Разработка и оценка качества новых питательных сред и стимуляторов роста микроорганизмов на основе активированных гидролизатов из молок рыб и вермикультуры

Ткаченко, Инна Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и оценка качества новых питательных сред и стимуляторов роста микроорганизмов на основе активированных гидролизатов из молок рыб и вермикультуры
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и оценка качества новых питательных сред и стимуляторов роста микроорганизмов на основе активированных гидролизатов из молок рыб и вермикультуры"

На правах рукопи

ТКАЧЕНКО Инна Николаевна

Разработка и оценка качества новых питательных сред и стимуляторов роста микроорганизмов на основе активированных гидролизатов из молок рыб и вермикультуры

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-з ДЕК 2009

Ставрополь - 2009

Работа выполнена в

ГОУ ВПО «Ставропольский государственный университет» и Южном научном центре Российской академии наук.

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор Тимченко Людмила Дмитриевна.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Жарникова Ирина Викторовна;

доктор медицинских наук Алиева Елена Васильевна.

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия».

Защита диссертации состоится 2009 г. в /у часов на заседании диссертациоййбго советй ДМ 212.256.09 в Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, 1, корп. 2, комн. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан

У^ С^Л 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Ржепаковский И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

■ 'Актуальность исследования. Культивирование микроорганизмов является важным этапом в промышленной и экспериментальной микробиологии. Основой успешного культивирования, обеспечйШо1!цёи максимальное накопление биомассы и поддержание активности штаммов,' является подбор питательных сред в соответствии с питательными и другими физиологическими потребностями микроорганизма (Малахов 'Ю.А. ii '¿ф:, 2000; Прозоркина Н.В., Рубашкина JIA., 2002; Faine S., 1982). Особое место среди "известных в микробиологии питательных сред занимают универсальные, на которых можно культивировать широкий перечень самых различных микроорганизмов, что обусловливает их высокую потребность. Лучшие из этих сред традиционно готовят на основе сырья природного происхождения.

Однако, вопросы разработки технологии, стандартизации, оценки качества питательных сред из природного сырья имеют определенные трудности в решении (Бубеев А.Т. и др., 2005). Это обусловлено, прежде всего, снижением качества самого сырья, в частности, мяса и растительных объектов, в связи со сложной экологической обстановкой* и антропогенным воздействием на окружающую среду. В сырье зачастую содержатся антибиотики, химикаты, нитраты, токсические продукты, что отрицательно отражается на культивировании и приросте биомассы микроорганизмов, снижает результативность диагностических исследований (Рябов В.Е. ¡и др., 1996; Вартанова Н.О. и др., 2005; Waguespack М., 1986; Corrigan P.J., Seneviratna Р., 1989). Кроме того, мясное сырье является дорогостоящим. Важность и острота проблемы снижения качества питательных сред подчеркивается многими исследователями (Зелютков Ю.Г. и др., 2007).

Важнейшим аспектом их разработки и применения в настоящее время является направленное усиление, ингибирование или выявление генетически присущих данному виду микроорганизмов культур ально-морфологических и биохимических особенностей (Ахапкина Hi"., Блинкова. ДД.„ 2001),;

Заслуживают внимания три основных пути оптимизацци и совершенствования питательных сред. К первому относят добавление различных питательных добавок и стимуляторов роста (Macfarlane D.E., Elian-Jones Т.Е., 1980). Второй путь связывают с поиском нового сырья, бргатого белками для приготовления питательных основ, среди которых особое место отводится белковым гидролизатам (Трошкова Г.П. и др., 2006). В последнее время проводятся исследования, связанные с возможностью использования белковых гидролизатов из нетрадиционного сырья: отходов мясной, молочной, рыбной и птицеперерабатывающей промышленности (Трошкова Г.П. и др., 2006). Третий путь — это разработка путей и методов повышения качества сырья, используемого для приготовления микробиологических питательных сред, направленных на увеличение в нем биологически активных компонентов. Сообщения о реальных результатах в этом направлении единичные (Панова Н.В., 2006).

В связи с вышеизложенным, изыскание новых, экологически чистых и экономически о прав|^йь<х'источников сырья, а также путей повышения его биологической. ,прлноценности с целью разработки высококачественных питательных сред, является актуальной и своевременной задачей.

Цель исследования: провести качественную оценку новых питательных сред, разработанных на основе активированных гидролизатов из молок рыб и вермикультуры. .

Основные задачи исследования:

, обосновать возможность и перспективы использования молок лососевых рыб и вермикультуры. калифорнийского червя в качестве сырья для гидролизата -г основы микробиологических питательных сред;

..- предложить и экспериментально обосновать пути повышения биологической полноценности гидролизата из нетрадиционного сырья;

•>,« изучить.возможность проведения гидролиза из активированных молок, лососевых рыб :и вермикультуры по различной технологии (кислотный^ щелочной и ферментативный);

- определить физико-химические свойства белковых гидролизатов, приготовленных из активированного сырья;

- разработать рецептуру новых питательных сред на основе гидролизатов из нетрадиционного сырья;

- провести сравнительное изучение ростовых качеств питательных сред на основе активированных гидролизатов из молок лососевых рыб и вермикультуры нё различных штаммах микроорганизмов;

изучить: возможность использования ферментативных гидролизатов из вермикультуры и молок лососевых рыб с поджелудочной железой крупного рогатого скота и пепсином в качестве стимуляторов роста микроорганизмов на примере Shigella flexneri и Staphylococcus aureus-,

- рассчитать экономическую эффективность применения новых питательных сред по сравнению с аналогом.

Научная новизна исследования. Впервые в качестве основы микробиологических питательных сред предложено использование гидролизатов из молок лососевых рыб и вермикультуры калифорнийских червей.

На примере вермикультуры доказана целесообразность и отработана технология активации сырья с целью повышения его биологической полноценности. Предложены собственные модификации методики активации.

Отработана технология гидролиза из молок лососевых рыб и калифорнийских червей, позволяющая добиться высоких стандартных показателей качества гидролизата (аминный и общий азот) в сочетании с высокой биологической активностью за счет содержания широкого перечня микро-, макроэлементов, аминокислот, углеводов, органических кислот, витаминов.

вермикультуры, доказано, что наивысшей биологической активностью обладают ферментативные гидролизаты. . " "*

Разработаны новые питательные среды на основе активированных гид-ролизатов из молок лососевых рыб и вермикультуры.'.'1'""'"

Впервые подтверждена универсальность питательйах' срёд"йк' бсНове активированных ферментативных гидролизатов Из калифорнийских червей с поджелудочной железой крунно/о рогатого скота и ш молок лососевых рыб с поджелудочной железой крупного рогатого ¿кота я пененном, и их преимущество по сравнению со средами, изготовленными на основе кислотного и щелочного гидролизатов. Наибольшая универсальность присуща питательной среде на основе ферментативного гидролизата из калифорнийских червей с поджелудочной железой крупног о рогатого скота.

Впервые на примере Shigella flexneri и Staphylococcus aureus, при их культивировании на традиционных питательных средах, доказана возможность использования ферментативного гидролизата из молок лососевых рыб с поджелудочной железой крупного рогатого скота и пепсином, а также ферментативного гидролизата из вермикультуры с поджелудочной железой крупного рогатого скота в качестве стимуляторов роста микроорганизмов.

Доказана экономкчё6кая_ эффективность применения новых питательных сред по сравнению с аналогом.

Приоритетность выполненных исследований подтверждена патентами № 2348686 «Питательная среда для культивирования микроорганизмов» и № 2352134 «Способ получения гидролизата из молок лососевых рыб».

Теоретическая и практическая значимость исследования. Результаты, подтверждающие целесообразность активации сырья с целью повышения его биологической полноценности в соответствии с потребностями микроорганизмов, и использования активированных гидролизатов в качестве компонентов питательных сред, дополняют и расширяют сведения о механизмах регуляции метаболизма и принципах культивирования бактерий.

Разработанные рекомендации могут быть использованы для наращивания бакмассы на предприятиях микробиологической промышленности и в лабораторной деятельности микробиолога. На основании проведенных исследований по испытанию активированных гидролизатов из калифорнийских червей с поджелудочной железой крупного рогатого скота и молок лососевых рыб с поджелудочной железой крупного рогатого скота и пепсином, а также питательных сред на их основе, разработана и утверждена на производственном уровне техническая документация. Научные разработки используются в работе Ставропольского научно-исследовательского противочумного института и научно-образовательного центра «Технологий живых систем, биологические материалы» Ставропольского государственного университета. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе Ставропольского филиала Московского государственного гуманитарного университета им. М.А. Шолохова, Ставропольской

государственной медицинской академии, Северо-Кавказского государственного технического университета (Ставрополь) в качестве дополнений к учебным материалам по дисциплинам «Микробиология», «Биотехнология», «Частная микробиология», «Санитарная микробиология», «Биотехнология, промышленное и хозяйственное использование микроорганизмов».

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные аспекты жизнедеятельности человека на Севере» (Архангельск, 2006 г.); на научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 2007г.); на третьей и четвертой ежегодной конференций студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН (Ростов-на-Дону, 2007; 2008 гг.); на научных конференциях «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2007; 2008 гг.); на X Международной научной конференции «Биологическое разнообразие Кавказа» (Грозный, 2008 г.).

Гидролизат из молок лососевых рыб и питательная среда на его основе представлены на Всероссийской выставке-ярмарке научно-исследовательских работ и инновационной деятельности молодых ученых «ИШЮВ-2007» (ЮР1ТУ, Новочеркасск, 2007 г.); на Международной ярмарке «Идеи, инновации и инвестиции IENA-2007 г.» (Нюрнберг, Германия, 2007 г.); VIII Московском Международном салоне инноваций и инвестиций (Москва, 2008 г.); на VI и VII Международных специализированных выставках «МИР БИОТЕХНОЛОГИИ 2008,2009» (Москва, 2008, 2009 гг.) и награждены 5 дипломами, 2 серебряными й 2 золотыми медалями.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Теоретически и экспериментально обоснованная на примере верми-культуры технология активации сырья для производства микробиологических питательных сред* позволяет повысить его биологическую полноценность, что обеспечивает высокое качество и экономические преимущества полученных гидролизатов.

2. Лучшими физико-химическими характеристиками и стандартными показателями качества за счет содержания широкого перечня микро-, макроэлементов, аминокислот, углеводов, органических кислот, витаминов отличаются ферментативные гидролизаты (по сравнению с кислотным и щелочным), изготовленные из обоих видов активированного сырья.

3. Питательные среды на основе ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, в отличие от сред, приготовленных по другим рецептурам, являются универсальными и по показателям скорости роста, количеству колоний, проявлению культу-ральных особенностей, при сохранении тинкториальных, морфологических, биохимических свойств всех тестовых микрорганизмов, а также по экономической эффективности превосходят агар Хоттингера.

4. Результаты исследования влияния активированных ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином на рост микроорганизмов Shigellaflexneri и Staphylococciis aureus в малых дозах, свидетельствуют о выраженных стимулирующих свойствах гидролиза-тов и расширяют перспективы их применения в качестве стимуляторов роста микроорганизмов при добавлении к традиционным питательным средам.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 12 печатных работ, в том числе одна из них в периодическом издании из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 168 страницах машинописного текста, иллюстрирована 37 рисунками, 13 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений и приложений. Список использованной литературы содержит 269 источников, в том числе 50 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в течение 2005-2008 гг. на кафедре общей биологии Ставропольского государственного университета и базовой кафедры гидробиологии и экотоксикологии Южного научного центра РАН. Научно-производственные опыты, апробация и производственные испытания новых питательных сред проводились на базе НОЦ «Технологии живых систем, биологические материалы», ПНИЛ «Экспериментальной иммуномор-фологии, иммунопатологии и иммунобиотехнологии», лаборатории питательных сред Ставропольского научно-исследовательского противочумного института, Краевой клинической инфекционной больнице (Ставрополь).

Гистологические исследования калифорнийских червей проводили по общепринятой технологии с окраской гематоксилин-эозином (Сулейманов С.М. и др., 2000).

При выполнении работы были использованы тест-штаммы микроорганизмов, полученные из ГИСК им. JI.A. Тарасевича: Shigella flexneri la 8516, Pseudomonas aeruginosa 27/99, Serratia marcescens-1, Shigella sonnei «S-form», Salmonella typhi H-901, Streptococcus faecalis-602, Yersinia pestis EV, Escherichia coli CA-18, Streptococcus pyogenes Dick-1, Corynebacterium xerosis 602.

В качестве сырья для приготовления гидролизатов использовали молоки лососевых рыб ТУ 9267-037-33620410-04 и биомассу калифорнийских червей.

Основой для получения гидролизатов явились рекомендации, изложенные Ю.А. Козловым (1950).

Ферментативные гидролизаты из молок лососевых рыб готовили с поджелудочной железой КРС и пепсином, с трипсином, с трипсином и желчью, с поджелудочной железой КРС. Кислотный и щелочной гидролизаты из молок

лососевых рыб получали с использованием 1 % растворов HCl и NaOH. Гид-ролизаты из активированных и неактивированных калифорнийских червей готовили ферментативным способом с поджелудочной железой КРС.

Получение плотных и жидких питательных сред готовили по методам, изложенным в справочной литературе (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М., 1982).

Аминный азот, pH, общий азот, хлориды определяли в соответствии с МУК 4.2.2316-08.

Процент расщепления белка определяли путем деления показателя аминного азота на количество общего азота.

Анализ микро- и макроэлементов проводили методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии на приборе ААС марки Perkin Elmer 2280 (производство США) (Ягодин Б.А. и др., 1987).

Анализ свободных аминокислот, углеводов и органических кислот осуществляли методом тонкослойной хроматографии (Шаршунова М. и др., 1980).

Витамины выявляли с помощью качественных реакций (Полюдек-Фабини Р., Бейрих Т., 1981).

Для оценки активности активированных и неактивированных гидролизатов из вермикультуры использовали способ К. Бакирджиева (Калашник И.А., 1990).

Микробные взвеси суточных культур тест-штаммов готовили по оптическому стандарту мутности ОСО, ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Так, в 0,9 % растворе натрия хлорида в объеме 4,5 мл доводили до конечной концентрации 1,0x109 м.к./мл по ОСО мутности (42-28-85 П) 10 единиц.

Проводили подсчет выросших колоний, а также микроскопию мазков, приготовленных из суточных агаровых культур и окрашенных по Граму.

Фотографирование мазков, окрашенных по Граму, осуществляли при помощи компьютерного комплекса; визуализации изображения на базе микроскопа «Микмед-2» и цифровой фотокамеры «Olympus-5060».

Результаты экспериментов подвергали, вариационно-статистической обработке с помощью программы Primer of Biostatistics (Version 4.03).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработка технологии получения гидролизатов из активированных молок лососевых рыб и калифорнийских червей

Полноценность гидролизата зависит от качества используемого сырья, которое должно содержать максимальное количество полноценного белка, витаминов, микро- и макроэлементов, быть экологически чистым и безвредным, легко воспроизводимым, доступным, обеспечивать экономическую эффективность применения. С учетом требований и на основании аналитического обзора в качестве исходного сырья для приготовления новых питательных сред нами выбраны вермикультура калифорнийского червя и молоки лососевых рыб.

Биомасса калифорнийских червей (Eisenia fétida) значительно превосходит мясное сырье по содержанию протеина (от 68 до 82 %) и не уступает

ему по количеству незаменимых аминокислот, витаминов, микро- и макроэлементов.

