Корректирующее действие пробиотиков при экспериментальном дисбактериозе

Колганова, Татьяна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Корректирующее действие пробиотиков при экспериментальном дисбактериозе
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Корректирующее действие пробиотиков при экспериментальном дисбактериозе"

На правах рукописи

КОЛГАНОВА Татьяна Владимировна

1 КОРРЕКТИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ПРОБИОТИКОВ

ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ДИСБАКТЕРИОЗЕ

03.00.07 — микробиология 03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена на кафедре микробиологии медицинского факультета Российского Университета Дружбы Народов, в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Та-расевича, на кафедре микробиологии и иммунологии медицинского центра Университета Луисвиля, Кентукки, США и в ЗАО "Агри аджиномото" Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научные руководители:

Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Кандидат медицинских наук, доцент

Официальные оппоненты:

Академик РАМН и РАЕН, доктор медицинских наук, профессор И.В. Домарадский

Доктор медицинских наук, профессор С.А. Дратвин

Ведущая организация:

Государственное учреждение "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского МЗ РФ"

Защита диссертации состоится " 2003 г. в ^' ^ час.

На заседании диссертационного совета Д 212.203.05 в Российском Университете Дружбы Народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке РУДН по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан " 2003 г

И.Г. Осипова Е.А. Васильева

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

О.Б. Гигани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Основная функция нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта - обеспечение колонизационной резистентности (КР). В обычных условиях поддержание КР микрофлорой осуществляется за счет продукции антибиотических веществ, конкуренции за места адгезии, подавления адгезии условно патогенных бактерий, ингибирования транслокации и ряда опосредованных механизмов.

Снижение КР влечет за собой цепь неблагоприятных последствий, основное из которых - развитие дисбактериоза кишечника. Факторы, способствующие нарушению состава микрофлоры и приводящие к развитию дисбактериозов, весьма многочисленны: это и прием лекарственных препаратов различных групп, стрессы, неблагоприятная экологическая обстановка, неправильный рацион питания, голодание. При антибиотикотерапии в первую очередь в нормобиоценозе исчезают "нормальные" кишечные палочки, и их место занимают условно патогенные и патогенные эшерихии, способные вызывать как местные, так и генерализованные инфекционно-воспалительные процессы. Причиной и характерным признаком дисбактериоза является избыточный рост патогенных и условно патогенных микроорганизмов в биотопе, что, в свою очередь, способствует их колонизации в нетипичных эконишах. Поэтому до настоящего времени актуальным является исследование и разработка новых подходов к коррекции дисбактериозов, одним из которых является разработка новых пробиотиков (ПБ), в том числе на основе нормальной кишечной палочки. Одним из первых отечественных ПБ является колибажтерин. Штамм Е.соН А. Ниссле [Перетц Л.Г., 1955], входивший в состав колибактерина, за годы эксплуатации утратил плазмиду, детерминирующую колициногенность, в связи с чем снизил антагонистическую активность в отношении ряда бактерий, чувствительных к действию колицина [Юхимеггко А.Н. с соавт., 1968; Шемчук Л.Ф.,1983].

Считается, что основным требованием при подборе производственных штаммов для ПБ должна быть их высокая колонизационная активность, основными показателями которой является антагонистическая и адгезивная активности.

Адгезивная активность является первым этапом развития колонизационною процесса и в большинстве случаев желательна для 11Б, тогда как у патогенных микроорганизмов рассматривается в качестве одного из стартовых механизмов развития инфекции. Таким образом, при подборе Г1Б для коррекции дисбиоза, вызванного тем или иным патогеном, целесообразно сравнение адгезивных свойств патогена и 11Б с целью выяснить, может ли данный ПБ конкурировать с патогеном за субстраты связывания и тем самым препятствовать колонизации последнего в организме.

Одной из важнейших задач при коррекции дисбиозов является удаление патогенов из экониш. Блокирование адгезии патогенов к субстратам связывания может предотвратить развитие инфекции на раннем этапе. Из литературы известны вещества, способные блокировать адгезию микроорганизмов, среди которых пептиды, моно и олигосахариды, ферменты, в том числе полифенол оксидаза (РРО). Известна так же способность физических факторов таких, как ультразвуковое воздействие, низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ), снижать адгезивную активность. Но если блокирование адгезии патогенов целесообразно, то снижение адгезивносга нормальной флоры нежелательно, в ряде случаев это может привести к неблагоприятным последствиям. Отсюда очевидна актуальность поиска агентов, способных избирательно ингибировать адгезивность патогенов, воздействуя при этом незначительно на нормофлору.

В настоящее время при доклиническом изучении ПБ руководствуются, в основном, методами т Шг», так как отсутствует эффективная экспериментальная модель дисбактериоза на животных. Таким образом, разработка такой модели д 1 ' ПБ

является актуальной задачей.

Целью исследования было изучить корректирующее действие ПБ при экспериментальном дисбактериозе.

Для достижения поставленной цели последовательно решались следующие задачи:

1. Сконструировать на базе известной плазмиды Со1Е1 гибридные плазмиды, несущие дегермипалту синтеза колицина и лишенные генов mob, контролирующих конъгога-тивную мобилизацию плазмиды.

2. Получить и исследовать новые рекомбшшггные варианты производственного штамма М-17 способные к продукции колицина Е1.

3. Изучить антагонистическую активность новых рекомбинантных ПБ в отношение патогенных клинических штаммов E.coh, выделенных от пациентов с дисбиозами.

4. Провести сравнительное изучение адгезивной активности ПБ различных групп (би-фидо, лакто, колисодержащих, споровых и грибов) и клинических штаммов Е.со/г, выделенных от пациентов с дисбиозами.

5. Изучить влияние физико-химического воздействия (НИЛИ и ферментов L-аспарагиназы (ASG) и полифсиол оксидазы (РРО)) на адгезию микроорганизмов.

6. Разработать адекватную модель дисбактериоза для оценки эффективности ПБ на животных.

7. Изучить защитное действие ПБ при экспериментальном дисбактериозе у животных. Научная новизна.

1. Впервые на основе родительской плазмиды ColEl получены новые плазмиды pCollacZ и Со1ДшоЬ, а так же рекомбинантные штаммы, содержащие полученные плазмиды: E.coh M-17/pCollacZ, М-17 fimH::npt/pCollacZ, M-17/CoIAmob, М-17 fimH::npt/ColAmob. Штаммы обладаю! способностью к продукции колицина Е1, при этом сконструированные плазмиды лишены mob области и вследствие этого не способны к мобилизации конъюгативными плазмидами.

2. Впервые изучена антагонистическая активность новых рекомбинантных штаммов и коммерческих ПБ различных групп в отношении клинических штаммов E.coh, выделенных от пациентов с дисбиозами.

3. Впервые исследовано влияние НИЛИ па адгезивные свойствы Е.сой и установлена большая чувствительность патогенов к антаадгезивному действию НИЛИ по сравнению с 11Б.

4. Впервые исследовано влияние ферметов ASG и РРО на адгезивную активность микроорганизмов и установлена большая чувствительность патогенов к антиадгезивному действию ферментов по сравнению с ПБ.

5. Разработана модифицированная модель экспериментального дисбактериоза на животных. При этом для доказательства наличия дисбактериоза впервые использован штамм E.cob 0157:Н7 (212), вызывающий геморрагический колит.

6. Впервые предложен способ коррекции геморра1ического колита с помощью ПБ: ген-ноишкенерных вариантов штаммов М-17, а так же коммерческих препаратов - биофлора, биоспоргата, лактобактериня, колибактеригга.

Практическая значимость. Представлены новые научные данные о механизме защитного действия ПБ. Предложена новая модель для изучения лисбактериоза с использованием мышей. Доказана эффективность применения ПБ для профилактики и лечения дисбакге-риозов на этой модели.

In vitro доказана возможность комплексного использования ПБ, ПИЛИ и ферментов РРО и ASG для предотвращения колонизации патогенов.

Получены новые рекомбинантные варианты пробиотического штамма E.coh М-17, обладающие способностью синтеза колицина Е1, которые могут быть использованы для разработки пробиотических препаратов.

Полученные данные можно использовать в лекционном материале по микробиологии в разделах нормальная флора, дисбактериозы и пробиотики. Положения, выносимые на защиту.

1. Сконструированные плаз милы pCollacZ и ColAmob содержат детерминанту синтеза колицина El (cea), ген иммунности к нему (гтт), не способны к мобилизации коныогатив-ными плазмидами (не содержат mob области), стабильно поддерживаются в популяции (за счет наличия гена сег) и пригодны для использования в качестве факторов, придающих родительскому штамму E.coli М 17 способность к синтезу колицина El и вследствие этого повышенную антагонистическую активность в отношении патогенов. 2 Полученные рекомбинантные штаммы, а так же колисодержащие ПБ в опытах in vitro проявляют высокий уровень антагонистической активности в отношении клинических штаммов патогенных E.coli, выделенных от больных с дисбиозами, тогда как споровые пробиотики и энтерол обладают низким уровнем антагонизма в отношение изучаемых штаммов.

3. Воздействие НИЛИ блокирует адгезины уропатогенных E.coli, и тем самым предотвращает колонизацию этих патогенов в организме. Обработка эритроцитов НИЛИ приводит к ингибированию рецепторов, что также выражается в частности снижением адгезии. Патогенные E.coli в значительной мере более чувствительны к воздействию НИЛИ, чем представители нормофлоры.

Ферменты ASG и РРО обладают свойством снижать уровень адгезивности микроорганизмов на различных моделях и экспериментах in vitnr. иммобилизированные субстраты, эука-риотические клетки (эритроциты и клетки защечного эпителия) и др. ПБ значительно менее чувствительны к воздействию ферментов по сравнению с патогенными E.coli. 4 Получена адекватная модель дисбакгериоза у животных для исследования эффективности ПБ. В качестве маркёра наличия дисбактериоза использован штамм E.coli 0157:Н7.

5. ПБ обладают протективным действием в отношении клинического штамма Е.соВ 0157:Н7 на модели гп ovo.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на научно-практических конференциях НПО "Биомедицинские технологии" (Москва, 2000, 2002, 2003), на международной научно-практической конференции памяти Г.И. Гончаровой (Москва, 2002) и на заседаниях кафедры микробиологии и биологии медицинского факультета РУДН (Москва, 2000,2001,2002, 2003).

Публикации- По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего источников. Работа иллюстрирова-

на рисунками и таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы коммерческие препараты пробиотиков: колибахтерин, би-фикол, окарин, биофлор, споробакгерин, бактисубтал, бакгиспорин, биоспорин, лакго-бактерин, ацилакт, энтерол.

В работе использован производственный штамм E.coli М-17, рекомбинантные штаммы (14 штаммов), клинические штаммы Е.соМ, выделенные от больных с пиелонефритом (29 штаммов), циститом (1 штамм), кишечной инфекцией (1 штамм), гемолитико-уремическим синдромом (9 штаммов).

При конструировании и исследовании генноинженерных вариантов E.co/i М-17 и изучении адгезивных свойств использованы стандартные плазмиды: pPKL9, ColEl, pUC19, pBR322, а так же химерная плазмида pColap (Чеснокова В.А., 1998).

Объектом для моделирования дисбактериоза служили беспородные мыши и мыши линии С57В1.

Для генерирования НИЛИ использовался прибор "Рикга" (частота. 5 - 5000 Гц) (ХейфецЮ.Б., 1999).

Антагонистическую активность ПБ в отношении патогенных Е.соВ определяли методом отсроченного антагонизма (Осипова И.Г., 1996).

Исследование адгезивной активности бактерий осуществляли с помощью методов аггрегации дрожжей, "исследования адгезии к иммобилизированным субстратам", радио-нуклеидного метода оценки адгезии (Sokurenko Е. et aL, 1992, 1994, 1995), адгезии к эритроцитам (Брилис В.И. с соавт., 1986) и клеткам защечного эпителия.

Выделение плазмидной ДНК осуществляли с помощью набора mini-QIAGENE (Германия-США); рестрикцию, лигирование трансформацию ДНК проводили по стандартным методикам (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., 1989); очистку плазмидной ДНК проводили с помощью набора GENECLEAN Kit II (США).

Анализ нуклеотидной последовательности плазмид проводили с помощью программы DNA SUN.

Для исследования трансмиссии плазмид использовали метод коньюгативной мобилизации, в качестве донора использовали штамм Е.соВ S17-1, содержащий tra оперон коньюгативной плазмиды RP4 в геноме (Миллер Дж, 1976).

Оценку продукции колицина El и чувствительности к нему штаммов Е.соВ проводили по стандартным методикам (Миллер Дж., 1976).

Для моделирования дисбактериоза на мышах основывались на методике интрагаст-рального введения ампиокса, предложенной Лиходедом В.Г. с соавг. (1998). Анализ количества микрофлоры производили по методике, разработанной Бочковым И.А. с соавт. (1988).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В работе использован штамм Е.соВ М17 и его низкоадгезивный вариант Е.соВ М-17 GmH::npt, охарактеризованный Чесноковой В.Л. (1998) в качестве более подходящего для колонизации кишечника. Штаммам было придано свойство колициногснноста с целью усиления их антагонистичекой активности. Колициногенность изначально была присуща пробиотику Е.соВ М-17, однако, в процессе культивирования была утрачена. Возможное объяснение этому - наличие в плазмиде ColEl области mob, определяющей способность плазмиды к коинтеграции с другими, в том числе конъюгативными плазмидами. В результате коинтеграции образуются гибридные плазмиды, которые, с одной стороны несут фактор колициногенности (cea) и устойчивости к нему (imm), с другой - содержат область tra, определяющую способность к конъюгативному переносу. Результатом конъюгативио-го переноса может быть, во-первых, приобретение другими бактериями, в том числе патогенными и условно патогенными, способности к синтезу колицина и иммунности к нему, а во-вторых, потеря плазмиды и вследствие этого снижение антагонистической активности штамма — пробиотика. Таким образом, целью работы было получение колициногенной плазмиды, лишенной mob области. Для создания такой плазмиды, способной стабильно сохраняться в пробиотических штаммах Е.соВ, было использовано два подхода:

- удаление mob области родительской плазмиды ColEl с помощью эндонуклеазы рестрикции BspLUl 1.1 и лигирования полученных липких концов друг на друга;

- удаление mob области плазмилы ColKl и всгавка гена lacZ из плазмилы plJC19. Таким образом, получены две илазмиды, обозначенные как pCollac'/ и Со1ДтоЬ (рис. 1, рис. 2).

Полученные плазмилы были трансформированы в штамм TG1. Селекция велась путем отбора колоний устойчивых к колипину (для пдазмид pCollacZ и CoIArnob) или путем отбора синих колоний па среде, содержащей IPTG/ X-Gal. Отбор трансформантов штаммов li.cclt М-17 и E.coh М-17 fiinHi.npt проводился на среде, содержащей колицин (рис.3). Было показало, что через 10, 20 .... 100 генераций при культивировании в среде, не содержащей селективного маркера, 100% исследованных клеток сохраняли полученные илазмиды. Все проверенные клетки несли признаки, детерминируемые данными плазми-дами. Доказано, что сконсгруировашше плазмилы не мобилизуются, что устраняет опасность переноса плазмилы в патогенные и условно патогенные бактерии (табл.1).

Таким образом, было подтверждено, что генетической основой нестабильности плазмилы и штамма се содержащего, является область mob.

8фШМ1 OS9)

Рис.1. Схема конструирования плазмид pCollacZ и CoIArnob.

1 lkb DNA Ladder

2. pUC19 нативная

3 CoLEl нативная

4 фрагмент 4231 bp ил ColEl/ BspLull.I

5 фрагмент 1246 bp из pUC19/ Alw441

6 фрагмент 943 bp из pUC19/ Alw44I

7 фрагмент 497 bp из pUC19/ Alw44I

8 lkb DNA Ladder

Рис 2 Электрофоретическос разделение элюированиых из геля и очищенных фрагментов ДНК плазмид рЬ'С 19, полученных в результате обработки ее эндопуклеазой рестрикции Л'лу441 (1246 Ьр, 943 Ьр, 497 Ьр), а так же илазмиды Со!Е1, обработанной .шдонуклеа-зой рестрикции BspLb' 111 (4231 Ьр)

Слева направо

1, 12- 1 кЬ омл Ьааа«,

2 - контроль (пативная ДНК пл23чилы pCol!acZ), 3,5,6 - плдзмилная ДНК (рСо11асХ), выделенная из трансфирмаптов Е.соЬ М 17; 4,7,8 - плазмилпая ДНК (pCol]acZ), выделенная из трапсформаптов Е.соЬ М-17 йтН::пр1,

9 - контроль (на I явная ДНК плазмиды Со1ДтоЬ);

10 - плазмидная ДНК (Со1ДтоЬ), выделенная из трансформатов Е.соЬ М-17;

11 - плазмилная ДНК (Со1АтоЬ), выделенная из трансформантов Е.соЬ М-17 БшН':пр1

Рис.3. Электрофоретический анализ нлазмидной ДНК, выделенной из 10 трансформантов (резистентных к колипину Е1), полученных при введении плазмил рСо11асХ и Со1ДгаоЬ в т гаммы Е сой М-17 и Е.соЬ М-17 йтН:.пр1.

