СВЧ-излучение практически полностью поглотится. В связи с этим, подбиралась лабораторная посуда, которая максимально соответствовала данному требованию.

Влияние ЭМИ НИ на физиологический статус клеток Escherichia coli К12 TGI (plum). Для выбора оптимальных режимов облучения вначале были проведены исследования на сенсорной биолюминесцентной системе «Эколюм-8». Обнаружена высокая чувствительность системы «Эколюм-8» к внешним ЭМИНИ миллиметрового и коротковолнового ИК диапазонов. В результате изучения влияния ЭМИНИ на люминесценцию Escherichia coli К12 TGI (plum) подобраны оптимальные условия, режимы и объемы пробы. При проведении биолюминесцентного теста выявлено несколько вариантов развития реакции свечения индикаторного штамма Е. coli К12 TGI (plum) после воздействия на него ЭМИНИ (рис.1,2).

Установлено, что миллиметровое СВЧ-излучение сразу повышало люминесценцию сенсора, после чего уровень свечения монотонно снижался. После 2 часов в зависимости от режима облучения уровень люминесценции увеличивался или оставался постоянным (рис. 1А). Несмотря на различный отклик сенсорной системы, критерии оптимизации почти равны; при Х=А,9 мм А7=4,74, при А.=5,6 мм АГ/=5,12, при Х= 7,1 мм А7=5,21. При изменении продолжительности облучения (20 или 60 мин) уровень люминесценции отличался. Критерий оптимизации 20-минутной экспозиции в целом составлял /0=2,7 по сравнению с Кг 1,63 60-минутной экспозиции. Следовательно 20-минутное облучение при ^.=8,14 мм оказывает более выраженный стимулирующий эффект на физиологический статус сенсорной системы по сравнению с облучением продолжительностью 60 мин. Таким образом показано, что развитие реакции люминесценции зависит от длины волны (рис. 1 А) и продолжительности облучения (рис. 1Б и рис. 2).

Рис. 1. Влияние СВЧ-излучения на биолюминесценцию Е. coli К12 TGI (plum). А - время экспозиции 60 мин (длина волны 4,9; 5,6;

7,1 мм), Б - время экспозиции 20 и 60 мин (длина волны 8,14 мм)

Определено, что коротковолновое ИК-излучение оказывает менее выраженное стимулирующее действие на эмиссию фотонов сенсорной биолюминесцентной системы, а реакция люминесценции развивается во времени колебательно и имеет косинусоидальный характер (рис.2). Продолжительность облучения коротковолновым ИК-излучением сильно влияло на динамику развития реакции люминесценции. При двухминутной продолжительности облучения наблюдалась преимущественно стимуляция свечения, при десятиминутной — ингибирование люминесценции. Также установлено, что сенсорная система

чувствительна к различной модуляции ЭМИНИ коротковолнового ИК-диапазона, однако меняющейся при изменении продолжительности облучения (рис. 2).

Ила

Время реакции, час

Рис. 2. Влияние коротковолнового ИК-излучения на биолюминесценцию Е. coli К12 TGI (plum). А - время экспозиции 2 мин (частота модуляции 5 кГц; 0,6 кГц; 0 кГц), Б - время экспозиции 5 мин (частота модуляции 5 кГц; 0,6 кГц; 0 кГц), В - время экспозиции 10 мин (частота модуляции 5 кГц; 0,6 кГц)

» 5 кГц. 10 ш Я 0.6 кГц. 10 мнн

Режимы с любой модуляцией при 10-минутной экспозиции и режим модуляцией 0,6 кГц имели наименьшее значение критерия оптимизации оказались не пригодными для повышения физиологического статуса клеток.

—♦—5 кГц. 5 мин -в-О.б кГц, 5 мин -*-0кГц. 5 мин

А

Илл

Время реакции, час

Время реакции, час

Таким образом, при разработке методов повышения эффективности культивирования необходимо учитывать такие параметры как продолжительность облучения ЭМИНИ, длину волны и частоту модуляции.

Следовательно, ЭМИНИ миллиметрового СВЧ- и коротковолнового ИК-диапазонов влияют на физиологический статус сенсорной биолюминесцентной системы и возможно на рост и выживаемость культуры. Для установления правильности данного вывода на следующем этапе исследований было проведено изучение влияния ЭМИМИ на биологические показатели промышленных штаммов пробиотических микроорганизмов.

Влияние ЭМИНИ миллиметрового диапазона на биологические параметры пробиотических микроорганизмов. Для дальнейшего изучения эксперименты разделили на две части: первая - облучение лиофилизированных культур В. bifidum 1 и L. plantarum 8Р-АЗ ЭМИНИ до посева (табл. I); вторая -облучение культур В. bifidum 1, Е. соИ М-17, L. plantarum 8Р-АЗ, L. fermentum 90Т-С4, L. acidophilus NKl, L. acidophilus lOOash ЭМИНИ в лаг-фазу роста. Такой подход позволял определять возможность усовершенствования методик культивирования микроорганизмов, которые используются в производстве пробиотических препаратов. Для облучения была выбрана установка, предоставленная кафедрой радиоэлектроники и защиты информации физического факультета ФГБОУ ВПО «ПГНИУ».

Таблица 1

Зависимость накопления биомассы В. bifidum 1 и L. plantarum 8Р-АЗ от

продолжительности облучения ЭМИНИ при >.=8.14 мм

КОЕ/мл

Штамм контроль Продолжительность облучения

20 мин 60 мин

В. bifidum 1 (107) 4,52' 4,46' 3,9'

L. plantarum 8Р-АЗ (109) 1,92' 2,17' 2,01'

Примечание. Уровень U-критерия Манна-Уитни находится: 1 в зоне незначимости.

Проведенные исследования показали отсутствие влияние электромагнитного излучения низкой интенсивности с >.=8,14 мм на выживаемость культуры, в том числе на восстановление ростовых свойств частично поврежденных при лиофилизации клеток, в сухих препаратах.

В ходе второй части исследований эксперименты, проведенные с культурой В. Ы/^ит 1, показали зависимость чувствительности (уровня накопления биомассы) культуры от продолжительности облучения (рис. 3).

Исследования с использованием штамма L. plantarum 8Р-АЗ показали низкую эффективность воздействия ЭМИНИ (табл. 2). При облучении штаммов L. acidophilus lOOash (табл. 6) и Е. coli М-17 (табл. 6) продолжительностью 20 мин происходит увеличение концентрации клеток микроорганизмов. Облучение продолжительностью 60 мин штаммов L. fermentum 90Т-С4 (табл. 3), L. acidophilus lOOash (табл. 6) и Е. coli М-17 (табл. 6) оказало негативный эффект на их рост и кислотообра-зование (табл. 3).

Таблица 2

Зависимость биологических показателей L. plantarum 8Р-АЗ от продолжительности облучения с А.=8,14 мм

Биологические показатели контроль Продолжительность облучения

20 мин 60 мин

КОЕ (109)/мл 2.21 2,64' 1,802

РН 3.72 3,85' 3,68'

Оптическая плотность 1,0 I,!1 1,0'

Примечание. Уровень U-критерия Манна-Уитни находится: 1 в зоне незначимости. 2 в зоне значимости.

Таблица 3

Зависимость биологических показателей Ь. /егтепШт 90Т-С4 от времени экспозиции при облучении с Х=8.14 мм

Биологические показатели контроль Продолжительность облучения

20 мин 60 мин

КОЕ (108)/мл 3,05 2,232 2.602

РН 3,69 3,76' 4.472

Оптическая плотность Ы 1,2' 0,482

Примечание. Уровень U-критерия Манна-Уитни находится: ' в зоне незначимости, 2 в зоне значимости.

■контроль Я 20 мни * 60 мин

Рис. 3. Зависимость уровня накопления биомассы В. Ъ'фйит 1 от времени экспозиции на А.=8.14 мм

Определено, что при продолжительности облучения 20 и 60 мин у L. acidophilus NK1 повышаются ростовые характеристики и кислотообразование культуры по сравнению с контрольными образцами (табл. 4).

В результате изучения влияния ЭМИНИ миллиметрового диапазона на биологические показатели культур микроорганизмов показана возможность его использования для повышения эффективности культивирования при изготовлении пробиотических препаратов.

Таблица 4

Зависимость биологических показателей L. acidophilus NK1 от времени экспозиции при облучении с 1=8,14 мм

Биологические показатели контроль Продолжительность облучения

20 мин 60 мин

КОЕ (107)/мл 4,20 4,90! 5,702

pH 3,76 3,70! 3,682

Оптическая плотность 0,86 1,0» 1 Л2

Примечание. Уровень U-критерия Манна-Уипш находится: 1 в зоне незначимости, 2 в зоне значимости.

Таблица 5

Зависимость биологических показателей L. acidophilus lOOash от времени экспозиции при облучении с 1=8,14 мм

Биологические показатели контроль Продолжительность облучения

20 мин 60 мин

КОЕ (108)/мл 1,6 1.61 1,102

pH 3,94 3,80' 4,0s1

Оптическая плотность 0,86 1,12 0,8*

Примечание. Уровень U-кригерия Манна-Уигни находится: 1 в зоне незначимости, 2 в зоне значимости.

Таблица 6

Зависимость биологических показателей Е. coli М-17 от времени экспозиции при облучении с 1=8,14 мм

Биологические показатели контроль Продолжительность облучения

20 мин 60 мин

КОЕ (107)/мл 5,12 6,45' 4,92'

pH 4,67 4,45' 3,72'

Оптическая плотность 0,52 U1 0,46'

Примечание. Уровень U-кригерия Манна-Уигни находится: 1 в зоне значимости.

Данные исследования биологических параметров штаммов В. bifidum 1, L. plantarum 8Р-АЗ, L. acidophilus lOOash, E. coli M-17 согласуются с данными исследования отклика сенсорной биолюминесцентной системы Е. coli К12 TGI (plum) (рис. 1Б).

В результате изучения влияния ЭМИНИ миллиметрового диапазона показана возможность его использования в способах повышения эффективности культивирования при изготовлении пробиотических препаратов.

Данные исследования биологических параметров штаммов В. bifidum 1, L. plantarum 8Р-АЗ, L. acidophilus lOOash, E. coli M-17 согласуются с данными исследования отклика сенсорной биолюминесцентной системы Е. coli К12 TGI (plum) (рис. 1Б).

Для определения воздействия ЭМИНИ предлагается использование биосенсора - генно-инженерного штамма, содержащего плазмиду с /их-опероном почвенных люминесцентных бактерий Photorhabdus luminescens ZM1. Способ заключается в определении воздействия ЭМИНИ на биолюминесценцию бактерий Е. со/г К12 TGI (plum).

Воздействие ЭМИНИ на метаболические процессы сенсорной тест-системы приводит к изменению биолюминесценции, что сопровождается изменением сигнала биолюминесценции. В зависимости от режима облучения ЭМИНИ уровень люминесценции изменяется. Интенсивность свечения облученного образца может превышать интенсивность свечения контрольного образца, который не облучался ЭМИНИ. Значение контрольной группы (без облучения) при исследовании люминесценции принимается за «О» (рис. 4). По значению уровня люминесценции сенсорной системы можно судить о характере воздействия определенного режима облучения ЭМИНИ на живой объект.

На рис. 4 приведены обобщенные данные всех экспериментов по исследованию реакции люминесценции сенсорной системы. По данным исследований отклика сенсорной биолюминесцентной системы и биологических показателей культуры диагностическим параметром является временной промежуток с 5 по 24 час (рис. 4).

Черный столбик показывает уровень свечения в 5 час после облучения, столбик с штриховкой - в 24 час после облучения. Характер воздействия излучения на биологические показатели может показать изменение уровня и направление реакции люминесценции. Увеличение интенсивности свечения сенсорной системы представлено графически большей высотой столбика с штриховкой относительно черного столбика, а снижение интенсивности наоборот (рис. 4). Изменение интенсивности люминесценции сенсорной системы, возможно, позволит прогнозировать динамику роста бактериальной культуры.

8,14 мм 20 шш 8,14 лш 1 ч 5,6 мм 1 ч 4,9 мм 1 ч 5 кГц, 2 müh 0,6 кГц, 2 мин 0 Гц, 2 млн 5 кГц, 5 мин 0,6 кГц, 5 Mfffi 0 Гц, 5 мин 5 кГц, 10 мин 0,6 кГц, 10 мин

■5ч 30,76 13,06 42 32,11 21,25 14,45 22,82 33,48 41,23 27,25 33,48 41,23

а*24 ч 30,9 3,61 55,06 31,38 36,48 18,32 24,89 27,12 33,56 20,18 -6,23 -2,87

Рис. 4. Способ определения стимуляции/ ингибирования роста культур

Предполагается, что данный метод позволит оценить характер влияния ЭМИНИ и подобрать параметры (продолжительность облучения, частота излучения и скважность импульса1), необходимые для оптимизации процессов культивирования пробиотических культур. Предлагаемый способ оценки воздействия ЭМИНИ обладает преимуществом экспрессности из-за быстрого отклика сенсорной биолюминесцентной системы и низкой трудозатратностью.

Исследование влияния электромагнитного излучения с 1=8,14 мм на силу адгезии на поверхности бактериальных клеток. Дтя понимания механизма воздействия ЭМИНИ был проведен анализ литературы, согласно которому СВЧ-излучение миллиметрового диапазона преимущественно поглощается молекулами воды (Tambiev et al., 2000; Савельев и др., 2012). Известно, что аккумуляция энергии ЭМИНИ определенных длин волн возможна посредством фазового процесса перераспределения электронной плотности молекул воды в адсорбированной фазе и разделения заряда (Zheng et al., 2006; Elia et al., 2013). Поэтому следующим шагом исследований было изучение динамики межфазных процессов на поверхности клеток микроорганизмов с помощью атомно-силовой

1 Скважность импульса - признак импульсных систем, определяющий отношение его периода следования (повторения) к длительности импульса.

микроскопии (ACM). Установлено, что ЭМИНИ по-разному влияет на отрыв зонда при обратном движении сканера и силу адгезии на поверхности клеток Е. coli К12 TGI (plum) в зависимости от времени облучения (рис. 5).

Рис. 5. А - Отскок кантилевера на поверхности клетки, Б - сила адгезии на поверхности клетки Е. coli К12 TGI (plum). 1 - контрольная проба, 2 - проба, подвергшаяся облучению в течение 20 мин., 3 - проба, подвергшаяся облучению в течение 60 мин.

На рис. 6 представлены 20-изображения, на рис. 7 - ЗО-скамы поверхностей клеток Е. coli К12 TGI (plum). На клетках, которые подвергались облучению, визуализируется складчатая структура поверхности, тогда как поверхность клеток без облучения имеет гладкий и ровный рельеф. Также наблюдаются изменения в пропорции клеток (меньшая высота в отношении длины), которые не подвергались облучению. Это косвенно подтверждает, что на поверхности облученных клеток толщина адсорбированной фазы меньше, чем у клеток, которые не подвергались облучению.

Таким образом можно предположить, что миллиметровое СВЧ-излучение способно поглощаться молекулами-акцепторами и трансформировать адсорбированную фазу воды на поверхности бактериальных клеток.

Рис. 6. А - клетка Е. coli К12 TGI (plum), подвергшаяся СВЧ-излучению в течение 60 мин, Б - без облучения

Рис. 7. А - 3D-изображение клетки Е. coli К12 TGI (plum), подвергшейся облучению 60 мин. Б - без облучения

Исследование изменения свойств питательной среды при воздействии электромагнитным излучением миллиметрового диапазона. Из предыдущих экспериментов установлено, что ЭМИНИ способно оказывать влияние на различные биологические параметры живой клетки и трансформацию её околоповерхностного пространства, поэтому следующим этапом исследований было определение способности ЭМИНИ изменять свойства питательной среды. Согласно используемому теоретическому аппарату в среде должны происходить изменения обводнения биополимеров (Zheng et al., 2006; Гапочка, 2013), входящих в состав питательной среды, что является следствием переходов между молекулярными уровнями, образованными электронами валентных оболочек атомов в молекулах. Для подтверждения этого положения наиболее

информативным методом является УФ-спектроскопия (Suzuki et al., 2007; Gunasekaran et al., 2008).

После облучения СВЧ-излучением на всех длинах волн наблюдался гипохромный эффекта также гипсохромные и батохромные сдвиги в УФ-диапазоне (рис. 8). Примечательно то, что подобные эффекты при облучении СВЧ-излучением миллиметрового диапазона были получены группой ученых из МГУ им. Ломоносова на культуре одноклеточной зеленой водоросли Scenedesmus quadricauda (Гапочка и др., 1998).

нм

■1

230 250 270 290 310 330 350 370

......Без облучения ---5,6 мм -7,1мм

Рис. 8. Спектры поглощения питательной среды МРС-1 в УФ-диапазоне.

Алгоритм проведения исследований для разработки методов стимуляции роста бактериальных культур и методы повышения эффективности культивирования пробиотических микроорганизмов. Алгоритм включает в себя следующие стадии: подготовка проб со штаммами культур микроорганизмов, проведение анализа спектров поглощения ЭМИНИ ИК- и СВЧ-диапазонов для определения резонансных линий или областей поглощения. Если спектры поглощения бактериальной культуры или её отдельных компонентов известны, то этап можно опустить, далее биологические объекты облучаются когерентным или некогерентным ЭМИНИ, с частотами, находящимися в областях поглощения и изучается реакция биологических объектов на облучение методами

2 Гипохромный эффект (гипохромизм) - изменение интенсивности поглощения в результате конформационных перестроек [Bakowska et al., 2003].

люминесцентного анализа, турбидиметрии бактериальной суспензии, атомно-силовой и/ или электронной микроскопии, возможны и другие методы. Далее полученные результаты анализируются и подбираются оптимальные условия облучения: частота, степень когерентности, поток мощности и время экспозиции. На основании полученных данных проводятся пилотные испытания, по результатам которых принимается решение о внедрении разработки в производство.

Предложено несколько вариантов реализации метода стимуляции культуры в промышленных условиях. Варианты технологических решений зависят от того, на какой стадии производственного процесса происходит облучение культуры. Соответственно, уже на этапе лабораторных исследованиях необходимо определить оптимальный вариант воздействия ЭМИНИ для конкретного штамма микроорганизмов.

Возможны следующие подходы: облучение культуры перед внесением в питательную среду; облучение культуры после внесения в питательную среду. Первый вариант подходит для обработки маточной культуры перед засевом в производственные питательные среды. В. bifidum 1 и Е. coli М-17 после внесения в питательную среду облучают в режиме: частота 36,84 ГГц, мощностью 0,5-^10 мВт/см2, время экспозиции 20±3 мин.

Указанный алгоритм исследований был практически апробирован в условиях отделения препаратов бактериотерапии НПО Биомед. Разработанные методики внедрены в практику работы в Филиале ФГУП НПО «Микроген» Пермское НПО «Биомед» (акт внедрения от 29 января 2014 г.).

Выводы

1. Изучены биологические показатели культур производственных штаммов при воздействии ЭМИНИ. При облучении культур ЭМИНИ при Х.=8,14 мм с экспозицией 20 мин прирост биомассы составляет: В. bifidum 1 - 122%, L. acidophilus lOOash - 128%, L. acidophilus NK1 - 116%, E. coli M-17 - 230%, при экспозиции 60 мин прирост биомассы L. acidophilus NK1 - 127% по отношению к контрольным пробам.

2. Показано, что сенсорная биолюминесценгная система «Эколюм-8» обладает высокой чувствительностью к внешним ЭМИНИ, а развитие реакции свечения носит пролонгированный характер. Установлено, что стимуляция или ингибирование реакции биолюминесценции сенсорной системы зависит от совокупности факторов, включающих вид, частоту импульсного режима лазерного излучения, интенсивность и длительность воздействия ЭМИНИ на бактериальную культуру. На основе изучения реакции люминесценции Эколюм-8 разработана методика определения влияния ЭМИНИ на микроорганизмы.

3. Обнаружено, что ЭМИНИ способно приводить к изменениям силы адгезии на поверхности клеток Е. coli К12 TGI (plum) и трансформировать их околоповерхностное пространство. Установлено, что ЭМИНИ вызывает гипохрамиз в питательных средах, что возможно является следствием изменения обводнения биополимеров и их конформации.

4. Выработан алгоритм проведения исследований для разработки методов стимуляции роста бактериальных культур с использованием источников электромагнитного излучения низкой интенсивности в ИК- и СВЧ-диапазонах. Визуализация эффекта стимуляции бактериальной культуры базируется на применении методов люминометрии, турбидиметрии, атомно-силовой микроскопии и др.

5. Разработаны методики повышения эффективности культивирования пробиотических бактериальных культур на примере Е. coli и В. bifidum. Усовершенствованные методы могут использоваться при изготовлении препаратов «Бифидумбактерин», «Бификол», «Колибактерин».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

1. Кузнецов, Д.Б. Физико-химические механизмы воздействия крайне-высокочастотного излучения на микроорганизмы / Д.Б. Кузнецов // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - № 1; URL: http://www.science-education.ru/107-8226 (дата обращения: 28.01.2013).

2. Кузнецов, ДБ. Исследование воздействия низкоингенсивного СВЧ электромагнитного поля на микролюминесценцию и оптическую плотность питательной среды MRS-1 / Д.Б. Кузнецов // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - № 2; URL: www.science-education.ru/108-9008 (дата обращения: 07.09.2013).

3. Кузнецов, Д.Б. Перспективы применения электромагнитных излучений крайне высокой частоты малой мощности в фармации / ДБ. Кузнецов // Фундаментальные исследования. - 2012. - № 10 (часть 2). - С. 400-404.

4. Кузнецов, Д.Б. Молекулярные механизмы воздействия инфракрасного излучения на микроорганизмы / Д.Б. Кузнецов // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 4 (часть 2), - С. 414-418.

5. Кузнецов, Д.Б. Исследование реакции бактериальной люминесценции под воздействием электромагнитного излучения миллиметрового и инфракрасного диапазонов / Д.Б. Кузнецов, Т.Ф. Одегова, В.А. Несчисляев, и др. // Бутлеровские сообщения. - Казань. - 2013. - Т.36. - №12. - С. 8-14.

6. Кузнецов, Д.Б. Исследование изменений на поверхности клеток Е. coli lum+ под влиянием СВЧ-излучения миллиметрового диапазона / Д.Б. Кузнецов, И.В. Лунегов, И.Л. Вольхин, и др. //Бутлеровские сообщения. - Казань. - 2013. -Т.36. - №12. - С.53-58.

Публикации в других журналах и сборниках

7. Кузнецов, Д.Б. Влияние СВЧ-излучения низкой интенсивности на рост штамма Bißobacterium bifidum при глубинном культивировании / Д.Б. Кузнецов, ИВ. Лунегов, И.Л. Вольхин, и др. // Материалы краевой научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Физика для Пермского края». - Пермь. - Вып. 6, - 2013. - С. 137-141.

8. Кузнецов, Д.Б. Электромагнитное излучение и живые системы / Д.Б. Кузнецов, Т.Ф. Одегова, И.Л. Вольхин // Lambert Academic Publishing. -2014,- 112 с.

9. Кузнецов, Д.Б. Каталитические технологии в биоиндустрии на основе физических механизмов воздействия / Д.Б. Кузнецов, Т.Ф. Одегова // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. — Пермь. - 2012, - №9, -С. 236-239.

10. Кузнецов, Д.Б. Эффекты воздействия СВЧ-излучения на Escherichia coli lum+ / Д.Б. Кузнецов, И.В. Лунегов, И.Л. Вольхин, и др. // Вестник Пермского Университета. (Серия: Физика) - 2013. - Вып. 2 (24). - С. 71-75.

Н.Кузнецов, Д.Б. Исследование воздействия низкоингенсивных миллиметровых волн на оптическую плотность питательной среды МЛ5-1 / Д.Б. Кузнецов // Международный журнал экспериментального образования. -2013.-№ 8-С. 129-131.

12. Кузнецов, Д.Б. Методика исследования влияния ИК- и СВЧ-излучения на микроорганизмы / Д.Б. Кузнецов, ИВ. Лунегов, И.Л. Вольхин, Т.Ф. Одегова // Вестник Пермского Университета. (Серия: Физика) - Пермь. - 2013. -Вып.З (25). - С. 83-87.

13. Кузнецов, Д.Б. Исследование влияния СВЧ-излучения миллиметрового диапазона на бактериальную суспензию тест-штамма / Д.Б. Кузнецов, И.Л. Вольхин, И.В. Лунегов // Материалы краевой научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Физика для Пермского края» - Пермь. - 2013. -С. 133-136.

Благодарность. Автор выражает глубокую благодарность начальнику отделения препаратов бактериотерапии Несчисляеву В.А. и профессору Одеговой Т.Ф. за возможность проведения исследований, руководителю РИЦ ФАРМАТЕСТ Малковой Т.Л. за возможность проведения УФ-спектроскопии, Директору Филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России «Пермское НПО «Биомед» Орловой Е.В. за предоставленные штаммы микроорганизмов и оборудование, а также ректору ПГНИУ Макарихину И.Ю. за предоставленное оборудование, доценту кафедры радиоэлектроники и защиты информации ПГНИУ Вольхину ИЛ. за предоставленную возможность проведения исследований по воздействию миллиметровым СВЧ-излучением на живые системы и заведующему кафедрой радиоэлектроники и защиты информации Лунегову ИВ. за проведение атомно-силовой микроскопии.

Подписано в печать 25.12.2014. Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 110 экз. Заказ № 236/2014.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии издательства Пермского национального исследовательского политехнического университета Адрес: 614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, к. 113. Тел. (342) 219-80-33.