Молоки лососевых рыб содержат до 16,3 % белка, в большом количестве фосфор, натрий, магний, калий, железо, витамины: Вь В2, В12, РР, С (в том числе и жирорастворимые), жирные кислоты омега-3, протамины.

Несмотря на высокий биологический потенциал'исходного' сьфья, нами предприняты дополнительные попытки его повышения с помощью ряда манипуляций. Пути активации биомассы калифорнийских червей заключались в поочередном воздействии на них полупроводниковым низкочастотным лазерным аппаратом АЛ-01 «Семикон» с интервалом в одни сутки и помещении их в холодильную камеру при температуре плюс 4...8°С после каждого сеанса облучения. Целесообразность применения лазера была подтверждена гистологическими исследованиями после первого и второго облучения. В кожно-мускульном мешке червей наблюдается гиперемия и увеличение количества клеток с крупными ядрами — амебоцитов. По нашему мнению, это связано со стимулирующим эффектом на обменные процессы в тканях. Сочетание принципов лазерного облучения калифорнийских червей, с последующим воздействием на них условий низкой температуры способствует поэтапному выбросу большего количества биологически активных веществ и повышению их активности, а также накоплению в субстрате в свободном состоянии.

Активация молок лососевых рыб по методике приготовления тканевых препаратов обеспечивалась уже самим технологическим циклом отлова и заготовки рыбы. По технологии, после извлечения из снулой рыбы, они подвергались поэтапно охлаждению и последующей заморозке — это исключило действие на них полупроводникового низкочастотного лазерного аппарата. Условия низкой температуры обеспечивают повышение биологической активности ткани за счет образования биогенных стимуляторов. Активное их накопление происходит уже с момента извлечения рыбы из воды на протяжении всего времени до момента непосредственной заморозки.

После активации сырья осуществляли его гидролиз, при температуре 37±1°С. Из молок лососевых рыб было приготовлено четыре гидролизата ферментативным способом: с поджелудочной железой крупного рогатого скота й пепсином, с трипсином, с Трипсином и желчью, с поджелудочной железой крупного рогатого скота. Химическим способом были приготовлены кислотный и щелочной. Гидролизаты из активированных калифорнийских червей готовили только ферментативным способом с учетом близости их химического состава к мясу. Для сравнения проводили гидролиз из неактивированной вермикулыуры.

Биологическая активность гидролизата, приготовленного из активированной вермикультуры, на 30 % выше, чем из неактивированной.

Физико-химические свойства активированных гидролизатов

; : > ' ' I " I

В гидролизатах всех видов, приготовленных из молок лососевых рыб, а также в ферментативном — из калифорнийских червей, изучали физико-химические свойства.

Из результатов следует, что кислотный гидролизат молок лососевых рыб (КГМЛР) и щелочной гидролизат молок лососевых рыб (ЩГМЛР), уступают всем ферментативным гидролизатам по показателям аминного, общего азота и расщепления белка. Среди ферментативных гидролизатов, приготовленных из молок лососевых рыб, максимально высокое количество аминного азота содержалось в ферментативном гидролизате из молок лососевых рыб (ФГМЛР) с поджелудочной железой крупного рогатого скота (КРС), и дрнрлн.ом - 0,25210,001 % (Р<0,05). Соответственно общий азот и расщепление -белка в нем было тоже максимальным — 0,550±0,001 % и 46,0±0,001.%. Самый,высокий аминный азот (0,786±0,004 %) был в фер-мштативном гидролизате калифорнийских червей (ФГКЧ) с поджелудочной железой-КРр. Общий азрт В1 нем составил 1,021±0,005 %, а расщепление белка - 77;0:Ь0.(001 %, что-значительно превосходило по всем показателям ФГМЛР с поджелудочной, железой 1СРС и пепсином (Р<0,05). Таким образом, среди гидролизатов,: приготовленных из молок лососевых рыб, наибольшие показатели аминного, »общего азота и расщепления белка были в ФГМЛР р. поджелудочной; железой, КРС и пепсином, но в сравнении с ФГКЧ с поджелудочной железой КРС они были меньшими.

Среди,гидролизатов из молок.лососевых рыб, наибольшее количество микро- и макроэлементов в ФГМЛР о ¡поджелудочной железой КРС и пепсином, но меньшими в сравнении с ФГКЧ с поджелудочной железой КРС. Цинк, железо, натрий, калий, магний, кальций содержали все гидролизаты. Медь содержали гидролизаты, .приготовленные из молок лососевых рыб: ФГМЛР, с поджелудочной железой КРС и пепсином, ФГМЛР с трипсином и КГМЛРч Наименьшее количество меди содержалось в ФГМЛР с трипсином - 0,1±0,02.мг/л, а наибольшее -^ в ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином-1,8±0,01 мг/л (Р<0,05). По количеству цинка гидролизаты, приготовленные из молок лососевых рыб и вермикультуры, незначительно отличались между собой, кроме ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, в, котором его было отмечено максимальное количество (6,3±0,2 мг/л),,Наибольшие показатели по количеству железа, калия, магния и кальция были отмечены в ФГКЧ с поджелудочной железой КРС. По количеству натрия превосходил ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином - 52,3±8,3 мг/л. ,,.ил>........

Глюкоза, лактоза и гликоген содержатся во всех ферментативных гидро-лизатах. В ЩГМЛР выявлены глюкоза и гликоген, а в КГМЛР - глюкоза.

Все ферментативные, кислотные и .щелочные гидролизаты были идентичны по качественному составу органических кислот.

Активированные ферментативные гидролизаты из молок лососевых рыб и вермикультуры содержали аминокислоты: глутамин, аргинин, треонин, про-лин, метионин, лизин; лейцин, гистидин, валин, фенилаланин, триптофан, глицин, аланин, тирозин, серин, изолейцин, цистин. КГМЛР содержал лизин, аргинин, треонин, пролин ;и валин, а ЩГМЛР — треонин, пролин, лизин и валин. Учитывая то, что метионин и валин часто служат добавочным фактором роста

микроорганизмов, обеспечивают удовлетворительный рост многих штаммов и универсальность питательных сред (Губарев Е.М., Ивановский H.H., 1958), во всех пробах гидролизатов определяли их количество. Метионин и валин содержали все ферментативные пидролизаты из молок лососевых рыб и верми-культуры. КГМЛР и 1ЦГМЛР содержали только валин, в меньших количествах по сравнению с ферментативными. На первом месте по содержанию этих аминокислот был ФГКЧ с поджелудочной железой КРС Метионина в нем отмечено 38,8±0,5 г/л, а валгша — 29,7±0,1 г/л. На втором месте по количеству метионина и вапина оказался ФГМЛВ:Споджелудочной железой КРС.ипепсином-33,4i0,2 г/л и 22,0±0,3 г/л (Р<0.05). >. 'Л л ' л-, ,

По результатам физико-химических исследований, аминного, общего азота и расщепления белка, количества микро- и макроэлементов, качественного состава органических кислот, количества метионина и валина, следует выделить ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином и ФГКЧ с поджелудочной железой КРС.

С учетом превосходства ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином и ФГКЧ с поджелудочной железой КРС по физико-химическим показателям, проводили дополнительные исследования по определению в них витаминов. В результате выявлено присутствие тиамина (Bi), рибофлавина (В->) Й никотиновой кислоты (РР или В5).

Несмотря на вышеперечисленный богатый перечень всех химических компонентов, входящих в состав гидролизатов, окончательная их биологическая полноценность подтверждена в эксперименте при удовлетворении ими физиологических потребностей микроорганизмов.

Разработка технологии приготовления, стандартизации и сравнительное изучение ростовых качеств питательных сред для культивирования микроорг анизмов на Основе гидролизатов из молок лососевых рыб и вермикультуры

На основе всех гидролизатов из вермикультуры и из молок лососевых рыб готовили плотные питательные среды.

На первом этапе эксперимента изучали культуральные свойства всех микроорганизмов, рекомендованных фармакопейной статьей предприятия в качестве тестовых (S. maree scens-1, P. aeruginosa 27/99, S. flexneri la 8516, S: sonnei «S-form»): В качестве контроля использовали агар Хоттин-гера(табл. 1).

Питательные Среды, приготовленные из активированных ферментативных гидролизатов из молок лососевых рыб и вермикультуры, и кислотных гидролизатов из möüok лососевых рыб, в отличие от среды на основе щелочного, обеспечивали рост всех тест-штаммов микроорганизмов. Наибольшей, ) чувствительностью обладают питательные среды на основе ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, а также ФГКЧ с поджелудочной железой КРС. По количеству и диаметру, выросших бесцветных, прозрачных, круглых колоний микроорганизмов 5. flexneri la 8516 и

S. sonnet «S-form», а также интенсивности пигмента для S.marcescens-1 и Р. aeruginosa 27/99 (рис. 1,2) превосходили контроль. Наилучшие показатели по чувствительности и скорости роста питательных сред объясняются тем, что их основы удовлетворяют физиологические потребности, культивируемых тест-штаммов.

С целью подтверждения универсальности новых питательных сред, приготовленных на основе ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином и ФГКЧ с поджелудочной железой КРС, проводили на них дополнительные испытания с помощью культивирования тест-штаммов: S. typhi Н-901, S.faecalis-602, V. pestis EV, Е. coli CÄ-18, С. xerosis 1911, S. pyogenes Dick 1. Так, E. coli CA-18 через 18 ч. инкубации при температуре 37°С, формировала на агаре из ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином 41,3±0,5 колонию. На новой питательной среде, приготовленной на основе ФГКЧ с поджелудочной железой КРС, Е. coli CA-18 было образовано 54,3±0,3 круглых колонии диаметром 2,0 мм и 2,5 мм, что значительно превосходило их рост на агаре Хоттингера.

Таблица 1

Результаты контроля плотных питательных сред на основе активированных гндролнзатов из молок лососевых рыб и калифорнийских червей

Основа питательной среда (гидролтат) Оценка ростовых качеств питательной среды при высеве тест-цггаммов (М±ш)

З.тагсе.чсет-! P. aeruginosa 27/99 Ч.Асхпеп 1а 8516 5. яоппе! «8-/огт»

Через 18 ч Через 18 ч Через 18 ч Через 18 ч

ФГМЛР с трипсином и желчью Пигмент слаборозовый Рост есть, пигмента нет 7,1±0,8 колоний Б до 1,0 мм 15,2±0,6 колоний Е)=1,0мм

ФГМЛР с трипсином Пигмент розовый Пигмент слабый сине-зеленый 15,3±0,3 колоний 1)=1,0 мм 7,2±0,5 колоний 0=1,0 мм

ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином Пигмент ярко-красный Пигмент сине-зеленый интенсивный 47,2±0,3 колоний 1)= 1,5 мм 45,3± 0,2 колоний 0=1,5-2,5 мм

1ДГМЛР Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста

ФГМЛР с поджелудочной железой КРС Пигмент розовый Пигмент слабосалатовый 2,1±0,1 колонии 0=1,0 мм 3,1± 0,1 колонии Е>=1,0 мм

КГМЛР Пигмент слаборозовый Пигмент слабосалатовый 1,1±0,1 колония П=1,0 мм 1,1± 0,2 колония 0=1,0 мм

ФГКЧ с поджелудочной железой КРС Пигмент ярко-красный Пигмент сине-зеленый интенсивный 48,2±0,9 колоний 1)= 1,5-2,0 мм 55,3±0,8 колоний 0=1,5-2,5 мм

Агар Хоттингера Пигмент розово-красный через 20 ч Пигмент сине-зеленый через 20 ч 35,3±0,2 колоний 0=1,2 мм через 20 ч 37,2±0,4 колоний 0=1,3 мм через 20 ч

Рис. 1. Колонии Serratia marcescens. Слева - через 20 часов -при выращивании на агаре Хоттингера. Справа -через 18 часов - интенсивное окрашивание колоний при выращивании на питательной среде на основе ФГКЧ с поджелудочной железой КРС.

Рис. 2. Колонии Pseudomonas aeruginosa. Слева - через 20 часов - при выращивании на агаре Хоттингера. Справа -через 18 часов - интенсивное окрашивание колоний, при выращивании на питательной среде на основе ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином.

S. typhi Н-901 через 22 ч. и S.faecalis 602 через 18 ч. инкубации формировали круглые колонии диаметром 1,5 мм и i,ü мм на питательной среде из ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином в количестве 45,2±0,2 и 35,2±0,1. На питательной среде из ФГКЧ с поджелудочной железой КРС 5. typhi Н-901 и S. faecalis 602 формировали колонии в количестве 58,2±0,2 и 46,2±0,2 круглых колоний диаметром 2,0 мм и 1,0 мм. У. pestis EV через 46 ч. инкубации на питательной среде из ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином формировала 55,3±0,1 слегка возвышающихся над поверхностью среды колоний диаметром 1,5-2,0 мм.

На питательной среде из ФГКЧ с поджелудочной железой КРС У. pestis EV было образовано 60,3±0,3 колоний круглой формы и диаметром 2,0 мм, что превосходило контроль (Р<0,05). Все колонии микроорганизмов были типичными для соответствующего вида микроорганизмов. Изучали особенности роста на новых питательных средах С. xerosis ¡911 и S. pyogenes Dick-I. Так, было отмечено, что через 46 ч. инкубации при температуре 37°С С. xerosis 1911 формировал на агарах из ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином и ФГКЧ с поджелудочной железой КРС выпуклые, полупрозрачные, с матовой поверхностью колонии в количестве 43,2±0,3 диаметром 1,0-2,0 мм и 44,2±0,3 диаметром 2,0 мм. Колонии 5. pyogenes Dick-1 были мелкие, диаметр их на питательной среде из ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином был 1,5 мм, а из ФГКЧ с поджелудочной железой КРС 1,1-1,2 мм. По количеству выросших колоний всех тестовых микроорганизмов первая питательная среда не на много, но уступала второй (Р<0,05). Однако обе питательные среды по количеству выросших колоний микроорганизмов превосходи контроль. Такие результаты обусловлены тем, что используемые основы обеспечивают микроорганизмов питательными веществами в количестве, доста-

точном для обмена и синтеза жизненно важных метаболитов, а так же свидетельствуют об универсальности питательных сред.

При определении морфологических и тинкториальных особенностей в мазках микроорганизмов S.marcescens-1, P. aeruginosa 21/99, Е. coli СА-18, S. typhi Н-901, Y. pestis EV, S. faecalis-602, С. xerosis 1911, S. sonnei «S-form», S.ßexneri la 8516, существенных различий в окраске, форме, размерах, расположении клеток микробов, выросших на опытных питательных средах, не обнаружено.

Биохимические исследования на примере микроорганизмов, I. Pestis EV., Е. coli СА-18 (сахаролитические), и S.flexneri la 8516 (индолообразование) углубили оценочную характеристику качества питательных сред (рис. 3,4).

В результате проведенных исследований установлено, что новые питательные среды на основе ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином обеспечивают полноценный рост культивируемых тест-штаммов: S. marcescens-1, P. aeruginosa 27/99, S.flexneri la 8516, Shigella sonnei «S-form», S. typhi H-901, S. faecalis-602, Y. pestis EV, E. coli С A-18, С. xerosis 1911, S. pyogenes Dick 1 с сохранением их культуральных и морфологических свойств, стабильность проявления биохимических свойств бактерий У. Pestis ЕнЕ. coli СА-18, образование индола при росте S.flexneri la 8516 в бульонах. Такие результаты свидетельствуют о том, что новые питательные среды по химическому составу вполне обеспечивают физиологические потребности вышеуказанных микроорганизмов, что обусловливает их универсальность.