Таблица 1.

Исследование мобилизации плазмил ColEl, pCollacZ, ColAmob

Штамм-донор Кол-во клеток донора Кол-во клеток реципиента E.coh W3350 Кол-во транс-конъюгантов Эффективность мобилизации на клетку

лонора реципиента

E.coi S-17-1 (Colli!) 4- 108 1.25 • 108 10 0 25 • Ю -' 0.8-10 -7

E.cokSAlA (pCollacZ) 5.2-108 3.0- 108 0 <0.19 • 10 8 <0.33- 10 я

H.rafS-17-l (ColAmob) 5.6- 108 2.9-10« 0 <0.1 - 10-е <0.23-10 8

Далее исследовалась антагонистическая активность полученных рекомбинантных штаммов и ПБ различных групп в отношении E.coh 0157:117 и уропаюгешшх E.coli (UPEC) по методике отсроченного антагонизма

Большинство исследованных пробиотиков обладают более выраженным антагонизмом по отношению к Escherichia coli 0157:Н7. Средний показатель антагонизма колисо-держаших пробиотиков против E.coh 0157:Н7 составляет (23,5+1,9 - 31,3+0,55) мм, mo достоверно выше, чем в отношении UPfX (17,1 ИД - 19,6±1,58) мм.

Доказана высокая антагонисгичская активность генноипженерных штаммов E.coh (E.coh М17/ pColap, E.coh Ml 7 fimH::npt/ pColap, E.coh М17/ pCollacZ, E.coh М17/ ColAmob), колисодержащих 11Б (колибакперин, производствсшшй штамм Е.соЬ М 17 биофлор), а так же средняя - биоспорина и лактобактерина. (рис 4)

Рис.4. Антагонистическая активность ПБ в отношений Е.соё 0157:Н7 и UPEC

Пробиотики, обладающие наибольшим уровнем антагонистической активности к исследуемым патогенам, были выбраны для дальнейшего изучения в качестве средств профилактики и лечения заболеваний, вызванных патогенными E.eoä 0157:Н7 и UPEC.

Важным показателем колонизационной активности является адгезивная активность. Для ПБ показатель адгезивной активности наряду с показателем антагонистической активности может служить характеристикой их терапевтической эффективности.

В качестве модели для сравнительного исследования адгезивности различных групп ПБ выбраны человеческие эритроциты B/II (Rh+). Эритроциты являются универсальной моделью для изучения адгезии разных микроорганизмов, так как имеют на своей поверхности гликофорин - гликопротеин, идентичный гликокаликсу эпителиальных клеток.

При исследовании адгезии определяли средний показатель адгезии (СПА), равный среднему количеству бактерий, прикрепившихся к одной эукариотической клетке, а так же показатель адгезии (К%), показывающий количество эукариотических клеток (%), несущих на своей поверхности адгезированные микроорганизмы. Уровень адгезивности различен у разных Г1Б. Среди колисодержащих ПБ наибольший СПА характерен для коли-бакгерина (2,5±0,40), производственного штамма E.coli М-17 (2,2±0,30) и варианта Е. coli М-17 pCollacZ (3.2±0,25). Таким образом, показано, что введение сконструированных плазмид в штамм E.coli М-17 увеличивает его адгезивность к эритроцитам. Варианты Е. coli М-17 fimH::npt/pCollacZ и Е. coli М-17 fimK-:npt обладают значительно более низким уровнем адгезивной активности (0,7±0,10 и 0,6±0,10) (р<0,05) вследствие отсутствия гена синтеза пилей I тина fimH. Средний уровень адгезивное™ наблюдается у лактобактерина (3,2±0,50) и бифидобактерина (1,7±0,20). Среди споровых ПБ наибольшим уровнем адгезивности обладает биоспорин (2,6±0,10), тогда, как СПА у бактиспорина и бактисубтила низок (0,4±0,15 и 0,1+0,10 соответственно). Низкий уровень адгезивности зафиксирован у энтерола (0,3+0,15) и ацилакта (0,3±0,10). Показатели К% у исследованных ПБ так же различались. Высокий К% показан у кишечных палочек с "включенным" геном синтеза адге-зина FimH, лактобактерина, биоспорииа, средний - у бактиспорина. Низкий К% проявля-

ли кишечные палочки с дефектным геном синтеза пилей I типа fimH, бактисубтил, энте-рол, ацилакт и бифидумбактерин. Известно, что показатель К% прямо зависит от количества рецепторов для адгезинов микроорганизмов. Таким образом, показано, что для коли-содержащих ПБ адгезия играет важную роль при реализации колонизационной активности, тогда как для споровых ПБ, лактосодержащих ПБ и энтерола процесс адгезии менее значим.

Параллельно проводилось исследование адгезивной активности патогенных Е.сой (0157:Н7 [п=9] и уропатогенных кишечных палочек (UPEC) [п=14]). Все штаммы UPEC проявляют разный уровень адгезивносги, который колеблется от 0,60±0,16 до 2,89±1,24. СПА к эритроцитам у UPEC составляет 1,83+1,20. Штаммы Е.сой 0157:Н7 также обладают различным уровнем адгезивной активности к эритроцитам. При этом СПА колеблется в более широком по сравнению с UPEC интервале: от 0,48±0,23 до 9,95±2,30. Из данных литературы известно, что все исследованные штаммы Е.сой 0157:Н7 одинаково патогенны и вызывали эпидемии в разных префектурах Японии (Armstrong G.D. et al, 1995, 1996; Isawa M. et al., 1999 и др.). Следовательно, для группы E.coü 0157:117 адгезивноегь не коррелирует с патогенностью. Однако, СПА для всей группы штаммов Е.сой 0157:Н7 достаточно высок и составляет 3,45+2,89.

В обеих группах патогенных Е.сой оггмечен средний или высокий показатель К%. Следует отметить, что К% выше в группе UPEC, тогда как СПА выше в группе 0157:Н7. Это свидетельствует о том, что для UPEC, так же как и для нормальной кишечной палочки М-17 существует больше рецепторов на мембране эритроцитов. Следовательно, возможна выраженная конкуренция между нормальными E.coli и UPEC, и, как следствие, возникает возможность применения колисодержащих ПБ для профилактики и лечения заболеваний, вызванных UPEC.

При дисбиозах одной из важнейших задач коррекции является удаление патогенов из экониш, одним из способов которого служит блокирование их адгезии к субстратам связывания. Исходя из механизма адгезии, ее можно блокировать либо угнетением бактериальных адгезинов, либо воздействием на рецепторные свойства клеток макроорганизма. Известно множество субстанций, обладающих способностью блокировать адгезию микроорганизмов. Но если блокирование адгезии патогенов целесообразно, то снижение адгезивносги нормальной флоры нежелательно. Следовательно, возникает целесообразность поиска агентов, способных ингибировать адгезивноегь патогенов, при этом незначительно воздействуя на нормофлору.

Исследовалось воздействие ферментов ASG и РРО на адгезивную активность микроорганизмов. Показано, что данные ферменты вызывают изменение адгезивности микроорганизмов. На модели адгезии к эритроцитам показано, что ферменты по-разному воздействуют на адгезивноегь патогенных Наб. При обработке ASG для всех штаммов отмечено снижение уровня адгезии от 23% до 71.9% . РРО вызвала как снижение адгезивносги, так и ее увеличение. Корреляции между действием обоих ферментов на штаммы не обнаруживается. (г,=-0.41)

На модели клеток защечного эпителия также показан неодинаковый уровень снижения адгезивной активности патогенных Е.сой под воздействием ASG и РРО (г8=0.25). Полифенол оксидаза оказывает меньший по сравнению с L-Аспарагивдзой эффект снижения уровня адгезии на модели клеток защечного эпителия. В целом процентное изме-нрние уровня адгезии микроорганизмов сопоставимо для обеих моделей, особенно для ASG (г,=0.80 для ASG и rs=0.20 для РРО). Полученные данные свидетельствуют об участии в процессе адгезии одинаковых адгезинов. Тот факт, что ферменты на модели бук-кальных клеток снижали уровень адгезии микроор1анизмов в меньшей степени может свидетельствовать об участии в адгезивном процессе дополнительных механизмов (например, образовании оснований Шиффа) или других типов адгезинов.

Положительный опыт применения низкочастотного импульсного лазерного излучения (НИЛИ) в различных областях медицины, в частности в урологии для лечения ин-фекционно-воспалительных заболеваний свидетельствует о влиянии НИЛИ не только на организм человека и отдельные субпопуляции его клеток, но и о воздействии на микроорганизмы, в частности на их адгезивные свойства. В модельных опытах показано, что терапевтическая частота (5 - 5000 Гц) и время (1 — 10 мин) лазерной обработки не оказывает бактерицидного действия, но почти во всех случаях снижает адгезию уропатогенных Е.соВ. Это было показано в опытах исследования адгезии с использованием эритроцитов и бук-кальных клеток. Причем на модели буккальных клеток, в сравнении с результатами, полученными на модели эритроцитов, эффект ингибирования менее выражен. Вероятно, это объясняется участием в адгезивном процессе различных типов пилий. Что касается штаммов - пробиотиков Е.соВ, то при обработке НИЛИ не наблюдалось снижения адгезивно-сти ни на модели эритроцитов, ни на модели буккальных клеток.

Механизм воздействия НИЛИ на адгезивный процесс до конца не исследован. Возможно, в этом случае имеет место как модификация структуры фимбрий, так и изменение рецепторов макроорганизма. Мы показали это в серии экспериментов, в которых подвергали лазерной обработке не бактериальные клетки, а клетки макроорганизма — эритроциты. В этом случае также показано снижение адгезии ПРЕС и Е.соВ 0157:Н7. Этот факт подтверждает целесообразность применения НИЛИ для лечения нефрологических больных, у которых причиной заболевания служит кишечная палочка.

На следующем этапе работы исследовано комплексное воздействие ферментов (ASG, РРО) и НИЛИ на адгезивные свойства микроорганизмов. На первой стадии исследования охарактеризована последовательность действия НИЛИ и фермента. Обрабатывали штаммы патогенных Е.соВ. В качестве субстрата использовались эритроциты. Доказано, что в большинстве случаев (5 из 8) больший уровень снижения адгезии наблюдается при комплексной обработке сначала НИЛИ, затем ферментами (использовали ASG в концентрации 6 ЕД/мл) (рис.5). При обработке последовательно ферментом, затем НИЛИ эффект снижения адгезии приблизительно равен таковому при монообработке ферментом или НИЛИ Результаты выводились, исходя из CIIA штаммов, К % достоверно не изменяется при разных способах обработки (р>0,05) практичеки для всех штаммов. Возможно, это связано с тем, что предшествующая лазерная обработка меняет конформацию адгези-яа, делая остатки аспарагина в субстратенязьгаающих сайтах более "доступными" для действия фермента.

Комплексное воздействие НИЛИ и ASG исследовалось также и на модели клеток защечного эпителия. Результаты, полученные на модели клеток ЗЭ, умеренно коррелируют с полученными на модели эритроцитов (г,=0,49).

Д алее было исследовано влияние ферментов ASG и РРО, а так же НИЛИ на адгезивную активность ПБ. В качестве ПБ использовались штаммы Е.сок М-17, M-17/pColap, М-17 fimH::npt, М-17 fimH::npt/pColap, М-17/ pCollacZ, М-17 fimH::npt/ pCollacZ; Lactobacillus fermentum 90-TS-4(21). Моделью служили эритроциты и клетки защечного эпителия. Полученные результаты (табл. 2) свидетельствуют о значительно меньшем эффекте, оказываемом НИЛИ и ферментами, на адгезию штаммов-пробиогтиков по сравнению со штаммами патогенных Е.соВ. Причем штаммы, экспрессирующие пили I типа, практически не изменяют уровень адгезии при обработке НИЛИ и ферментами, у штаммов с дефектным геном синтеза пилий I типа и Lactobacillus fermentum 90-TS-4(21) наблюдается некоторое увеличение адгезии к эритроцитам и клеткам защечного эпителия. Эти результаты позволяют предположить возможное использование ферментов и НИЛИ одновременно с ПБ для профилактики и/ или лечения инфекций, вызванных чувствительными к ферментам и НИЛИ микроорганизмами.

О 50 100

% изменения адгезивной активности относительно контрольного уровня (%)

■ НИЛИ Г 1000Нг + АЗО 6 Шп1 ОАЗвб иЛп!+ НИЛИ Г1000Н2 ННИЛИПОООНг ИАЯСб и/т1

' Рис 5. Снижение адгезивной активности Е.соВ к эритроцитам при комплексной обработке НИЛИ и АБС

Таблица 2

Изменение адгезивной активности Iffi иод воздействием НИЛИ и ферментов

Штамм Число бактерий на 1 клетку

Без 1 НИЛИ обработки 1 ASG 6.0 ЕД РРО 400 ЕА

Эритроциты

Е. coli М-17 2,2+0,32 2,5+0,20 2,0±0,15 2,3 ±0,24

Е. coli М-17 pColap 3,0±0,25 2,8±0,20 2,8±0,40 2,5±0,14

Е. coli М-17 fimH::npt/pColap 0,8±0,10 1,0±0,14 0,9±0,13 0,9±0,18

Е. coli М-17 fimH::npt 0,8±0,10 • 1,2±0,12 0,7 ±0,14 1,4±0,22

Е. coli М-17 fimH::npt/pCollacZ 1,1 ±0,21 1,5±0,20 1,2±0,13 2,0±0,17

Е. cob М-17 pCollacZ 3,1 ±0,19 3,0±0,17 3,1 ±0,16 2,7 ±0,21

L.fermentum 90-TS-4(21) 3.8±0.22 • 20±0.10 1.5±0.32 3.5±0.27

Клетки ЗЭ

Е. coli М-17 8,1 ±0,31 7,9±0,32 7,8±0,40 9,8±0,60

Е. coli М-17 pColap 6,9±0,42 - 6,9±0,33 6,9±0,42

Е. coli М-17 fimH::npt/pColap 3,8±0,21 - 4,3 ±0,40 3,6±0,33

Е. coli М-17 fimH::npt 4,0±0,18 3,9±0,21 4,0±0,31 5,7±0,29

Е. coli М-17 fimH::npt/pCollacZ 3,6+0,19 4,0±1,13 3,9±0,33 3,5±0,41

Е. coli М-17 pCollacZ 7,2±0,38 6,8+0,20 7,0 ±0,40 6,9 ±0,44

Ufermentam 90-TS-4(21) 10,2+0,41 9,0+1,1 13,3+0,62 10,2±0,45

Таким образом, в экспериментах in vitro показано, что полученные рекомбинантные штаммы за счет плазмиды, детерминирующей синтез колипина, обладают выраженной

антагонистичекой активностью по отношению к патогенным штаммам, выделенным при дисбиозах у пациентов с урологическими заболеваниями и гемолитико-уремическим синдромом. При этом сконструированные штаммы наряду с колибактерином обладают высокой адгезивной активностью и практически не чувствительны к воздействию ферментов ASG и РРО, что делает их перспективными для использования, в том числе в комплексе с изученным физико-химическим воздействием, для лечения и профилактики колонизации изученных патогенов в организме.

Окончательный вывод об эффективности ПБ можно сделать лишь на основе экспериментов in vivo. Экспериментальный дисбактериоз вызывается посредством кровопотери, голодания, стрессовых ситуаций, радиационного облучения, приема антибиотиков (Бонл В.М с соавт., 1992 и др.). Однако, до настоящего времени отсутствует эффективная экспериментальная модель дисбактериоза на животных.

Дисбаетериоз у мышей вызывали посредством инграгастрального введения антибиотиков: ампиокса в суточной дозе 4 мг в течение 14 суток или доксициклина в дозе 0,2 мг однократно. Дисбактериоз диагностировали по изменению состава фекальной микрофлоры (рис б, рис. 7). Количество микроорганизмов выражали в lg КОЕ/г фекалий. После однократного введения доксициклина (рис. 7) наблюдались следующие изменения в составе фекальной микрофлоры: увеличивалось количество грибов рода Candida (на 2,0 lg) и снижалось количество лактозопозитивных Е.соН (на 4,0 lg). При этом внешне все животные выглядели удовлетворительно.

При изучении влияния ампиокса на состав микрофлоры показано более резкое изменение состава микрофлоры (рис. б). Так увеличивалось количество лактозонегативных E.coli (более чем на 5,0 lg), умеренно (примерно на 2,0 lg) росло содержание лактоэопози-тивных кишечных палочек и грибов рода Candida (на 2,0 lg), резко увеличивалось содержание Proteus spp. (более чем на 5,0 lg). На 1,0 lg увеличивалось содержание Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis и Entcrococcus sp. При этом содержание молочнокислых бактерий (Bifidobacterium и Lactobacillus) и бактерий рода Clostridium не изменялось. Вследствие более глубоких изменений состава кишечной микрофлоры в последующих экспериментах использовался ампиокс.

