Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

БИОТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА ЭНТОМОФТОРОВЫХ ГРИБОВ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ПРОТИВ ГОРОХОВОЙ ТЛИ

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "БИОТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА ЭНТОМОФТОРОВЫХ ГРИБОВ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ПРОТИВ ГОРОХОВОЙ ТЛИ"

На правах рукописи МИРОНОВА Екатерина Николаевна

БИОТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА ЭНТОМОФТОРОВЫХ ГРИБОВ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ПРОТИВ ГОРОХОВОЙ ТЛИ

Специальность 06.01.11 - защита растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1997

- и ^рс^итепи

С"

Работа выполнена в Отделении "Питательные среды" и отделе средств защиты растений Государственного научного центра прикладной микробиологии и на кафедре защиты растений Российского государственного аграрного заочного университета в 1989- 1997 гг.

Научные руководители - доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН П.И. Сусидко; кандидат биологических наук, профессор Н.П. Яковлева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Г.А. Бегляров; кандидат биологических наук, доцент С.Н. Кручина.

Ведущее предприятие - ЦИНАО.

Защита диссертации состоится " " ¿¿^ 1997г.

в У^ часов на заседании<^;"2»-^/-£~нного совета Д. 120.35.09 в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева.

Адрес академии: 127550, Москва И-550, Тимирязевская улица, д. 49, корпус 8. Ученый совет МСХА.

С. диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ МСХА.

Автореферат разослан " " 1997г.

Ученый секретарь диссертационного совета -

доцент ¿¿К-—-. В.А. Шкаликов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ■

Актуальность темы. Перевод защиты растений на'экологическую' основу требует приоритетной разработки высокоэффективных нехимических средств, В практике защиты растений и в научных исследованиях в области- бнометода важное место занимают энгомофторовые грибы, как экологически безопасные энтомопатогены в борьбе с некоторыми сосущими вредителями. Они могут накапливаться в биоценозах, длительно сохраняться вне организма хозяина, вызывать массовые эпизоотии вредных насекомых на больших площадях (Воронина, 1989). В качестве объекта при изучении энтомопатогенной эффективности препарата на основе гриба E.thaxteriana нами был избран один из опаснейших вредителей гороха и других бобовых культур -гороховая тля Acyrthosiphon pisum Harris. В природе заражение тли происходит в основном конидиями гриба, но из-за короткого срока ; их жизнедеятельности основой биопрепарата энтомофторина сухого являются покоящиеся споры (Воронина, 1985). Для культивирования гриба используется соевая мука. Экономические проблемы привели к необходимости подбора новых источников сырья, замене пищевого белка непищевым. ' . " . ■ ; .

Промышленный выпуск биопрепарата на основе покоящихся спор гриба E.thaxteriana Fetch отсутствует. . . '

Цель н задачи Исследований. Основная цель наших исследований заключалась в разработке биотехнологии производства и оценке эффективности применения гриба E.thaxteriana, выращенного д на модифицированных; питательных средах, а также изыскании; новых источников сырья с целью замены пищевого белка непищевым. В рамках общей проблемы решались следующие задачи:

1. Выбор оптимального штамма E.thaxteriana с учетом инсектицидной активности по отношению к гороховой тле и степени воспроизводства.

2. Выявление возможности использования полиакриламидных основ (непищевого сырья) для поверхностного культивирования.

3. Использование белковых основ питательных сред с учетом замены пищевого белка непищевым. •'

4. Сопоставление аминокислотного состава гомогената гороховой тли с искусственными питательными средами и их анализ.

5. Определение влияния различных Сахаров, некоторых витаминов группы В и усиление аэрации путем использования перфторуглеродных, соединений на грпба Е. thaxteriana.

6. Определение ^^^^АтчЬШдйЬЩА^ектпв юсти использования Мое!' , • ОТЕКА

и .. ' ' Инв. Ns^

гриба Е.1Иах1ег1апа, выращенного на модифицированных питательных средах.

Научная новизна. Теоретически обоснована возможность замены пищевого белка непищевым при культивировании гриба ЕлИах1епапа. Рекомендована шгтательная среда, белковой основой которой является автолизат отходов суспензии пивных дрожжей. Доказана возможность использования перфторуглеродных соединений с целью усиления аэрации во время культивирования гриба Е.1Нах(епапа. Установлена корреляция между 'количеством инфекционного начала в рабочей суспензии и биологической эффективностью суспензии покоящихся спор гриба в лабораторных и полевых условиях. Предложена лабораторная технологическая схема производства препарата на основе гриба ЕЛках1епапа с применением полиакриламндного геля. Внесены изменения в технологическую схему получения энтомофторина сухого, в частности, предложена замена питательной среды для культивирования гриба.

1 Практическая значимость работы. На основании исследований, проведенных в 1989-1997 гг., получены результаты, позволяющие оптимизировать условия культпшфовалия гриба Елках1ег1апа. Доказана возможность использования отходов пищевой промышленности и белков микробного, происхождения для получения покоящихся спор ЕЛЬах1сг1апа, являющихся основой биопрепарата. Предложена технологическая схема производства автолизата отходов пивных дрожжей, ■. применяемого в качестве белковой ОСНОВЫ при культивировании • гриба. Это позволяет заменить пищевой* белок непищевым и тем самым снизить стоимость сырья. Экспериментально доказана возможность использования полиакриламидного геля как заменителя агар-агара. Использование гриба ЕлИсо^епапа, полученного на* разработанных нами питательных средах, позволяет относительно эффективно его использовать в полевых условиях, что способствует улучшению экологической обстановки путем сокращения или исключения * химических обработок.

Апробации работы. В течение 4-х.лет (1993-1996) на научных конференциях молодых ученых Российского государственного аграрного заочного университета докладывались результаты исследований, отражающие основные положения диссертационной работы. Результаты исследований, обсуждены на научном семинаре в Отделении "Питательные 'среды" и п отделе, средств защиты растений Государственного научного центра прикладной микробиологии. .

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научные статьи, одна работа находится в печати. *•

Структура и объем диссертации. Работа сосгош из введения, обзора литературы, материалов и методов исследовании, б глав, выводов и предложений, списка литературы, приложений. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста, содержт- 43 таблицы,, 44 рисунка. Список использованной литературы, включает 192 наименования, в том числе 52 иностранных источники . -

, СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2.1. Материал, .методика, условии проведении исследований.;

Объектом исследования служили 9 штаммов грибов , рода Епк>-торЫЬога, полученные из ВИЗР. Экспериментальный штамм Г-166 (ЕлНтаепапа), отобранный в результате изучения популяции,.способен расти на общепринятых для энтомофторовьк грибов питательных средах, обладает высокой вирулентностью по отношению к гороховой тле (6070%). ' * ;

Культивирование штамма проводили на разработанных нами 15 питательных средах.* Среда на основе соевой муки, предложенная сотрудагеами ВИЗР, использовалась в качестве стандарта: Условно5 все питательнью среды можно разделить на гидролизные среды и среды на нативной основе.1 Белковой основой гидролизных сред служили: солянокислотный гидролизат казеина, прогосубтилиновый гидролизаг белково-вигамшшого концентрата, сернокислотные гидролюаты соевой, фасолевой.гороховой, люпиновой муки, панкреатический гидролизаг рыбной муки, панкреатический гидролизаг белково-витаминного концентрата, панкреатический гидролизат казеина, автолизат суспешин отходов пивных дрожжей. Для приготовления сред на нативной основе использовали соевую, гороховую, фасолевую, люшшовую муку, а тагах обезжиренное молоко. - • : _

Наряду с методами, принятыми в практике защиты растений, использованы нетрадиционные для защиты . растений методы: определение аминного и общего азога, сырого протеина, количественное и качественное определение аминокислот и витаминов в белковых основах питательных сред и гомогенате гороховой тли . 8' ,

Изучая влияние витаминов на рост и спорообразование гриба,' использовали вотамины В1; В2, В6, РР, Н, а также дрожжевой автолтат, очищенный от витаминов, фирмы "БИсо" (США). В полевых исследованиях исгалтывалн культуральные жидкости на основе соевой муки, обезжиренного молока и автолнзага суспензии отходов пивных дрожжей. Полиакрнламидный гель получали по методике, разработанной в Киевском медицинском институте (Еилько, Гашинский, 1982). •

Влияние витаминов на рост и спорообразование гриба изучали с использованием витаминов В,, В2, В6, РР, Н, а также дрожжевого экстракта, очищенного от витаминов, влияние Сахаров»'-" с-использованием мальтозы, глюкозы, лактозы, сахарозы.

Учет 'ШСЛСННОСТИ гороховой тли в полевых условиях проводили по метод>; Э.Г. Ворониной. . , \ г;.

Статистическую обработку данных проводили методом; дисперсионного анализа (Доспехов, 1985), а. также с применением . многокритериального математического подхода для огпташзашга экспериментальных данных (Михалевич,' Волковйч, '."1982;. Волковйч,

Волошин, Горлова, 1984; Гнатиснко, 1990; 1992). : , ■ < --л.*}-"

"-••(, '• ■"

2.2. Морфолого-1сультуралы1ые особенности и эитомопатогенная > V I * ' характеристика гриба ЕЛИаа^епапа • ? ¡г&5

; В последнее время в биологической защите растений все шире. используются энтомопатогснные грибы, в частности, энтомофторовые • (Воронина, 1989). Пракппеское использование этих грибов сдерживают проблемы/биотехнологии получения биопрепарата. Биотехнология* ЕлЬах\ейапа включает: выбор штамма, оптимизацию питательныхсред, культивирование в производственных условиях, создание товарной, формы препарата. _

, Наши, исследования показали, что в зависимости от состава питательной среды и условий культивирования гриб формирует; несептированный мицелии, сферические конидии с сосочком на конце.! Размер шпшй при увеличении в 400 раз 27-31 мкм. - V ,

; При .глубинном культивировании максимальное образование покоящихся спор происходит на пристеночном кольце колбы, на границе; раздела жидкой и воздушной фаз. Покоящиеся; споры шаровидной, формы, диаметр 28-36 мкм при увеличении в 400 раз. :*, ;

"! #Срашпшип.ная инсектицидная активность испытанных 9 штаммов грибов ;рода ЕМоторЫНога против гороховой тли лабораторной: популяции представлена на рис. 1. Наиболее продуктивным оиоался шгамм Г-166. Титр спор у этого штамма на стандартной среде составил 8,0-105 спор/мл. , / Ч . ' '••

2.3. 0пт11.млльш,гс условия культивирования гриба Е./ЛсШепапа, ,

ДГ?|(Нами выявлено, что оптимальными условиями для процесса-роста' й 'спорообразования энтомофгоровых грибов является температура 26-28°С:н рН-, 6,5-7,5, что согласуется с данными Э.Г. Ворониной, Г.М." Гиндиной, И.И. Новиковой (1987). Полиакриламидный гель полностью

Г-161 Г-162

Г-166

• :" - 56%

■ ■ ■■ . * ■ ..........■ . ч» • , . » . г

■ . * Рис. 1. Сравнительная активность штаммов грибов рода ЕШоторЫЬога

против лабораторной популяции гороховой тли . : : ? ..

отвечает этим требованиям, поэтому его использовали как сшгтспркхкин заменитель агар-агара. Среды на его основе,'по сравнению с агаровыми, имеют ряд ¡преимуществ.».-<Их прозрачность облегчает изучение морфологии. термостабильность и устойчивость к низким значениям'рН расширяет ; " возможность изучения *. условий культивирования. Биологическая инертность открывает широкие возможности для создания

сред строго определенного состава.

Таблица 1

Влияние некоторых витаминов группы В на рост Л.«, »порообразование гриба ЕлЬаЯепапа

. •*'. • ^¿Варгаит"^-'-.'^ , . Км-во * ї витаминов в -среде.'мг/л .. ;*. Среднее число;'! , спор на 10 сутки : кульпт1фоваш1я ■

Кошроль (ЭД свободный от вютминов) _ ... 11 . .;

ЭД свободный от витаминов + В4 - - -5 . . 4],

ЭД свободный от витаминов + В2 - 5 - 24 ч...'

ЭД свободный от витамшов + В$ . . 5,- - '

ЭД свободный от витаминов + биотип Ю- , • 56

ЭД свободный от В1ггамшов + шшош ' 20 46 -

ЭД свободный от витаминов + В,+ В2+ Вв+бисгшн+ниащш '' 5+5+5+104-20 87*" ;

Полнакриламидную основу использовали для изучения влияния некоторых витаминов группы В на. рост и спорообразование гриба &№ах(ёкапа; а также возможность использования перфторуглеродных соединений (проксанол) с целью > усиления аэрации во время культивирования. ' V V." .

I;: Исследования показали,(табл. 1), что для роста'к. развития гриба необходимо I наличие в /питательной * среде всех - вишпшов • группы В.

; Однако/ в большей степени гриб нуждается в биотинеи пиридоксине (В6); в среднем количество спор в камере Горяева составляет.52^56 ппук,"а в контроле-11'штук. * V ' ... '

Разработанная нами лабораторная технология использования полнакриламидного геля заключается в увеличении : площади культивирования путем использования гранулированной полнакриламидной основы. Эту основу пропитывали питательной средой, вносили стерильный раствор глюкозы и проксанол. Дефицит кислорода создавали увеличением объема гранул полиакриламида до 75% от объема колбы* Проксанол использовали в концентрации 0,001%; 0,01%; 0,005% от объема питательной среды. В условиях дефицита кислорода проксанол оказывает существенное влияние на развитие Е.Ьках^папапри оптимальной концентрации носителя кислорода 0,01%. . V -.

^Исследованиями установлена эффективность использования поли-акрнламидного геля в качестве заменителя агар-агара (ттггр спор/мл 107). Ч

100,0Е«6' ' 10СЕ+6 1,СЕ*6 ЮО.СЕ+З 10.СЕ+3 , 1.СЕ+3 . 100.СЕ+0 «Тб.СЕ+О r -> Ï.CEtO

ПСреда 12

г

>> тя /

к

ч

V

□Среда 5

Глюкоза

Сахароза

Лактоза . Без Сахаров .

Гис.2. Влияние Сахаров на рост и спорообразование гриба E.thaxteriana

Выявлено, »что, гриб лучше расщепляет мальтозу (титр спор 1,7*10 спор/ мл)' Варианте с глюкозой титр спор составил 9,0-10 спор/мл, а^тактоза ингибируег, спорообразование (титр спор 1,1 -102 спор/мл), в то время как в ко1пролс (без Сахаров) титр спор 4,0-103 (рис.2). Для усиления аэрации в глубинной культуре использовали перфтордекалин различной процентной концентрации (0,5%; 1%; 5%; 10% ; 30%); наиболее эффаттной была конисшрация перфтордекалина не менее 30%..

., 3. Использование белковой основы питательных сред " — ■

В биотехнологий производства микробиологических препаратов!^ широко "используются1 гидролизаты. пищевого белка. ; Однако;- с; экономической точки; зрения они менее рентабельны." Взамен их мы« использовали гидролизаты непищевых белковых основ: рыбной муки, ! казеина, белково-витаминного концентрата, - Для сравнения., использовали нагавные пищевые и кормовые белковые основы из*: соевой, гороховой,'фасолевой и люпиновой муки. ~ '.*,«' . Г-Установлено,, что непищевые белковые основы по качественному; составу аминокислот не отличаются » друг .от» друга, . а по-количественному аминокислотному составу наиболее перспективной ? - явилась белковая основа - казеин. В отличие от нешицевьк белковьк- л основ пшцевые и кормовые белковые основы (из соевой, гороховой,! люпиновой, фасолевой муки) значительно отличаются между собой.; Белковая основа из люпиновой и фасолевой -муки, содержит намного; меньше незаменимых аминокислот (12 и 7), чем из соевой (18). Все; основы тпательных сред из непищевого белка не уступают-налшным* • основам и могут быть использованы в приготовлении питательных сред' дляку^тьтттфовашйгриба£.<Лах/епоиа.. Г \ п.- ¿--/Г*'

4. Использование питательных сред для получении '

, ■' | . покоящихся снор гриба Елках1епапа Г ф

й Одним из основных звеньев биотехнолопш получения препарата / , на основе покоящшсся^"спор' Е^ахИНта является оптимизация -питательных сред?; и - сбалансированность их компонентов<*Лв ' соотношении г с потательными потребностями гриба - В' состав* испытанных 16 питательных сред входили нативные и гидролизные, в качестве стандарта' использовали среду на основе соевой муки. На нативных'основах были приготовлены среды на основе фасолевой,4--гороховой "и люпиновой муки, а также обезжиренном молоке." Ш непищевых использовали среды на' основе солянокислотного_ гвдролттта казеина, протос>бт1иинового' Л панкреатического . гвдролизата БВК,| сернокислотного гидролнзата рыбной муки,:. автош!зата с>хпензии ■ отходов пивных дрожжей, панкреатического л гидролизата рыбной муки, панкреатического гидролнзата казеина. • -.

На основе гидролизатовпнщевого белка испытывали 5 сред: сернокислотные гидролизаты соевой муки, гороховой муки, люпиновой муки, а также обезжиренное молоко (табл.2).' * \ .

Таблица 2

■ ... - - • > ? Использование аминокислот грибом ЕлИсриег1апа

при культивировании на комбинированной и гидролизных средах, (%)

Аминохисгаты ;Процент использования аминокислот грибом при культивировании Л ;

гнлра-ппат соевой мути ги^ролизат фасолевой мути гилроліпат гороховой мути гвдроягоат хюпиновой муки гидра-злат ; г&зеина Комбини^ ро ванная

Аспарапіновії 64,0 — 100,0 7 ~ ■ 70,0 8,3 .

Треонин V ■ ■ ! ! " 97,0 — 100,0 100,0 61,7 71,5

Сгртш " 'Л. 68,5 ' — • 100,0 ; — 40,9. .80,4

Глутами 4.Т-невдяг 76,1 — 71,6 реакция синтеза 41,0 95,1

ІІролин -Ті Г ,78,8 — . 100,0 г _ 100,0 ..79,1 £83,21;

Глнщш■ • ; 93,7 ;48,з- • * 67,1 ~ 79,6 г 83,6 -.

Алании . ■ .90,4 . — 100,0 —. 88,1 94,1

{(истин!;■ 100,0 100,0 100,0 — - . 61,8 ' 100,0"

Валин'* 1 ■ 100,0 — 100,0 100,0 ; 49,4 100,0

Мстнонші' ' <гї 100,0 .100,0 . 100,0 100,0 . 72,2 100,0

Шолсйцпи ■ ■' . * ;. - • .1,00,0 реакция синтеза реакция синтеза реакция синтеза 64,9 100,0

Лейцин■" . < 77,7 — . .100,0. .100,0 • 73,5 : 83,5 ;

Тироіич .І " " 100,0 100,0 100,0 — 86,2 "* 100,0

«Ічннлалінин 100,0 . 100,0 100,0 100,0 82,7 100,0

Ліпші' .100,0 52,6 100,0 . 100,0 ... , 84,0 . 96,6 І

Гистидяк,-) ' * 52,8 43,0 , 50,0 \ 88,0 ; 71,7. :89,3 ■

Аршини;„' - .л'і к'ч. : 100,0 100,0 100,0 , 100,0 , 81,6 -95,2 Г;

/>, Установлено прежде всего, что питательные среды: по качественному аминокислотном}' составу, отличаются, друг; от друга.-Наиболее богата аминокислотами была среда на основе солянокислотного гидроштга качешт. После культивирования некоторые аминокислоты , ■

такие, как, цистин, валин, метионин, изолейцин, тирозин, фенилаланин,. были использованы грибом полностью. В тоже время аснарапшовая кислота, треонин, херин, глутаминовая кислота, пролин, глицин, алаинн,.* лейцин, пістидин были использованы на разных питательных средах ог 3% до 57%. Комбинированная среда на основе 50%-ною обезжиренного молокаходеряапгв достаточном количестве все амшюкислогы, причём некоторых, даже' болъше;»чем в среде. с'^¿¿шом.ГИспользротся: ониС грибом лболёе,* чем на 71,5%, за исключением аспарапшовой кислоты.^ (8,3%). Минимальное потребление аспарапшовой кислоты грибом; E-thaxteriana из комбинированной среды указывает, что она значительно лучше других сред сбалансирована по ашшокислотному составу. .. .

Выявлена зависимость формирования мицелия и покоящихся спор * на нативныхи гидролизных средах (табл.3). Развитие гриба на' нативныхТ питательных средах частично зависит от их аминокислотного состава. На средах на основе фасолевой муки и люпнновой муки отмечена обратная зависимость между аминокислотным. составом. и количеством покоящихся спор* т.е. чем беднее среда,. тем больше' формируется покоящихся спор. •

Образование покоящихся спор на гидролизных средах варьирует. Избыток аминокислот вг среде на основе аминокислотного гидролизата казеина и в среде на основе сернокислотного гидролизата рыбной муки приводит к очень низкому тіггру спор (2,Ы0г спор/мл и 1,4-103 спор/мл).. Культивирование гриба на средах, основой которых являются; ферментативные пщролизаты дало сходные результаты: тіпр^спор, 2,б^-4,2-104 спор/мл. Только в культуральной жидкости комбинированноft среды и среды, на основе -автолизата .пивных .дрожжей '.innp.tcnpp' значительно отличался и составил соответственно 1,6«107-и-2,Ь'Іб.л< Накопление ¿биомассы, грибом Ethaxteriana на шпательных средах' с низким титром спор возрастало до 72%. . ; -О-;

Изучение" динамики спорообразования E.thaxteriana на разных, шпательных средах показало, что в начале культивировашія гриба на средах на основе СКГК, ФГБВК, ГРМ, ПГРМ, БВК, ПГК формировался! ветвистый обильный мицелий, а пр'цесс спорообразовашія затягивался. Первые покоящиеся споры были отмечены только на 4-е сутки (рис. 3). Избыток питания привел к удлинению вегетативной стадии развития гриба и замедленному, формированию репродуктивной. Только на комбинированной {среде и на основе АпивД наблюдали более раннее образование покоящихся спор. ' '

Обобщение полученных результатов по изучению аминокислотного состава питательных сред, выходу биомассы и формированию покоящихся спор грибом E.thaxteriana на разных питательных средах

Таблица 3 .

Рост и развитие грибаЁлЬахйНапа га нативных ^ ^ ипиролизныхшггательныхсредах

< ¿.¿¿Вариант ".. Тигр . "спор'мл Выход биомассы : «Содержание после, куль-пшировагага, мг,%

мл*1 •*

Соевая м>ка, стандарт*. —».: 8,МО5 13,5 54,0 10,0 ■

' ФасоЛеваял'^тса" "т,5-ю4» 19,51» ¿•38,0*1.

Гороховая мука 2,6-104 8,0 32,0 6,0

Люшпговая мука 8,5-10' 8,5 34,0 5,0 , .

На'<хнове СКГК 2,1-'Ю' 18,0 72,0 = .....7з,о"-"г;-"-

Нагоюве ФГБВК-- 4,2-104 15,5 = -62,0 — -г- - -г Х-5.0.'

На основе ГТМ 1,4-10' 17,5 70,0 8,0 • : -

На основе г-та, соевой м>ки 2,0-105 18,0 72,0 10,0

На основе г-та фасспевой'м>'кн 1,9-Ю' • 18,5 74,0 % - - 6,0- ' ••Г/г*;..

На основе г-та ,* . * "гороховой л^ки * 2,3- 10г 17,5 70,0 . Г 8,0 • ;

На основе г-та : , ЛЮШШОВОЙ М}КИ 2,1-Ю1 18,0 - 72,0 ■ ; • 7,0 >:

Комбшпфовшпия среда** ' 1.6-107 12,5 - 50 - 2-3 % ;"■«

На основе ЛштД. 2,0-10' 11,5 . .46

На основе ПГРМ 3,7-10 4 16,0 . • 64 ;* -

На основе ианхр. ,БВК ' 2,6-104 16,0 64 . :

На"основё ПГК^ '-' 2,8-104 17,0 68,0 . , 4,0 ' '

,,Г,^' . Н . •

позволило придти к заключешо, что наиболее перспективными явились' комбинирования среда на основе обсзотгренного молока и среда на основе автолпзата отходов пивных дрожжей, которые обоснованно можно рекомендовать1 в биотехнологию производства препзрата/ ; Т Л

| Использование предложенных нами питательных сред в'виде отдельных блоков полностью вписьгеаются в интегрированную структуру биотсхнологическон схемы получения биоматсриала Е.(/1ах(епапа на иолиакрнламвднои основе. 4 • " - .. -.*•;

V -

'•¿Г-

Титр спор/мл - юо,ое+6-г

10.0Е+6-1.0Е+6-

юо,он+з-

;П;:10.0Е+3-

100.СЕ+0-10.0Е+0-1.0Е+0-

, I ЙЬ^ -

Сутки

... . Питательные среди:. 1 - на основе ПГК, 2 - на основе панкр. БВК, 3 - на основе ПГРМ, 4 - на основе автолизата отходов пивных дрожжей, 5 - на основе обезжиренного молока, 6 - на основе ГРМ, 7 - на .основе ФГБВК, 8 - на основе>СКГК. *

-Л ■ • . : -4 ¿Г?.- I . л I. 4- ;

. Рис. 3. Динамика спорообразования ЕлЪах1ег1апа на различных

• питательных средах*

5. Биологическая эффективность биопрепарата й ; против гороховой тли' ^

Изучение И эффективности суспензии покоящихся спор гриба ЕлкШспапа "против" гороховой тли было проведено с использованием стандартной основы* 50%-но го обезжиренного молока и автолизата отходрв V | пивных ^дрожжей^ : Первичные^ испытания: проводили на лабораторной популяцш^на^ использовали 5%- -

ную (успенмполокоящнхся спор гриба (табл.'4):;Как видно из таблицы 4, по всем'трем вариантам,1 включая стандарт, приу5%-ной концентрации культур альной жидкости была достигнута';би6л6пиеск&я эффективность от 59% до 78%.' В контроле (обработки водой) численность вредителя возросла 5 на 24-30%. Эффективность суспензии покоящихся спор на основе автолизата 'пивных_-дрожжей" (непищевой - белок) не уступает , эффект1шноста1риба, ¿¿Сращенного на соевой муке. *.

' В • 1юяа№"усло)шк^11(аапа1ше суспензии"проводилось тоже на гороховой-.тле в?Московской области и Ставропольском крае. Для приготовления рабочей ' суспензии ' брали 5% (3 мл) культуральной

* : Влияние суспензии покоящихся спор Е.Ша^епапа • • а. л -на гибель гороховой тли в лабораторных условиях (1992-1994 гг.);,2;

.р'сг Л. - ' •< Ц . .'¿а .Л \ '

Таблица 4

> 1 ¡ Варианта \ \ .. Л - .¡¿и- , а - / < .»■ V«V >« * V» * ~ г •<••■ .■•'>» 1' и * Л » ^ 4 ы 1, Т ■ ^ / " 1992 Г."--' ; ' " Количество тлей ' , 1 I . - . 1- ! % 1993 г. ^ Количество тлей - 1994г. : 1 \ ■ Количество тлей; ' Л Биатопиеская эффеюпшностъ', % .

•обработки " -после." 4 обработки: до * . обработай;. ".после < обработай .'• до ; ■ • обработки; . после ' ■.обработки".; П992 Г * . 1993 ' . 1994

"Кмггроль 1; г • (вода)"), г 100; Ь- ' '* Т, ~ ; £ ЧОО;:- ••г 124 1«я 4» ФЧ 0 Ы »-и.- * -V *«1. -V», ^ ' V - л ' гЩ'Ц .Л»'! ;о,о 0,0 ' г... >■ . <

.5%ОС : соевой "муки" (стандарт.): * 100* 1 "»>1Г Т' Т П 1%.' и ( Г •*' З5.т- 3 £ •** -;100. 38 г * -.Л 100 ; 62 ¡; "»•и: »V.. ' ,59/

5 % КЖ , • комбгашр.; ■ 'среди-.,'' * гюо " 1 ;Р : »#-->-»5 »■• / * «1» - о.« > -.; - г»* • • - ■ ч- ■• 'ЮО: , « «, -.*,." . * 31 "■'-100 ' "22 Г л-( ?5' * ; 69 78 '

5 %КЖ 1 • АпивД;-' 100>- • > 4 а, - 1- 'г 31 • «к. < <1 : • V ' - * ■ •*• ' 100 . А". 38' ?'Ю0 С ' -69 • . / д ;; 62 V 61...

13 м

жидкости стандартной среды на основе соевой муки, 0,2% (0,13 мл) кулиуральной жидкости среды наднове обезяафенного молока и 0,45% (0,27 мд) етльтур*альной*жйдкс)сти среды га!основе"автолгаата тшных дрожжей. Норма; расхода суспензии - бОмл/м 1 при .титре спор 4,0-10 спор/мл ''' ' ^ 11 п;«і>ї|а&- і

. і - • л;.»-.4--~ |Таблица5

' 1 * Гибель гороховой тли послеобработки суспензией! ; ь .¿покоящихсяспорКіЛахіегітавпбтвтуітітях^., [ ■ (Московская область, 1992 год, на 7 день после обработай) - - -

ї Варианты...* -Численность тлей-*~ ■ Пібель тли, .'. '..;.., % "Биологическая \ •; ■ ! г. эффективность,

до 'обработки •*;, после " * * £ _ • ч "обработки

Контроль*-? г — * (вода) / - ; ги ■ 1 л . .. 2з7 — : численность"' "увеличилась"*' на 12.3 •" ; г*5>0

КЖ соевой' ' _"""'" муки (стандарт)^ 221 ¡¿'•'•'1. .--Л 4*1 • 129 ! 41,6 • '".»". їіГ- 38,8

КЖ комбини-' роваиной среды 197 .; * 106 46*1 ; " 38,3

кж ' Ч-нГі*. АштД у* 2 . . ,.207 - 116 • -..... -•.-»г.іа^,' ' «Г— 43,9 - 38^4 ' * *

'.»'. Щ 1 ГГ}}"?? '>~ . ' '*.■•>• ~ м

Опыт, проведенный в 1992 г., показал, что при одинаковом титре

спор в?- ^бочей]}<7(Я1Ш^:)(биолопр»(асая' эффективность во всех

варгантах огалта бьша(тактически;одинаковой й' составляла 38,3%-

■38,8%: ТЛ^и ; •

Более-}• низкая биологическая *ц эффективность^ суспензии в естественньрс; условижс,; чемлв. лабораторных, связан^ с воздействием погодных] ^фаеторов ^ воу] время {проведешм I эксперимента. - Низкая относ1^тьная вла^ость воздуха и высшая среднесуточная температура, табгаодаёмые в^1992 г.; сказались наразвитая энпшофтороза.''!

В 1993 г., когда погодные условия были более благоприятны для развития\э*1ТОмофторовых; грибов^ (рис.4),. опыт былпродублирован (табл.б)?1то£^т.табша более высокой и досггагла 41-47%. .

ДогошпстедьнькГ;аналотчные;опыты,проведенные в, 1994 г. в

■ " '.' -•■*'' - ' .' I •':•: : ''' ¡ст.-1" •

* j j

. я. » " ^ •• ' • J » .

ачг »;

н i« j/ Таблица 6

' S • « *ч ч V i^il i Г'>г' |>,.( U» i

Гибель гороховой тли после обработки суспензиеи , „ ~

. * * t ы«. I » . » !1 •>, "i—r/J • > './Иль -Sil ч i*f >

«.*./'. покояпцкся cnop E.thaxtenario в полевых условшк^"^" г,,- ' t; - (Московская область, 1993Yo^ на 7 де^после обработки)'1 1, * "

' - ' ' * —*■ t ~ * * Варианты» . Численность тлей :; i Гибель тли,.1 'Vi 0/о-л;, Биолопгческая . 'эффективность,

» . Vi обработки t после. ] • ; обработки у

Контроль -'' (вода) ^ ^ - , ». -- «-.у- • - 394 .- •"Г.- r*/-! z ' 452 ^.численность, j .'увелищшась * на 14,7 ' ** vi i^i'ltt'«* f; 1 ■ i'. . . 0,0 .

КЖ соевой *! муки (станд.)* ; 387. " t > 228*"* * i4 xL* 1 W mi.iOWI 1 Г Jfb°vV' 1 * г * * i * 42 1 * «• Л J - i*~>1 i -V

КЖ комбини-* рован. среды v 426" • е-,-»« -л 235 ^П44,8..... 40,3

кж - , ЛпивД '417r'Ч » ' Г» г '47,0:1.. ____43,9 '

*i ч* . - /{'* \ г->-■ I с'-!'« -

* Ставропольском _ крае,_ подтвердили^ результаты,; отлученные^ ранее * Московской области (табл.7). I, \ , ч ,

» 7Q ___—^—^—КПП '

j

5 4*50. >а 3 t * о о. о! ?40 ■

S В

§■ §30-

; м о >

§ I20;

5

.10

ji

J?4

!

Ai i1 V- f-

r** »

y.. < : . > 4 V -" \ , — — ~ h „ \

u ir r:;: > N 4 \ Q •) • ■ 4 \ \ ■ХУ »

iл ~ ä i, ? i«

r .SV л J --vvC " i • t, p sä \ ) IS У ч\ л 4 * V \ •4 4 \ * t

u 1 2 3 r i 1 2 3 v! 1 2 3 -ff.-. 1 3 1

350,; 2.

К 250 g. ш

i-. - . о о ■ 200': - ь * • £ • 2 '< ■ 150 о * 2 vu : ■100g " i ч 50 ё

3" Г, О _ :

i !

* к

" I ""

* * . Л\-1;08Л6р»т }.15.0б ,<-22.06' г .гэ.ое.., ■ - 0е.07„ '-Л t (

- ' »":.• ; И »» »* »гf • < I ■ ' г

1 - КЖ соевойсреды ,~ 'г' ! 14 ^ " ^^ отходов дрожжей г

2 - КЖ комбинированной среды ¡г 4*- ^етенность гороховой тли.

Рис."4. Динашпса'гибели гороховой тли от экгомофтороза = »'.••• (Московская область, 1993 год)

15.» . С'-. *

....... . . ...» и,'-»^.-••^-(■•ж .Тавлцца7 '

,\; | Тифльтороховой тли шсле обработки сустеюйей|Ну'"и Г" 1такояшихся спор ЁМваеНспа в* полевых уатовиях* " ' ' , (Ставрополю^

■ ' • *•::•!!' грАО ¡ТемижввгамИТ"

1 * Численность особей " ' тйбель'тли,--*:" Биологическая

Варишпы' ■ 1:до "Г~ПОСЯв 1Г" эффективность^

обработай обработай

' .и Контроль | , (вода) *.ч.2б0 й ' ' ♦ -V. * * 5« ТУ4" -"?87., г.%- ► увеличилась на:

КЖ соевой муки (ст.) 218 . 171 21,8 34,2 . л* .

КЖ комби- . 210 «...164 21,9 36,9

нир. среды

КЖ АпивД . 213 166 ; 22,2 ; 36,1

4 - , " ... . ^ .,

Контроль'!1 (вода) 420 ' , ..... 'г Л: -! - ; .'•''532 ' ...численность увеличилась на, ' ; 26.6 * '; о,о

КЖ соевой 394 ..-'^.♦251 36,4 40,2

муки (ст.).

КЖ комби- . 403 ; 262 . ; 34,9 37,6

нир. среды • ...

КЖ •• 431 4 267 .: 38,0 36,4

АпивД ■ . - " у-г • ' I •'•*."'■ г'"!

Можно . полагать,.: что угнетающее действие на' развитие энгомофтороза оказали не только погодные'условия; но и предпосевная обработка семян гороха бенлатом, обладающим системным эффектом. Дожди, выпавшие в конце июня, вызвали более интенсивное,развитие энтомофтороза (рис.5) и последующее усиление эпизоотии.

Хотя эффективность испытанных культуральных жидкостей, стимулирующих энтомофторозы гороховой тли, не является достаточно

-1-КЖ соевой среды/ .. < s" ,г., 3 - КЖ отходов дрожжей 2 - КЖ комбшифованной среды* »v-У 4 -,Численность гороховой тли •„»,

: Рис; 5. Динамика гибели гороховой тли от энтомофгороза <

• ,-^ (Ставропольский край, АО "Темижбсксюш", 1994 год) . • "*

>. ' * « „,\ af, .Ьгс-»^ «W -I»»* Г i 4<eí; ж.1» - . "Я . + . л . .. * л ■ .

' высокой,.: ее ¿можно г считать; вполне допустимой, если учесть эффект ► экологической безопасности,?4To\oco6eHHo* важно 'для-курортной зоны • Ставрополья;-а также если 'рассматривать: этот прием как'отдельный: г.элсмекгвс1рук1урев^1ри^ваннойза1Ц1пы. -".-"и!. «

. . . ■ > " . * . * „ . .. ' " < ^ ' б. Экономическаяэффективность иримспсип» 1 . - : модифицированных питательных сред, используемых для. ' получения покоящихся спор грибаE.thaxteriana ' -

ч > -Учитывая норму расхода суспензии для обработки 1м*. (60мл при титре спор 4,0-104 спор/мл) готовилирабочую суспензию. Такті образом, культуральной жидкости стандартной среды на соевой щке использовали .5% (Змл); [комбинированной 0,2% (0,13 ;мл), . на основе автолизата ; отходов пивных дрожжей - 0,45% (0,27. мл). Затраты на приготовление 1 ♦л среды!на'іоснове'автолйзата:'отходов*пивных-дрожжей превосходили затраты 4 кна^і' стандартную и | • комбитфованную •-і среды. | - Расход. . культуратной жидкости Ъгс^

•:5,75 рубДкомбинированной^^^еда*га;обёзж^ешом молоке - 0,24 руб.,. - среды:на5<зсвювё;автолизата*от При

этом зкошміїчесі^^ффектішность /обработіаі *1 м2 посевов составила

і »

V ' ^ '.Таблица 8

Затраты на использование сусиензш! покоящихся спор гриба,. * ЕлЪахЫг\апа, выращенного на разныхпигательных средах;1 :

= ;; • Показатели - Среда на основе; соевой муки (стандарт) . — '•Среда : Комбинированная' * ';• ;' '.Т ' • Среда на ' основе'АгатД < , 11 > ■ . ■ . -

Норма расхода, мл/м1 . • :з,оо>». ■ $ •да.:;

Стоимость' 1 л суспензии,1 руб. ' .1916,35 <Л • .-г ,г 1817,52 . . . « ЯП.Т ¡4 . 2168,03,

Стоимость суспензии -на обработку 1 м^руб. 5,75.-?

5,56 и 5,16 руб. Обработка 1 гёкп!ра'горохового поля с использованием стандартной средысоставила 57500; руб.,а модифицированных сред соответственно 2400 руб. и 5900 рублей.'* '** ' !.

М-''"'' "

, ВЫВОДЫ . ■ ' / ^ •' ^

1. Изучение грибов рода Еп1оторЫНога позволило 'выделить штамм Г-166, обладающий высокой энгомопатогенной активностью, продукпшносгью и^технологичностью/ ; * ' X . :?:;>.'

2. Для 'уточнения'' биотехнологий ' производства КОгахЫНапа определена рольСахаров^ вигашпгов иаминогагслотпри

гриба. Наиболее эффективно гриб использует'мальтозу,'витамины В,, В,, В6, РР, биотин.^ .. / ^ / г . : . г

3. Установлено, что* [для . усиления аэрации перспекпшно использование проксанола в концентрации 0,01% и перфтордекалина в концентрация 30%.

4; Выявлена эффективность замены агар-гитара прлиакриламцдным гелем. ^"'"ЧЧ"" ■ •*.. - 1 Л,-.' '• ,

¿.Экспериментально*,. доказана] зависимость развития гриба ЕлЬа^епапа | шгательных "сред.''Триб

нуждается . во, всех незаменимых . а\11шокислотах, но ¿" процессе кулытодовгаия; максхшально использует * ¿истин, валин^метионин, изолейщга, тирозин, фенилаланин. 4,1'""''"■::. ! ''" *

б. Из числа разработанных нами 15' питательных сред наиболее сбалансированы по аминокислотному составу* среды на основе

обезжиренного молока и автолизата отходов пивных дрожжей, на которых формирование покоящихся спор отмечено на 3-й сутки.

7. Наибольший эффект обеспечивает" среда,'белковой основой которой является обезжиренное'молоко;: ее целесообразно использовать не только для получения покоящихся спор, но и для наработки посевного материала.^*, ;. ;-'ч<*',,1;'> Иг,':I

*' * 8. Для замены пищевого белка непшцевым наиболее целесообразно,; для промышленного iyjaTmH^BaH^'E.th}a:ieriärja использование среды на основе автолизата отходов шшных дрожжей. -- - • . - --

• ] ' 9: Предложена новая^лабораторная технолопи культивирования г E.thaxteriana на полна^иламмдаой основе. '' »' . ,

• 10. Биологическая эффективность суспензии покоящихся спор Е.thaxteriana.Г против лабораторной.популяции гороховой тли составила^ 59-78%, ¿В;" полевых условиях' Московской; области - 41 -47%,;.в; Ставропольском крае — 34,2-40,2%: <

. .. , ПРЕДЛОЖЕНИЯ

- 4 5,

■ !Ц . > • i t* ~ ■>

, - 1. Рекомендовать для промышленного;культивирования штамм грибаT'\66^(E.thaxteriana). , ^ ' " ' ~

2; Использовать - в питательных .средах при культивировании . E.thaxteriani ; мальтозу и глюкозу* как более дешевый компонент.

3. Применять витамины грухты В в качестве витаминных добавок к питательным средам.-,, , ^ ( _ < ч ■

4.Испытать в» 'промышленных условиях лабораторную технологическую; схему получения. биопрепарата с использованием полиакрил^Гщщо"гоГ.<геля,^^ отличающуюся, - экономичностью . и технологичностью, а также провести'полевые испытания. .

1 5. В "биотехнологии производства препарата из покоящихся спор E.thaxterianal "применять гагтательные: среды, на основе обезжиренного молока и автолизата отходов пивных дрожжеи. ^ ^ ,

, : Список работ, опубликованных по теме диссертации. Л

_ 1: Миронова E.H. Энтомопатогенный гриб Entomophthora thaxteriana н его'использование в защите гороха от гороховой тли. //Сб. Научных трудов. ВСХИЗО -\А1ропромьпш1енному комплексу. - М., 1994. - ',; ; , _ 2. МироноваE.H.,': РахимовА.А;-.01тшизация питательных сре^"-используемьк для получения покояхщкея спор "триба Entomophthora thaxteriana //Сб. Научных трудов. -ВСХИЗО Агропромышленному

3.Миронова E.H. Изучение возможности использования полиакриламидных (ПАА) основ для культивирования гриба Entomoph-thora thaxteriana //Сб. Научных трудов. ВСХИЗО - Агропромышленному комплексу. - М., 1995. . 1 '

4. Миронова E.H., Яковлева Н.П. Повышение экологической безопасности зашиты гороха от тли путем использования гриба Ento-mophthora thaxteriana I ICQ. научных трудов. ВСХИЗО - Агропромышленному комплексу. - М., 1995. -

5. Гнатиенко Т.Н., Миронова E.H. Применение многокритериального подхода в задачах оптимизации биологической защиты

растений, (на укр.языке, в печати). "