Рис. 3. Определение биохимических свойств Y. Pestis EV на питательной среде из ФГКЧ с поджелудочной железой КРС.

Рис. 4. Определение биохимических свойств Е. coli СА-18 на питательной среде из ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином.

fiilillllA

Изучение стимулирующего действия ферментативных гидролизатов из калифорнийских червей с поджелудочной железой крупного рогатого скота и молок лососевых рыб с поджелудочной железой крупного рогатого скота и пепсином

Ферментативные гидролизаты из ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином и ФГКЧ с поджелудочной железой КРС добавляли в питательные среды - кровяной агар и среду Чистовича в дозах: 2,5 мл/1000 мл; 1,5 мл/1000 мл; 0,5 мл/1000 мл. Для посева на питательные среды были использованы штаммы микроорганизмов Staphylococcus aureus и Shigella flexneri. Для обоих гидролизатов при выращивании как S. aureus, так и 5. flexneri, оптимальной дозой, обеспечивающей высокий стимулирующий эффект является 0,5 мл на один литр питательной среды. Такие результаты свидетельствуют о возможности использования ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, а также ФГКЧ с поджелудочной железой КРС в качестве стимуляторов роста микроорганизмов.

ВЫВОДЫ

1. Аналитические и ретроспективные данные свидетельствуют о высоком биологическом потенциале, экологической чистоте, доступности, быстрой воспроизводимости в достаточном количестве, в том числе в лабораторных и производственных условиях, а также эксклюзивности, качественном и количественном превосходстве химического состава вермикультуры и молок лососевых рыб по сравнению с традиционным мясным, рыбным и растительным сырьем для микробиологических питательных сред, что обусловливает широкие перспективы использования новых сырьевых субстанций.

2. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена целесообразность активирования нативного сырья для приготовления универсальных питательных сред. Методика активации калифорнийских червей с использованием комплекса манипуляций (облучение лазером в сочетании с методом В.П. Филатова) позволяет повысить биологическую активность вермикультуры на 30 %.

3. Доказана возможность проведения гидролиза из активированных молок лососевых рыб и вермикультуры ферментативными, кислотным и щелочным способами. Получено 7 видов гидролизатов: ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, ФГМДР. поджелудочной железой КРС, ФГМЛР с трипсином, ФГМЛР с трипсином и желчью, КГМЛР, ЩГМЛР, ФГКЧ с поджелудочной железой КРС, показатели аминного азота, которых позволяют их использовать для приготовления микробиологических питательных сред.

4. Ферментативные гидролизаты из обоих видов сырья идентичны по качественному составу органических кислот, но превосходят кислотные- и щелочные по аминному, общему азоту и уровню расщепления белка, качественному составу углеводов, аминокислот, количественному содержанию метиони-на и валина. ФГКЧ с поджелудочной железой крупного рогатого скота по

аминному, общему азоту, уровн$> расщепления белка, количественному составу микро- и макроэлемицр.в, количественному содержанию метионина и валина превосходит ферментативные, кислотный и щелочной из молок лососевых рыб.

5. Наилучншми показателями по аминному, общему азоту, количественному составу метионина и валина отличаются ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, а также ФГКЧ с поджелудочной железой КРС, что обусловило необходамость^из^е!^ состава, в результате чего в 0<роих,вд тиамин (Bi), рибофлавин (В2), никотиновая кислота (РР или В5), являюпшеся обязательным составным компонентом универсальных питательных сред.

6. Питательные среда, сконструированные из активированных ферментативных гидролизатов из молок лососевых рыб и вермикультуры, и кислотных гидролизатов из молок лососёвых рыб, в отличие от среды на основе щелочного, обеспечивали рост всех тест-штаммов микроорганизмов. Наилучшими ростовыми качествами, при сохранении морфологических и тинкториальных свойств, обладали питательные среды на основе ферментативных гидролизатов, при максимальной чувствительности на основе ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, что подтверждается количеством выросших колоний при минимальном разведении S.flexneri la 8516 и S. sonnei «S-form» и интенсивностью пигментообразования S.marcescetis-1, Р. aeruginosa 27/99.

7. Оптимальные физико-химические свойства, результаты исследований при культивировании 4 тест-штаммов S.flexneri la 8516 и S. sonnei «S-form», S.marcescens-1, P. aeruginosa 27/99 (согласно фармакопейной статье предприятия), а также дополнительных микроорганизмов с различными питательными потребностями S. typhi Н-901, S. faecalis-602, Y. pestis EV, Е. coli CA-18, С. xerosis 1911 позволили подтвердить универсальность питательных сред на основе ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином. Обе питательные среды обеспечивают рост колоний всех микроорганизмов с сохранением характерных культуральных, морфологических, тинкториальных и биохимических свойств, а по показателям скорости роста и количеству колоний превосходят агар Хоттингера.

8. На примере микроорганизмов Staphylocöcciti aureus и Shigellaflexneri установлен ростости мулирую щий эффект активированных ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином при добавлении в количестве 0,5 мл/1000 мл питательной среды кровяного агара и среды Чистовича. Наибольшее стимулирующее действие при добавлении к традиционным питательным средам выше у ФГКЧ с поджелудочной железой КРС.

9. Экономическая эффективность применения питательных сред из ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином и ФГКЧ с поджелудочной железой КРС, подсчитанная по коэффициенту рентабельности, выше, чем при использовании агара Хоттингера, на 4 и 6 % соответственно, что обусловливает широкие перспективы их производственного и лабораторного использования.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Технология получения активированных гидролизатов из молок лососевых рыб и вермикультуры калифорнийского червя, а также универсальных питательных сред на основе этих гидролизатов, подкрепленная патентами и технической документацией, может использоваться в качестве коммерческой и экономически выгодной в условиях микробиологических и биотехнологических производств, нуждающихся в больших объемах питательных сред и их высоком качестве, необходимых для наращивания бакмассы, а также с целью обеспечения стандартных свойств производственных штаммов. .

2. Универсальные питательные среды на основе ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, а также сами гидролизаты в качестве стимуляторов роста могут широко использоваться в лабораторной практике в диагностических и научных целях для быстрого выявления и идентификации широкого перечня микроорганизмов, а также для поддержания архивных штаммов.

3. Материалы диссертационной работы могут использоваться; в научных целях, при составлении учебных и справочных пособий, чтении лекций, ведении практических занятий по микробиологии и биотехнологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ткаченко, И.Н. Перспективные направления биотехнологии белковых гидролизатов / И.Н. Ткаченко // Экология человека. — Архангельск, 2006.-Приложение 4/1. - С. 164-165.

2. Ткаченко, И.Н. Разработка технологий получения гидролизатов из молок лососевых; рыб / И.Н. Ткаченко, Л. Д. Тимченко, Л .С. Катунина, О.Л. Старцева // Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России: Матер. науч.-практ. конф. (21-22 марта, 2007 г., г. Ставрополь). - Ставрополь, 2007. - С. 135-137. ^ ^ I ';

3. Ткаченко, И.Н. Культуральные свойства тест-штаммов микроорганизмов, выращенных на основе гидролизатов из молок'лососевых рыб / И.Н. Ткаченко // Третья ежегодная научная конференция студентов и: аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН: Тезисы докладов. - Ростов-на-Дону: Изд-во ЮНЦ РАН, 2007. - С. 34-35. ; '

4. Ткаченко, И.Н. Аминокислотный состав кислотных, щелочных и ферментативных гидролизатов из молок лососевых рыб и калифорнийских червей / И.Н. Ткаченко, Л. Д. Тимченко // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: Мат-лы научн. конф. / СГУ. - Ставрополь, 2007. - С. 247-248.

5. Тимченко, Л.Д. Рациональные подходы к разработке новых питательных сред из экологически чистого сырья / Л.Д. Тимченко, И.Н. Ткачен-

,. ко, Л.С. Катунина // Вестник Южного Научного Центра РАН. - Ростов! -на-Дону: Изд-во ЮНЦ РАН, 2008. - Т 4. - № 1. - С. 42-46.

6.: Ткаченко, И.Н. Результаты изучения ростовых качеств новой питательной ■ среды в процессе культивирования S. marcescem-ln Р. aeruginsa 27/99 /

И.Н. Ткаченко // Четвертая ежегодная научная конференция студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН: Тезисы докладов. - Ростов-на-Дону: Изд-^во ЮНЦ РАН, 2008. - С. 26-27.

7. Ткаченко, И.Н. Результаты испытания гидролизата из молок лососевых рыб в качестве стимулятора роста микроорганизмов / И.Н. Ткаченко, Л.Д. Тимченко, Н.М. Юнда, Е.А. Кантеева, А.Н. Боблов // Проблемы развипая биологии и экологии на Северном Кавказе: Мат-лы научн. конф. / СГУ - Ставрополь, 2008. - С. 184-186.

8. Тимченко, Л.Д. Биохимические свойства Е. pestis EV, выращенного на питательной среде на основе гидролизата из активированной верми-культуры // Л.Д. Тимченко, И.Н, Ткаченко, Л.С. Катунина // Материалы пятого съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. -Москва, 2008.-С. 294-295.

9. Ткаченко, И.Н. Изучение культуральных и морфологических свойств некоторых микроорганизмов на! новой- -питательной среде на основе ферментативного гидролизата из биомассы калифорнийских червей / И.Н. Ткаченко, Л.Д. Тимченко, Л.С. Катунина // Материалы X Международной научной конференции «Биологическое разнообразие Кавказа» (9-10 октября, 2008 г., г. Грозный). - Грозный, 2008. - С. 357-359.

10. Ткаченко, И.Н. Биохимические свойства тест-штамма Е. coli СА-18, выращенного на питательной среде на основе гидролизата из активированной вермикультуры / И.Н. Ткаченко, Л.Д. Тимченко, Л.С. Катунина // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: Мат-лы научн. конф. / СГУ. - Ставрополь, 2009. - С. 77-79. "

11 .Патент № 2348686 РФ. Питательная среда для культивирования микроорганизмов / Л.Д. Тимченко, И.Н. Ткаченко, Л.С. Катунина, О.Л. Стар-цева, В.Н. Вакулин, И.В. Ржепаковский. - Приоритет от 20.04.2007; Опубл. 10.03.2009. Бюл. № 7.

12.Патент № 2352134 РФ. Способ получения гидролизата из молок лососевых рыб / Л.Д. Тимченко, И.Н. Ткаченко, И.В. Ржепаковский, В.Н. Вакулин. - Приоритет от 28.01.2008; Опубл. 20.04.2009- Бюл. №11.

■ . I t '.¡¡- ■■ ' ' 1

Подписано в печать 12.11.2009 Формат 60x84 1/16 Усл.печл. 1,05 Уч.-изд.л. 1,08 Бумага офсетная_Тираж 100 экз._Заказ 384

Отпечатано в Издательско-полиграфическом комплексе Ставропольского государственного университета. 355009, Ставрополь, ул.Пушкина, 1.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ткаченко, Инна Николаевна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Основные задачи и принципы культивирования микроорганизмов.

1.2. Питательные потребности микроорганизмов.

1.3. Характеристика питательных сред, используемых в экспериментальной и промышленной микробиологии и пути их оптимизации.

1.3.1 . Требования, предъявляемые к питательным средам.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

2.1. Лабораторное и производственное оборудование.

2.1.1. Штаммы микроорганизмов.

2.1.2. Растворы, реактивы, сырье.

2.1.3. Питательные среды.

2.2. Методы получения гидролизатов.

2.2.1. Методы физико-химического контроля гидролизатов и питательных сред.

2.2.2. Исследование биологической активности активированного и неактивированного гидролизатов вермикультуры калифорнийских червей.

2.2.3. Показатели чувствительности, скорости роста и стабильности основных биологических свойств микроорганизмов.

2.2.4. Методы статистической обработки материала.

Глава 3. Экспериментальное обоснование технологии получения и качество питательных сред для культивирования микроорганизмов на основе активированных молок рыб и вермикультуры (результаты собственных исследований).

3.1. Разработка технологии получения гидролизатов из активированных молок лососевых рыб и калифорнийских червей.

3.1.1. Приготовление ферментативного гидролизата из молок лососевых рыб с поджелудочной железой крупного рогатого скота и пепсином.

3.1.2. Приготовление кислотного гидролизата из молок лососевых

3.1.3. Приготовление щелочного гидролизата из молок лососевых

3.1.4. Приготовление ферментативного гидролизата из молок лососевых рыб с трипсином и желчью.

3.1.5. Приготовление ферментативного гидролизата из молок лососевых рыб с трипсином.

3.1.6. Приготовление ферментативного гидролизата из молок лососевых рыб с поджелудочной железой крупного рогатого скота.

3.1.7. Приготовление ферментативных гидролизатов из активированного и неактивированного сырья калифорнийских червей с поджелудочной железой крупного рогатого скота.

3.1.8. Сравнительная характеристика новых активированных гидролизатов для питательных сред, приготовленных путем ферментативного и химического гидролиза.

3.1.8.1. Физико-химические свойства активированных гидролизатов.

3.1.8.2. Аминокислотный состав ферментативных, щелочных и кислотных гидролизатов.

3.2. Разработка технологии приготовления, стандартизации и сравнительное изучение ростовых качеств питательных сред для культивирования микроорганизмов на основе гидролизатов из молок лососевых рыб и вермикультуры.

3.3. Изучение стимулирующего действия ферментативных гидролизатов из калифорнийских червей с поджелудочной железой крупного рогатого скота и молок лососевых рыб с поджелудочной железой крупного рогатого скота и пепсином.

3.4. Сравнительная оценка экономической эффективности применения питательных сред на основе ферментативных гидролизатов из калифорнийских червей с поджелудочной железой крупного рогатого скота и молок лососевых рыб с поджелудочной железой крупного рогатого скота и пепсином с агаром Хоттингера.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и оценка качества новых питательных сред и стимуляторов роста микроорганизмов на основе активированных гидролизатов из молок рыб и вермикультуры"

Актуальность исследования. Культивирование микроорганизмов является важным этапом в промышленной и экспериментальной микробиологии. Основой успешного культивирования, обеспечивающей максимальное накопление биомассы и поддержание активности штаммов, является подбор питательных сред в соответствии с питательными и другими физиологическими потребностями микроорганизма (Малахов Ю.А. и др., 2000; Прозоркина Н.В., Рубашкина Л.А., 2002; Faine S., 1982). Особое место среди известных в микробиологии питательных сред занимают универсальные, на которых можно культивировать широкий перечень самых различных микроорганизмов, что обусловливает их высокую потребность. Лучшие из этих сред традиционно готовят на основе сырья природного происхождения.

Однако, вопросы разработки технологии, стандартизации, оценки качества питательных сред из природного сырья имеют определенные трудности в решении (Бубеев А.Т. и др., 2005). Это обусловлено, прежде всего, снижением качества самого сырья, в частности, мяса и растительных объектов, в связи со сложной экологической обстановкой и антропогенным воздействием на окружающую среду. В сырье зачастую содержатся антибиотики, химикаты, нитраты, токсические продукты, что отрицательно отражается на культивировании и приросте биомассы микроорганизмов, снижает результативность диагностических исследований (Рябов В.Г. и др., 1996; Вартанова Н.О. и др., 2005; Waguespack М., 1986; Corrigan P.J., Seneviratna P., 1989). Кроме того, мясное сырье является дорогостоящим. Важность и острота проблемы снижения качества питательных сред подчеркивается многими исследователями (Зелютков Ю.Г. и др., 2007).