В предварительных опытах отобран штамм Е.а>& Ol57:H7 №212, так как у здоровых животных он не вызывал заболевания, и только при экспериментальном дисбактериозе было возможно определить LDso, которая составила 109 КОЕ.

Lactobacillus

S. epidermidis

Е coli 1ас+

.coli lac-

Proteus

• контрольный уровень содержании бактерий

• "уровень содержания бактерий после

обработай аяшиохсом

Рис. 6. Изменение состава микрофлоры мышей в % относительно контрольного уровня под воздействием ампиокса 4 мг/ сут в течение 10 суток

Bifidobacterium

S. epidermidis.

Candil

Lactobacillus

Proteus

* контрольный уровень содержания бахтеряи

• ■""уровень содержания бактерий после

обработки докситтклином

Рис. 7. Изменение состава микрофлоры мышей в % относительно контрольного уровня под воздействием доксициклина 0,2 мг однократно.

Известно, что при дисбактериозе кишечника происходит транслокация условно патогенных бактерий в несвойственные им биотопы, провоцируя различные инфскционно-воспалительные заболевания, такие, как пиелонефрит, бактериальный вагиноз и проч. Было проведено изучение транслокации кишечной флоры во внутренние органы в норме и при экспериментальном дисбактериозе, вызванном введением ампиокса. Наблюдалась транслокация лактозонегативной флоры (E.coS, Proteus) в легкие, почки, тимус и печень, при этом селезенка и кровь оставались стерильны. В контрольной группе животных (получавших per os физиологический раствор) все органы и кровь были стерильны. Следует отметить, что лактозопозитивная кишечная флора не транслоцировалась (рис.8). Транслокация условно патогенной флоры при дисбактериозе объясняется значительным количественным ее увеличением, что, в свою очередь приводит к массовому выбросу в кровь эндотоксинов и параллельному снижению как клеточного, так и гуморального антиэндо-токсинового иммунитета. Таким образом, полученные результаты коррелируют с данными литературы о том, что наибольшим уровнем транслокации обладает кишечная палочка, а также о том, что одним из пусковых механизмов транслокации служит чрезмерное увеличение количества кишечной флоры.

ПБ в медицинской практике применяются для лечения и профилактики дисбакте-риозов. На основании этого в эксперимент были взяты три группы животных. Первая группа получала Г1Б per os в двух дозировках ("человеческой" дозе (ч.д.), т. е. дозе равной разовой дозе, применяемой у человека, и "мышиной" дозе (м.д.), т. е. лозе ПБ в пересчете на массу мыши.) 1 раз в сутки параллельно с ампиоксом за 5 дней до заражения; вторая группа получала пробиотик per os в двух дозировках (ч.д. и м.д.) 1 раз в сутки за два дня до заражения и получала его в течение 5 дней, т. е., 3 дня после заражения; третья группа начала получать пробиотик per os в одной ч.д. 1 раз в сутки через 1 день после заражения в течение 4 дней; 1 контрольная группа животных до заражения получала только амциокс per os; 2 контрольная группа живопгых до и после заражения не получала ни каких i ipena-ратов.

Показан профилактический и лечебный эффект генноинженерных штаммов, а также ПБ различных групп (рис. 9). В первой группе животных наблюдалось выраженное профилактическое действие, наиболее четкий эффект был отмечен при приеме тенноин-женерных вариантов штамма E.coS М-17, колисодержащих препаратов (колибактерин и биофлор) и, а так же лактобактерина и биоспорина. Отмечено, что генноинженерные штаммы проявили выраженный защитный эффект как в "человеческой", так и в "мышиной" лозах, колисодержащие ПБ оказывали профилактическое действие в

кровь

Рис 8. Органо-тканевая транслокация лактозонегативной кишечной флоры у мышей с дисбактериоз ом.

почка

"человеческой" дозе (1С КОЕ, 106 КОЕ для биофлора), а лактобактерин и биосиорин - в "мышиной" дозе (106 КОЕ). Во второй группе животных наблюдался выраженный про-тективный эффект при применении "мышиных" дозировок 1енноинжененрного штамма Е.соЬ М-17 fknH::npt/pCollacZ и биофлора, Ю1да как "мышиная" дозировка колибактери-на оказалась неэффективной, высокое защитное действие проявил биоспорин в "человеческой" дозировке. В третьей группе все исследованные побиотики проявили примерно равную (40-60%) протективную активность в "человеческой" дозировке. Животные контрольных групп, получавшие до заражения физиологический раствор (контроль 2) или ампиокс (контроль 1) per os, значительно хуже перенесли заражение по сравнению с животными, получавшими ПБ (р>0.05).

Таким образом, результаты экспериментов in vitro, доказывающие эффективность использования ПБ против патогенов, выделенных при дисбиозах у пациентов с заболеваниями мочевыводящего тракта, подтверждены на модели in vivo. При этом показана высокая активность сконструированных генноинжененных вариантов Е.соН М-17: Е.сой М-17/pCollacZ, М-17 fimll::npt/pColIacZ, М-17/Со1ДтоЪ, М-17 fimH::npt/ColAmob.

выводы

1. На базе известной и лаз милы ColEl сконструированы гибридные плазмиды pCollacZ и ColAmob, несущие детерминанту синтеза колицина El (ген cea), ген устойчивости к нему (гтт) и лишенные генов mob, контролируюглих конъюгативную мобилизацию плазмиды.

2. Получены штаммы Е.соВ, производные производственного штамма Е.соВ М-17 и его варианта Е.соВ М-17 fimH::npt, несущие плазмиды pCollacZ и ColAmob. Штаммы проявляют повышенную антагонистичекую активность в условиях in vitro и in vivo.

3 Разработана модель дисбактериоза на животных, позволяющая изучить эффективность пробиотиков in vivo. I ¡оказано, что пероральнос введение ампиокса вызывает выраженное изменение состава микрофлоры, сопровождающаяся транслокацией лакгозонегативной флоры из кишечника в легкие, почки, печень и тимус.

4. На модели экспериментального дисбактериоза впервые показан протективный эффект пробиотиков в отношении клинического штамма Е.соВ 0157:Н7. При этом достигалось 100% профилактическое и 60% лечебное действие пробиотиков.

5. Выявлен разный уровень антагонизма различных пробиотиков в отношении клинических штаммов патогенных Е.соВ, выделенных от больных с дисбиозами. Коли-содержащие пробиотики и полученные рекомбинантные штаммы проявляют высокий уровень антагонистической активности (от 23,5+1,9 до 31,3±0,55 мм в отношении Е.свВ 0157:Н7 и от 17,1 ±1,2 до 19,6±1,58 мм в отношении ЦРЕС), тогда как споровые пробиотики и энтерол обладают низким уровнем антагонизма в отношение изучаемых штаммов (споровые: от 0 до 13, 5±0,7 в отношении Е.соВ 0157:Н7 и от 0 до 7,5±0,5 мм в отношении UPEC, энтерол: 0 мм в отношении E.coh 0157:Н7 и 1,2±0,2 мм в отношении UPEC).

б При сравнительном изучении адгезивной активности пробиотиков и клинических штаммов патогенных Е.соВ , выделенных от больных с дисбиозами, установлено, что колисодержащие пробиотики и полученные рекомбинантные штаммы обладают наибольшим уровнем адгезивной активности (от 2,2±0,30 до 3,2+0,25) и могут конкурировать с патогенными Е.соВ за сайты связывания.

7. В опытах in ñtro показано, что воздействие низкочастотного импульсного лазерного из лучения (НИЛЙ) блокирует адгезины уропатогенных Е.соВ, и тем препятствует колонизации бактерий в организме. Обработка эритроцитов НИЛИ приводит к ин-гибированию рецеторов, что также выражается в снижении адгезии. Патогенные Е.соВ в значительной мере более чувствительны к воздействию НИЛИ, чем пробиотики.

8. Впервые установлена способность ферментов L-аспарагиназы и Полифенол окси-дазы снижать адгезивностъ патогенных Е.соВ на различных моделях in vitro. Показано, что пробиотики значительно менее чувствительны к действию ферментов по сравнению с патогенными Е.соВ.

9. Полученные данные о высокой колонизационной способности новых рекомби-нантных штаммов Е.со/г. M-17/pCollacZ, М-17 fimH::npt/pCollacZ, M-17/ColAmob, М-17 fimH-npt/ColAmob следует рассматривать как экспериментальное обоснование их использования для коррекции дисбактериозов.

ПУБЛИКАЦИИ (по материалам диссертации опубликовано 9 работ)

Т.В. Колганова, И.Г. Осипова, М.В. Далин, X. Ватанабе, Е.А. Васильева, В.Л. Чесно-кова, В.Ф. Евлашкина, Э.Г. Кравцов, Н.Ю. Абрикосова, О.Ю. Лукьянова. Некоторые механизмы взаимодействия пробиотиков с веротоксинпродуцирующими Escherichia coli 0157: Н7// сб. Биотехнология, Москва, 2000, №13, с. 69-76. Адгезивная активность пробиотиков, применяемых в гинекологической практике/ И.Г. Осипова, Л. Созаева, В.Ф. Евлашкина, Е.А. Васильева, О.Ю. Лукьянова, Т.В. Чумасва,Т.В. Колганова. // сб. Биотехнология Москва, 2001, №16, с. 35-39. 'Г.В. Колганова, X. Ватанабе, М.В. Далин, Е.А. Васильева, И.Г. Осипова, В.А. Лившиц, О.Ю. Лукьянова, В.Ф. Евлашкина К вопросу о механизме защитного действия пробиотиков// сб. Биотехнология, Москва, 2001, №16, с. 23-28. Т.В. Колганова, А.В. Ермолаев, РДжДойл. Влияние ферментов аспарагиназы и по-лифенолоксидазы на адгезивные свойства микроорганизмов// БЭБ, 2002, № 1, с. 71 -74.

Т.В. Колганова, Т. Джарадат, Т.В. Чумаева, И.Г. Осипова и др. К вопросу о воздействии импульсного инфракрасного лазерного излучения и пробиотиков на штаммы Escherichia coli, выделенные от людей с заболеваниями мочевыделительной системы// международная научно-практическая конференция памяти Г.И. Гончаровой, Сб. материалов, Москва, 2002, с. 25.

Изучение адгезивной активности пробиотиков различных лекарственных форм, применяемых в гинекологической практике/ Т.В. Чумаева, И.Г. Осипова, Е.А. Васильева, Т.В. Колганова, О.В. Золотарева, С.Э. Саркисов// международная научно-практическая конференция памяти ГИ Гончаровой, Сб. материалов, Москва, 2002, с. 24.

Т.В. Колганова, Т. Джаралат, А.В. Ермолаев, И.Г. Осипова, Е.А. Васильева, М.В. Далин, Р.Дж. Дойл. К вопросу о комплексном воздействии импульсного инфракрасного лазерного излучения и аспарагиназы на штаммы Escherichia coli, выделенные при заболеваниях мочевыделительной системы// БЭБ, 2002, т. 133, №6, с. 681683.

Т. В. Колганова, Т. Джарадат, А. В. Ермолаев, И.Г. Осипова, Е.А. Васильева, М.В. Далин, Р.Дж. Дойл. К вопросу о комплексном воздействии низкочастотного лазерного излучения и полифенолоксидазы на адгезивную способность штаммов Escherichia coli, выделенных при заболеваниях мочевыделительной системы у людей// БЭБ, 2002, т. 134, №7, с. 190-192.

Изучение адгезивной активности пробиотиков различных лекарственных форм, применяемых в гинекологической практике/ Т.В. Чумаева, И.Г. Осипова, Е.А. Васильева, Т.В. Колганова., О.В. Золотарева, С.Э. Саркисов //сб. Биотехнология Москва, 2002, №19, с. 100-103.

КОЛГАНОВА Татьяна Владимировна (Россия). Корректирующее действие пробиотиков при экспериментальном дисбактериозе.

Работа посвящена изучению механизмов защитного действия пробиотиков против патогенных представителей вида E.coli. При исследовании антагонистической активности пробиотиков различных групп установлено, что наибольшим уровнем антагонитической активности в отношении исследуемых патогенов обладают колисодержащие пробиотики, включая полученные в работе генноинженерные варианты штамма E.coli М-17, способные к продукхши колицина El. Споровые пробиотики и энтерол обладают низким уровнем антагонизма в отношение изучаемых штаммов.

На различных моделях in vitro исследована адгезивная активность пробиотиков и патогенных E.coli, а также влияние физико-химических факторов на уровень адгезивной активности микроорганизмов исследуемых групп. Показано, что действие низкочастотного импульсного лазерного излучения (НИЛИ) блокирует адгезины уропатогенных E.coli, и тем самым предотвращает колонизацию бактерий в организме. Обработка эритроцитов НИЛИ приводит к ингибированию рецепторов, что также выражается в снижении адгезии. Патогенные E.coli в значительной мере более чувствительны к воздействию НИЛИ, чем пробиотики. Впервые установлена способность ферментов L-аспарагиназы и Полифенол оксидазы снижать адгезивноегь патогенных E.coli. Показано, что пробиотики значительно менее чувствительны к действию ферметов по сравнению с патогенными E.coli.

Разработана адекватная модель дисбактериоза для изучения защитного действия пробиотиков in vivo.

На модели экспериментального дисбактериоза у мышей впервые показано профилактическое и лечебное действие пробиотиков в отношении клинического штамма E.coli

Ключевые слова: ингибирование адгезии, низкочастотное импульсное лазерное излучение, L-Аспарагиназа, 11олифенол Оксидаза, пробиотики, модель дисбактериоза.

KOLGANOVA Tatiana Vladimirovna (Russia). Remedial Action of Probiotics against Disbacteriosis in Experiment.

The dissertation is devoted to study the probiotics action mechanisms against pathogenic E.coli. The antagonistic activity of different probiotics was studied. The highest level of antagonistic activity against pathogens was observed into E.i»£-contained probiotics, inclusive recombinant colicin El-producing variants of E.coli M-17. The probiotics containing Bacillus spp. and Saccharomyces cerevisiae was demonstrated low level of antagonistic activity against studied pathogens.

The adhesion of probiotics and pathogenic E.coli, influence of physical-chemical factors for adhesion was studied using different in vitro models. It was demonstrated the low-frequency pulse laser irradiation blocks the adhesions of uropathogenic E.coli thus prevents of their colonization into organism. The low-frequency pulse laser irradiation has possibility to inhibit the erythrocytes receptors. The pathogenic E.coli are substantially more sensitive to this irradiation action in comparison with probibiotics. It was pioneered the property of enzymes L-Asparagynase and Polyphenol Oxidase to decrease the adhesion of pathogenic E.coli. Just as for the low-frequency pulse laser irradiation probibiotics are less sensitive to enzymes action as compared with pathogens. The experimental model of disbacteriosis in vivo have been elaborated. The protective action of probiotics was studied using mince model of disbacteriosis. It was shown the preventive and therapeutic efficacy of probiotics towards clinical isolate E. cob 0157:H7.

Key words: adhesion decrease, the low-frequency pulse laser irradiation, L-Asparagynase, Polyphenol Oxidase, probiotics, disbacteriosis model.

0157:H7.

2оо? ' f\

7 i43

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Колганова, Татьяна Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Нормофлора и ее роль в обеспечении колоницационной резистентности организма.

Глава 2. Адгезия как первый этап колонизационного процесса.

Глава 3. Нарушения колонизационной резистентности - дисбиозы. Модели дисбактеризов.

3.1. Инфекции, вызываемые энтерогеморрагическими Escherichia coli.

3.2. Урогенитальные инфекции, как следствие дисбиоза.

Глава 4. Профилактика и лечение дисбиозов

4.1. Использование пробиотиков в терапии дисбиозов.

4.2. Низкоинтенсивное импульсное лазерное излучение (НИЛИ) в терапии инфекционных заболеваний.

ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Глава 1. Материалы и методы

1. Материалы.

2. Методы.

2.1. Идентификация бактерий.

2.2. Методы исследования бактериальной адгезии

2.2.1. Тест агрегации дрожжей.

2.2.2. Тест «исследование адгезии к иммобилизированным субстратам» (Growth assay).

2.2.3. Обогащение культур микроорганизмов клетками, экспрессирующими пили I типа.

2.2.4.Радионуклеидное исследование адгезии.

2.2.5. Формалинизация эритроцитов.

2.2.6. Исследование адгезии к эритроцитам.

2.2.7. Исследование адгезии микроорганизмов к клеткам защечного эпителия.

2.2.8. Исследование связывание протеина FimH с пероксидазой хрена.

2.2.9. Обработка ферментами ASG и РРО.

2.2.10. Обработка НИЛИ.

