Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Биотехнология производства энтомофторовых грибов и эффективность их применения против гороховой тли

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Биотехнология производства энтомофторовых грибов и эффективность их применения против гороховой тли"

На правах рукописи МИРОНОВА Екатерина Николаевна

БИОТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА ЭНТОМОФТОРОВЫХ ГРИБОВ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ПРОТИВ ГОРОХОВОЙ тли

Специальность 06.01.11 - защита растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена в Отделении "Питательные среды" и отделе средств защиты растений Государственного научного центра прикладной микробиологии и на кафедре защиты растений Российского государственного аграрного заочного университета в 1989- 1997 гг.

Научные руководители - доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН П.И. Сусидко; кандидат биологических наук, профессор Н.П. Яковлева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Г.А. Бегляров; кандидат биологических наук, доцент С.II. Кручина.

Ведущее предприятие - ЦИНАО.

Защита диссертации состоится " " 1997г.

в часов на заседании у ис с у, р> га аиолтото совета

Д. 120.35.09 в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева.

Адрес академии: 127550, Москва И-550, Тимирязевская улица, д. 49, корпус 8. Ученый совет МСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ МСХА.

Автореферат разослан " ^ " ¿/С 1997г.

Ученый секретарь диссертационного совета доцент

В.А. Шкаликов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Перевод защиты растений на экологическую основу требует приоритетной разработки высокоэффективных нехимических средств. В практике защиты растений и в научных исследованиях в области биометода важное место занимают энтомофторовые грибы, как экологически безопасные энтомопатогепы и борьбе с некоторыми сосущими вредителями. Оин могут накапливаться и биоценозах, длительно сохраняться вне организма хозяина, вызывать массовые эпизоотии вредных насекомых на больших площадях (Воронина, 1989). В качестве объекта при изучении энтомопатогеннон эффективности препарата на основе гриба E.thaxteriana нами был избран один из опаснейших вредителей гороха и других бобовых культур -гороховая тля Acyrthosiphon pisum Harris. В природе заражение тли происходит в основном конидиями гриба, но из-за короткого срока их жизнедеятельности основой биопрепарата энтомофторина сухого являются покоящиеся споры (Воронина, 1985). Для культивирования гриба используется соевая мука. Экономические проблемы привели к необходимости подбора новых источников сырья, замене пищевого белка непищевым.

Промышленный выпуск биопрепарата на основе покоящихся спор гриба E.thax(ehana Petch отсутствует.

Цель и задачи исследований. Основная цель наших исследований заключалась в разработке биотехнологии производства и оценке эффективности применения гриба E.thaxteriana, выращенного на модифицированных питательных средах, а также изыскании новых источников сырья с целью замены пищевого белка непищевым. В рамках общей проблемы решались следующие задачи:

1. Выбор оптимального штамма E.thaxteriana с учетом инсектицидной активности по отношению к гороховой тле и степени воспроизводства.

2. Выявление возможности использования полиакриламидных основ (непищевого сырья) для поверхностного культивирования.

3. Использование белковых основ питательных сред с учетом замены пищевого белка непищевым.

4. Сопоставление аминокислотного состава гомогената гороховой тли с искусственными питательными средами и их анализ.

5. Определение влияния различных Сахаров, некоторых витаминов группы В и усиление аэрации путем использования перфторуглеродных соединений на спорообразование гриба E.thaxteriana.

6. Определение биологической эффективности использования

гриба ЕЛках1ег1апа, выращенного на модифицированных питательных средах.

Научная новизна. Теоретически обоснована возможность замены пищевого белка непищевым при культивировании гриба Е.(Иах1ег(апа. Рекомендована питательная среда, белковой основой которой является автолизат отходов суспензии пивных дрожжей. Доказана возможность использования перфторуглеродных соединений с целью усиления аэрации во время культивирования гриба ЕЛЪахгепапа. Установлена корреляция между количеством инфекционного начала в рабочей суспензии и биологической эффективностью суспензии покоящихся спор гриба в лабораторных и полевых условиях. Предложена лабораторная технологическая схема производства препарата на основе гриба ЕЛИах1епапа с применением полиакриламидного геля. Внесены изменения в технологическую схему получения энтомофторина сухого, в частности, предложена замена питательной среды для культивирования гриба.

Практическая значимость работы. На основании исследований, проведенных в 1989-1997 гг., получены результаты, позволяющие оптимизировать условия культивирования гриба Е.Лах1еНапа. Доказана возможность использования отходов пищевой промышленности и белков микробного происхождения для получения покоящихся спор ЕАках1ег1апа, являющихся основой биопрепарата. Предложена технологическая схема производства автолизата отходов пивных дрожжей, применяемого в качестве белковой основы при культивировании гриба. Это позволяет заменить пищевой белок непищевым и тем самым снизить стоимость сырья. Экспериментально доказана возможность использования полиакриламидного геля как заменителя агар-агара. Использование гриба Е. (Иах(епапа, полученного на разработанных нами питательных средах, позволяет относительно эффективно его использовать в полевых условиях, что способствует улучшению экологической обстановки путем сокращения или исключения химических обработок.

Апробация работы. В течение 4-х лет (1993-1996) на научных конференциях молодых ученых Российского государственного аграрного заочного универиггета докладывались результаты исследований, отражающие основные положения диссертационной работы. Результаты исследований обсуждены на научном семинаре в Отделении "Питательные среды" и в отделе средств защиты растений Государственного научного центра прикладной микробиологии.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научные (ппгьн. одна пабога находится в печати.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, 6 глав, выводов и предложений, списка литературы, приложений. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста, содержит 43 таблицы, -М рисунка. Список использованной литературы включает 19? наименования, в том числе 52 иностранных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2.1. Материал, методика, условия проведения исследовании.

Объектом исследования служили 9 штаммов грибов рода Етно-торЫИога, полученные из ВИЗР. Экспериментальный штамм Г-166 (ЕлНса^епапа), отобранный в результате изучения популяции, способен расти на общепринятых для энтомофторовых грибов питательных средах, обладает высокой вирулентностью по отношению к гороховой тле (6070%).

Культивирование штамма проводили на разработанных нами 15 питательных средах. Среда на основе соевой муки, предложенная сотрудниками ВИЗР, использовалась в качестве стандарта. Условно все питательные среды можно разделить на гидролизные среды и среды на нативной основе. Белковой основой гидролизных сред служили: солянокислотный гидролизат казеина, протосубтилиновый гидролизат белково-витаминного концентрата, сернокислотные гидролизаты соевой, фасолевой, гороховой, люпиновой муки, панкреатический гидролизат рыбной муки, панкреатический гидролизат белково-витаминного концентрата, панкреатический гидролизат казеина, автолизат суспензии отходов пивных дрожжей. Для приготовления сред на нативной основе использовали соевую, гороховую, фасолевую, люпиновую муку, а также обезжиренное молоко.

Наряду с методами, принятыми в практике защита растений, использованы нетрадиционные для защиты растений методы: определение аминного и общего азота, сырого протеина, количественное и качественное определение аминокислот и витаминов в белковых основах питательных сред и гомогенате гороховой тли .

Изучая влияние витаминов на рост и спорообразование гриба, использовали витамины В,, В2, В6, РР, Н, а также дрожжевой автолизат, очищенный от витаминов, фирмы "01Гсо" (США). В полевых исследованиях испытывали культуральные жидкости на основе соевой муки, обезжиренного молока и автолизата суспензии отходов пивных дрожжей. Полиакриламидный гель получали по методике, разработанной в Киевском медицинском институте (Билько, Гашинский, 1982).

Влияние витаминов на рост и спорообразование гриба изучали с использованием витаминов Вь В2, Вб, РР, Н, а также дрожжевого экстракта, очищенного от витаминов, влияние Сахаров - с использованием мальтозы, глюкозы, лактозы, сахарозы.

Учет численности гороховой тли в полевых условиях проводили по методу Э.Г. Ворониной.

Статистическую обработку данных проводили методом дисперсионного анализа (Доспехов, 1985), а также с применением многокритериального математического подхода для оптимизации экспериментальных данных (Михалевич, Волкович, 1982; Волкович, Волошин, Горлова, 1984; Гнатиенко, 1990; 1992).

2.2. Морфолого-культуральные особенности и энтомопатогенная

характеристика гриба ЕЛ1тх1епапа

В последнее время в биологической защите растений все шире используются энтомопатогенные грибы, в частности, энтомофторовые (Воронина, 1989). Практическое использование этих грибов сдерживают проблемы биотехнологии получения биопрепарата. Биотехнология К. 11шх1ег1апа включает: выбор штамма, оптимизацию питательных сред, культивирование в производственных условиях, создание товарной формы препарата.

Наши исследования показали, что в зависимости от состава питательной среды и условий культивирования гриб формирует несептированный мицелий, сферические конидии с сосочком на конце. Размер конидий при увеличении в 400 раз 27-31 мкм.

При глубинном культивировании максимальное образование покоящихся спор происходит на пристеночном кольце колбы, на границе раздела жидкой и воздушной фаз. Покоящиеся споры шаровидной формы, диаметр 28-36 мкм при увеличении в 400 раз.

Сравнительная инсектицидная активность испытанных 9 штаммов грибов рода ЕпШпорЫНога против гороховой тли лабораторной популяции представлена на рис. 1. Наиболее продуктивным оказался штамм Г-166. Титр спор у этого штамма на стандартной среде составил 8,0-105 спор/мл.

2.3. Оптимальные условия культивирования гриба ЕЛкахАепапа

Нами выявлено, что оптимальными условиями для процесса роста и спорообразования энтомофторовых грибов является температура 2628° С и рН- 6,5-7,5, что согласуется с данными Э.Г. Ворониной, г.м. Гиндиной, И.И. Новиковой (1987). Полиакриламидный гель полностью

Г-161 Г-162 г.163

Г-166 56%

Рис. 1. Сравнительная активность штаммов грибов рода Еп1отор1и1юга против лабораторной популяции гороховой тли

отвечает этим требованиям, поэтому его использовали как синтетический заменитель агар-агара. Среды на его основе, по сравнению с агаровыми, имеют ряд преимуществ. Их прозрачность облегчает изучение морфологии, термостабильность и устойчивость к низким значениям рН расширяет возможность изучения условий культивирования. Биологическая инертность открывает широкие возможности для создания сред строго определенного состава.

Таблица 1

Влияние некоторых витаминов группы В на рост и спорообразование гриба Е.Итх1епапа

Варианты Кол-во витаминов в среде, мг/л Среднее число спор на 10 супси культивирования

Контроль (ЭД свободный от витаминов) - И

ЭД свободный от витаминов + В, 5 41

ЭД свободный от витаминов + В2 5 24

ЭД свободный от витаминов + В6 5 52

ЭД свободный от витаминов + биотин 10 56

ЭД свободный от витаминов + ниацин 20 46

ЭД свободный от витаминов + В,+ В2+ В6+ биотин+ ниацин 5+5+5+10+20 87

Полиакриламидную основу использовали для изучения влияния некоторых витаминов группы В на рост и спорообразование гриба ЕлЬШепапа, а также возможность использования перфторуглеродных соединений (проксанол) с целью усиления аэрации во время культивирования.

Исследования показали,(табл. 1), что для роста и; развития гриба необходимо наличие в питательной среде всех витаминов группы В. Однако, в большей степени гриб нуждается в биотине и пиридоксине (В6); в среднем количество спор в камере Горяева составляет 52-56 ппук, а в контроле - 11 штук.

Разработанная нами лабораторная технология использования полиакриламидного геля заключается в увеличении площади культивирования путем использования гранулированной полиакриламидной основы. Эту основу пропитывали питательной средой, вносили стерильный раствор глюкозы и проксанол. Дефицит кислорода создавали увеличением объема гранул полиакриламида до 75% от объема колбы. Проксанол использовали в концентрации 0,001%; 0,01%; 0,005% от объема питательной среды. В условиях дефицита кислорода проксанол оказывает существенное влияние на развитие Е.(Ьах(епапа при оптимальной концентрации носителя кислорода 0,01%.

Исследованиями установлена эффективность использования полиакриламидного геля в качестве заменителя агар-агара (титр спор/мл 107).

100.0Е+6-10.0Е+6-1.0Е+6-100,0Е+3 10.0Е+3' 1.0Е+3-Ю0,0Е+0' 10.0Е+0-1.0Е+0-

□Среда 12 □Среда 5

Глюкоза

Сахароза

Мальтоза

Лактоза Без Сахаров

Рнс.2. Влияние Сахаров на рост и спорообразование гриба ЕлИах1епапа

Выявлено, что гриб лучше расщепляет мальтозу (титр спор 1,7-107спор/ мл). В варианте с глюкозой тигр спор составил 9,0-10 спор/мл, а лактоза ингпбнруст спорообразование (титр спор 1,1-102 спор/мл), в то время как и ко!ггроле (без Сахаров) титр спор 4,0-105 (рис.2). Для усиления аэрации и глубинной культуре использовали перфтордекалин различной процентной концентрации (0,5%; 1%; 5%; 10% ; 30%); наиболее эффективной была концентрация перфтордекалина не менее 30%.

3. Использование белковой основы питательных сред

В биотехнологии производства микробиологических препаратов широко используются гидролизаты пищевого белка. Однако, с экономической точки зрения они менее рентабельны. Взамен их мы использовали гидролизаты непищевых белковых основ: рыбной муки, казеина, белково-витаминного концентрата. Для сравнения использовали нативные пищевые и кормовые белковые основы из гоевой, гороховой, фасолевой и люпиновой муки. Установлено, что непищевые белковые основы по качественному составу аминокислот не отличаются друг от друга, а по количественному аминокислотному составу наиболее перспективной явилась белковая основа - казеин. В отличие от непищевых белковых основ пищевые и кормовые белковые основы (из соевой, гороховой, люпиновой, фасолевой муки) значительно отличаются между собой. Белковая основа из люпиновой и фасолевой муки, содержит намного меньше незаменимых аминокислот (12 и 7), чем из соевой (18). Все основы питательных сред из непищевого белка не уступают нативным основам и могут быть использованы в приготовлении питательных сред для культивирования гриба Е. Июх1ег1апа.

4. Использование питательных сред для получения покоящихся спор гриба ЕЛксоЛепапа

Одним из основных звеньев биотехнологии получения препарата на основе покоящихся спор Е.(Ьах(епапа является оптимизация питательных сред и сбалансированность их компонентов в соотношении с питательными потребностями гриба. В состав испытанных 16 питательных сред входили нативные и гидролизные, в качестве стандарта использовали среду на основе соевой муки. На нативных основах были приготовлены среды на основе фасолевой, гороховой и люпиновой муки, а также обезжиренном молоке. Из непищевых использовали среды на основе солянокислотного гидролизата казеина, протосубтилинового и панкреатического гидролизата БВК, сернокислотного гидролизата рыбной муки, автолизата суспензии отходов пивных дрожжей, панкреатического гидролизата рыбной муки, панкреатического гидролизата казеина.

На основе гидролизатов пищевого белка испытывали 5 сред: сернокислотные гидролизаты соевой муки, гороховой муки, люпиновой муки, а также обезжиренное молоко (табл.2).

Использование аминокислот грибом Е.Лах1епапа при культивировании на комбинированной и гидролизных средах, (%)

Аминокислоты Процент использования аминокислот грибом при культивировании

гидролизах соевой муки гидролизат фасолевой муки гидролизат гороховой муки гидролизат люпиновой муки гидролизат казеина Комбинированная

Аспарапшовая 64,0 — 100,0 — 70,0 8,3

Треонин 97,0 — 100,0 100,0 61,7 71,5

Серии 68,5 — 100,0 — 40,9 80,4

Глутамн попал к 76,1 — 71,6 реакция синтеза 41,0 95,1

Пролин 78,8 — 100,0 100,0 79,1 83,2

Глицкн 93,7 — 48,3 67,1 79,6 83,6

Алании 90,4 — 100,0 — 88,1 94,1

Цистин 100,0 100,0 100,0 — 61,8 100,0

Валин 100,0 — 100,0 100,0 49,4 100,0

Метиопин 100,0 100,0 100,0 100,0 72,2 100,0

Изолейщш 100,0 реакция синтеза реакция синтеза реакция синтеза 64,9 100,0

Лейцин 77,7 — 100,0 100,0 73,5 83,5

Тирозин 100,0 100,0 100,0 — 86,2 100,0

Фешиалашш 100,0 100,0 100,0 100,0 82,7 100,0

Лизии 100,0 52,6 100,0 100,0 84,0 96,6

Гистпдиц 52,8 43,0 50,0 88,0 71,7 89,3

Лрпшин 100,0 100,0 100,0 100,0 81,6 95,2

Установлено прежде всего, что питательные среды по качественному аминокислотному составу отличаются друг от друга. Наиболее богата аминокислотами была среда на основе солянокислотного пщролизата казеина. После культивирования некоторые аминокислоты ,

такие, как, цистин, валин, метионин, изолейцин, тирозин, фешшалашш, были использованы грибом полностью. В тоже время лспарапшопал кислота, треонин, серин, глутаминовая кислота, пролии, пшцин, алашш, лейцин, гистидин были использованы на разных питательных средах от 3% до 57%. Комбинированная среда на основе 50%-ного обезжиренного молока содержит в достаточном количестве все аминокислоты, причем некоторых даже больше, чем в среде с казеином. Используются они грибом более, чем на 71,5%, за исключением аспарагиновой кислоты. (8,3%). Минимальное потребление аспарагиновой кислоты грибом ЕЛках1гпапа из комбинированной среды указывает, что она значительно лучше других сред сбалансирована по аминокислотном],' составу.

Выявлена зависимость формирования мицелия и покоящихся спор на нативных и гидролизных средах (табл.3). Развитие гриба на нативных питательных средах частично зависит от их аминокислотного состава. На средах на основе фасолевой муки и люпиновой муки отмечена обратная зависимость между аминокислотным составом и количеством покоящихся спор, т.е. чем беднее среда, тем больше формируется покоящихся спор.

Образование покоящихся спор на гидролизных средах варьирует. Избыток аминокислот в среде на основе солянокислотного гидролнзата казеина и в среде на основе сернокислотного гидролизата рыбной муки приводит к очень низкому титру спор (2,1-Ю2 спор/мл и 1,4-103 спор/мл). Культивирование гриба на средах, основой которых являются ферментативные гидролизаты дало сходные результаты: тигр спор 2,64,2-104 спор/мл. Только в культуральной жидкости комбинированной среды и среды на основе автолизата пивных дрожжей титр спор значительно отличался и составил соответственно 1,6-107 и 2,(НО0. Накопление биомассы грибом ЕлИах1епапа на питательных средах с низким титром спор возрастало до 72%.

Изучение динамики спорообразования Е.(Иах(епапа на разных питательных средах показало, что в начале культивирования гриба на средах на основе СКГК, ФГБВК, ГРМ, ПГРМ, БВК, ПГК формировался ветвистый обильный мицелий, а пр^есс спорообразования затягивался. Первые покоящиеся споры были отмечены только на 4-е сутки (рис. 3). Избыток питания привел к удлинению вегетативной стадии развили гриба и замедленному формированию репродуктивной. Только на комбинированной среде и на основе АпивД наблюдали более раннее образование покоящихся спор.

Обобщение полученных результатов по изучению аминокислотного состава питательных сред, выходу биомассы и формированию покоящихся спор грибом ЕлЬах^папа на разных питательных средах

Рост и развитие гриба ЕлЪах1епапа на нативных и гидролизных питательных средах

Варианты Титр спор/мл Выход биомассы Содержание после культивирования, мг %

мл %

Соевая мука, стандарт 8,МО5 13,5 54,0 10,0

Фасолевая мука 1,5-Ю4 9,5 38,0 4,0

Гороховая мука 2,6-10' 8,0 32,0 6,0

Люпиновая мука 8,5-103 8,5 34,0 5,0

На основе СКГК 2,1-Ю2 18,0 72,0 3,0

На основе ФГБВК 4,2-104 15,5 62,0 5,0

На основе ГРМ 1,4-103 17,5 70,0 8,0

На основе г-та соевой муки 2,0-103 18,0 72,0 10,0

На основе г-та фасолевой муки 1,9-Ю3 18,5 74,0 6,0

На основе г-та гороховой муки 2,3-10г 17,5 70,0 8,0

На основе г-та люпиновой муки 2,1-Ю3 18,0 72,0 7,0

Комбинированная среда 1,6-Ю7 12,5 50 2-3

На основе АгашД 2,0-106 11,5 46 2-3

На основе ПГРМ 3,7-104 16,0 64 9

На основе гтанкр. Б13К 2,6-10" 16,0 64 5

Па основе ПГК 2,8-104 17,0 68,0 4,0

позволило придти к заключеию, что наиболее перспективными явились комбинированая среда на основе обезжиренного молока и среда на основе автолизата отходов пивных дрожжей, которые обоснованно можно рекомендовать в биотехнологию производства препарата.

Использование предложенных нами питательных сред в виде отдельных блоков полностью вписываются в интегрированную структуру биотсхнологической схемы получения биоматериала Е.1Иах(ег1ста на полиакрнламидноп основе.

Гитр спор/мл

Сутки

Питательные среды: 1 - на основе ПГК, 2 - на основе панкр. БВК, 3 - на основе Ш ИМ, 4 - на основе автолизата отходов пивных дрожжей, 5 - на основе обезжиренного молока, 6 - на основе ГРМ, 7 - на основе ФГБВК, 8 - на основеСКГК.

Рис. 3. Динамика спорообразования ЕлЪахгепапа на различных

питательных средах

5. Биологическая эффективность биопрепарата против гороховой тли

Изучение эффективности суспензии покоящихся спор гриба ЕлИах1епапа против'гороховой тли было проведено с использованием стандартной основы, 50%-ного обезжиренного молока и автолизата отходов пивных дрожжей. Первичные испытания проводили на лабораторной популяции насекомых. Для обработки использовали 5%-ную суспензию покоящихся спор гриба (табл.4)-. Как видно из таблицы 4, по всем трем вариантам, включая стандарт, при 5%-ной концентрации культуральной жидкости была достигнута биологическая эффективность от 59% до 78%. В контроле (обработки водой) численность вредителя возросла на 24-30%. Эффективность суспензии покоящихся спор на основе автолизата пивных дрожжей (непищевой белок) не уступает эффективности гриба, выращенного на соевой муке.

В полевых условиях испытание суспензии проводилось тоже на гороховой тле в Московской области и Ставропольском крае. Для приготовления рабочей суспензии брали 5% (3 мл) культуральной

Влияние суспензии покоящихся спор Е.ЛаЛепапа на гибель гороховой тли в лабораторных условиях (1992-1994 гг.)

Варианта 1992 г. Количество тлей 1993 г. Количество тлей 1994 г. Количество тлей Биологическая эффективность, %

До обработки после обработки До обработки после обработки До • обработай после обработай 1992 1993 1994

Контроль (вода) 100 130 100 124 100 127 0,0 0,0 0,0

5%КЖ соевой муки (стандарт.) 100 35 100 38 100 41 65 62 59

5 %КЖ комбинир. среды 100 25 100 31 100 22 75 69 78

5 %КЖ АливД 100 31 100 38 100 39 69 62 61

жидкости стандартной среды на основе соевой муки, 0,2% (0,13 мл) культуральной жидкости среды нфснове обезжиренного молока и 0,45% (0,27 мл) культуралъной жидкости среды на основе автолизата пивных дрожжей. Норма расхода суспензии - 60мл/м2 при титре спор 4,0-104 спор/мл.

Таблица 5

Гибель гороховой тли после обработки суспензией покоящихся спор ЕлЬШепапа в полевых условиях (Московская область, 1992 год, на 7 день после обработки)

Варианты Численность тлей Гибель тли, % Биологическая эффективность, %

ДО обработки после обработки

Контроль (вода) 211 237 численность увеличилась на'12,3 0,0

КЖ соевой муки (стандарт) 221 129 41,6 38,8

КЖ комбинированной среды 197 106 46,1 38,3

КЖ АпивД 207 116 43,9 38,4

Опыт, проведенный в 1992 г., показал, что при одинаковом тигре спор в рабочей суспензии биологическая эффективность во всех вариантах опыта была практически одинаковой и составляла 38,3%-38,8%.

Более низкая биологическая эффективность суспензии в естественных условиях, чем в лабораторных, связан^ с воздействием погодных факторов во время проведения эксперимента. Низкая относительная влажность воздуха и высокая среднесуточная температура, наблюдаемые в 1992 г., сказались на развитии энтомофтороза.

В 1993 г., когда погодные условия были более благоприятны для развития энтомофторовых грибов (рис.4), опыт был продублирован (табл.6). Гибель тли была более высокой и достигла 41-47%.

Дополнительные аналогичные опыты, проведенные в 1994 г. в

Гибель гороховой тли после обработки суспензией покоящихся спор Е. 1Ьах1ег1апа в полевых условиях (Московская область, 1993 год, на 7 день после обработки)

Варианты Численность тлей Гибель тли, % Биологическая эффективность, %

ДО обработки после обработки

Контроль (вода) 394 452 численность увеличилась на 14,7 0,0

КЖ соевой муки (станд.) 387 228 41,0 42,1

КЖ комбинирован. среды 426 235 44,8 40,3

КЖ АливД 417 221 47,0 . 43,9

Ставропольском крае, подтвердили результаты, полученные ранее в Московской области (табл.7).

£

о §

е >э

0 <0

1 Л»

I 0)

*о

е

70

60

гя

<в"50

г

о.

¡40

■9-

§30

о

§20 О

10

-

.1*

11

1 2 3 1 г 3 1 г 3 1 г 3

600 ' 450*1

П

4001 35о| 300 §

2501

Р

200

150 §

100 §

60 | т

0

08.06

15.06

22.06

29.06

06.07

1 - КЖ соевой среды

2 - КЖ комбинированной среды

Рис. 4. Динамика гибели гороховой тли от энгомофтороза (Московская область, 1993 год)

3 - КЖ отходов дрожжей

4 - Численность гороховой тли

.. Гибель гороховой тли после обработки суспензией покоящихся спор ЕЛЪах^папа в полевых условиях (Ставропольский край, 1994 год, на 7 день после обработки)

АО "Темижбекский"

Варианты Численность особей Гибель тли, % Биологическая эффективность, %

До обработки после обработки

Контроль (вода) 260 387 численность увеличилась на 48,8 0,0

КЖ соевой муки (ст.) 218 171 21,8 34,2

КЖ комби-нир. среды 210 164 21,9 36,9

КЖ АпивД 213 166 22,2 36,1

АО "Подгорненское"

Контроль (вода) 420 532 численность увеличилась на 26,6 0,0

КЖ соевой муки (ст.) 394 251 36,4 40,2 ■ 1

КЖ комби-нир. среды 403 262 34,9 37,6

КЖ АпивД 431 267 38,0 36,4

Можно полагать, что угнетающее действие на развитие энгомофтороза оказали не только погодные условия, но и предпосевная обработка семян гороха бенлатом, обладающим системным эффектом. Доади, выпавшие в конце июня, вызвали более интенсивное развитие энтомофтороза (рис.5) и последующее усиление эпизоотии.

Хотя эффективность испытанных культуральных жидкостей, стимулирующих энтомофторозы гороховой тли, не является достаточно

1 - КЖ соевой среды 3 - КЖ отходов дрожжей

2 - КЖ комбинированной среды 4 - Численность гороховой тли

Рис. 5. Динамика гибели гороховой тли от энтомофтороза

(Ставропольский край, АО "Темижбекский", 1994 год)

высокой, ее можно считать вполне допустимой, если учесть эффект экологической безопасности, что особенно важно для курортной зоны Ставрополья, а также если рассматривать этот прием как отдельный элемент в структуре интегрированной защиты.

6. Экономическая эффективность применения модифицированных питательных сред, используемых для получения покоящихся спор гриба ЕЛкссйепапа

Учитывая норму расхода суспензии для обработки 1м2 (60мл при титре спор 4,0-104 спор/мл) готовили рабочую суспензию. Таким образом, культуральной жидкости стандартной среды на соевой муке использовали 5% (Змл), комбинированной - 0,2% (0,13 мл), на основе автолизата отходов пивных дрожжей - 0,45% (0,27 мл). Затраты на приготовление 1 л среды на основе автолизата отходов пивных дрожжей превосходили затраты на стандартную и комбинированную среды. Расход культуральной жидкости стандартной среды для обработки 1 м2 составил 5,75 руб., комбинированной среды на обезжиренном молоке - 0,24 руб., среды на основе автолизата отходов пивных дрожжей - 0,59 руб. При этом экономическая эффективность обработки 1 м2 посевов составила

Затраты на использование суспензии покоящихся спор гриба ЕлНах1ег\апа, выращенного на разных питательных средах.

Показатели Среда на основе соевой муки (стандарт) Среда комбинированная Среда на основе Апив Д

Норма расхода, мл/.м2 3,00 0,13 . 0,27

Стоимость 1 л суспензии, руб. 1916,35 1817,52 2168,03

Стоимость суспензии на обработку 1 м2,руб. 5,75 0,24 0,59

5,56 и 5,16 руб. Обработка 1 гектара горохового поля с использованием стандартной среды составила 57500 руб., а модифицированных сред соответственно 2400 руб. и 5900 рублей.

ВЫВОДЫ

1. Изучение грибов рода ЕМоторЫЬога позволило выделить штамм Г-166, обладающий высокой энтомопатогенной активностью, продуктивностью и технологичностью.

2. Для уточнения биотехнологии производства ЕЛЪШепста определена роль Сахаров, витаминов и аминокислот при культивировании гриба. Наиболее эффективно гриб использует мальтозу, витамины В1( В,, В6> РР, биотин.

3. Установлено, что для усиления аэрации перспективно использование проксанола в концентрации 0,01% и перфтордекалина в концентрации 30%.

4. Выявлена эффективность замены агар-агара прлиакриламидным

гелем.

5. Экспериментально доказана зависимость развития гриба Ел1гах1епапа от аминокислотного состава питательных сред. Гриб нуждается во всех незаменимых аминокислотах, но в процессе культивирования максимально использует цистин, валин, метионин, изолейцин, тирозин, феннлаланин.

6. Из числа разработанных нами 15 летательных сред наиболее сбалансированы по аминокислотному составу среды на основе

обезжиренного молока и автолизата отходов пивных дрожжей, на которых формирование покоящихся спор отмечено на 3-й сутки.

7. Наибольший эффект обеспечивает среда, белковой основой которой является обезжиренное молоко; ее целесообразно использовать не только для получения покоящихся спор, но и для наработки посевного материала.

8. Для замены пищевого белка непищевым наиболее целесообразно для промышленного культивирования E.thaxteriana использование среды на основе автолизата отходов пивных дрожжей.

9. Предложена новая лабораторная технология культивирования E.thaxteriana на полиакриламидной основе.

10. Биологическая эффективность суспензии покоящихся спор E.thaxteriana против лабораторной популяции гороховой тли составила 59-78%, в полевых условиях Московской области - 41 - 47%, в Ставропольском крае - 34,2 - 40,2%.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Рекомендовать для промышленного культивирования штамм гриба Г-166 (E.thaxteriana).

2. Использовать в питательных средах при культивировании E.thaxteriana мальтозу и глюкозу, как более дещевый компонент.

3. Применять витамины группы В в качестве витаминных добавок к питательным средам.

4. Испытать в промышленных условиях лабораторную технологическую схему получения биопрепарата с использованием полиакрил амидного геля, отличающуюся экономичностью и технологичностью, а также провести полевые испытания.

5. В биотехнологии производства препарата из покоящихся спор E.thaxteriana применять питательные среды на основе обезжиренного молока и автолизата отходов пивных дрожжей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Миронова E.H. Энгомопатогенный гриб Entomophthora thaxteri-апа и его использование в защите гороха от гороховой тли. //Сб. Научных трудов. ВСХИЗО - Агропромышленному комплексу. - М., 1994.

2. Миронова E.H., Рахимов A.A. Оптимизация питательных сред, используемых для получения покоящихся спор гриба Entomophthora thax-teriana //Сб. Научных трудов. ВСХИЗО - Агропромышленному комплексу. -М., 1994.

3. Миронова E.H. Изучение возможности использования полиакриламидных (ПАА) основ для культивирования гриба Entomoph-thora thaxteriana //Сб. Научных трудов. ВСХИЗО - Агропромышленному комплексу. - М., 1995.

4. Миронова E.H., Яковлева Н.П. Повышение экологической безопасности защиты гороха от тли путем использования гриба Ento-mophthora thaxteriana //Сб. научных трудов. ВСХИЗО - Агропромышленному комплексу. - М., 1995.

5. Гнатиенко Г.Н., Миронова E.H. Применение многокритериального подхода в задачах оптимизации биологической защиты растений, (на укр.языке, в печати).