Важнейшим аспектом их разработки и применения в настоящее время является направленное усиление, ингибирование или выявление генетически присущих данному виду микроорганизмов культурально-морфологических и биохимических особенностей (Ахапкина И.Г., Блинкова Л.П., 2001).

Заслуживают внимания три основных пути оптимизации и совершенствования питательных сред. К первому относят добавление различных питательных добавок и стимуляторов роста (Macfarlane D.E., Elian-Jones Т.Е., 1980). Второй путь связывают с поиском нового сырья, богатого белками для приготовления питательных основ, среди которых особое место отводится белковым гидролизатам (Трошкова Г.П. и др., 2006). В последнее время проводятся исследования, связанные с возможностью использования белковых гидролизатов из нетрадиционного сырья: отходов мясной, молочной, рыбной и птицеперерабатывающей промышленности (Трошкова Г.П. и др., 2006). Третий путь — это разработка путей и методов повышения качества сырья, используемого для приготовления микробиологических питательных сред, направленных на увеличение в нем биологически активных компонентов. Сообщения о реальных результатах в этом направлении единичные (Панова Н.В., 2006).

В связи с вышеизложенным, изыскание новых, экологически чистых и экономически оправданных источников сырья, а также путей повышения его биологической полноценности с целью разработки высококачественных питательных сред, является актуальной и своевременной задачей.

Цель исследования: провести качественную оценку новых питательных сред, разработанных на основе активированных гидролизатов из молок рыб и вермикультуры.

Основные задачи исследования:

- обосновать возможность и перспективы использования молок лососевых рыб и вермикультуры калифорнийского червя в качестве сырья для гид-ролизата - основы микробиологических питательных сред;

- предложить и экспериментально обосновать пути повышения биологической полноценности гидролизата из нетрадиционного сырья;

- изучить возможность проведения гидролиза из активированных молок лососевых рыб и вермикультуры по различной технологии (кислотный, щелочной и ферментативный);

- определить физико-химические свойства белковых гидролизатов, приготовленных из активированного сырья;

- разработать рецептуру новых питательных сред на основе гидролизатов из нетрадиционного сырья;

- провести сравнительное изучение ростовых качеств питательных сред на основе активированных гидролизатов из молок лососевых рыб и верми-культуры на различных штаммах микроорганизмов;

- изучить возможность использования ферментативных гидролизатов из вермикультуры и молок лососевых рыб с поджелудочной железой крупного рогатого скота и пепсином в качестве стимуляторов роста микроорганизмов на примере Shigella flexneri и Staphylococcus aureus;

- рассчитать экономическую эффективность применения новых питательных сред по сравнению с аналогом.

Впервые в результате сравнительного анализа качества белковых гидролизатов, приготовленных ферментативными, кислотным и щелочным способами из активированных молок лососевых рыб и ферментативным из вермикультуры, доказано, что наивысшей биологической активностью обладают ферментативные гидролизаты.

Разработаны новые питательные среды на основе активированных гидролизатов из молок лососевых рыб и вермикультуры.

Впервые подтверждена универсальность питательных сред на основе активированных ферментативных гидролизатов из калифорнийских червей с поджелудочной железой крупного рогатого скота и из молок лососевых рыб с поджелудочной железой крупного рогатого скота и пепсином, и их преимущество по сравнению со средами, изготовленными на основе кислотного и щелочного гидролизатов. Наибольшая универсальность присуща питательной среде на основе ферментативного гидролизата из калифорнийских червей с поджелудочной железой крупного рогатого скота.

Доказана экономическая эффективность применения новых питательных сред по сравнению с аналогом.

Разработанные рекомендации могут быть использованы для наращивания бакмассы на предприятиях микробиологической промышленности и в лабораторной деятельности микробиолога. На основании проведенных исследований по испытанию активированных гидролизатов из калифорнийских червей с поджелудочной железой крупного рогатого скота и молок лососевых рыб с поджелудочной железой крупного рогатого скота и пепсином, а также питательных сред на их основе, разработана и утверждена на производственном уровне техническая документация. Научные разработки используются в работе Ставропольского научно-исследовательского противочумного института и научно-образовательного центра «Технологии живых систем, биологические материалы» Ставропольского государственного университета. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе Ставропольского филиала Московского государственного гуманитарного университета им. М.А. Шолохова, Ставропольской государственной медицинской академии, Северо-Кавказского государственного технического университета (Ставрополь) в качестве дополнений к учебным материалам по дисциплинам «Микробиология», «Биотехнология», «Частная микробиология», «Санитарная микробиология», «Биотехнология, промышленное и хозяйственное использование микроорганизмов».

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные аспекты жизнедеятельности человека на Севере» (Архангельск, 2006 г.); на научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 2007г.); на третьей и четвертой ежегодной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН (Ростов-на-Дону, 2007; 2008 гг.); на научных конференциях «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2007; 2008 гг.); на X Международной научной конференции «Биологическое разнообразие Кавказа» (Грозный, 2008 г.).

ИННОВ-2007» (ЮРГТУ, Новочеркасск, 2007 г.); на Международной ярмарке «Идеи, инновации и инвестиции IENA-2007 г.» (Нюрнберг, Германия, 2007 г.); VIII Московском Международном салоне инноваций и инвестиций (Москва, 2008 г.); на VI и VII Международных специализированных выставках «МИР БИОТЕХНОЛОГИИ 2008, 2009» (Москва, 2008, 2009 гг.) и награждены 5 дипломами, 2 серебряными и 2 золотыми медалями.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Теоретически и экспериментально обоснованная на примере верми-культуры технология активации сырья для производства микробиологических питательных сред, позволяет повысить его биологическую полноценность, что обеспечивает высокое качество и экономические преимущества полученных гидролизатов.

3. Питательные среды на основе ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, в отличие от сред, приготовленных по другим рецептурам, являются универсальными и по показателям скорости роста, количеству колоний, проявлению культуральных особенностей, при сохранении тинкториальных, морфологических, биохимических свойств всех тестовых микрорганизмов, а также по экономической эффективности превосходят агар Хоттингера.

4. Результаты исследования влияния активированных ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином на рост микроорганизмов Shigella flexneri и Staphylococcus aureus в малых дозах, свидетельствуют о выраженных стимулирующих свойствах гидролизатов и расширяют перспективы их применения в качестве стимуляторов роста микроорганизмов при добавлении к традиционным питательным средам.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ткаченко, Инна Николаевна

ВЫВОДЫ

3. Доказана возможность проведения гидролиза из активированных молок лососевых рыб и вермикультуры ферментативными, кислотным и щелочным способами. Получено 7 видов гидролизатов: ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, ФГМЛР поджелудочной железой КРС, ФГМЛР с трипсином, ФГМЛР с трипсином и желчью, КГМЛР, ЩГМЛР, ФГКЧ с поджелудочной железой КРС, показатели аминного азота, которых позволяют их использовать для приготовления микробиологических питательных сред.

4. Ферментативные гидролизаты из обоих видов сырья идентичны по качественному составу органических кислот, но превосходят кислотные и щелочные по аминному, общему азоту и уровню расщепления белка, качественному составу углеводов, аминокислот, количественному содержанию метионина и валина. ФГКЧ с поджелудочной железой крупного рогатого скота по аминному, общему азоту, уровню расщепления белка, количественному составу микро- и макроэлементов, количественному содержанию метионина и валина превосходит ферментативные, кислотный и щелочной из молок лососевых рыб.

5. Наилучшими показателями по аминному, общему азоту, количественному составу метионина и валина отличаются ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, а также ФГКЧ с поджелудочной железой КРС, что обусловило необходимость изучения витаминного состава, в результате чего в обоих гидролизатах обнаружены тиамин (Bj), рибофлавин (В2), никотиновая кислота (РР или В5), являющиеся обязательным составным компонентом универсальных питательных сред.

6. Питательные среды, сконструированные из активированных ферментативных гидролизатов из молок лососевых рыб и вермикультуры, и кислотных гидролизатов из молок лососевых рыб, в отличие от среды на основе щелочного, обеспечивали рост всех тест-штаммов микроорганизмов. Наилучшими ростовыми качествами, при сохранении морфологических и тинкториальных свойств, обладали питательные среды на основе ферментативных гидролизатов, при максимальной чувствительности на основе ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, что подтверждается количеством выросших колоний при минимальном разведении S.flexneri la 8516 и S. sonnei «S-form» и интенсивностью пигментообразования S.marcescens-1, P. aeruginosa 27/99.

7. Оптимальные физико-химические свойства, результаты исследований при культивировании 4 тест-штаммов S.flexneri la 8516 и S. sonnei «S-formS.marcescens-1, P. aeruginosa 27/99 (согласно фармакопейной статье предприятия), а также дополнительных микроорганизмов с различными питательными потребностями S. typhi Н-901, S. faecalis-602, Y. pestis EV, Е. coli СА-18, С. xerosis 1911 позволили подтвердить универсальность питательных сред на основе ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином. Обе питательные среды обеспечивают рост колоний всех микроорганизмов с сохранением характерных культуральных, морфологических, тинкториальных и биохимических свойств, а по показателям скорости роста и количеству колоний превосходят агар Хоттингера.

8. На примере микроорганизмов Staphylococcus aureus и Shigella flexneri установлен ростостимулирующий эффект активированных ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином при добавлении в количестве 0,5 мл/1000 мл питательной среды кровяного агара и среды Чистовича. Наибольшее стимулирующее действие при добавлении к традиционным питательным средам выше у ФГКЧ с поджелудочной железой КРС.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

3. Материалы диссертационной работы могут использоваться в научных целях, при составлении учебных и справочных пособий, чтении лекций, ведении практических занятий по микробиологии и биотехнологии.

129

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Культивирование микроорганизмов - это посев исследуемого материала на питательные среды для выращивания чистой культуры микробов в целях всестороннего изучения их свойств и определения видовой принадлежности и производственного использования (Сбойчаков В.Б., 2007).

Главной задачей культивирования является наращивание бактериальной массы, которое зависит от качества питательных сред, перечень которых сегодня велик (Поляк М.С. и др., 2003; Дзержинская И.С., 2008).

Большинство универсальных питательных сред изготавливается на основе мясного сырья, на которых культивируют широкий перечень самых различных микроорганизмов (Комоско Г.В. и др., 1997; Старцева О.Л., 2005; Bezkorovainy A., Solberg L., 1989; Naktin J., Beavis K.G., 1999).

Однако в последние годы остро стоит проблема снижения стандартности питательных сред. Это обусловлено, прежде всего, снижением качества продуктов природного происхождения, используемых в составе питательных сред, в связи со сложной экологической обстановкой и антропогенным воздействием на окружающую среду (Зелютков Ю.Г., Зайцев В.И., 1997; Омарова С.М., 2007). Для получения большого количества бакмассы необходимы большие объемы питательных сред, что увеличивает расход мясного сырья для основ, а, следовательно, и стоимость конечного продукта (Рябов В. и др., 1996; Вартанова И.О. и др., 2005; Старцева О.Л., 2005; Косик Н.В., 2006; Султанов 3.3., 2008; Waguespack М., 1986; Corrigan P.J., Seneviratna Р., 1989;).

Вышеизложенные проблемы обусловливают потребность поиска равноценной замены мясному сырью, с использованием других сырьевых резервов, например, рыбного сырья, что снижает стоимость питательных сред (Мельникова В.А. и др., 2003; Няникова Г.Г. и др., 2003; Бакулин А.В., 2008). Как известно, для приготовления питательных сред, чаще всего используется переработанное сырье, в основном рыбо-костная мука. Такая обработка снижает его биологическую ценность. Кроме того, сырьем для приготовления питательных сред является каспийская килька, улов которой из-за экологических проблем Каспия снизился (Султанов 3.3., 2008).

Попыткой найти альтернативу многим средам на основе мясного и рыбного сырья, явилась разработка сред на растительной основе (Казиах-медов З.А. и др., 2002; Блинкова Л.П. и др., 2003; Заикина И.А., 2008). Однако, главным недостатком растительного сырья, используемого для приготовления питательных сред, является низкое содержание белка, дефицит серосодержащих аминокислот и триптофана, а это не соответствует потребностям многих микроорганизмов (Грачева И.М. и др., 1992). Поэтому растительные объекты не могут являться полной альтернативой мясному сырью, особенно при моделировании универсальных питательных сред.

Важным спектром работы по разработке новых микробиологических питательных сред является использование нетрадиционного сырья. Так, например, кровь сельскохозяйственных животных (Филимонова Г.В. и др., 2003; Бубеев А.Т. и др., 2005), казеин (Дармов И.В. и др., 2003; Свириден-ко Ю.Я. и др., 2006). Исследователи отмечают, что такие питательные среды не обеспечивают стабильного роста всех производственных штаммов и высокого выхода бактериальной массы, нестандартны при изготовлении (Власова Н.П. и др., 1983; Ситьков В.И. и др., 1994; Таран Т.В., 1999; Белоусов В.И., 2000; Волина Е.Г., Саруханова Л.Е., 2001).

Попытки исправить все вышеперечисленные недостатки питательных сред приводят к необходимости добавления различных питательных добавок и стимуляторов роста (Macfarlane D.E., Elian-Jones Т.Е., 1980).

В настоящее время осуществляется поиск нового сырья, богатого белками для приготовления питательных основ, среди которых особое место отводится белковым гидролизатам (Трошкова Г.П. и др., 2006).

Проводится разработка путей и методов повышения качества сырья, используемого для приготовления микробиологических питательных сред, направленных на увеличение в нем биологически активных компонентов (Панова Н.В., 2006).

В связи с вышеизложенными проблемами, связанными с нестандартностью питательных сред и низким качеством сырья, на наш взгляд, наряду с изысканием нового экологически чистого, доступного, дешевого сырья, в том числе нетрадиционного, должна совершенствоваться технология новых высокоактивных белковых основ, в качестве которых могут быть рекомендованы гидролизаты, а также стимуляторов роста.

Данные многих авторов свидетельствуют, что именно в процессе гидролиза происходит расщепления белка до стадии аминокислот и простейших пептидов, образуется большой набор веществ в доступной и активной для усвоения микроорганизмом форме (Смирнова Г.А. и др., 1985; Бабаян Г.Л., Латов В.К., 2003).

Известно, что к стимуляторам роста относятся такие вещества как витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, которые легко усваиваются микроорганизмами в таком виде, входят целиком в состав протоплазменных веществ, играют роль катализаторов химических процессов, действуют исключительно в малых количествах. Вещества в такой форме могут высвобождаться в процессе гидролиза (Смирнова Г.А. и др., 1985; Бабаян Г.Л., Латов В.К., 2003).

На основании вышеперечисленных сведений доступной литературы можно сделать заключение, что как в качестве перспективных белковых основ питательных сред, так в качестве стимуляторов роста микроорганизмов можно рассматривать гидролизаты из высокоактивного биологического сырья.

Учитывая то, что полноценность гидролизата зависит от качества используемого сырья для гидролиза, в процессе поиска новых сырьевых источников, нами учитывался ряд, предъявляемых к ним требований. Сырье должно содержать максимальное количество полноценного белка, витаминов, микро- и макроэлементов, быть экологически чистым и безвредным, быть легко воспроизводимым, доступным, обеспечивать экономическую эффективность применения.