2.3. Определение антагонистической активности методом отсроченного антагониз

2.4. Моделирование дисбактериоза у животных.

2.5. Исследование транслокации кишечной флоры в органы и ткани.

2.6. Методы работы с ДНК.

2.6.1. Выделение плазмидной ДНК.

2.6.2. Обработка ДНК.

2.6.3. Методы введения генетического материала в клетку.

2.6.3.1. Кальциевая трансформация.

2.6.3.2. Конъюгация и мобилизация.

2.7. Оценка продукции колицина и чувствительности бактерий к его действию

2.7.1. Тест с верхним агаром.

2.8. Методы статистической обработки результатов исследований.

Глава 2. Получение генноинженерных вариантов штамма E.coli М

2.1. конструирование плазмид ColAmob и pCollacZ.

2.2. получение штаммов E.coli М17/ pCollacZ, E.coli М17/ ColAmob, E.coli M17 fimH::npt/ pCollacZ, E.coli M17 fimH::npt/ pColAmob.

Глава 3. Антагонистическая активность нормальной микрофлоры по отношению к патогенным Escherichia coli.

Глава 4. Сравнительное исследование адгезивной активности различных групп пробиотиков.

Глава 5. Исследование влияния на уровень адгезии различных штаммов E.coli физико-химических факторов.

5.1. Влияние низкочастотного инфракрасного лазерного излучение на уровень адгезии патогенных E.coli к различным субстратам.

5.1.1. Исследование влияния НИЛИ на уровень жизнеспособности

E.coli.

5.1.2. Влияние НИЛИ на уровень адгезии патогенных E.coli к эритроцитам.

5.1.3. Изменение адгезии патогенных E.coli под влиянием обработки НИЛИ эритроцитов.

5.1.4. Влияние НИЛИ на уровень адгезии патогенных E.coli к клеткам защечного эпителия.

5.2. Влияние обработки ферментами L-Аспарагиназой и Полифенол оксидазой на уровень адгезии E.coli к различным субстратам.

5.2.1. Определение бактерицидных свойств ферментов ASG и РРО.

5.2.2. Определение эффективной антиадгезивной концентрации ASG и РРО.

5.2.3. Исследование влияния ферментов L-Аспарагиназы и Полифенол оксида-зы на адгезию патогенных E.coli к эритроцитам.

5.2.4. Исследование влияния ферментов ASG и РРО на адгезию патогенных E.coli к клеткам защечного эпителия.

5.2.5. Исследование влияния ферментов ASG и РРО на адгезию E.coli в опытах "Исследования адгезии к иммобилизированным субстратам" и "радионуклеидном исследовании адгезии".

5.2.6. Исследование влияния ASG и РРО на величину связывания очищенного протеина FimH с пероксидазой хрена в реакции ELISA.

5.3. Влияние комплексной обработки НИЛИ и ферментами ASG и РРО на уровень адгезии E.coli.

5.4. Влияние НИЛИ и ферментов РРО и ASG на адгезивную активность пробио-тиков.

Глава 6. Исследование защитного действия пробиотиков на модели in vivo

6.1. Отработка модели дисбактериоза на мышах.

6.2. Моделирование инфекционного процесса, вызванного E.coli

0157:Н7.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Корректирующее действие пробиотиков при экспериментальном дисбактериозе"

Известно, что основной функцией нормальной микрофлоры человека является обеспечение колонизационной резистентности (КР) пищеварительного тракта. В обычных условиях поддержание КР микрофлорой осуществляется за счет продукции антибиотических веществ, конкуренции за места адгезии, подавления адгезии условнопатогенных бактерий, ингибирования транслокации и ряда опосредованных механизмов [88].

Факторы, способствующие нарушению состава микрофлоры и приводящие к развитию дисбактериозов, весьма многочисленны: это и прием лекарственных препаратов различных групп, стрессы, неблагоприятная экологическая обстановка, неправильный рацион питания, голодание. При антибиотикотерапии в первую очередь в нормобиоценозе исчезают "нормальные" кишечные палочки, и их место занимают условно патогенные и патогенные эшерихии, способные вызывать как местные, так и генерализованные инфекционно-воспалительные процессы. Причиной и характерным признаком дисбактериоза является избыточный рост патогенных и условно патогенных микроорганизмов в биотопе, что, в свою очередь, способствует их колонизации в нетипичных эконишах. Поэтому до настоящего времени актуальным является исследование и разработка новых подходов к коррекции дисбактериозов, одним из которых является разработка новых пробиотиков (ПБ), в том числе на основе нормальной кишечной палочки. Одним из первых отечественных ПБ является колибактерин. Штамм E.coli А. Ниссле [45], входивший в состав колибактерина, за годы эксплуатации утратил плазмиду, детерминирующую колициногенность, в связи с чем снизил антагонистическую активность в отношении ряда бактерий, чувствительных к действию колицина [64].

Считается, что основным требованием при подборе производственных штаммов для препаратов — ПБ должна быть их высокая колонизационная активность [131,132]. При этом особое внимание следует обращать на такие факторы колонизации как антагонистическая и адгезивная активности.

Адгезивная активность является первым этапом развития колонизационного процесса и в большинстве случаев желательна для ПБ, тогда как у патогенных микроорганизмов рассматривается в качестве одного из стартовых механизмов развития инфекции. Таким образом, при подборе ПБ для коррекции дисбиоза, вызванного тем или иным патогеном, целесообразно сравнение адгезивных свойств патогена и

ПБ с целью выяснить, может ли данный ПБ конкурировать с патогеном за субстраты связывания и тем самым препятствовать колонизации последнего в организме.

Одной из важнейших задач при коррекции дисбиозов является удаление патогенов из экониш. Блокирование адгезии патогенов к субстратам связывания может предотвратить развитие инфекции на раннем этапе. Из литературы известны вещества, способные блокировать адгезию микроорганизмов, среди которых пептиды, моно и олигосахариды, ферменты, в том числе полифенол оксидаза (РРО). Известна так же способность физических факторов таких, как ультразвуковое воздействие, низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ), снижать адгезивную активность. Но если блокирование адгезии патогенов целесообразно, то снижение адгезивности нормальной флоры нежелательно, в ряде случаев это может привести к неблагоприятным последствиям. Отсюда очевидна актуальность поиска агентов, способных избирательно ингибировать адгезивность патогенов, воздействуя при этом незначительно на нормофлору.

Имеется положительный опыт применения низкоинтенсивного импульсного лазерного излучения (НИЛИ) в различных областях медицины, в частности в урологии для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний. Опубликован ряд работ, посвященных воздействию НИЛИ на организм человека и на отдельные его клеточные субпопуляции, но о воздействии НИЛИ на микроорганизм сведений в литературе очень мало. Известно только, что достигаемая с помощью такого лечебного воздействия быстрая санация мочевыводящего тракта у больных позволяет предположить возможное воздействие НИЛИ не только на макроорганизм, но и на микроора-низмы.

В настоящее время при доклиническом изучении ПБ руководствуются, в основном, методами in vitro, так как отсутствует эффективная экспериментальная модель дисбактериоза на животных. Наиболее информативная - модель на гнотобио-тических животных. Однако работа с ними требует наличия специальных условий и оборудования. Поэтому, предложено несколько способов моделировать дисбакте-риоз у «микробных» животных. Дисбактериоз вызывается посредством тотальной кровопотери, голодания, стресовых ситуаций, радиационного облучения, приема антибиотиков. Последний способ изучался В.Г. Лиходедом с соавт. [28,34,60]. Ими в частности было доказано, что введение мышам больших доз ампиокса сопровождается значительным снижением клеточного и гуморального антиэндотоксинового иммунитета.

Учитывая всё вышеизложенное, настоящая работа преследовала цель изучить корректирующее действие ПБ при экспериментальном дисбактериозе. Для достижения поставленной цели последовательно решались следующие задачи:

1. Сконструировать на базе известной плазмиды Со1Е1 гибридные плазмиды, несущие детерминанту синтеза колицина и лишенные генов mob, контролирующих конъюгативную мобилизацию плазмиды.

2. Получить и исследовать новые рекомбинантные варианты производственного штамма М-17 способные к продукции колицина Е1.

3. Изучить антагонистическую активность новых рекомбинантных ПБ в отношение патогенных клинических штаммов E.coli, выделенных от пациентов с дисбиоза-ми.

4. Провести сравнительное изучение адгезивной активности ПБ различных групп (бифидо, лакто, колисодержащих, споровых и грибов) и клинических штаммов E.coli, выделенных от пациентов с дисбиозами.

5. Изучить влияние физико-химического воздействия (НИЛИ и ферментов L-аспарагиназы (ASG) и полифенол оксидазы (РРО)) на адгезию микроорганизмов.

6. Разработать адекватную модель дисбактериоза для оценки эффективности ПБ на животных.

7. Изучить защитное действие ПБ при экспериментальном дисбактериозе у животных.

Научная новизна:

1. Впервые на основе родительской плазмиды Со1Е1 получены новые плазмиды pCollacZ и СоЩтоЬ, а так же рекомбинантные штаммы, содержащие полученные плазмиды: E.coli М-17/pCollacZ, М-17 fimH::npt/pCollacZ, М-17/СоЩтоЬ, М-17 fimH::npt/ColAmob. Штаммы обладают способностью к продукции колицина Е1, при этом сконструированные плазмиды лишены mob области и вследствие этого не способны к мобилизации конъюгативными плазмидами.

2. Впервые изучена антагонистическая активность новых рекомбинантных штаммов и коммерческих ПБ различных групп в отношении клинических штаммов E.coli, выделенных от пациентов с дисбиозами.

3. Впервые исследовано влияние НИЛИ на адгезивные свойствы E.coli и установлена бульшая чувствительность патогенов к антиадгезивному действию НИЛИ по сравнению с ПБ.

4. Впервые исследовано влияние ферментов ASG и РРО на адгезивную активность микроорганизмов и установлена бульшая чувствительность патогенов к антиадгезивному действию ферментов по сравнению с ПБ.

5. Разработана модифицированная модель экспериментального дисбактериоза на животных. При этом для доказательства наличия дисбактериоза впервые использован штамм E.coli 0157:Н7 (212), вызывающий геморрагический колит.

6. Впервые предложен способ коррекции геморрагического колита с помощью ПБ: генноинженерных вариантов штаммов М-17, а так же коммерческих препаратов -биофлора, биоспорина, лактобактерина, колибактерина.

Практическая значимость.

1. Представлены новые научные данные о механизме защитного действия ПБ.

2. Предложена новая модель для изучения дисбактериоза с использованием мышей. Доказана эффективность применения ПБ для профилактики и лечения дис-бактериозов на этой модели.

3. In vitro доказана возможность комплексного использования ПБ, НИЛИ и ферментов РРО и ASG для предотвращения колонизации патогенов.

4. Получены новые рекомбинантные варианты пробиотического штамма E.coli М-17, обладающие способностью синтеза колицина Е1, которые могут быть использованы для разработки пробиотических препаратов.

Полученные данные можно использовать в лекционном материале по микробиологии в разделах нормальная флора, дисбактериозы и пробиотики.

Положения, выносимые на защиту.

1. Сконструированные плазмиды pCollacZ и СоЩтоЬ содержат детерминанту синтеза колицина Е1 (сеа), ген иммунности к нему (imm), не способны к мобилизации конъюгативными плазмидами (не содержат mob области), стабильно поддерживаются в популяции (за счет наличия гена сег) и пригодны для использования в качестве факторов, придающих родительскому штамму E.coli М 17 способность к синтезу колицина Е1 и вследствие этого повышенную антагонистическую активность в отношении патогенов.

2. Полученные рекомбинантные штаммы, а так же колисодержащие ПБ в опытах in vitro проявляют высокий уровень антагонистической активности в отношении клинических штаммов патогенных E.coli , выделенных от больных с дисбиозами, тогда как споровые пробиотики и энтерол обладают низким уровнем антагонизма в отношение изучаемых штаммов.

4. Ферменты ASG и РРО обладают свойством снижать уровень адгезивности микроорганизмов на различных моделях и экспериментах in vitro: иммобилизирован-ные субстраты, эукариотические клетки (эритроциты и клетки защечного эпителия) и др. ПБ значительно менее чувствительны к воздействию ферментов по сравнению с патогенными E.coli.

5. Получена адекватная модель дисбактериоза у животных для исследования эффективности ПБ. В качестве маркёра наличия дисбактериоза использован штамм E.coli 0157:Н7.

6. ПБ обладают протективным действием в отношении клинического штамма E.coli 0157:Н7 на модели in vivo.

1.Т.В. Колганова, И.Г. Осипова, М.В. Далин, X. Ватанабе, Е.А. Васильева, В.Л. Чес-нокова, В.Ф. Евлашкина, Э.Г. Кравцов, Н.Ю. Абрикосова, О.Ю. Лукьянова. Некоторые механизмы взаимодействия пробиотиков с веротоксинпродуцирующими Escherichia coli 0157: Н7//сб. Биотехнология, Москва, 2000, №13, с. 69-76.

2.Адгезивная активность пробиотиков, применяемых в гинекологической практике/ И.Г. Осипова, Л. Созаева, В.Ф. Евлашкина, Е.А. Васильева, О.Ю. Лукьянова, Т.В. Чумаева, Т.В. Колганова. //сб. Биотехнология Москва, 2001, №16, с. 35-39.

3.Т.В. Колганова, X. Ватанабе, М.В. Далин, Е.А. Васильева, И.Г. Осипова, В.А. Лившиц, О.Ю. Лукьянова, В.Ф. Евлашкина К вопросу о механизме защитного действия пробиотиков//сб. Биотехнология, Москва, 2001, №16, с. 23-28.

4.Т.В. Колганова, А.В. Ермолаев, Р.Дж.Дойл. Влияние ферментов аспарагиназы и полифенолоксидазы на адгезивные свойства микроорганизмов// БЭБ, 2002, № 1, с. 71 - 74.

5.Т.В. Колганова, Т. Джарадат, Т.В. Чумаева, И.Г. Осипова и др. К вопросу о воздействии импульсного инфракрасного лазерного излучения и пробиотиков на штаммы Escherichia coli, выделенные от людей с заболеваниями мочевыделительной системы// международная научно-практическая конференция памяти Г.И. Гончаровой, Сб. материалов, Москва, 2002, с. 25.

6.Изучение адгезивной активности пробиотиков различных лекарственных форм, применяемых в гинекологической практике/ Т.В. Чумаева, И.Г. Осипова, Е.А. Васильева, Т.В. Колганова, О.В. Золотарева, С.Э. Саркисов// международная научно-практическая конференция памяти ГИ Гончаровой, Сб. материалов, Москва, 2002, с. 24.

7.Т.В. Колганова, Т. Джарадат, А.В. Ермолаев, И.Г. Осипова, Е.А. Васильева, М.В. Далин, Р.Дж. Дойл. К вопросу о комплексном воздействии импульсного инфракрасного лазерного излучения и аспарагиназы на штаммы Escherichia coli, выделенные при заболеваниях мочевыделительной системы// БЭБ, 2002, т. 133, №6, с. 681-683.

8.Т. В. Колганова, Т. Джарадат, А. В. Ермолаев, И.Г. Осипова, Е.А. Васильева, М.В. Далин, Р.Дж. Дойл. К вопросу о комплексном воздействии низкочастотного лазерного излучения и полифенолоксидазы на адгезивную способность штаммов Escherichia coli, выделенных при заболеваниях мочевыделительной системы у людей// БЗБ, 2002, т. 134, №7, с. 190-192.

9.Изучение адгезивной активности пробиотиков различных лекарственных форм, применяемых в гинекологической практике/ Т.В. Чумаева, И.Г. Осипова, Е.А. Васильева, Т.В. Колганова., О.В. Золотарева, С.Э. Саркисов // сб. Биотехнология Москва, 2002, №19, с. 100-103.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Колганова, Татьяна Владимировна

Выводы:

1) На базе известной плазмиды Со1Е1 сконструированы гибридные плазмиды pCollacZ и Colflmob, несущие детерминанту синтеза колицина Е1 (ген сеа), ген устойчивости к нему (imm) и лишенные генов mob, контролирующих конъюгативную мобилизацию плазмиды.

2) Получены штаммы E.coli, производные производственного штамма E.coli М-17 и его варианта E.coli М-17 fimH::npt, несущие плазмиды pCollacZ и Colflmob. Штаммы проявляют повышенную антагонистичекую активность в условиях in vitro и in vivo.

3) Разработана модель дисбактериоза на животных, позволяющая изучить эффективность пробиотиков in vivo. Показано, что пероральное введение ампиокса вызывает выраженное изменение состава микрофлоры, сопровождающаяся транслокацией лакгозонегативной флоры из кишечника в легкие, почки, печень и тимус.

4) На модели экспериментального дисбактериоза впервые показан протективный эффект пробиотиков в отношении клинического штамма E.coli 0157:Н7. При этом достигалось 100% профилактическое и 60% лечебное действие пробиотиков.

5) Выявлен разный уровень антагонизма различных пробиотиков в отношении клинических штаммов патогенных E.coli, выделенных от больных с дисбиозами. Колисодержащие пробиотики и полученные рекомбинантные штаммы проявляют высокий уровень антагонистической активности (от 23,5±1,9 до 31,3±0,55 мм в отношении E.coli 0157:Н7 и от 17,1±1,2 до 19,6±1,58 мм в отношении UPEC), тогда как споровые пробиотики и энтерол обладают низким уровнем антагонизма в отношение изучаемых штаммов (споровые: от 0 до 13, 5±0,7 в отношении E.coli 0157:Н7 и от 0 до 7,5±0,5 мм в отношении UPEC, энтерол: 0 мм в отношении E.coli 0157:Н7 и 1,2±0,2 мм в отношении UPEC).

6) При сравнительном изучении адгезивной активности пробиотиков и клинических штаммов патогенных E.coli, выделенных от больных с дисбиозами, установлено, что колисодержащие пробиотики и полученные рекомбинантные штаммы обладают наибольшим уровнем адгезивной активности (от 2,2±0,30 до 3,2±0,25) и могут конкурировать с патогенными E.coli за сайты связывания.

7) В опытах in vitro показано, что воздействие низкочастотного импульсного лазерного излучения (НИЛИ) блокирует адгезины уропатогенных E.coli, и тем препятствует колонизации бактерий в организме. Обработка эритроцитов НИЛИ приводит к ингибированию рецепторов, что также выражается в снижении адгезии. Патогенные E.coli в значительной мере более чувствительны к воздействию НИЛИ, чем пробиотики.

8) Впервые установлена способность ферментов L-аспарагиназы и Полифенол оксидазы снижать адгезивность патогенных E.coli на различных моделях in vitro. Показано, что пробиотики значительно менее чувствительны к действию ферментов по сравнению с патогенными E.coli.

9) Полученные данные о высокой колонизационной способности новых рекомбинантных штаммов E.coli: М-17/pCollacZ, М-17 fimH::npt/pCollacZ, М-17/Со1ДтоЬ, М-17 fimH::npt/Colflmob следует рассматривать как экспериментальное обоснование их использования для коррекции дисбактериозов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нормальная микрофлора обеспечивает колонизационную резистентность (КР) пищеварительного тракта, то есть устойчивость к колонизации условнопатогенными или патогенными бактериями [88]. В обычных условиях поддержание КР микрофлорой осуществляется за счет продукции антибиотических веществ, конкуренции за места адгезии, подавления адгезии условнопатогенных бактерий и ряда опосредованных механизмов [14,194]. Снижение КР микроорганизмов влечет за собой цепь неблагоприятных последствий, основное из которых - развитие дисбиоза, который во многих случаях является пусковым механизмом для развития инфекционных процессов различной этиологии [4,14,29,63].

Любой колонизационный процесс - колонизация пробиотиков, инфекция, -реализуется только при наличии комплекса факторов, характеризующих микро и макроорганизм. Для микроорганизма эти факторы включают в себя адгезивную активность, которую можно рассматривать как начальный этап любого колонизационного процесса, специфическую активность, реализуемую за счет высокой ферментативной деятельности, продукции антибиотических веществ, бактериоцинов и колицинов, способности изменять рН, и пр.; для патогенных микроорганизмов важную роль в процессе колонизации играет так же токсинопродукция, гемолитическая активность, выработка ферментов агрессии (гиалуронидаза, лецитиназы, протеиназы и др.).

Пробиотики давно и повсеместно применяют при дисбактериозах, кишечных инфекциях, таких, как шигеллез, дизентерия, сальмонеллез, инфекции вирусной этиологии и др.

Одним из первых отечественных ПБ является колибактерин. Штамм E.coli А. Ниссле [Перетц Л.Г., 1955], входивший в состав колибактерина, за годы эксплуатации утратил плазмиду, детерминирующую колициногенность, в связи с чем снизил антагонистическую активность в отношении ряда бактерий, чувствительных к действию колицина [Юхименко Л.Н. с соавт., 1968]. Таким образом, настоящая работа преследовала цель получить и исследовать новые рекомбинантные варианты производственного штамма М-17 способные к продукции колицина Е1 и обладающие вследствие этого повышенной антагонистической активностью.

В работе использован штамм E.coli М17 и его низкоадгезивный вариант E.coli М-17 fimH::npt, охарактеризованный Чесноковой В.Л. (1998) в качестве более подходящего для колонизации кишечника. Штаммам было придано свойство колициногенности с целью усиления их антагонистичекой активности. Колициногенность изначально была присуща пробиотику E.coli М-17, однако, в процессе культивирования была утрачена. Возможное объяснение этому - наличие в плазмиде Со1Е1 области mob, определяющей способность плазмиды к коинтеграции с другими, в том числе конъюгативными плазмидами. В результате коинтеграции образуются гибридные плазмиды, которые, с одной стороны несут фактор колициногенности (сеа) и устойчивости к нему (imm), с другой - содержат область tra, определяющую способность к конъюгативному переносу. Результатом конъюгативного переноса может быть, во-первых, приобретение другими бактериями, в том числе патогенными и условно патогенными, способности к синтезу колицина и иммунности к нему, а во-вторых, потеря плазмиды и вследствие этого снижение антагонистической активности штамма - пробиотика. Таким образом, целью работы было получение кол и ци но ген ной плазмиды, лишенной mob области. Для создания такой плазмиды, способной стабильно сохраняться в пробиотических штаммах E.coli, было использовано два подхода:

- удаление mob области родительской плазмиды Со1Е1 с помощью эндонуклеазы рестрикции BspLUH.I и лигирования полученных липких концов друг на друга;

- удаление mob области плазмиды Со1Е1 и вставка гена lacZ из плазмиды pUC19. Таким образом, получены две плазмиды, обозначенные как pCollacZ и Colflmob.

Полученные плазмиды были трансформированы в штамм TG1. Селекция велась путем отбора колоний устойчивых к колицину (для плазмид pCollacZ и СоЩтоЬ) или путем отбора синих колоний на среде, содержащей IPTG/ X-Gal. Отбор трансформантов штаммов E.coli М-17 и E.coli М-17 fimH::npt проводился на среде, содержащей колицин. Было показано, что через 10, 20 . 100 генераций при культивировании в среде, не содержащей селективного маркера, 100% исследованных клеток сохраняли полученные плазмиды. Все проверенные клетки несли признаки, детерминируемые данными плазмидами. Доказано, что сконструированные плазмиды не мобилизуются, что устраняет опасность переноса плазмиды в патогенные и условно патогенные бактерии.

Таким образом, было подтверждено, что генетической основой нестабильности плазмиды и штамма ее содержащего, является область mob.

Далее исследовалась антагонистическая активность полученных рекомбинантных штаммов и ПБ различных групп в отношении E.coli 0157:Н7 и уропатогенных E.coli (UPEC) по методике отсроченного антагонизма.

Большинство исследованных пробиотиков обладали более выраженным антагонизмом по отношению к Escherichia coli 0157:Н7. Средний показатель антагонизма колисодержащих пробиотиков против E.coli 0157:Н7 составил (23,5±1,9 - 31,3+0,55) мм, что достоверно выше, чем в отношении UPEC (17,1 ±1,2 - 19,6±1,58) мм.

Доказана высокая антагонистичекая активность генноинженерных штаммов E.coli (E.coli М17/ pColap, E.coli M17 fimH::npt/ pColap, E.coli М17/ pCollacZ, E.coli М17/ СоЩтоЬ), колисодержащих ПБ (колибактерин, производственный штамм E.coli М-17 биофлор), а так же средняя - биоспорина и лактобактерина.

В качестве модели для сравнительного исследования адгезивности различных групп ПБ выбраны человеческие эритроциты В/И (Rh+). Эритроциты являются универсальной моделью для изучения адгезии разных микроорганизмов, так как имеют на своей поверхности гликофорин - гликопротеин, идентичный гликокаликсу эпителиальных клеток.

3.2±0,25). Таким образом, показано, что введение сконструированных плазмид в штамм E.coli М-17 увеличивает его адгезивность к эритроцитам. Варианты Е. coli М-17 fimH::npt/pCollacZ и Е. coli М-17 fimH::npt обладают значительно более низким уровнем адгезивной активности (0,7±0,10 и 0,6±0,10) (р<0,05) вследствие отсутствия гена синтеза пилей I типа fimH. Средний уровень адгезивности наблюдается у лактобактерина (3,2±0,50) и бифидобактерина (1,7±0,20). Среди споровых ПБ наибольшим уровнем адгезивности обладает биоспорин (2,6±0,10), тогда, как СПА у бактиспорина и бактисубтила низок (0,4±0,15 и 0,1±0,10 соответственно). Низкий уровень адгезивности зафиксирован у энтерола (0,3±0,15) и ацилакта (0,3±0,10). Показатели К% у исследованных ПБ так же различались. Высокий К% показан у кишечных палочек с "включенным" геном синтеза адгезина FimH, лактобактерина, биоспорина, средний - у бактиспорина. Низкий К% проявляли кишечные палочки с дефектным геном синтеза пилей I типа fimH, бактисубтил, энтерол, ацилакт и бифидумбактерин. Известно, что показатель К% прямо зависит от количества рецепторов для адгезинов микроорганизмов. Таким образом, показано, что для колисодержащих ПБ адгезия играет важную роль при реализации колонизационной активности, тогда как для споровых ПБ, лактосодержащих ПБ и энтерола процесс адгезии менее значим.

Параллельно проводилось исследование адгезивной активности патогенных E.coli (0157:Н7 [п=9] и уропатогенных кишечных палочек (UPEC) [п=14]). Все штаммы UPEC проявляют разный уровень адгезивности, который колеблется от 0,60±0,16 до 2,89±1,24. СПА к эритроцитам у UPEC составляет 1,83±1,20. Штаммы E.coli 0157:Н7 также обладают различным уровнем адгезивной активности к эритроцитам. При этом СПА колеблется в более широком по сравнению с UPEC интервале: от 0,48±0,23 до 9,95±2,30. Из данных литературы известно, что все исследованные штаммы E.coli 0157:Н7 одинаково патогенны и вызывали эпидемии в разных префектурах Японии (Armstrong G.D. et al., 1995, 1996; Isawa M. et al., 1999 и др.). Следовательно, для группы E.coli 0157:Н7 адгезивность не коррелирует с патогенностью. Однако, СПА для всей группы штаммов E.coli 0157:Н7 достаточно высок и составляет 3,45±2,89.

В обеих группах патогенных Е.coli отмечен средний или высокий показатель К%. Следует отметить, что К% выше в группе UPEC, тогда как СПА выше в группе 0157:Н7. Это свидетельствует о том, что для UPEC, так же как и для нормальной кишечной палочки М-17 существует больше рецепторов на мембране эритроцитов.

Следовательно, возможна выраженная конкуренция между нормальными E.coli и UPEC, и, как следствие, возникает возможность применения колисодержащих ПБ для профилактики и лечения заболеваний, вызванных UPEC.

При дисбиозах одной из важнейших задач коррекции является удаление патогенов из экониш, одним из способов которого служит блокирование их адгезии к субстратам связывания. Исходя из механизма адгезии, ее можно блокировать либо угнетением бактериальных адгезинов, либо воздействием на рецепторные свойства клеток макроорганизма. Известно множество субстанций, обладающих способностью блокировать адгезию микроорганизмов. Но если блокирование адгезии патогенов целесообразно, то снижение адгезивности нормальной флоры нежелательно. Следовательно, возникает целесообразность поиска агентов, способных ингибировать адгезивность патогенов, при этом незначительно воздействуя на нормофлору.

При обработке ASG для всех штаммов отмечено снижение уровня адгезии от 23% до 71.9% . РРО вызвала как снижение адгезивности, так и ее увеличение. Корреляции между действием обоих ферментов на штаммы не обнаруживается.(rs=-0.41)

На модели клеток защечного эпителия также показан неодинаковый уровень снижения адгезивной активности патогенных E.coli под воздействием ASG и РРО (rs=0.25). Полифенол оксидаза оказывает меньший по сравнению с L-Аспарагиназой эффект снижения уровня адгезии на модели клеток защечного эпителия. В целом процентное изменение уровня адгезии микроорганизмов сопоставимо для обеих моделей, особенно для ASG (rs=0.80 для ASG и rs=0.20 для РРО). Полученные данные свидетельствуют об участии в процессе адгезии одинаковых адгезинов. Тот факт, что ферменты на модели буккальных клеток снижали уровень адгезии микроорганизмов в меньшей степени может свидетельствовать об участии в адгезивном процессе дополнительных механизмов (например, образовании оснований Шиффа) или других типов адгезинов.

Положительный опыт применения низкочастотного импульсного лазерного излучения (НИЛИ) в различных областях медицины, в частности в урологии для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний свидетельствует о влиянии НИЛИ не только на организм человека и отдельные субпопуляции его клеток, но и о воздействии на микроорганизмы, в частности на их адгезивные свойства. В модельных опытах показано, что терапевтическая частота (5 - 5000 Гц) и время (1 -10 мин) лазерной обработки не оказывает бактерицидного действия, но почти во всех случаях снижает адгезию уропатогенных E.coli. Это было показано в опытах исследования адгезии с использованием эритроцитов и буккальных клеток. Причем на модели буккальных клеток, в сравнении с результатами, полученными на модели эритроцитов, эффект ингибирования менее выражен. Вероятно, это объясняется участием в адгезивном процессе различных типов пилий. Что касается штаммов -пробиотиков E.coli, то при обработке НИЛИ не наблюдалось снижения адгезивности ни на модели эритроцитов, ни на модели буккальных клеток.

Механизм воздействия НИЛИ на адгезивный процесс до конца не исследован. Возможно, в этом случае имеет место как модификация структуры фимбрий, так и изменение рецепторов макроорганизма. Мы показали это в серии экспериментов, в которых подвергали лазерной обработке не бактериальные клетки, а клетки макроорганизма - эритроциты. В этом случае также показано снижение адгезии UPEC и E.coli 0157:Н7. Этот факт подтверждает целесообразность применения НИЛИ для лечения нефрологических больных, у которых причиной заболевания служит кишечная палочка.

На следующем этапе работы исследовано комплексное воздействие ферментов (ASG, РРО) и НИЛИ на адгезивные свойства микроорганизмов. На первой стадии исследования охарактеризована последовательность действия НИЛИ и фермента. Обрабатывали штаммы патогенных E.coli. В качестве субстрата использовались эритроциты. Доказано, что в большинстве случаев (5 из 8) больший уровень снижения адгезии наблюдается при комплексной обработке сначала НИЛИ, затем ферментами (использовали ASG в концентрации 6 ЕД/мл). При обработке последовательно ферментом, затем НИЛИ эффект снижения адгезии приблизительно равен таковому при монообработке ферментом или НИЛИ. Результаты выводились, исходя из СПА штаммов, К% достоверно не изменяется при разных способах обработки (р>0,05) практичеки для всех штаммов. Возможно, это связано с тем, что предшествующая лазерная обработка меняет конформацию адгезина, делая остатки аспарагина в субстратсвязывающих сайтах более "доступными" для действия фермента.

Далее было исследовано влияние ферментов ASG и РРО, а так же НИЛИ на адгезивную активность ПБ. В качестве ПБ использовались штаммы E.coli: М-17, М-17/pColap, М-17 fimH::npt, М-17 fimH::npt/pColap, М-17/ pCollacZ, М-17 fimH::npt/ pCollacZ; Lactobacillus fermentum 90-TS-4(21). Моделью служили эритроциты и клетки защечного эпителия. Полученные результаты свидетельствуют о значительно меньшем эффекте, оказываемом НИЛИ и ферментами, на адгезию штаммов-пробиотиков по сравнению со штаммами патогенных E.coli. Причем штаммы, экспрессирующие пили I типа, практически не изменяют уровень адгезии при обработке НИЛИ и ферментами, у штаммов с дефектным геном синтеза пилий I типа и Lactobacillus fermentum 90-TS-4(21) наблюдается некоторое увеличение адгезии к эритроцитам и клеткам защечного эпителия. Эти результаты позволяют предположить возможное использование ферментов и НИЛИ одновременно с ПБ для профилактики и/ или лечения инфекций, вызванных чувствительными к ферментам и НИЛИ микроорганизмами.

Таким образом, в экспериментах in vitro показано, что полученные рекомбинантные штаммы за счет плазмиды, детерминирующей синтез колицина, обладают выраженной антагонистичекой активностью по отношению к патогенным штаммам, выделенным при дисбиозах у пациентов с урологическими заболеваниями и гемолитико-уремическим синдромом. При этом сконструированные штаммы наряду с колибактерином обладают высокой адгезивной активностью и практически не чувствительны к воздействию ферментов ASG и РРО, что делает их перспективными для использования, в том числе в комплексе с изученным физико-химическим воздействием, для лечения и профилактики колонизации изученных патогенов в организме.

Окончательный вывод об эффективности ПБ можно сделать лишь на основе экспериментов in vivo. Экспериментальный дисбактериоз вызывается посредством кровопотери, голодания, стрессовых ситуаций, радиационного облучения, приема антибиотиков (Бонд В.М. с соавт., 1992 и др.). Однако, до настоящего времени отсутствует эффективная экспериментальная модель дисбактериоза на животных.

Дисбактериоз у мышей вызывали посредством инграгастрального введения антибиотиков: ампиокса в суточной дозе 4 мг в течение 14 суток или доксициклина в дозе 0,2 мг однократно. Дисбактериоз диагностировали по изменению состава фекальной микрофлоры. Количество микроорганизмов выражали в lg КОЕ/г фекалий. После однократного введения доксициклина наблюдались следующие изменения в составе фекальной микрофлоры: увеличивалось количество грибов рода Candida (на 2,0 lg) и снижалось количество лактозопозитивных E.coli (на 4,0 lg). При этом внешне все животные выглядели удовлетворительно.

При изучении влияния ампиокса на состав микрофлоры показано более резкое изменение состава микрофлоры. Так увеличивалось количество лактозонегативных E.coli (более чем на 5,0 lg), умеренно (примерно на 2,0 lg) росло содержание лактозопозитивных кишечных палочек и грибов рода Candida (на 2,0 lg), резко увеличивалось содержание Proteus spp. (более чем на 5,0 lg). На 1,0 lg увеличивалось содержание Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis и Enterococcus sp. При этом содержание молочнокислых бактерий (Bifidobacterium и Lactobacillus) и бактерий рода Clostridium не изменялось. Вследствие более глубоких изменений состава кишечной микрофлоры в последующих экспериментах использовался ампиокс.

В предварительных опытах отобран штамм E.coli 0157:Н7 №212, так как у здоровых животных он не вызывал заболевания, и только при экспериментальном дисбактериозе было возможно определить LD50, которая составила 109 КОЕ.

Известно, что при дисбактериозе кишечника происходит транслокация условно патогенных бактерий в несвойственные им биотопы, провоцируя различные инфекционно-воспалительные заболевания, такие, как пиелонефрит, бактериальный вагиноз и проч. Было проведено изучение транслокации кишечной флоры во внутренние органы в норме и при экспериментальном дисбактериозе, вызванном введением ампиокса. Наблюдалась транслокация лактозонегативной флоры {E.coli, Proteus) в легкие, почки, тимус и печень, при этом селезенка и кровь оставались стерильны. В контрольной группе животных (получавших per os физиологический раствор) все органы и кровь были стерильны. Следует отметить, что лактозопозитивная кишечная флора не транслоцировалась. Транслокация условно патогенной флоры при дисбактериозе объясняется значительным количественным ее увеличением, что, в свою очередь приводит к массовому выбросу в кровь эндотоксинов и параллельному снижению как клеточного, так и гуморального антиэндотоксинового иммунитета. Таким образом, полученные результаты коррелируют с данными литературы о том, что наибольшим уровнем транслокации обладает кишечная палочка, а также о том, что одним из пусковых механизмов транслокации служит чрезмерное увеличение количества кишечной флоры.

ПБ в медицинской практике применяются для лечения и профилактики дисбактериозов. На основании этого в эксперимент были взяты три группы животных. Первая группа получала ПБ per os в двух дозировках ("человеческой" дозе (ч.д.), т. е. дозе равной разовой дозе, применяемой у человека, и "мышиной" дозе (м.д.), т. е. дозе ПБ в пересчете на массу мыши.) 1 раз в сутки параллельно с ампиоксом за 5 дней до заражения; вторая группа получала пробиотик peros в двух дозировках (ч.д. и м.д.) 1 раз в сутки за два дня до заражения и получала его в течение 5 дней, т. е., 3 дня после заражения; третья группа начала получать пробиотик peros в одной ч.д. 1 раз в сутки через 1 день после заражения в течение 4 дней; 1 контрольная группа животных до заражения получала только ампиокс per os] 2 контрольная группа животных до и после заражения не получала ни каких препаратов.

Показан профилактический и лечебный эффект генноинженерных штаммов, а также ПБ различных групп. В первой группе животных наблюдалось выраженное профилактическое действие, наиболее четкий эффект был отмечен при приеме генноинженерных вариантов штамма E.coli М-17, колисодержащих препаратов (колибактерин и биофлор) и, а так же лактобактерина и биоспорина. Отмечено, что генноинженерные штаммы проявили выраженный защитный эффект как в "человеческой", так и в "мышиной" дозах, колисодержащие ПБ оказывали профилактическое действие в "человеческой" дозе (109 КОЕ, 106 КОЕ для биофлора), а лактобактерин и биоспорин - в "мышиной" дозе (106 КОЕ). Во второй группе животных наблюдался выраженный протективный эффект при применении "мышиных" дозировок генноинжененрного штамма E.coli М-17 fimH::npt/pCollacZ и биофлора, тогда как "мышиная" дозировка колибактерина оказалась неэффективной, высокое защитное действие проявил биоспорин в "человеческой" дозировке. В третьей группе все исследованные побиотики проявили примерно равную (40-60%) протективную активность в "человеческой" дозировке. Животные контрольной группы, получавшие до заражения физиологический раствор (контроль 2) выжили в 80% случаев, тогда как в группе животных, получавших ампиокс per os (контроль 1), летальность составила 90%.

Таким образом, результаты экспериментов in vitro, доказывающие эффективность использования ПБ против патогенов, выделенных при дисбиозах у пациентов с заболеваниями мочевыводящего тракта, подтверждены на модели in vivo. При этом показана высокая активность сконструированных генноинжененных вариантов E.coli М-17: E.coli М-17/pCollacZ, М-17 fimH::npt/pCollacZ, М-17/Со1ДтоЬ, М-17 fimH::npt/Colflmob.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Колганова, Татьяна Владимировна, Москва

1. Авдошин В. П. Неспецифические воспалительные заболевания почек, мочевыводящих путей и половых органов у мужчин. Гл. 15, с. 406-423, из книги Низкоинтенсивная лазерная терапия. Под ред. Москвина С. В., М., 2000

2. Азизов И. С., Тургунов Е. М. Влияние электроимпульсной обработки органов брюшной полости на гистотаксис и адгезию госпитальных штаммов микроорганизмов// www.antismed.ru

3. Балтрашевич АК, Подопригора ГИ, Комаровская ТП. Влияние метронидазола на КР кишечника мышей к сальмонеллам//Антибиотики и микроэкология человека и животных (труды института), с 94-98, М. 1988

4. Блохина И.Н., Дорофейчук В.Г. Дисбактериозы// Л., 1979

5. Бонд ВМ, Горская ЕМ. Новые подходы к моделированию, диагностике и лечению дисбактериозов кишечника//Мед аспекты микробной экологии, вып 6, с 23-26, 1992

6. Бондаренко ВМ. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса//ЖМЭИ «5 с 34-39, 1999

7. Бондаренко ВМ и др. Адгезивная активность клинических штаммов клебсиелл// ЖМЭИ №2, с 104-109, 1996

8. Бочков ИА, Трофимов ОД, Дарбеева ОС и др. Упрощенная методика подсчета микроорганизмов при изучении аутофлоры человека//Лаб Делоб с 43-47, 1988

9. Бриллис ВИ, Брилене ТА, Тюваева РФ и др. О возможности воздействия на цитоадгезию микроорганизмов//Антибиотики и колонизационная резистентность. Труды института НИИ Антибиотиков, с 147, М. 1990

10. Бриллис ВИ, Бриллене ТА, Лейнцер ХП и др. Антибиотики и адгезивная активность микроорганизмов// Антибиотики и микроэкология. Труды института НИИ Антибиотиков, с 147, М. 1988

11. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.Б., Ленцнер А.А. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов //Лаб. Дело. № 4. -с.210-212, 1986

12. Буглова С.Е. с соавт. Применение лазерного облучения в нефрологической практике. Урология и нефрология, 1994, № 4, с. 27-30

13. Вомышев АВ, Елагина НН, Кириллов ВА, Кириллов ДА, Бухарин ОВ. Влияние бифидобактерий на антилизоцимную активность энтеробатерий// ЖМЭИ, №4, с 77-80, 2000

14. Воробьев АА, Пак СГ. Дисбактериозы у детей// М. 1998

15. Воробьев АА, Лыкова ЕА. Бактерии нормальной микрофлоры. Биологические свойства и защитные функции//ЖМЭИ, №6, с 102-105, 1999

16. Воробьев АА, Несвижский ЮВ, Зуденков АЕ, Буданова ЕВ. Сравнительное изучение пристеночной и просветной микрофлоры толстой кишки в эксперименте на мышах//ЖМЭИ, №1, с 62-67, 2001

17. Воробьев АА, Несвижский ЮВ, Липницкий ЕМ, Алленов МН и др. Исследование пристеночной микрофлоры кишечника человека//ЖМЭИ №1, с 60-63, 2003

18. Горская Е.М. Механизмы развития микробиологических нарушений в кишечнике и новые подходы к их коррекции. Автореф. дис. д-ра мед.наук. -М., 1994

19. Гриценко В. А., Бухарин О. В. Экологические и медицинские аспекты симбиоза Escherichia coli и человека. ЖМЭИ, с. 92-99, № 3, 2000

20. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул// «Медицина» М., 1985

21. Интизаров ЛМ. Оценка СПФ-мышей, полученных с помощью деконтаминации антибиотиками и другими средствами, по результатам биомедицинских исследований, проводимых на них в течение 5 лет// Антибиотики и пр, вып XIX, с 62-67, М. 1990

22. Козель А. И., Попов Г. К. Механизм действия лазерного облучения на тканевом и клеточном уровне. Вестник Российской Академии Медицинских Наук, с. 41-43, № 2, 2000

23. Колганова Т, Ермолаев А., Дойл Р. Влияние ферментов аспарагиназы и полифенолоксидазы на адгезивные свойства микроранизмов// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2002, 1, с. 71-74

24. Колганова Т., Ватанабэ X., с соавт. К вопросу о механизме защитного действия пробиотиков// Сб. Биомедицинские технологии, 2001, вып. 16, с. 23-29

25. Коршунов ВМ, Ефимов БА, Пикина АП. Характеристика биологических препаратов и пищевых добавок для функционального питания и коррекции микрофлоры кишечника//ЖМЭИ №3, с 86-91, 2000

26. Косяков ИН. Иммунология изоантигенов и изоантител// М., Медицина, с 149-154, 1965

27. Кочурко ЛИ, Лиходед ВГ, Лобова ЕА. Показатели иммунитета к эндотоксину грамотрицательных бактерий при кишечных дисбактериозах// ЖМЭИ №5, с 2527, 1998

28. Крылов ВП, Кроличенко, Малышева ТВ и др. Новый вариант рабочей классификации дисбактериоза микрофлоры в просвете толстого кишечника// ЖМЭИ №3, с 103-104, 1997

29. Куравлев ПП, Чернова ОЛ, Гиргизова СБ. Взаимодействие окситоцина, лазерного и электромагнитного излучения на персистентные свойства S.aureus// ЖМЭИ, 4, с 62-64, 2000

30. Курлаев П. П., Чернова О. Л., Киргизова С. Б. Взаимодействие окситоцина, лазерного и электромагнитного излучения на персистентные свойства Staphylococcus aureus. ЖМЭИ, с. 62-64, № 4, 2000

31. Ларченко НТ, ЗлаткинаАР. Комплексная терапия при заболеваниях органов пищеварения// М., Медицина, с 162-166, 1977

32. Лизько НН. Дисбактериозы экстремальных состояний// Антибиотики и медицинская биотехнология №3, 1987

33. Лиходед В. Г., Яковлев М. Ю, Лиходед Н. В. с соавт. Состояние антиэндотоксинового иммунитета при экспериментальном кишечном дисбактериозе у мышей.//ЖМЭИ.-1998,- №4.- с. 14-16

34. Малик НИ, Панин АН, Вершинина ИЮ. Пробиотики: теоретические и практические аспекты// Био №3(18), март 2002

35. Медицинская газета, №61, с 2, 1996

36. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике// Мир, с183-189, М.1978

37. Митрохин С.Д. Метаболиты нормальной микрофлоры человека в экспресс -диагностике и контроле лечения дисбиоза толстой кишки// Автореф.дис.докт.мед.наук. 37 с. 1998

38. Москвин СВ, Буйлин ВА. Низкоинтенсивная лазерная терапия// М., ТОО Фирма Техника, 2000

39. Мухина ЮГ. Диагностика и коррекция дисбактериоза у детей// РМЖ, Том 7 № 11, 1999

40. Никитенко ВИ, Захаров ВВ, Бородин АВ и др. Роль транслокации бактерий в патогеннезе хирургических инфекций// Хирургия, №2, с 63-66, 2001

41. Осипова И.Г. Некоторые аспекты механизма защитного действия колибакгерина и споровых эубиотиков и новые методы их контроля.// Автореф.дис.канд.биол.наук.- М., 25 с. 1997

42. Палий ГК, Виевский АН. Биологические свойства некоторых энтеробактерий, устойчивых к антибактериальным препаратам// Антибиотики и КР. Труды НИИ АБ, с 67, М. 1990

43. Парфенов АИ, Калоев ЮК. Дисбактериоз кишечника// Молск мед журн, 1, с 12-18,1998

44. Перетц ЛГ. Значение нормальной микрофлоры для организма человека: об использовании микробов нормальной микрофлоры в терапии и профилактике// Гл IX, М. 1955

45. Петровская ВГ, Давыдова НВ. Экспериментальное получение поликолициногенных штаммов E.coli с широким спектром ингибиторного действия// Вестник АМН СССР, №2, с 83-87, 1986

46. Петровская ВГ, Марко ОП. Микрофлора человека в норме и патологии// М. 1976

47. Покровский ВИ, Поздеев ОК. Медицинская микробиология: факультативные грамотрицательные палочки семейства Enterobacteriaceae// Гл 12, с 344-416, М.1999

48. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериозов кишечника. Методические рекомендации.- 23 с. М. 1986

49. Пяткин КД, Кривошеин ЮС. Микробиология//с 255-259, М. 1980

50. Ратинер ЮА, Бондаренко ВМ. Энтерогеморрагичекие кишечные палочки и вызываемые ими заболевания//ЖМЭИ, №5, с 87-96, 1998

51. Савицкая КИ, Русаенова ЕВ, Нехорошева АГ и др. Микрофлора толстой кишки больных с длительно текущей уроинфекцией// Мед аспекты микробной экологии, вып 7/8, с 173-175, 1993/1994

52. Селиверстов ВВ. Методические рекомендации по подготовке препаратов для изучения степени адгезии микроорганизмов с клетками животных в световом и сканирующем электронном микроскопе № 13-7-2/4 от 16 Февраля 1999 г.

53. Смирнов ВВ, Резник CP, Василевская ИА. Спорообразующие аэробные бактерии—продуценты биологически активных веществ// Киев.Наукова думка. 278 С, 1983

54. Сорокулова ИБ. Теоретическое обоснование и практика применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых пробиотиков// Дисс на соиск уч степ дбн, Киев 1999

55. Тарасенко ВС, Никитенко ВИ, Кубышкин ВА. Острый панкреатит и транслокация бактерий// Вестник хирургии, с 86-89, 2000

56. Хейфец Ю.Б. Методические рекомендации по применению магнитно-инфракрасно-лазерного аппарата квантовой терапии. Москва, ПКП ГИТ, 1999

57. Хопельман А, Гирлингс с. Инфекции мочевыводящих путей при сахарном диабете// КМАХ, том 2, №2, 2000

58. Чеснокова ВЛ. Варианты штамма E.coli М17, перспективные для получения эубиотиков// Дисс на соиск уч ст кмн, М. 1998

59. Чхаидзе И. Г., Лиходед В. Г., Лиходед М. В. с соавт. Корректирующее действие антител при экспериментальном кишечном дисбактериозе.//ЖМЭИ.- 1998.- №14. С. 12-14

60. Шендеров Б.А. Значение колонизационной резистентности в патогенезе инфекционных заболеваний // Иммунология инфекционного процесса. М.,.С. 112121,1994

61. Шендеров БА. Медицинская микробная экология и функциональное питание//1, с 38-39, М. Грантъ, 1998

62. Шептулин АА. Синдром избыточного роста бактерий и «дисбактериоз кишечника»: их место в современной гастроэнтерологии// Росс Журнал-гастроэнтерол гепатол колопроктол, №3, с. 51-54, 1999

63. Юхименко ЛН, Завгородняя ЕФ, Троп ИЕ, Бондаренко АП. Определение колициногенности микрофлоры кишечника при отсутствии приживаемости штаммов E.coli М-17 и безуспешного лечебного применения колибактерина.// Хабаровск. -1979

64. Ющук НД, Бродов ЛЕ. Лечение острых кишечных инфекций// М. 1998

65. Acheson DW, Levine ММ, Карег JB, Keusch GT. Protective immunity to Shiga-like toxin I following oral immunization which Shiga-like toxin I subunit-producting Vibrio cholerae CVD 103-HgR// Infect. Immun., 64:355-357, 1996

66. Adams MR. Safety of industrial lactic acid bacteria// J Biotechnol Feb 19;68(2-3):171-8, 1999

67. Adleberth I, Ahme S, Johasson ML et al. A mannose-specific adherence mechanism in L.plantarum conferring binding to the human colonic cell line HT-29// Appl.Environ.Microbiol., 62(7):2244-2251, Jul 1996

68. Akao T, Mizuki E, Yamashita S, Kim HS, Lee DW. Specifity of lectin activity of bacillus thuringuensis parasporal inclusion proteins// J.Basic.Microbiol., 41(1):3-6, 2001

69. Alvarez-Olmos Ml, Oberhelman RA. Probiotic agents and infectious diseases: a modern perspective on a traditional therapy// Clin Infect Dis, 1, 32 (11), 1567-76, Jun 2001

70. Ammon A, Petersoen LR, Kareh H. A large outbreak of hemolytic uremic syndrome caused by an unusual sorbitol-fermenting strain of E.coli 0157:H-// J. Infect. Dis., 179 (5): 1274-1277, May 1999

71. Andersson B. Attachment of Streptococcus pneumoniae to human pharyngeal epithelial cells// Lang and Respir., 5, #1, p. 13-14, 1988

72. Apostolou E, Kirjavainen PV, Saxelin M, Ruatelin H, Valtonen V, Salminen SJ, Ouwehand AC. Good adhesion properties of probiotics: a potential risk for bacteremia//FEMS Immunol Med Microbiol, 31(1), 35-39, Jul 2001

73. Armstrong GL, Hollingsworth J, Morris JG. Emerging food borne pathogens: E.coli 0157:H7 as a model of entry of a new pathogen into the food supply of the developed world//Epidemiol. Rev. 18:29-51,1996

74. Arne P, Marc D, Bree A et al. Increase tracheal colonization in chicken without impairing pathogenic properties of avian pathogenic E.coli MT78 with a fimH deletion// Avian Diseases, 44(2): 343-355, Apr-Jun 2000

75. Aronson M, Medalia O, Schori L, Millerman D et al. Prevention of colonization of the urinary tract of mice with E.coli by blocking of bacterial adherence with methyl 6-D-mannopyranoside//J Ifect Dis, v 139, p329, 1979

76. Asahara T, Nomoto K, Watamiki M et al. Antimicrobial activity of intraureally administrated probiotic L.casei in a murine model of E.coli UTI// J.Antimicrob.Agents.Chemother., 45(6):1751-1760, Jun 2001

77. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA. Short Protocols in Molecular Biology, 4th edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons Inc., New York. 1999

78. Avlami A, Kordossis T, Vrizidis N, Sipsas NV. Lactobabacillus rhamnosus endocarditis complicating coloscopy// J.Infect, 42(4):283-285, May 2001

79. Bai X, Liu X, Su Y. Inhybitory effects of intestinal mucus on bacterial adherence cells after surface burns// Clin. Med. J., May, 113(5):449-450, 2000

80. Bailey MT, Сое CL. Maternal separation disrupts the integrity of the intestinal microflora in infant rhesus monkeys// Dev Psychobiol Sep;35(2): 146-55, 1999

81. Barbes C, Boris S. Potential role of lactobacilli as prophylactic agents against genital pathogens//AIDS Patient Care STDS, 13(12):747-751, Dec 1999

82. Bautista-Garfias CR et al. Effect of viable or dead Lactobacillus casei organisms administrated orally to mice on resistance against Trichinella spiralis infection// Parasite 8, S226-8, Jun 2001

83. Bell PB et all. A multistate outbreak of E.coli 0157:H7-assosiated bloody Diarrhea and hemolytic Uremic Syndrome from hamburgers//JAMA, 272:1349-1353, 1994

84. Benenson AS. Control of communicable disease manual// 16ed Washington: American Public Health Association, 141-144, 1995

85. Bengmark S. Ecological control of the gastrointestinal tract. The role of probiotic flora// Gut Jan;42(1):2-7,1998

86. Berdgey's Manual of Systematic bacteriology// vol. 3, Ed. JT Staley-1010

87. Berg RD. Bacterial translocation from the intestines//Jikken Dobutsu, 34:1:1-16, 1985

88. Beuth J, Ко HL, Shroten H et al. Lectin mediated adhesion of Streptococcus pneumoniae and its specific inhibition in vitro and in vivo// Zbl.Bakt.Hyg., 265, 160168, 1987

89. Blackwell CC, Dundas S, James VS, Mackenzie DA, Braun JM, Alkout AM, Todd WT, Elton RA, Weir DM. Blood Group and Susceptibility to Disease Caused by Escherichia coli 0157// J Infect Dis Feb 1;185(3):393-6, 2002

90. Blanc-Pottard AB, Solomon F, Kayser J, Groisman EM J. Bacteriol., v.181, p. 9981004, 1999

91. Boedeker EC. Adherent bacteria: breaching the mucosal barrier?// Gastroenterology Jan; 106(1 ):255-7, 1994

92. Bourdaillez B, Berquin P, Mariani-Kurjian P, Bef D, Cuvelier B, Capek J. Possible person-to-person transmission of E.coli 0111-assosiated hemolytic uremic syndrome// Pediatr.Nephrol., 11:36-39, 1997

93. Boyd AC, Archer JA, Sherratt DJ. Characterization of the Col E1 mobilization region and its protein products// Mol.Gen.Genet., v.217, p. 488-498, 1989

94. Bradley DE. Colicinogeny of 0157:H7 enterohemorrhagic E.coli and the shielding of colicin abd phage receptors by their O-antigenic side chain// Can.J.Microbiol., 37:97104,1991

95. Bricon TL. Laboratory identification and measurement of urinary proteins.//Ann Biol Clin (Paris) Sep-0ct;60(5):525-40, 2002

96. Broda P. Plasmids// Oxford San Francisco: Freeman and Co., p. 188, 1989

97. Caprioli A, Luzzi J, Rosmini F, Resti С et al. Community wide outbreak of hemolytic-uremic syndrome associated with non 0157 verotoxin-producing E.coli// J Infect Dis, 169:208-211, 1994

98. Chan PT, Ohmori H, Tomizawa J, Lebowitz J. Nucleotid sequence and gene organization of Col E1 DNA//J Biol Chem, v 260, p 8925-8935, 1985

99. Charatan F. New York outbreak of E coli poisoning affects 1000 and kills two// BMJ;319:873, 2 October, 1999

100. Chart H, Scotland S, Rowe B. Serum antibodies to E.coli serotype 0157:H7 in patients with hemolytic uremic syndrome// J Clin Microbiol 27-285-290, 1989

101. Chick S, Harber MJ, Mackenzie R, Asscher AW. Modified method for studying bacterial adhesion to isolated uroepithelial cells and uromucoid// Infect Immun Oct;34(1):256-61, 1981

102. Coad NAG, Marchall T, Rowe B, Taylor CM. Changes in the post-enteropathie form of the haemolytic-uremic syndrome in children//Clin Nephrol; 35:10-6, 1991

103. Cohen PS, Laux DC. Bacterial adhesion to and penetration of intestinal mucus in vitro// Methods Enzymol;253:309-14, 1995

104. ЮЭ.СотКй de malaies infectieuses d'immunisation, SCP. L'escherichia coli 0157:H7, les autres colibacilles verotoxinogenes et le syndrome hemolitique et uremique chez I'enfant// No de reference: ID95 03

105. Сгау CW. Experimental infection of calves and adult cattle with E.coli 0157:H7// Appl Environ Microbiol 61:1585-1590, 1995

106. Darouich RO, Hull RA. Bacterial interference for prevention of UTI// J Spinal Cord Med, 23(2): 136-141, Summer 2000

107. Davidson GP, Butler RN. Probiotics in pediatric gastrointestinal disorders// Curr Opin Pediatr Oct;12(5):477-81, 2000

108. H5.Davidson GP, Butler RN. Probiotics in pediatric gastrointestinal disorders// Curr Opin Pediatr, 12(5):477-481, Oct 2000

109. Davidson VL, Cramer WA, Brunden KR, Cohen FS. Studies of the mechanism of action о channel-forming colicins using artificial membranes// J Membr Biol, v 79, p 105-118, 1984

110. H9.Dougan G, Saul M, Warren G, Sherratt G. A functional map of plasmid ColE1// Mol Gen Genet, v 158, p325-327, No 3, 1978

111. Doyle MP, Zhao T, Harmon BG, Brown CA.: Control of enterohemorrhagic E. coli 0157:H7 in cattle by probiotic bacteria and specific strains of E. coli// US5965128

112. Doyle RJ. Contribution of the hydrophobic effect to microbial infection// Microbes and Infection, Apr.;2(4):391-400, 2000

113. Drago L, Gismondo MR, Lombardi A et al. In hibition of in vitro growth of enteropathogen by new lactobacillus isolates of human intestinal origin// FEMS microbial Lett, 15:153(2):455-463, 15 Aug 1997

114. Duncan SH, Doherty CJ, Govan JRW, Neogrady S et al. Characteristic of sheep-rumen isolates of Pseudomonas aeruginosa inhibitory to the growth of E.coli 0157// FEMS Microbiology letters, v180, No2, 15 November 1999

115. Ebina Y, Takahara Y, Kishi Y et al. Lex A protein is a repressor of the colicin E1 gene// J Biol Chem v 258, p 13258-13261, 1983

116. Elliott SJ, Krejany EO, Mellies JL, RobinsBrowne RM et al. Esp G, a novel type III system-secreted protein from Enteropathogenic Escherichia coli with similarities to VirA of Shigella flexneri// Infect Immun, Jun, 69(6):4027-4033, 2001

117. Farina C, Arosio M, Mangia M, Moioli F. Lactobacillus casei subsp. rhamnosus sepsis in a patient with ulcerative colitis//J Clin Gastroenterol, Sept, 33(3):251-2, 2001

118. Fitzpatrick M. Haemolytic uraemic syndrome and E coli 0157// BMJ, p. 684-685,v. 318 13 March 1999

119. Fitzpatrick MM, Shan VS, Trompeter RS, Dillon MJ et al. Long term renal outcome of childhood haemolitic uremic syndrome// BMJ, 303:489-492, 1991

120. Flores FX, Jabs K, Thorne GM, Jaeger J, Linshaw MA, Somers MJG. Immune response to Escherichia coli 0157:H7 in hemolytic uremic syndrome following salmonellosis// Pediatr Nephrol 11: 488-490, 1997

121. Fowler JE, Mariano M, Lau JL. Interaction of urinary Tamm-Horsfall protein with transitional cells and transitional epithelium//J Urol Aug;138(2):446-8, 1987

122. Fuller R. Probiotics in human medicine.// Gut. 32 №4. -p.439-42, 1991

123. Fuller R. Probiotics in man and animals.//J. Appl. Bacter. 66 №5. -p.365-70,1989

124. Fung D, Kang D// Pat No WO 1999US0018524 USA 24 Feb 2000

125. Geerlings SE, Meiland R, van Lith EC, Brouwer EC, Gaastra W, Hoepelman Al. Adherence of type 1-fimbriated Escherichia coli to uroepithelial cells: more in diabetic women than in control subjects// Diabetes Care Aug;25(8):1405-9, 2002

126. Gentilini M. Miidecine tropicale// Frarace, Paris, p 790-804, 1993

127. Genyo M, Torao M. Health beverage containing wasabia japonica or western mustard// Pat of Jap, 1998

128. Gianantonio C, Vitaceo M, Mendilaharzu F et al. The hemolytic-uremic syndrome// Nephrol, 11:174-193, 1973

129. Griffin PM, Tauxe RV. The epidemiology of infections caused by E.coli, and the associated hemolytic-uremic syndrome//Epidemiol Rev,13:60-98, 1991

130. Hammermuller JD, Gyles CL. Recent advances in verotoxin-producing E.coli infections//Elsevier Sci. BV, p113-116, 1994

131. Jann K, Schmidt G, Blumenstock E, Vosbeck K. Escherichia coli adhesion to Saccharomyces cerevisiae and mammalian cells: role of piliation and surface hydrophobicity// Infect Immun May;32(2):484-9, 1981

132. JASR. Verotoxin-producing E.coli, January 1991 November 1995, Japan//v 17, No 1, Jan 1996

133. Johnson J., Weissman S., Steel A. et al. Clonal and Pathotypic Analysis of Archetypal Escherichia coli Cyctitis Isolate NU14// The Journal of Infectious Diseases, 184, p. 900-908, 2001

134. Jones R, Ellbogen M, Dunlay R. Lactobacillus allograft pyelonephritis and bacteremia// Nephron, 86(4):502, Dec 2000

135. Jshibashi N, Yamazaki S. Probiotic and safety// Am J Clin Nutr, 73 (suppl), p 46594709, 2001

136. Kakkos SK et al. Nonabsorbable antibiotics reduce bacterial and endotoxin translocation in hepatectomised rats HPB//Surg, 10:5:283-289-291, 1997

137. Капо H, Kaneko T, Kaminogawa S. Oral intake of Lactobacillus delbruecki subsp. Bulgaricus OLL1073R-1 prevents collagen-induced arthritis in mice// J Food Prot 65(1): 153-60, Jan 2002

138. Kaplan BS, Cleary TG, Obrig TG. Recent advances in understanding the pathogenesis of the hemolytic-uremic syndromes// Pediatr nephrol, 4, 276-283,1990

139. Karch H, Schubert S, Zhang D, Zhang W, Schmidt T, L|lschlflger T, Hacker J. A Genomic Island, Termed High-Pathogenicity Island, Is Present in Certain Non-0157

140. Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Clonal Lineages// Infection and Immunity, November, p. 5994-6001, Vol. 67, No. 11, 1999

141. KarchH, Heesemann J, Laufs R, O'Brien AD et al. A plasmid of enterihemorrhagic E.coli 0157-H7 is required for expression of a new fimbrial antigen and for epithelial cells// Infect Immun, 55, 455-461, 1996

142. Karmali MA. Infection by verotoxin-producind E.coli// Clin microbial Rev, 2:15-38, 1989

143. Kasai K, Galton J, Terasaki PI et al. Tissue distribution of the Pk antigen as determined by a monoclonal antibody//J Immunogenet, 12:213-220, 1985

144. Каиг IP, Chopra K, Saini A. Probiotics: potential pharmaceutical application// Eur J Pharm Sci, 15(1):1-9R, Feb 2002

145. Kirjavainen PV, Ouwehand AC, Isolauri E, Salminen SJ. The ability of probiotic bacteria to bind to human intestinal mucus// FEMS Microbiol Lett Oct 15; 167(2): 185-9, 1998

146. Klaasen H.L., Van der Heijden F.J., Stok W. et al Apathogenic, intestinal, segmented, filamentous bacteria stimulate the mucosal immune system of mice// Infect. Immun. 61, N 1. P. 303-306, 1993

147. Korhonen Т. K., Leffler H., Svanborg C. et al. Binding specifity of palliated strains of E.coli and S.typhimurium to epithelial cells, Saccharomyces cerevisiae cells, and erythrocytes// Infect. Immun., vol. 82, p. 796-804, 1981

148. Kornegay E.T., Thomas H.R. Bacterial and yeast preparations for starter and grower rations // Virginia polytechnic Institute and State University, Research Division Report, N 151. Blacksburg, Virginia, USA, 1973

149. Lilly D.M., Stillwell R.H. Probiotics: Growth promoting factors produced by microorganisms//Science 147.- P.747-748, 1965

150. Linwood CA, Law H, Richardson S et al. Glycopeptid binding of purified and recombinant E.coli produced verotoxin in vitro//J Biol Chem, 262, 8834-8839, 1987

151. Litalien С, Proulx F, Mariscalco MM, Robitaille P, Turgeon JP, Orrbine E, Rowe PC, McLaine PN, Seidman E. Circulating inflammatory cytokine levels in hemolytic uremic syndrome// Pediatr Nephrol 13:840-845, 1999

152. Ludwig K, Bitzan M, Zimmermann S, Kloth M, Ruder H, Mbller-Wiefel DE. Immune response to non-0157 vero toxin-producing E.coli in patients with hemolytic-uremic syndrome//J Infect Dis, 174:1028-1039, 1996

153. Mack DR, Michail S, Wei S, McDougall L, Hollingsworth MA. Probiotics inhibit enteropathogenic E. coli adherence in vitro by inducing intestinal mucin gene expression//Am J Physiol Apr;276 (4 Pt 1):G941-50, 1999

154. Madsen KL. The use of probiotics in gastrointestinal disease// Can J Gastroenterol, 15(12):817-22, Dec 2001

155. Mark DR, Michail S, Wei S, Mc Dougall L. Probiotics inhibit enteropathogenic E.coli adherence in vitri by including intestinal mucin gene expression// Am J Physiol, 276(4 Pt 1): G 941-50, Apr 1999

156. Matsumoto M, Tani H, Ono H, Ohishi H, Bonno Y. Adhesive property of bifidobacterium lactis LKM 512 and predominant bacteria of intestinal microflora to human intestinal mucin// Curr Microbiol, 44(3), 212-215, March, 2002

157. Matsumura A, Saito T, Arakuni M, Kitazawa H, Kawai Y, Itoh T. New binding assay and preparative trial of cell-surface lectin from Lactobacillus acidophilus group lactic acid bacteria//J Dairy Sci Dec;82(12):2525-9, 1999

158. Matsuzaki T, Chin J. Modulating immune response with probiotic bacteria// Immunol Cell Biol, 78(1):67-73, Feb 2000

159. Matsuzaki T, Chin J. Modulating immune responses with probiotic bacteria// Immunol Cell Biol Feb;78(1):67-73, 2000

160. Mc Cormick BA, Franclin DP, Laux DC, Cohen PC. Type I pili are not necessary for colonization of the streptomycin-treated mouse large intestin by type I -piliated E.coli F-18 and E.coli K-12// Infect Immun, v 57, p3022-3029, 1989

161. Mclnnes C, Engel D, Martin RW. Fimbriae damage and removal of adherent bacteria after exposure to acoustic energy// Oral Microbiol Immunol, 8(5):277-282, Oct, 1993

162. Мепд J et al. Competitive exclusion as a method of prevent colonization of E.coli 0157:H7 in cattle// Society for Industrial Microbiology Ann Meeting, Jul 1996

163. Mitsuoka T. Intestinal flora and host//Asian Med. J. 31, N 7. P. 400-409, 1988l81.Mobasselech M, Keusch GT, Seall E. Recent advances in verotoxin-producing E.coli infections// Elsevier Sci BV, p 159-162, 1994

164. Mombelli B, Gimondo MR. The use of probiotics in medicinal practice// Int J Antimicrob Agents 16 (4):531-6, Dec 2000

165. Mukai T, Asasaka T, Sato E et al. Inhibition of binding of Helicobacter pylori to the glicolipid receptors by probiotic Lactobacillus reuteri// FEMS Immunol Med Microbiol, 32(2):105-110,14 Jan 2002

166. Murinda SE. Evaluation of colicins for inhibitory activity against diarrhegenic E.coli starins, including serotype 0157:H7//Appl Environ Microbiol, 62:3196-3202, 1996

167. Myron M et al. A DNA probe to identify Enterohemorrhaggic E.coli of 0157:H7 and other serotypes that cause hemorrhagic colitis and hemolytic-uremic syndrome// J of Inf Dis, v 156, No1, p 175-182, July 1987

168. Nakayama M, Itoh K, Takabashi E. Cyclophosphamid induced bacterial translocation in E.coli C25-monoassociated specific pathogen-free mice// Microbiol Immunol, 41:8:587-593, 1997

169. Nataro JP, Kaper JB. Diarrhegenic E.coli//Clin Microbiol Rev, 11, 142-201, 1998

170. Neeser JR, Granato D, Rouvet M, Servin A, Teneberg S, Karlsson KA. Lactobacillus johnsonii La1 shares carbohydrate-binding specificities with several enteropathogenic bacteria//Glycobiology Nov;10(11): 1193-9, 2000

171. Neeser JR, Granato D, Rouvet M, Servin A, Teneberg S. Lactobacillus johnsonii La1 shares carbohydrate-binding specificities with several enteropathogenic bacteria// Glycobiology, 10(11):1193-1199, Nov 2000

172. Neill MA, Christye DL, Tarr PI et al. Subclinical hemolytic uremic syndrome in causes of hemorrhagic colitis with E.coli 0157:H7// Int Symposium and workshop on verotoxin-producing E.coli infections. Toronto: Jul 1987

173. Netherwood T, Bowden R, Harrison P, O'Donnell AG, Parker DS, Gilbert HJ. Gene Transfer in the Gastrointestinal Tract// Applied and Environmental Microbiology, November, p. 5139-5141, Vol. 65, No. 11, 1999

174. Netherwood T, Bowden R, Harrisson P, O'Donnel AG et al. Gene transfer in the gastrointestinal tract//Appl Env Microbiol, v 65, No 11, p 5139-5141, Nov 1999

175. Newburg DS, Chaturvedi P, Lopez EL et al. Susceptibility to hemolytic-uremic syndrome relates to erythrocyte glycophospholipid patterns// J Infect Dis, 168:476-9, 1993

176. Pai CH, Gordon R. Sporadic cases of hemorrhagic colitis associated with E.coli 0157:H7//Ann Intern Med, 101:738-42, 1984

177. Рак J, Pu Y, Zhang ZT et al. Tamm-Horsfall protein binds to type I fimbriated E.coli and prevents E.coli from binding to uroplakin la and lb receptors// J Biol Chem, 30, 276(13):9924-3, Mar 2001

178. Parker R.B. Probiotics, the other half of the antibiotics story// Animal Nutrition and Health. 29. P.4-8, 1974

179. Pat No 10147536 (1998). Agent for disease caused by bacterial toxin

180. Pat No 10265394 (1998) JN. Medicine for preventing and treating enterohemorrhagic E.coli infected disease

181. Pat No 10287521 (1998) 0157 bactericine and its production

182. Pat No 10298105 (1998). Preventing and curing agent for infectious disease caused by enterohemorrhagic E.coli

183. Pat No 10330267 (1998). Verotoxin-neutralizing agent

184. Pat No 5747293 (05.05.98) GB. Intimin-like proteins of E.coli

185. Pat No 5750118 (12.05.1998) France. Vaccine method against swine dysentery

186. Pat No 9805329 (29.1099) France. Sequence nucleotidique pour la detection de E.coli enterohemorrhagique (EHEC)

187. Pat No JP 11009281 (1999). Oligonucleotyide for detecting bacteria and process utilizing the same

188. Pat No US 5798260 (25.08.98) USA. E.coli 0157:H7 epithelial adhesin

189. Rasavi B, Shilling M. Chondritis attributable to Lactobacillus after ear piercing//Diagn Microbiol Infect Dis, 37(1):75-76, May 2000

190. Regan S, Chesney RW, Kaplan BS et al. Red cell membrane phospholipid abnormalities in the hemolilytic-uremic syndrome// Clin Nephrol, 15:14-17, 1980

191. Reid G. probiotic agents to protect the urogenital tract against infection// Am J Clin Clin Nutr, 73 (suppl), 437s-443s, 2001

192. Reid G. Probiotic Therapy and Functional Foods for Prevention of Urinary Tract Infections: State of the Art and Science// Curr Infect Dis Rep Dec;2(6):518-522, 2000

193. Riley LW, Remis RS. Hemorrhagic colitis associated with a rare E.coli serotype// N Eng J Med, 308:681-5, 1983

194. Riley MA, Wertz JE. Bacteriocin diversity: ecological and evolutionary perspectives// Biochimie 84, 357-364, 2002

195. Rocha F, Laughlin R, Musch MW et al. Surgical stress shifts the intestinal E.coli population to that of a more adherent phenotype: role in barrier regulation// Syrgery 2001, 130(1 ):65-73, Jul 2001

196. Rogers A.L. and Kennedy M.J. Opportunistic Hyaline Hyphomycetes. In the book "Manual of Clinical Microbiology", 8 Ed. // American Soc.for Microbiology, Washington, D.C.-1991 .-P.659-673

197. Rolph HJ, Lennon A, Riggio MP et al. Molecular identification of microorganisms from endodontic infections//J Clin Microbiol, 39(9):3282-9, Sep 2001

198. Santii publique. Une nouvelle source d'infection par Escherichia coli//

199. Schaechter M., Medoff G., Eisenstein B.l.//Mechanisms of Microbioal Disease -2 nd ED. Baltimore, 1991

200. Schembri M, Hasman H, Klemm P. Expression and purification of the mannose recognition domain of the FimH adhesin / FEMS Microbiology Letters ,v.188 p147,2000

201. Schembri M., Hasman H.p Klemm P. / Expression and purification of the mannose recognition domain of the FimH adhesin / FEMS Microbiology Letters, 2000,v.188 p147.

202. Sekiya J. Escherichia coli 0157:H7 chez les animaux de rente au Japon// Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 16 (2), 391-394, 1997

203. Sonnenborn U et al. Antagonismus von E.coli gegen andere Mikroorganismen// In Beeziehungen zwischen Wirtsorganismus und Darmflora, 2nd Ed. Stuttgart-NY, p55-69, 1991

204. Spencer RJ, Chesson A. The effect of Lactobacillus spp. on the attachment of enterotoxigenic Escherichia coli to isolated porcine enterocytes// J Appl Bacteriol 1994 Aug;77(2):215-20

205. Suzuki K, Bakaletz LO. Synergistic effect of adenovirus type 1 and nontypeable Haemophilus influenzae in a chinchilla model of experimental otitis media// Infect. Immun., May, 1710-1718, Vol 62, No. 5, 1994

206. Tachikawa T, Seo G, Nakazawa M, Sucyoshy M, Ohishi T, Joh K. Estimation of probiotics by infection model of infant rabbit with enterohemorrhagic E.coli 0157:H7// Kansenshogaku Zasshi, 72(12): 1300-1305, Dec 1998

207. Tachikawa T, Seo G, Nakazawa M, Sueyoshi M, Ohishi T, Joh K. Estimation of probiotics by infection model of infant rabbit with enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7.// Kansenshogaku Zasshi, 72(12): 1300-5, Dec1998

208. Takahashi M, Taguchi H, Yamaguchi H, Osaki T, Sakazaki R et al. Antagonistic interaction between Clostridium butyricum and Enterohemorrhagic E.coli 0157:H7// Kansenshogaku Zasshi, 73(1):7-14, Jan 1999

209. Takahashi M, Taguchi H, Yamaguchi H, Osaki T, Sakazaki R, Kamiya S. Antagonistic interaction between Clostridium butyricum and enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7.// Kansenshogaku Zasshi, 73(1):7-14 Jan 1999

210. Tanzer JM, Livingston J, Thompson AM. The microbiology of primary dental caries in humans// J Dent Educ, 65(10):1028-37, Oct 2001

211. Tarr P, Bilge SS, Besser ТЕ, Vary JrC. Escherichia coli 0157:H7 epithelial adhesin// US5798260

212. Tarr P, Fouser LS, Stapleton AE et al. Hemolytic uremic syndrome in a six-year old girl after an urinary tract infection with shiga-toxin-producing E.coli 0193:H2// N Eng J Med, 335:635-638, 1996

213. Tarr P, Neill MA, Clausen CR et al. E coli 0157:H7 and the hemolytic uremic syndrome: importance of early cultures in establishing the etiology// J Infect Dis,162:553-556, 1990

214. Tiina I. Karu Tl, Pyatibrat LV, Ryabykh TP. Nonmonotonic behavior of the dose dependence of the radiation effect on cells in vitro exposed to pulsed laser radiation at = 820 nm// Lasers in Surgery and Medicine, Volume 21, Issue 5, p 485-492, 1999

215. Tuomola EM, Ouwehand AC, Salminen SJ. Chemical, physical and enzymatic pre-treatments of probiotic lactobacilli alter their adhesion to human intestinal mucus glycoproteins// Int J Food Microbiol Sep 15;60(1):75-81, 2000

216. Tuomola EM, Ouwehand AC, Salminen SJ. The effect of probiotic bacteria on the adhesion of pathogens to human intestinal mucus// FEMS Immunol Med Microbiol Nov;26(2): 137-42, 1999

217. Tuomola EM, Salminen SJ. Adhesion of some probiotic and dairy Lactobacillus strains to Caco-2 cell cultures// Int J Food Microbiol May 5;41(1):45-51, 1998

218. Tuttle J, Gomez PM, Doyle MP et al. Lesson from a large outbreak contamination of hamburger patties// Epidemiol and Infect, 122 No 2, p 185-192, 1999

219. Vernozy-Rozand C. Les Escherichia coli viirotoxiques (VTEC) et Escherichia coli 0157:H7 en clinique et en agro-alimentaire// ABC -Annales de Biology Clinique, Numiiro 5 Septembre - Octobre 1999

220. Verweyen HM, Allerberger HK, Zimmerhackl FLB. Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) in Pediatric Hemolytic-Uremic Syndrome: a Prospective Study in Germany and Austria// Infection 27, No.6, 341-348, 1999

221. Verweyen HM, Karch H, Allerberger F et al. Enterohemorrhagic E.coli (EHEC) in pediatric hemolytic-uremic syndrome: a prospective study in Germany and Austria// Infection No 6, p 341-347, 1999

222. Vilpponen-Salmela T, Alander M, Satokari R, Bjorkman P, Kontula P, Korpela R, Saxelin M, Mattila-Sandholm T, von Wright A. Probiotic bacteria and intestinal health: new methods of investigation// J Physiol Paris Mar-Apr;94(2): 157-8, 2000

223. Virkola R, Westerlund B, Holthufer H et al. Binding Characteristics of E.coli adhesions in human Urinary bladder// Inf Imm, p 2615-2622, Oct 1988

224. Virkola R., Westerlund В., Holthofer H. et al. Binding Characteristics of Escherichia coli Adhesins in Human Urinary Bladder// Infection and Immunity, Oct., Vol.56, No. 10, p. 2615-2622, 1988

225. Waddell T, Head S, Petric M et al. Globotriosil ceramide is specifically recognized by the E.coli verotoxin 2// Biochem Biophys Res Commun, 15:674-679, 1988

226. Walterspiel JN, Ashkenazi S, Morrow AL et al. Effect of subinhibitiry concentration of antibiotics on extracellular Shiga-like toxin I// Infection, 20:25-29, 1992

227. Watanabe H, Akito W, Yoshishige Inagaki et al. Outbreak of enterohemorrhagic E.coli 0157:H7 infection by two different genotype strains in Japan, 1996// The Lancet, v 348, 21 Sept 1996

228. Watanabe Y, Ozasa K, Mermin JH, Griffin PM, Masuda K, Imashuku S, Sawada T. Factory outbreak of Escherichia coli 0157:H7 infection in Japan// Emerg Infect Dis, 5(3):424-8 May-Jun 1999

229. Wetscherek W. Milchsaurebakterien statt antibiotika in der Kalbermast// Forderungsdienst 35, N 1. P. 19-21, 1987

230. Wolska-Duda I, Dulawa J, Kokot F. Urinary excretion of Tamm-Horsfall protein, albumin and beta-2 microglobulin in children with recurrent urinary tract infection.// Pol Merkuriusz Lek Jul;11(61):36-9, 2001

231. Wright von A, Salminen S. Probiotics: established effects and open questions// Eur J Gastroenterol Hepatol Nov; 11 (11): 1195-8,1999

232. Wu C, Li Z, Xiong D. Relationship between enteric microelogic disbiosis and bacterial translocation in acute necrotizing pancreatitis// World J Gastroenterol, 4(3) 242-245, Jun 1998

233. Wu C, Li Z. The pathogenesis of infection complicated by acute necrozing pancreatitis: an experimental study// Zhonghua Wai Ke Za Zhi 36(4):230-233, Apr 1998

234. Wu Q, Wang Q, Taylor KG, Doyle RJ. Subinhibitory concentrations of antibiotics affect cell surface properties of Streptococcus sobrinus// Journal of Bacteriology, Mar.; 177(5):1399-401, 1995

235. Yamamoto T, Fujita K, Yokota T. Adherence characteristics to Human small intestine mucosa of E.coli isolated from patients with diarrhea or urinary tract infections// JID, 162:896-908, 1990

236. Young J. European market developments in prebiotic- and probiotic-containing foodstuffs// Br J Nutr Oct;8Q(4):S231-3, 1998

237. Yu J, Kaper JB. Cloning and characterization of the eae gene of enterohemorrhagic E.coli 0157:H7//Mol Microbiol, 6:411-417, 1992

238. Zhanel GG, Nicolle LE. Effect of subinhibitory antimicrobial concentration (sub MIC) on in vitro bacterial adherence to uroepithelial cells// J Antimicrob Chemother, 29(6):617-27, Jun 1992

239. Zhang X, Rosenberg HM, Doyle RJ. Inhibition of the cooperative adhesion of Streptococcus sanguis to hydroxylapatite// FEMS, Sep. 15; 59(3):315-8, 1990

240. Zhao T, Doyle MP, Harmton BG, Brown CA et al. Reduction of Carriage of enterohemorrhagic E.coli 0157:H7 in cattle by inoculation with probiotic bacteria// J of Clin Microbiol, v 36, No 3, p 641-647, March 1998

Информация о работе

Колганова, Татьяна Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.07

Диссертация

Корректирующее действие пробиотиков при экспериментальном дисбактериозе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы