Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Приготовление питательных сред на основе гидролизата соевой муки для глубинного культивирования бактерий рода Bacillus

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Приготовление питательных сред на основе гидролизата соевой муки для глубинного культивирования бактерий рода Bacillus"

На правах рукописи

ВИШНЯКОВ Александр Валерьевич

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД НА ОСНОВЕ ГИДРОЛИЗ ATA СОЕВОЙ МуКИ ДЛЯ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS

03.00.23 - Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (МГАВМиБ) и Центре военно-технических проблем биологической защиты научно-исследовательского института микробиологии МО РФ (ЦВТП БЗ НИИМ).

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Грязнева Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты: Заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор Сидоров Михаил Анисимович; , , . ч доктор биологических наук Малик Нина Ивановна.

Ведущая оргаййзация - Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко» (ГНУ ВИЭВ).

Защита состоится_мая 2006 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д.220.042.01 в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины у биотехнологии имени К.И. Скрябина» (109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Тел. (095) 377-93-83).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГАВМиБ.

Автореферат разослан ^.апреля 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Т.Н. Грязнева

2QQgfr

1гаъ

з

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Разработка и совершенствование Технологий производства биопрепаратов является одной из важнейших задач1 отечественной медицины и ветеринарии. Это объясняется ростом заболеваемости людей и сельскохозяйственных животных инфекционными болезнями в условиях ухудшающейся эпидемической, эпизоотической и экологической обстановки, а также недостаточной эффективностью существующих лечебно-профилактических средств и их высокой стоимостью (Воробьёв A.A., 1997; Рогожин А.З., 2003; Bonomi А., 2002).

Одним из направлений биотехнологии как у нас в стране, так и за рубежом, является разработка и усовершенствование технологий производства биопрепаратов на основе бактерий рода Bacillus.

Практика применения пробиотиков на основе B.subtilis и B.licheni-formis при желудочно-кишечных болезнях человека и животных, а также объёмы их закупок за рубежом свидетельствуют о высокой эффективности и востребованности данных биопрепаратов (Смирнов В.В., 1993; Тихонов И.В. и др., 2004).

Немаловажное значение имеет совершенствование технологии' и увеличение производства вакцин против сибирской язвы, особенно в условиях нарастающей угрозы биотерроризма (Онищенко Г.Г., 2000; Бакулов И.А. и др., 2001; Beiton F., 1994).

Одним из направлений решения данного вопроса является стандартизация питательных основ и оптимизация компонентного состава питательных сред (ПС), применяемых для промышленного культивирования микроорганизмов. Стабильность культивирования бактерий рода Bacillus глубинным методом и свойства готовой формы биопрепарата зависят, наряду с качеством посевного материала и условий выращивания, от качества ПС, которое определяется физико-химическими, биологическими показателями и обусловливается стандартностью исходного сырья и технологией их приготовления.

Учитывая отмеченное, проблема разработки новых ПС для увеличения производства и снижения стоимости пробиотических и вакцинных препаратов на основе бактерий рода Bacillus является весьма актуальной для народного хозяйства РФ.

Цель и задачи исследований. Цель исследований - разработка технологии приготовлейия питательных сред на основе гидролизата соевой муки для глубинного культивирования бактерий'рода Bacillus при производстве пробиотических и вакцинных препаратов.

Для достижения пос+авЛенной цели необходимо было решить следующие задачи: - '

1. Разработать сбалансированный компонентный состав питательных сред на основе гидролизата соевой муки для глубинного способа выращивания бактерий рода Bacillus.

2. Определить условия гидролиза соевой муки и изучить физико-химические, биохимические и биологические показатели полученных гидролизатов.

3. Оптимизировать состав питательных сред для глубинного культивирования бацилл в биореакторах.

4. Оптимизировать параметры и режимы глубинного способа культивирования различных видов и штаммов бацилл в разработанных питательных средах.

5. Определить показатели, характеризующие стадию завершения культивирования бацилл в разработанных питательных средах.

6. Оценить биологическую активность готовых лекарственных форм препаратов Биоспорин и Биод-5, полученных из культур микроорганизмов, выращенных в разработанных питательных средах.

7. Обосновать экономическую целесообразность внедрения в производство новых питательных сред для глубинного культивирования бактерий рода Bacillus.

Научная новизна. Впервые разработан компонентный состав питательных сред В1 и В2 на основе гидролизата соевой муки для глубинного выращивания в биореакторах B.subtilis, B.licheniformis и B.anthracis. Разработанные среды являются стандартизированными и отвечают питательным потребностям указанных микроорганизмов при их росте и спорообразовании.

Определены условия солянокислотного гидролиза соевой муки, позволяющие получить гидролизаты с содержанием аминного азота не менее 4,0 г/л.

Оптимизированы параметры и режимы глубинного способа культивирования в питательных средах В1 и В2 культур вакцинных штаммов B.anthracis СТИ-1, B.anthracis 55-ВНИИВВиМ, а также культур пробиоти-ческих штаммов B.subtilis 3, B.subtilis ТПИ 13, B.licheniformis 31 и B.licheniformis ТПИ 11, обеспечивающие увеличение выхода биомассы бацилл в 1,7 раза, в сравнении с существующими технологиями.

При выращивании бацилл в биореакторах определены критерии оценки процесса завершённости накопления биомассы в средах В1 и В2 по водородному показателю, оптической плотности и терморезистентности клеток.

Практическая значимость. Для биотехнологической промышленности предложены стандартные среды В1 и В2, пригодные для культивиро-

вания трех видов бацилл: B.anthracis, B.subtilis и B.licheniformis.

Разработана и утверждена 18.07.2005 г. инструкция по приготовлению гидролизата соевой муки и питательных сред В1 и В2 для культивирования бактерий рода Bacillus.

Разработана и утверждена 04.08.2005 г. инструкция по оценке качества питательных сред В1 и В2.

Результаты исследований по созданию технологии приготовления питательных сред В1 и В2 включены в промышленные регламенты производства пробиотиков Биоспорин (утвержден 13.07.2002 г.) и Биод-5 (утвержден 14.01.2004 г.).

Разработаны сборники инструкций предприятия по оценке качества полуфабрикатов для приготовления, препаратов Биоспорин и Биод-5, утвержденные 12.09.2005 г.

Результаты исследований используются в учебном процессе на кафедре биотехнологии МГАВМиБ имени К.И. Скрябина при подготовке 9jy-дентов по специальностям 111201 - Ветеринария, 110401 - Зоотехния, 012200 - Биофизика, специализации «Ветеринарная биофизика»,; 012300 -Биохимия, специализации «Ветеринарная биохимия». t f. /,

Апробация результатов диссертации. Основные результаты изложены в 6 научных отчетах и доложены на научно-практическод, конференции, посвященной 75-летию НИИ микробиологии МО РФ ,(2003).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Теоретическое и экспериментальное обоснование компонентного состава питательных сред В1 и В2 для глубинного культивирования бактерий рода Bacillus.

2. Условия гидролиза соевой муки для приготовления питательных сред и оптимизация их состава.

3. Параметры и режимы глубинвдго способа культивирования различных видов и штаммов бацилл в разработанных ПС В1 и В2.

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 4 статьи, в т.ч. 2 - в научных журналах и 2 - в сборниках научных конференций.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 120 страницах и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (128 источников, из которых Юр^оте^ественньцс,^ 28 иностранных), приложения. Работа содержит 32 таблицы и 9 рисунков. , ,, ,. (,

» I и

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 2001 по 2005 год на кафедре биотехнологии МГАВМиБ и в Центре военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ.

В исследованиях использовали штаммы бацилл B.subtilis ТПИ 13, B.subtilis ВКПМ В-2335 (3), B.licheniformis ТЛИ 11, B.li'cheniformis ВКПМ В-2336 (31), B.anthracis СТИ-1 и B.anthracis 55-ВНИ-ИВВиМ, а также тест-штаммы - S.sonnei 5063, S.typhimurium 55, S.aureus 209, С.albicans ИМВ 690, полученные нами из коллекции ЦВТП БЗ НИИМ.

Для культивирования микроорганизмов использовали стандартные и модифицированные ПС, а также разработанные и приготовленные нами в ходе проведения исследований.

Контроль качества питательных основ и сред проводили согласно методическим рекомендациям ГИСК им. Д.А.Тарасевича (1987).

Контроль технологических процессов изготовления ПС осуществляли по методам, описанные Артюхиным В.И. с соавт. (1990).

Для приготовления гидролизата соевой муки (ГСМ) использовали соевую муку ГОСТ 3898-56. Кислотный гидролиз белкового сырья осуществляли во флаконах и эмалированных биореакторах объемом 0,15 и 0,3 м\ Осветление полученных гидролизатов проводили путем фильтрования через ткань бельтинг.

Эффективность гидролиза оценивали как отношение концентраций аминного азота к общему. Для определения подлинности белковых гидролизатов использовали реакции с биуретовым, фосфорно-вольфрамовым реактивом. Аминокислотный состав приготовленных гидролизатов определяли по методикам, описанным Телишевской Л.Я. (2000).

, Для сравнительной оценки качества разработанных ПС использовали среды X® 4 и № 7, применяемые для выращивания пробиотических штаммов B-subtilis и B.licheniformis.

Культивирование бацилл проводили во флаконах и в биореакторах «БИОР-0,1» и «БИОР-0,25».

Общую (ОК), биологическую (БК) концентрацию и термоустойчивость (BKt) микроорганизмов определяли методами, описанными Егоровым Н.С. (1990). Спорообразование (%) изучаемых бацилл рассчитывали как отношение БК к BKt.

Экспериментальные данные обрабатывали с помощью пакета компьютерных программ «Statistica 6,0» и анализом результатов по Ашмарину И.П. и Воробьеву А.А.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Выбор условий гидролиза соевой муки

В производстве пробиотиков Биоспорйн и Вйод-5, для выращйвЙния В.зиЫШв и В.ПсЬегийэптпз применяют Среды ПС № 4 и ПС № 7, соответственно, на основе гидролизата казеина (ГК) и кукурузного экстракта (КУК). Вакцинные сибиреязвенные штаммы культивируют на средах из мясного кислотного гидролизата, экстракта картофеля, пептона и др. Однако воспроизводимость процесса культивирования по выходу биомассы и спорообразованию при выращивании бацилл в данных средах варьирует в связи с нестандартностью применяемого сырья.

В связи с этим нами были проведены исследования по разработке ПС на основе ГСМ, которые удовлетворяли бы питательные потребности как пробиотических, так и вакцинных штаммов бацилл, обеспечивали их синхронное спорообразование и высокий выход биомассы.

На начальном этапе исследований в лабораторных условиях были приготовлены солянокислотные ГСМ с различной степенью расщепления белка. При выборе оптимальных условий гидролиза варьировали такими показателями, как концентрация соляной кислоты (2-6%), температура гидролиза (100-130°С), продолжительность (20-60 мин), при соотношении соевой муки и раствора соляной кислоты 1:5.

Было установлено, что эффективность гидролиза при 127°С, продолжительности 20 мин и 3 %-ной концентрация соляной кислоты дает возможность получить гидролизаты с содержанием аминного азота не менее 4,0 г/л (табл. 1).

1. Характеристика ГСМ, полученных при 127°С в течение 20 мин с различной концентрацией соляной кислоты

Концентрация Общий азот, г/л Аминный азот, г/л Аминный азот

НС1, % Общий азот

2 7,15±0,52 3,68±0,15 0,515

3 8,39±0,52 4,74±0,23 0,565

4 8,69±0,99 5,15±0,26 0,593

5 8,90±0,42 5,65±0,31 0,635

6 9,32±0,65 6,11±0,36 0,656

Из данных таблицы следует, что показатели отношения аминного азота к общему увеличиваются прямо пропорционально увеличению концентрации соляной кислоты. Следовательно, степень расщепления 1 соевого белка коррелирует с концентрацией соляной кислоты, используемо^ для гидролиза. ' " I

Изучение физико-химических й ростовых свойств экспериментальных образцов гидролизатов соевой муки

Для изучения аминокислотного, пептидного и минерального состава было приготовлено 3 серии 3%-ных солянокислотных ГСМ из различных партий соевой муки.

Из данных, представленных в табл. 2, следует, что приготовленные ГСМ содержат весь определяемый спёктр аминокислот и являются полноценной Основой для приготовления ПС для культивирования бактерий рода Bacillus.

При изучении гетерогенности пептидов в ГСМ в сравнительном аспекте, было установлено, что в образцах ГСМ содержание ростостимулирующих фракций пептидов с молекулярной массой от 500 до 1000 Дальтон составляет 32,8 % от общего содержания пептидов, против 18 % в ГК, что свидетельствует о высоких ростовых свойствах ГСМ, как основы ПС.

3. Минеральный состав ГСМ

Серия ГСМ Содержание минеральных веществ, %

Mg К Fe Zn Na Pb P Ca

1 0,030 0,36 0,94 1,78 5,48 0,03 0,013 0,17

2 0,028 0,38 0,96 1,71 5,55 0,06 0,016 0,24

3 0,030 0,37 1,03 1,73 5,47 0,02 0,017 0,19

Анализ минерального состава ГСМ (табл. 3) показал, что концентрации микроэлементов в различных сериях ГСМ близки по значениям, что свидетельствует о стандартности изучаемого белкового сырья

Далее необходимо было рценить рортррые сврйства ПС, приготовленных на основе ГСМ с различной степенью расщепления белков. Культивирование В.эиЫШз и В.ИсЬетйшшз проводили во флаконах, в

2. Аминокислотный состав ГСМ

Аминокислота Содержание аминокислоты в пробе

мкг/мл %

Аспарагиновая кислота 6838+205 13,67+0,41

Глутаминовая кислота 9487+285 19,00+0,57

Серии 2645+79 5,32+0,16

Глицин + треонин 2070+62 4,21+0,13

Гистидин 844+25 1,73+0,05

Алании 5229+157 10,48+0,32

Аргинин 3967+119 8,03+0,24

Тирозин 1824+55 3,66±0.11

Валин 2476+74 4,97+0,15

Метионин 959+29 1,88+0,06

Изолейцин 1884+57 3,80+0,11

Лейцин 5295+159 10,64+0,32

Фенилаланин 2984+90 5,96+0,18

Лизин 3300+99 6,55+0,20

Сумма аминокислот 49802+1494 100,00+3,0

средах, приготовленных по прописям ПС № 4 и № 7, соответственно, с исключением из их состава КУК и ГК и введением вместо них ГСМ. В качестве контрольных использовали ПС № 4 и № 7 (табл. 4).

4. Характеристика культур В. виЬ^Нв ТПИ 13, выращенных в ПС из ГСМ с различной степенью расщепления белка

ГСМ, % НС1 Через 24 ч культивирования Через 42'ч культивирования

ОП БК, млрд. кл/л БК„ млрд. кл/л ' Спорообразование, % ОП ,БК, млрд. кл/л млрд. кл/л Сцоро-образование, %

2 3 4 5 6 2,52±0,34 3,55±0,29 3,67±0,31 3,79±0,30 3,62±0,19 2,0±0,42 2,26±0,29 2,44±0,45 3,31±0,54 3,02+0,58 1,39±0,53! 2,15 ±0,8 1,94±0,24 2,56±0,36 2,36±0,49 69±13 95±10 79±8 77 ±¿1 ~78±15 3,76±0,22 4,28±0,19 4,24±0,15 3,81±0,18 4,16±0,29 3,68±0,44 3,95±0,42 3,75±0,56 4,53±0,68 4,55±0,55 1,93±0,28 1,93±0,17 3,60±0,43 3,63±0,39 4,0±0,65 50±7 50±5 96±12 80±9 87±15

ПС №4 3,68±0,18 2,0±0,74 1,52±0,79 76±9 3,93±0,23 3,24±1,01 2,92±1,19 90±16

При анализе полученных результатов можно заключить, что для выращивания В.виЫШз ТПИ 13 пригодны ПС на основе гидролизатов с различной степенью расщепленйя бе№а; однако при использовании 3%-ных солянокислотных ГСМ к 24 ч концентрация терморезистентных клеток достигала 95 %. Несмотря на то, что к 42 ч показатели БК и БК, бацилл при использовании 4-6%-ных ГСМ были выше, чем через 24 ч, наблюдался вторичный рост бацилл и неоднородность культуры. Кроме того, длительное культивирование было экономически нецелесообразным. По сравнению с ПС № 4 среды из ГСМ отличались более высокой продуктивностью по выходным параметрам культуральной жидкости (КЖ) В.зиЫШэ ТПИ 13. Аналогичные результаты были получены и при культивировании В.НсЬешйэгпш ТПИ 11.

Для оценки стандартности ГСМ в сравнительном аспекте были использованы различные партии соевой муки: полуобезжиренная дезодорированная (ГСМ серий №№ 1-4) и дезодорированная необезжиренная (ГСМ серий №№ 9-11). Характеристика гидролизатов приведена в табл. 5.

5. Физико-химические показатели различных серий ГСМ, полученных с использованием 3%-ной соляной кислоты

Се- Общий Аминный ^ам^^общ , Каль- Магний, Фосфор Сухой рн

рия азот, азот, ций, г/л г/л неорга- оста-

ГСМ г/л г/л нич., г/л ток, % /

1 2 _ 3 4 5 6 7 , 8 ' 9 А,.

1 8,05 4,00 .0,50 0,57 0,72 0,76 14,8 4,1

2 7,77 4,00 0,52 0,52 0,72 0,73 14,3

1 2 3 4 5 6 7 8 9

' 3 8,40 4,18 0,50 0,55 0,71 0,82 14,9 4,0

4 8,47 4,33 0,51 0,71 0,76 0,92 15,0 4,0

9 8,05 4,80 0,60 0,45 , 0,63 0,57 13,8 4,3

10 8,82 5,00 0,57 0,48 0,51 0,52 14,2 4,2

11 9,31 4,33 0,47 0,60 0,57 0,44 13,5 4,0

Х*1„ 8,41*0,52 4,38±0,39 0,52*0,05 0,55*0,9 0,66*0,09 0,68*0,17 14,4*0,6 4,Ш,1

Приготовленные ГСМ были близки по физико-химическим показателям.

В дальнейших исследованиях гидролизаты, приготовленные из различных партий соевой муки, были использованы для получения жидких ПС для культивирования В.атЬгас18, В.зиЫШя и В.НсЬешйэптш.

Среды на основе ПС № 4 и № 7, в которых КУК и ГК заменили 3%-ным солянокислотным ГСМ (по аминному азоту), получили рабочее название В1 и В2, соответственно. Штаммы В.БиЫШэ выращивали в среде В1, В.НсЬетГогппв - в среде В2, В.'аМЬшпк - как в среде В1, так и в среде В2 в течение (26±2) ч во флаконах. Для сравнения проводили культивирование бацилл в не модифицированных ПС № 4 и № 7 (табл. 6).

6. Характеристика культур бацилл, выращенных в ПС на основе ГСМ

из различных партий

Культура Серия ГСМ ОП БК, млрд. БКС, млрд. Спорообра-

, , , , кл./мл . кл./мл зование, %

В. БиЬиНз 9 3,2 3,24 1,95 60

ТПИ 13 И 3,6 3,50 2,01 58

1 4,0 3,60 2,10 58

- 3,6*0,4 3,45±0,19 2,02*0,08 59*1

В. НсЬешГоптш 9 6,0 5,40 3,00 56

ТПИ 11 И 5Д 5,94 2,91 50

1 6,7 7,04 4,91 70

- 5,9*0,8 6,13±0,84 3,6Ш,13 59*10

В.апйи^в 9 4,0 4,10 ' 2,10 90

СТИ-1 11 4,3 4,45 2,32 93

1 4,5 4,70 2,61 95

- 4,2*0,2 4,41 ±0,3 2,34*0,27 92*3

В.апймаав 9 3,2 3,24 2,16 80

55-ВНИИВВи^ 11 3,6 3,55 2,28 88

1 3,8 3,72 2,45 88

- 3,5*3,0 3,50*0,22 2,29±0,13 85*3

Анализируя полученные данные, можно отметить, что показатели ОП, БК и БЮ: нативных культур изучаемых бацилл при выращивании их в ПС на основе гйдролизатов из различных партий соевой муки, имели достоверно близкие результаты.

Таким образом, по данным проведенных исследований можно заключить, что 3 %-ные солянокислотные ГСМ имеют в своем составе факторы роста, необходимые для глубинного культивирования бактерий рода Bacillus и являются полноценными основами для получения ПС. Для приготовления ГСМ как основы ПС для культивирования пробиотических и вакцинных штаммов бацилл моЖет быть использована как полуобезжиренная так и необезжиренная соевая мука.

Оптимизация состава питательных сред для глубинного культивирования бацилл

Исследования по оптимизации состава разработанных ПС для разных видов и штампов изучаемых бацилл проводили в два этапа. На первом этапе изучали влияние содержания в ПС аминного азота и глюкозы на выход жизнеспособных и термоустойчивых клеток, на втором - минеральных элементов (Mg, Mn, Ca). При поиске оптимального состава ПС использовали метод планирования по схемам ортогональных латинских прямоугольников.

На первом этапе оптимизации ПС переменными величинами были концентрации ГСМ (по аминному азоту) и глюкозы, постоянными - концентрации солей (г/л: MgS047H20 - 0,375; MnS045H20 - 0,03; СаС126Н20 -0,8; FeS047H20 - 0,001). В качестве параметров оптимизации использовали показатели БК и BKt бацилл.

Было установлено, что при снижении концентрации аминного азота в ПС до 0,15-0,20 г/л и увеличении концентрации глюкозы до 16 г/л выход бацилл по БК и BKt возрастал, в среднем, в 1,7 раза. У изучаемых штаммов B.anthracis степень роста и спорообразования в среде В1 по интенсивности была аналогична таковой у B.subtilis. Абсолютные величины эффектов превышали значение доверительного интервала, что свидетельствует о значимости полученных результатов.

На втором этапе использовали ПС, содержащие 0,2 г/л аминного азота и 16 г/л глюкозы, варьируя концентрацией минеральных компонентов.

Максимальный выход биомассы B.subtilis и B.anthracis был получен в вариантах среды В1, содержащих, г/л: MgS047H20 - 0,1, MnS045H20 -0,035, СаС126Н20 - 0,8 и MgS047H20 - 0,7, MnS045H20 - 0,01, СаС126Н20 - 0,4, соответственно.

При выращивании B.licheniformis и B.anthracis в среде В2 было установлено, что увеличение концентрации аминного азота до 0,6 г/л и глюкозы до 27 г/л приводит к повышению выхода клеток по БК и BKt в 1,5-2,0 раза, однако спорообразование более синхронно происходит в ПС, содержащих 0,5 г/л аминного азота. Дополнительное введение в среду В2 солей

магния оказывало положительный эффект на накопление биомассы, но отрицательный - на спорообразование. Высокий положительный эффект наблюдался при введении в ПС 0,8 г/л СаСЬ-бНгО. Введение в ПС 0,02 г/л солей марганца оказывает положительное влияние на выход жизнеспособных и терморезистентных клеток. Дальнейшее увеличение концентрации солей марганца снижало уровень спорообразования бацилл.

В результате проведённых экспериментов были разработаны компонентные составы сред В1 и В2 для глубинного выращивания пробиотиче-скмх и вакцинных штаммов бацилл (табл. 7).

7. Компонентный состав сред В1 и В2 и разработанных ранее ПС № 4 и № 7

Наименование Концентрация компонента в среде, г/л

компонента В1 В2 №4 №7

(из расчета по аминному азоту) КУК ГК ГСМ 0,17 0,55 0,1 0,08 0,15 0,15

Глюкоза 16 27 11 21

Мв8047Н20 0,1 0,1 0,3 0,3

Мп8045Н20 0,01 0,02 0,25 0,25

СаС126Н20 V 0,4 0,8 0,4 0,4

Ре8047Н20 , Д),001 0,001 0,001 0,001

ЫаС1 1,0 1,0 1,0 1,0

Си$045Н20 0,001 0,001

Таким образом, среды В1 и В2, приготовленные на основе 3%-ного солянокислотного ГСМ, удовлетворяют питательные потребности изучаемых штаммов В.апйи-аав, В.зиЫШэ и В.НсЬетВэпшз и обеспечивают увеличение выхода биомассы бацилл при глубинном культивировании, в среднем, в 1,7 раза, в сравнении со средами, разработанными ранее.

Стандартизация условий глубинного культивирования различных штаммов бацилл в ПС на основе гидролизата соевой муки

В связи с разработкой и использованием новых ПС были проведены исследования по стандартизации условий глубинного культивирования изучаемых штаммов бацилл по таким показателям, как величина посевной дозы (ПД), температура, уровень аэрации и перемешивания. Определялись также показатели, характеризующие стадию завершения культивирования бацилл в разработанных: ПС.

При определении величины ПД использовали посевной материал (ПМ) бацилл в виде суспензии и лиофильно высушенный.

Концентрацией ПД варьировали в пределах 104-107 спор/см3 ПС. Анализ изменений показателей рН, ОП, БК, БЮ и спорообразования прово-

дили на 3,6,1*8, 24, 30, Зё'и'42 ^ культивирования. ' '

Было установлено, что ПД изучаемых бацилл в средах В1 и В2 должна составлять не менее 105 спор/мл ПС как для жидкого, так и для лиофиль-но высушенного ПМ и находится в той же области значений, что и для ПС, разработанных ранее.

Для изучения влияния температуры на рост и спорообразование выращивание бацилл осуществляли при 34 и 37 °С. Было установлено, что величины БК и BKt были в 1,5-2,0 раза выше при 37 °С, чем при 34 °С.

Таким образом, бациллы культивировали в биореакторах БИОР-0,1 и БИОР-0,25, в средах В1 и В2, при температуре (37±1)°С, частоте вращения мешалки - у БИОР-0,1 - 530 об/мин и у БИОР-0,25 - 320 об/мян. В качестве основного критерия эффективности культивирования служил показатель концентрации термоустойчивых спор.

Было установлено, что с увеличением сульфитного коэффициента до 1,17-1,19, наблюдается устойчивая тенденция роста показателей ОП, БК и BKt для штаммов B.subtilis (3 и ТПИ 13) и B.anthracis 55-ВНИИВВиМ, а для штаммов B.licheniformis (31 и ТПИ 11) и B.anthracis СТИ-1, напротив, увеличение сульфитного коэффициента в указанных пределах приводит к снижению вышеперечисленных показателей. Для дальнейшей работы были выбраны параметры и режимы глубинного культивирования бацилл в биореакторах, которые приведены в табл. 8.

Наименование показателей B.subtilis ТПИ 13 B.subtilis 3 B.licheniformis ТПИ 11 B.licheniformis 31 B.anthracis СТИ-1 3.anthracis 55-ВНИИВВиМ

Марка биореактора БИОР-0,25 БИОР-0,25 БИОР-0,1 БИОР-0,1 БИОР-0,1 БИОР-0,25

ПС В1 В1 В2 В2 В1 В2

Коэф. заполн. биореактора 0,6 0,7 0,7 0,7 0,7 0,6

Уровень аэрации, л/мин 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35

Част.вращ. мешалки, об/мин 320 325 530 500 500 320

Давление, МПа 0,10±0,05 0,10±0,05 0,10±0,05 0,10±0,05 0,10±0,05 0,10±0,05

Сульфит, коэф. 1,17 1,19 0,84 0,79 0,79 1,17

Продолжит, культивир., ч 26±2 26±2 2б±2 26±2 26±2 26±2

Т, °С 37±1 37±1 37±1 37±1 37±1 37±1

ПД, не менее, кл/мл ПС : 10* 1 105 105 ю5 •' |1ÓSV!V' ! М'Ю5 '

Для определения показателей, характеризующих стадию завершения культивирования бацилл в разработанных ПС определяли pH, ОП, БК и BKt культуральной жидкости, а также оценивали антагонистическую активность пробиотических штаммов.

Было установлено, что к (26±2) ч выращивания культуры изучаемых штаммов бацилл наиболее однородны, на 70-90 % состоят из свободных спор и имеют максимальные значения показателей БК и BKt. Антагонистическая активность пробиотических штаммов соответствовала требованиям нормативных документов. По нарастанию ОП и изменению морфологии, клеток можно прогнозировать величины показателей БК и BKt и определить «зону максимума» и минимальную гетерогенность нативной культуры бацилл при глубинном культивировании в биореакторах.

Оценка воспроизводимости технологии приготовления питательных сред на основе гидролизата соевой муки

Для оценки воспроизводимости усовершенствованной технологии приготовления ПС было приготовлено 3 серии ГСМ, которые по физико-химическим показателям отвечали предъявляемым к ним требованиям.

Необходимо было оценить, насколько эффективны и достаточны полученные результаты глубинного выращивания бацилл в биореакторах в разработанных средах В1 и В2. Для решения этой задачи было приготовлено 8 серий ПС В1 и 9 серий ПС В2, показатели которых представлены в табл. 9.

9. Физико-химические показатели сред В1 и В2, используемых для выращивания бацилл в биореакторах

Р5+, Mg2+, Са2+, Глю- Буферная Сухой

ПС pH N... коза, ёмкость, оста-

г/л г/л г/л г/л г/л г/л гэкв./л ток, %

NaOH HCl

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

В1 7,35 0,170 0,421 0,038 0,115 0,397 16,4 2,4 2,1 2,4

7,40 0,171 0,414 0,040 0,116 0,395 16,0 2,3 2,0 2,6

7,40 0,17| 0,424 0,035 0,110 0,399 16,1 2,3 2,0 2,6

7,40 0,170 0,420 0,035 0,113 0,407 16,3 2,6 2,0 2,5

7,35 0,172 0,425 0,039 0,108 0,400 16,0 2,7 1,9 2,5

7,30 0,175 0,420 0,038 0,117 0,401 15,9 3,0 1,9 2,4

7,30 0,177 0,420 0,041 0,100 0,409 16,1 3,0 2,0 2,6

"7,30 0,170 0,420 0,038 0,101 0,410 15,9 2,& 2,0 2,5

7,35± 0,172± 0,420± 0,03 7± 0,109± 0,402± 16,1± 2,6± 2,0± 2,5±

bs 0,05 0,0029 0,007 0,017 0,001 0,001, 0,01 0,3 0,1 0,1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 и

В2 7,20 0,556 0,994 0,087 0,109 0,822 27,1 4,6 4,4 4,4

7,30 0,560 0,998 0,085 0,100 0,806 26;9 5,7 4,0 4,3

7,35 0,555 1,020 0,088 0,101 0,823 27,2 4,5 3,8 4,5

7,10 0,551 1,048 О;091 0,100 0,799 27,3 5,2 4,8 4,4

7,15 0,551 1,050 0,084 0,103 0,798 27,3 5,6 5,0 4,6

7,20 0,558 0,990 0,090 0,108 0,816 27,2 5,7 4,0 4,8

7,15 0,557 1,060 0,087 0,107 0,811 27,1 5,6 4,9 4,6

7,15 0,556 1,027 0,088 0,090 0,800 26,8 5,9 6,4 4,3

7,00 0,554 1,034 0,092 0,101 0,801 27,1 6,4 6,0 4,3

7,15± 0,555± 1,024± 0,088± 0,102± о,т± 27,1± 5,6± 5,0± 4,4±

0,15 0.001 0.001 0.005 0.003 0,001 0,01 0,7 0,5 0,2

Анализ результатов, приведённых в табл., свидетельствует о достоверной стандартности и воспроизводимости физико-химических показателей-сред В1 и В2, а также об отработанности технологии их приготовления.

Среда В1 в наибольшей степени удовлетворяет питательные потребности В.апШгас1з 55 ВНИИВВиМ, т.к. показатель ОП культуры в среде В1 составил 7,01 ед. ОП, против 3,49 ед. ОП - в ПС В2. Питательные потребности В.атЬгааэ СТИ-1 в наибольшей степени удовлетворяет среда В2 (8,49 ед. ОП в ПС В2 против 6,52 ед. ОП в ПС В1). Оптическая плотность культур штаммов В.эиЫШз в среде В1 была на 23-24 % выше чем в ПС № 4, а В.НсЬешАоптпз - на 13-14 %, выше чем в ПС № 7 (рис. 1).

ОП, ед. ОП

ОП, ед. ОП

а) среда В1

1 - В.зиЫШв 3;

2 - В.БиЫШБ ТЛИ 13;

3 - В.апНиаыв 55 ВНИИВВиМ;

4 - В.аШЬга^в СТИ-1

б) среда В2

1 - В.НсЬетКтшв ТЛИ 11;

2 - В.НсЬетГотш 31;

3 - В.апЛгааэ 55 ВНИИВВиМ;

4 - В.апЙ1гас15 СТИ-1

1. Показатели оптической плотности нативных культур бацилл при выращивании в средах В1 и В2

Такая же закономерность роста в разработанных средах В1 и В2 наблюдалась и в отношении биологической концентрации бацилл (рис. 2).

БК, млрд кл/мл

16

БК, млрд кл/мл

12 3 4

а) среда В1

1 - В.зиЬйНв 3;

2 - В.эиЫШз ТЛИ 13;

3 - В.апШгас^ 55 ВНИИВВиМ;

4 - В.атЪгаод СТИ-1

2 3 4

б) среда В2

1 - В.НсЬешГогпш ТЛИ 11;

2 - ВЛ1с1ютй>пш8 31;

3 - В.апйгааз 55 ВНИИВВиМ;

4 - В.апЛгаав СТИ-1

2. Показатели БК бацилл при выращивании в средах В1 и В2

На основании полученных результатов были сформулированы требования к культурам изучаемых штаммов бацилл, полученным в разработанных среДах При культивировании в биореакторах (табл. 10).

10, Требования к КЖ, приготовленным в биореакторах

ПС Характеристика КЖ

РН ОП БК, млрд. кл/мл Спорообразование, %

В1 не менее 5,8 не менее 3,0 не менее 2,0 "не менее 60

В2 не менее 6,5 не менее 5,0 не менее 4,0 не менее 60

Показатели ОП, ОК и БК для В.ашЬгаЫз 55 ВНИИВВиМ, В.БиЫШэ 3 и В^цЬйНб ТПИ 13 в среде В1, а В.апгЪгаЫз СТИ-1, В.НсЬешйэпшз 31 и ВгИсЬеП^йэпшз ТПИ 11 в среде В2 были в 1,5-2,0 раза выше, чем в разработанных ранее ПС № 4 и № 7. Новые среды В1 и В2 удовлетворяли питательные потребности изучаемых пробиотических и вакцинных штаммов бацилл, способствуя высокой скорости роста, накоплению биомассы и синхронному спорообразованию.

Сравнительная характеристика показателей качества препаратов Виоспорин и Биод-5, приготовленных по усовершенствованной и существующим технологиям е

Для изучения в сравнительном аспекте основных показателей качества пробиотиков Биоспорин и Биод-5 (БК бацилл в дозе, антагонистическая активность, отсутствие контаминации посторонней микрофлорой) проводили культивирование бацилл в биореакторах в новых средах В1 и В2 и в средах № 4 и № 7.

Было установлено, что бациллы-компоненты пробиотиков Биоспорин и Биод-5, выращенные глубинным способом в средах В1 я В2, обладают высокой антагонистической активностью в отношении возбудителей острых кишечных инфекций животных, а готовые лекарственные формы пробиотиков, полученные по усовершенствованной технологии, по основным показателям соответствуют нормативным документам.

Расчетные затраты на 1000 руб. товарной продукции, произведенной по разработанной технологии, были меньше на 40-45%, чем по существующей технологии. Годовой экономический эффект от внедрения новых сред В1 и В2 составил 9900000 руб.

ВЫВОДЫ

1. Разработанные условия гидролиза соевой муки при массовом соотношении муки и 3,0 %-ного раствора соляной кислоты 1:5, температуре гидролиза (127±1)°С и продолжительности процесса гидролиза 20 мин, позволяют получить гидролизаты с содержанием аминного азота не менее 4,0 г/л.

2. Для приготовления гидролизатов как основы сред В1 и В2, может быть использована не только полуобезжиренная, но и необезжиренная соевая мука. Полученные гидролизаты были стандартны по составу и содержали, г/л: общего азота - 8,41±0,52; аминного азота - 4,38±0,39; кальция - 0,55±0,9; магния - 0,66±0,09; фосфора - 0,68±0,17.

3. Питательные среды В1 и В2, приготовленные на основе солянокис-лотного гидролизата соевой муки, обеспечивают рост и спорообразование культур штаммов В.зиЫШв 3, В^иЬ^Пэ ТЛИ 13, В.аШЬгааэ 55 ВНИИВ-ВиМ и В.НсЬешйэпшз 31, В.НсЬешйгпш ТПИ 11, В.апЙггааБ СТИ-1, соответственно. Показатели общей и биологической концентрации натив-ных культур изучаемых бацилл были в 1,5-2,0 раза выше, чем в средах, разработанных ранее.

4. Усовершенствованные параметры и режимы глубинного выращивания культур вакцинных штаммов В.аЩЬгааБ (СТИ-1 и 55 ВНИИВВиМ), а также штаммов В.БиЫШэ (3 и ТПИ 13) и В.НсЬешйитшз (31 и ТПИ 11), входящих в состав пробиотиков Биоспорин и Биод-5, являются воспроизводимыми и позволяют повысить выход биомассы бацилл в споровой форме, в среднем, в 1,7 раза.

5. Бациллы-компоненты пробиотиков Биоспорин и Биод-5, выращенные глубинным способом в средах В1 и В2, обладают высокой антагонистической активностью в отношении возбудителей острых кишечных инфекций животных, а готовые лекарственные формы пробиотиков, полученные по усовершенствованной технологии, по основным показателям

соответствуют нормативным документам.

6. .Стоимость сред В1 и В2 в 2,8 раза ниже, чем получаемых на основе кукурузного экстракта и гидролизата казеина. Расчетные показатели затрат на 1000 руб. товарной продукции, произведенной с использованием разработанных питательных сред, были меньше на 40-45 %, чем по существующей технологии.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты исследований реализованы разработкой, согласованием и утверждением следующей нормативно-технологической документации:

1. Регламент производства биоспорина сухого № 1245-02, утвержденный 13.07.2002.

2. Промышленный регламент производства пробиотика Биод-5, утвержденный 14.01.2004 г.

3. Сборник инструкций по оценке качества полуфабрикатов и конечного продукта «Биоспорин», утвержденный 12.09.2005 г.

4. Сборник инструкций по оценке качества полуфабрикатов и конечного продукта «Биод-5», утвержденный 12.09.2005 г.

5. Инструкция по приготовлению гидролизата соевой муки и питательных сред В1 и В2 для культивирования бактерий рода Bacillus, утвержденная 18.07.2005 г.

•6. Инструкция по оценке качества питательных сред В1 и В2, утвержденная 04.08.2005 г.

Кроме того, в технологии производства обоснованы к использованию составы ПС В1 и В2, изготавливаемые из дешевого недефицитного сырья, выпускаемые в РФ серийно материалы и реактивы, аналитические и контрольно-измерительные приборы и технологическое оборудование.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Разработанные новые прописи питательных сред В1 и В2, приготовленные на основе гидролизата соевой муки, а также отработанные технологические параметры и режимы глубинного выращивания бактерий рода Bacillus в биореакторах БИОР-0,1 и БИОР-0,25 могут быть рекомендованы при производстве вакцин против сибирской язвы и пробиотиков Биоспорин и Биод-5.

2. Результаты исследований по конструированию и оценке, качества новых ПС, предназначенных для культивирования пробиотических и вакцинных штаммов рекомендуется использовать в учебном процессе в высших учебных заведениях по дисциплине «Биотехнология».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рогожин А.З. Разработка технологии получения сухих питательных сред в порошковой, гранулированной и таблетированной формах для использования в производстве препарата Биод-5 /Рогожин А.З., Васильев П.Г., Тихонов И.В., Вишняков A.B. и др. //Сб.науч.тр. научно-практической конференции, посвященной 75-летию НИИ микробиологии МО РФ,- Киров: НИИМ МО РФ,- 2003.- С. 164-165.

2. Рогожин А.З. Экспериментальное обоснование использования сухих питательных сред в производстве препарата Биод-5 /Рогожин А.З., Васильев П.Г., Тихонов И.В., Вишняков A.B. и др. //Сб. науч. тр. научно-практической конференции, посвященной 75-летию НИИ микробиологии МО РФ.- Киров: НИИМ МО РФ.- 2003.- С. 165-166.

3. Вишняков A.B. Разработка питательной среды на основе гидролиза-та соевой муки для глубинного выращивания культур B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 /Вишняков A.B., Забокрицкий А.Н., Федорова Н.В. и др. //Ветеринарная медицина.- Изд. «Агровет».- 2005,- № 3-4.- С. 9.

4. Вишняков A.B. Совершенствование технологии глубинного способа культивирования бактерий рода Bacillus при производстве пробиотиков /Вишняков A.B., Грязнева Т.Н., Рогожин А.З. и др. //Ветеринарная медицина.- Изд. «Агровет».- 2005,- № 3-4.- С. 10-11.

Сдано в производство 15.04.2006 г. Ризограф Тираж 100 Заказ 89 Издательско-лолиграфический отдел ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина.

109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23

¿00€ h

-7295

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вишняков, Александр Валерьевич

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,

СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Питательные потребности бактерий рода Bacillus.

1.2. Факторы, влияющие на интенсивность процессов спорообразования и накопления биомассы бацилл.

1.3. Критерии выбора композиционного состава питательных сред при культивировании бактерий рода Bacillus.

1.4. Получение и применение гидролизатов в составе питательных сред.

1.5. Питательные среды, применяемые для культивирования бактерий рода Bacillus при производстве вакцинных и пробиотических препаратов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.2.1. Выбор условий гидролиза соевой муки.

2.2.2. Изучение физико-химических и ростовых свойств экспериментальных образцов гидролизатов соевой муки.

2.2.3. Оптимизация состава питательных сред для глубинного культивирования бацилл.

2.2.4. Стандартизация условий глубинного культивирования различных штаммов бацилл в питательных средах на основе гидролизата соевой муки.

2.2.4.1. Изучение влияния посевной дозы на основные показатели на-тивной культуры.

2.2.4.2. Влияние температуры культивирования на рост и спорообра- 65 зование бацилл.

2.2.4.3. Стандартизация условий перемешивания и аэрации при глубинном культивировании бацилл в биореакторах БИОР-0,1 и БИОР-0,25.

2.2.4.4. Определение показателей, характеризующих стадию завершения культивирования бацилл в разработанных питательных средах.

2.2.5. Оценка воспроизводимости технологии приготовления питательных сред на основе гидролизата соевой муки.

2.2.6. Сравнительная характеристика показателей качества препаратов Биоспорин и Биод-5, приготовленных по усовершенствованной и существующим технологиям.

3. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

7. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Приготовление питательных сред на основе гидролизата соевой муки для глубинного культивирования бактерий рода Bacillus"

Актуальность темы. Разработка и совершенствование технологий производства биопрепаратов является одной из важнейших задач отечественной медицины и ветеринарии. Это объясняется ростом заболеваемости людей и сельскохозяйственных животных инфекционными болезнями в условиях ухудшающейся эпидемической, эпизоотической и экологической обстановки, а также недостаточной эффективностью существующих лечебно-профилактических средств и их высокой стоимостью [19, 20, 26, 59].

В настоящее время из-за имеющихся экономических трудностей здравоохранение и ветеринарная служба России испытывают дефицит в современных, не дорогих лечебно-профилактических препаратах. В связи с этим актуальными являются исследования, направленные на создание эффективных медицинских и ветеринарных препаратов, а так же технологий их получения.

Одним из направлений биотехнологии как у нас в стране, так и за рубежом, является разработка и усовершенствование технологий производства биопрепаратов на основе бактерий рода Bacillus.

Практика применения пробиотиков на основе B.subtilis и B.licheniformis при желудочно-кишечных болезнях человека и животных, а также объёмы их закупок за рубежом и их реализация показывают, что спрос на данные препараты значительно превышает предложение [91].

Немаловажное значение имеет усовершенствование технологии производства вакцин против сибирской язвы, особенно в условиях нарастающей угрозы биотерроризма [9, 61].

Сотрудниками Центра военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ (ЦВТП БЗ) разработана технология глубинного культивирования пробиотика медицинского назначения «Биоспо-рин» на основе 2 штаммов бацилл B.subtilis 3 и B.licheniformis 31.

Кафедрой биотехнологии Московской государственной академии ветеф ринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина (МГАВМиБ) на основе штаммов B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 разработан про-биотик ветеринарного назначения «Биод-5», являющийся патентной собственностью Российской Федерации.

Указанные пробиотики обладают широким спектром антагонистического действия по отношению к патогенным и условно-патогеннным микроорганизмам, вызывающим желудочно-кишечные заболевания человека и животных. Это объясняется комплексным механизмом действия препаратов Биоспорин и Биод-5 за счёт сочетания в них композиции спор и вегетативных клеток бацилл, высокой антагонистической активностью бактерий-• компонентов, которые синтезируют при росте и спорообразовании аминокислоты, антибиотики, ферменты, другие биологически активные вещества. Данные пробиотики отвечают современным требованиям, включая не только высокую антагонистическую активность по отношению к возбудителям острых кишечных инфекций, но и продолжительность гарантийного срока хранения препаратов при комнатной температуре, что свидетельствует об их перспективности и необходимости расширения производства. [6, 85, 115, ].

По данным Онищенко Г.Г. [61], Бакулова И.А. с соавт. [9], Belton F. [101] и др., технология производства вакцинных препаратов против сибирской яз-^ вы на основе штаммов СТИ-1 и 55-ВНИИВВиМ является традиционной для

Российской Федерации и хорошо отработана, однако возрастающая потребность не только отечественной медицины и ветеринарии, но и зарубежных потребителей в вакцинах против сибирской язвы указывает на необходимость увеличения объема выпуска данных биопрепаратов.

Одним из направлений решения данного вопроса является стандартизация питательных основ и оптимизация компонентного состава питательных сред (ПС), применяемых для промышленного культивирования микроорганизмов, а также снижение их стоимости. [26, 113]. Ф Стабильность культивирования бактерий рода Bacillus глубинным методом и свойства готовой формы биопрепарата зависят, наряду с качеством посевного материала и условий выращивания, от качества ПС, которое определяется физико-химическими, биологическими показателями и обусловливается стандартностью исходного сырья и технологией их приготовления [91, 116].

Следовательно, проблема разработки новых ПС с использованием дешёвого растительного сырья для увеличения производства и снижения стоимости пробиотических и вакцинных препаратов на основе бактерий рода Bacillus, является весьма актуальной для народного хозяйства РФ.

Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований - разработка технологии приготовления питательных сред на основе гидролизата соевой муки для глубинного культивирования бактерий рода Bacillus при производстве пробиотических и вакцинных препаратов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать сбалансированный компонентный состав питательных сред на основе гидролизата соевой муки для глубинного способа выращивания бактерий рода Bacillus.

2. Определить условия гидролиза соевой муки и изучить физико-химические, биохимические и биологические показатели полученных гидро-лизатов.

3. Оптимизировать состав питательных сред для глубинного культивирования бацилл в биореакторах.

4. Оптимизировать параметры и режимы глубинного способа культивирования различных видов и штаммов бацилл в разработанных питательных средах.

5. Определить показатели, характеризующие стадию завершения культивирования бацилл в разработанных питательных средах.

6. Оценить биологическую активность готовых лекарственных форм препаратов Биоспорин и Биод-5, полученных из культур микроорганизмов, выращенных в разработанных питательных средах.

7. Обосновать экономическую целесообразность внедрения в производство новых питательных сред для глубинного культивирования бактерий рода Bacillus.

Научная новизна.

1. Впервые разработан компонентный состав питательных сред В1 и В2 на основе гидролизата соевой муки для глубинного выращивания в биореакторах B.subtilis, B.licheniformis и B.anthracis. Разработанные среды являются стандартизированными и отвечают питательным потребностям указанных микроорганизмов при их росте и спорообразовании.

2. Определены условия солянокислотного гидролиза соевой муки, позволяющие получить гидролизаты с содержанием аминного азота не менее 4,0 г/л.

3. Оптимизированы параметры и режимы глубинного способа культивирования в питательных средах В1 и В2 культур вакцинных штаммов B.anthracis СТИ-1, B.anthracis 55-ВНИИВВиМ, а также культур пробиотических штаммов B.subtilis 3, B.subtilis ТПИ 13, B.licheniformis 31 и B.licheniformis ТПИ 11, обеспечивающие увеличение выхода биомассы бацилл в 1,7 раза, в сравнении с существующими технологиями.

4. При выращивании бацилл в биореакторах определены критерии оценки процесса завершённости накопления биомассы в средах В1 и В2 по водородному показателю, оптической плотности и терморезистентности клеток.

Практическая значимость.

1. Для биотехнологической промышленности предложены стандартные питательные среды В1 и В2, пригодные для культивирования трех видов бацилл: B.anthracis, B.subtilis и B.licheniformis.

2. Разработана и утверждена 18.07.2005 г. инструкция по приготовлению гидролизата соевой муки и питательных сред В1 и В2 для культивирования щ бактерий рода Bacillus.

3. Разработана и утверждена 04.08.2005 г. инструкция по оценке качества питательных сред В1 и В2.

4. Результаты исследований по созданию технологии приготовления питательных сред В1 и В2 включены в промышленные регламенты производства пробиотиков Биоспорин (утверждён 13.07.2002 г.) и Биод-5 (утверждён 14.01.2004 г.).

5. Разработаны сборники инструкций предприятия по оценке качества полуфабрикатов для приготовления препаратов Биоспорин и Биод-5, утвержденные 12.09.2005 г.

6. Результаты исследований по технологии приготовления питательных сред В1 и В2 для культивирования бактерий рода Bacillus используются в учебном процессе на кафедре биотехнологии МГАВМиБ имени К.И. Скрябина при подготовке студентов по специальностям 111201 - Ветеринария, 110401 - Зоотехния, 012200 - Биофизика, специализации «Ветеринарная биофизика»; 012300 - Биохимия, специализации «Ветеринарная биохимия».

Личный вклад соискателя. Автору принадлежат организация и непосредственное осуществление исследований по разработке компонентного состава питательных сред В1 и В2, отработке режимов и параметров глубинно-^ го способа выращивания культур штаммов B.subtilis 3, B.subtilis ТПИ 13,

B.licheniformis 31, B.licheniformis ТПИ И, B.anthracis СТИ-1 и B.anthracis 55-ВНИИВВиМ, оценке качества гидролизатов соевой муки и разработанных питательных сред, анализ и теоретическое обобщение полученных данных, разработка научно-технической документации.

В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве со старшими научными сотрудниками ЦВТП БЗ, канд. биол. наук Лиморенко А.П. и канд. тех. наук Орловым Ю.Н., которым выражаю благодарность за помощь и поддержку. Ф Апробация результатов диссертации. Основные результаты проведенных исследований были изложены в 6 научных отчетах и доложены на научно-практической конференции, посвященной 75-летию НИИ микробиологии МО РФ (2003).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 4 статьи, в том числе 2 - в научных журналах и 2 - в сборниках научных конференций.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (128 источников, из которых 100 отечественных и 28 иностранных), приложения. Работа содержит 32 таблицы и 9 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Вишняков, Александр Валерьевич

1. Разработанные условия гидролиза соевой муки при массовом соотно шении муки и 3,0 %-ного раствора соляной кислоты 1:5, температуре гидро лиза (127±1)^С и продолжительности процесса гидролиза 20 мин, позволя ют получить гидролизаты с содержанием аминного азота не менее 4,0 г/л. 2. Для приготовления гидролизатов как основы сред В1 и В2, может быть

использована не только полуобезжиренная, но и необезжиренная соевая му ка. Полученные гидролизаты были стандартны по составу и содержали, г/л:

общего азота - 8,41±0,52; аминного азота - 4,38±0,39; кальция - 0,55±0,9;

магния - 0,66±0,09; фосфора - 0,68±0,17. 3. Питательные среды В1 и В2, приготовленные на основе солянокис лотного гидролизата соевой муки, обеспечивают рост и спорообразование

культур штаммов B.subtilis 3, B.subtilis ТПИ 13, B.anthracis 55 ВНИИВВиМ

и B.licheniformis 31, B.licheniformis ТПИ И, B.anthracis СТИ-1, соответст венно. Показатели обш,ей и биологической концентрации нативных культур

изучаемых бацилл были в 1,5-2,0 раза выше, чем в средах, разработанных ра нее. 4. Усовершенствованные параметры и режимы глубинного выращивания

культур вакцинных штаммов B.anthracis (СТИ-1 и 55 ВЬЖИВВиМ), а также

штаммов B.subtilis (3 и ТПИ 13) и B.Hcheniformis (31 и ТПИ 11), входящих в

состав пробиотиков Биоспорин и Биод-5, являются воспроизводимыми и по зволяют повысить выход биомассы бацилл в споровой форме, в среднем, в

1,7 раза. 5. Бациллы-компоненты пробиотиков Биоспорин и Биод-5, выращенные

глубинным способом в средах В1 и В2, обладают высокой антагонистиче ской активностью в отношении возбудителей острых кишечных инфекций

животных, а готовые лекарственные формы пробиотиков, полученные по

усовершенствованной технологии, по основным показателям соответствуют

нормативным документам. 6. Стоимость сред В1 и В2 в 2,8 раза ниже, чем получаемых на основе ку курузного экстракта и гидролизата казеина. Расчетные показатели затрат на

1000 руб. товарной продукции, произведенной с использованием разрабо танных питательных сред, были меньше на 40-45 %, чем по существующей

технологии. 6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕППЫХ ПАУЧПЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты исследований реализованы разработкой, согласованием и ут верждением следующей нормативно-технологической документации:

1. Регламент производства биоспорина сухого JSTa 1245-02, утвержденный

13.07.2002. 2. Промышленный регламент производства пробиотика Биод-5, утвер жденный 14.01.2004 г. 3. Лицензия на право производства, хранения и реализации биоспорина

64/0102-Л/02 от 10.11.2002 г., срок действия до 10.11.2007 г. 4. Сборник инструкций по оценке качества полуфабрикатов и конечного

продукта «Биоспорин», утвержденный 12.09.2005 г. 5. Сборник инструкций по оценке качества полуфабрикатов и конечного

продукта «Биод-5», утвержденный 12.09.2005 г. 6. Инструкция по приготовлению гидролизата соевой муки и питатель ных сред В1 и В2 для культивирования бактерий рода Bacillus, утвержденная

18.07.2005 г. 7. Инструкция по оценке качества питательных сред В1 и В2, утвер жденная 04.08.2005 г. Кроме того, в технологии производства обоснованы к использованию

составы ПС В1 и В2, изготавливаемые из дешёвого недефицитного сырья,

выпускаемые в РФ серийно материалы и реактивы, аналитические и кон97

трольно-измерительные приборы и технологическое оборудование (БИОР 0,1 и БИОР-0,25), а также изготовленные в Центре ВТП БЗ отдельные не стандартизированные конструктивные элементы. 7. РЕКОМЕНДАЦИИ ИО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Разработанные новые прописи питательных сред В1 и В2, приготов ленные на основе гидролизата соевой муки, а также отработанные техноло гические параметры и режимы глубинного выраш,ивания бактерий рода Ba-

cillus в биореакторах БИОР-0,1 и БИОР-0,25 могут быть рекомендованы при

производстве вакцин против сибирской язвы и пробиотиков Биоспорин и

Биод-5. 2. Результаты исследований по конструированию и оценке качества но вых питательных сред, предназначенных для культивирования пробиотиче ских и вакцинных штаммов рекомендуется использовать в учебном процессе

по дисциплине «Биотехнология» в высших учебных заведениях по специаль ностям 111201 -Ветеринария; 110401 - Зоотехния; специальности 012200-

«Биофизика», специализации «Ветеринарная биофизика»; специальности

012300-«Биохимия»; специализации «Ветеринарная биохимия».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вишняков, Александр Валерьевич, Москва

1. Аиба Т. Биохимическая технология и аппаратура Т.Аиба, А.Хемфри, Н.Миллис М.: Пищевая промыщленность.- 1975. 297.

2. Александровская Н.Б. Биологическая характеристика дрожжевых автолизатов: Автореф. дис... канд. мед. наук: 03.00.23 /Н.Б.Александровская; ММИ.-М., 1956.-19 с.

3. Алиев A.M. Сравнительное изучение различных белковых основ для производства бактериологических питательных сред /A.M. Алиев, Л.С. Костенко, П.Ш. Гашимова //Разработка новых и соверщенствование существующих сухих диагностических и производственных питательных сред, их стандартизация и методы контроля: Сб. науч.тр. Махачкала: МСХИ, 1975. 31-34.

4. Алиева P.O. Разработка оптимальных условий кислотного гидролиза казеина для среды КУА в реакторах /P.O. Алиева //Технология производства сухих диагностических питательных сред: Сб. науч. тр.- Махачкала: МСХИ, 1974.-С. 88-91.

5. Артюхин В.И. Белковые гидролизаты в производстве питательных сред /В.И. Артюхин, А.П. Шепелин, Н.В. Киселева //Производство и применение продуктов микробиологических производств: Обзорн. информ.- М.: Из-во «Мед. литература».- 1990. Вып. 10. 53-72.

6. Арчаков А.В. Пробиотик «Биод-5» и его применение в птицеводстве /А.В. Арчаков //Ветеринарная медицина.- Изд-во «Агровет».- 2003.- 3.- 20-21. 7. А.с. 1520094 СССР, МКИ 3 С 12 1/

7. Питательная среда для выращивания спорообразующих аэробных бактерий B.subtilis и B.licheniformis /В.Н. Чаплинский, В.И. Крылова, В.А. Вьюницкая //Бюл.

8. Опубл. 07.11.1989. 8. А.с. 1708832 СССР, МКИ 3 С 12 1/

9. Питательная среда для

10. Бакулов И.А, Сибирская язва (антракс): новые страницы в изучении «старой» болезни //Бакулов И.А., Гаврилов В.А., Селиверстов В.В. Владимир: ВНИИВВиМ.- 2001. 283 с.

11. Бациллы. Генетика и биотехнология /Пер. с англ.- Под ред. А.А. Прозорова.-М.: Мир.- 1992.- 156 с.

12. Бендас Л.Г. Пути совершенствования контроля бактериологических питательных сред промышленного изготовления /Л.Г. Бендас //Разработка и стандартизация бактериологических питательных сред: Сб.науч.тр.- М.: ПИИ вакцин и сывороток им. Мечникова.- 1980. 10-14.

13. Березин И.В. Биокинетика /И.В. Березин, Д. Варфоломеев.- М.: Знание.- 1979.- 307 с.

14. Борисенко Е.Г. Некоторые закономерности автолиза дрожжей рода Candida Е.Г. Борисенко //Микробиологический синтез.- 1967.- 15.- 8-9.

15. Быков В.А. Расчёт процессов микробиологических производств /В.А. Быков, А.Ю. Винаров, В.В. Шерстобитов.- Киев: Паукова Думка.1985.--174 с.

16. Ванек З.И. Микробная дифференциация, споруляция и синтез метаболитов /З.И. Ванек, В.К. Винтер Микробиол. журн.- 1977.- Т. 39.- J f 3. So 275-280.

17. Ванек З.И. Процессы регуляции при делении, споруляции и синтезе метаболитов у микроорганизмов /З.И. Ванек, В.К. Винтер //Микробиол. журн. 1977. Т 39. 3. 683-695.

18. Васильев П.С. Препараты для парентерального питания /П.С. Васильев, В.В. Суздалева, А.Д. Пеклюдов //Современные кровезаменители. М.: Медицина.- 1980. 28-43.

19. Виноградова И.П. Производственные питательные среды /И.П. Виноградова Под ред. М.А. Жукова-Вережнокова. М.: Высшая школа.- 1962.

20. Войчишина Л.A. Применение спорообразующих бактерий в лечении больных дисбактериозом /Л.А. Войчишина, В.Я. Чанлинский, В.А. Вьюницкая //Врачебное дело. 1991. 2. 73-75.

21. Воробьёв А.А. Дисбактериозы актуальная проблема медицины /А.А. Воробьёв, Н.А. Абрамов, В.М. Бондаренко //Вестник РАМН. 1997. №3.-С.4-7.

22. Глазман Р.А. Осветление нентозных гидролизатов ионитом ИА-1Ф /Р.А. Глазман, Л.И. Наумова, Б.А. Глазман //Гидролиз, и лесохим. промышленность. 1971.-№ 4 С 5-7.

23. Горская Н.А. Адсорбционная хроматография на активированных углях при получении белковых гидролизатов /Н.А. Горская //Лечебные препараты из крови и тканей: Сб. науч. тр. Л.: НИНВС- 1974. 171-173.

25. Горфункель Д.М. Сравнительная оценка азотистых пептонов различного происхождения /Д.М. Горфункель, Э.Ю. Шапиро, А.Ю. Шапиро //Химия питательных сред: Сб.науч.тр.- Киев: Укр, ИЭМ. Т. 14. Вып. 2., 1948.-С. 49-53.

26. Григорян А.Н. Ферментативные дрожжевые гидролизаты как основа приготовления питательных сред /А.Н. Григорян, Г.Л. Головкина //Материалы симпозиума по биотехнологии и биоинженерии.- Рига, 1979. 1516.

27. Грязнева Т.Н. Оценка эффективности пробиотика «Биод-5» при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят /Т.Н. Грязнева, П.Г. Васильев, Г.Н. Тихонов //Ветеринарная медицина.- Изд-во «Агровет».- 2002.№ 2 С 22-23.

28. Децина А.Н. Белковые гидролизаты в качестве основы питательных сред: производство и применение продуктов микробиологических производств /А.Н. Децина, А.Г. Багинский, В.И. Байбакова //Обзорн. информ. М., 1985.-Вып. 6 72 с.

29. Дзагуров Г. Современные принципы стандартизации вакцинных препаратов /С.Г. Дзагуров, Б.Д. Быченко, А.А. Сумароков //Журн. Микроб и о л 1 9 8 2 1 2 С 7-12.

30. Егоров Н.С. Влияние аминокислот и белков на синтез бацитрацина и экзопротеазы B.licheniformis /Егоров Н.С. //Микробиология. 1983. Т. 52. -Вып. 5 С 693-697.

31. Егоров Н.Е. Влияние ионов марганца и цинка на синтез бацитрацина и спорообразование B.licheniformis 28КА /Егоров Н.Е., Выборных Н., Лория Ж.К. //Вестник МГУ: сер. «Биология». 1985. 2. 56-58.

32. Егоров Н.Е. Влияние катионов на синтез экзопротеазы и спорообразование B.licheniformis /Егоров Н.Е., Выборных Н., Лория Ж.К. Микробиология. 1985. Т. 53. 4. 568-571.

33. Егоров Н.Е. Влияние состава среды на синтез бацитрацина и спорообразование B.licheniformis 28КА /Егоров Н.Е., Лория Ж.К. //Прикл. биох. и микробиол. 1986. Т. 22. 1. 107-111.

34. Егоров Н.С. Промышленная микробиология /Егоров Н.С. М.: Техника.- 1990.- 351 с.

35. Казакова Г.И. Изменение уровня триптофана и аммиака в процессе приготовления гидролизата казеина /Казакова Г.И., Малахова Г. М., Васильев Н.С. //Актуальные вопросы парентерального питания. Рига: Изд-во «Медикал».- 1972.-С. 207-209.

36. Калунянц К.А. Влияние источников углерода, азота и фосфора на синтез протеазы культурой B.subtilis /Калунянц К.А., Стрельников А.И., Штейн И.В. Прикл. биох. и микробиол. 1989. Т. 15. -Вып. 1. 57-61.

37. Канчук А.А. Соотношение аминокислот в гидролизатах в процессе

39. Каширских В.А. Об образовании гуминовых веществ при кислотном гидролизе белка /Каширских В.А. //Журн. общ. химии. 1989. Т. 10. Вып. 16.-С. 1495-1500.

40. Кейлер В.А. Экономика предприятия /Кейлер В.А. М: Мир.- 2001. -219с.

41. Клинов И.Я. Химическое оборудование в коррозионностойком исполнении /Клинов И.Я., Удыма П.Г.- М.: Техника.- 1980.- 357 с.

42. Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии /Козлов Ю.А. М Медицина.- 1970. 185 с.

43. Козлов Ю.А. Применение поджелудочной железы в производстве питательных сред /Козлов Ю.А., Карцева П.В. //Сб. работ НИИЭГ ВС СССР. -Вып. 1.-м.: НИИЭГ.- 1977.-С. 424-437.

44. Колчинская И.Д. Влияние солевых компонентов среды на активность амилазы и пероксидазы Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus /Колчинская И.Д., Медвинская Л.Ю., Тиньянова Н.З. //Микробиол. журн. 1984. Т. 26.-Вып. 4 С 29-32.

45. Кольцова Э.В. Проблемы сырьевого обеспечения микробиологических производств и пути их решения /Кольцова Э.В., Мальцева П.И., Гайденко В.К. //Производство и применение микробиологического белка: Обзорн. информ. М., 1986. 83.

46. Кудрявцев В.А. Подбор состава среды для оптимизации аминосинтетической активности аэробных бацилл /Кудрявцев В.А., Сафронова Л.А., Осадчая А.И. //Микробиол. журн.- 1991.-Т. 53.-№ 4.- 68-72.

47. Кудрявцев P.M. Использование бисульфата натрия для кислотного гидролиза /Кудрявцев P.M., Страшненко Е.С., Волков Е.Н. Труды ВНРШ консерв. и овощн. промышленности. М 1982. С 38-41.

48. Кузовкина Т.А. Взаимосвязь между синтезом бацитрацина и содер49. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований /Лабинская А.С. М.: Медицина.- 1972. 177.

50. Лиепиньш Г.К. Сырье и питательные субстраты для промышленной биотехнологии /Лиепиньш Г.К., Дунце М.Э.- Рига: Технология.- 1986.- 212 с.

51. Лихварь Н.А. Научные основы производства бактерийных и вирусных препаратов /Лихварь Н.А., Виноградова И.Н., Власова Е.В. Уфа: Биотех.-1969.- 411 с.

52. Матвеев В.Е. Разрушение аминокислот в растворах при нагревании. Ч.

53. Влияние температуры, времени выдержки и рН на деградацию аланина /Матвеев В.Е., Скворцов Г.Е., Куян Н.В. //Биотехнол.- 1986.- 2.- 58-62.

54. Меджидов М.М. Состояние и перспективы развития производства микробиологических питательных сред /Меджидов М.М. //Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии: Сб.науч.тр.- Махачкала: МСХИ.-1988.- Ч. I.- 3-8.

55. Мейнелл Дж. Экспериментальная микробиология /Мейнелл Дж., Мейнелл Э. /Пер. с англ.- под ред. А.С. Кривинского и В.И.Урбаха.— М.: Мир, 1967.-432 с.

56. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. М ГИСК им. Л.А.Тарасевича.- 1980. 134 с.

57. Методические указания по применению физико-химических методов контроля питательных сред.- М.: ГИСК им. Л.А.Тарасевича.- 1987.- 82 с.

58. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям /Методические указания МУК 4.1/4.2.588-96. -166 с.

59. Методы обш,ей бактериологии /Пер. с англ. под ред. Е.П. Кондратьевой, Л.В. Калануцкрго. М.: Мир.- 1984. 344 с.

60. Микробные ферменты и биотехнология Пер. с англ. под ред.

61. Малик Н.И. Ветеринарные пробиотические препараты /Малик Н.И., Панин А.Н. Ветеринария. 2001. 1. 46-51.

62. Малик Н.И. Новые пробиотические препараты ветеринарного на- значения: Автореф. ДИС....ДОКТ. биол.наук: 16.00.03 /Н.Н Малик; ВГНКИ.-М., 2002. 53 с.

63. Неклюдов А.Д. Получение гидролизатов с заданными свойствами /Неклюдов А.Д., Навашин СМ. //Прикл. биохим. и микробиол. М., 1985. Вып. 1.-С. 3-17.

64. Онищенко Г.Г. Биотерроризм как национальная и глобальная угроза /Онищенко Г.Г., Сандахчиев Л.С., Нетесов С В //Журн. Микробиол. 2000, 6 С 83-85.

65. Осадчая А.И. Стимуляция роста и спорообразования B.subtilis с оптимизацией углеродного питания при глубинном культивировании /Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова Л.А. //Прикл. биохимия, и микробиология. -1975.-Т. 3 3 С 321-324.

66. Осадчая А.И. Азотное питание штаммов аэробных спорообразующих бактерий в условиях глубинного культивирования /Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Козачко A.M. //Прикл. биохим. и микробиол. 1997. Т. 33. 4 С 433-438.

67. Осадчая А.И. Влияние кислотности среды и температуры на рост и эксрекцию полисахаридов Bacillus subtilis при глубинном культивировании /Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова Л.А. Микробиол. журн. 1999. Т 6 0 4 С 25-32.

68. Осадчая А.И. Роль аминокислот в интенсификации биосинтеза экзополисахаридов В. subtillis в глубинных условиях роста /Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафропова Л.А. //Микробиол. журн. 1995.- Т. 64. 1. С 44-50.

69. Осадчая А.И. Влияние источников питания на синтез экзополисаха70. Павлов П.В. Влияние нродуктов глубокого расщенления белковых веществ нитательной среды на токсинообразование бактерий /Павлов П.В., Леонова А.Г., Смирнова М.В. //Журн. микробиол. 1980. 8. 65-69.

71. Панюков А.П. О составе и природе нродуктов, образующихся на промежуточных стадиях кислотного гидролиза: Автореф. дис... канд. биол. наук: 03.00.23 Панюков А.П. Л 1981. 19 с.

72. Перт Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток /Перт Дж.- М.: Мир.- 1988. 298 с.

73. Подберёзный В.В. Культивирование производственных штаммов Вас.subtilis в подсырной сыворотке /Подберёзный В.В., Полянцев В.В., РопаеваЛ.В.//Ветеринария. 1996.-№ 1.-С. 21-26.

74. Полтарак О.М. Физико-химические основы ферментативного катализа/Полтарак О.М., Чухрай Е.С. М Паука.- 1981. -256 с.

75. Попова В. А. Особенности получения смеси аминокислот и низших пептидов /Попова В. А., Петрейкова М.М., Езерская М. Ф. //В кн. Аминокислоты для сельского хозяйства, пищевой промышленности, здравоохранения и научных исследований. Фрунзе: ФГУ.- 1981. 43-44.

76. Пригода А.С. Современное состояние и перспективы получения и использования питательных сред: производство и применение продуктов микробиологических производств /Пригода А.С, Муратова B.C.- Обзорн. информ. М., 1989. Вып. 8. 45 с.

77. Равилов А.З. Микробиологические среды /Равилов А.З., Гильмудинов Р.Я., Хусаинов М.Ш.- Казань: ФЭП. 1999. 166 с.

78. Ракитин В.Ю. Технология ферментативного гидролиза растительного сырья /Ракитин В.Ю., Прокофьева П.В. Производство и применение продуктов микробиологических производств: Обзорн. информ. Вып. 2. М., 1982.-78 с.

79. Рогожин А.З. Разработка технологии получения сухих питательных сред в порошковой, гранулированной, и таблетированной формах для использования в производстве препарата «Биод-5» /Рогожин А.З,, Васильев П.Г., Тихонов И.В. //Материалы юбилейной науч.-практ. конф., посвященной 75-летию НИИМ МО РФ. -Киров: НИИМ МО РФ.- 2003. 312-313.

80. Рогожин А.З. Экспериментальное обоснование использования сухих питательных сред в производстве препарата «Биод-5» /Рогожин А.З., Васильев П.Г., Тихонов И.В.. Материалы юбилейной науч.-практ. конф., посвященной 75-летию НИИМ МО РФ.- Киров: НИИМ МО РФ.- 2003.- 314-315.

81. Роуз Э. Химическая микробиология /Роуз Э. //Пер. с англ.- М.: Мир.-1971.-423 с.

82. Садуллаев М.К. Использование микрофильтрации для очистки гидролизата казеина /Садуллаев М.К., Гаджиев М.К. //Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии: Сб.нау.тр.- Махачкала: м е х и 1988.-Ч. П С 276-277.

83. Сапронов А.Р. Роль аминокислот и Сахаров в образовании красящих веществ /Сапронов А.Р., Потапова Н.М., Воронкова И.Н. //Сахарная промышленность. 1980. 2. 22-25. 81. Семёнов СМ. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов: Справочник /Семёнов СМ. М Агропромиздат.- 1990. 156 с. 82. Семёнов СМ. Пептоны, используемые в микробиологии Производство и применение продуктов микробиологических производств: Обзорн. информ. Вып. 4. М., 1988. 66 с.

84. Смирнов В.В. Спорообразующие аэробные бактерии-продуценты биологически активных веществ /Смирнов В.В., Резник СР., Василевская П.А. Киев: Техн1ка.- 1982. 98 с.

85. Смирнов В.В. Рост и спорообразование B.subtillis в различных условиях аэрации /Смирнов В.В., Осадчая А.И., Кудрявцев В.А. //Микробиол. журн. 1993. Т. 55. -ШЗ.С. 38-41.

86. Смирнов В.В. Современные представления о механизмах лечебнопрофилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus /Смирнов В.В., Резник СР., Вьюницкая В.А. Микробиол. журн. 1993. JT S» 4 С 92-112.

87. Степанов Э.Р. Сравнительная характеристика различных видов технологического оборудования для промышленного приготовления сухих питательных сред /Степанов Э.Р. //Разработка новых и усовершенствование суш,ествуюш,их питательных сред, их стандартизация и методы контроля: Сб.науч.тр. Махачкала: МСХИ.- 1975. 62-66.

88. Степчков К.А. Сравнительная эффективность различных ферментных препаратов для гидролиза белка дрожжей /Степчков К.А., Головкин Г.П., Тинякова О.Х. //Актуальные вопросы парентерального питания. Рига: Изд-во «Медикал».- 1972. 163-169.

89. Суздалева В.В. Улучшенные препараты гидролизата казеина для парентерального белкового питания /Суздалева В.В., Малахова Г.М., Васильев П.С. и др. Пробл. гематологии и переливания крови.- 1974. Т. 19. J T 1. N» 30-32.

90. Тарков М.И. Микробиологические методы оценки искусственных питательных сред /Тарков М.И. Кишинев: Штиинца.- 1972. -89 с.

91. Телишевская Л.Я. Белковые гидролизаты. Получение, состав, применение /Телишевская Л.Я. М.: Знание.- 2000. 241 с.

92. Тихонов И.В. Терапевтическая эффективность пробиотика «Биод-5» при желудочно-кишечных болезнях лошадей /Тихонов И.В., Грязнева Т.Н., Васильев П.Г. //Ветеринарная медицина.-Изд-во «Агровет».- 2004.-JS2 4.- 9.

93. Тихонов И.В. Совершенствование технологии производства пробиотика «Биод-5» и методов его контроля Тихонов И.В., Грязнева Т.Н., Лиморенко А.Н. //Ветеринарная медицина.- Изд-во «Агровет».- 2004.-Х» 4.- 40-41.

94. Трофименко Н.З. Среды из ферментативных гидролизатов соевых

95. Тутова Э. Г. Сушка продуктов микробиологического синтеза /Тутова Э. Г., Куц П.С.-М.: Агропромиздат.- 1987.-311 с.

96. Филатов А.Н. Белковые гидролизаты /Филатов А.Н., Чаплыгина З.А., Депп М.Е.- Л.: Лениздат.- 1968. 147 с.

97. Хванг СТ. Мембранные методы

98. Чеботарева П. И. О деминерализации белковых гидролизатов на ионообменных смолах /Чеботарева П.И., Кудряшов В.А., Пальмин В.В. //Пишевая технология. 1976. J f 1. С 39-40. So

99. Черников М.П. Протеолиз и биологическая ценность белков /Черников М.П.-М.: Мир.- 1975.-216 с.

100. Шагам Н.Л. О физико-химических методах стандартизации микробиологических питательных сред /Шагам Н.Л., Раскин Б.М., Мельникова В.А. //Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол.— 1981.-JY2 4.- 24-29.

101. Эрин А.Э. Гидролиз казеина протеазами различного происхождения /Эрин А.Э. В кн. Получение и применение иммобилизированных ферментов в научных исследованиях промышленности и медицине. Л.: Лениздат.- 1980.- 206 с.

102. Belton F. Studits on а protective antigen produced in vitro from B. Anthracis: medium and method of produced /Belton F., Stranye R. //Brit. J. Expl. 1994.-Vol. 2. P. 364-414.

103. Benedettini G. Immunomodulation by Bacilllus subtilis spores /Benedettini G., Delibero C, Pierotti R. //Boll. 1st. Sieroter.Milan.-1983.- B2.-P. 509-516.

104. Blish M.J. nidrolysis of protein and the method for preparing of amino acids solutions /Blish M.J. //Patent of USA, 1949, 2487784.

105. Bonomi A. Probiotics in swine feeding: The use of Bacillus subtilis and

106. Cipradi G. Effect of an adjunative treatment with Bacillus subtilis for foodallergy /Cipradi G. Chemioterapia.-1986.- 5, N 6.- P. 408-410.

107. Coppi F. Results of treatment with Bacillus subtilis spores (Enterogermina) after antibiotic therapy in 95 patients with infection calculosis /Coppi F. //Chemotherapia. -1985. 2. P. 467 470.

108. Ducluzeau R. Production of an antibiotic substance by Bacillus licheniformis within the digestive tract of gnotobiotic mice /Ducluzeau R., Dubos F., Rainbaud P. //Antimicrob. Agents Chemother.- 1998.-13, N 2.- P. 97-103.

109. Dityatkovskaja E.G. Biosporin white allergietching dermatosis treatment /Dityatkovskaja E.G., Chaplinsky V.Y. //1-st Int. Conf. Immunoreabilitation «Reabilitation oe Immune system». Dagomys, 1-5 Juli, 1992 Tsk. 1992. P. 97.

110. Donell A.G. Characterization of Bacillus subtilis, Bacillus pumillis. Bacillus lichenifomiis and Bacillus amylaliquefaciens by pyrolisis, gas liquid chromatography DNA-DNA hybridization, biochemical test and PPI system /Donell A.G., Horis I.R., Clans D. //Isyst Bacteriol@, 1980. -P.- 448-459.

111. Erickson L.E. Application of Massing Energy Balance Regularities to Product Formation /Erickson L.E., Selga S.W., Viesturs U.E. //Biotechnol. and Bioeng.-1978.-V. 2 0 P 1623-1638.

112. Fais S. Lymphocyte activation by Bacillus subtilis spores /Fais S. Boll. 1st. Sieroter. Milan. 1987. 66, N 5. P. 391-394.

113. Fleuring H. P. Responses of B.subtillis spores to ionic environments during sporulation and germination Fleuring H. P., Ordal Z. J. J. Bacterial. 1964.-V.88.-P.1529-1537.

114. Famularo G. Stimulation of immunity by probiotics /Famularo G., Mretti S., Marcelli S., De Simone C. //In Fuller (ed.), Probiotics 2/ Applications and practical aspects. Chapman and Hall/ New York. -1977. -p. 133-161.

115. Fiorini G. Bacillus subtilis selectively stimulates the synthesis of mem-

116. Fuller R. History and development of probiotics/Fuller R. //Probiotics. The scientific basis. London: Chapman a. Hall. 1992. P. 29-53.

117. Fuller R. Probiotics in man and animals /Fuller R. J. Appl. Bacter. 1989.-66 B l P 365-378.

118. Guida V. Importansia do Bacillus esporulados aerobios em gastroenterologia e nutricao /Guida V., Guida R. Ren. Brasil. Med. 1978. 35, N 12. P. 702-707.

119. Guerina N.G., Neutra M.R. Mechanism of Bacterial Adherence /Guerina N.G., Neutra M.R. Microecol. Therapy, 1984. vol.14. P. 466-467.

120. Hanson R.S. Biochemistry of sporulation. I. Metabolism of acetate by vegetative and sporulating cells Hanson R.S., Spinivasan V.R. and Halvorson H.O. J.Bacteriol. 1963. V. 85. P. 451-460.

121. Hanson R.S. Relationship between the tricarboxylic acid cycle enzymes and sporulation of B. subtillis Hanson R.S., Blicharska I. and Sulmajster I. Biochem. Biophys.Res.Commun. 1984. V. 17. 1-7.

122. Keynon A. Spore structure and its relations to resistance, dormancy and germination Spores VII, papers presented at the Seventh International Spore Conference Madison, Wisconsin, 5-8 oktober 1977 Ed. Y Shambles, I.C. Vary. Washington, 1974.-P. 43-53.

123. Neilson N.E. Grout studies on B. stearothermiphillus Neilson N.E., Macgnillan M.F., Campbele L.L. Canad. J. Microbiol.- 1959.- V.6.- P. 293-298.

124. Pool W. O. Process for purifying protein hydrolysate solutions. Patent of USA, 1963, №3100201.

125. Scheffer P. Catabolic repression of bacterial sporulation Scheffer P., Millet I. and Aubert I. 1

126. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -V. 54. P. 704-711.

127. Sorokulova J.B. Translocation of exogenous micro flora through mucous membranes of warmbloodeol JUMS Congress: Bacteriology, Mycology.

128. Sterlini I. Commitment to sporulation in Bacillus subtillis and its relationship to the development of actinomicin resistance Sterlini I., Mandelstam I. //Biochem I. 1969. V. 113. P. 29-37. 127. Tan Т.е. Activity of the enzyme system in thermally killed Bacillus cells /Tan T.C., Qian Z.R. Enzyme and Microb. Technol. -1996.-19, N 2. P. 150-156.

129. Vaccines and indication for use in laboratory workes dealing with hazardous microdiological agent In: Laboratory safety of the center for aspeets of biosecurity for person working with hazardous microbiologic agent Vs. Dept. Health servise. Center for Disease Control Publication NCDC, 75-8118, 1975. P. 11-68.