С учетом вышеизложенных требований и на основании аналитического обзора в качестве исходного сырья для приготовления новых питательных сред для культивирования микроорганизмов нами выбраны верми-культура калифорнийского червя и молоки лососевых рыб.

Важную роль в оценке биомассы калифорнийских червей (Eisenia fet-ida) играет их химический состав. По содержанию протеина (от 68 до 82 %), оно значительно превосходит мясное сырье и не уступает ему по количеству незаменимых аминокислот, витаминов, микро- и макроэлементов (Томме М.Ф., Мартыненко Р.В., 1972; Laverack M.S., 1963; Sabine J.R., 1983; Pokarzhevskii A.D. et all., 1997; Pokarzhevskii A.D. et all., 2003).

Молоки лососевых рыб содержат до 16,3 % белка, в большом количестве фосфор, натрий, магний, калий, железо, витамины: Вь В2, В12, РР, С, в том числе и жирорастворимые, жирные кислоты омега-3, протамины (Кру-пицын В.В., 2004). По химическому составу они не только не уступают мясному сырью, но и превосходят его, например, по содержанию протами-нов - низкомолекулярных белков, содержащихся в ядрах сперматозоидов у рыб, в которых они составляют фракцию основного белка (почти весь белок ядер), хорошо растворимых в воде, кислой и нейтральной среде, не денатурирующих при нагревании (Лавровская Н.Ф., 1973).

Однако в литературных источниках нами не найдено сведений об использовании биомассы калифорнийских червей и молок лососевых рыб в качестве сырья для гидролиза и приготовления питательных сред.

Исходя из вышеизложенных проблем, свидетельствующих, что питательные среды нестандартны, в основном, из-за низкокачественного сырья, используемого для их приготовления, пути их решения мы видим не только в поиске новых сырьевых источников, но и в разработке методов повышения его качества. Содержание химических веществ в сырьевых субстратах не всегда стабильно, что, на наш взгляд, требует дополнительных технологических манипуляций, позволяющих повысить активность, унифицировать и оптимизировать состав и качество сырья, используемого для приготовления микробиологических питательных сред.

Несмотря на высокий биологический потенциал исходного сырья, нами предприняты дополнительные попытки его повышения с помощью ряда манипуляций. Выбранные с этой целью технологические подходы базировались на имеющихся научных и практических данных. Так, в основу нами положен метод получения тканевых препаратов по В.П. Филатову (1955), базирующийся на учении о биогенных стимуляторах, возникающих в организме в результате воздействия на него неблагоприятных для жизни факторов среды. В качестве субстрата, используемого для получения тканевых препаратов по В.П. Филатову некоторые авторы, рекомендуют ткани с высокой активностью роста, а значит и обменом веществ, например, эмбриональную ткань (Панова Н.В., 2006). Доказано, что наиболее жизнеспособные и биологически активные ткани в процессе гибели вырабатывают максимальное количество биологически активных веществ, в том числе биогенных стимуляторов. Результаты эксперимента Н.В. Пановой (2006), свидетельствуют об эффективном влиянии на куриный эмбрион облучения лазером и выдерживание эмбрионов в холодильной камере, с последующим приготовлением биологически активного препарата «ЭСРМ», используемого в качестве стимулятора роста микроорганизмов.

Сочетание этих принципов (лазерная активация и метод получения тканевых препаратов по Филатову) и последующее использование собственных модификаций этого метода положено в основу отработки технологии повышения биологической активности сырьевых объектов.

Выбранные нами модификации путей активации субстрата получаемого из биомассы калифорнийских червей заключались в поочередном воздействии на живое сырье полупроводниковым низкочастотным лазерным аппаратом AJI-01 «Семикон» с интервалом в одни сутки и помещением их в холодильную камеру при температуре плюс 4.8°С, после каждого сеанса облучения.

Целесообразность применения лазера была подтверждена гистологическими исследованиями после первого и второго облучения. В кожно-мускульном мешке червей наблюдается гиперемия и увеличение количества клеток с крупными ядрами. Эти клетки распознаются, как лимфоцито-подобные амебоциты — фагоцитарные факторы, относящиеся к элементам иммунной системы червя. По нашему мнению, это связано со стимулирующим эффектом на обменные процессы в тканях.

Сочетание принципов лазерного облучения калифорнийских червей, с последующим воздействием на них условий низкой температуры способствует поэтапному выбросу большего количества биологически активных веществ и большей их активности, а также накоплении в субстрате в свободном состоянии.

Из активированных и неактивированных калифорнийских червей готовили гидролизаты. Биологическая активность гидролизата, приготовленного из активированной вермикультуры на 30 % выше, чем из неактивированной.

В отличие от активации вермикультуры, активация молок лососевых рыб по методике приготовления тканевых препаратов обеспечивалась уже самим технологическим циклом отлова и заготовки рыбы. По технологии, после извлечения из снулой рыбы, они подвергались поэтапно охлаждению и последующей заморозке. Условия низкой температуры по методике получения тканевых препаратов по В.П. Филатову обеспечивают повышение биологической активности ткани за счет образования биогенных стимуляторов.

Основой для получения ферментативных и химических гидролизатов явились рекомендации, изложенные Ю.А. Козловым (1950).

С учетом выбора нового сырья для получения гидролизата, возникла необходимость проведения гидролиза различными методами. Поэтому нами из молок лососевых рыб было приготовлено четыре гидролизата ферментативным способом: с поджелудочной железой КРС и пепсином, с поджелудочной железой КРС, с трипсином, с трипсином и желчью. Химическим способом были приготовлены кислотный и щелочной. Гидролизаты из активированных калифорнийских червей готовили только ферментативным способом. Температура проведения гидролиза по различным рецептурам была одинаковой - 37±1°С.

В связи с тем, что использованы различные методы ведения гидролиза, нами была проведена качественная характеристика полученных гидролизатов. В гидролизатах, приготовленных ферментативными, кислотным и щелочным способами из молок лососевых рыб, а также в ФГКЧ с поджелудочной железой КРС, изучали физико-химические свойства. Было установлено, что КГМЛР и ЩГМЛР уступают всем ферментативным гидроли-затам по показателям аминного, общего азота и расщеплению белка. Из гидролизатов, приготовленных из молок лососевых рыб, наибольшие показатели аминного, общего азота и расщепления белка были в ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, но в сравнении с ФГКЧ с поджелудочной железой КРС они были меньшими.

Гидролизаты, приготовленные из молок лососевых рыб и вермикультуры содержат достаточно широкий набор микро- и макроэлементов: цинк, медь, железо, натрий, калий, марганец и кальций. Установлено, что общее количество микро- и макроэлементов, из всех гидролизатов, приготовленных из молок лососевых рыб, было наибольшим в ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином. ФГКЧ с поджелудочной железой КРС по общему количеству микро- и макроэлементов превосходит ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином. При этом отмечено превосходство ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином по количеству цинка, меди, натрия, а по количеству железа, калия, магния и кальция - ФГКЧ с поджелудочной железой КРС.

Во всех пробах гидролизатов качественной реакцией было определено наличие углеводов: глюкозы, лактозы и гликогена. Из полученных результатов следует, что глюкоза, лактоза и гликоген содержатся во всех ферментативных гидролизатах. В ЩГМЛР выявлены глюкоза и гликоген, а в КГМЛР - глюкоза.

В пробах гидролизатов качественной реакцией определялись лимонная, яблочная, аскорбиновая, янтарная и пировиноградная кислоты. Все ферментативные, кислотные и щелочные гидролизаты были идентичны по качественному составу органических кислот.

Во всех гидролизатах определяли качественный состав аминокислот. В результате установлено, что активированные ферментативные гидролизаты из молок лососевых рыб и вермикультуры содержали аминокислоты: глутамин, аргинин, треонин, пролин, метионин, лизин, лейцин, гистидин, валин, фенилаланин, триптофан, глицин, аланин, тирозин, серии, изолей-цин, цистин. КГМЛР содержал лизин, аргинин, треонин, пролин и валин, а ЩГМЛР - треонин, пролин, лизин и валин.

Учитывая то, что метионин и валин часто служат добавочным фактором роста микроорганизмов, обеспечивают удовлетворительный рост многих штаммов и универсальность питательных сред (Губарев Е.М., Ивановский Н.Н., 1958), во всех пробах гидролизатов определяли их количество. Установлено, что по количеству метионина и валина превосходили ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином и ФГКЧ с поджелудочной железой КРС.

Исходя из результатов исследования физико-химических показателей: аминного, общего азота и уровня расщепления белка, количества микро- и макроэлементов, метионина и валина, следует выделить ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином.

На основании вышеизложенного, можно сделать заключение, что лучшими по физико-химическим показателям являются ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином. Поэтому проводились дополнительные исследования по определению в них витаминов. Витамины представляют собой биологически активные вещества и играют роль катализаторов химических процессов в клетке. Присутствие витаминов в питательных средах необходимо для размножения бактерий. Чем шире их перечень, тем универсальнее питательная среда.

С помощью качественных реакций в ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином нами было выявлено присутствие тиамина (Bi), рибофлавина (Вг), никотиновой кислоты (РР или В5).

На основе гидролизатов из вермикультуры и из молок лососевых рыб готовили плотные питательные среды.

На первом этапе эксперимента нами изучались культуральные свойства всех микроорганизмов, рекомендованных фармакопейной статьей предприятия в качестве тестовых (S. marcescens-1, P. aeruginosa 21/99, S. flexneri la 8516, Shigella sonnei «S-form»). В качестве контроля использовали агар Хоттингера.

Установлено, что питательные среды, приготовленные из активированных ферментативных гидролизатов из молок лососевых рыб и вермикультуры, и кислотных гидролизатов из молок лососевых рыб, в отличие от среды на основе щелочного, обеспечивали рост всех тест-штаммов микроорганизмов. Наибольшей чувствительностью обладают питательные среды на основе ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, а также ФГКЧ с поджелудочной железой КРС. По количеству и диаметру, выросших бесцветных, прозрачных, круглых колоний микроорганизмов S. flexneri la 8516 и S. sonnei «S-form», а также интенсивности пигмента для S.marcescens-1 и P. aeruginosa 27/99 превосходили контроль.

Такие результаты указывают на преимущество питательных сред и позволяют сделать вывод, что их основы из ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином удовлетворяют физиологические потребности, культивируемых тест-штаммов.

Лучшие ростовые качества питательных сред из ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, обусловили тот факт, что все наши дальнейшие исследования проводились только на них.

С целью установления универсальности новых питательных сред из ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, нами выбран дополнительный перечень тест-штаммов микроорганизмов: S. typhi Н-901, S. faecalis-602, Y. pestis EV, Е. coli СА-18, С. xerosis 1911, S. pyogenes Dick 1, отличающихся по химическому составу клеточной стенки (грамположительные и грамотрицательные), по метаболизму, патогенности и непатогенности.

При выращивании на этих питательных средах вышеперечисленных микроорганизмов установлена максимальная чувствительность агаров, приготовленных на основе ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином и ФГКЧ с поджелудочной железой КРС. Обе питательные среды по количеству выросших колоний микроорганизмов превосходи контроль.

Таким образом, полученные результаты при культивировании S. flex-neri la 8516 и S. sonnei «S-form», S.marcescens-1, P. aeruginosa 27/99 (согласно фармакопейной статье предприятия), а также дополнительных тест-штаммов с различными питательными потребностями S. typhi Н-901, S. faecalis-602, Y. pestis EV, Е. coli СА-18, С. xerosis 1911 обусловлены тем, что используемые основы обеспечивают микроорганизмы питательными веществами в количестве, достаточном для обмена и синтеза жизненно важных метаболитов, а так же свидетельствуют об универсальности питательных сред на основе ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином.

Для характеристики качества новых питательных сред на основе ФГКЧ с поджелудочной железой КРС, а также ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, всех выращенных микроорганизмов, кроме культуральных, изучали их морфологические и тинкториальные свойства. При определении морфологических и тинкториальных особенностей в мазках микроорганизмов S.marcescens-1, P. aeruginosa 27/99, Е. coli СА-18, S. typhi Н-901, Y. pestis EV, S. faecalis-602, С. xerosis 1911; S. sonnei «S-form», S. flexneri la 8516 существенных различий в окраске, форме, размерах, расположении клеток микробов, выросших на опытных питательных средах, не обнаружено.

Для углубления оценочной характеристики качества питательных сред из ФГКЧ с поджелудочной железой КРС, а также ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, мы провели биохимические исследования на примере микроорганизмов, Y. Pestis EV, Е. coli СА-18 (сахаролитиче-ские), и S.flexneri la 8516 (индолообразование). Эти критерии качества питательной среды, свидетельствуют о ее полноценности.

Было установлено, что через 24 ч инкубации культура чумного микроба, выращенная как на контрольной среде, так и на новых изучаемых средах, обеспечивала ферментацию глюкозы, маннита, маннозы, арабинозы с образованием кислоты без газа, о чем свидетельствовало покраснение индикатора. Среды, содержащие глицерин, сахарозу и рамнозу оставались без изменений, что является характерным признаком для данного штамма возбудителя чумы.

Результаты эксперимента показали, что через 18 ч инкубации культура Е. coli СА-18, выращенная как на контрольной среде, так и на новых изучаемых средах, обеспечивала ферментацию лактозы, сорбита, раффинозы, инозита, салицина, маннита с образованием кислоты с газом. Среды, содержащие дульцит и сахарозу, оставались без изменений. Подобные реакции являются характерными признаками для данного штамма.

Через 22±2 °С ч роста S. flexneri la 8516 при 37±1 °С в бульоне розовое окрашивание индикаторных бумажек во всех пробирках свидетельствовало об образовании индола и, следовательно, о полноценном составе сред, приготовленных на основе как ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, так и ФГКЧ с поджелудочной железой КРС.

Таким образом, культивирование возбудителя чумы и обоих штаммов кишечной палочки на питательных средах на основе ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином и ФГКЧ с поджелудочной железой КРС, не влияло на биохимическую активность микробов.

В процессе наших исследований выявлено, что ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином и ФГКЧ с поджелудочной железой КРС, используемые в качестве основ для приготовления питательных сред, отличаются наиболее высокими физико-химическими свойствами, что и обеспечивает их универсальность по отношению к потребностям многих микроорганизмов. На основании этого мы решили испытать эти гидролизаты в качестве стимуляторов роста микроорганизмов.

Ферментативные гидролизаты из ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином и ФГКЧ с поджелудочной железой КРС добавляли в питательные среды - кровяной агар и среду Чистовича в дозах: 2,5 мл/1000 мл; 1,5 мл/1000 мл; 0,5 мл/1000 мл. Для посева на питательные среды были использованы штаммы микроорганизмов Staphylococcus aureus и Shigella flexneri, являющиеся возбудителями кишечных инфекций человека и животных, а также наиболее частыми объектами лабораторной диагностики, что требует использования качественных питательных сред, обеспечивающих их выделение и идентификацию. Они отличаются по химическому составу клеточной стенки (грамположительные и грамотрицательные), культуральным, морфологическим и биохимическим свойствам, что обеспечивает потенциальную универсальность гидролизата в случае подтверждения его стимулирующего эффекта.

В результате проведенных исследований установлена оптимальная доза гидролизатов как стимуляторов роста, при добавлении 0,5 мл к питательным средам при выращивании как Staphylococcus aureus, так и Shigella flexneri. При этом стимулирующее действие при добавлении в одинаковой дозе к традиционным питательным средам выше у ФГКЧ с поджелудочной железой КРС. Такие результаты свидетельствуют о возможности использования ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, а также ФГКЧ с поджелудочной железой КРС в качестве стимуляторов роста микроорганизмов.

Таким образом, стимулирующее действие активированных ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, а также ФГКЧ с поджелудочной железой КРС, обеспечивается за счет широкого набора биологически активных веществ, необходимых для роста и развития микроорганизмов. Такие результаты, по нашему мнению, достигнуты как за счет технологии, направленной на повышение биологической активности сырья, так и за счет выбора метода гидролиза, что позволило получить свободные биологически активные вещества и сохранить их в активном виде.

Учитывая высокие ростовые качества питательных сред на основе ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином, сочли целесообразным рассчитать экономическую эффективность их применения, о которой судили по коэффициенту рентабельности. В результате подсчета было выявлено, что коэффициент рентабельности питательной среды из ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином превосходит на 4 %, а из ФГКЧ с поджелудочной железой КРС -на 6 % агар Хоттингера, что свидетельствует о наибольшей их эффективности, с наименьшими затратами, при культивировании широкого круга бактерий.

Полученные результаты, по применению питательных сред, приготовленных на основе ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином и ФГКЧ с поджелудочной железой КРС, используются в научнопроизводственной работе лаборатории питательных сред ФГУЗ Ставропольского научно-исследовательского противочумного института, что подтверждено актом внедрения. Также ФГМЛР с поджелудочной железой КРС и пепсином и ФГКЧ с поджелудочной железой КРС и питательные среды, приготовленные на их основе были представлены на Всероссийской выставке-ярмарке научно-исследовательских работ и инновационной деятельности молодых ученых «ИННОВ-2007» (ЮРГТУ, г. Новочеркасск, 2007 г.), на Международной выставке в Нюрнберге (г. Нюрнберг, 2007), VIII Московском Международном салоне инноваций и инвестиций (г. Москва, 2008 г.), VI Международной специализированной выставке «МИР БИОТЕХНОЛОГИИ 2008» (г. Москва, 2008), VII Международной специализированной выставке «МИР БИОТЕХНОЛОГИИ 2009» (г. Москва, 2009) и награждены 5 дипломами, 2 серебряными и 2 золотыми медалями (приложение 4).

125

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ткаченко, Инна Николаевна, Ставрополь

1. Андреева, И.Н. Влияние условий культивирования на рост и пигментацию Serratia marcescens / И.Н. Андреева, Т.И. Огородникова // Микробиология. 1999. - № 3. - С. 16-20.

2. Андриевский, А.Е. Опыт применения препарата Деринат в комплексном лечении эубиотических изменений в толстой кишке / А.Е. Андриевский // Материалы II Всероссийской конференции (3-6 апреля). -Москва, 2002.-С. 60-61.

3. Антипова, Л.В. Биохимия мяса и мясных продуктов / Л.В. Антипова, Н.А. Жеребцов. Воронеж, 1991. - 183 с.

4. Апарин, Г.П. Микробиология чумы: Руководство / Г.П. Апарин, Е.П. Голубинский. Иркутск: Изд-во ун-та, 1989. - 91 с.

5. Ассонов, Н.Р. Микробиология: Учебники и учебные пособия для студентов ВУЗов / Н.Р. Ассонов. М.: Колос, 2001.-352 с.

6. Ахапкина, А.Г. Питательные среды как исскуственная среда роста и развития микроорганизмов / А.Г. Ахапкина, Л.П. Блинкова // Микробиология. 2001. - № 6. - С. 99-108.

7. Ахапкина, И.Г. Культивирования Psevdomonas aeruginosa на средах с испрользованием ферментативного гидролизата хлореллы в качестве питательной основы / И.Г. Ахапкина, Л.П. Блинкова, Л.Г. Бутова // Микробиология. 2002. - № 5. - С.67-68.

8. Ахметова, Э.М. Разработка и испытание сухих питательных сред для индикации уреаплазм / Э.М. Ахметова, М.М. Меджидов, С.М. Омаро-ва // Микробиология. 2000. - № 3. - С. 29.

9. Бабаян, Г.JI. Способ оценки протеиназной активности комплесного ферментного препарата по данным кинетики протеолиза модельного белкового субстрата / Г.Л. Бабаян, В.К. Латов // Биотехнология. — 2003.-№6.-С. 47-51.

10. Бакулин, А.В. Ферментативный гидролиз высокомолекулярного хито-зана фитопаином / А.В. Бакулин // Материалы пятого съезда общества биотехологов России им. Овчинникова (2-4 декабря). М., 2008. - С. 312-314.

11. Балохонцева, В.Н. Питательная ценность и безвредность кормовых дрожжей БВК для сельскохозяйственных животных / В.Н. Балохонцева и др.. -М.: 1983.-35 с.

12. Баронец, Н.Г. Витамин К как стимулятор роста микроорганизмов / Н.Г. Баронец // Микробиология. 2003. - № 4. - С. 104-105.

13. Баснакьян, И.А. Классификация процессов культивирования микроорганизмов / И.А. Баснакьян, В.М. Боровкова, Л. Н. Запорожцев // Труды Московского научно-исследовательского ин-та вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова.-М., 1981. С. 5-17.

14. Бейли, Д. Основы биохимической инженерии /Д. Бейли, Д. Оллис. Пер. с англ. Л. 2. -М.: Мир, 1989. - 590 с.

15. Беккер, М.Е. Биотехнология / М.Е. Беккер, Г.К. Липинын, Е.П. Райпу-лис. М.: Агропромиздат, 1990. - С. 108-111.

16. Бендас, Л.Г. Стимулятор бактериального роста из кормовых дрожжей / Л.Г. Бендас, Б.М. Раскин // Лабороторное дело. 1974. - № 1. - С. 4345.

17. Боринских, И.И. Технология и аппаратура для полупромышленного выращивания почвенных микроорганизмов / И.И. Боринских, Г.А. Оборин, Д.И. Сычев // Ускоренная рекультивация земель с использованием высокоэффективной биотехнологии. Пермь, 1988. - С. 17-23.

18. Борисов, Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / Л.Б. Борисов // Учебник. М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2001. 736 с.

19. Бубеев, А.Т. Технология получения основы микробиологических питательных сред / А.Т. Бубеев, Т.Е. Данилова, В.Ж. Цыренов // Биотехнология: состояние и перспективы развития. М., 2005. - 4.1. - С. 320-321.

20. Бульон, В.В. Исползование диет, включающих соевые продукты, при лечении экспериментальной алиментарной дистрофии /В.В. Бульон, Л.К. Хныченко, К.А. Малышкин // Вопросы питания. 1996. - № 3. -С. 38-40.

21. Вартанова, Н.О. Создание новой синтетической среды для культивирования Helicobacter pylori / Н.О. Вартанова и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2005. - Т. 139. - № 5. - С. 538-543.

22. Васильева, З.И. Сухая дрожжевая питательная среда для диагностики чумного микроба / З.И. Васильева и др. // Проблемы природной очаговости чумы: Тез. докл. IV советско-монгольской конф. специалистов противочум. учр. Иркутск, 1980. - Ч. 2. - С. 60-61.

23. Веревкина, М.Н. Аминокислотный состав стимулятора роста микроорганизмов ТС-1 / М.Н. Веревкина // Диагностика, лечение и профилактика заболеваний сельскохозяйственных животных: Сб. науч. тр. / Ставроп. ГСХА. Ставрополь, 1998. - С. 58-61.

24. Веревкина, М.Н. Влияние СРМ ТС-1 на накопление биомассы Trichohpyton faviforme / М.Н. Веревкина // Актуальные проблемы ин-ваз., инфекц. и незараз, патологии животных. Ставрополь, 2003. - С. 155-157.

25. Веревкина, М.Н. Технология приготовления, характеристика и применение стимулятора роста микроорганизмов ТС 1 в биологической промышленности: дис.канд. биол. наук: 03.00.23. / М.Н. Веревкина. -Ставрополь, 2000. - 185 с.

26. Верховцева, Н.В. Трансформация соединений трехвалентного железа Leptothrixpseudoochracea / Н.В. Верховцева, Г.А. Дубинина, И.Н. Гле-бова//Микробиология. 1992. - Т. 61, вып. 5. - С. 830-837.

27. Вишняков, А.В. Приготовление питательных сред на основе гидролизатов соевой муки для глубинного культивирования бактерий рода Bacillus'. дис.канд. биол. наук: 03.00.23 / А.В. Вишняков. Москва, 2006. - 120 с.

28. Власова, Н.П. Оптимизация питательной среды для культивирования бактерий рожи свиней / Н.П. Власова А.С. Фоменко, JI.C. Соловьева // Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности / Экспресс-информация. М., 1983. - №3. - С. 7-9.

29. Волина, Е.Г. Культивирование лептоспир в жидкой питательной среде с лизированной кроличьей кровью / Е.Г. Волина, JI.E. Саруханова // Микробиология. 2001. - № 1. - С. 3-5.

30. Воробьев, А.А. Медицинская и санитарная микробиология / А,А. Воробьев, Ю.С. Кривошеин, В.П. Широбоков. М.: Издательский центр «Академия», 2003. - 464 с.

31. Воробьев, А.В. Микробиология: Учебник / А.В. Воробьев и др.. М.: Медицина, 1998. - С. 181-193.

32. Гавристова, И.А. Характеристика белковых основ бактериологических питательных сред по содержанию углеводов / И.А. Гавристова, Л.Г. Бендас // Микробиология. 1991. - № 5. - С. 76.

33. Галаев, Ю.В. Особенности обмена дикарбоновых аминокислот и их амидов у микроорганизмов кишечной группы / Ю.В. Галаев // ЖМЭИ. -1974. -№6. -С. 23-26.

34. Гальперин, В.М. Микроэкономика / В.М. Гальперин, С.М. Игнатьев, В.И. Моргунов. Санкт-Петербург «Экономическая школа», 1994. - Т. 1.-349 с.

35. Гитилис, B.C. Дождевые черви, пригодные для промышленного разведения / B.C. Гитилис и др.. Иваново-Франковск, 1990. - 7 с.

36. Голубев, В.И. Реидентификация штаммов дрожжей, используемых в гидролизно-дрожжевых производствах / В.И. Голубев // Биотехнология. 1994.-№ 6. - С. 3.

37. Голшмид В.К. Применение веществ, стимулирующих рост энторобак-терий в практике получения микробных адсорбентов / В.К. Голшмид и др. // Микробиология. 1984. - № 6. - С. 47-50.

38. Голшмид, В.К. Гидролизаты крови для микробиологических питательных сред / В.К. Голшмид и др. // Лабораторное дело. 1990. - № 10.-С. 68.

39. Горкин, В.З. Роль металлов в каталитическом действии ферментов / В.З. Горкин. М.: Изд-во АН СССР, 1964. - С. 58-75.

40. Горобец, О.Б. Влияние примесей в агарах на качество питательных сред / О.Б. Горобец, Л.П. Блинкова, А.П. Батуро // Клиническая лабораторная диагностика. 2001. - № 11. - С. 34.

41. Городний, Н.М. Биоконверсия органических отходов в биодинамическом хозяйстве / Н.М. Городний и др.. К.: Урожай, 1990. - 256 с.

42. Готтшалк, Г. Метаболизм бактерий / Г. Готшалк. М.: Мир, 1982. -310 с.

43. Грачева, И.М. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и биоэнергия / И.М. Грачева, А.А. Иванова, В.М. Кантере. М., 1992.-383 с.

44. Гюлушанян, К.С. Использование питательной среды на основе кукурузного экстракта в производстве чумной вакцины ЕВ: автореф. дис.канд. биол. наук: 03.00.07 / К.С. Гюлушанян. Саратов, 1994. -19 с.

45. Дармов, И.В. Разработка диагностической питательной среды для идентификации возбудителя сибирской язвы / И.В. Дармов и др. // Сб. науч. трудов, посвящ. 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. -Киров, 2003. С.26.

46. Дацун, В.М. Вторичные ресурсы рыбной промышленности / В.М. Да-цун. М.: Колос, 1995. - 96 с.

47. Дедюхина, Э.Г. Незаменимые химические элементы в регуляции метаболизма микроорганизмов / Э.Г. Дедюхина, В.К. Ерохин // Успехи микробиологии. М.: Наука, 1992. - Вып. № 25. - С. 126-141.

48. Дзержинская, И.С. Питательные среды для выделения и культивирования микроорганизмов: учеб. пособие / И.С. Дзержинская. Астрахань: Изд-во АГТУ, 2008. - 348 с.

49. Дубровская, Т.А. Использование хитозансодержащего сырья / Т.А. Дубровская // Обзорная информация / ВНИЭРХ. Сер. обработка рыбы и морепродуктов. 1996. - С. 11-22.

50. Ермолаев, М.В. Биологическая химия / М.В. Ермолаев. М.: Медицина, 1978.-320 с.

51. Ефимова, Н.П. Использование кормовых дрожжей в качестве стимулирующей добавки к питательной среде для культивирования С/. Oedematiens / Н.П. Ефимова, М.А. Каменева // Лабораторное дело. -1974. -№ 12.-С. 121-122.

52. Журбенко, Р.С. Изучение возможности использования бактериологического пептона из цельной крови как питательной основы для выращивания микроорганизмов / Р.С. Журбенко и др. // Микробиология. 1993.-№2.-С. 23-26.

53. Заикина, И.А. Экологическая роль бактериального сообщества эпифитов филлосфры в жизнедеятельности растений: дис.канд. биол. наук: 03.00.07. / И.А. Заикина. Ставрополь, 2008. - 170 с.

54. Западнюк В.И., Аминокислоты в медицине / В.И. Западнюк и др..г1. Киев, 1982.-209 с.

55. Запорожцев, JI.H. К вопросу о классификации процессов культивирования микроорганизмов. Новости медицины и медицинской техники / JI.H. Запорожцев, И.А. Баснакьян, В.М. Боровкова // Экспресс-информация. -М.: ВНИИМИ, 1980. № 8. - С. 1-39.

56. Зелютков, Ю.Г. Эффективность двухкомпонентной питательной среды при культивировании микроорганизмов / Ю.Г. Зелютков, В.И. Зайцев // Зооанропозооноз. Болезни, меры профилактики и борьбы. -Минск, 1997.-С. 132-134.

57. Иерусалимский, Н.Д. Основы физиологии микроорганизмов и клеток / Н.Д. Иерусалимский. М.: Изд-во АМН СССР, 1963. - 263 с.

58. Ионина, С.В. Новая питательная среда с биодобавками и минеральным комплексом / С.В. Ионина // Сибир. аграр. наука III тысячелетия. -Новосибирск, 2000.-С. 152-153.

59. Казиахмедов, З.А. Совершенствование питательной среды для индикации микобактерий / З.А. Казиахмедов и др. // Сб. науч. трудов, по-свящ. 50-летию Дагестанской противочум. станции. Махачкала, 2002.-С. 187-190.

60. Калашник, И.А. Стимулирующая терапия в ветеринарии / И.А Калаш-ник. К.: Урожай, 1990. - 160 с.

61. Карпов, А.А. Масштабирование процесса глубинного культивирования микроорганизмов в биореакторах: автореф. дис.канд. биол. наук: 03.00.07 / А.А. Карпов. Щелково, 2004. - 26 с.

62. Карташова, JI.Д. Гидролизат белка пшеничных отрубей новая основа микробиологических питательных сред и его характеристика / Л.Д. Карташова, О.В. Шеремет // Проблемы ООН. - 1994. - № 5 (75). - С. 130-138.

63. Касаткин, Н.Ф. Влияние кукурузного экстракта на качество агара Хоттингера, используемого для выращивания возбудителя чумы / Н.Ф. Касаткин, Н.Г Ованесова, В.И. Тынянова // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1972. - Вып. 3 (25). - С. 206-208.

64. Катунина, Л.С. Использование липоевой кислоты с целью усовершенствования питательных сред для культивирования чумного микроба: дис.канд. биол. наук: 03.00.23 / Л.С. Катунина. Ставрополь, 2002. -164 с.

65. Кисленко, В.Н. Ветеринарная микробиология и иммунология / В.Н. Кисленко, Н.М. Колычев. -М., «КолосС», 2006. -4.1. 183 с.

66. Кнорре, Д.Г. Биологическая химия: Учеб. для хим., биол. и мед. спец. вузов. / Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина. М.: Высш. школа, 2000. - 479 с.

67. Козлов, В.И. Основы лазерной физио- и рефлексотерапии / В.И. Козлов и др. / Под ред. O.K. Скобелкина. Самара-Киев, 1993. - С. 1322.

68. Козлов, Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии / Ю.А. Козлов. -М., Медгиз, 1950. -251с.

69. Кондрашкова, Т.В. Возможные пути усовершенствования сред для производства бакпрепаратов против особо опасных инфекций: / Т.В. Кондрашкова, В.И. Васильева / Биохимия, патофизиология и микробиология особо опасных инфекций. Саратов, 1983. - С. 3-10.

70. Коробейников, A.JI. Технология приготовления сухих питательных основ для производства биоспорина: дис.канд. биол. наук: 03.00.23 / A.JT. Коробейников. Москва, 2005. - 147 с.

71. Кретович, B.JI. Растительные белки и их биосинтез / B.JI. Кретович. -М., 1975. 190 с.

72. Крупицын, В.В. Методические указания к выполнению лабораторных и практических работ по дисциплине «Анатомия пищевого сырья» / В.В. Крупицын. Воронеж. - 2004. - 89 с.

73. Кузник, Б.И. Цитомедины: 25-летний опыт экспериментальных и клинических исследований / Б.И.Кузник, В.Г. Морозов, В.Х. Хавинсон. -СПБ.: Наука, 1998.-310 с.

74. Кулешова, И.А. Использование гидролизата фибрина в качестве основы питательной среды для выращивания рожистой палочки / И.А. Кулешова // Учен. зап. Витеб. гос. акад. вет. медицины, 1999. Т.35. -4.1.-С. 71-72.

75. Лабинская, А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований / А.С. Лабинская. М., «Медицина», 1978. - 394 с.

76. Лабинская, А.С. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований / А.С. Лабинская, Л.П. Блинкова, А.С. Ещина. М., «Медицина», 2004. - 576 с.

77. Лавровская, Н.Ф. Современные исследования по биохимии рыб. / Н.Ф. Лавровская. М., 1973. - 99 с.

78. Лещенко, А.А. Разработка альтернативных питательных основ для выращивания F. Tularensis / А.А. Лещенко и др. // Сб. науч. трудов, посвящ. 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. Киров, 2003. - С. 151.

79. Листериоз. Методические рекомендации (№ 11). М., 2001. - 10 с.

80. Малахов, Ю.А. Лептоспироз животных / Ю.А. Малахов, А.Н. Панин, ГЛ. Соболева. Ярославль: ДИА-пресс, 2000. - 584 с.

81. Малек, И. Непрерывное культивирование микроорганизмов. Теоретические и методологические основы / Под ред. И. Малека, 3. Фенцля. -М.: Пищевая промышленность, 1968. - 345 с.

82. Мартене, Л.А. Плотные агаровые среды из кислотных гидролизатов рыбо-костной муки / Л.А. Мартене // Учен. Зап. Дагест. н.-и. ин-та по производству питательных сред. Махачкала, 1964. - вып. 4. - С. 8797.

83. Меджидов, М.М. Разработка питательной среды для ускуренной идентификации Escherichia coli и других колиформных бактерий в объектах окружающей среды / М.М. Меджидов, Р.Ю. Юнусова, Э.Д. Степанова // Коллектив авторов, 2007. С. 114-115.

84. Меджидов, М.М. Справочник по питательным средам / М.М. Меджидов. -М.: «Медицина», 2003. - 208 с.

85. Мейнелл, Э. Экспериментальная микробиология (теория и практика) / Э. Мейнелл, Дж. Мейнелл. М.: Мир, 1967. - 347 с.

86. Меныпин, В.В. Культивирование листерий в жидкой питательной среде и влияние засевной дозы на накопление /В.В. Меныпин, А.Я. Са-муйленко, Е.Э. Школьников // Междунар. симпоз. Листериоз на рубеже тысячелетий: Материалы. Покров, 1999. - С. 109-111.

87. Месробяну, И.Л. Физиология бактерий / И.Л. Месробяну, Э. Пэуне-ску. Бухарест: Медицина, 1963. - 807 с.

88. Методические рекомендациями к контролю питательных сред по биологическим показателям. М., 1980. - 80 с.

89. Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов / ВНИИ эксперим. ветеринарии им. Я.Р. Коваленко. М., 1986. - 69 с.

90. Методические рекомендации по контролю пептидного состава гидролизатов для выращивания бактериальных культур / Всерос. Гос. НИИконтроля, стандартизации и сертификации вет. препаратов. М., 1994. -7 с.

91. Методы контроля бактериологических питательных сред: МУК 4.2.2316-М., 2008.-68 с.

92. Мишустин, Е.Н. Микробиология / Е.Н. Мишустин, В.Т. Емцев. М.: Агропромиздат, 1987. - 368 с.

93. Нетрусов, А.Н. Практикум по микробиологии: учебное пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.Н. Нетрусов, М.А. Егорова, J1.M. За-харчук; под ред. А.И. Нетрусова. М.: Издательский центр «Академия», 2005.-602 с.

94. Никитина, В.А. Изыскание эффективной дрожжевой питательной среды для культивирования бактерий / В.А. Никитина, В.И. Бобрышев, Ф.И. Кафизова // Ученые записки Казанского гос. ветеринарного ин-та им. Н.Э.Баумана. Казань, 1979. - С. 132-134.

95. Николаев, И.В. Оптимизация процесса ферментативного гидролиза сырья животного происхожения для получения функционального мясного протеина / И.В. Николаев и др. // Биотехнология. — 2008. -№5.-С. 59-67.

96. Николаенко, А.Ф. Организация безотходного производства в мясной промышленности / А.Ф. Николаенко. Киев, 1991. - 245 с.

97. Лабинская, А.С. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований: Учебное пособие / Под. ред. А.С. Ла-бинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной. М.: Медицина, 2004. - 576 с.

98. Озеренко, О.А. Моделирование процессов периодического культивирования микроорганизмов: автореф. дис.канд. биол. наук: 03.00.23 / О.А. Озеренко. Щелково, 2004. - 28 с.

99. Омарова, С.М. Биологические свойства листерий, культивируемых на новых средах для накопления и выделения / С.М. Омарова // Микробиология. 2007. - № 3. - С. 90-92.

100. Орлова, Т.А. Фракционный и аминокислотный состав белков криля и возможность получения из него белковых препаратов / Т.А. Орлова, Е.Е. Чурина, Л.К. Куранова // Вопросы питания. 1985в. №1. - С. 6265.

101. Орлова, Т.В. Технологии получения продуктов и биологически активных веществ из морских гидробионтов / Т.В. Орлова, B.C. Зензерова. Апатиты: Изд. КНЦ РАН, 2004. - 277 с.

102. Панова, Н.В. Разработка нового стимулятора роста микроорганизмов и изучение его влияния на их биологические свойства на примере некоторых вакцинных штаммов бактерий: дис.канд. биол. наук: 03.00.23, 03.00.07 / Н.В. Панова. Ставрополь, 2006. - 173 с.

103. Пенчуков, В.М. Культура больших возможностей / В.М. Пенчуков, Н.В. Медянников, А.У. Каппушев. Ставрополь, 1984. - 28с.

104. Пилат, Т.Л. Биологически активные добавки к пище (теория, производство, применение) / Т.Л. Пилат, А.А. Иванов. М.: Авваллон, 2002.-710 с.

105. Питерман, М. Физические и химические свойства рибосом / М. Пи-терман. М.: Мир, 1967. - 221 с.

106. Повхан, М.Ф. Вермикультура: производство и использование / М.Ф. Повхан и др.. К.: УкрИНТЭИ, 2004. - 128 с.

107. Поздеев, O.K. Бактериологические исследования. Медицинская микробиология / O.K. Поздеев, В.И. Покровский М., 1999. - 1200 с.

108. Покаржевский, А.Д. Геохимическая экология наземных животных / А.Д. Покаржевский. М., Наука, 1985. - 300 с.

109. Покровский, А.А. Перспективы использования одноклеточных организмов: Медико-биологические исследования углеводородных дрожжей / А.А. Покровский М., 1972. - С. 9-58.

110. Полюдек-Фабини, Р. Органический анализ / Р. Полюдек-Фабини, Т. Бейрих. Ленинград «ХИМИЯ», 1981.-622 с.

111. Поляк, М.С. Питательные среды для медицинской микробиологии. / М.С. Поляк, В.И. Сухаревич, М.Э. Сухаревич. Санкт-Петербург, Слби-СПб, 2008.-351 с.

112. Пригода, А.С. Современное состояние и перспективы получения и использования питательных сред: Обзор, информ / А.С. Пригода, B.C. Муратов // ВНИИ систем упр., эконом, исслед. и НТИ. М., 1989. - 55 с.

113. Прозоркина, Н.В. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии: Учебное пособие для средних спец. мед. уч. заведений / Н.В. Прозоркина, Л.А. Рубашкина. Ростов н/Д: Феникс, 2002. - 416 с.

114. Промышленная микробиология / Под ред. Н.С. Егорова — М.: Высш. шк., 1989. 688 с.

115. Пяткин, К.Д. Микробиология с вирусологией и иммунологией / К.Д. Пяткин. -М.: Медицина, 1971. 351 с.

116. Раевский, А.А. Перспективное технологическое направление культивирования бактерий при производстве вакцин / А.А. Раевский // Материалы Междунар. науч.-пр. конф. «Научные основы производства вет. биол. препаратов». Щелково, 2003. - С. 61-64.

117. Раевский, А.А. Разработка управляемого культивирования Pasterella multocida: дис.канд. биол. наук: 03.00.07 / А.А. Раевский Ставрополь, 2002.-164 с.

118. Ржепаковский, И.В. Разработка биостимулятора эмбрионального и оценка его эффективности при иммунодефицитных состояниях у животных раннего возраста: дис.канд. биол. наук: 03.00.23, 16.00.02 / И.В. Ржепаковский. Ставрополь, 2003. - 157 с.

119. Рогожин, С.П. Использование гидролизата из непищевого сырья при производстве биологических препаратов / С.П. Рогожин и др. // Бюл. Всес. Орд. Ленина НИИ эксперим. ветеринарии им. Я.Р. Коваленко. -М., 1983.-№49.-С. 78-82.

120. Сазыкин, Ю.О. Биотехнология: учебное пособие для студ. высш. учеб. заведений / Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева; под ред. А.В. Катлинского. — М.: издательский центр «Академия», 2006. 256 с.

121. Самыгин, В.М. Конструкция установки для глубинного культивирования аэробных патогенов / В.М. Самыгин и др. // Биотехнология. -2008. -№ 2. С. 65-68.

122. Самыкина, JI.H. Поиск новых путей управления микробиологическими процессами на основе регуляторных возможностей дегидрогеназ / Л.Н. Самыкина // Микроорганизмы в сельском хозяйстве: Тез. докл. 4 Всесоюз. науч. конф. Пущено, 1992. - С. 179.

123. Сбойчаков, В.Б. Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований: (Учебник для средних медицинских учебных заведений) / В.Б. Сбойчаков. Санкт-Петербург: «СпецЛит», 2007. - 591 с.

124. Свириденко, Ю.Я. Гидролизаты термокоагулированных белков молочной сыворотки / Ю.А. Свириденко и др. // Молочная промышленность. 2006. -№ 6. - С. 66-67.

125. Сенькин, А.В. Использование желточных сред для повышения высе-ваемости возбудителя сибирской язвы / А.В. Сенькин, Т.Н. Терентьев, Н.П. Медведев // Сб. науч. трудов, посвящ. 75-летию НИИ микробиолог. МО РФ. Киров, 2003. - С. 168.

126. Ситьков, В.И. Изготовление и испытание малобелковой пительной среды для культивирования лептоспир / В.И. Ситьков и др. // Диагностика, лечение и профилактика заболеваний с.-х. животных. Ставрополь, 1994.-С. 42-45.

127. Смирнова, Г.А. Изучение пептидного и аминокислотного состава различных белковых основ питательных сред / Г.А. Смирнова и др. // ЖМЭИ. 1985. - № 12. - С. 22-26.

128. Смирнова, Г.А. Состояние и перспективы развития сырьевой базы производства питательных сред / Г.А. Смирнова // Микробиология. -1991.-№5.-С. 63-67.

129. Соболев, A.M. Запасание белка в семенах растений / A.M. Соболев. -М.: Наука, 1985.- 113 с.

130. Сорокулова, И.Б. Разработка питательной среды для культивирования Lactobacillus plantarum 8R-A3 / И.Б. Сорокулова, Т.В. Хилько, А.И. Осадчая // Мшробюл.ж. 2003. - 65. - № 3. - С. 39-45.

131. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под. ред. М.О. Биргера. М.: Медицина, 1982. - 464 с.

132. Стадник, Б.Г. Вермикультура новая биотехнология / Б.Г. Стадник, JI.M. Зимина, Г.В. Голиков // Биология в школе. - 1997, № 4. - С. 1721.

133. Старцева O.JI. Совершенствование биотехнологии производства питательных сред для культивирования чумного микроба на основе сырья животного и растительного происхождения: дис.канд. биол. наук: 03.00.23 / O.JI. Старцева. Ставрополь, 2005. - 182 с.

134. Сулейманов С.М. Методы морфологических исследований (методическое пособие) / С.М. Сулейманов, П.А. Паршин, Ю.П. Жарова. Воронеж, 2000. - 64 с.

135. Султанов, 3.3. Разработка и усовершенствование технологий получения микробиологических питательных основ и сред: автореф. дис.докт. биол. наук: 03.00.07 / 3.3. Султанов. Махачкала, 2008. -45 с.

136. Таран, Т.В. Досвщ використання сереловища irna для культивування лептосшр / Т.В. Таран // BicH. аграр. науки. 1999. - № 10. - С. 76-77.

137. Телишевская, Л.Я. Контроль и стандартизация компонентов и питательных сред бактериальных культур / Л.Я. Телишевская и др. // Бюл. Всес. Ордена Ленина НИИ эксперим. ветеринарии им. Я.Р. Коваленко. М., 1983. - № 49. - С. 83-89.

138. Телишевская, Л.Я. Разработка методов изготовления гидролизатов для питательных сред / Л.Я. Телишевская, С.П. Сергеева // Аграр. наука, 2000. -№ Ю.-С. 22-23.

139. Телишевская, Л.Я. Белковые гидролизаты / Л.Я. Телишевская. М., 2000.-295 с.

140. Теппер, Е.З. Практикум по микробиологии: Учебное пособие для вузов / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева; под ред. В.К. Шильниковой. М.: Дрофа, 2004. - 256 с.

141. XIII конф. противочум. учр. Средней Азии и Казахстана. Алма-Ата, 1990.-С. 91-93.

142. Томе, М.Ф. Аминокислотный состав кормов / М.Ф. Томе, Р.В. Марты-ненко. М.: Колос, 1972. - 288 с.

143. Трифонова, А.А. О приготовлении агара из перевара сгустков крови /А.А. Трифонова, Т.В. Кондрашкова // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1972. - Вып. 4 (26). - С. 162-163.

144. Трошкова, Г.П. Совершенствование технологии приготовления питательных сред на основе ферментативных гидролизатов рисовой и соевой муки / Г.П. Трошкова и др. // Биотехнология. 2006. - № 4. - С. 74-78.

145. Тру скова, Т.Ю. Живильш середовища на основ! пдрол!зату з некондицшного м'яса сшьськогосподарських тварин / Т.Ю. Трускова,

146. В.В. Кшрич // еет. Медицина. / 1н-т експерим. I юишч. вет. меди-цини УААН, 2000. Вип. 78. - Т. 1. - С. 287-291.

147. Тутов, В.К. Основы биотехнологии ветеринарных препаратов / В.К. Тутов, В.И. Ситьков // Учебное пособие для студентов высших учебных заведений по специальности 31.08.00 ветеринария. - Ставрополь, 1997.-253 с.

148. Тутов, И.К. Испытание новой питательной среды из органов лимфо-идной системы / И.К. Тутов, В.А. Кравцов // Диагностика, лечение и профилактика заболеваний с.-х. животных. — Ставрополь, 2001. С. 31-32.

149. Фармакопейная статья предприятия № 42-0397261002. Питательный агар для культивирования микроорганизмов, готовый к применению (Агар Хоттингера). М., 2002. - 9 с.

150. Федорова, О.В. Влияние компонентного состава питательных сред и стерилизации на связывание ионов железа / О.В. Федорова и др. // Биотехнология. 1991. - № 3. - С. 60-61.

151. Феофилова, Е.П. Пигменты микроорганизмов / Е.П. Феофилова. М., 1974.-150 с.

152. Филатов, В.П. Тканевая терапия / В.П. Филатов. М.: Знание, 1955. -180 с.

153. Филимонова, Г.В. К вопросу хранения скоропортящегося микробиологического сырья и возможности дальнейшего его использования / Г.В. Филимонова и др. // Сб. науч. трудов, посвящ., 75-летию НИИ микробиол. МО РФ. Киров, 2003. - С. 172.

154. Филиппов, А.Ф. Выращивание культур чумного микроба на средах из аутолизатов рыбы / А.Ф. Филиппов и др. // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1973. - Вып.6(34). - С. 74- 77.

155. Фурсова, П.В. Определение потребностей диссоциантов Pseudomonas aeruginosa в углероде, азоте и фосфоре / П.В. Фурсова и др. // Микробиология. 2004. - Т. 73. - № 1. - С. 45-50.

156. Хабаров, А.К. Разработка процесса хемостатного культивирования пастерелл при производстве вакцин: автореф. дис.кандидата биол. наук: 03.00.23, 16.00.03 / А.К. Хабаров. Щелкова, 2005. - 14 с.

157. Халдун, А.О. Антибактериальное действие эфирных масел некоторых растений / А.О. Халдун // Микробиология. 2006. - № 3. - С. 92-93.

158. Черкес, Ф.К. Руководство к практическим занятиям по микробиологическим исследованиям / Ф.К. Черкес. М.: Медицина, 1974. - 221 с.

159. Числов, Ю.В. Метод ускоренного контроля чистоты культуры вакцинного сибиреязвенного штамма /Ю.В. Числов // Вестник ветеринарии.- 1998.-№ 10. С. 16-18.

160. Шаршунова, М. Тонкослойная хромотография в фармации и клинической биохимии / М. Шаршунова, В. Шварц, Ч. Михалец // Под ред.

161. B.Г. Березкина, С.Д. Соколова. М.: Мир, 1980. - 622 с.

162. Шепелев, И.А. Оптимизация условий масштабируемого культивирования туляремийного микроба в технологиях получения протектив-ных антигенов: дис.канд. биол. наук: 03.00.07 / И.А. Шепелев. Саратов, 2005. - 136 с.

163. Шилов, П.И. Основы клинической витаминологии / П.И. Шилов, Т.Н. Яковлев. Ленинград: Медицина, 1974. - 342 с.

164. Шлегель, Г. Общая микробиология /Г. Шлегель. М.: Мир, 1987. - 566 с.

165. Ягодин, Б.А. Практикум по агрохимии. / Б.А. Ягодин, И.П. Дерюгин, Ю.П. Жуков. Москва, 1987. - 511 с.

166. Ярцев, М.Я. Показатели роста микроорганизмов в управляемых процессах культивирования / М.Я. Ярцев // Ветеринария. 2000. - № 4.1. C. 25-28.

167. Ярцев, М.Я. Специфическая профилактика и технология вакцинного производства при сальмонеллезах / М.Я. Ярцев // Ветеринария. 1996.- № 8. С. 47.

168. Bare, G. Effect of plant protein hydrolysates on culture of CHO cells in media with serum, without serum and without protein / G. Bare // 17th Meeting of ESACT «From target to market». Sweden, 2001. - P. 160.

169. Barreto Michael. Extract from seaweeds can promote fungal growth / Michael Barreto, Alan T. Critchley, Colin J. Straker // J. Basic Microbiol. -2002.-№5. -P. 302-310.

170. Bezkorovainy, A. Ferrous iron uptake by Bifidobacterium breve / A. Bez-korovainy, L. Solberg // Biol. Trace Elem. Res. 1989. - Vol. 20. - № 3. -P.-251-267.

171. Brison, J. Action de cations Ca et Mg sur la croissanse de quelques bac-teriens halophiles d' origine marine / J. Brison, H. Vargues // Ann. Inst. Past., 1963.-Vol. 105.-№3.-P. 580-596.

172. Brok, I. Effect of magnesium ion deficiency on Escherichia coli and possible relation to the mode of action of novobiocin / I. Brok // J. Bact. 1962.- Vol. 84. № 4. - P. 679-682.

173. Brubaker, R.R. The effect of Ca++ and Mg++ on lysis growth and production of virulence antigens by P. pestis / R.R. Brubaker, M.L. Surgalla // J. Infect. Dis. 1964. - Vol. 114. - P. 13-25.

174. Corrigan, P.J. Pesticide residues in Australian meat / P.J. Corrigan, P. Se-neviratna//Veter. Rec. 1989. - T.125. - № 8.-P. 181-184.

175. Doudoroff, M. Studies on the nutrition and metabolizm of Pasteurells pestis /М. Doudoroff// Pros. Soc. exp. Biol., 1943. Vol. 53. - P. 73-75.

176. Duszkiewicz-Reinhard, W. Badania microbiologiczne preparatow bi-alkowych z fasoli w ukladach modelowych oraz w polaczeniu z meisem / W. Duszkiewicz-Reinhard. Warszawa; Wydaw. SGGW, 1992. - 59 p.

177. Edwards, C.A. Biology of earthworms / C.A. Edwards, P.J. Bohlen. London, Chapman & Hall, 1996. - 426 p.

178. Ellinghausen, H. Nutrion of Leptospira Pomona and the growth of 13 other serotypes; fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80 / H. Ellinghausen, W. Amer, J. McCullought // Vet. Res., 1965.-№26.-P. 45-51.

179. Faine, S. Guidelines for the control of Leptospirosis / S. Faine // W.H.O. -Geneva, 1982.-P. 170.

180. Flechtenmacher, W. Spruhgetrocknetes Proteinkonzentrat aus Saureober-laugenbehandeltem Rohkrill und Enzyvatisch / W. Flechtenmacher, W. Wanke // Inform. Fishwirtschaft. 1976. Vol. 25. -№ 6. P. 196-207.

181. Foster, I.W. Chemical activities of fungi / I.W. Foster. New York, 1949. - 198 p.

182. Haines, R.B. The proteolytic enzymes of microorganisms / R.B. Haines // Biol. Rev., 1933.-№ 9.-P. 235-261.

183. Hartenstein, R. Composition of earthworm Ersinia fotida and assimilation of 15 elements from sludge during growth / R. Hartenstein et all. // Сотр. Biochem. Physiol., 1980. Vol. 66. - P. 187-192.

184. Ianasa, M. Chemical composition of Euphausia superba and its utilization / M. Ianasa // Bull. Tokai Reg. 1971. № 65. - P. 59-66.

185. Laverack, M.S. The physiology of earthworms / M.S. Laverack. Oxford. Pergamon press, 1963. - 206 p.

186. Leighton, P.M. Yersinia hepatic abscesses to longterm iron therapy / P.M. Leighton, H.M. Macsween // J. Amer. med. Ass. 1987. - Vol. 257. - № 7.-P. 964-965.

187. Lemancik, I.F. Versatile coy flours / I.F. Lemancik, I.V. Ziemba // Food Enf., 1962. Vol. 34. - № 7. - P. 90-91.

188. Lichstein, H.C. Microbial nutrition / H.C. Lichstein // Annu. Rev. Microbiol., 1960.-Vol. 21.-P. 14.

189. Lindsay, D.G. Monitoring and testing for residues of therapeutics in meat. / D.G. Lindsay //Veter. Rec., 1983.-Vol. 112.-№20.-P. 469-471.

190. Macfarlane, D.E. Improved media for the culture of Neisseria gonorrhocea / D.E. Macfarlane, Т.Е. Elian-Jones // J. Microbiol., 1980. Vol. 13. - № 4. -P. 595-607.

191. Martin, M.H. Biologikal monitoring of heavy metal pollution / M.H. Martin, P.J. Coughtrey. London. N. Y.: Applied Science Publ., 1982. - 475 p.

192. Millar, D.B. Production of soybean protein isolate of improved purity / D.B. Millar. General Poods Ins. 1982. - P. 132.

193. McBride, J.R. The liguefaction of British Columbian herring by ensilage, proteolytic enzymes and acid hydrolysis / J.R. McBride, D.R. Adler, R.A. Macleod // J. Food Res. Bd. Can. 1961. Vol. 18. - № 1. - P. 93.

194. Morey, K.S. Protein guality of fish in modified atmospheres as predicted by the C-PER assay / K.S. Morey, L.D. Satterlee, W.D. Brown // J. Food Sci. 1982. Vol. 47. - № 5. - P. 1399-1409.

195. Morio, A. Protein production by yeast in acidic cultural condition / A. Mo-rio, N. Yukinobu, Yamada Tetsua // Agr. And Biol. Chem. 1978. - Vol. 42.-№ 12.-P. 91-92.

196. Murakami, K. Acids proteases of Antarctic Krill Euphausia Superba purifi-gation and some properties / K. Murakami, K. Kimoto. Food Sci. Techn. Abstr. 1979. Vol. 11. -№ 2. - 200 p.

197. Naktin, J. Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis / J. Nak-tin, K.G. Beavis // Clin. Lab. Med. 1999. - Vol. 19. - № 3. - P. 523-536.

198. Neilands, J.B. Some aspects of iron metabolism / J.B. Neilands // Bacterial. Rev., 1957.-№21.-P. 101-111.

199. Nieman, C. Influence of trace amounts of fatty acids on the growth of microorganisms / C. Nieman // Bact. Rev., 1954. P. 18-20.

200. Paulsen, T.M. A study of macaroni products containing soy flour / T.M. Paulsen // Food Technol. 1961. № 15. - P. 118-121.

201. Pokarzhevskii A.D. Amino acids in earthworms are earthworms: ecosys-temivorous? / A.D. Pokarzhevskii et all. // Soil Biol. Biochem., 1997. -Vol. 29. № 3/4. - P. 559-567.

202. Pokarzhevskii, A.D. Microbial links and element flows in nested detrital food-webs / A.D. Pokarzhevskii et all. // Pedobiologia, 2003. Vol. 47. -P. 213-224.

203. Pollock, M.R. Unsaturated fatty acids in cotton wool plugs / M.R. Pollock //Nature.-bond., 1948.-P. 161-165.

204. Porter, J.R. Bacteriol. chemistry and physiology / J.R. Porter // Ed. 11. -NV.London: Ed. J .Willey, A.Chorman, 1954. P. 1073.

205. Rice, D.N. Nebraska residue avoidance program report reducing residues in meat and milk / D.N. Rice, S. Wallen, D. Nitzel // Proceedings, 1984. P. 116-120.

206. Rowley, D. Interrelationships between amino-acids in the growth of coli-form organisms / D.J. Rowley // Gen. Microbiol. 1953. - № 9. - P. 37.

207. Sabine, J.R. Earthworms as a source of food and drugs / J.R. Sabine // Earthworm ecology London, Chapman & Hall, 1983. P. 285-296.

208. Scherer, Christiane. Influence of culture conditions on the fatty acid profiles of laboratory adapted and freshly isolated strains of Helicobacter pylori / Scherer Christiane et all. // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol. 41. - № 3.-P. 1114-1117.

209. Scott, T.A. The Conversion of Formyl-L-Aspartate into Nicotinic Acid by Extracts of Clostridium butylicum / T.A. Scott, M. Bellion // Europ. J. Bio-chem. 1969. -Vol. 10. - P. 318-323.

210. Sheppard S.C. Advances in earthworm ecotoxicology / S.C. Sheppard et all. -Pensacola, SETAC, 1998.-472 p.

211. Todorov, S. Influence of growth medium on bacteriocin production in lac-tobacillus plantarum ST 31 / S. Todorov et all. // Biotechnol. And Bio-technol. Equip. 2000. - Vol. 14. - № 1. - P. 50-55.

212. Venant, A. Emploi actuel des pesticides organochlores en France. Toxicite-residus dans les denrees alimentaires d"origine animale / A. Venant, L. Richou-Bac.// Bull. Soc Veter. Prat. Fr., 1984. - Vol. 68. - № 1. - P. 3159.

213. Waguespack, M. Eliminating residue in «Bob» veal calves / M. Wa-guespack // Anim. Health Nutrit, 1986. Vol.41. - № 6. - P. 28-30.

214. Waring, W.S. Iron deficience in bacterial metabolism / W.S. Waring, C.H. Werkman // Arch. Biochem., 1944. № 4. - P. 75-87.

215. Wolk, W.I. Purification and properties of the proteins in soybeans Chemistry and tehnology / W.I. Wolk. Proteins. West-port; Conn.: Avi. Publ. Co., 1972.-Vol. 1.-315 p.

216. Wren, M.W.D. An improved cooked meat medium for the growth of anaerobic bacteria / M.W.D. Wren // Med. Lab. Sci., 1979. Vol. 36. - № 2. -P. 197-199.

217. Yebin, Liu The study on lactose promoting Escherichia coli multiplication / Liu Yebin et all. // Acta veter. zootechn. Sinica, 1999. Vol. 30. - № 3. -P. 235-237.

Информация о работе

Ткаченко, Инна Николаевна
кандидата биологических наук
Ставрополь, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Разработка и оценка качества новых питательных сред и стимуляторов роста микроорганизмов на основе активированных гидролизатов из молок рыб и вермикультуры - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы